JP6830118B2 - ワクチン組成物 - Google Patents

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Description

本発明は、ワクチン組成物および、デング病(dengue disease)に対してヒト対象を保護する方法における該組成物の使用に関する。
デング病(Dengue)は、マラリアに次いで２番目に重要な感染性の熱帯病であり、世界の人口の約半数が、伝染流行の危険がある地域に住んでいる。毎年デング病は、５０００万〜１億例発症し、５００，０００人の患者がデング出血熱（ＤＨＦ: dengue hemorrhagic fever）で入院し、約２５，０００人が死亡していると推定される。
デング感染症は、１００を超える熱帯国で流行しており、デング出血熱（ＤＨＦ）は、これらの国のうちの６０で発症していることが示されている(Gubler, 2002, TRENDS in Microbiology, 10: 100-103)。
デング病は、抗原性が異なるが、近縁である、４つのデングウイルス血清型のフラビウイルス属により引き起こされる(Gubler et al., 1988, in: Epidemiology of arthropod-borne viral disease. Monath TPM, editor, Boca Raton (FL): CRC Press: 223-60; Kautner et al., 1997, J. of Pediatrics, 131 : 516-524; Rigau-Perez et al., 1998, Lancet, 352: 971-977; Vaughn et al., 1997, J. Infect. Dis., 176: 322-30)。
デング病は、通常、ウイルスに感染したネッタイシマカ (Aedes aegypti)による血液摂取(blood meal)の間にデングウイルスが注入されることにより伝染する。４〜１０日間の潜伏期間の後、該疾患は急激に発症し、以下の３つのフェーズが見られる: 発熱期（２〜７日間）、重症期(critical phase)（２４〜４８時間−この間に重度の合併症が発症し得る）および回復期（４８〜７２時間）。重症期の間、重篤な合併症、例えば出血、ショックおよび急性臓器機能障害を発症し得る。これらの予測できない予後を適切に管理することができれば、致死率を低下させることができる。デング病の治療は、７〜１０日後には完了するが、通常無力症がその後も継続する。白血球および血小板数の減少もしばしば観察される。
デング出血熱(ＤＨＦ)は、デングウイルス感染症の、致死的である可能性のある合併症である。ＤＨＦは、高熱とデング病の症候により特徴づけられるが、極度の傾眠および嗜眠を伴う。血管透過性の上昇および恒常性異常により、血液量の低下、低血圧、ならびに、重症の場合には、血液量減少性ショックおよび内出血が引き起こされ得る。ＤＨＦの発症には２つの要因−高レベルのウイルス血症を伴う急速なウイルス複製(該疾患の重症度は、ウイルス血症のレベルと相関する、Vaughn et al., 2000, J. Inf. Dis., 181: 2-9))および高レベルの炎症性メディエーターの遊離を伴う熾烈な炎症応答 (Rothman and Ennis, 1999, Virology, 257: 1-6; Alan L. Rothman. 2011, Nature Reviews Immunology, 11: 532-543)が重要な役割を果たしていると考えられている。処置をしない場合、ＤＨＦの死亡率は１０％に達し得るが、処置ができる場合、ほとんどの施設において、死亡率は＜１%である。
デング性ショック症候群(ＤＳＳ) は、ＤＨＦの一般的な進行したものであり、致死的であることがしばしばある。ＤＳＳは、血管外空間への血漿漏出を引き起こす全身性脈管炎より起こる。ＤＳＳは、頻脈、拍出量低下、低血圧、四肢冷感および不穏状態により特徴付けられる。
アジアでは、ＤＨＦおよびＤＳＳは主に児童において見られ、ＤＨＦの約９０％は、１５歳未満の児童で発症している(Malavige et al., 2004, Postgrad Med. J., 80: 588−601; Meulen et al., 2000, Trop. Med. Int. Health, 5:325−9)。対照的に、カリブ海地域および中央アメリカにおける流行では、主に大人が感染している (Malavige et al., 2004, Postgrad Med. J., 80: 588−601)。
４つの血清型のデングウイルスは、約６０〜８０％の配列相同性を示す。１つのデングウイルス血清型に感染することにより、長期間維持される同種免疫がもたらされるが、もたらされる異種免疫は限定的なものである(Sabin, 1952, Am. J. Trop. Med. Hyg., 1: 30-50)。したがって、１つの血清型のデングに感染した個体が、その後、異なる血清型に感染することもあり得る。以前は、ＤＨＦを示す患者の大部分が、それよりも前に４つのデングウイルスの血清型のうち他のものの少なくとも１つに曝されていたため、異なるデングウイルス血清型による二度目の感染は、ＤＨＦの発症の危険因子であると理論上考えられていた。
これまでのところ、デング病に対する特異的な処置は存在しない。デング病の処置は対症的であって、床上安静、解熱剤および鎮痛剤による熱および痛みの抑制ならびに適量の水分摂取(adequate drinking)を伴う。ＤＨＦの処置には、水分損失のバランスをとること、凝固因子の補充およびヘパリンの注入が必要である。
蚊の駆除および咬傷からの個人的防御のようなデング予防処置は、効果が限定的であり、実施が困難で高価であるため、安全で有効なデングワクチンが、予防の最良の方法であると考えられる。しかし、現在利用可能なこの種類のワクチンで承認を受けているものは存在しない。
Gubler, 2002, TRENDS in Microbiology, 10: 100-103 Gubler et al., 1988, in: Epidemiology of arthropod-borne viral disease. Monath TPM, editor, Boca Raton (FL): CRC Press: 223-60 Kautner et al., 1997, J. of Pediatrics, 131 : 516-524 Rigau-Perez et al., 1998, Lancet, 352: 971-977 Vaughn et al., 1997, J. Infect. Dis., 176: 322-30 Vaughn et al., 2000, J. Inf. Dis., 181: 2-9 Rothman and Ennis, 1999, Virology, 257: 1-6 Alan L. Rothman. 2011, Nature Reviews Immunology, 11: 532-543 Malavige et al., 2004, Postgrad Med. J., 80: 588−601; Meulen et al., 2000, Trop. Med. Int. Health, 5:325−9 Malavige et al., 2004, Postgrad Med. J., 80: 588−601
したがって、デング病に対してヒト対象を保護する方法にて用いた場合に有効性を示すワクチン組成物を開発することが望ましい。
本発明は、デング病に対してヒト対象を保護する方法で使用するためのワクチン組成物であって：
(i) 以下の(a)〜(e)からなる群から選択されるデング抗原:
(a) 弱毒化生デングウイルス;
(b) 不活化デングウイルス;
(c) 弱毒化生もしくは不活化キメラデングウイルス;
(d) デングウイルス様粒子 (ＶＬＰ); および
(e) (a)〜(d)の２つ以上の組合せ;
または
(ii) デングＶＬＰであるデング抗原をヒト細胞中で発現させることのできる核酸構築物またはウイルスベクター
を含む、組成物に関する。
本発明はさらに、デング病に対してヒト対象を保護するための医薬の製造のための本発明のワクチン組成物の使用に関する。
本発明はさらに、デング病に対してヒト対象を保護する方法であって、該ヒト対象に本発明の組成物を有効量投与することを含む、方法に関する。
さらに、本発明は、本発明の組成物および該組成物をデング病に対してヒト対象を保護する方法に用いるための使用説明書を含むキットに関する。
ＲＴ−ＰＣＲおよびクローニングによるＹＦ−ＶＡＸ ｃＤＮＡの構築を示す。
定義
本明細書中で用いる「デング病(Dengue disease)」という語は４つのデングウイルス血清型のいずれか１つの感染後の個体が示す臨床症候を指す。１９７０年以来、臨床的なデング病は、世界保健機関のガイドラインにしたがって、（ｉ）デング熱または（ｉｉ）デング出血熱に分類される (World Health Organization. Dengue hemorrhagic fever: Diagnosis, treatment, prevention and control 2nd Ed. Geneva: WHO, 1997; ISBN 92 4 154500 3)。２００９年、WHOは、臨床的なデング病を、 (i) 危険信号を伴うもしくは伴わないデング病または(ｉｉ) 重度のデング病に分類する新しいガイドラインを発行した。両方の分類が、Srikiatkachorn et al., Clin. Infect. Dis. (2011) 53(6): 563の図１および２に示されている。先の分類によれば、デング熱は、頭痛、関節痛、後眼窩痛、発疹、筋肉痛、出血性の症状および白血球減少症から選択される少なくとも２つの症候によって特徴づけられ、支持的な血清検査または確認された他のデング症例と同じ場所および時間での発症であることを伴う。デング出血熱への進行は、熱、出血性の症状、血小板減少症および血漿漏出の証拠が全て観察された場合に確認される。最近の分類によれば、デング病と診断するためには、発熱ならびに、悪心、嘔吐、発疹、疼痛(ache)および痛み(pain)、駆血帯試験陽性または、腹痛および圧痛、持続性の嘔吐、臨床的な体液貯留、粘膜出血、傾眠または不穏状態、２cmを超える肝臓の肥大または血小板数の急速な減少と同時発生する、ヘマトクリットの増加から選択されるいずれかの危険信号が必要とされる。以下のいずれかが発症した場合、重度のデング病と診断される：ショックまたは呼吸促迫を引き起こす血漿漏出、医師の評価による重度の出血または重度の臓器合併症。
本明細書中で用いる「デング出血熱」もしくは「ＤＨＦ」という語は、発熱、出血性の症状、血小板減少症および血漿漏出の証拠が全て観察される、ウイルス学的に確認されるデング病を指す。本明細書中では、ＤＨＦは、その重症度に基づいてさらに定義されていてもよい。例えば、ＤＨＦは、グレードＩ、グレードＩＩ、グレードＩＩＩまたはグレードＩＶと定義し得る(World Health Organization. Dengue hemorrhagic fever: Diagnosis, treatment, prevention and control 2nd Ed. Geneva: WHO, 1997; ISBN 92 4 154500 3)。グレードＩは、非特異的な体質性症候を伴う発熱として定義され；出血性症候は、臍帯血試験が陽性である、および／またはあざができやすいことのみを指す。グレードＩＩは、グレードＩの患者の症状に加えて、通常皮膚もしくは他の出血として見られる、特発性の出血として定義される。グレードＩＩＩは、皮膚の冷湿化と不穏状態を伴う、速く弱い脈拍と脈圧の狭小化または低血圧によって起こる循環不全として定義される。グレードＩＶは、血圧または脈拍が検出できない、重度のショックとして定義される。当業者には理解されることであるが、本発明の実施、例えばＤＨＦに対する保護方法において、該ＤＨＦはウイルス学的に確認されるものでなくてもよい。
本明細書中にて用いる、「ウイルス学的に確認されるデング病」という語は、デングウイルスによって誘発されたものであることが、例えば逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ：reverse transcriptase polymerase chain reaction）またはデングのＮＳ１(non-stractural １)蛋白質の酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)によって確認された、急性の発熱性エピソードを指す。ＲＴ−ＰＣＲ法において、血清試料は、Callahan et al, J. Clin. Microbiol. (2001) 39: 4119に記載の方法にしたがって、試験される。端的には、市販のキットを用いて、ＲＮＡを血清から抽出し、含まれている可能性のあるＴａｑポリメラーゼ阻害因子または緩衝因子を除去する。その後、デングのＮＳ５遺伝子配列由来の、血清型特異的なプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ反応を行う。結果は、プラスミドに取り込んだウイルスのゲノム血清型特異的な核酸配列を既知の濃度で含む標準との比較により、濃度（log１０GEQ (genome equivalent)/mL）として表す。ＥＬＩＳＡ法では、患者の血清、陽性対照、陰性対照またはカットオフ対照５０μlを、試料希釈液で１：２に希釈し、希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−標識した抗ＮＳ１モノクローナル抗体（ＭＡｂ）１００μlと結合させる。希釈血清および結合体を、キャプチャー抗ＮＳ１ ＭＡｂでコーティングしたマイクロウェルに添加し、プレートを３７℃にて９０分間インキュベーションした。血清中にＮＳ１が存在する場合、キャプチャーMAb/NS１/HRP標識MAb複合体が形成される。陽性のウェルでは、複合体は、３,３’,５,５’テトラメチルベンジジン (TMB)基質１６０μLを添加し、室温、暗所にて３０分間インキュベーションすることにより誘発される発色反応により検出する。かかる反応を、停止溶液(１N Ｈ２ＳＯ４)１００μｌを添加することによって停止し、プレートを読み取る。試料の比率は、各試料について、試験試料の平均光学密度（ＯＤ）をカットオフ対照の平均ＯＤで割ることによって決定する（４つ組みにて試験）。＜０.５、０.５〜＜１.０および≧１の試料比率は、それぞれ、結果が、陰性、疑わしいおよび陽性であることを示す。
本明細書中で用いる、「重度のウイルス学的に確認されるデング病」という語は、１９９７年のWHOの分類により定義され、さらに、以下の一連の症候により特徴付けられるデング出血熱(ＤＨＦ)を指す：輸血を必要とする出血、毛細血管透過性の客観的な根拠、循環不全の徴候または内臓の症状。
本明細書中で用いる、「デング性ショック症候群」という語は、上述のＤＨＦの最も重症の合併症を指す。１９９７年のＷＨＯの分類によれば、ＤＳＳは、グレードＩＩＩおよびＩＶのＤＨＦに相当する。
「デング熱ウイルス」、「デングウイルス」および「ＤＥＮ」という語は互換可能に用いる。これらの語は、フラビウイルス科のフラビウイルス属に属する（＋）鎖一本鎖ＲＮＡウイルスを指す。デングウイルスには４つの異なる血清型（血清型１、２、３および４）があり、これらは約６０〜８０％の配列相同性を示す。ゲノムの構成は以下の要素を含む：５’非翻訳領域(ＮＣＲ)、構造蛋白質をコードする領域(キャプシド (Ｃ)、プレメンブレン(ｐｒＭ) およびエンベロープ (Ｅ)) および非構造蛋白質をコードする領域(ＮＳ１−ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５) ならびに３’ＮＣＲ。デングウイルスゲノムは、翻訳後プロセシングを受ける単一のポリ蛋白質に翻訳される、非中断コード領域（uninterrupted coding region）をコードする。
本発明の文脈において、「ワクチンデングウイルス(vaccinal dengue virus)」は、該ワクチンデングウイルスを免疫適格性の対象に投与することによって、該ワクチンデングウイルスが由来するデングウイルス血清型に対する中和抗体を誘発し得るウイルスを指す。本発明の方法で使用し得るワクチンデングウイルスの例としては、不活化デングウイルス、弱毒化生デングウイルスおよび弱毒化生もしくは不活化キメラデングウイルスが挙げられる。本発明で使用するワクチンデングウイルスの血清型は、血清型１、２、３および４を含む。好ましくは、本発明で用いるワクチンデングウイルスは、弱毒化生キメラデングウイルスである。
本明細書中で用いる「不活化ウイルス」という表現は、相当する野生型のウイルスの複製が許容される細胞において、有意な程度の複製をすることができないウイルスを指す。ウイルスは、当業者に公知の多数の方法で不活化し得る。ウイルスの不活化方法の例としては、化学処理または放射線照射処理（熱照射または電磁放射を含み、典型的にはＸ線または紫外線照射の形態である）が挙げられる。
本明細書中で用いる「不活化デングウイルス」という語は、デングウイルスの構造蛋白質全て(エンベロープ（ｅｎｖ）、プレメンブレン／メンブレンおよびキャプシド蛋白質) および不活化ウイルスＲＮＡを含む、不活化した野生型ウイルスを指す。不活化デングウイルスはまた、不活化キメラデングウイルスを指していてよい。不活化デングウイルスは、例えば、米国特許第６,２５４,８７３号に記載されている。
本明細書中で用いる用語「弱毒化生ウイルス」または「ＬＡＶ」は、相当する野生型のウイルスに関連するのと同一の一連の症候によって特徴づけられる病態を誘発することのできないウイルスを指す。弱毒化生ウイルスの例は、当該分野でよく知られている。弱毒化生ウイルスは、野生型ウイルスから、例えば組み換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、遺伝子操作、複製能のある細胞における連続的な継代、化学的変異誘発処理、または電磁放射により作成し得る。
本明細書中で用いる、「弱毒化生デングウイルス」という語は、毒性の減弱および相当する野生型デングウイルスに関連する同一の一連の症候によって特徴付けられる病態を誘発することができなくなるようにする遺伝子修飾によって、毒性野生型デングウイルスから得られる生デングウイルスを指す。本発明を実施する上で有用な弱毒化生デングウイルスの例としては、ＶＤＶ-１、ＶＤＶ−２および例えば、国際公開第０２/６６６２１号、第００/５７９０４号、第００/５７９０８号、第００/５７９０９号、第００/５７９１０号、第０２/０９５００７５号および第０２/１０２８２号に記載されている株が挙げられる。本発明の方法に使用し得る血清型１の弱毒化生デングウイルスとしては、ＶＤＶ-１が挙げられる。本発明の方法で使用し得る本発明の弱毒化生ウイルスとしては、ＶＤＶ−２およびＬＡＶ−２が挙げられる。
「ＶＤＶ」および「ベロデングワクチン」という語は、本明細書中で互換可能に用いられ、Ｖｅｒｏ細胞で複製可能であり、ヒトにおいて、中和抗体の誘発を含む特定の体液性応答を誘発することのできる、弱毒化生デングウイルスを指す。
ＤＥＮ−１ １６００７/ＰＤＫ１３株は、「ＬＡＶ１」とも称され、ＰＤＫ（primary dog kidney）細胞で１１回の継代を行った野生型ＤＥＮ−１ (dengue virus serotype １) １６００７株 (ＤＥＮ−１ １６００７/ＰＤＫ１１)に由来する。ＬＡＶ１は、欧州特許出願公開第１ １５９９６８号（Mahidol University）に記載されており、National Microorganisms Cultures Collection (CNCM)に第I-２４８０号として提出されている。「ＶＤＶ-１」は、続けてＶｅｒｏ細胞に適用することによって、ＬＡＶ１から得られるウイルスであり; このとき、Ｖｅｒｏ細胞に遺伝子導入する前に、ＬＡＶ１からＲＮＡを抽出し、精製する。該ＶＤＶ-１株は、続けて、プレート精製およびＶｅｒｏ細胞中で増幅を行うことにより得られる。該ＶＤＶ-１株は、ＤＥＮ−１ １６００７/ＰＤＫ１３株 (ＰＤＫ細胞で１３回継代)と比較してさらに１４の変異を有する。ＶＤＶ-１株を作成し、特徴付ける方法は、国際公開第０６/１３４４３３号（Sanofi-Pasteurおよびthe Center for Disease Control and Prevention）に記載されている。
ＤＥＮ−２ １６６８１/ＰＤＫ５３株は、「ＬＡＶ２」としても知られ、ＰＤＫ細胞で５０回の継代を行った野生型株ＤＥＮ−２ (dengue virus serotype ２) １６６８１系(ＤＥＮ−２ １６６８１/ＰＤＫ５０)より得られる。ＬＡＶ２は、欧州特許第１１５９９６８号（Mahidol University）に記載されており、National Microorganisms Cultures Collection (CNCM)に第１-２４８１号として申請されている。「ＶＤＶ−２」は、次いで、Ｖｅｒｏ細胞に適用することにより得られるＬＡＶ−２由来の株であり; このとき、Ｖｅｒｏ細胞に遺伝子導入する前に、ＬＡＶ２からＲＮＡを抽出し、精製する。該ＶＤＶ−２株は、続いて、Ｖｅｒｏ細胞でのプレート精製および増幅を行うことにより得られる。該ＶＤＶ−２株は、ＤＥＮ−２ １６６８１/ＰＤＫ５３株 (ＰＤＫ細胞で５３回継代)と比較して、４つのサイレント変異を含む、さらに１０の変異を有する。ＶＤＶ−２株を作成し、特徴付ける方法は、国際公開第０６/１３４４４３号 （Sanofi-Pasteuおよびthe Center for Disease Control and Prevention）に記載されている。ＶＤＶ−２株の完全な核酸配列は、配列番号２４に記載する通りである。ＶＤＶ−２株のＭ蛋白質の配列は、配列番号２７に示し、ＶＤＶ−２株のＥ蛋白質の配列は、配列番号２６に示す。
ＶＤＶ １および２株は、Ｖｅｒｏ細胞中で増幅により作成する。産生されたウイルスを回収し、濾過により細胞の残屑を除く。ＤＮＡを酵素処理により消化する。不純物を限外濾過により除去する。感染力価は、濃縮法により上昇させ得る。安定剤を添加した後、該株を使用するまで凍結乾燥または凍結形態で保存し、必要な場合は元に戻す。
本発明の文脈において、「デングキメラもしくはキメラデングウイルス」は、遺伝子骨格が、レシピエントフラビウイルスのｐｒＭおよびＥ蛋白質のコード配列を、デングウイルスの相当する配列に置きかえることによって修飾されているレシピエントフラビウイルスを指す。典型的には、レシピエントフラビウイルスは、弱毒化してよい。該レシピエントフラビウイルスは、黄熱（ＹＦ）ウイルス、例えば弱毒ＹＦ １７Ｄ、ＹＦ １７ＤＤおよび ＹＦ １７Ｄ２０４ (ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）) ウイルスであってよく; その場合、該キメラは、ＹＦ／デングキメラと称される。該レシピエントフラビウイルスはまた、デングウイルスであってもよく、その場合、デング／デングキメラと称され、ｐｒＭおよびＥ蛋白質のデングウイルス血清型特性は、遺伝子骨格のレシピエントデングウイルス血清型特性と同一であっても異なっていてもよい。血清型が同一である場合、レシピエントのデングウイルスとｐｒＭおよびＥ蛋白質のコード配列が由来するデングウイルスは、同一の血清型の２つの異なるウイルス株である。本発明で使用する際、キメラデングウイルスは、典型的にはＹＦ／デングキメラである。キメラデングウイルスは、好ましくは不活化されているかもしくは弱毒化生デングウイルスである。本発明の弱毒化生キメラデングウイルスのレシピエントウイルスは、有利には、ＹＦ １７ＤまたはＹＦ １７Ｄ２０４である。実施態様の一によれば、デングキメラは不活化ウイルスである。他の実施態様によれば、デングキメラは弱毒化生ウイルスである。本発明の保護方法で使用し得るデングキメラとしては、ChimerivaxTM Dengue Serotype１ (ＣＹＤ−１としても知られる)、ChimerivaxTM Dengue Serotype ２ (ＣＹＤ−２としても知られる)、ChimerivaxTM Dengue Serotype３ (ＣＹＤ−３としても知られる) およびChimerivaxTM Dengue Serotype４ (ＣＹＤ−４としても知られる)が挙げられる。
本発明を実施するのに有用なキメラデングウイルスの例としては、国際公開第９８/３７９１１号に記載のデング／ＹＦキメラウイルスおよび、例えば国際公開第９６/４０９３３号および第０１/６０８４７号に記載されているような、デング／デング熱キメラウイルスが挙げられる。
実施態様の一において、キメラＹＦ／デングウイルスは、弱毒化黄熱ウイルス株ＹＦ１７Ｄのゲノム骨格を含み(Theiler M. and Smith H.H., 1937, J.Exp.Med., 65. 767-786)、例えばＹＦ１７Ｄ/ＤＥＮ−１、ＹＦ１７Ｄ/ＤＥＮ−２、ＹＦ１７Ｄ/ＤＥＮ−３およびＹＦ１７Ｄ/ＤＥＮ−４ウイルスが挙げられる。使用し得るＹＦ１７Ｄ株の例としては、ＹＦ１７Ｄ２０４ (ＹＦ−ＶＡＸ(R), Sanofi-Pasteur, Swiftwater, PA, USA; Stamaril(R), Sanofi-Pasteur, Marcy I'Etoile, France; ARILVAX(TM), Chiron, Speke, Liverpool, UK; FLAVIMUN(R), Berna Biotech, Bern, Switzerland; ＹＦ１７Ｄ-２０４ France (Ｘ１５０６７、Ｘ１５０６２); ＹＦ１７Ｄ-２０４,２３４ US (Rice et al., 1985, Science, 229: 726-733)または関連株ＹＦ１７ＤＤ (Genbankアクセス番号Ｕ１７０６６)、ＹＦ１７Ｄ-２１３ (Genbank アクセス番号Ｕ１７０６７)およびGaller et alに記載のＹＦ１７ＤＤ (1998, Vaccines, 16(9/10): 1024-1028)が挙げられる。
