CN102757480A - 抗登革4型病毒中和表位特异性抗体及其在治疗登革4型病毒感染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明登革4型病毒ED3的新的中和表位LTLH，与上述中和表位特异性结合的抗登革4型病毒ED3的单克隆抗体1G6及其在制备治疗登革4型病毒感染药物中的应用。

Description

抗登革4型病毒中和表位特异性抗体及其在治疗登革4型病毒感染中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种蛋白的功能表位、与这个表位特异性结合的单克隆抗体及用途。

背景技术

登革病毒(dengue virus，DENV)是黄病毒属、有包膜的单正链RNA病毒，根据其包膜的抗原性不同，分为四种血清型(DENV1-4)，每个血清型根据基因的进化关系又分为不同的基因型。主要以埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介，广泛流行于热带和亚热带地区。临床上主要引起登革热(Dengue Fever，DF)、登革出血热(Dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克综合征(dengue shocksyndrome，DSS)。其中，DF是自限性发热性疾病；而DHF/DSS则引发血管通透性显著增加，导致血浆渗漏引发休克，严重威胁患者的生命。世界上约有半数的人口生活在登革热疫区，每年有超过5000万的感染病例，其中有50万人发展为严重的登革出血热和登革休克综合征。但是，临床上缺乏预防和治疗DENV感染的有效疫苗和药物，主要以对症支持治疗为主。

登革病毒基因组全长约10-11kb，依次编码3种结构蛋白(C、prM/M和E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。其中，DENV包膜E蛋白全长495个氨基酸，相对分子量约为54KDa，位于成熟病毒表面，排列成平行二聚体结构，构成病毒颗粒的主要突起，是DENV最主要的结构蛋白，在介导病毒与宿主细胞的吸附、膜融合以及在病毒组装成熟过程中具有重要作用；同时，E蛋白也是DENV最主要的保护性抗原，也是DENV主要的毒力蛋白，而且包含型特异、属特异性抗原决定簇，可有效诱导机体产生保护性免疫应答，在机体抵御DENV感染的过程中发挥重要作用。因此，对E蛋白的结构与功能进行深入研究，有助于阐明DENV与宿主细胞间的相互作用及致病的分子机制，为DENV的诊断、疫苗的研究开发和抗病毒药物的设计提供理论依据。

根据已测定的E蛋白晶体结构，其在空间结构上形成3个不同的结构域(I，II和III区，分别命名为ED1，ED2和ED3)。其中，I区位于E蛋白单体的中央，包含8个首尾相连的β桶状结构；II区位于E蛋白氨基端，折叠成指样结构(finger-like structure)，该区包含了一段介导病毒与靶细胞融合的融合肽结构(fusion loop，98-110位氨基酸)，该融合肽结构在整个黄病毒属中是高度保守的；III区位于E蛋白羧基端，具有免疫球蛋白样结构，该区介导了病毒与靶细胞的吸附，被认为是包含了受体结合区的区域，包含最重要的中和表位。实验证明：ED3蛋白可竞争阻断病毒同靶细胞的结合，而针对ED3的单抗是阻碍病毒吸附细胞最有力的阻碍剂(R.T.He，B.L.Innis，A.NisalaK，W.Usawattanakul，S.Wang，et al.Antibodies that block virus attachmentto Vero cells are a major component of the human neutralizing antibodyresponse against dengue virus type 2.J Med Virol，1995，45：451-61)；经过四个血清型病毒ED3串联蛋白免疫后的小鼠可以耐受多个血清型病毒的致死性攻击(S.Chen，M.Yu，T.Jiang，Y.Deng，C.Qin，et al.Inductionof tetravalent protective immunity against four dengue serotypes by thetandem domain III of the envelope protein.DNA Cell Biol，2007，26：361-7)，因此，ED3成为疫苗和中和抗体治疗的潜在靶蛋白。

