KR20200067938A - 백신 조성물 - Google Patents

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레미 포라
쟝 랑
멜라니 사빌
나디아 토니포쓰
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사노피 파스퇴르
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Abstract

본 발명은 인간 개체를 뎅기열 질환으로부터 예방하는 방법에 사용가능한 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

백신 조성물 {VACCINE COMPOSITIONS}
본 발명은 백신 조성물, 및 인간 개체를 뎅기 질환으로부터 예방하는 방법에 있어서의 상기 백신 조성물의 용도에 관한 것이다.
뎅기열은 말라리아 다음으로 두번째로 가장 주요한 열대성 감염 질환으로, 전세계 인구의 대략 1/2이 유행성 확산 위험 지역에 살고 있다. 매년 뎅기열 질환 사례는 50,000,000 내지 100,000,000 건으로 추산되는데, 이중 500,000명이 출혈성 뎅기열 (DHF)로 인해 입원하며, 약 25,000명이 사망한다.
뎅기열 질환 감염은 100개국 이상의 열대 국가에서 유행하고 있으며, 이들 국가들 중 60개국에서 출혈성 뎅기열 (DHF)이 보고되고 있다 (Gubler, 2002, TRENDS in Microbiology, 10: 100-103).
뎅기열 질환은, 항원으로는 구분되지만 플라비바이러스 (flavivirus) 속에 속하는 매우 밀접하게 관련되어 있는 4가지 타입의 혈청형의 바이러스에 의해 야기된다 (Gubler et al., 1988, in: Epidemiology of arthropod-borne viral disease. Monath TPM, editor, Boca Raton (FL): CRC Press: 223-60; Kautner et al., 1997, J. of Pediatrics, 131 : 516-524; Rigau-Perez et al., 1998, Lancet, 352: 971-977; Vaughn et al., 1997, J. Infect. Dis., 176: 322-30).
뎅기열 질환은 일반적으로 바이러스에 의해 감염된 이집트 숲 모기(Aedes aegypti)에 의한 흡혈시 이루어지는 뎅기열 바이러스의 감염에 의해 전염된다. 4-10일간의 잠복 기간이 지나고 나면, 갑자기 질병 상태에 돌입하게 되며, 발열기 (2-7일), 중대기 (24-48시간 - 이 시기에 중증 합병증이 발병할 수 있음) 및 회복기 (48-72시간)로 구성된 3 단계가 이어진다. 중대기에는 출혈, 쇼크 및 급성 장기 손상과 같이 생명을 위협하는 합병증이 발생할 수 있다. 이렇듯 예측하기 어려운 증상에 대한 적절한 조치가 치사률 (case fatality rate)을 낮출 수 있다. 뎅기열을 완치하는데에는 7 - 10일이 걸리지만, 통상 무력증이 이어진다. 백혈구와 혈소판의 수치 감소도 자주 관찰된다.
출혈성 뎅기열 (DHF)은 뎅기열 바이러스 감염으로 인한 잠재적으로 치명적인 합병증이다. DHF는 고열과 뎅기열 질환의 증상이 특징적이며, 극도의 무기력과 졸음이 수반된다. 혈관 투과성 증가 및 항상성 이상은 혈량 감소, 저혈압 및 중증 질환, 저혈량성 쇼크 및 내출혈을 일으킬 수 있다. 이 2가지 요인이 DHF 발병 - 높은 수준의 바이러스 혈증을 동반한 빠른 바이러스 복제 (질환의 중증도는 바이러스 혈증 수준과 관련있음; Vaughn et al., 2000, J. Inf. Dis., 181: 2-9) 및 높은 수준의 염증성 매개인자의 방출을 동반한 주요 염증성 반응 - 에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다 (Rothman 및 Ennis, 1999, Virology, 257: 1-6; Alan L. Rothman. 2011, Nature Reviews Immunology, 11: 532-543)). DHF의 사망율은 무치료시 10%에 달할 수 있지만, 치료를 제공할 수 있는 대부분의 센터에서는 1% 미만이다.
뎅기열 쇼크 증후군 (DSS)은 DHF의 통상적인 진행 단계로서, 종종 치명적이다. DSS는 범발성 혈관염으로 인한 것으로, 혈관외 공간으로 혈장의 누출을 야기한다. DSS는 빠르지만 약한 맥박, 저혈압, 수족냉증 및 불안이 특징이다.