本発明の実施に使用するための特に適当なキメラデングウイルスの一例は、「Chimerivaxデングウイルス」である。本明細書において、「Chimerivaxデングウイルス」は、プレメンブレン (ｐｒＭ) およびエンベロープ(Ｅ) 蛋白質をコードする核酸配列が、デングウイルスの相当する構造蛋白質をコードする核酸配列に置きかえられたＹＦ１７ＤまたはＹＦ１７Ｄ２０４ (ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）) ウイルスのゲノム骨格を含む弱毒化生ＹＦ／デングウイルスである。本発明で用いるのに好ましいキメラデングウイルスは、プレメンブレン（ｐｒＭ）およびエンベロープ（Ｅ）蛋白質をコードする核酸配列が、デングウイルスの相当する構造蛋白質をコードする核酸配列に置きかえられたＹＦ１７Ｄウイルスのゲノム骨格を含む、弱毒化生キメラＹＦ／デングウイルスである。本発明で用いるのに好ましいキメラデングウイルスは、プレメンブレン（ｐｒＭ）およびエンベロープ（Ｅ）蛋白質をコードする核酸配列が、相当するデングウイルスの構造蛋白質をコードする核酸配列に置きかえられた、ＹＦ１７Ｄ２０４ (ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）) ウイルスのゲノム骨格を含む、弱毒化生キメラＹＦ／デングウイルスである。該Chimerivaxウイルスの構築は、Chambers, et al. (0999, J.Virology 73(4):3095-3000)の記載にしたがって、もしくは実質的にしたがって達成してよい。実施例に記載の具体的なChimerivax (ＣＹＤ) デングウイルスは、ＤＥＮ １ ＰＵ０３５９ (ＴＹＰ１ １４０)、ＤＥＮ２ ＰＵＯ２１８、ＤＥＮ３ ＰａＨ８８１/８８およびＤＥＮ ４ １２２８ (ＴＶＰ ９８０) 株のｐｒＭおよびＥ配列ならびにＹＦ１７Ｄウイルスのゲノム骨格を用いて作成した。かかる具体的なChimerivax株は、本明細書中において、それぞれ、「ＣＹＤ−１」、「ＣＹＤ−２」、「ＣＹＤ−３」および「ＣＹＤ−４」と称する (実施例参照) 。これらの具体的なＣＹＤ−１、ＣＹＤ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４株の作成は、国際公開第９８/３７９１１号、第０３/１０１３９７号、第０７/０２１６７２号、第０８/００７０２１号、第０８/０４７０２３号および第０８/０６５３１５号に詳述されており、引用によって、その製造方法の正確な記述としてよい。あるいは、他のデング熱ウイルス株を、本発明の実施に有用なキメラウイルスの構築、例えば他のＣＹＤ−１(Chimerivax dengue serotype 1)、ＣＹＤ−２(Chimerivax dengue serotype 2)、ＣＹＤ−３(Chimerivax dengue serotype 3) およびＣＹＤ−４(Chimerivax dengue serotype 4)株の構築を促進するための核酸源として用いてよい。本発明のワクチン組成物、例えば、血清型２のキメラデングウイルスは有利に、実施例に記載するように、ＬＡＶ−２、ＢＩＤ−Ｖ５８５、ＰＲ/ＤＢ０２３またはＭＤ１２８０の血清型２株由来のｐｒＭ−Ｅ配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるｐｒＭ−Ｅ配列を含んでいるか、または、配列番号２に示すｐｒＭ−Ｅ配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるｐｒＭ−Ｅ配列を含んでいてよい。本発明の方法で使用するためのワクチン組成物、例えば血清型２のキメラデングウイルスは、実施例で記載するように、ＬＡＶ−２、ＢＩＤ−Ｖ５８５、ＰＲ/ＤＢ０２３またはＭＤ１２８０の血清型２株のｐｒＭ−Ｅ配列または、配列番号２からのｐｒＭ−Ｅ配列を有利に含んでいてよい。該キメラデングウイルスのレシピエントのゲノム骨格がＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）由来である場合、該株は、本明細書中において、ＣＹＤ−ＬＡＶ、ＣＹＤ−ＢＩＤ、ＣＹＤ−ＰＲおよびＣＹＤ−ＭＤと称する。血清型２株のＬＡＶ−２ (配列番号 ８)、ＢＩＤ−Ｖ５８５ (配列番号９)、ＰＲ/ＤＢ０２３ (配列番号１０)、ＭＤ１２８０ (配列番号１１) または配列番号２のｐｒＭ−Ｅ配列を用いて作成した、またはＬＡＶ−２、ＢＩＤ−Ｖ５８５、ＰＲ/ＤＢ０２３、ＭＤ１２８０の血清型２株由来のｐｒＭ−Ｅ配列または配列番号２から由来のｐｒＭ−Ｅ配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるｐｒＭ−Ｅ配列を用いて作成した、血清型２のキメラデングウイルスを含む本発明のワクチン組成物は、本発明によるワクチン組成物において、ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４と有利に組み合わせて用いてよい。
本発明の保護方法において使用し得るキメラデングウイルスの他の実施態様は、遺伝子骨格が、(i) レシピエントフラビウイルスのＥ蛋白質のコード配列が、デングウイルスの相当する配列に置きかえられた、および(ii) レシピエントフラビウイルスのｐｒＭ蛋白質のコード配列が、非デングフラビウイルス、例えばＪＥＶウイルスの相当する配列に置き変えられたことによって修飾を受けた、レシピエントウイルスである。典型的には、該キメラウイルスは、弱毒化生ウイルスまたは不活化ウイルスであってよい。該キメラデングウイルスの例は、国際公開第２０１１/１３８５８６号に記載されている。
本発明のワクチン組成物に用いるための血清型１のワクチンデングウイルスは、例えば、ＶＤＶ１、ＣＹＤ−１株、またはＤＥＮ−１ １６００７/ＰＤＫ１３株のｐｒＭおよびＥアミノ酸配列を含む、ＹＦ１７Ｄ/ＤＥＮ−１キメラウイルスであってよい。本発明の方法で使用するための血清型２のワクチンデングウイルスは、株ＶＤＶ２、ＣＹＤ−２、ＤＥＮ−２ １６６８１/ＰＤＫ５３株のｐｒＭおよびＥアミノ酸配列を含むＹＦ１７Ｄ/ＤＥＮ−２キメラウイルス、ＤＥＮ−２株ＬＡＶ−２、ＢＩＤ−Ｖ５８５、ＰＲ/ＤＢ０２３またはＭＤ１２８０のｐｒＭおよびＥアミノ酸配列を含むキメラウイルスまたは、血清型２株ＬＡＶ−２、ＢＩＤ−Ｖ５８５、ＰＲ/ＤＢ０２３またはＭＤ１２８０由来のｐｒＭ−Ｅ配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるｐｒＭ−Ｅ配列または配列番号２のｐｒＭ−Ｅ配列に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるｐｒＭ−Ｅ配列を含むキメラウイルスであってよい。本発明の方法で使用するための、血清型３のワクチンデングウイルスは、例えばＣＹＤ−３または、ＹＦ１７Ｄ/ＤＥＮ−３キメラウイルスであってよい。血清型４のワクチンデングウイルスの例は、ＣＹＤ−４または他のＹＦ１７Ｄ/ＤＥＮ−４キメラウイルスである。
本発明の組成物は、少なくとも１つのデング抗原を含む。典型的には、本発明の組成物は、デング抗原、例えば、それぞれ血清型１、２、３および４のワクチンデングウイルスを含む。本発明の各血清型のデング抗原、例えばワクチンデングウイルスは、本明細書に記載の通りであってよい。例えば、本発明の組成物は、以下に記載するデング抗原の組合せのいずれか１つを有利に含んでいてよい： i) ＣＹＤ−１のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭおよびＥアミノ酸配列を含むキメラデングウイルスならびにＣＹＤ−４のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原; ii) ＣＹＤ−１のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原ならびにＣＹＤ−４のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原; (iii) ＣＹＤ−１のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原ならびにＣＹＤ−４のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原; (iv) ＣＹＤ−１のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原ならびにＣＹＤ−４のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原。例えば、本発明の組成物は、以下のデング抗原の組合せを有利に含んでいてよい： i) ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＬＡＶ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４; ii) ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＢＩＤ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４; (iii) ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＰＲ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４または(iv) ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＭＤ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４。本発明の組成物はまた、以下のデング抗原の組合せを有利に含んでいてよい: i) ＣＹＤ−１のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＶＤＶ２、ＣＹＤ−３のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原およびＣＹＤ−４のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原。例えば、本発明の組成物は、ＣＹＤ−１、ＶＤＶ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４を有利に含んでいてよい。本明細書に記載するように、本発明の組成物は、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号８)、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号９)、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号１０)、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号１１)または配列番号２を含む、血清型２のデング抗原を有利に含んでいてよい。本明細書に記載するように、本発明の組成物は、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号８)、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号９)、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号１０)、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号１１)または配列番号２と少なくとも９０％同一である配列を含む、血清型２のデング抗原を有利に含んでいてよい。例えば、該配列は、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒｍ−Ｅ配列(配列番号８)、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒｍ−Ｅ配列(配列番号９)、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒｍ−Ｅ配列(配列番号１０)、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒｍ−Ｅ配列(配列番号１１)または配列番号２と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であってよい。
本明細書中において用いる、「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」という語は、複製的な遺伝物質を含まないが、その表面に、ビリオンの構造と同様に反復性に並んだデングＥ蛋白質が存在するウイルス粒子を指す。典型的には、デングＶＬＰはまた、デングｐｒＭおよび／またはＭ、ならびにＥ蛋白質を含む。ＶＬＰは、生体外で作成してよい (Zhang et al, J. Virol. (2011) 30 (8):333)。ＶＬＰはまた、生体内で作成してもよい。かかる目的のためには、ｐｒＭおよびＥデング蛋白質をコードする核酸構築物(例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物) を、対象、例えばヒト対象の細胞に、当該分野で公知の方法、例えば、ウイルスベクターを使用して導入してよい。ｐｒＭおよびＥデングウイルス配列の両方を含み、発現させることが可能であれば、任意のウイルスベクターを使用してよい。本発明の方法で使用し得るウイルスベクターの非限定的な例としては、ポックスウイルス（例えば、弱毒化ポックスアンカラウイルス）および麻疹ウイルスが挙げられる。本発明で使用するために、生体内でＶＬＰを発現する具体的なカテゴリーのウイルスベクターとしては、例えば、ReplivaxＴＭ技術による、複製欠損性偽感染（pseudoinfectios）(PIV)ウイルスが挙げられる(Rumyantsev AA, et al. Vaccine. 2011 Jul 18;29(32):5184-94)。
本明細書中において用いる、「複製欠損性偽感染ウイルス」という語は、複製周期に必須な配列、例えばキャプシド蛋白質のコード配列がゲノムに存在しないために、生体内で複製欠損性であるビリオン粒子を指す。しかし、該ビリオン粒子は、かかる必須の配列をトランスで提供するヘルパー細胞の培養中では増殖することができる。本発明で使用するための複製欠損性偽感染ウイルスは、上記の定義による、任意の血清型のデングウイルスのｐｒＭおよびＥ蛋白質を発現させることのできる任意のウイルスを含む。例としては、複製欠損性フラビウイルス/デングキメラ、例えば複製欠損性ウエストナイルウイルス/デング、日本脳炎ウイルス/デングおよびＹＦ/デングキメラが挙げられる。
本発明のワクチン組成物の対象における免疫応答の誘発能（すなわち、中和抗体の産生の誘発能）は、例えば、該組成物に含まれるデングウイルス血清型に対して産生された中和抗体の力価を測定することによって評価し得る。該中和抗体の力価は、プラーク減少中和試験(ＰＲＮＴ５０) 試験により評価し得る。端的には、中和抗体の力価を、本発明のワクチン組成物の投与から少なくとも２８日後に、ワクチン接種した対象から回収した血清中にて測定する。（予め熱により不活化した）倍数希釈した血清を、一定の負荷容量の血清型１、２、３または４のデングウイルスそれぞれと適宜混合する(PFU/mLで表す)。該混合物を、単層のＶｅｒｏ細胞がコンフルエントに播かれているマイクロプレートのウェルに播く。吸着後、単層細胞を２、３日インキュベーションする。デングウイルスに感染した細胞の存在は、血清試料における、感染巣（infected focus）の形成および、中和抗体の存在による、ウイルスの感染力の低下により示される。報告された値(エンドポイント中和力価) は、陰性対象のウェルのウイルス巣の平均数（１００％ウイルス負荷を表す）と比較して、デング負荷ウイルスの≧５０％（ウイルス巣の数）が中和される、最も高い血清の希釈率を表す。該エンドポイント中和力価は、連続的な値として表す。該アッセイの定量下限(LLOQ) は１０ (１/希釈率)である。一般的に、力価が１０ (１/希釈率)以上になると、抗体陽転が起こると考えられている。ＰＲＮＴ試験は、研究室によって少し変わり得るため、LLOQもまた少し変わり得る。したがって、一般的に、力価が該試験のLLOQ以上になった場合、抗体陽転が起こると考えられる。中和抗体の力価が以下の文献で考慮されているが、著者らは、保護との相関を確立していない (Guirakhoo et al, J. Virol. (2004) 78 (9): 4761; Libraty et al, PLoS Medicine (2009) 6 (10); Gunther et al, Vaccine (2011) 29: 3895) and Endy et al, J. Infect. Dis. (2004), 189(6): 990-1000)。
「CCID５０」という語は、培養細胞の５０％に感染するウイルス（例えばワクチンウイルス）の量を指す。該CCID５０アッセイは、統計的な力価の算出を伴う、限界希釈アッセイである(Morrison D et al J Infect Dis. 2010; 201(3):370-7))。
「ヒト対象」という語は、種々の年齢の男性および女性を指すことを意図する。本発明のヒト対象は、１８歳未満または１２歳未満であることが好ましい。例えば、本発明のヒト対象は、０〜１７歳、０〜１１歳、４〜１７歳、４〜１１歳、４〜６歳、６〜８歳、８〜１０歳、２〜８歳、２〜１１歳、２〜１４歳、９〜１６歳、１２〜１７歳、または１８〜４５歳であってよい。本発明のヒト対象は、４〜１１歳、２〜１４歳または９〜１６歳であればより好ましい。本発明のヒト対象は、少なくとも生後９ヶ月または９ヶ月未満であってもよい。例えば、本発明のヒト対象は、生後９ヶ月〜１６歳、９ヶ月〜１４歳、９ヶ月〜１１歳または９ヶ月〜８歳であってよい。本発明のヒト対象は、少なくとも生後９ヶ月の、本明細書に記載のワクチン組成物の成分のいずれに対しても重症なアレルギーの病歴がなく、先天性または後天性の免疫不全がなく、症候性のＨＩＶ感染を示さない対象であってよく、該対象は、妊娠中または授乳中であってはならない。
本明細書中において用いる、「フラビウイルスナイーブ対象」という表現は、フラビウイルスに感染したことも、以前に、フラビウイルスワクチンにより免疫化されたこともない対象を指し、すなわち、該対象から採取した血清試料は、フラビウイルスＥＬＩＳＡまたはＰＲＮＴアッセイにおいて、陰性の結果を示す。
本明細書中において用いる、「デングナイーブ対象」という表現は、デングウイルスに感染したことも、以前に、デングワクチンにより免疫化したこともない対象を指し、すなわち、該対象から採取した血清試料は、デングＥＬＩＳＡまたはＰＲＮＴアッセイにおいて、陰性の結果を示す。
本明細書中において用いる、「フラビウイルス免疫対象」という表現は、本発明のワクチン組成物の投与前に、フラビウイルスに感染した、もしくは免疫化されたことのある対象を指し、すなわち、該対象から採取した血清試料は、フラビウイルスＥＬＩＳＡまたはＰＲＮＴアッセイにおいて、陽性の結果を示す。
本明細書中において用いる、「デング免疫対象」という表現は、本発明のワクチン組成物の投与前に、デングウイルスに感染したか、または、デングワクチンにより免疫化されたことのある対象を指し、すなわち、該対象から採取した血清は、デングＥＬＩＳＡまたはＰＲＮＴアッセイにおいて陽性の結果を示す。
本発明によれば、本明細書中における「保護方法」は、デングウイルスに暴露されたヒト対象における、デング病の重症度または発症の可能性を低下させる。有利には、かかる低下は、統計学的に有意である。例えば、本発明の保護方法は、本明細書中に記載するデング病の少なくとも１つの症候の軽減または、該症候の任意の２つ以上の組合せを軽減し得る。該保護は、以下の１つ以上をもたらし得る：
(i) 任意の血清型のデングウイルスにより引き起こされるウイルス学的に確認される症候性のデング病の、発症頻度または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防;
(ii) 血清型１、３または４のいずれか１つのデングウイルスにより引き起こされるウイルス学的に確認される症候性のデング病の発症頻度または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防;
(iii) 任意の血清型のデングウイルスにより引き起こされる症候性のデング病の発症頻度または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防;
(iv) 血清型１、３または４のいずれか１つのデングウイルスにより引き起こされる症候性のデング病の発症頻度または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防;
(v) 任意の血清型のデングウイルスにより引き起こされる重度のウイルス学的に確認されるデング病の発症頻度または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防;
(vi) 任意の血清型のデングウイルスにより引き起こされる重度のデング病の発症頻度または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防;
(vii) 任意の血清型のデングウイルスにより引き起こされる、グレードＩ〜ＩＶのデング出血熱の発症頻度または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防；
(viii) 任意の血清型のデングウイルスにより引き起こされるグレードＩのＤＨＦの発症頻度または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防；
(ix) 任意の血清型のデングウイルスにより引き起こされるグレードＩＩのＤＨＦの発症頻度または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防;
(x) 任意の血清型のデングウイルスにより引き起こされるグレードＩＩＩのＤＨＦの発症頻度または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防;
(xi) 任意の血清型のデングウイルスにより引き起こされるグレードＩＶのＤＨＦの発症頻度または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防;
(xii) 発熱頻度または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防または発熱の平均の持続期間および／または程度の低下;
(xiii) ヘマトクリットの変化により規定される血漿漏出の発症頻度または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防、またはヘマトクリットの変化により規定される血漿漏出の平均値の低下;
(xiv) 血小板減少症の発症頻度または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防または血小板減少症の平均値の低下;
(xv) アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）を含む肝臓酵素のレベル上昇の発症頻度または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防;
(xvi) 任意の血清型のデングウイルスにより引き起こされるウイルス学的に確認されるデング病による入院の頻度または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防;
(xvii) 任意の血清型のデングウイルスにより引き起こされるデング病による入院の頻度または可能性の統計学的に有意な低下、例えば予防;
(xviii) ウイルス学的に確認されるデング病による病院滞在の長さの統計学的に有意な低下；
(xix) デング病による病院滞在の長さの統計学的に有意な低下。
熱の持続期間および程度は、標準的な病院の手法によりモニターし、記録する。ヒト対象において、発熱（すなわち熱性エピソード）は、少なくとも４時間の間隔をあけて２度検温し、３７.５℃以上の体温が２回観察されることと定義する。ヘマトクリット、血小板減少および肝臓酵素レベルの測定は、例えば薬局方に記載されているように、当業者によく知られた標準的な試験である。
デング病に対する保護、例えば上記の（ｉ）〜（ｘｉｘ）の点における保護を、特定のデングウイルス血清型により引き起こされるデング病について示してもよい。例えば、本明細書中において、デング病に対する保護は、血清型１のデングウイルス、血清型２のデングウイルス、血清型３のデングウイルスまたは血清型４のデングウイルスにより引き起こされるデング病について示してよい。本明細書中において、デング病に対する保護を、例えば、血清型１または血清型３のデングウイルス、血清型１または血清型４のデングウイルス、血清型３または血清型４のデングウイルス、血清型１または血清型２のデングウイルス、血清型２または血清型３のデングウイルス、血清型２または血清型４のデングウイルス、血清型１、２または３のデングウイルス、血清型１、３または４のデングウイルス、血清型２、３または４のデングウイルス、または血清型１、２、３または４のデングウイルスにより引き起こされるデング病について有利に示してよい。
本明細書中において、デング病に対する保護を、特定のヒト対象のサブグループにおいて有利に示してよい。例えば、デング病に対する保護を、１８歳未満または１２歳未満のヒト対象において有利に示してよい。例えば、本発明のヒト対象は、０〜１７歳、０〜１１歳、４〜１７歳、４〜１１歳、４〜６歳、６〜８歳、８〜１０歳、２〜８歳、２〜１１歳、２〜１４歳、９〜１６歳、１２〜１７歳または１８〜４５歳であってよい。本発明のヒト対象は、４〜１１歳、２〜１４歳または９〜１６歳であるのがより好ましい。本発明のヒト対象は、少なくとも生後９ヶ月または９ヶ月未満であってよい。例えば、本発明のヒト対象は、生後９ヶ月〜１６歳、９ヶ月〜１４歳、９ヶ月〜１１歳または９ヶ月〜８歳であってよい。本発明のヒト対象は、本明細書に記載のワクチン組成物のいずれの成分に対しても重度のアレルギーの病歴がなく、先天性または後天性の免疫不全を示さず、症候性のＨＩＶ感染を示さない、少なくとも生後９ヶ月の対象であってよく、該対象は、妊娠もしくは授乳中であってはならない。