抗体的感染增强作用(Antibody-dependent enhancement，ADE)是抗体治疗应用的一个障碍，而型特异性抗体同交叉反应性抗体相比，具有更强的中和活性，以及不会导致由其它血清型登革病毒引起的ADE。但目前针对登革4型病毒的中和抗体研究比较少，型特异中和抗体只有一株5H2，利用病毒逃逸株的方式来确定其表位位于ED1结构域的第174和176位氨基酸(C.J.Lai，A.P.Goncalvez，R.Men，C.Wernly，O.Donau，et al.Epitope determinants ofa chimpanzee dengue virus type 4(DENV-4)-neutralizing antibody andprotection against DENV-4 challenge in mice and rhesus monkeys bypassively transferred humanized antibody.J Virol，2007，81：12766-74)，其余3株对登革4型病毒有中和活性的单抗4E11，9F12和9D12均为交叉反应性抗体(O.Lisova，F.Hardy，V.Petit and H.Bedouelle.Mapping tocompleteness and transplantation of a group-specific，discontinuous，neutralizing epitope in the envelope protein of dengue virus.J Gen Virol，2007，88：2387-97；R.Rajamanonmani，C.Nkenfou，P.Clancy，Y.H.Yau，S.G.Shochat，et al.On a mouse monoclonal antibody that neutralizesall four dengue virus serotypes.J Gen Virol，2009，90：799-809；S.Sukupolvi-Petty，S.K.Austin，W.E.Purtha，T.Oliphant，G.E.Nybakken，et al.Type-and subcomplex-specific neutralizing antibodies againstdomain III of dengue virus type 2 envelope protein recognize adjacentepitopes.J Virol，2007，81：12816-26)，而ED3区特异性中和抗体尚未见报道。文献中提到的具有中和活性的登革4型病毒抗体所识别的ED3表位均集中于由E蛋白305-312位氨基酸构成的交叉结合区域。

发明内容

本发明的目的之一是公开了登革4型病毒ED3的新的中和表位LTLH，本发明公开的抗登革4型病毒单克隆抗体所识别的表位处于上述的结合位点以外，但在体内外均有良好的中和保护作用。

本明的另外一个目的是公开了与上述表位区域结合的登革4型病毒特异性中和抗体。

更具体的，本发明公开了与上述中和表位特异性结合的抗登革4型病毒ED3的单克隆抗体1G6，其重链、轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4。

本发明的另外一个目的是公开了上述抗登革4型病毒的单克隆抗体在制备治疗登革4型病毒感染药物中的应用。

具体地，本发明的发明人首先利用分子生物技术克隆串联的四种血清型登革病毒ED3基因，利用原核表达了串联ED3蛋白，免疫小鼠并通过细胞融合-杂交瘤的方法制备了一系列特异性抗登革病毒ED3区的单克隆抗体，其中尤其以抗体1G6中和效果为最佳，并对该单抗可变区基因进行了克隆并测定了其序列。本发明的发明人利用中国仓鼠肾细胞株BHK-21进行了一系列实验，来验证本发明公开的鼠抗登革4型病毒中和抗体1G6对病毒感染的抑制作用。体外中和活性实验结果表明抗登革4型病毒抗体1G6可有效阻断登革4型病毒对BHK-21细胞的感染，相应的，作为对照的单克隆抗体6E1则没有上述作用，从而说明了本发明公开的上述抗登革4型病毒抗体1G6可有效抑制登革4型病毒对靶细胞的感染。

本发明的发明人利用登革4型病毒颅内注射在乳鼠体内建立了乳鼠体内攻毒模型，并在该模型上验证了抗登革4型病毒单克隆抗体1G6在体内也具有有效的中和保护作用。除此之外，利用该模型本发明的发明人还验证了该抗体在体内具有有效的治疗登革4型病毒感染作用。本发明的发明人还利用噬菌体展示技术鉴定了该抗体1G6结合的表位区域，位于E蛋白387-390位的氨基酸区域LTLH，进一步运用系列缺失突变和定点突变的方法明确了该抗体结合的两个关键氨基酸T388和H390。更具体的，本发明的发明人通过单克隆抗体抗原表位的噬菌体肽库淘选、噬菌体克隆ELISA鉴定及序列分析推测出抗克隆抗体的的中和表位，进一步通过系列缺失突变和定点突变技术进行突变体蛋白的构建和原核表达，通过体外亲和力检测对表位区域的关键氨基酸位点进行鉴定。

本发明公开的登革4型病毒特异性中和抗体可阻断登革4型病毒与靶细胞的结合进而阻止其感染细胞，在发生病毒感染后的一定时间内依然可发挥良好的保护活性，故此可以作为良好的登革4型病毒感染的治疗候选药物。