아시아에서는, DHF와 DSS는 주로 어린이에서 관찰되며, DHF 환자의 약 90%가 15세 미만이다 (Malavige et al., 2004, Postgrad Med. J., 80: 588-601; Meulen et al., 2000, Trop. Med. Int. Health, 5:325-9). 반면, 카리브해와 중앙 아메리카에서는 대부분 성인들에서 발병하고 있다 (Malavige et al., 2004, Postgrad Med. J., 80: 588-601).
뎅기열 바이러스의 4종의 혈청형들은 약 60-90%의 서열 상동성을 가지고 있다. 한가지 혈청형으로 감염되면 장기간 지속되는 동종 면역 (homologous immunity)이 형성되지만, 이종 면역 (heterologous immunity)은 제한적이다 (Sabin, 1952, Am. J. Trop. Med. Hyg., 1: 30-50). 즉, 뎅기열 혈청형 한가지에 감염된 개체는 이후 다른 혈청형에도 감염될 수도 있다. 예전에는, DHF를 나타내는 환자 대부분은 과거 다른 4가지 혈청형의 뎅기열 바이러스 중 1종 이상에 노출된 적이 있기 때문에, 다른 뎅기열 바이러스 혈청형으로 인해 발생되는 2차 감염은 이론적으로는 DHF 발병의 위험 인자로 간주되었다.
지금까지, 뎅기열 질환에 대한 특별한 치료법은 없는 실정이다. 뎅기열 질환에 대한 치료는 증상에 따르며, 침상 휴식, 해열제와 진통제에 의한 열 및 통증 관리 및 적절한 수분 섭취이다. DHF의 치료에는 체액 손실 보정, 응고 인자의 보충 및 헤파린 주입이 요구된다.
모기 방제 및 흡혈로부터 개인의 보호 등의 뎅기열 예방 조처들은 효과가 제한적이고 시행하기 어렵고 비용이 높기 때문에, 안전하며 효능이 있는 뎅기 백신이 최상의 예방법이 될 것이다. 하지만, 현재 이용가능한 이런 타입의 백신은 허가된 것이 없다.
따라서, 뎅기열 질환으로부터 인간 개체를 예방하는 방법에 사용하였을 때 유용한 백신 조성물을 개발하는 것이 바람직하다.
본 발명은, 하기 (i) 또는 (ii)를 포함하는, 뎅기열 질환으로부터 인간 개체를 예방하는 방법에 사용하기 위한 백신 조성물에 관한 것이다:
(i) (a) 내지 (e)로 이루어진 군으로부터 선택되는 뎅기열 항원:
(a) 약독화된 뎅기열 생 바이러스;
(b) 불활화된 뎅기열 바이러스;
(c) 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스 또는 불활화된 키메라 뎅기열 바이러스;
(d) 뎅기열 바이러스-유사 입자 (VLP); 및
(e) (a) - (d) 중 2 이상의 조합;
또는
(ii) 뎅기열 VLP인 뎅기열 항원을 인간 세포에서 발현할 수 있는, 핵산 구조체 또는 바이러스 벡터.
아울러, 본 발명은, 뎅기열 질환으로부터 인간 개체를 예방하기 위한 약제의 제조에 있어, 본 발명의 백신 조성물의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 본 발명에 따른 조성물을 유효량으로 인간 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 뎅기열 질환으로부터 인간 개체를 예방하는 방법에 관한 것이다.
부가적으로, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물과 뎅기열 질환으로부터 인간 개체를 예방하는 방법에 상기 조성물을 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다.
도 1은 RT-PCR 및 클로닝을 통한 YF-VAX cDNA 구축을 도시한 것이다.