本明細書中において、デング病に対する保護を、世界の特定の国、地域または地方で有利に示してもよい。例えば、デング病に対する保護を、デング流行地域において有利に示してもよい。例えば、本発明において、保護を示し得るデング流行領域としては、熱帯および亜熱帯地域に含まれるアメリカ諸国またはその一部が含まれる。したがって、本発明において保護を示し得るデング流行領域としては、以下のいずれか１つ以上が挙げられる： ブラジル、ベネズエラ、コロンビア、エクアドル、ペルー、ボリビア、パラグアイ、パナマ、コスタリカ、ニカラグア、ホンジュラス、エルサルバドル、グァテマラ、ベリーズ、メキシコ、米国およびカリブ諸島。特定の実施態様において、保護を示し得る本発明のデング流行地域は以下からなっていてよい：ブラジル、コロンビア、ホンジュラス、メキシコおよびプエルトリコ。本発明において保護を示し得るデング流行地域としてはまた、熱帯および亜熱帯地域に含まれる南アジアおよびオセアニアの国々が含まれる。したがって、保護を示し得る、本発明のデング流行地域は、以下のいずれか１つ以上からなっていてよい：インド、ミャンマー (ビルマ)、タイ、ラオス、ベトナム、カンボジア、インドネシア、マレーシア、シンガポール、フィリピン、台湾、パプアニューギニアおよびオーストラリア。本発明の、保護を示し得るデング流行地域において、特定の血清型、株または遺伝子型の野生型デングウイルスが、主要の流行株であってよい。例えば、血清型２のデングウイルスが、Asian IまたはAsian/Americanの遺伝子型を有していると特徴付けられてよい。Asian/American遺伝子型株は、ｐｒＭ-１６、Ｅ−８３、Ｅ−２０３、Ｅ−２２６、Ｅ−２２８およびＥ−３４６のそれぞれに位置する、以下の残基Arg、Asn、Asp、Thr、GlyおよびHisの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは６つ全てにより特徴付けられる(ここで、ｐｒＭ-１６とは、ｐｒＭ蛋白質の第１６番目を指し、Ｅ−８３等は、Ｅ蛋白質の第８３番目を指す)。Asian I遺伝子型株は、ｐｒＭ-１６、Ｅ−８３、Ｅ−２０３、Ｅ−２２６、Ｅ−２２８およびE-３４６にそれぞれ位置する以下の残基、Ile、Lys、Asn、Arg、GluおよびTyrのうち少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは６つ全てによって特徴付けられる (Hang et al., PLoS NTD, 4(7): e757の表１を参照のこと)。本発明によって保護が示され得る好ましいデング流行地域は、遺伝子型Asian/Americanを有するデングウイルスが、主要な流行株である、すなわち、該デング流行地域におけるデング病の症例の少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、少なくとも９５%または１００%が、遺伝子型Asian/Americanを有するデングウイルスにより引き起こされるものである、地域である。本発明によって保護が示され得る好ましいデング流行地域は、血清型１、３または４の任意の１つ以上が主要な流行血清型である、すなわち、デング病の症例の少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、少なくとも９５%または１００%が血清型１、３または４のデングウイルスにより引き起こされるものである、地域である。
本明細書中において用いる、特定のＤＮＡ配列の「ＲＮＡ等価物」という語は、デオキシチミジンがウリジンに置きかえられた配列を指す。当該ＤＮＡ配列が、デングウイルスのｃＤＮＡ配列を構成するため、該ＲＮＡ等価配列は、それらのデングウイルスの（＋）鎖ＲＮＡを構成する。
いくつかの実施態様の概要
本発明によって、ヒト対象のデング病に対する保護において、ワクチン組成物の有効性を初めて示したものである。
したがって、本発明は、デング病に対してヒト対象を保護する方法で使用するためのワクチン組成物に関し、ここで、該組成物は:
(i) 以下からなる群から選択されるデング抗原:
(a) 弱毒化生デングウイルス;
(b) 不活化デングウイルス;
(c) 弱毒化生または不活化キメラデングウイルス;
(d) デングウイルス様粒子 (ＶＬＰ); および
(e) (a)〜(d)の２つ以上の組合せ;
または
(ii) デングＶＬＰであるデング抗原をヒト細胞で発現させることのできる核酸構築物またはウイルスベクター
を含む。
本発明のデング病はウイルス学的に確認されるデング病であることが好ましい。
本発明のヒト対象は、１８歳未満または１２歳未満であることが好ましい。例えば、本発明のヒト対象は、０〜１７歳、０〜１１歳、４〜１７歳、４〜１１歳、４〜６歳、６〜８歳、８〜１０歳、２〜８歳、２〜１１歳、２〜１４歳、９〜１６歳、１２〜１７歳または１８〜４５歳であってよい。本発明のヒト対象は、４〜１１歳、２〜１４歳または９〜１６歳が好ましい。本発明のヒト対象は、少なくとも生後９ヶ月または９ヶ月未満であってもよい。例えば、本発明のヒト対象は生後９ヶ月〜１６歳、９ヶ月〜１４歳、９ヶ月〜１１歳または９ヶ月〜８歳であってもよい。本発明のヒト対象は、本明細書に記載するワクチン組成物の任意の成分に対して重度のアレルギーの病歴がなく、先天的もしくは後天的な免疫不全がなく、症候性のＨＩＶ感染を発症していない、少なくとも生後９ヶ月の対象であってよく、該対象は妊娠もしくは授乳中であってはならない。
本発明のワクチン組成物を投与する対象は、感染の危険性がある個人、例えばデング熱が存在する地域、すなわちデング流行地域を訪れる個人、または該地域の住人であることが好ましい。本発明のデング流行地域には、熱帯および亜熱帯地域のほとんど、例えばＷＨＯによって流行国と特定されたすべての国が含まれる。例えば、本発明のデング流行地域は、熱帯および亜熱帯の範囲内であるアメリカ諸国またはその一部を含んでいてよい。したがって、本発明のデング流行地域は、以下のいずれか１つ以上を含んでいてよい: ブラジル、ベネズエラ、コロンビア、エクアドル、ペルー、ボリビア、パラグアイ、パナマ、コスタリカ、ニカラグア、ホンジュラス、エルサルバドル、グァテマラ、ベリーズ、メキシコ、米国およびカリブ諸島。特定の実施態様において、本発明のデング流行地域は、以下からなっていてよい: ブラジル、コロンビア、ホンジュラス、メキシコおよびプエルトリコ。本発明のデング流行地域としてはまた、熱帯および亜熱帯地域の範囲内にある南アジアおよびオセアニアの国々も含まれてよい。したがって、本発明のデング流行地域は、以下のいずれか１つ以上からなっていてよい: インド、ミャンマー (ビルマ)、タイ、ラオス、ベトナム、カンボジア、インドネシア、マレーシア、シンガポール,フィリピン、台湾、パプアニューギニアおよびオーストラリア。本発明のデング流行地域において、特定の血清型、株および遺伝子型の野生型デングウイルスが優占的な流行株であってよい。例えば、血清型２のデングウイルスは、Asian IまたはAsian/American遺伝子型を持っていると特徴付けてよい。Asian/American遺伝子型株は、ｐｒＭ−１６、Ｅ−８３、Ｅ−２０３、Ｅ−２２６、Ｅ−２２８およびＥ−３４６のそれぞれに位置する以下の残基Arg、Asn、Asp、Thr、GlyおよびHisの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは６つ全てにより特徴付けられる(ここで、ｐｒＭ-１６は、ｐｒＭ蛋白質の第１６番目の位置を指し、Ｅ−８３はＥ蛋白質の第８３番目の位置を指す)。Asian I遺伝子型株は、ｐｒＭ−１６、Ｅ−８３、Ｅ−２０３、Ｅ−２２６、Ｅ−２２８およびＥ−３４６のそれぞれに位置する以下の残基Ile、Lys、Asn、Arg、GluおよびTyrの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは６つ全てにより特徴付けられる(Hang et al., PLoS NTD, 4(7): e757の表1を参照のこと)。本発明の好ましいデング流行地域は、Asian/Americanの遺伝子型を有するデングウイルスが流行の優占的な株である、すなわち、該デング流行地域において、デング病の症例の少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、少なくとも９５%または１００%が、Asian/American遺伝子型を有するデングウイルスにより引き起こされるものである、地域である。本発明の好ましいデング流行地域は、血清型１、３または４のいずれか１つ以上のデングウイルスが、優占的な流行血清型である、すなわち、デング病の症例の少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、少なくとも９５%または１００%が、血清型１、４または４のデングウイルスにより引き起こされるものである、地域である。
本発明のワクチン組成物は、フラビウイルス免疫対象、例えば、デング免疫対象に投与しても、または、本発明のワクチン組成物を、フラビウイルスナイーブ対象に投与してもよい。本発明のワクチン組成物は、フラビウイルス免疫対象、例えばデング免疫対象に有利に投与される。
好ましくは、本発明の組成物、例えば本発明の方法で用いるための組成物は、ＤＨＦの可能性または重症度を低下させる。ＤＨＦの可能性の低下（すなわち、ＤＨＦに罹患する可能性の低下）は、本発明のワクチン組成物を投与した対象群における、ＤＨＦの発症例の数と、本発明のワクチン組成物を投与していない対象の対照群におけるＤＨＦの発症例の数を比較することにより測定し得る。ＤＨＦの重症度の低下は、本発明のワクチン組成物の投与を受けた対象群における、グレードＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのそれぞれのＤＨＦを示す対象の数を算出し、本発明のワクチン組成物の投与を受けていない対象の対照群の相当する数と比較することにより決定し得る。例えば、本発明の方法に使用するための組成物は、ワクチンの投与を受けた対象において、グレードＩＤＨＦの発症数、グレードＩＩのＤＨＦの発症数、グレードＩＩＩのＤＨＦの発症数および／またはグレードＩＶのＤＨＦの発症数を本発明のワクチン組成物の投与を受けていない対象の対照群で見られる、グレードＩＤＨＦ、グレードＩＩＤＨＦ、グレードＩＩＩＤＨＦ、グレードＩＶＤＨＦの相当する数と比較して低下させるのが好ましい。
好ましくは、本発明の組成物、例えば、本発明の方法で使用するための組成物は、症候性のウイルス学的に確認されるデング病の発症頻度または可能性を低下させる。本発明の組成物、例えば、本発明の方法で使用するための組成物は、血清型１、３または４のデングウイルスにより引き起こされる症候性のウイルス学的に確認されるデング病の発症頻度または可能性を有利に低下させる。本発明の組成物、例えば、本発明の方法で使用するための組成物は、ウイルス学的に確認されたデング病による入院率を低下させる、すなわち、ウイルス学的に確認されたデング病の入院頻度を低下させるのが好ましい。例えば、本発明の組成物、例えば、本発明の方法で使用するための組成物は、血清型１、３または４のデングウイルスにより引き起こされるウイルス学的に確認されるデング病による入院率を低下させる、すなわち、血清型１、３または４のデングウイルスにより引き起こされる、ウイルス学的に確認されるデング病の入院頻度を低下させる。
本発明の組成物、例えば、本発明の方法で使用するための組成物は、デング病の発症頻度または可能性を低下させるのが好ましい。本発明の組成物、例えば、本発明の方法で使用するための組成物は、血清型１、３または４のデングウイルスにより引き起こされるデング病の発症頻度または可能性を低下させる。本発明の組成物、例えば、本発明の方法で使用するための組成物は、血清型１、２、３または４のデングウイルスにより引き起こされるデング病の発症頻度または可能性を有利に低下させる。本発明の組成物、例えば、本発明の方法で使用するための組成物は、デング病による入院率を低下させる、すなわち、デング病の入院頻度を低下させるのが好ましい。例えば、本発明の組成物、例えば、本発明の方法で使用するための組成物は、血清型１、３または４のデングウイルスにより引き起こされるデング病による入院率を低下させる、すなわち、血清型１、３または４のデングウイルスにより引き起こされるデング病の入院頻度を低下させる。
本発明のワクチン組成物は、複数回投与してよい。本発明のワクチン組成物は、初回ワクチン接種レジメンにて投与し、その後に追加ワクチン接種を行ってよい。例えば、本発明のワクチン組成物は、１、２もしくは３またはそれより多く、例えば４回投与してよい。１回目の投与と３回目の投与は、約１２ヶ月の間隔をあけて行うのが好ましい。例えば、本発明の初回ワクチン接種レジメンでは、３回投与を行い、該ワクチン接種レジメンの１回目の投与と３回目の投与は、約１２ヶ月間隔をあけて行う。本発明のワクチン組成物は、１回目の投与、２回目の投与および３回目の投与として有利に投与される。そのような実施態様において、１回目の投与と３回目の投与は、約１２ヶ月の間隔をあけて行ってよい。例えば、本発明のワクチン組成物は、１回目、２回目および３回目の投与を行い、ここで、２回目の投与は、１回目の投与の約６ヶ月後に行い、３回目の投与は、１回目の投与の約１２ヶ月後に行う。あるいは、３回の投与を、０ヶ月時点、約３〜４ヶ月の時点（例えば、約３ヶ月半の時点）および約１２ヶ月の時点で行ってもよい（すなわち、組成物の２回目の投与を１回目の投与の約３.５ヶ月後に行い、組成物の３回目の投与を１回目の投与の約１２ヶ月後に行うレジメン）。
本発明のワクチン組成物を、２回投与してもよい。１回目と２回目の投与は、約６〜１２ヶ月間隔があいていることが好ましい。２回目の投与は、１回目の投与から約８ヶ月後に行うのが好ましい。２回目の投与は、１回目の投与から約８ヶ月半〜約９ヶ月後に行うのが好ましい。
本発明のワクチン組成物は、単回投与してもよい。
本明細書中において、デング病は、デングウイルスの２つの血清型のうちのいずれか１つによって引き起こされ得る。例えば、デング病は、血清型１または血清型３のデングウイルス、血清型１または血清型４のデングウイルス、血清型３または血清型４のデングウイルス、血清型１または血清型２のデングウイルス、血清型２または血清型３のデングウイルス、血清型２または血清型４のデングウイルスにより引き起こされるのが好ましい。本明細書中において、デング病は、３つの血清型のデングウイルスのいずれか１つによって引き起こされるのが好ましい。例えば、デング病は、血清型１、２または３のデングウイルス、血清型１、３または４のデングウイルス、血清型１、２または４のデングウイルス、または血清型２、３または４のデングウイルスによって引き起こされるのが好ましい。他の実施態様において、デング病は、血清型１のデングウイルス、血清型２のデングウイルス、血清型３のデングウイルス、血清型４のデングウイルスによって引き起こされる。
本発明のワクチン組成物、例えば本発明の方法で用いるためのワクチン組成物は、血清型１のデング抗原、血清型２のデング抗原、血清型３のデング抗原および血清型４のデング抗原を含むのが好ましい。該組成物は、本明細書中において、四価の組成物と表記し得る。例えば、本発明の組成物、例えば、本発明の保護方法で用いるための組成物は、以下の組合せの血清型１、２、３および４のデング抗原のいずれか１つを有利に含んでいてよい： i) ＣＹＤ−１のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭおよびＥ配列を含むキメラデングウイルスおよびＣＹＤ−４のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原; ii) ＣＹＤ−１のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原およびＣＹＤ−４のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原; (iii) ＣＹＤ−１のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原ならびにＣＹＤ−４のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原; (iv) ＣＹＤ−１のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原およびＣＹＤ−４のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原。例えば、本発明の組成物はまた、以下のデング抗原の組合せのうちのいずれか１つを有利に含んでいてよい: i) ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＬＡＶ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４; ii) ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＢＩＤ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４; (iii) ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＰＲ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４または (iv) ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＭＤ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４。本発明の組成物はまた、以下のデング抗原の組合せを有利に含んでいてよい：i) ＣＹＤ−１のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＶＤＶ２、ＣＹＤ−３のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原およびＣＹＤ−４のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原。例えば、本発明の組成物は、ＣＹＤ−１、ＶＤＶ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４を有利に含んでいてよい。本明細書中において、本発明の組成物は、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号８)、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号９)、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号１０)、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号１１)または配列番号２を含む、血清型２のデング抗原を有利に含んでいてよい。本明細書中において、本発明の組成物は、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号８)、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号９)、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号１０)、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号１１)または配列番号２と少なくとも９０％同一な配列を含む、血清型２のデング抗原を有利に含んでいてよい。例えば、該配列は、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号８)、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号９)、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号１０)、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号１１)または配列番号２と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であってよい。
本発明のワクチン組成物、例えば本発明の方法で用いるためのワクチン組成物は、血清型１のデング抗原、血清型２のデング抗原、血清型３のデング抗原および血清型４のデング抗原を含むのが好ましい。該組成物は、本明細書中において、四価の組成物として表してよい。例えば、本発明の組成物、例えば本発明の方法で用いるための組成物は、以下の血清型１、２、３および４のデング抗原の組合せのいずれか１つを有利に含んでいてよい：i) ＣＹＤ−１のＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＬＡＶのＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のＭおよびＥ配列を含むキメラデングウイルスおよびＣＹＤ−４のＭおよびＥ配列を含むデング抗原; ii) ＣＹＤ−１のＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＢＩＤのＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のＭおよびＥ配列を含むデング抗原およびＣＹＤ−４のＭおよびＥ配列を含むデング抗原; (iii) ＣＹＤ−１のＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＰＲのＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のＭおよびＥ配列を含むデング抗原ならびにＣＹＤ−４のＭおよびＥ配列を含むデング抗原; (iv) ＣＹＤ−１のＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＭＤのＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のＭおよびＥ配列を含むデング抗原およびＣＹＤ−４のＭおよびＥ配列を含むデング抗原。例えば、本発明の組成物はまた、以下のデング抗原の組合せのいずれか１つを有利に含んでいてよい: i) ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＬＡＶ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４; ii) ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＢＩＤ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４; (iii) ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＰＲ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４または (iv) ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＭＤ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４。本発明の組成物はまた、以下のデング抗原の組合せを有利に含んでいてよい： i) ＣＹＤ−１のＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＶＤＶ２、ＣＹＤ−３のＭおよびＥ配列を含むデング抗原ならびにＣＹＤ−４のＭおよびＥ配列を含むデング抗原。例えば、本発明の組成物は、ＣＹＤ−１、ＶＤＶ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４を有利に含んでいてよい。本明細書中において、本発明の組成物は、ＣＹＤ−ＬＡＶのＥ配列(配列番号１３)、ＣＹＤ−ＢＩＤのＥ配列(配列番号１４)、ＣＹＤ−ＰＲのＥ配列(配列番号１５)、ＣＹＤ−ＭＤのＥ配列(配列番号１６)または配列番号１８を含む血清型２のデング抗原を有利に含んでいてよい。本発明の組成物は、本明細書中において、ＣＹＤ−ＬＡＶのＥ配列(配列番号１３)、ＣＹＤ−ＢＩＤのＥ配列(配列番号１４)、ＣＹＤ−ＰＲのＥ配列(配列番号１５) ＣＹＤ−ＭＤのＥ配列(配列番号１６)または配列番号１８に少なくとも９０％同一である配列を含む、血清型２のデング抗原を有利に含んでいてよい。例えば、該配列は、ＣＹＤ−ＬＡＶのＥ配列(配列番号１３)、ＣＹＤ−ＢＩＤのＥ配列(配列番号１４)、ＣＹＤ−ＰＲのＥ配列(配列番号１５) ＣＹＤ−ＭＤのＥ配列(配列番号１６)または配列番号１８と少なくとも９１%、少なくとも９２%、少なくとも９３%、少なくとも９４%、少なくとも９５%、少なくとも９６%、少なくとも９７%、少なくとも９８%または少なくとも９９%同一であってよい。
本明細書中において、本発明の組成物（例えば、本発明の方法で用いるための、例えば四価の製剤）は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３からなる群から選択されるポリペプチドを含む血清型２のデング抗原を有利に含んでいてよい。血清型２の該デング抗原は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６または配列番号１８からなる群から選択されるポリペプチドをさらに含むのが好ましい。例えば、血清型２の該デング抗原は、以下を含むのが好ましい: i) 配列番号１３のポリペプチドおよび配列番号１９のポリペプチド; ii) 配列番号１４のポリペプチドおよび配列番号２０のポリペプチド; iii) 配列番号１５のポリペプチドおよび配列番号２１のポリペプチド; iv) 配列番号１６のポリペプチドおよび配列番号２２のポリペプチド; またはv) 配列番号１８のポリペプチドおよび配列番号２３のポリペプチド。
本明細書中において、本発明の組成物(例えば、本発明の方法で用いるための、例えば四価の製剤)は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３に少なくとも９０％同一であるポリペプチドを含む血清型２のデング抗原を有利に含んでいてよい。血清型２の該デング抗原は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６または配列番号１８と少なくとも９０％同一であるポリペプチドをさらに含むのが好ましい。例えば、血清型２の該デング抗原は、以下を含むのが好ましい：i) 配列番号１３に少なくとも９０％同一であるポリペプチドおよび配列番号１９に少なくとも９０％配列が同一であるポリペプチド; ii) 配列番号１４に少なくとも９０％配列が同一であるポリペプチドおよび配列番号２０に少なくとも９０％配列が同一であるポリペプチド; iii) 配列番号１５に少なくとも９０％配列が同一であるポリペプチドおよび配列番号２１と少なくとも９０％配列が同一であるポリペプチド; iv) 配列番号１６と少なくとも９０％配列が同一であるポリペプチドおよび配列番号２２と少なくとも９０％配列が同一であるポリペプチド; またはv) 配列番号１８と少なくとも９０％配列が同一であるポリペプチドおよび配列番号２３と少なくとも９０％配列が同一であるポリペプチド。好ましい実施態様において、本明細書における少なくとも９０%の同一性という言及は、特定の配列に対する、少なくとも９１%、少なくとも９２%、少なくとも９３%、少なくとも９４%、少なくとも９５%、少なくとも９６%、少なくとも９７%、少なくとも９８%または少なくとも９９%の同一性と解釈してよい。
上述の段落に記載する血清型２のデング抗原は、本明細書の他の箇所に記載する任意の血清型１、３および４のデング抗原と有利に組み合わせて、血清型１のデング抗原、血清型２のデング抗原、血清型３のデング抗原および血清型４のデング抗原を含む四価の製剤を形成してよい。例えば、血清型１、２、３および４の該デング抗原は、それぞれ独立して、弱毒化生デングウイルスまたは弱毒化生キメラデングウイルスから選択してよい。本発明の方法で用いるための組成物は、それぞれ血清型１、２、３および４のデング抗原を有利に含み、ここで、血清型１、２、３および４の該デング抗原は、それぞれ弱毒化生キメラデングウイルスである。本発明の方法で用いるための組成物は、それぞれ血清型１、２、３および４のデング抗原を有利に含み、ここで、血清型１、３および４の該デング抗原はそれぞれ弱毒化生キメラデングウイルスであり、血清型２のデング抗原は、弱毒化生デングウイルスおよび弱毒化生キメラデングウイルスからなる群から選択される。