附图说明

图1登革病毒ED3基因序列酶切链接PGEX-4T-2后的酶切电泳图，其中1-4泳道为登革1-4型病毒ED3表达载体酶切鉴定，目的条带在300bp左右；泳道5-8为串联ED3表达载体1-4号克隆酶切鉴定，目的条带在1400bp左右；M为DNA分子量marker D2000；

图2登革病毒各个血清型ED3以及串联ED3蛋白的原核诱导表达SDS-PAGE图，其中1、3、5、7、9为未诱导的菌体；2、4、6、8为诱导表达后的DENV1-4ED3表达菌体上清；10：诱导表达后的串联ED3蛋白菌体上清。

图3单克隆抗体1G6结合特异性实验；

图4单克隆抗体1G6对登革4型病毒体内外中和保护活性实验

图5抗体吸附前后抑制实验；

图6抗体体内治疗实验；

图7表位淘选结果；

图8ED3蛋白的系列缺失突变对抗体1G6的结合影响；

图9抗体表位一级序列和三维结构的比对结果；

图1029株不同基因型登革4型病毒ED3序列比对；

图11不同氨基酸位点突变所致亲和力改变；

图12Insight II软件显示1G6的表位与已报道表位的空间结构关系。

具体实施方式

以下结合实施例、实验例进一步对本发明进行说明，这些实施例、实验例不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法以及经典的细胞融合和单克隆抗体筛选及纯化的方法等。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold spring Harbor Laboratory Press.

本发明实施例或实验例中未标明来源的原、辅料均为市售。

实施例1.串联ED3区的全基因合成及克隆

参照GENEBANK提供的四种血清型登革病毒资料及序列，进行全基因合成，序列如下：

GGATCC

TCATATGTGATGTGCACAGGCTCATTCAAGCTAGAGAAAGGGGTGGCTGAGACCCAGCATGGAACCGTTCTAGTGCAGGTTAAATACGAAGGAACAGATGCACCATGCAAGATCCCTTTTTCAACCCAAGATGAAAAAGGAGTAATCCAGAATGGGAGAGTGATAACAGCCAACCCTATAGTCACTGACAAGGAAAAACCAGTCAACATTGAGGCAGAACCACCTTTTGGTGAGAGTTACATCGTGGTAGGAGCAGGTGAAAAAGCTTTGAAACTAAGCTGGTTCGAGAAAGGAAGCACCATAGGGAAA

TCATACTCTATGTGCACAGGAAAGTTTAAAGTTGTGAAGGAAATAGCAGAAACACAACATGGAACAATAGTTATCAGAGTACAATATGAAGGGGACGGTTCTCCATGTAAGATCCCTTTTGAGATAATGGATTTGGAAAAAAGACATGTTTTAGGTCGCCTGATTACAGTCAACCCAATCGTAACAGAAAAAGATAGCCCAGTCAACATAGAAGCAGAACCTCCATTCGGAGACAGCTACATCATCATAGGAGTAGAGCCGGGACAATTGAAGCTCAACTGGTTTAAGAAAGGAAGTTCTATCGGCCAA

CAGCTATGCAATGTGCTTGAATACCTTTGTGTTGAAGAAAGAAGTCTCCGAAACGCAGCATGGGACAATACTCATTAAGGTTGAGTACAAAGGGGAAGATGCACCCTGCAAGATTCCTTTCTCCACGGAGGATGGACAAGGGAAAGCTCACAATGGCAGACTGATCACAGCCAATCCAGTGGTGACCAAGAAGGAGGAGCCTGTCAACATTGAGGCTGAACCTCCTTTTGGGGAAAGTAATATAGTAATTGGAATTGGAGACAAAGCCCTGAAAATCAACTGGTACAGGAAGGGAAGCTCGATTGGGAAG

CTCATACACGATGTGCTCAGGAAAGTTCTCAATTGACAAAGAGATGGCAGAAACACAGCATGGGACAACAGTGATTAAAGTCAAATATGAAGGTGCTGGAGCTCCGTGTAAAGTTCCCATAGAGATAAGAGATGTGAACAAGGAAAAAGTGGTAGGGCGTGTCATCTCATCTACCCCTTTTGCTGAGAATACCAACAGTGTAACCAACATAGAGTTGGAACCCCCTTTTGGGGACAGCTACATAATAATAGGTGTTGGAGACAGTGCATTAACACTCCATTGGTTCAGGAAAGGGAGTTCCATTGGCAAGTAAGAATTC