정의
용어 "뎅기열 질환"은, 본원에서, 4가지 뎅기열 바이러스 혈청형 중 임의의 한가지로 감염되어 개체에서 발생되는 임상 증상을 지칭한다. 1970년 이래로, 임상 뎅기열은 세계 보건 기구의 가이드라인에 따라 (i) 뎅기열 또는 (ii) 출혈성 뎅기열로 분류되고 있다 (World Health Organization. Dengue hemorrhagic fever: Diagnosis, treatment, prevention and control 2nd Ed. Geneva: WHO, 1997; ISBN 92 4 154500 3). 2009년, WHO는 임상 뎅기열을 (i) 경고 신호를 수반한 뎅기열 또는 수반하지 않은 뎅기열, 또는 (ii) 중증 뎅기열로서 분류하는 새로운 가이드라인을 공표하였다. 이들 2가지 분류는 Srikiatkachorn et al., Clin. Infect. Dis. (2011) 53(6): 563의 도 1 & 2에 도시되어 있다. 초기 분류에 따르면, 뎅기열은 두통, 관절통, 안와-후방 통증, 발진, 근육통, 출혈 증상 및 백혈구 감소증으로부터 선택되는 2가지 이상의 증상과 더불어 이를 뒷받침하는 혈청 테스트 및 다른 검증된 뎅기열 사례와 동일 지역과 시기에서의 발병을 특징으로 한다. 출혈성 뎅기열로의 진행은 열, 출혈 증상, 혈소판 감소증 및 혈장 누출 증거들이 모두 관찰될 때 확진된다. 최신 분류에 따르면, 뎅기열을 진단하는데에는, 발열과, 구역질, 구토, 발진, 동통 및 통증, 지혈대 검사 (tourniquet test)에서의 양성, 또는 복통 및 압통, 지속적인 구토, 임상 체액 축적, 점막 출혈 , 무기력 또는 불안, 2 cm 이상의 간 비대 또는 혈소판 수치의 급격한 감소를 동반한 적혈구 용적률 증가로부터 선택되는 임의의 경고 신호 중 2가지 이상의 임상 증상이 요구된다. 중증 뎅기열은, 쇼크 또는 호흡 곤란을 야기하는 심각한 혈장 누출, 임상학자에 의해 평가되는 중증 출혈 또는 장기로의 상당한 영향 중 임의의 증상이 관찰되었을 때, 진단된다.
용어 "출혈성 뎅기열 또는 DHF "는, 본원에서, 열, 출혈 증상, 혈소판 감소증 및 혈장 누출 증가가 모두 관찰되는, 바이러스-확증된 뎅기열 질환을 지칭한다. 본원에서, DHF는 중증도를 기준으로 더욱 규정할 수 있다. 예를 들어, DHF는 I 등급, II 등급, III 등급 또는 IV 등급으로 분류할 수 있다 (World Health Organization. Dengue hemorrhagic fever: Diagnosis, treatment, prevention and control 2nd Ed. Geneva: WHO, 1997; ISBN 92 4 154500 3). I 등급은 비-특이적이고 본질적인 증상을 동반한 열로 정의되며; 유일한 출혈 표시는 지혈대 검사에서의 양성과, 및/또는 쉽게 발생하는 타박상이다. II 등급은 I 등급 환자의 증상 이외에 일반적으로 피부 또는 다른 출혈 형태인 자발적인 출혈로서 정의된다. III 등급은 빠르고 약한 맥박, 및 맥압 또는 저혈압의 감쇠 (narrowing)로 나타나는 순환 부전으로서 정의되며, 차갑고 축축한 피부 및 불안이 나타난다. IV 등급은 혈압 또는 맥박을 검출할 수 없는 심각한 발작 (profound shock)으로서 정의된다. 당해 기술 분야의 당업자가 이해하는 바와 같이, 본 발명의 실시시, 예컨대, DHF 예방 방법에서, DHF는 바이러스-확증이 필요하지 않다.
용어 "바이러스-확증된 뎅기열"은, 본원에서, 뎅기열 바이러스에 의해 유발된 것으로 검증된, 예를 들어 역전사효소 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 또는 뎅기열 비-구조 1 (NS1) 단백질 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 검증된, 급성 발열 현상을 지칭한다. RT-PCR 방법에서, 혈청 샘플은 Callahan et al, J. Clin. Microbiol. (2001) 39: 4119의 방법에 따라 테스트한다. 간략하게는, 잠재적인 Taq 중합효소 저해제 또는 간섭 인자들을 제거하기 위해 상업용 키트를 이용하여 혈청으로부터 RNA를 추출한다. 그런 후, 혈청형 특이적인 프라이머를 사용해 뎅기열 NS5 유전자 서열로부터 RT-PCR 반응을 수행한다. 그 결과는 바이러스 게놈 플라미드에 삽입된 혈청형-특이 핵산 서열을 기지 농도로 포함하는 표준물과 비교하여, log10GEQ (게놈 당량)/mL의 농도로서 표시한다. ELISA 방법의 경우, 환자의 혈청 50 ㎕, 양성 대조군, 음성 대조군 또는 컷-오프 대조군을 샘플 희석제에 1:2로 희석하고, 호스라디시 퍼옥시다제 (HRP)-표지된 항-NS1 단일클론 Ab (MAb) 희석물 100 ㎕와 조합한다. 희석한 혈청과 접합체를 포착용 항-NS1 MAb-코팅된 마이크로웰에 넣고, 플레이트를 37℃에서 90분간 인큐베이션한다. 포착용 MAb/NS1/HRP-표지된-MAb 복합체는, NS1이 혈청에 존재하는 경우에, 형성된다. 3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질 160 ㎕를 첨가하여 실온 및 암 조건에서 30분간 인큐베이션함으로써 유도되는 발색 반응을 통해, 양성 웰에서 복합체를 검출한다. 이 반응은 정지 용액 (1N H2SO4) 100 ㎕를 첨가하여 정지시키고, 플레이트를 판독한다. 샘플 비율은 테스트 샘플의 평균 광학 밀도 (OD)를 (4세트로 테스트한) 컷-오프 대조군의 평균 OD로 나누어 각 샘플에서 구한다. 샘플 비율 <0.5, 0.5-<1.0, 및 ≥1은 각각 음성, 모호 및 양성 결과를 나타낸다.