本発明の方法に用いるための組成物は、１、２、３および４それぞれの血清型のデング抗原を含み、ここで、血清型１、３および４の該デング抗原はそれぞれ、弱毒化生キメラデングウイルスであり、血清型２の該デング抗原は、弱毒化生デングウイルスである。例えば、血清型１、３および４の該弱毒化生キメラデングウイルスは、デング／デングキメラ、例えば、ＤＥＮ−２ １６６８１/ＰＤＫ５３株 (ＬＡＶ２としても知られる)に基づくデング／デングキメラであってよい。例えば、血清型１、３および４の該デング／デングキメラは、ＤＥＮ−２ １６６８１/ＰＤＫ５３株のｐｒＭおよびＥ遺伝子が、血清型１株、血清型２株および血清型３株のｐｒＭおよびＥ遺伝子でそれぞれ置きかえられているようにＤＥＮ−２ １６６８１/ＰＤＫ５３株のゲノムが修飾を受けている、キメラウイルスであってよい。該キメラデング／デングウイルスは、それぞれ、ＤＥＮ−２/１、ＤＥＮ−２/３およびＤＥＮ−２/４と称し得る。この文脈において、弱毒化生ウイルスである血清型２のデング抗原は、ＤＥＮ−２ １６６８１/ＰＤＫ５３株 (ＬＡＶ２としても知られる)であってよい。
本発明の方法で用いるための最適化四価デングワクチン組成物（すなわち、血清型１、２、３および４のそれぞれのデング抗原を含むワクチン組成物）であって、実施例１に示す様に、ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４により産生される中和抗体応答と比較して、血清型２のデングウイルスに対して改善した中和抗体応答をもたらす、ワクチン組成物を提供することは、本発明の目的の一つである。
したがって、態様の一において、本発明は、本発明の方法で用いるためのワクチン組成物であって、血清型１、２、３および４のそれぞれのデング抗原を含み、血清型１、３および４の該デング抗原がそれぞれ弱毒化生キメラデングウイルスであり、血清型２の該デング抗原が、配列番号２４に示す配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む弱毒化生デングウイルスである、ワクチン組成物を提供する。
したがって、他の態様において、本発明は、本発明の方法に用いるためのワクチン組成物であって、血清型１のデング抗原、血清型２のデング抗原、血清型３のデング抗原および血清型４のデング抗原を含み、ここで：
i) 血清型１の該デング抗原は、ＹＦ/デングキメラデングウイルス (すなわち、ＹＦウイルスの、ｐｒＭおよびＥ蛋白質のコード配列が、デング血清型１ウイルスの相当する配列に置きかえられることによって、ＹＦウイルスの遺伝子骨格が修飾を受けているレシピエント黄熱ウイルス)であり;
ii) 血清型２の該デング抗原が、配列番号２４に示す配列と少なくとも９０％の配列同一性を示す核酸配列を含む、血清型２の弱毒化生デングウイルスであり;
iii) 血清型３の該デング抗原が、ＹＦ／デングキメラデングウイルス(すなわち、ＹＦウイルスのｐｒＭおよびＥ蛋白質のコード配列が、デング血清型３ウイルスの相当する配列に置きかえられることによって、ＹＦウイルスの遺伝子骨格が修飾されているレシピエント黄熱ウイルス)であり、そして、
iv) 血清型４の該デング抗原が、ＹＦ／デングキメラデングウイルス（すなわち、ＹＦウイルスのｐｒＭおよびＥ蛋白質のコード配列が、デング血清型４ウイルスの相当する配列に置きかえられることによって、ＹＦウイルスの遺伝子骨格が修飾されているレシピエント黄熱ウイルス）である、
ワクチン組成物を有利に提供する。
該レシピエントＹＦウイルス（血清型１、３および４のＹＦ／デングキメラウイルスの遺伝子骨格を形成する）は、弱毒ＹＦウイルスであるのが好ましい。例えば、該レシピエントＹＦウイルスは、ＹＦ １７Ｄ、ＹＦ １７ＤＤおよびＹＦ １７Ｄ２０４からなる群から選択される弱毒ＹＦウイルスであってよい。血清型１、３および４の該ＹＦ／デングキメラウイルスは、それぞれ、ＣＹＤ−１(Chimerivax dengue serotype 1)、ＣＹＤ−３(Chimerivax dengue serotype 3)およびＣＹＤ−４(Chimerivax dengue serotype 4)であることが好ましい。
本明細書において、配列番号２４に示す配列に少なくとも９０％の配列同一性を示す核酸配列、という言及は、好ましくは、配列番号２４に示す配列と少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を示す核酸配列、と解釈してよい。（配列番号２４に示す配列と少なくとも９０％の配列同一性を示す、）該核酸配列内に位置するヌクレオチドであって、配列番号２４の第７３６、１６１９、４７２３、５０６２、９１９１、１００６３、１０５０７、５７、５２４、２０５５、２５７９、４０１８、５５４７、６５９９および８５７１番に相当する位置のヌクレオチドは、変異していないことが好ましい。本発明の組成物で用いるための (例えば、上述および本願明細書の他の箇所に記載の血清型１、３および４のデング抗原（例えば弱毒化生キメラデングウイルスである、血清型１、３および４のデング抗原、例えばＹＦ／デングキメラデングウイルス）と組み合わせて用いるための)、弱毒化生デングウイルスである血清型２のデング抗原は、配列番号２４に示す配列と１００％の配列同一性を示す核酸配列を含む弱毒化生デングウイルスであるか、または、配列番号２４に示す配列と比較したときに、少なくとも１つの、２０以下のヌクレオチド置換を含む弱毒化生デングウイルスであることが有利である。該弱毒化生デングウイルスは、配列番号２４に示す配列と比較して、少なくとも１つの、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３または２以下のヌクレオチド置換を含むことが好ましい。該核酸配列の中に位置するヌクレオチドであって、配列番号２４の、７３６、１６１９、４７２３、５０６２、９１９１、１００６３、１０５０７、５７、５２４、２０５５、２５７９、４０１８、５５４７、６５９９および８５７１番に相当する位置のヌクレオチドは、変異していないことが好ましい。本発明の組成物で使用するための弱毒化生デングウイルスである、血清型２のデング抗原は、配列番号２４に示す配列と比較して、２０塩基以下の変異、欠失または挿入を有する核酸配列を有利に含む。特定の場合において、血清型２の該弱毒化生デングウイルスは、配列番号２４に示す配列と比較して、１５以下、または１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１塩基以下の、変異、欠失または挿入を有する核酸配列を含む。該核酸配列内に位置する、配列番号２４の第７３６、１６１９、４７２３、５０６２、９１９１、１００６３、１０５０７、５７、５２４、２０５５、２５７９、４０１８、５５４７、６５９９および８５７１番に相当する位置のヌクレオチドが、変異していないことが好ましい。
本発明のワクチン組成物にて用いるための血清型２のデング抗原(例えば、血清型２の弱毒化生ウイルスまたは弱毒化生キメラデングウイルスである、デング抗原)が、ヒトにおいて中和抗体を誘発することができ、四価デングワクチン組成物にて用いた場合に、均衡のとれた免疫応答を誘発することができることもまた好ましい。本発明のワクチン組成物にて用いるための血清型２のデング抗原 (例えば、血清型２の弱毒化生デングウイルスまたは弱毒化生キメラデングウイルスである、デング抗原) によって、ヒトにおいて、ウイルス血症が低下するもしくは見られなくなることもまた好ましい。本発明の四価ワクチン組成物で用いるための血清型２のデング抗原(例えば、血清型２の弱毒化生デングウイルスまたは弱毒化生キメラデングウイルスであるデング抗原) が、実施例１に示すように、ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４により産生される中和抗体応答と比較して、血清型２のデングウイルスに対する中和抗体応答の改善をもたらすことも、また好ましい。
本発明の方法で用いるためのワクチン組成物は、血清型１、２、３および４それぞれのデング抗原を有利に含み、ここで、血清型１、３および４の該デング抗原は、それぞれ、弱毒化生キメラデングウイルスであり、血清型２の該デング抗原は、配列番号２４に示す配列と少なくとも９０％の配列同一性を示す核酸配列を含む弱毒化生デングウイルスであり、血清型１、２、３および４の該デング抗原は、それぞれ、ＣＹＤ−１、ＶＤＶ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４ではないか、または、それぞれ、ＣＹＤ１のＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＶＤＶ２、ＣＹＤ３のＭおよびＥ配列を含むデング抗原およびＣＹＤ４のＭおよびＥ配列を含むデング抗原ではない。
本発明の方法で用いるためのワクチン組成物は、それぞれ血清型１、２、３および４のデング抗原を有利に含み、ここで： (i)血清型１の該デング抗原は、ＣＹＤ−１以外の弱毒化生キメラデングウイルスであるか、または血清型１の該デング抗原はＣＹＤ−１であり; (ii)血清型２の該デング抗原は、ＶＤＶ−２以外の弱毒化生デングウイルスであるか、または、血清型２の該デング抗原はＶＤＶ−２であり; (iii) 血清型３の該デング抗原はＣＹＤ−３以外の弱毒化生キメラデングウイルスであるか、または、血清型３の該デング抗原はＣＹＤ−３であり、そして、(iv) 血清型４の該デング抗原はＣＹＤ−４以外の他の弱毒化生キメラデングウイルスであるか、または血清型４の該デング抗原は、ＣＹＤ−４である。この文脈において、該ＶＤＶ−２株は、続けてＶｅｒｏ細胞に適用することにより、ＤＥＮ−２ １６６８１/ＰＤＫ５３株(ＬＡＶ２)より得られる株であり、ここで、該ＶＤＶ−２株は、ＤＥＮ−２ １６６８１/ＰＤＫ５３と比較して、４つのサイレント変異を含む、さらなる１０の変異を有する。
本発明の方法において用いるための組成物は、血清型１、２、３および４それぞれのデング抗原を有利に含み、ここで： (i) 血清型１の該デング抗原が、ＣＹＤ−１以外の弱毒化生キメラデングウイルスであるか、または血清型１の該デング抗原がＣＹＤ−１であり; (ii) 血清型２の該デング抗原が、ＶＤＶ−２以外の弱毒化生デングウイルスであるか、または血清型２の該デング抗原がＶＤＶ−２であり; (iii) 血清型３の該デング抗原が、ＣＹＤ−３以外の弱毒化生キメラデングウイルスであるか、または、血清型３の該デング抗原がＣＹＤ−３であり、そして、(iv)血清型４の該デング抗原が、ＣＹＤ−４以外の弱毒化生キメラデングウイルスであるか、または血清型４の該デング抗原がＣＹＤ−４である。この文脈において、該ＶＤＶ−２株は、配列番号２４に示す核酸配列を含む株である。
本発明の方法で用いるための好ましいワクチン組成物は、血清型１のデング抗原、血清型２のデング抗原、血清型３のデング抗原および血清型４のデング抗原を含み、ここで：
i) 血清型１の該デング抗原がＣＹＤ−１以外のＹＦ／デングキメラデングウイルスであるか、または血清型１の該デング抗原がＣＹＤ−１であり;
ii) 血清型２の該デング抗原が、配列番号２４に示す配列と少なくとも９０％の配列同一性を示す核酸配列を含む、血清型２の弱毒化生デングウイルスであり、ここで、血清型２の該デング抗原は、配列番号２４に示す配列と１００％の配列同一性を示す核酸配列を含む、血清型２の弱毒化生デングウイルスではないか、または、血清型２の該デング抗原が、配列番号２４に示す配列と１００％の配列同一性を示す核酸配列を含む、血清型２の弱毒化生デングウイルスであり；
iii) 血清型３の該デング抗原が、ＣＹＤ−３以外のＹＦ／デングキメラデングウイルスであるか、または、血清型３の該デング抗原がＣＹＤ−３であり;
iv) 血清型４の該デング抗原がＣＹＤ−４以外のＹＦ／デングキメラデングウイルスであるか、または血清型４の該デング抗原がＣＹＤ−４である。
本発明のワクチン組成物の方法で用いるための（例えば、上述の、および本明細書中の他の箇所に記載する血清型１、３および４のデング抗原（例えば、ＹＦ／デングキメラデングウイルスである血清型１、３および４のデング抗原）と組み合わせて用いるための）、弱毒化生キメラデングウイルスである、血清型２のデング抗原は、配列番号２５に示す配列に少なくとも９０％の配列同一性を示す核酸配列を有利に含む。該核酸配列は、配列番号２５に示す配列と少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を示すのが好ましい。該核酸配列内に位置する、配列番号２４の第５２４番、第７３６番、第１６１９番および第２０５５番に相当する位置のヌクレオチドは、変異していない(すなわち、配列番号２４においてその位置に示されるヌクレオチドが維持されている)ことが好ましい
本明細書中において、本発明の組成物は、(a) 弱毒化生デングウイルス; (b) 不活化デングウイルス; (c) 弱毒化生デングウイルスまたは不活化キメラデングウイルス、ならびに (d) (a)〜(c)の２つ以上の組合せからなる群から選択されるデング抗原を有利に含んでいてよく、ここで、該デング抗原は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
本明細書中に記載するように、本発明の組成物は、(a) 弱毒化生デングウイルス; (b) 不活化デングウイルス; (c) 弱毒化生、または不活化キメラデングウイルスおよび (d) (a)〜(c)の２つ以上の組合せからなる群から選択されるデング抗原を有利に含んでいてよく、ここで、該デング抗原は、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
本明細書中に記載するように、本発明の組成物は、(a) 弱毒化生デングウイルス; (b) 不活化デングウイルス; (c) 弱毒化生、または不活化キメラデングウイルスおよび (d) (a)〜(c)の２つ以上の組合せからなる群から選択されるデング抗原を有利に含んでいてよく、ここで、該デング抗原は、本明細書に記載するＭおよびＥ配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
例えば、本発明の組成物、例えば本発明の保護方法で用いるための組成物は、以下の血清型１、２、３および４のデング抗原の組合せのいずれか１つを有利に含んでいてよい： i) ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＬＡＶ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４; ii) ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＢＩＤ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４; (iii) ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＰＲ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４または (iv) ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＭＤ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４。本発明の組成物は、以下のデング抗原の組合せを有利に含んでいてもよい: i) ＣＹＤ−１のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＶＤＶ２、ＣＹＤ−３のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原およびＣＹＤ−４のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原。例えば、本発明の組成物は、ＣＹＤ−１、ＶＤＶ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４を有利に含んでいてよい。本明細書中に記載するように、本発明の組成物は、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号８)、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号９)、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号１０) ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号１１)または配列番号２を含む、血清型２のデング抗原を有利に含んでいてよい。本明細書に記載するように、本発明の組成物は、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号８)、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号９)、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号１０)、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号１１)または配列番号２に少なくとも９０％の同一性を示す配列を含む、血清型２のデング抗原を有利に含んでいてよい。例えば、該配列は、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒｍ-Ｅ配列(配列番号８)、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒｍ-Ｅ配列(配列番号９)、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒｍ-Ｅ配列(配列番号１０)、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒｍ-Ｅ配列(配列番号１１)または配列番号２と、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であってよい。
本発明で用いる、例えば本発明の方法で用いるためのワクチン組成物は、ワクチンデングウイルスであるデング抗原を含んでいるのが好ましい。該ワクチンデングウイルスとしては、例えば、不活化ウイルス、弱毒化生ウイルスおよび弱毒化生キメラデングウイルスが挙げられる。該ワクチンデングウイルスは、弱毒化生キメラデングウイルスであることが好ましい。本発明の弱毒化生キメラデングウイルスは、デングウイルス由来の１つ以上の蛋白質および異なるフラビウイルス由来の１つ以上の蛋白質を含むのが好ましい。かかる異なるフラビウイルスは、有利には、黄熱ウイルス、例えば、ＹＦ １７Ｄ株の黄熱ウイルスである。本発明のキメラデングウイルスは、デングウイルスのｐｒＭ−Ｅアミノ酸配列を含む、例えば、本発明のキメラデングウイルスは、そのｐｒＭ−Ｅ配列が、デングウイルスのｐｒＭ−Ｅ配列に置きかえられた黄熱ウイルスゲノムを含むのが好ましい。本発明のワクチン組成物、例えば、本発明の方法で用いるためのワクチン組成物は、ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４を有利に含む。本発明の組成物は、以下のデング抗原の組合せのいずれか１つを有利に含んでいてよい： i) ＣＹＤ−１のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭおよびＥ配列を含むキメラデングウイルスならびにＣＹＤ−４のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原; ii) ＣＹＤ−１のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原およびＣＹＤ−４のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原; (iii) ＣＹＤ−１のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原およびＣＹＤ−４のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原; (iv) ＣＹＤ−１のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＣＹＤ−３のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原およびＣＹＤ−４のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原。例えば、本発明の組成物はまた、以下のデング抗原の組合せのいずれか１つを有利に含んでいてよい: i) ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＬＡＶ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４; ii) ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＢＩＤ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４; (iii) ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＰＲ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４または(iv) ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−ＭＤ、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４。本発明の組成物はまた、以下のデング抗原の組合せを有利に含んでいてよい： i) ＣＹＤ−１のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原、ＶＤＶ２、ＣＹＤ−３のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原およびＣＹＤ−４のｐｒＭおよびＥ配列を含むデング抗原。例えば、本発明の組成物は、ＣＹＤ−１、ＶＤＶ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４を有利に含んでいてよい。本明細書に記載するように、本発明の組成物は、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号８)、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号９)、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号１０)、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号１１)または配列番号２を含む血清型２のデング抗原を有利に含んでいてよい。本明細書に記載するように、本発明の組成物は、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号８)、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号９)、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号１０)、ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号１１)または配列番号２に少なくとも９０％の同一性を示す配列を含む、血清型２のデング抗原を有利に含んでいてよい。例えば、該配列は、ＣＹＤ−ＬＡＶのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号８)、ＣＹＤ−ＢＩＤのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号９)、ＣＹＤ−ＰＲのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号１０) ＣＹＤ−ＭＤのｐｒＭ−Ｅ配列(配列番号１１) または配列番号２と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であってよい。
本発明のワクチンデングウイルスの厳密な投与量は、ワクチン接種する患者の年齢および体重、投与頻度ならびに組成物中の他の成分（例えばアジュバント）によって変化し得る。本発明のワクチン組成物に含まれる弱毒化生デングウイルスの量は、約１０３〜約１０７ CCID５０の範囲内にある。一般的に、本発明のワクチン組成物に含まれる血清型１〜４のそれぞれの弱毒化生ウイルスの量は、約１０３〜約１０６ CCID５０の範囲、または約１０３〜約１０７ CCID５０の範囲、例えば約５ x １０３〜約５ x １０５ CCID５０の範囲、例えば約１ x １０４〜約１ x １０５ CCID５０の範囲、例えば約１０５ CCID５０である。本発明のワクチン組成物に含まれる血清型１〜４のそれぞれの弱毒化生デングウイルスの量は、約１０４〜約１０７ CCID５０の範囲にあり、例えば約１０６ CCID５０であってよい。本発明の四価組成物に含まれる、血清型１〜４それぞれの弱毒化生デングウイルス量は、等量であってよい。例えば、本発明の四価組成物は、血清型１〜４のそれぞれの弱毒化生デングウイルスを、約１０５ CCID５０含んでいてよい。あるいは、本発明の四価組成物は、血清型１〜４のそれぞれの弱毒化生デングウイルスを、約１０６ CCID５０含んでいてよい。本発明のワクチン組成物に含まれるキメラデングウイルス（例えば本明細書に記載する、ＹＦ／デングキメラまたはChimerivax (ＣＹＤ) ワクチン）の量は、約１０５ CCID５０または約１０６ CCID５０である。本発明のワクチン組成物に含まれる弱毒化生物に含まれる血清型１〜４それぞれの不活化デングウイルスの量は、約１０４〜約１０８ CCID５０当量の範囲、好ましくは約５ x １０４ 〜約５ x １０７ CCID５０当量の範囲、好ましくは約１ x １０４〜約１ x １０６ CCID５０ 当量の範囲にあり、好ましくは約１０５ CCID５０当量である。一般的に、本組成物に含まれる血清型１〜４のそれぞれのＶＬＰの量は、ＶＬＰ約１００ng〜約１００μg、好ましくは約１００ng〜約５０μg、好ましくは約１００ng〜約２０μg、好ましくは約１μg〜約１０μgの範囲にある。ＶＬＰの量は、ＥＬＩＳＡにより決定し得る。本発明のワクチン組成物は、本明細書に記載する、有効量のデング抗原を有利に含む。