其中，下划线部分为酶切位点BamH I和Xho I，斜线为EK酶切位点，黑色方框中标记为15个氨基酸的linker。经双酶切后与pGEX-4T-2(NOVAGEN公司)连接，转化大肠杆菌TG1后，筛选获得有插入片断的阳性克隆。DNA序列测定确认，结果见图1。

实施例2.登革病毒各型ED3及串联蛋白的原核表达

将实施例1所得的序列正确的含ED3基因片断的pGEX-4T-2质粒转化BL21DE3细菌(Promega公司)后，挑取单个克隆，经IPTG诱导表达出各ED3-GST(谷胱甘肽S-转移酶)融合蛋白，结果见图2。选择高表达单克隆大量诱导表达后收集表达上清，经抗GST层析柱纯化，获得纯ED3蛋白。

实施例3.鼠抗登革4型病毒单克隆抗体的筛选与特异性检测

100ug串联ED3蛋白和等体积完全弗氏佐剂乳化后，腹腔注射BALB/C小鼠(上海西普尔一必凯实验动物有限公司)免疫接种，每两周后加强免疫一次，剂量均同第一次免疫，后两次改为不完全弗氏佐剂进行乳化，共免疫3次后，选取血清中抗串联ED3抗体低度较高小鼠，分离其脾脏淋巴细胞，利用经典的PEG细胞融合法，将小鼠脾脏淋巴细胞与NS-1细胞进行细胞融合。采用ELISA、免疫印迹和免疫荧光法反复筛选，最终获得可稳定表达特异性针对登革4型病毒的杂交瘤细胞株1G6。大量扩增单克隆细胞株1G6，腹腔注射BALB/C小鼠5×10⁶/只，7天左右待小鼠腹部彭隆后开始收集小鼠腹水，利用Protein A柱，亲和层析纯化单克隆抗体。

实验例1针对四种血清型登革病毒的免疫荧光测定

实验例1-1病毒抗原片的制备

我们将登革1、2、3、4型病毒(其中登革1型病毒毒株名为DENV1 128，GENEBANK号为FJ176780；登革2型病毒毒株名为DENV2 43，GENEBANK号为AF204178；登革3型病毒毒株名为DENV3 80-2，GENEBANK号为AF317645；登革4型病毒毒株名为DENV4 B5，GENEBANK号为AF289029)。以上病毒株的悬液分别接种单层BHK-21细胞，37℃培养3-7天后将病毒感染的细胞消化制成细胞悬液；将其滴加到处理好的镀膜细胞玻片孔内，放入湿盒中置37℃培养使细胞贴壁；用PBS缓冲液漂洗掉未贴壁的悬浮细胞，室温晾干玻片后放入预冷丙酮中进行固定，晾干玻片即得到登革1、3、4型病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒和森林脑炎病毒的病毒抗原片，-20℃密封保存。

实验例1-2间接免疫荧光检测

将1G6和对照单克隆抗体6E1加入不同登革病毒制备的抗原片孔中，放入湿盒中置37℃作用60min，然后病毒抗原片以PBS缓冲液振荡洗涤5min，室温晾干。在病毒抗原片上加入用0.02％伊文思兰溶液200倍稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗(中杉金桥公司产品)，湿盒中置于37℃作用30min，然后以PBS缓冲液振荡洗涤5min，室温晾干，荧光显微镜下观察结果。实验结果见图3-A。结果显示，1G6抗体特异性结合登革4型病毒。

实验例2免疫印迹检测

将登革1-4型病毒ED3区蛋白经10％SDS-PAGE电泳，将胶上蛋白转移至硝酸纤维素膜上。含10％脱脂奶粉的TBST缓冲液，4℃封闭过夜后，加入合适浓度的单克隆抗体1G6或对照抗体，室温孵育1h，用TBST缓冲液洗膜3次，每次10min。加入HRP标记的羊抗人IgG(1∶4000)，室温孵育1h，同样条件洗膜。最后化学发光法胶片显色。结果见图3-B。显示，单抗1G6特异性与登革4型病毒的ED3区结合。