용어 "바이러스-확증된 중증 뎅기열"은, 본원에서, 1997 WHO 분류에 의해 정의되는 출혈성 뎅기열 (DHF)를 지칭하며, 또한 다음과 같은 추가적인 증상 목록으로 특정된다: 수혈이 필요한 출혈, 모세관 투과성에 대한 객관적인 증거, 순환 부전 신호 또는 내장 증상.
용어 "뎅기열 쇼크 증후군"은, 본원에서, 전술한 가장 중증인 DHF 합병증을 지칭한다. 1997 WHO 분류에 따르면, DSS는 III 등급 및 IV 등급의 DHF이다.
용어 "댕기열 바이러스", "뎅기 바이러스" 및 "DEN"은 상호 호환적으로 사용된다. 이들 용어는 플라비리다에 (flaviridae) 과의 플라비바이러스 속에 속하는, (+) 단일가닥 RNA 바이러스를 지칭한다. 뎅기열 바이러스는 4가지 혈청형 (1, 2, 3 및 4형)이 존재하며, 상호 서열 상동성은 약 60-80%이다. 게놈의 구성은 5'-비코딩부 (NCR), 구조 단백질 코딩부 (캡시드 (C), 프리-멤브레인 (prM) 및 외막 (E)), 비-구조 단백질 토길주 (NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5), 및 3' NCR이다. 뎅기열 바이러스 게놈은 연속적인 코딩부를 코딩하는데, 이는 하나의 폴리단백질로 번역된 다음 번역 후 가공을 거치게 된다.
본 발명의 맥락에서, "백신용 뎅기열 바이러스"는, 면역 능력을 가진 개체에게 상기한 백신용 뎅기열 바이러스를 투여함으로써, 백신용 뎅기열 바이러스로부터 유래되는 뎅기열 바이러스 혈청형에 대한 중화 항체를 유도할 수 있는 바이러스를 지칭한다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 백신용 뎅기열 바이러스의 예로는, 불활화된 뎅기열 바이러스, 약독화된 생 뎅기열 바이러스 및 약독화된 또는 불활화된 생 키메라 뎅기열 바이러스를 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 백신용 뎅기열 바이러스의 혈청형은 혈청형 1, 2, 3 및 4를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 백신용 뎅기열 바이러스는 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스이다.
본원에서, "불활화된 바이러스"라는 표현은, 대응되는 야생형 바이러스의 복제를 허용하는 세포에서 어느 정도의 상당한 수준으로는 복제할 수 없는 바이러스를 지칭한다. 바이러스는 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려진 여러가지 방법으로 불활화될 수 있다. 바이러스의 불활화 방법의 예로는 화학적 처리 또는 방사선 처리를 포함한다 (열 또는 전자기 조사, 전형적으로 X선 또는 자외선 조사 타입을 포함함).
본원에서, 용어 "불활화된 뎅기열 바이러스"는, 뎅기열 바이러스의 모든 구조 단백질 (env, 프리-멤브레인/멤브레인 및 캡시드 단백질)과 불활화된 바이러스 RNA를 포함하는 불활화된 야생형 바이러스를 지칭한다. 또한, 불활화된 뎅기열 바이러스는 불활화된 키메라 뎅기열 바이러스를 지칭한다. 불활화된 뎅기열 바이러스는 예를 들어 미국 특허 6,254,873에 기술되어 있다.