本発明のワクチン組成物はさらに、薬学的に許容される担体または賦形剤を含んでいてよい。本発明の薬学的に許容される担体または賦形剤は、医薬品またはワクチンの製剤において、安定性、無菌性および活性薬剤のデリバラビリティを亢進するために一般的に使用される、ヒトにおいて、二次応答、例えばアレルギー応答を全く引き起こさない、任意の溶媒または分散媒等を指す。賦形剤は、選択された医薬形態、投与方法および経路に基づいて選択される。医薬製剤に関する適当な賦形剤および要件は、“Remington's Pharmaceutical Sciences”(19th Edition, A.R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995))に記載されている。薬学的に許容される賦形剤の具体的な例としては、水、リン酸緩衝食塩水（PBS）溶液および０.３%グリシン溶液が挙げられる。本発明のワクチン組成物は、０.４% 生理食塩水および２.５% ヒト血清アルブミン (HSA)を有利に含んでいてよい。
本発明の方法で用いるためのワクチン組成物は、生理的条件に近付けるために、薬学的に許容される補助物質、例えばｐH調整剤および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、ヒト血清アルブミン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、Ｌ−塩酸アルギニン（L-arginine hydrochlorate）、サッカロース、無水Ｄ−トレハロース、ソルビトール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよび／または尿素を、適宜含んでいてよい。さらに、本ワクチン組成物は、薬学的に許容される添加剤、例えば、希釈剤、結合剤、安定剤および保存剤を含んでいてよい。好ましい安定剤は、国際公開第２０１０/００３６７０号に記載されている。
本発明のワクチン組成物は、デング免疫蛋白質であるデング抗原を含んでいてよい。本明細書中にて、デング免疫蛋白質は、免疫適格性の対象に投与した場合に、血清型１、２、３または４のデングウイルスに対して中和抗体を誘発するデングエンベロープ（Ｅ）蛋白質、またはその誘導体もしくは断片である。デング免疫蛋白質には、デングＥ蛋白質の天然および誘導体形態が含まれ、その化学共役体、免疫断片および融合蛋白質が含まれる。
デング免疫蛋白質またはその誘導体もしくは断片は、担体分子に共役させてよい。かかる共役は、化学的な共役技術またはデング免疫蛋白質またはその誘導体もしくは断片と担体分子を含む融合蛋白質の組み換え発現により達成し得る。共役体を作成するのに使用する担体分子の例としては、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、破傷風毒素のフラグメントＣ、ジフテリア毒素の変異体、例えばＣＲＭ１９７、ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ９、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３およびＣＲＭ１０７、肺炎球菌ニューモリシン、OMPC、熱ショック蛋白質、百日咳蛋白質、肺炎球菌表面蛋白質PspAまたはクロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）の毒素ＡもしくはＢが挙げられる。
本発明のワクチン組成物は、該デング抗原の免疫原性を増強するために１つ以上のアジュバントを含んでいてよい。当業者には、本発明において適当なアジュバントを選択することができるであろう。アジュバントは、不活化ウイルス、またはＶＬＰまたはデング構造蛋白質を含む、本発明のワクチン組成物で用いるのが好ましい。アジュバントは、複製に影響を及ぼさない限り、弱毒化生ウイルスを含む本発明のワクチン組成物にて用いてもよい。
適当なアジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウムまたはアルミニウムミョウバンのようなアルミニウム塩が挙げられるが、カルシウム、マグネシウム、鉄もしくは亜鉛の塩であってもよい。さらなる適当なアジュバントとしては、アクリル酸チロシンまたは糖アクリル酸、カチオン性もしくはアニオン性に誘導体化したサッカライド、ポリホスファゼンが挙げられる。あるいは、アジュバントは、水中油型エマルションアジュバント（欧州特許第０ ３９９ ８４３号)ならびに水中油型エマルションと他の活性薬剤との組合せ(国際公開第９５/１７２１０号; 第９８/５６４１４号; 第９９/１２５６５号および第９９/１１２４１号)であってよい。他の油性エマルションアジュバント、例えば油中水型エマルション(米国特許第５,４２２, １０９号; 欧州特許第０ ４８０ ９８２号)および水中油中水型エマルション(米国特許第５,４２４,０６７号; 欧州特許第０ ４８０ ９８１号)が記載されている。該アジュバントの例としては、ＭＦ５９、ＡＦ０３ (国際公開第２００７/００６９３９号)、ＡＦ０４ (国際公開第２００７/０８０３０８号)、ＡＦ０５、ＡＦ０６およびその誘導体が挙げられる。該アジュバントは、サポニン、リピドＡまたはその誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、リン酸アルキルグルコサミド(alkyl glucosamide phosphate)、水中油型エマルションまたはその組合せであってよい。サポニンの例としては、Quil Aおよびその精製断片、例えばＱＳ７およびＱＳ２１が挙げられる。
当業者には理解されることであるが、本発明のワクチン組成物は、意図する投与経路に適合するように適当に製剤される。適当な投与経路の例としては、例えば、筋肉内、経皮、皮下、鼻腔内、経口または皮内が挙げられる。該投与経路は、有利には、皮下投与である。
本発明のワクチン組成物は、例えば、Becton Dickinson Corporation (Franklin Lakes, NJ, USA) より市販されているような、慣用されている皮下注射器または安全注射器またはジェット式注射器を用いて投与してよい。皮内投与には、慣用されている皮下注射器を、マントー法を用いて使用するか、または特定化した皮内送達デバイス、例えばBD Soluvia(TM) microinjection system (Becton Dickinson Corporation, Franklin Lakes, NJ, USA)を使用してよい。
本発明のワクチン組成物の投与量は、投与方法に依存する。皮下注射の場合、投与量は、一般的に０.１〜１.０ mlであり、好ましくは約０.５ mlである。
また、本発明のワクチン組成物の追加投与を、例えば、初回免疫から（すなわち、初回免疫化レジメンの計画による最後の投与から）６ヶ月〜１０年後、例えば６ヶ月、１年、３年、５年または１０年後に行ってよい。
実施態様の一において、本発明はまた、本発明のワクチン組成物と、該ワクチン組成物を、ヒト対象をデング病に対して保護する方法における使用説明書とを含むキットを提供する。該キットは、本明細書にて考慮される任意のワクチン組成物を（典型的には注射器で）少なくとも１用量含んでいてよい。実施態様の一によれば、該キットは、本明細書に記載する任意のワクチン組成物の反復投与用製剤を（典型的にはバイアルで）含んでいてよい。該キットはさらに、デング病を防ぐ（prevention）ための該ワクチン組成物の使用またはデング病の予防（prophylaxis）のための該ワクチンの使用について言及するリーフレットをさらに含む。該リーフレットはさらに、ワクチン接種レジメンおよびワクチン接種を受けるべきヒト対象集団について言及していてもよい。
デング病の発症の可能性または重症度の低下における本発明のワクチン組成物の有効性は、多くの方法で測定し得る。例えば、症候性のウイルス学的に確認されるデング病の可能性または重症度の低下における、本発明のワクチン組成物の有効性は、該ワクチン組成物を少なくとも１回投与した後（例えば、該ワクチン組成物を１、２または３回投与した後）に、該ワクチン組成物の投与を受けた対象群において、以下：
(i) 任意の血清型のデングウイルスにより引き起こされる症候性のウイルス学的に確認されるデング症例のパーセンテージ;
(ii) 任意の血清型のデングウイルスにより引き起こされる重度のウイルス学的に確認されるデング症例のパーセンテージ;
(iii) 任意の血清型のデングウイルスにより引き起こされるグレードＩ〜ＩＶのデング出血熱の症例のパーセンテージ;
(iv) 任意の血清型のデングウイルスにより引き起こされるグレードＩのＤＨＦ症例のパーセンテージ;
(v) 任意の血清型のデングウイルスにより引き起こされるグレードＩＩのＤＨＦ症例のパーセンテージ;
(vi) 任意の血清型のデングウイルスにより引き起こされるグレードＩＩＩのＤＨＦ症例のパーセンテージ;
(vii) 任意の血清型のデングウイルスにより引き起こされるグレードＩＶのＤＨＦ症例のパーセンテージ;
(viii) 任意の血清型のデングウイルスにより引き起こされるウイルス学的に確認されるデングの年間の入院率; および／または
(ix) 任意の血清型のデングウイルスにより引き起こされる症候性のウイルス学的に確認されるデング症例についての、入院期間の長さ;
を決定し、該数値を、該ワクチン組成物の投与を受けていない対象の対照群の相当する数値と比較することにより算出でき、ここで、両方の群の対象はともに、デング流行地域に居住している。非ワクチン接種対照群の対象と比較した場合に、ワクチン接種群の対象の（ｉ）〜（ｉｘ）のいずれか１つ以上が統計学的に有意に低下していれば、本発明のワクチン組成物が有効であることが示される。好ましい実施態様において、本発明のワクチン組成物の有効性は、上述の数値の１つ以上が統計学的に有意に低下していることによって示され、ここで、ＤＨＦ症例またはデング症例は、血清型１、３または４のデングウイルスによって引き起こされる。
デング病の重症度または発症の可能性の低下における本発明のワクチン組成物の有効性はまた、該ワクチン組成物を少なくとも１回投与した後（例えば、該ワクチン組成物を１回、２回または３回投与した後）に、該ワクチン組成物の投与を受け、ウイルス学的に確認されるデング病を発症した対象群において、以下:
(i) 熱の平均持続期間および／または程度;
(iii) ヘマトクリットの変化により規定される血漿漏出の平均値;
(iii) 血小板減少（血小板数）の平均値；および／または
(iv) アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）を含む肝臓酵素レベルの平均値
を決定し、これらの数値を、該ワクチン組成物の投与を受けず、ウイルス学的に確認されるデング病を発症した対象の対照群における相当する数値と比較することにより算出し得る。ウイルス学的に確認されるデング病を発症した対象による対照群と比較した場合に、ウイルス学的に確認されるデング病を発症したワクチン接種対象群において、（ｉ）〜（ｖ）のいずれか１つ以上が統計学的に有意に低下していれば、本発明のワクチン組成物が、デング病の重症度または発症の可能性の低下に有効であることが示される。
典型的には、本発明のデング病に対する保護方法の有効性は、例えば、実施例１に記載する方法 (VE=１００*(１-IDＣＹＤ/ID対照)（式中、IDは、それぞれの群における罹患密度 (すなわち、ウイルス学的に確認されるデング病のヒト対象の数をリスク人年の数で割った値)である)）で測定した場合、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％であり、ここで、該デング病は血清型１、３または４により引き起こされる。該保護方法の有効性は、有利には、血清型３または４により引き起こされるデング病に対して少なくとも７０％であり、好ましくは８０％である。該保護方法の有効性は、血清型４により引き起こされるデング病に対して、有利には少なくとも９０％である。
２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列の間のパーセント同一性は、標準のアラインメントアルゴリズム、例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol., 215: 403-410に記載のBLAST (Basic Local Alignment Tool)、Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol., 48: 444-453に記載のアルゴリズム; Meyers et al. (1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17に記載のアルゴリズム; またはTatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett., 174: 247-250に記載のアルゴリズム等によって決定する。該アルゴリズムは、BLASTN、BLASTPおよび"BLAST 2 Sequences"プログラム(www.ncbi.nim.nih.gov/BLASTを参照のこと)に取り込まれる。該プログラムを用いる場合、初期設定のパラメーターを用いてよい。例えば、“BLAST 2 Sequences”については、ヌクレオチド配列に関しては以下の設定を使用してよい: プログラム：BLASTN、reward for match：2、penalty for mismatch：-2、open gap penaltyおよび extension gap penalty: それぞれ5および2、gap x-dropoff：50、expect：10、word size：11、filter：ON。“BLAST 2 Sequences”について、アミノ酸配列に関しては以下の設定を使用してよい: プログラム：BLASTP、マトリクス：BLOSUM62、open gap penaltyおよびextension gap penalty：それぞれ11および1、gap x-dropoff：50、expect：10、word size 3、filter：ON。
本願は、以下の発明を包含する。
［発明１］
デング病に対するヒト対象の保護方法に使用するためのワクチン組成物であって、以下：
(i) 以下からなる群から選択されるデング抗原：
(a) 弱毒化生デングウイルス;
(b) 不活化デングウイルス;
(c) 弱毒化生、または不活化キメラデングウイルス;
(d) デングウイルス様粒子 (ＶＬＰ); および
(e) (a)〜(d)の２つ以上の組合せ;
または
(ii) ヒト細胞において、デングＶＬＰであるデング抗原を発現させることのできる核酸構築物またはウイルスベクター
を含む、ワクチン組成物。
［発明２］
該ヒトが４〜１１歳である、発明１記載の、使用するための組成物。
［発明３］
該対象がデング流行地域に居住している、発明１または２記載の、使用するための組成物。
［発明４］
該対象が、フラビウイルス免疫性である、発明１〜３のいずれか記載の、使用するための組成物。
［発明５］
該対象がフラビウイルスナイーブである、発明１〜４のいずれかに記載の、使用するための組成物。
［発明６］
該方法によって、デング病の発症頻度または可能性が低下する、発明１〜５のいずれか記載の方法に使用するための組成物。
［発明７］
デング病がウイルス学的に確認されるものである、発明１〜６のいずれか記載の方法に使用するための組成物。
［発明８］
該デング病が、血清型１、血清型３または血清型４のデングウイルスにより引き起こされる、発明１〜７のいずれか記載の方法に使用するための組成物。
［発明９］
該方法が該組成物を複数回投与することを含む、発明１〜８のいずれか記載の、使用するための組成物。
［発明１０］
該方法が該組成物を３回以上投与することを含む、発明８記載の、使用するための組成物。
［発明１１］
１回目の投与と３回目の投与が約１２ヶ月の間隔をおいて投与される、発明８または９記載の、使用するための組成物。
［発明１２］
該方法が、１回目、２回目および３回目に投与することを含み、２回目の投与を１回目の投与から約６ヶ月後に行い、３回目の投与を１回目の投与の約１２ヶ月後に行う、発明８〜１０のいずれか記載の、使用するための組成物。
［発明１３］
該組成物が血清型１のデング抗原、血清型２のデング抗原、血清型３のデング抗原および血清型４のデング抗原を含む、発明１〜１２のいずれか記載の、使用するための組成物。
［発明１４］
該組成物が、弱毒化生デングウイルスまたは弱毒化生キメラデングウイルスを含む、発明１〜１３のいずれか記載の、使用するための組成物。
［発明１５］
血清型１、２、３および４の該デング抗原が、それぞれ、弱毒化生デングウイルスまたは弱毒化生キメラデングウイルスから独立して選択される、発明１３記載の、使用するための組成物。
［発明１６］
血清型１、３および４のデング抗原がそれぞれ、弱毒化生キメラデングウイルスであり、血清型２のデング抗原が、弱毒化生デングウイルスおよび弱毒化生キメラデングウイルスからなる群から選択され、好ましくは弱毒化生デングウイルスである、発明１５記載の、使用するための組成物。
［発明１７］
血清型２のデング抗原が、配列番号２４で示す配列に、少なくとも９０%の配列同一性を示す核酸配列を含む、弱毒化生デングウイルスである、発明１６記載の、使用するための組成物。
［発明１８］
血清型１、２、３および４のデング抗原がそれぞれ、弱毒化生キメラデングウイルスである、発明１５記載の、使用するための組成物。
［発明１９］
弱毒化生キメラデングウイルスを含む、発明１〜１８のいずれか記載の、使用するための組成物。
［発明２０］
該キメラデングウイルスが、デングウイルス由来の１つ以上の蛋白質と、異なるフラビウイルス由来の１つ以上の蛋白質とを含む、発明１〜１９のいずれか記載の、使用するための組成物。
［発明２１］
該キメラデングウイルスが、１つの血清型のデングウイルス由来の１つ以上の蛋白質と、他の血清型のデングウイルス由来の１つ以上の蛋白質とを含む、発明１〜１９のいずれか記載の、使用するための組成物。
［発明２２］
異なるフラビウイルスが、黄熱ウイルスである、発明１９または２０記載の、使用するための組成物。
［発明２３］
黄熱ウイルスが、株ＹＦ１７Ｄである、発明２１または２２記載の、使用するための組成物。
［発明２４］
該キメラデングウイルスが、デングウイルスのｐｒＭ−Ｅ配列を含む、発明１３〜２３のいずれか記載の、使用するための組成物。
［発明２５］
該キメラデングウイルスが、ｐｒＭ−Ｅ配列がデングウイルスのｐｒＭ−Ｅ配列で置換された、黄熱ウイルスのゲノムを含む、発明１３〜２０および２２〜２４のいずれか記載の、使用するための組成物。
［発明２６］
ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４のｐｒＭ−Ｅ配列を含む、発明１３〜２５のいずれか記載の、使用するための組成物。
［発明２７］
ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４を含む、発明１３〜２０および２２〜２６のいずれか記載の、使用するための組成物。
［発明２８］
ＣＹＤ−１、ＶＤＶ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４を含む、発明１３〜１７、１９〜２０および２２〜２５および２１〜２５のいずれか記載の、使用するための組成物。
［発明２９］
少なくとも１つの血清型デングウイルスが、約１０ ３ 〜約１０ ６ CCID ５０ の量で存在する、発明１３〜２８のいずれか記載の、使用するための組成物。
［発明３０］
少なくとも１つの血清型のデングウイルスが、約１０ ３ 〜約１０ ７ CCID ５０ の量で存在する、発明１３〜２８のいずれか記載の、使用するための組成物。
［発明３１］
４つ全ての血清型のデングウイルスを含み、各血清型が、約１０ ３ 〜約１０ ６ CCID ５０ の量で存在する、発明２７または２９記載の、使用するための組成物。
［発明３２］
４つの血清型全てのデングウイルスを含み、各血清型それぞれが、約１０ ３ 〜約１０ ７ CCID ５０ の量で存在する、発明３０記載の、使用するための組成物。
［発明３３］
少なくとも１つの血清型のデングウイルスが、約１０ ５ CCID ５０ の量で存在する、発明１３〜３２のいずれか記載の、使用するための組成物。
［発明３４］
少なくとも１つの血清型のデングウイルスが、約１０ ６ CCID ５０ の量で存在する、発明１３〜３２のいずれか記載の、使用するための組成物。
［発明３５］
４つ全ての血清型のデングウイルスを含み、それぞれの血清型が約１０ ５ CCID ５０ で存在する、発明３１記載の、使用するための組成物。
［発明３６］
該組成物が４つ全ての血清型のデングウイルスを含み、それぞれの血清型が約１０ ６ CCID ５０ の量で存在する、発明３２記載の、使用するための組成物。
［発明３７］
該組成物が凍結乾燥されている、発明１〜３６のいずれか記載の、使用するための組成物。
［発明３８］
該方法が、ヒト対象に皮下経路を介して投与することを含む、発明１〜３７のいずれか記載の、使用するための組成物。
［発明３９］
薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、発明１〜３８のいずれか記載の、使用するための組成物。
［発明４０］
デング病に対してヒト対象を保護する方法であって、該ヒト対象に、発明１〜３９のいずれか記載の組成物を有効量投与することを含む、方法。
［発明４１］
発明１〜３９のいずれか記載の組成物と、デング病に対してヒト対象を保護する方法において該組成物を用いるための使用説明書とを含むキット。
本明細書に記載する、本発明の種々の特徴および好ましい実施態様は、組み合わせてもよいことは理解される。

本明細書において、種々の文献を引用する。これらの引用文献の開示内容は、出典明示により本明細書の一部を構成する。
本発明は、以下の実施例によりさらに説明される。しかし、本発明は、特許請求の範囲により定義されるものであり、これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものするものではないことは理解されるべきである。
実施例１：タイにおける、ChimerivaxＴＭ ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４を含む四価デングワクチン（ＴＤＶ）組成物を用いてワクチン接種した患者の一年間の経過観察
方法：
試験計画および参加者
ウイルス学的に確認されたデング病に対する、四価ChimerivaxＴＭワクチン (すなわち、ＤＥＮ１ PU０３５９(TYP １ １４０)のｐｒＭおよびＥ配列から作成した特定のＣＹＤ−１株、ＤＥＮ２ ＰＵＯ２１８のｐｒＭおよびＥ配列から作成した特定のＣＹＤ−２株、ＤＥＮ３ ＰａＨ８８１/８８のｐｒＭおよびＥ配列から作成した特定のＣＹＤ−３株ならびにＤＥＮ４ １２２８(ＴＶＰ ９８０)のｐｒＭおよびＥ配列から作成した特定のＣＹＤ−４株を含む四価のワクチン、国際公開第０３/１０１３９７号およびGuy et al., Vaccine (2011), 29(42): 7229-41参照) の有効性についての観察者盲検（observer-blind）、無作為化、対照、単一中心(monocentric)、フェーズＩＩｂ試験を行う。病歴および健康診断に基づいて、健康状態の良い４〜１１歳の就学児童４００２人を、該試験に登録する。該試験は、Ratchaburi Regional Hospital (RRH)（Ratchaburi province, Muang district, Thailand）にて行う。登録時に急性の熱性の疾病を発症した児童、先天性もしくは後天性の免疫不全を示す児童、および免疫抑制療法または他の禁止された処置もしくはワクチンの投与を受けている児童を除外する。参加者を、０、６および１２ヶ月の時点で、デングワクチンの投与を３回受けるか、または対照調製物の投与を受けるように、無作為に２：１に割り当てる。
調製物
以下の文献に記載されているように、キメラウイルスをそれぞれ作成し、Ｖｅｒｏ細胞で培養する：国際公開第０３/１０１３９７号, Guy et al, Hum. Vaccines (2010) 6 (9): 696; Guy et al, Vaccine (2010) 28: 632; Guirakhoo et al, J. Virol. (2000) 74 : 5477 ; Guirakhoo et al, J. Virol. (2001) 75 (16) : 7290 ; Guirakhoo et al, Virol. (June 20, 2002) 298: 146; およびGuirakhoo et al, J. Virol. (2004) 78 (9): 4761。
該ワクチンは、凍結乾燥粉末として提供され（予め２℃〜８℃の温度で保存）、注射用に溶媒(０.４% NaCl、２.５%ヒト血清アルブミンを含む)０．５mLを用いて再構成される。再構成すると、ワクチンは、０.５ mLの用量につき、それぞれ、各血清型のキメラデング (１、２、３および４)を５±１ log１０ CCID５０および賦形剤 (必須アミノ酸、非必須アミノ酸、塩酸Ｌ−アルギニン、サッカロース、無水Ｄ−トレハロース、ソルビトール、トリス（ヒドロキシルメチル）アミノエタンおよび尿素)を含む。対照調製物は、対照群に無作為に割り当てた最初の５０人の児童の１回目の注射については、不活化狂犬病ワクチン(Verorab（登録商標）, Sanofi Pasteur, Lyon France) であり、他の全ての注射については、０.９% NaCl 生理食塩水プラシーボである。全ての調製物を、上腕の三角筋領域に、皮下注射する。
評価
学期の間の欠席についての出席簿による毎日の調査（欠席者の電話および家庭訪問による追跡）ならびに、学校休暇中の２週間毎の家庭訪問、電話または携帯電話のテキストメッセージに基づいて、急性の熱性疾病を検出するために、全ての児童を積極的に監視する。熱性の疾病（少なくとも４時間間隔をあけて、３７.５℃以上の体温が２回測定される疾病として定義される）のいずれの場合においても、診断および処置のために、児童をＲＲＨで受診させるように親に依頼する。該調査システムはまた、ＲＲＨでの自発的な受診も捕捉する。１４日間以上の無症候期間で分けられる連続的な発熱エピソードは、別々のエピソードと見なす。発症時 (すなわち、発熱から７日以内に採取した、急性期の試料) および７〜１４日後（回復期の試料）で一対の血清試料として、Sanofi Pasteur’s Global Clinical Immunology (GCI) laboratory (Swiftwater, PA, USA) およびCentre for Vaccine Development (CVD, Mahidol University, Thailand)に送る。急性期の試料は、フラビウイルスの有無を検定するフラビウイルスの保存性の高い配列からなるプライマーを用いた初期ＲＴ−ＰＣＲアッセイによって、フラビウイルスの有無についてスクリーニングを行う。陽性の試料を、本明細書に記載する、血清型特異的な定量ＲＴ−ＰＣＲによって、野生型デングウイルスについて試験する。並行して、全ての急性期試料を、市販のＥＬＩＳＡキット(PlateliaＴＭ, Bio-Rad Laboratories, Marnes-La-Coquette, France)を用いて、デングＮＳ１抗原の有無について試験する。ウイルス学的に確認されるデング病のエピソードは、血清型特異的なＲＴ−ＰＣＲまたはＮＳ１抗原ＥＬＩＳＡの結果が陽性であることで定義する。