实验例3不同血清型登革病毒ED3同1G6结合的间接ELISA

为检测1G6抗体是否可同时结合天然状态下的不同抗原，首先将1μg/ml浓度的不同血清型登革病毒ED3蛋白包被ELISA板，1G6杂交瘤上清分别加入到不同血清型ED3包被的ELISA孔中，与37℃孵育1h，洗涤后加入HRP标记的抗鼠二抗，继续孵育1h，再次洗涤后加入TMB底物溶液，最后用H₂SO₄终止反应，测定A450值。结果见图3-C。结果显示，单抗1G6在特异性与登革4型病毒ED3蛋白结合，不与其他三种血清型登革病毒ED3结合。

实施例4.抗体可变区基因克隆和序列测定

收集总数5×10⁶～1×10⁷个1G6杂交瘤细胞，用Trizol(InvitrogenCat.No.15596-026)法抽提其总RNA，根据小鼠抗体恒定区序列，设计引物如下：

LGSP1：5’TTgCTgTCCTgATCAgTCCAACT 3’

LGSP2：5’TgTCgTTCACTgCCATCAATCTT 3’

LGSP3：5’TTgTTCAAgAAgCACACgACTgA 3’

HGSP1：5’ACTgAgCTgCTCATAgTgTAgAg 3’

HGSP2：5’gACAgggATCCAgAgTTCCAA 3’

HGSP3：5’CAgAgTCACggAggAACCAg 3’

采用Invitrogen 5’RACE kit(Cat.No.18374-058)，分别以HGSP1，LGSP1为引物，合成第一链cDNA；在TdT(Invitrogen，美国)和dCTP(Invitrogen，美国)作用下，给第一链cDNA 3’端加poly C尾；分别以HGSP2、HGSP3和LGSP2、LGSP3为5’端引物，通过巢式PCR得到VH、VL的PCR产物；将PCR产物装入pGEM-T载体(Promega，美国)中；挑取克隆抽提质粒，限制性内切酶鉴定得到阳性克隆，通过测序确定其序列。1G6重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2；轻链可变区核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4。

实施例5.单克隆抗体1G6对登革4型病毒体内外中和保护活性实验

实验例5-1体外中和实验

利用BHK-21细胞感染登革病毒来检测单克隆抗体的体外中和作用。具体的说，先用BHK-21细胞检测登革病毒的滴度，首先用含2％FCS的细胞维持液将病毒原液10倍比稀释，然后将不同稀释度的病毒液加入细胞单层，37℃孵育1h。弃上清，加入含1％低熔点琼脂糖的DMEM细胞维持液，继续培养5天。显微镜下观察，细胞出现病变后，4％甲醛溶液固定细胞30min，弃上层琼盖，用去离子水清洗后，加入1％结晶紫染色30min，去离子水清洗后计数蚀斑数，病毒滴度用蚀斑形成单位(plaque form unit，PFU/ml)表示。

随后，进行抗体的蚀斑减少中和实验。具体地说，采用固定病毒稀释抗体的方法进行：将不同浓度单抗与含50-100PFU的登革4型病毒悬液等量混合，37℃水浴作用1h。将混合液加入培养于6孔板的BHK21细胞，37℃孵育1h，弃去混合液，用PBS缓冲液洗细胞。加入营养琼盖，继续培养5d后固定染色，计数蚀斑数，并计算抗体的中和活性(以PRNT₅₀表示)。实验结果见图4。1G6抗体的PRNT₅₀为1.52±0.63μg/ml。

实验例5-2乳鼠颅内中和实验

利用乳鼠颅内攻毒模型检测抗体的体内中和效价。具体地说，将不同浓度单抗与105PFU/ml的登革病毒等量混匀，37℃孵育1h。将病毒抗体混合液颅内接种1日龄昆明种乳鼠，每只约30μl，每个浓度接种1窝(9-12只)。每天观察和记录乳鼠发病和死亡情况，共观察3周，计算小鼠存活率。结果见图4。结果显示，未加单抗的阳性对照组乳鼠在病毒感染后第8天开始出现神经症状并死亡，14天后死亡率达100％。加低浓度单抗的实验组乳鼠尽管也出现相似的神经症状，但它们的死亡时间明显延迟，且随着抗体浓度的不断增加，乳鼠存活率显著提高。1G6在100μg/ml时保护60％的乳鼠免受致死剂量登革4型病毒的攻击(P＜0.001)，在20和4μg/ml时也能分别提供30％(P＜0.001)和10％的保护(P＜0.05)，提示1G6抗体在乳鼠体内具有良好的保护活性。