본원에서, 용어 "약독화된 생 바이러스 또는 LAV "는, 야생형 바이러스로 인한 동일한 증상 세트로 특정되는 질환 상태를 유발할 수 없는 바이러스를 지칭한다. 약독화된 생 바이러스의 예는 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 약독화된 생 바이러스는 야생형 바이러스로부터, 예를 들어, 재조합 DNA 기법, 부위 특이적인 돌연변이 유발, 유전자 조작, 복제-적격 세포에서의 연속 계대 배양, 화학적 돌연변이 유발 처리 또는 전자기 조사에 의해 제조할 수 있다.
본원에서, 용어 "약독화된 생 뎅기열 바이러스"는, 해당 야생형 뎅기열 바이러스로 인한 동일한 증상 세트로 특정되는 질환 상태를 유발할 수 없으며 병독성을 감쇠시키는 유전자 변형에 의해 병독성 야생형 뎅기열 바이러스로부터 유래된 생 뎅기열 바이러스를 지칭한다. 본 발명의 실시에 유용한 약독화된 생 뎅기열 바이러스의 예로는 VDV-1, VDV-2, 및 예컨대 WO 02/66621, WO 00/57904, WO 00/57908, WO 00/57909, WO 00/57910, WO 02/0950075 및 WO 02/102828에 기술된 균주를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 혈청형 1의 약독화된 생 뎅기열 바이러스로는 VDV-1을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 혈청형 2의 약독화된 생 뎅기열 바이러스로는 VDV-2 및 LAV-2를 포함한다.
"VDV " 및 "Vero 뎅기열 백신"은 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, 인간에서 인간 항체를 유도하는 등의 특이적인 체액성 반응을 유도할 수 있으며 Vero 세포에서 복제할 수 있는 약독화된 생 뎅기열 바이러스를 지칭한다.
DEN-1 16007/PDK13 균주는 "LAV1"이라고도 하며, 초기 개 신장 (PDK: primary dog kidney) 세포에서 11회 계대 배양된 야생형 DEM-1 (뎅기열 바이러스 혈청형 1) 16007 균주 (DEN-1 16007/PDK11)로부터 파생된 것이다. LAV1은 마히돌 대학의 특허 출원 EP1 159968에 기술되어 있으며, 국립 미생물 배양 콜렉션 (CNCM)에 I-2480으로 수탁되어 있다. "VDV-1"은 LAV1을 Vero 세포에서 후속적으로 적응시킴으로써 파생된 바이러스로서; 이와 관련하여, LAV1으로부터 RNA를 추출하고, 정제한 후 Vero 세포에 형질전환한다. 그런 후, 이를 Vero 세포에서 플레이트 정제 및 증폭시켜, VDV-1 균주를 수득한다. VDV-1 균주는 DEN-1 16007/PDK13 균주 (PDK 세포에서 13회 계대 배양된 것임)와 비교해 14개의 추가적인 돌연변이를 가지고 있다. VDV-1 균주의 제조 및 특정화 방법은 사노피-파스테르 및 질환 방제 및 예방 센터의 국제 특허 출원 WO06/134433에 기술되어 있다.
DEN-2 16681/PDK53 균주는 또한 "LAV2"라고도 하는데, 이는 DEN-2 (뎅기열 바이러스 혈청형 2) 16681를 PDK 세포에서 50회 계대 배양하여 수득한 것이다. LAV2는 마히돌 대학의 특허 출원 EP1159968에 개시되어 있으며, 국립 미생물 배양 콜렉션 (CNCM)에 1-2481로 수탁되었다. "VDV -2"는 LAV2를 Vero 세포에서 후속적으로 적응시킴으로써 파생된 바이러스이며; 이와 관련하여, LAV2로부터 RNA를 추출하고, 정제한 후 Vero 세포에 형질전환한다. 그런 후, 이를 Vero 세포에서 플레이트 정제 및 증폭시켜, VDV-2 균주를 수득한다. VDV-2 균주는 DEN-2 16681/PDK53 균주 (PDK 세포에서 53회 계대 배양된 것임)와 비교해 침묵 돌연변이 4종을 비롯하여 10개의 추가적인 돌연변이를 가지고 있다. VDV-2 균주의 제조 및 특정화 방법은 사노피-파스테르 및 질환 방제 및 예방 센터의 국제 특허 출원 WO06/134443에 기술되어 있다. VDV-2 균주의 전체 핵산 서열은 서열번호 24에 기술되어 있다. VDV-2 균주의 M 단백질 서열은 서열번호 27에 기술되어 있으며, VDV-2 균주의 E 단백질 서열은 서열번호 26에 기술되어 있다.