積極的調査(active surveillance)は、各参加者を３回目のワクチン接種から少なくとも１３ヶ月間監視し、独立したデータモニタリング委員会（ＩＤＭＣ）が、パープロトコル（ＰＰ）群において２７以上の症例が生じたことを確認するまで続ける。
最後のワクチン接種から６ヶ月後までは、全ての重篤有害事象（ＳＡＥ）を記録し、それ以降は、致死的なＳＡＥまたはワクチン関連性のＳＡＥがあれば記録する。
デング免疫応答は、登録した児童の最初の３００人について、ＲＲＨにて、登録時と各注射から２８日目に採取した血清において評価する。また、３回目の注射から２８日目に、この時点以降に生じるウイルス学的に確認されるデングに罹患している児童における免疫応答を評価するために、予め全ての参加者から血清を採血する。血清はGCIに送り、本明細書に記載する、プラーク減少中和試験(ＰＲＮＴ５０)を用いて、ＣＹＤ親デングウイルスに対する血清特異的な中和抗体力価を測定する。該アッセイの定量限界は１０ (１/希釈率)である。この値を下回る試料は、力価を５とし、血清陰性とみなす。
統計学的解析
第一の目的は、登録し、計画通りにワクチン接種した児童のうち、３回目の接種後２８日より後の時点で症候性のウイルス学的に確認されるデングを発症している例に対するワクチンの有効性（ＶＥ）を、以下の式によって決定することである:
VE =１００*(１-IDＣＹＤ/ID対照)
［式中、IDは、各群における罹患密度（すなわち、ウイルス学的に確認されるデングを発症している児童数を、リスク人年の数で割った値）である。］。推定疾患発症率が１.３％、真(true)ＶＥが７０%、３回目のワクチン接種後の経過観察期間が最短で１年であり、ＰＰ対象の減少率が７.５%/年である場合、デングワクチン接種群または対照群に２：１で割り当てられた４００２人の対象は、ＶＥがヌルでないことを、８２％より高い検出率および９５％の信頼性で示す必要がある。解析は、ＶＥの両側９５％信頼区間（ＣＩ）に基づき、Exact method (Breslow NE, Day NE. Statistical Methods in Cancer Research, Volume II−The Design and Analysis of Cohort Studies. International Agency for Research on Cancer (IARC scientific publication No. ８２), Lyon, France)を用いて算出する。第一の解析を、ＰＰ集団、すなわち、登録基準を満たす集団について行い、この集団は、０、６ヶ月(±１５日)、１２ヶ月(±３０日)の時点で、割り当てられた３回のワクチン接種を正確に全て受け、該群への割り当ては知らされていない。この解析を、有効性について、最大の解析対象集団（FAS集団：Full Analysis Set）に対して繰り返し、この集団は３回の注射を受ける。第二の目的として、デングに対するＶＥを、３回のワクチン接種レジメンが完了する前に決定する。盲検解除後の解析において、各血清型に対するＶＥをそれぞれ調べる。安全性および免疫原性のエンドポイントについてのそれぞれの解析は、９５％信頼区間を用いて表す。
結果
登録した４００２人の児童のうち、９５.９%がワクチン接種を完了し、９１.８%が、有効性についてのＰＰ解析集団（per protocol analysis set）に含まれる。ワクチン接種群および対照群は、年齢および性別について同程度である。ベースラインにて試料採取したうちの９０％より多くが、デングまたはＪＥＶに対する抗体について陽性である。
有効性
試験の間の１３１のデング症例(１３１人の児童が１３６例の発症を示した) が、ウイルス学的に確認されるものである。これらのうちの７７例は、ＰＰ集団の３回目の投与の２８日目より後で発症し、第一の解析に含まれ:ワクチン接種群において、リスク人年２５２２の中で、４５例が発症し、一方、対照群では、リスク人年１２５１の中で３２例が発症した。相当するワクチン有効性は、３０.２% (９５%CI: −１３.４〜５６.６)である。このことは、ＦＡＳ集団において確認される（以下の表１参照）。少なくとも１回注射を行った後の有効性は、３３.４% (９５%CI: ４.１〜５３.５)であり、少なくとも２回注射を行った後では、３５.３% (９５%CI: ３.３〜５６.５)である。
事後解析により、血清型により、有効性が異なることが明らかになっている(表１を参照のこと)。少なくとも１回注射した後の、ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４に対する有効性は、６１.２%〜９０.０%の範囲にある一方で、ＤＥＮＶ２に対する有効性は１.７%である。３回注射を行った後のＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４に対する有効性は、５５.３%〜１００%の範囲にある一方で、ＤＥＮＶ２に対する有効性は１５.６%である。
ウイルス学的に確認されるデングを発症した対象において、ワクチン接種群では、対照群と比較して年間の入院率が統計学的に有意に減少していた。３回投与後の相対危険度（ＲＲ）は０.５２３であった (表２を参照のこと)。
免疫原性
ＰＰ解析集団における、３回目の注射から２８日目の、デング血清型１〜４に対する中和抗体の幾何平均力価(ＧＭＴ) は、ワクチン接種群ではそれぞれ１４６ (９５%CI: ９８.５〜２１７)、３１０ (２２４〜４３１)、４０５ (３０７〜５３４)および１５５ (１２３〜１９６)である。対照群では、これらの値は、２３.９ (１４.０〜４０.９)、５２.２ (２６.８〜１０２)、４８.９ (２５.５〜９３.９)および１９.４ (１１.６〜３２.２)である。１年後のＧＭＴは、血清型１、２、３および４に対してそれぞれ７６.５; １２２; ９４および１５３である。
安全性
該試験の間に、５８４のＳＡＥが見られ: その中の３６６例は、ワクチン接種群の１１.８% (３１５/２６６６)の参加者により報告されたものであり、２１８例は、対照群の１３.２% (１７６/１３３１)の参加者により報告されたものである。デング群には、ワクチン関連性のＳＡＥは全く見られず、対照群では１例が見られる。観察されるSAEは、年齢群と一致する医学的症状であり、ワクチン接種後７日または２８日以内では、クラスタリングを示さない。
ワクチン接種者において、突発的に発症するウイルス学的に確認されるデング症例は、対照群で発症する症例ほど重篤ではなかった。
試験における流行性野生型血清型２株のｐｒＭ−Ｅ領域の配列
試験においてＤＥＮ−２症例を引き起こす野生型の血清型２のｐｒＭ−Ｅ領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を決定する。これらを、以下にそれぞれ配列番号１および配列番号２として示す。試験においてＤＥＮ−２症例を引き起こす血清型２株のＥおよびＭのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１８および２３として示す。
＞ヌクレオチド配列 (配列番号１)
ttccatctaaccacacgcaacggagaaccacacatgatcgtcggtatacaggagaaagggaaaagtcttctgttcaaaacagaggatggtgtgaacatgtgcaccctcatggctatggaccttggtgaattgtgtgaagacacaatcacgtacaagtgtcctcttctcaggcagaatgagccagaagacatagactgttggtgcaactccacgtccacgtgggtaacctatgggacctgtaccactacgggagaacataggagagaaaaaagatcagtggcactcgttccacatgtgggaatgggactggagacgcgaaccgaaacatggatgtcatcagaaggggcttggaaacatgcccagagaattgaaacttggatcctgagacatccaggcttcaccataatggcagcaatcctggcatacaccataggaacgacacatttccagagagtcctgattttcatcctactgacagctgtcgctccttcaatgacaatgcgttgcataggaatatcaaatagagactttgtagaaggggtttcaggaggaagttgggttgacatagtcttagaacatggaagctgtgtgacgacgatggcaaaaaacaaaccaacattggatttcgaactgataaaaacggaagccaaacagcctgccaccctaaggaagtactgcatagaagcaaaactaaccaacacaacaacagaatcccgttgcccaacacaaggggaacccagcctaaaagaagagcaggacaagaggttcgtctgcaaacactccatggtagacagaggatggggaaatggatgtggattatttggaaagggaggcattgtgacctgtgctatgttcacatgcaaaaagaacatggaagggaaaatcgtgcaaccagaaaacttggaatacaccattgtggtaacacctcactcaggggaagagcatgcggtcggaaatgacacaggaaaacacggcaaggaaatcaaagtaacaccacagagttccatcacagaagcagaactgacaggttatggcaccgtcacgatggagtgctccccgagaacaggcctcgacttcaatgagatggtgttgctgcagatggaaaataaagcttggctggtgcataggcaatggtttctagacctgccattaccatggctgcccggagcggataaacaagaatcaaattggatacagaaagaaacattggtcactttcaaaaatccccatgcgaagaaacaggatgttgttgttttaggatcccaagaaggggccatgcatacagcactcacaggagccacagaaatccaaatgtcgtcaggaaacttgctcttcactggacatctcaagtgcaggctgagaatggacaagctacagcttaaaggaatgtcatactctatgtgcacaggaaagtttaaagttgtgaaggaaatagcagaaacacaacatggaacgatagttatcagagtgcaatatgaaggggacggctctccatgtaaaattccttttgagataatggatttggaaaaaagatatgtcttaggccgcctgatcacagtcaacccaattgtaacagaaaaagacagcccagtcaacatagaagcagaacctccattcggagacagttacatcatcataggagtagagccgggacaactgaagctcaactggttcaagaaaggaagttctatcggccaaatgtttgagacaacgatgagaggggcgaagagaatggccattttgggtgacacagcctgggacttcggatccctgggaggagtgtttacatctataggaaaagctctccaccaagtctttggagcgatctatggggctgccttcagtggggtttcatggaccatgaaaatcctcataggagtcattatcacatggataggaatgaactcacgcagcacctcactgtctgtgtcactggtactggtgggaattgtgacactgtatttaggagtcatggtgcaggcc
＞アミノ酸配列 (配列番号２)
FHLTTRNGEPHMIVGIQEKGKSLLFKTEDGVNMCTLMAMDLGELCEDTITYKCPLLRQNEPEDIDCWCNSTSTWVTYGTCTTTGEHRREKRSVALVPHVGMGLETRTETWMSSEGAWKHAQRIETWILRHPGFTIMAAILAYTIGTTHFQRVLIFILLTAVAPSMTMRCIGISNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLKEEQDKRFVCKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFTCKKNMEGKIVQPENLEYTIVVTPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKVTPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMENKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADKQESNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRYVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVSLVLVGIVTLYLGVMVQA
＞アミノ酸配列 (配列番号１８)
MRCIGISNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLKEEQDKRFVCKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFTCKKNMEGKIVQPENLEYTIVVTPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKVTPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMENKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADKQESNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRYVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVSLVLVGIVTLYLGVMVQA
＞アミノ酸配列 (配列番号２３)
SVALVPHVGMGLETRTETWMSSEGAWKHAQRIETWILRHPGFTIMAAILAYTIGTTHFQRVLIFILLTAVAPSMT
検討
この試験で主に明らかにされたことは、キメラＣＹＤウイルスに基づいた、デングウイルスに対する安全で有効なワクチンが可能であるということである。ＤＥＮＶ１、３および４に対する推定有効性は、仮定の７０％に相当する範囲であり、少なくとも１回のワクチン接種の後において統計学的に有意である。ＤＥＮＶ２に対しては、仮定の７０％に相当する範囲の有効性は観察されていない。ＤＥＮＶ２は、この試験において流行している血清型であるため、この条件における、全体的なワクチン有効性が減少している。
該ワクチンは安全性および反応原性プロファイルが優れており、２６００人より多くのワクチン接種者の２年間にわたる積極的な経過観察より集めたＡＥおよびＳＡＥを再調査しても、ワクチン関連性のＳＡＥおよび安全シグナルは特定されない。これまでは、４つの血清型のデングに対する免疫応答が不完全であることにより、デング病の発症率または重症度が高くなる可能性に伴う、論理的な安全性への懸念により、ワクチンの開発が妨げられてきた。この試験において、流行しているＤＥＮＶ２ウイルスに対する免疫応答が不完全であっても、疾患の亢進が見られないということは、重要で人を安心させる発見である。例えば、ワクチン接種者における症例は、発熱期間のような要素または、出血、血漿漏出または血小板減少のような標準的なデング病の臨床症候において、対照における症例と異なるものではない。さらに、ワクチン接種者において、試験のいずれのタイムポイントにおいても、重症のデングを対照よりも頻繁に発症することはなかった。
ウイルス学的に確認されるデング病に罹患した対象において、ワクチン接種群では、年間の入院率が、対照群と比較して有意に低下している様が観察された。この低下は、ウイルス学的に確認される、血清型２のデング病に罹患した対象において見られた(表３を参照のこと)。
ＤＥＮＶ２について観察される結果は、多数の要因によって説明し得る。例えば、ＣＹＤ２ワクチンウイルスと、該試験で疾患を引き起こすＤＥＮＶ２ウイルスの間には、抗原性にミスマッチがある可能性がある。それまで優位であったウイルスのAsian/American株に取ってかわった遺伝子型Asian １のＤＥＮＶ２は、１９９０年代に、東南アジアで出現したものである。Ｅ蛋白質のドメイン２において特定された、いくつかの変異 (Ｅ８３および特にＥ２２６およびＥ２２８) は、ウイルスの適応症および抗原性が変化していることを示唆している。ＣＹＤ２ワクチンのドナー野生型ウイルス(およびＰＲＮＴ５０で用いた負荷株) は、１９８０年にバンコクより臨床的に単離されたものである(Guirakhoo F et al., J Virol 2000, 74: 5477−85)。このウイルスは、遺伝子型がAsian Iに属するとして分類されている一方で、このウイルス（したがってＣＹＤ２）において重要な上述のアミノ酸残基は、Asian/American遺伝子型のものに相当する (Hang et al PLoS Negl Trop Dis. 2010 Jul 20;4(7):e757)。
さらに、ＣＹＤ２ワクチンのｐｒＭ−Ｅ配列には、免疫応答のミスマッチに寄与し得る、２つのきわめて希少な変異がある。これらの変異は、ｐｒＭ２４およびＥ２５１に位置する (Guirakhoo et al, J. Virol. (2004) 78 (9): 4761)。
ＤＥＮＶ２に対して観察される結果は、ＰＲＮＴ５０アッセイで免疫原性が見られないことに相関するものではない。ＤＥＮＶ２に対するワクチン接種後の中和抗体応答は、ＤＥＮＶ１およびＤＥＮＶ３に対するものよりも高い。
結論として、本試験は、安全で有効なデングワクチンが可能であるということをこれまでで初めて示したものであり、デングワクチン開発の主要な道標となるものである。
実施例２:血清型２のデングワクチンの最適株の特定
本実施例の目的は、血清型２のデングウイルスに対して最適なデングワクチン組成物を作成するための基礎をもたらす、血清型２のデングウイルス株を特定することであり、ここで、該最適デングワクチン組成物は、本発明の方法で用いた場合に、ChimerivaxＴＭ ＣＹＤ−２と比較して、有効性を改善する。
一般的なデング２抗原を決定するための最適株の選択を決定する基準としては、以下が挙げられる: (i) 近年流行している株であること; (ii) Asian株およびAmerican株の均衡のとれた選択; (iii) 最適な株は、入手可能な血清型２のデングウイルスのｐｒＭ−Ｅ配列の配列比較により作成した、推定グローバルコンセンサス配列とできる限り類似するｐｒＭ−Ｅ配列を有していなければならない; (iv) 抗原認識に影響を与えると予測されるアミノ酸変異は避けるべきである; (v) ｐｒＭおよびＥ配列の特定の位置、特にＥ蛋白質の外部ドメインにおいては、希アミノ酸は避けるべきである（特定の位置における希アミノ酸とは、その位置にそのアミノ酸があることが、比較した配列のうち１５％未満であるアミノ酸を指す）; (vi) 最適株は、これまでにいくつかの研究室で用いられたことがあるものが望ましく、そして(vii) 四価組成物において均衡の取れた免疫応答を引き起こすデング抗原であること。
局地的なデング２抗原に対する(すなわち、特定の地域で流行している野生型のデングウイルスに対して特に効果的な)最適株の選択を決定するための基準は、基準(ｉ)および（ｖｉｉ）である。
方法
データベース
配列は、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）デングウイルスバリエーションのデータベースより検索する
(www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/VirusVariation/Database/nph-select.cgi?tax_id=12637)。
配列解析
配列比較は、MUSCLEアルゴリズム (Edgar, R. C. (2004) MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res, 32(5):1792-1797)を用いて行う。
配列比較の結果は、Vector NTi version ９, module AlignX (Invitrogen)に作成される。配列の類似度検索は、BLASTアルゴリズムを用いて行う (Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., and Lipman, D. J. (1990) Basic local alignment search tool. J Mol Biol, 215(3):403-410)。
ｐｒＭ−Ｅ配列の配列番号付け
ｐｒＭ−Ｅ配列に含まれるサブ配列は、様々な方法で番号付けを行ってよい: (i) 全長のｐｒＭ-Ｅ蛋白質配列は、１番〜６６１番まで番号を付け、ｐｒｅＭ蛋白質の配列を１番〜９０/９１番とし、Ｍ蛋白質の配列を９１/９２番〜１６６番ならびに、Ｅ蛋白質の配列を１６７番〜６６１番とする; (ii) ｐｒＭおよびＭ蛋白質の配列は、まとめて番号を付け、すなわち、全配列の１番〜１６６番まで番号を付け、Ｅ蛋白質は別に１〜４９５番とする; (iii) ｐｒＭ、ＭおよびＥ配列に別々に番号を付ける、すなわち、ｐｒＭを１番〜９０/９１番、Ｍを１番〜７５/７６番およびＥを１番〜４９５番とする。
結果
公知配列検索
入手可能な全ての血清型２のデングウイルスの全長のｐｒＭおよびＥ蛋白質の配列を、NCBIデングデータベースからダウンロードする。配列のダウンロードは、２回の別々の機会、２０１０年１０月４日と２０１１年に行った。１回目には、６６９の配列をダウンロードし、２回目には約３２００の配列をダウンロードした。
グローバルコンセンサス配列の作成
それぞれの場合に、検索した蛋白質の配列を全て並列比較して、血清型２のデングウイルスのｐｒＭおよびＥ蛋白質のグローバルコンセンサス配列を作成する。グローバルコンセンサス配列は、定義によれば、各位置に最も頻度の高いアミノ酸を含む、人工配列である。２０１０年の配列比較についてのグローバルコンセンサス配列と、２０１１年の配列比較についてのグローバルコンセンサス配列は、２つのアミノ酸においてのみ異なる。２０１０年の配列比較では、グローバルコンセンサス配列は、Ｅ蛋白質の第１２９番および第３０８番の位置にそれぞれイソロイシンおよびバリンを含み（Ｅ配列を１〜４９５番と番号付け）、対照的に、２０１１年の配列比較では、グローバルコンセンサス配列は、Ｅ蛋白質の第１２９番と第３０８番の位置にそれぞれバリンおよびイソロイシンを含む(Ｅ配列は、１〜４９５番と番号付け)。２０１０年と２０１１年のグローバルコンセンサス配列のかかる差異は、これらの位置に、バリンまたはイソロイシンを含む株のそれぞれのパーセンテージが５０％に近いことにより説明がつく。したがって、ｐｒＭ−Ｅ配列のグローバルコンセンサス配列は以下の通りである：
Ｅ配列のグローバルコンセンサス配列を以下に示す：
上の配列において、ｐｒＭ配列のグローバルコンセンサス配列を小文字で、Ｅ配列のグローバルコンセンサス配列を大文字で示す。Ｘ (Ｅ配列の１２９番) およびＺ (Ｅ配列の第３０８番) として表されるアミノ酸は、それぞれ独立してValまたはIleである、すなわち、配列比較したアミノ酸配列のうち、その位置にValまたはIleを含む配列の割合が、５０％に近い。
微量アミノ酸残基の決定およびChimerivaxＴＭ ＣＹＤ２配列の解析
可変アミノ酸の位置の一覧を、比較した配列において少なくとも５％で変異するアミノ酸の位置を全て含むグローバル配列比較から確立する。さらに、グローバルコンセンサス配列と一致しないChimerivaxＴＭ ＣＹＤ２のｐｒＭおよびＥ蛋白質の配列中の任意のアミノ酸の特定も行う。結果は表４に示す(注、表中、ｐｒＭおよびＭ蛋白質配列はまとめて番号を付ける、すなわち全配列の第１番〜第１６６番であり、Ｅは、別に第１番〜第４９５番に番号を付ける)。
比較した配列において、少なくとも５％の頻度でグローバルコンセンサス配列から変異するおよび／またはＣＹＤ２のｐｒＭおよびＥ蛋白質の配列から異なるｐｒＭおよびＥ配列の合計４１個のアミノ酸位置を特定する。ＣＹＤ２のｐｒＭおよびＥ蛋白質の配列の１０の位置のアミノ酸が、グローバルコンセンサス配列とは異なる(５つがＥ、２つがＭ、および３つが前駆部位に位置する、表４を参照のこと)。異なる１０の残基のうちの５つは、５０:５０に近い変異分布を示し、これは、天然の可変部位であることが示唆される。非常に少数の変異と考えられるのは、ＣＹＤ２ ｐｒＭ−Ｅ配列の中の３つの部位のみである (ｐｒ−２４ Val、Ｍ−１２５ IleおよびＥ−２５１ Phe)。
ＥおよびＭ蛋白質の変異のインパクト解析
可変部位についてさらに洞察するために、免疫系による血清中和に最も重要なドメインである、Ｅ蛋白質外部ドメイン (アミノ酸１〜３９５)における変異をさらに解析する。
血清型２のデングウイルスのＥ蛋白質の可溶型外部ドメインの、公開されている３Ｄ構造より入手可能な情報を用いて(Modis, Y., et al. (2003) Proc Natl Acad Sci U S A, 100(12):6986-6991)、デングウイルス粒子表面の３Ｄモデルを再構成する。これにより、Ｅ外部ドメインの各アミノ酸の接近しやすさを、細かく評価することができ、これを、可変性レベルおよびアミノ酸の変化の性質と組み合わせて、抗体認識に対してＣＹＤ２変異が及ぼす可能性のある影響を評価する。
該解析により、ChimerivaxＴＭＣＹＤ２配列の、グローバルコンセンサス配列からの２つの変異 (Ｅ蛋白質のVal １４１およびVal １６４) は、３Ｄ構造では完全に埋没しているため、ビリオンの表面で抗体と直接相互作用することはできないことが示される。Ｅ蛋白質の第１２９番は、Val (ChimerivaxＴＭ ＣＹＤ２) とIle (グローバルコンセンサス配列)が５０:５０で可変であるアミノ酸部位であり、該置換はまた、完全に保存的な変化である。したがって、これらの変異が及ぼしうる影響は、非常に限定的であると考えられる。
Ｅ蛋白質の２０３番における変異(ChimerivaxＴＭ ＣＹＤ２ではAsnであり、グローバルコンセンサス配列ではAspである)は、影響を与え得る可能性がある(よく露出した残基であり、電位が変化する)が、株間の変異の分布は約５０:５０であるため、これは天然の可変部位であることが示唆される。
ChimerivaxＴＭ ＣＹＤ２のＥ蛋白質の第２５１番目の変異 (ChimerivaxＴＭＣＹＤ２ではPheであり、グローバルコンセンサス配列ではValである) は、検索した株の中できわめて希少なものである。かかる変異は、希少なものであり、ビリオンの表面に比較的よく露出しており（２９％）、保存されていないアミノ酸の変化であるため、抗体による認識に何らかの影響を与えている可能性がある。