实验例5-3病毒吸附前后感染抑制实验

采用病毒吸附前后感染抑制实验来检测抗体是在病毒周期的哪个阶段发挥的中和作用。具体地说，将10³PFU/ml的登革病毒冰上吸附BHK21细胞前后的1h，分别加入不同浓度的单抗(1G6为0.8、4、20、100和500μg/ml)。在病毒吸附后，用预冷的PBS缓冲液洗掉未结合的病毒液，单抗再冰上孵育1h。所有细胞用预冷的PBS缓冲液洗数3次，加入营养琼盖，37℃继续培养5天。最后，固定染色，计数蚀斑，并计算病毒感染抑制率。结果见图5。结果显示，单抗1G6在病毒吸附前应用较之于吸附后应用，可更为显著地抑制病毒的感染(P＜0.05)。这表明E蛋白III区特异中和抗体1G6主要是通过抑制病毒与宿主细胞受体的吸附来发挥其中和作用的。

实施例6单克隆抗体166对登革4型病毒体内治疗实验

进一步采用乳鼠颅内攻毒模型检测单克隆抗体1G6对登革4型病毒感染后的治疗效果。具体的说，首先经脑内途径接种104PFU/ml的登革病毒，分别于感染4和24h后再经腹腔途径注射单剂量50μg的单抗，观察和记录乳鼠发病和死亡情况共3周，计算小鼠存活率。结果见图6。在病毒感染4和24小时后注射抗体的乳鼠可分别存活90％(P＜0.001)和30％(P＜0.05)，与阳性对照组比较，它们之间存在显著性差异。这表明1G6单抗在乳鼠感染登革4型病毒后同样具有较好的被动治疗效果。

实施例7.单克隆抗体1G6抗原表位的鉴定实验

实验例7-1采用随机12肽库免疫淘选法，整个过程在96孔板上进行。单克隆抗体1G6100ug/ml，100ul/孔4℃包被过夜，10％脱脂奶粉(TBST稀释)封闭过夜，1×TBST(Tween-20 0.1％)洗涤6次；噬菌体随机肽库(购自NEB，Ph.D.-12^TM Phage Display Peptide Library Kit)2×10¹¹pfu+100ul TBS，室温轻摇1小时。1×TBST(Tween-20 0.1％)、1×TBST(Tween-20 0.3％)、1×TBST(Tween-20 0.5％)分别洗涤5次；用含1mg/ml BSA的Glycine-Cl PH 2.2洗脱，室温轻摇15分钟，15ul Tris-Cl PH 9.1中和。10ul用于测滴度，其余用于扩增。扩增产物经PEG/NaCl沉淀，测滴度，同时进行第二轮淘选，相同过程进行第三轮淘选后挑取单克隆鉴定。结果见图7-A。

实验例7-2噬菌体测序及序列分析

M13噬菌体单链DNA提取试剂盒(OMEGA公司)制备模版，测序引物为M13-96引物，其序列为：5′-GCC CTC ATA GTT AGC GTA ACG-3′。Chromas读取序列，30个阳性克隆有7个独立序列；AlignX分析，结果显示有一致序列YLTMH(见图7-B)。在抗原登革4型病毒包膜E蛋白序列上，可以找到其同源基序，由此可见，1G6的可能抗原表位为：LTLH。

实验例7-3单克隆抗体1G6的表位缺失突变验证

为进一步验证所得该抗原表位对于抗体结合的重要性，将ED3蛋白由C末端以每5aa间隔进行系列缺失突变，以免疫印迹法对1G6的结合活性进行检测。结果显示，当将包含此表位区域的5aa进行缺失突变后，1G6的结合活性丧失，将此段区域恢复后，结合活性也随之回复。表明我们采用噬菌体技术筛选获得的表位区域对于单抗1G6的结合是关键性的(见图8)。