上述のモデルアッセイにより、抗体認識に影響を及ぼす可能性のある、Ｅ蛋白質中の他の２つの位置の変異(第２２６番および第２２８番)が検出されるが、ChimerivaxＴＭ ＣＹＤ２は、この部位では、グローバルコンセンサス配列から変異していない。したがって、最適な血清型２株を特定する際に、これらの位置が、グローバルコンセンサス配列から変異している（すなわち、第２２６番がThrであり、第２２８番がGlyである）ものは、ユニバーサルデング２ワクチンに用いるのを避ける方が好ましい。
理論に何ら制約されるものではないが、本発明の発明者は、アミノ酸変異の影響は、多数の関連因子を考慮に入れるスコア法を用いても評価し得ると考えている。具体的には、この方法では、変異のゲノム上の位置（Ｇ）、アミノ酸の変化の性質（Ｂ）、３Ｄマッピング（Ｍ）および問題となっている位置における既知の変異（ＤＢ）を考慮に入れ、ここで、該スコアは、
Ｇx Ｂx Ｍx ＤＢ
として算出する。スコアが０であれば、影響を及ぼさない、＞０〜１０であれば及ぼす影響が低い、＞１０〜２５であれば、中程度の影響が予測される、＞２５であれば、高い影響が予測される、と分類される。
該アミノ酸がｐｒＭ／Ｍ蛋白質のＭ部分(すなわち、ｐｒＭ/Ｍ配列の第９２番〜第１６６番)またはＥ蛋白質の第３９６番〜第４９５番に位置している場合、ゲノム部位のスコア (Ｇ) は０である。該アミノ酸が、ｐｒＭ/Ｍ蛋白質のｐｒＭ部位に位置する場合 (すなわち、ｐｒＭ／Ｍ配列の第１番〜第９１番)またはＥ蛋白質の第１番〜第３９５番に位置する場合、ゲノム部位のスコアは１である。
アミノ酸変化の性質に関するスコア（Ｂ）は、
Ｂ= １００− [(Blosum９５スコア + ６) x １０]
で算出され、種々のアミノ酸置換についてのBlosum９５スコアは、以下の表５に示す通りである。
Ｍ値は、該アミノ酸がｐｒＭ／Ｅインターフェースに位置するかどうかによるものである。例えば、実施例１で用いるＣＹＤ２において、該インターフェースに位置するアミノ酸は、ｐｒＭ残基６、７、３９、４０、４６〜５４、５６、５９〜６５、６７、７４および７７であり、Ｅ残基６４〜７２、８２〜８４、１０１〜１０４、１０６〜１０８および２４４〜２４７である。アミノ酸が該インターフェースに位置する場合、Ｍの値は１である。アミノ酸が該インターフェースに位置していない場合、Ｍ = Ｙ x SAS %である。該アミノ酸が「上側」に位置する（すなわち、外部環境を向いた方向である）場合、Ｙは１であり；該アミノ酸が分子の「側面」に位置する場合（すなわち、該アミノ酸が外部環境にもキャプシドにも向いていない場合）、Ｙは０.５であり、該アミノ酸が「下側」の位置にある（すなわち、キャプシドに向いている）場合、Ｙは０である。溶媒露出面積% (SAS %) の値は、Discovery Studio ３D modeling software (Accelrys, Inc., CA, USA)を用いて作成する。
該アミノ酸置換によって、置換部位のアミノ酸が、GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)に存在するデング配列において、その部位で最も一般的なアミノ酸になる場合、ＤＢの値は０である。該アミノ酸置換によって、置換部位のアミノ酸が、データベースに存在するデング配列において、その部位で５％よりも多く見られる（が、該部位での最も一般的なアミノ酸ではない）アミノ酸になる場合、ＤＢ値は０.２５である。該アミノ酸置換によって、置換部位のアミノ酸が、データベースに存在するデング配列において、その位置で、５％未満で見られるアミノ酸になる場合（ユニークな置換を除く）、ＤＢ値は０.５０である。該アミノ酸置換がユニークなものである場合、ＤＢ値は１である。
ウイルスは、複製の間に、アミノ酸置換をもたらす変異を獲得し得る。上述の方法は、該変異が、変異ウイルスの子孫に及ぼす影響を決定する手法を提供する。
好ましい配列 (すなわち、特定したコンセンサス配列に十分近いと考えられる配列)は、(ｉ)影響の大きいアミノ酸置換を最大で２つ、好ましくは１つ持つかもしくは全く持たない; (ii) 中程度の影響のアミノ酸置換を最大で３つ、好ましくは２つもしくは１つ持つか、または全く持たない; および／または(iii)影響の低いアミノ酸置換を最大で５つ、４つ、３つ、２つまたは１つ有する。
最適化血清型２株の特定
最適化血清型２株は、上述の選択基準に基づいて特定する。
全ての入手可能な配列の中で、ｐｒＭ−Ｅグローバルコンセンサス配列に最も近い配列を有する株を特定するために、ＢＬＡＳＴ検索を行う。ｐｒＭ−Ｅグローバルコンセンサス配列と１００％同一である配列は見つけられないが、最も近いのは、グローバルコンセンサス配列と第９１番における１つの変異のみを示す(グローバルコンセンサス配列ではValであり、ＢＩＤ−Ｖ５８５ではIleである)、ＢＩＤ−Ｖ５８５株由来の配列である (NCBI Protein ID no. ACA58343; Genome ID no. EU529706; 2006年にプエルトリコより単離)。該ＢＩＤ−Ｖ５８５ ｐｒＭ−Ｅ配列は、ChimerivaxＴＭ ＣＹＤ−２ ｐｒＭ−Ｅと比較すると１３の変異を含んでいる。
株の起源において地理的に均衡をもたらすために、株の選択をさらに行う。そのため、近年単離された、BLAST解析にて良いスコアを示すAsian株を選択する(ＭＤ-１２８０株; NCBI Protein ID no. CAR65175; Genome ID no. FM21043;２００４年にベトナムより単離)。グローバルコンセンサス配列と比較して、ｐｒＭ−Ｅ配列に６つの変異を示すが、６つの変異のうちの３つは、株の３０％より多くにおいて天然に変異する可変部位であることが特定されている。該ＭＤ-１２８０ ｐｒＭ−Ｅ配列は、ChimerivaxＴＭ ＣＹＤ−２ ｐｒＭ−Ｅ配列と比較して１５の変異を含む。
株について以前に集積されている多量の知識に基づいて、さらなる株選択を行う。選択したのは、ＬＡＶ−２株としても知られる、Mahidol Universityのデング血清型２ １６６８１株より得られた弱毒化生ウイルスである、ＰＤＫ５３-１６６８１株である (NCBI Protein ID no. AAA73186; Genome ID no. M84728; １９６４年にタイより単離; Blok, J., et al. (1992); Virology 187 (2), 573-590)。該ＬＡＶ−２ ｐｒＭ−Ｅ配列は、グローバルコンセンサス配列と比較して１０の変異を含み、ChimerivaxＴＭ ＣＹＤ−２ ｐｒＭ−Ｅ配列と比較して１３の変異を含む。
上述の基準に基づいて選択されるさらなる株は、ＰＲ/ＤＢ０２３株 (NCBI Protein ID no. AEN71248; Genome ID no. JF804036;２００７年にプエルトリコより単離)である。該ＰＲ/ＤＢ０２３ ｐｒＭ−Ｅ配列は、グローバルコンセンサス配列と比較すると３つの変異を含み、ChimerivaxＴＭ ＣＹＤ−２ ｐｒＭ−Ｅ配列と比較して１３の変異を含む。
選択した株はいずれも、ChimerivaxＴＭＣＹＤ−２ ｐｒＭ−Ｅ配列中に希少アミノ酸、すなわちｐｒＭ-２４にVal、M-１２５にIleおよびE-２５１にPheを含まない。
選択した４つの株のｐｒＭからＥのヌクレオチド配列：
＞ＬＡＶ−２ ｐｒＭEヌクレオチド配列 (配列番号４)
ttccatttaaccacacgtaacggagaaccacacatgatcgtcagcagacaagagaaagggaaaagtcttctgtttaaaacagaggttggcgtgaacatgtgtaccctcatggccatggaccttggtgaattgtgtgaagacacaatcacgtacaagtgtccccttctcaggcagaatgagccagaagacatagactgttggtgcaactctacgtccacgtgggtaacttatgggacgtgtaccaccatgggagaacatagaagagaaaaaagatcagtggcactcgttccacatgtgggaatgggactggagacacgaactgaaacatggatgtcatcagaaggggcctggaaacatgtccagagaattgaaacttggatcttgagacatccaggcttcaccatgatggcagcaatcctggcatacaccataggaacgacacatttccaaagagccctgattttcatcttactgacagctgtcactccttcaatgacaATGCGTTGCATAGGAATGTCAAATAGAGACTTTGTGGAAGGGGTTTCAGGAGGAAGCTGGGTTGACATAGTCTTAGAACATGGAAGCTGTGTGACGACGATGGCAAAAAACAAACCAACATTGGATTTTGAACTGATAAAAACAGAAGCCAAACAGCCTGCCACCCTAAGGAAGTACTGTATAGAGGCAAAGCTAACCAACACAACAACAGAATCTCGCTGCCCAACACAAGGGGAACCCAGCCTAAATGAAGAGCAGGACAAAAGGTTCGTCTGCAAACACTCCATGGTAGACAGAGGATGGGGAAATGGATGTGGACTATTTGGAAAGGGAGGCATTGTGACCTGTGCTATGTTCAGATGCAAAAAGAACATGGAAGGAAAAGTTGTGCAACCAGAAAACTTGGAATACACCATTGTGATAACACCTCACTCAGGGGAAGAGCATGCAGTCGGAAATGACACAGGAAAACATGGCAAGGAAATCAAAATAACACCACAGAGTTCCATCACAGAAGCAGAATTGACAGGTTATGGCACTGTCACAATGGAGTGCTCTCCAAGAACGGGCCTCGACTTCAATGAGATGGTGTTGCTGCAGATGGAAAATAAAGCTTGGCTGGTGCACAGGCAATGGTTCCTAGACCTGCCGTTACCATGGTTGCCCGGAGCGGACACACAAGGGTCAAATTGGATACAGAAAGAGACATTGGTCACTTTCAAAAATCCCCATGCGAAGAAACAGGATGTTGTTGTTTTAGGATCCCAAGAAGGGGCCATGCACACAGCACTTACAGGGGCCACAGAAATCCAAATGTCATCAGGAAACTTACTCTTCACAGGACATCTCAAGTGCAGGCTGAGAATGGACAAGCTACAGCTCAAAGGAATGTCATACTCTATGTGCACAGGAAAGTTTAAAGTTGTGAAGGAAATAGCAGAAACACAACATGGAACAATAGTTATCAGAGTGCAATATGAAGGGGACGGCTCTCCATGCAAGATCCCTTTTGAGATAATGGATTTGGAAAAAAGACATGTCTTAGGTCGCCTGATTACAGTCAACCCAATTGTGACAGAAAAAGATAGCCCAGTCAACATAGAAGCAGAACCTCCATTTGGAGACAGCTACATCATCATAGGAGTAGAGCCGGGACAACTGAAGCTCAACTGGTTTAAGAAAGGAAGTTCTATCGGCCAAATGTTTGAGACAACAATGAGGGGGGCGAAGAGAATGGCCATTTTAGGTGACACAGCCTGGGATTTTGGATCCTTGGGAGGAGTGTTTACATCTATAGGAAAGGCTCTCCACCAAGTCTTTGGAGCAATCTATGGAGCTGCCTTCAGTGGGGTTTCATGGACTATGAAAATCCTCATAGGAGTCATTATCACATGGATAGGAATGAATTCACGCAGCACCTCACTGTCTGTGACACTAGTATTGGTGGGAATTGTGACACTGTATTTGGGAGTCATGGTGCAGGCC
大文字: Ｅコード配列;小文字: ｐｒＭコード配列
＞ＢＩＤ/Ｖ５８５−ｐｒＭＥヌクレオチド配列 (配列番号５)
ttccatttaaccacacgtaatggagaaccacacatgatcgttggtaggcaagagaaagggaaaagtcttctgtttaaaacagaggatggtgttaacatgtgcaccctcatggccatagaccttggtgaattgtgtgaagatacaatcacgtacaagtgccccctcctcaggcaaaatgaaccagaagacatagattgttggtgcaactctacgtccacatgggtaacttatgggacatgtaccaccacaggagaacacagaagagaaaaaagatcagtggcactcgttccacatgtgggcatgggactggagacacgaactgaaacatggatgtcatcagaaggggcctggaaacatgttcagagaattgaaacctggatcttgagacatccaggctttaccataatggcagcaatcctggcatataccataggaacgacacatttccaaagggctctgatcttcattttactgacagccgttgctccttcaatgacaATGCGTTGCATAGGAATATCAAATAGAGACTTCGTAGAAGGGGTTTCAGGAGGAAGTTGGGTTGACATAGTCTTAGAACATGGAAGTTGTGTGACGACGATGGCAAAAAATAAACCAACATTGGATTTTGAACTGATAAAAACAGAAGCCAAACAACCTGCCACTCTAAGGAAGTACTGTATAGAAGCAAAGCTGACCAATACAACAACAGAATCTCGTTGCCCAACACAAGGGGAACCCAGTCTAAATGAAGAGCAGGACAAAAGGTTCATCTGCAAACACTCCATGGTAGACAGAGGATGGGGAAATGGATGTGGATTATTTGGAAAGGGAGGCATTGTGACCTGTGCTATGTTCACATGCAAAAAGAACATGGAAGGAAAAGTCGTGCAGCCAGAAAATCTGGAATACACCATCGTGATAACACCTCACTCAGGAGAAGAGCACGCTGTAGGTAATGACACAGGAAAGCATGGCAAGGAAATCAAAATAACACCACAGAGCTCCATCACAGAAGCAGAACTGACAGGCTATGGCACTGTCACGATGGAGTGCTCTCCGAGAACGGGCCTCGACTTCAATGAGATGGTACTGCTGCAGATGGAAGACAAAGCTTGGCTGGTGCACAGGCAATGGTTCCTAGACCTGCCGTTACCATGGCTACCCGGAGCGGACACACAAGGATCAAATTGGATACAGAAAGAGACGTTGGTCACTTTCAAAAATCCCCACGCGAAGAAACAGGACGTCGTTGTTTTAGGATCTCAAGAAGGGGCCATGCACACGGCACTTACAGGGGCCACAGAAATCCAGATGTCATCAGGAAACTTACTGTTCACAGGACATCTCAAGTGTAGGCTGAGAATGGACAAATTACAGCTTAAAGGAATGTCATACTCTATGTGTACAGGAAAGTTTAAAATTGTGAAGGAAATAGCAGAAACACAACATGGAACAATAGTTATCAGAGTACAATATGAAGGGGACGGCTCTCCATGTAAGATTCCTTTTGAGATAATGGATTTGGAAAAAAGACACGTCCTAGGTCGCCTGATTACAGTGAACCCAATCGTAACAGAAAAAGATAGCCCAGTCAACATAGAAGCAGAACCTCCATTCGGAGACAGCTACATCATCATAGGAGTAGAGCCGGGACAATTGAAACTCAATTGGTTCAAGAAGGGAAGTTCCATTGGCCAAATGTTTGAGACAACAATGAGAGGAGCGAAGAGAATGGCCATTTTAGGTGACACAGCCTGGGATTTTGGATCCCTGGGAGGAGTGTTTACATCTATAGGAAAGGCTCTCCACCAAGTTTTCGGAGCAATCTATGGGGCTGCTTTTAGTGGGGTCTCATGGACTATGAAAATCCTCATAGGAGTTATTATCACATGGATAGGAATGAATTCACGTAGCACCTCACTGTCTGTGTCACTAGTATTGGTGGGAGTCGTGACACTGTACTTGGGGGTTATGGTGCAGGCT
＞ＰＲ/ＤＢ０２３ ｐｒＭＥヌクレオチド配列 (配列番号６)
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＞ＭＤ１２８０ ｐｒＭＥヌクレオチド配列 (配列番号７)
ttccatttaaccacacgaaatggagaaccacacatgatcgttggcagacaagagaaagggaaaagccttctgtttaaaacagaggatggtgtgaacatgtgtaccctcatggccattgatcttggtgaattgtgtgaagatacaatcacgtacaagtgccccctcctcaggcagaatgaaccagaagatatagattgttggtgcaactccacgtccacatgggtaacttatgggacgtgtaccaccacaggagaacacagaagagaaaaaagatcagtggcactcgttccacatgtgggtatgggactggagacacgaactgaaacatggatgtcgtcagaaggggcctggaaacacgctcagagaattgaaacttggatcttgagacatccaggctttaccataatggcagcaatcctggcatataccgtaggaacgacacatttccaaagggccctgattttcatcttactggcagctgtcgctccttcaatgacaATGCGTTGCATAGGAATATCAAATAGAGACTTTGTAGAAGGGGTTTCAGGAGGAAGCTGGGTTGACATAGTCTTAGAACATGGAAGTTGTGTGACGACAATGGCAAAAAATAAACCAACACTGGATTTTGAACTGATAAAAACAGAAGCCAAACAACCTGCCACTCTAAGGAAGTACTGTATAGAGGCAAAGCTGACCAATACAACAACAGAATCTCGTTGCCCAACACAAGGGGAACCCAGTCTAAATGAAGAGCAGGACAAAAGGTTCGTCTGCAAACACTCCATGGTAGACAGAGGATGGGGAAATGGATGTGGATTATTTGGAAAGGGAGGCATTGTGACCTGTGCTATGTTCACATGCAAAAAGAACATGGAAGGAAAAATCGTGCAACCAGAAAATTTGGAATACACCATCGTGATAACACCTCACTCAGGAGAAGAGCACGCTGTAGGTAATGACACAGGAAAACATGGTAAGGAAATTAAAATAACACCACAGAGTTCCATCACAGAAGCAGAACTGACAGGCTATGGCACAGTCACGATGGAGTGCTCTCCGAGAACGGGCCTTGACTTCAATGAGATGGTGCTGCTGCAGATGGAAGATAAAGCTTGGCTGGTGCACAGGCAATGGTTCCTAGACCTGCCGTTACCATGGCTACCCGGAGCGGACACACAAGGATCAAATTGGATACAGAAAGAGACATTGGTCACTTTCAAAAATCCCCACGCGAAGAAGCAGGATGTCGTTGTTTTAGGATCTCAAGAAGGAGCCATGCACACGGCACTCACAGGGGCCACAGAAATCCAGATGTCATCAGGAAACTTACTATTCACAGGACATCTCAAATGCAGGCTGAGAATGGACAAACTACAGCTCAAAGGAATGTCATACTCTATGTGTACAGGAAAGTTTAAAATTGTGAAGGAAATAGCAGAAACACAACATGGAACAATAGTTATCAGAGTACAATATGAAGGAGACGGCTCTCCATGTAAGATCCCTTTTGAAATAATGGATTTGGAAAAAAGACATGTCTTAGGTCGCCTGATTACAGTTAATCCGATCGTAACAGAAAAAGATAGCCCAGTCAACATAGAAGCAGAACCTCCATTCGGAGACAGCTACATCATTATAGGAGTAGAGCCGGGACAATTGAAACTCAACTGGTTCAAGAAAGGAAGTTCCATCGGCCAAATGTTTGAGACGACAATGAGAGGAGCAAAGAGAATGGCCATTTTAGGTGACACAGCCTGGGATTTTGGATCTCTGGGAGGAGTGTTTACATCTATAGGAAAGGCTCTCCACCAAGTTTTCGGAGCAATCTATGGGGCTGCCTTTAGTGGGGTTTCATGGACTATGAAAATCCTCATAGGAGTCATCATCACATGGATAGGAATGAATTCACGTAGCACCTCACTGTCTGTGTCACTAGTATTGGTGGGAATCATAACACTGTACTTGGGAGCTATGGTGCAGGCT
選択した４つの株の、相当するｐｒＭからＥ蛋白質の配列
＞ＬＡＶ２ ｐｒＭＥ蛋白質配列 (配列番号８)
fhlttrngephmivsrqekgksllfktevgvnmctlmamdlgelcedtitykcpllrqnepedidcwcnststwvtygtcttmgehrrekrsvalvphvgmgletrtetwmssegawkhvqrietwilrhpgftmmaailaytigtthfqralifilltavtpsmtMRCIGMSNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLNEEQDKRFVCKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFRCKKNMEGKVVQPENLEYTIVITPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKITPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMENKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADTQGSNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVTLVLVGIVTLYLGVMVQA
＞ＬＡＶ２ Ｅ蛋白質配列 (配列番号１３)
MRCIGMSNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLNEEQDKRFVCKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFRCKKNMEGKVVQPENLEYTIVITPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKITPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMENKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADTQGSNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVTLVLVGIVTLYLGVMVQA
＞ＬＡＶ２ Ｍ蛋白質配列 (配列番号１９)
svalvphvgmgletrtetwmssegawkhvqrietwilrhpgftmmaailaytigtthfqralifilltavtpsmt
＞ＢＩＤ/V５８５ ｐｒＭＥ蛋白質配列 (配列番号９)
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＞ＢＩＤ/V５８５ Ｅ蛋白質配列 (配列番号１４)
MRCIGISNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLNEEQDKRFICKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFTCKKNMEGKVVQPENLEYTIVITPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKITPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMEDKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADTQGSNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKIVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVSLVLVGVVTLYLGVMVQA
＞ＢＩＤ/V５８５ Ｍ蛋白質配列 (配列番号２０)
svalvphvgmgletrtetwmssegawkhvqrietwilrhpgftimaailaytigtthfqralifilltavapsmt
＞ＰＲ/ＤＢ０２３ ｐｒＭＥ蛋白質配列 (配列番号１０)
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＞ＰＲ/ＤＢ０２３ Ｅ蛋白質配列 (配列番号１５)
MRCIGISNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLNEEQDKRFICKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFTCKKNMEGKVVLPENLEYTIVITPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKITPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMEDKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADTQGSNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKIVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVSLVLVGVVTLYLGVMVQA
＞ＰＲ/ＤＢ０２３ Ｍ蛋白質配列 (配列番号２１)
svalvphvgmgletrtetwmssegawkhvqrietwilrhpgftimaailaytigtthfqralifilltavapsmt
＞ＭＤ１２８０ ｐｒＭＥ蛋白質配列 (配列番号１１)
fhlttrngephmivgrqekgksllfktedgvnmctlmaidlgelcedtitykcpllrqnepedidcwcnststwvtygtctttgehrrekrsvalvphvgmgletrtetwmssegawkhaqrietwilrhpgftimaailaytvgtthfqralifillaavapsmtMRCIGISNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLNEEQDKRFVCKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFTCKKNMEGKIVQPENLEYTIVITPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKITPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMEDKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADTQGSNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKIVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVSLVLVGIITLYLGAMVQA
＞ＭＤ１２８０ Ｅ蛋白質配列 (配列番号１６)
MRCIGISNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLNEEQDKRFVCKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFTCKKNMEGKIVQPENLEYTIVITPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKITPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMEDKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADTQGSNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKIVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVSLVLVGIITLYLGAMVQA
＞ＭＤ１２８０ Ｍ蛋白質配列 (配列番号２２)
svalvphvgmgletrtetwmssegawkhaqrietwilrhpgftimaailaytvgtthfqralifillaavapsmt
＞コンセンサスＭ配列 (配列番号１７)
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実施例３: 最適化血清型２のキメラウイルスに相当するｃＤＮＡクローンの構築およびコードされたウイルスの産生
最適化血清型２株に相当するキメラデングウイルスの構築は、Chambers, et al. (1999, J.Virology 73(4):3095-3101)の記載に実質的にしたがって、ChimerivaxＴＭ technologyを用いて達成する。ＣＹＤ−１、ＣＹＤ２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４を構築する類似の方法について詳述している、国際公開第９８/３７９１１号、第０３/１０１３９７号、第０７/０２１６７２号、第０８/００７０２１号、第０８/０４７０２３号および第０８/０６５３１５号を参照してよい。端的には、最適化血清型２株に相当するキメラデングウイルスは以下のように構築する(注、最適化キメラデングウイルスは、ＹＦ株ＹＦ１７Ｄ２０４ (ＹＦ−ＶＡＸ(R), Sanofi-Pasteur, Swiftwater, PA, USA)の遺伝子骨格を用いて構築する)。
プラスミドｐＳＰ１１０１の構築
ＹＦ−ＶＡＸ ｃＤＮＡクローン−ｐＪＳＹ２２８４.１ (ｐＡＣＹＣ ＹＦ−Ｖａｘ ５-３)の構築
ＹＦ−ＶＡＸの全長の感染性ｃＤＮＡクローンを構築する。全長の感染性ｃＤＮＡクローンは、ＹＦ−ＶＡＸの配列に基づく。全長のｃＤＮＡクローンを組み立てるために、低コピー数プラスミド(low copy number plasmid)ｐＡＣＹＣ１７７ (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, USA)を用いる。
ＳＰ６ ＹＦ−Ｖａｘ ５-３と命名するＤＮＡ配列をGeneArt（登録商標）によって合成する。ＳＰ６ ＹＦ−Ｖａｘ ５-３の配列は、全長のＹＦ−Ｖａｘ ｃＤＮＡクローンの容易な組み立てが促進されるような方法でデザインする。該配列は、２８９７bpの長さであり、Xma I-SP６プロモーター、ＹＦ−Ｖａｘ ５’ＵＴＲ、キャプシド、ｐｒＭ、Ｍ、組み立てのためのユニークな部位であるMlu I-Sap I-Ngo MI-Aat II-Cla Iが続くApa Iサイトまで延びているＥ部分、ＮＳ５部分を含み、さらに、３’ＵＴＲまで延び、その後ろに、ランオフに用いるためのNru Iサイトが続く。この合成ＤＮＡ配列は、EcoR VサイトおよびXho Iサイトに隣接している。EcoR V/Xho Iで消化した後、このＤＮＡ断片を低コピー数プラスミドｐＡＣＹＣ１７７のAat II/Xho Iサイトにクローニングし、１６１５bpのAat II/Xho I断片と置きかえる。得られたプラスミドｐＪＳＹ２２８４.１ (ｐＡＣＹＣ ＹＦ−Ｖａｘ ５-３) を、配列決定解析により確認する。
Apa I、Mlu I、Sap I、Ngo MI、Aat IIおよびCla IサイトにまたがるＹＦ−Ｖａｘ ｃＤＮＡ断片のＲＴ−ＰＣＲおよびクローニングならびにＹＦ-vax (ｐＪＳＹ２３７４.５) の全長の感染性ｃＤＮＡクローンの組み立て
黄熱ワクチンＹＦ−ＶＡＸをＶｅｒｏ細胞で増殖させ、該ウイルス粒子を濃縮する。ＹＦ−ＶＡＸのウイルスＲＮＡを、濃縮ウイルスから抽出し、ｃＤＮＡコピーを逆転写により作成する。本明細書に記載する５種類のｃＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、TOPOクローニングを行い、配列を決定し、ＹＦ−ＶＡＸ ２００３の配列と比較する。各断片中に見られるＰＣＲエラーは、部位特異的変異誘発もしくはフラグメントスイッチングにより修正する。ＴＯＰＯクローニング後のNgo MI-Aat II断片は、非常に多くの配列の違いが見られるため、この断片はGeneArt（登録商標）により合成する。最終的に配列を確認した後、５つのＤＮＡ断片; Apa I-Mlu I、Mlu I-Sap I、Sap I-Ngo M１、Ngo MI-Aat II、およびAat II-Cla Iを単離し、プラスミドｐＪＳＹ２２８４.１のユニーク部位であるApa I、Mlu I、Sap I、Ngo MI、Aat IIおよびCla Iサイトに段階的にクローニングしてプラスミドｐＪＳＹ２３７４.５を得、これが正しい配列のＹＦ−ＶＡＸ全長ｃＤＮＡを含んでいることを確認する。
ＬＡＶ２株由来の最適化キメラデングウイルスについてのｃＤＮＡ(ｐＳＰ１１０１)構築
戦略は、以前ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４デングワクチンの構築を行ったように、ChimerivaxＴＭ technologyを用いてＹＦ−ＶＡＸゲノムを含むｐＪＳＹ２３７４.５プラスミド中のＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）ワクチン株のｐｒＭおよびＥ遺伝子を、ＬＡＶ２株のものに置きかえることである。得られるプラスミドは、ｐＳＰ１１０１である。
ｐＪＳＹ２３７４にて、クローニングに用いる制限酵素サイトは、Xma IおよびMlu Iである。これらの部位は、SP６プロモーター、ＹＦ１７Ｄ ５’ＵＴＲ、ＹＦ１７Ｄ-キャプシド、ＹＦ１７Ｄ−ｐｒＭ、ＹＦ１７Ｄ-ＥおよびＹＦ１７Ｄ-ＮＳ１のＮ末端を含む３０００ｂｐ断片の上流および下流に位置する。この断片に相当するが、Xma IおよびMlu Iサイトに隣接する、ＬＡＶ２のｐｒＭおよびＥ遺伝子を含む配列をGeneArt（登録商標）により合成し、プラスミドｐＭＫ-ＲＱ(GeneArt（登録商標）, Life Technologies Ltd, Paisley, U.K.) 中にクローニングし、プラスミドｐＭＫ-ＲＱ-Ｓｅｑ１を作成する。プラスミドｐＪＳＹ２３７４.５およびｐＭＫ-ＲＱ-Ｓｅｑ１をXma IおよびMlu Iによって消化する。次に、ｐＭＫ-ＲＱ-Ｓｅｑ１から得られたXma I-Mlu I断片をプラスミドｐＪＳＹ２３７４.５に挿入し、プラスミドｐＳＰ１１０１を形成する。大きいプラスミドに適当であるため、XL-10 Gold Ultracompetent bacteria (Agilent Technologies, CA, USA) を形質転換に用いる。第二の工程において、陽性のクローンを、大きなサイズのプラスミドの相当量での増幅が可能である、One Shot（登録商標）TOP10 E. coli (Life Technologies Ltd, Paisley, U.K.)に移す。
したがって、プラスミドｐＳＰ１１０１により、ＬＡＶ２株のｐｒＭおよびＥ蛋白質を、ＹＦ−ＶＡＸの複製エンジン（replication engine）とともに発現させることができる。生じたキメラウイルスを、ＣＹＤ−ＬＡＶと称する。配列決定解析により、元の配列と比較して変異がないことが示される。
株ＢＩＤ−Ｖ５８５、ＰＲ/ＤＢ０２３およびＭＤ１２８０に相当するプラスミドの構築
上述と同様の戦略を用いて、血清型２の株であるＢＩＤ−Ｖ５８５、ＰＲ/ＤＢ０２３およびＭＤ１２８０に相当するプラスミドを構築する。これらのプラスミドを、ｐＳＰ１１０２ (ＢＩＤ−Ｖ５８５)、ｐＳＰ１１０３ (ＰＲ/ＤＢ０２３) およびｐＳＰ１１０４ (ＭＤ１２８０)と称する。これらのプラスミドから作成したキメラウイルスを、ＣＹＤ−ＢＩＤ、ＣＹＤ−ＰＲおよびＣＹＤ−ＭＤと称する。作成したプラスミドについて配列決定解析を行うと、元の配列と比較して変異が全く見られない。
プラスミドｐＳＰ１１０１、ｐＳＰ１１０２、ｐＳＰ１１０３およびｐＳＰ１１０４からのキメラウイルスの作成
ＲＮＡの試験管内転写およびウイルスの作成は、以前記載したように行う (Guirakhoo F et al. J. Virol. ２００１; ７５:７２９０-３０４)。
実施例４. メキシコのフラビウイルスナイーブの成人における四価デングワクチン製剤の評価
本試験の目的は、ＣＹＤ−１ (すなわち、ＤＥＮ１ PU０３５９(TYP １ １４０)のｐｒＭおよびＥ配列から作成した特定のＣＹＤ−１ (Chimerivax dengue serotype 1))、ＶＤＶ２、ＣＹＤ−３ (すなわち、ＤＥＮ３ ＰａＨ８８１/８８のｐｒＭおよびＥ配列から作成した特定のＣＹＤ−３(Chimerivax dengue serotype 3)株)およびＣＹＤ−４ (すなわち、ＤＥＮ４ １２２８(ＴＶＰ ９８０)のｐｒＭおよびＥ配列から作成した特定のＣＹＤ−４(Chimerivax dengue serotype 4)株)を含む混合四価デングワクチンの免疫原性およびウイルス血症を、ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−２ (すなわち、ＤＥＮ２ ＰＵＯ２１８のｐｒＭおよびＥ配列から作成した特定のＣＹＤ−２(Chimerivax dengue serotype２)株)、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４を含む四価デングワクチンの免疫原性およびウイルス血症と比較することであった。この試験で用いた具体的なＣＹＤ−１、ＣＹＤ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４のさらなる詳細については実施例１を参照のこと。
ＶＤＶ２株の関連するヌクレオチドおよび蛋白質の配列は以下の通りである:
＞ＶＤＶ２ ヌクレオチド配列 (配列番号２４)
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＞ＶＤＶ２ ｐｒＭＥヌクレオチド配列 (配列番号２５)
UUCCAUUUAACCACACGUAACGGAGAACCACACAUGAUCGUCAGCAGACAAGAGAAAGGGAAAAGUCUUCUGUUUAAAACAGAGGUUGGCGUGAACAUGUGUACCCUCAUGGCCAUGGACCUUGGUGAAUUGUGUGAAGACACAAUCACGUACAAGUGUCCCCUUCUCAGGCAGAAUGAGCCAGAAGACAUAGACUGUUGGUGCAACUCUACGUCCACGUGGGUAACUUAUGGGACGUGUACCACCAUGGGAGAACAUAGAAGAGAAAAAAGAUCAGUGGCACUCGUUCCACAUGUGCGAAUGGGACUGGAGACACGAACUGAAACAUGGAUGUCAUCAGAAGGGGCCUGGAAACAUGUCCAGAGAAUUGAAACUUGGAUCUUGAGACAUCCAGGCUUCACCAUGAUGGCAGCAAUCCUGGCAUACACCAUAGGAACGACACAUUUCCAAAGAGCCCUGAUUUUCAUCUUACUGACAGCUGUCACUCCUUCAAUGACAAUGCGUUGCAUAGGAAUGUCAAAUAGAGACUUUGUGGAAGGGGUUUCAGGAGGAAGCUGGGUUGACAUAGUCUUAGAACAUGGAAGCUGUGUGACGACGAUGGCAAAAAACAAACCAACAUUGGAUUUUGAACUGAUAAAAACAGAAGCCAAACAGCCUGCCACCCUAAGGAAGUACUGUAUAGAGGCAAAGCUAACCAACACAACAACAGAAUCUCGCUGCCCAACACAAGGGGAACCCAGCCUAAAUGAAGAGCAGGACAAAAGGUUCGUCUGCAAACACUCCAUGGUAGACAGAGGAUGGGGAAAUGGAUGUGGACUAUUUGGAAAGGGAGGCAUUGUGACCUGUGCUAUGUUCAGAUGCAAAAAGAACAUGGAAGGAAAAGUUGUGCAACCAGAAAACUUGGAAUACACCAUUGUGAUAACACCUCACUCAGGGGAAGAGCAUGCAGUCGGAAAUGACACAGGAAAACAUGGCAAGGAAAUCAAAAUAACACCACAGAGUUCCAUCACAGAAGCAGAAUUGACAGGUUAUGGCACUGUCACAAUGGAGUGCUCUCCAAGAACGGGCCUCGACUUCAAUGAGAUGGUGUUGCUGCAGAUGGAAAAUAAAGCUUGGCUGGUGCACAGGCAAUGGUUCCUAGACCUGCCGUUACCAUGGUUGCCCGGAGCGGACACACAAGAGUCAAAUUGGAUACAGAAGGAGACAUUGGUCACUUUCAAAAAUCCCCAUGCGAAGAAACAGGAUGUUGUUGUUUUAGGAUCCCAAGAAGGGGCCAUGCACACAGCACUUACAGGGGCCACAGAAAUCCAAAUGUCAUCAGGAAACUUACUCUUCACAGGACAUCUCAAGUGCAGGCUGAGAAUGGACAAGCUACAGCUCAAAGGAAUGUCAUACUCUAUGUGCACAGGAAAGUUUAAAGUUGUGAAGGAAAUAGCAGAAACACAACAUGGAACAAUAGUUAUCAGAGUGCAAUAUGAAGGGGACGGCUCUCCAUGCAAGAUCCCUUUUGAGAUAAUGGAUUUGGAAAAAAGACAUGUCUUAGGUCGCCUGAUUACAGUCAACCCAAUUGUGACAGAAAAAGAUAGCCCAGUCAACAUAGAAGCAGAACCUCCAUUUGGAGACAGCUACAUCAUCAUAGGAGUAGAGCCGGGACAACUGAAGCUCAACUGGUUUAAGAAAGGAAGUUCUAUCGGCCAAAUGUUUGAGACAACAAUGAGGGGGGCGAAGAGAAUGGCCAUUUUAGGUGACACAGCCUGGGAUUUUGGAUCCUUGGGAGGAGUGUUUACAUCUAUAGGAAAGGCUCUCCACCAAGUCUUUGGAGCAAUCUAUGGAGCUGCCUUCAGUGGGGUUUCAUGGACUAUGAAAAUCCUCAUAGGAGUCAUUAUCACAUGGAUAGGAAUGAAUUCACGCAGCACCUCACUGUCUGUGACACUAGUAUUGGUGGGAAUUGUGACACUGUAUUUGGGAGUCAUGGUGCAGGCC
＞ＶＤＶ２ Ｅ蛋白質配列 (配列番号２６)
MRCIGMSNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLNEEQDKRFVCKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFRCKKNMEGKVVQPENLEYTIVITPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKITPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMENKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADTQESNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVTLVLVGIVTLYLGVMVQA
＞ＶＤＶ２ Ｍ蛋白質配列 (配列番号２７)
SVALVPHVRMGLETRTETWMSSEGAWKHVQRIETWILRHPGFTMMAAILAYTIGTTHFQRALIFILLTAVTPSMT
試験デザイン
非盲検、無作為化、比較対照、フェーズＩＩａ試験において、１８〜４５歳の健康な成人１５０人が、デング非流行地域であるメキシコシティの２つの施設に登録した。主な除外基準は: 妊娠中または授乳中、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎もしくはＣ型肝炎血清陽性、免疫不全または、結果に干渉し得る他の任意の慢性疾患、デング病の流行性が高い地域に以前住んでいた、もしくは２週間より長く滞在していた、フラビウイルス感染の病歴がある、もしくはフラビウイルス疾患に対するワクチン接種を受けたことがある、というものであった。妊娠可能な女性は、１回目の注射の少なくとも４週間前から、最後の注射の少なくとも４週間後まで、有効な避妊方法を用いるかもしくは禁欲することが必要であった。
参加者を、２つの群に無作為に分け、ワクチン接種を０日目および１０５日目（±１５日）に行った。該群は、以下の製剤の投与を受けた：
群１: 混合ＣＹＤ/ＶＤＶ２四価製剤、すなわち、ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−３、ＣＹＤ４およびＶＤＶ２を含む製剤
群２: 対照四価製剤 (ＣＹＤ−ＴＤＶ)、すなわち、ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４。
該製剤は、各血清型のＣＹＤウイルスを１０５ CCID５０含んでおり、群１に投与した製剤は、ＶＤＶ−２ウイルスを１０４ CCID５０含んでいた。
ウイルス血症
ワクチンの安全性を評価するために、各注射の７、１４および２１日後に、回収した血清中のＣＹＤ−１〜４またはＶＤＶ−２の有無を評価した。解析は、Global Clinical Immunology laboratory (Sanofi Pasteur, Swiftwater, PA, USA)により行った。
ＣＹＤ−１〜４ウイルス血症についての解析は、Poo et al. Pediatr Infect Dis J (2011) 30: e9に記載されているように、2つの工程にて行った。端的には、最初に、非血清型特異的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、４つのＣＹＤウイルスのいずれかの存在を検出した。この第一の試験で陽性を示した試料を次に、４つのＣＹＤ血清型特異的な定量型ＲＴ−ＰＣＲを用いて解析した。非血清型特異的なＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＲＮＡは市販のキットを用いて血清から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲは、黄熱病コア遺伝子配列由来のプライマーを用いて行った。血清型特異的なＲＴ−ＰＣＲでは、ＲＮＡは、再び市販のキットを用いて血清から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲは、各血清型のエンベロープＮＳＰ１接合遺伝子配列由来の血清型特異的プライマーを用いて行った。群１に投与される四価混合製剤は、ＶＤＶ−２ウイルスを含んでいるため、この群において、血清型２についてデングＲＴ−ＰＣＲを行った。
免疫原性
４つのデングウイルス血清型のそれぞれの抗体レベルを、それぞれの注射後２８日目ならびに最初の注射の３６５日後に回収した血清についての５０％プラーク減少中和試験によって決定した。端的には、熱で不活化した血清を倍数希釈し、一定の負荷用量の各デング血清型ＤＥＮ−１、−２、−３または−４と混合した (プラーク形成ユニット [PFU]/mLとして表す)。該混合物を、２４ウェルプレートの、単層Ｖｅｒｏ細胞がコンフルエントに播種されているウェルに播いた。数日間インキュベーションした後では、デングウイルスの感染が、プラークの形成により示される。中和抗体の力価を、ウイルスプラーク数の≧５０%の減少が観察される血清の最も高い希釈率の逆数(１/希釈率) として算出する(ＰＲＮＴ５０)。デングＰＲＮＴ５０の定量の下限は、１０であり;力価が≧１０である試料は、血清陽性とみなした。
結果
製剤を、試験の０日目および１０５日目に、群１および２の参加者に投与した。１回目または２回目のワクチン接種後に、注射部位または全身の反応性について、２つの群の間で顕著な差異は見られなかった。ウイルス血症を、各注射後７、１４および２１日目に回収した血清中で評価した(表６)。中和抗体の力価を、各注射の２８日後および１回目の注射後３６５日目に評価した（表７）。
１回目の注射の後、非血清型特異的なＲＴ−ＰＣＲ試験により決定されるように、検出可能なウイルス血症が、両方の群の同等の人数の参加者において観察された（表６を参照のこと）。症例の大部分において、ウイルス血症は、定量下限を下回っていた。血清特異的なアッセイによる解析により、ＣＹＤ−４が最も頻繁に検出される血清型であり、その次がＣＹＤ−３であることが示された。群１における混合ＣＹＤ/ＶＤＶワクチンの２回目の注射または群２におけるＣＹＤ−ＴＤＶワクチンの２回目の注射の後では、ウイルス血症は、非血清型特異的アッセイにより、群につき１人の参加者でのみ検出された。
したがって、誘発されるウイルス血症のレベルについては、混合ＣＹＤ/ＶＤＶとＣＹＤ−ＴＤＶの間で有意な差異は見られなかった。
表７から、混合ＣＹＤ/ＶＤＶワクチン (群１)の２回目の注射が、ＣＹＤ−ＴＤＶワクチン (群２)よりも、血清型２のデングウイルスに対してより高いＧＭＴを誘発したことが理解できる。１回目の投与から３６５日後においても、混合ＣＹＤ/ＶＤＶ群において血清型２への反応が改善した様子が観察された。
さらに、混合ＣＹＤ/ＶＤＶワクチンの２回目の注射 (群１)により、ＣＹＤ−ＴＤＶワクチンの投与を受けた群 (群２)と比較して、全ての血清型のデングウイルスに対して中和抗体応答の改善が見られた。混合ＣＹＤ/ＶＤＶ製剤群が、１回目の注射から３６５日後において、ＣＹＤ−ＴＤＶ群よりも持続性のあるデングウイルスに対する中和抗体反応を示したことは、重要なことである。
したがって、該実施例により、混合ＣＹＤ−１、３、４/ＶＤＶ２ワクチン製剤は、ウイルス血症レベルで示すように、ＣＹＤ−ＴＤＶワクチンと同等の安全性プロファイルを示すが、全体的に、ＣＹＤ−ＴＤＶワクチンと比べて、デングウイルス血清型に対してより強力でより長期間持続する免疫応答を誘発することが示される。
上記のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド配列がＤＮＡである場合、ヌクレオチドＴは、ＤＮＡ配列に相当するＲＮＡ配列を得るために、ヌクレオチドＵと置換してよい。同様に、ヌクレオチド配列がＲＮＡである場合、ヌクレオチドＵは、相当するＤＮＡ配列を得るためにヌクレオチドＴと置換してよい。上述のＤＮＡ配列は、着目するデングウイルスのｃＤＮＡ配列を構成し、そのため、相当するＲＮＡ配列が、該デングウイルスの（＋）鎖のＲＮＡを構成する。

Claims (13)

  1. デング病に対するヒト対象の保護方法に使用するためのワクチン組成物であって、該組成物が、血清型１のデング抗原、血清型２のデング抗原、血清型３のデング抗原および血清型４のデング抗原を含み；血清型１、２、３および４のデング抗原が、それぞれ、弱毒化生キメラデングウイルスであり；キメラデングウイルスが、ｐｒＭ−Ｅ配列がデングウイルスのｐｒＭ−Ｅ配列で置換された、黄熱ウイルスのゲノムを含み；血清型１のデング抗原が、血清型１ ＰＵＯ３５９株由来のｐｒＭ−Ｅ配列を含み、血清型２のデング抗原が、血清型２ ＰＵＯ２１８株由来のｐｒＭ−Ｅ配列を含み、血清型３のデング抗原が、血清型３ ＰａＨ８８１／８８株由来のｐｒＭ−Ｅ配列を含み、血清型４のデング抗原が、血清型４ １２２８株由来のｐｒＭ−Ｅ配列を含み；ヒト対象が、デング免疫対象であり；方法が、デングウイルスにより引き起こされる症候性のデング病の発症頻度または可能性の統計学的に有意な低下をもたらす、ワクチン組成物。
  2. ヒトが、９〜４５歳である、請求項１記載の組成物。
  3. 対象が、デング流行地域に居住している、請求項１または２記載の組成物。
  4. デング病が、ウイルス学的に確認されるものである、請求項１〜３のいずれか一項記載の組成物。
  5. デング病が、血清型１、血清型３または血清型４のデングウイルスにより引き起こされる、請求項１〜４のいずれか一項記載の組成物。
  6. 方法が、組成物を複数回投与することを含む、請求項１〜５のいずれか一項記載の組成物。
  7. 方法が、組成物を３回以上投与することを含む、請求項６記載の組成物。
  8. １回目の投与と３回目の投与が約１２ヶ月の間隔をおいて投与される、請求項６または７記載の組成物。
  9. 方法が、組成物を１回目の投与、２回目の投与および３回目の投与で投与することを含み、２回目の投与を１回目の投与から約６ヶ月後に行い、３回目の投与を１回目の投与から約１２ヶ月後に行う、請求項６〜８のいずれか一項記載の組成物。
  10. 各血清型が、約１０３〜約１０６ ＣＣＩＤ５０の量で存在する、請求項１〜９いずれか一項記載の組成物。
  11. 凍結乾燥されている、請求項１〜１０のいずれか一項記載の組成物。
  12. 方法が、組成物をヒト対象に皮下経路により投与することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項記載の組成物。
  13. 薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、請求項１〜１２のいずれか一項記載の組成物。
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