实验例7-4单克隆抗体1G6表位的特异性分析

由于单克隆抗体1G6与登革4型病毒特异结合，说明该抗体在E蛋白上拥有一个特异的抗原表位。为了进一步分析其结合特异性的原因，我们分别对四种血清型登革病毒ED3蛋白的一级结构和三级结构进行了比较。结果见图9。在四型登革病毒ED3的氨基酸序列比对上，LTLH序列在不同血清型登革病毒间是不保守的。在空间结构上，首先通过Discovery Studio 2.0软件将4种血清型登革病毒ED3蛋白结构进行重叠分析，显示四种血清型登革病毒ED3具有相同的骨架区，在单抗1G6的表位区域，由387LTLH390位氨基酸形成一个线性表位，暴露在登革病毒E蛋白III区的表面。进一步将表位区域结构进行放大后观察，我们发现，在H390位，存在一个与其它3种血清型病毒都不相同的咪唑环结构，其侧链氨基酸的空间位置决定了单抗1G6的特异性基础。

实验例7-5单克隆抗体1G6表位在29株不同基因型病毒株中的保守性分析

登革4型病毒根据基因的进化关系又分为3个不同的基因型，研究发现，同一血清型不同基因型病毒株之间的氨基酸位点差异会极大影响抗体的结合和中和能力。为此，我们比对了29株不同登革4型病毒株的ED3蛋白氨基酸序列，见图10。比对分析结果发现，1G6抗体结合区域在登革4型病毒同一血清型不同基因型病毒株间是高度保守的。结合至高度保守的中和表位区域，使它具有可中和登革4型病毒所有基因型病毒株的潜力。

实施例8中和抗体结合关键位点的确定

为了进一步明确1G6结合表位的关键氨基酸位点，我们采用定点突变技术，分别对表位区域的4个氨基酸位点进行单一或组合突变，然后利用ELISA的方法检测不同位点的氨基酸突变对1G6结合的影响。结果见图11。根据ELISA结合曲线进行亲和力计算，与未突变蛋白相比，单独突变T388和H390位氨基酸仅能将抗体亲和力降低10倍左右，但组合突变后抗体的结合活性却完全丧失，表明T388和H390位对登革病毒特异性单抗1G6与登革病毒的结合是必需的，充分表明T388和H390位是抗体与E蛋白结合的关键位点，并证明了氨基酸残基之间存在协同作用，单抗1G6同登革4型病毒的结合是由T388和H390位氨基酸共同决定的。

实施例9单克隆抗体1G6表位同已有中和抗体表位的空间位置关系

目前，针对登革4型病毒的中和表位研究甚少，针对E蛋白III区的型特异中和抗体和表位尚未见报道；仅有3株交叉反应性中和抗体分别为4E11、9F12和9D12。为了进一步验证揭示单抗1G6的表位是否全新表位以及与已有中和抗体表位的空间位置关系，我们在登革4型病毒ED3蛋白晶体结构上模拟了不同中和表位的相对位置，结果见图12。结果显示，3株交叉反应性抗体的中和表位氨基酸相互重叠，主要集中在305-312位氨基酸区域，而单抗1G6的表位有2个非关键氨基酸L387和L389与之重叠，但T388和H390位关键氨基酸残基位于已有中和表位区域的外周，可见，我们所发现的单抗1G6的中和表位是全新的。

Claims (8)

1.一种登革4型病毒ED3的中和表位LTLH。

2.一种特异性中和抗体，其特征在于与权利要求1所述的登革4型病毒ED3的中和表位LTLH结合。

3.权利要求2所述的特异性中和抗体，为抗登革4型病毒特异性中和抗体。

4.权利要求3所述的特异性中和抗体，为抗登革4型病毒ED3的单克隆抗体1G6。

5.权利要求4所述的抗登革4型病毒ED3的单克隆抗体1G6，其重链、轻链可变区和氨基酸序列分别为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4。

6.一种核酸分子，编码权利要求1所述的抗登革4型病毒ED3的单克隆抗体1G6。

7.权利要求6所述的核酸分子，其中编码重链可变区的核酸分子为SEQ IDNO：1，编码轻链可变区的核酸分子为SEQ ID NO：3。

8.权利要求2～5任一所述的特异性中和抗体在制备治疗登革4型病毒感染药物中的应用。

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