VDV 1 균주와 VDV 2 균주는 Vero 세포에서 증폭시켜 구축된다. 구축된 바이러스는 회수하고, 여과를 통해 세포 파편을 제거한다. DNA는 효소 처리에 의해 분해한다. 불순물은 초여과를 통해 제거한다. 감염 역가는 농축 방법으로 높일 수 있다. 균주에 안정제를 첨가한 다음 사용 전까지 동결건조하여 저장하거나 또는 냉동된 형태로 저장하고, 필요시 재구성한다.
본 발명의 맥락에서, "뎅기열 키메라 또는 키메라 뎅기열 바이러스"는, 수용체 플라비바이러스의 prM 및 E 단백질을 코딩하는 서열이 뎅기열 바이러스의 대응되는 서열로 치환됨으로써 유전자 백본이 변형된, 수용체 플라비바이러스를 의미한다. 전형적으로, 수용체 플라비바이러스는 약독화될 수 있다. 수용체 플라비바이러스는 황열 (YF) 바이러스, 예컨대 약독화된 YF 17D, YF 17DD 및 YF 17D204 (YF-VAX®) 바이러스일 수 있으며; 이 경우, 이런 키메라는 YF/뎅기열 키메라로 지칭된다. 또한, 수용체 플라비바이러스가 뎅기열 바이러스일 수도 있는데, 이 경우는 뎅기열/뎅기열 키메라로 지칭되며, prM 및 E 단백질의 뎅기열 바이러스의 혈청형 특징은 유전자 백본의 수용체 뎅기열 바이러스 혈청형 특징과 동일하거나 상이하다. 혈청형이 동일한 경우, 수용체 뎅기 바이러스와, prM 및 E 단백질 코딩 서열의 기원이 되는 뎅기열 바이러스는, 혈청형은 동일하지만 상이한 2종의 바이러스 균주이다. 본 발명의 용도에서, 키메라 뎅기열 바이러스는 전형적으로 YF/뎅기열 키메라이다. 키메라 뎅기열 바이러스는 바람직하게는 불활화된 또는 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스이다. 유익하게는, 본 발명에 따른 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스의 수용체 플라비바이러스는 YF 17D 또는 YF 17D204이다. 일 구현예에서, 뎅기열 키메라는 불활화된 바이러스이다. 다른 구현예에서, 뎅기열 키메라는 약독화된 생 바이러스이다. 본 발명의 예방 방법에 사용될 수 있는 뎅기열 키메라로 Chimerivax™ Dengue 혈청형 1 (CYD-1), Chimerivax™ Dengue 혈청형 2 (CYD-2), Chimerivax™ Dengue 혈청형 3 (CYD-3) 및 Chimerivax™ Dengue 혈청형 4 (CYD-4)를 포함한다.
본 발명의 실시에 사용가능한 키메라 뎅기열 바이러스의 예로는, 특허 출원 WO 98/37911에 기술된 뎅기열/YF 키메라 바이러스, 및 특허 출원 WO 96/40933 및 WO 01/60847에 기술된 바와 같은 뎅기열/뎅기열 키메라를 포함한다.
일 구현예에서, 키메라 YF/뎅기열 바이러스는 약독화된 황열 바이러스 균주 YF17D, 예컨대 바이러스 YF17D/DEN-1, YF17D/DEN-2, YF17D/DEN-3 및 YF17D/DEN-4의 게놈 백본을 포함한다 (Theiler M. and Smith H.H., 1937, J.Exp.Med., 65. 767-786). 사용될 수 있는 YF17D 균주의 예로는, YF17D204 (YF-VAX(R), Sanofi-Pasteur, Swiftwater, PA, USA; Stamaril(R), Sanofi-Pasteur, Marcy I'Etoile, France; ARILVAX(TM), Chiron, Speke, Liverpool, UK; FLAVIMUN(R), Berna Biotech, Bern, Switzerland; YF17D-204 France (X15067, X15062); YF17D-204,234 US (Rice et al., 1985, Science, 229: 726-733), 또는 관련 균주 YF17DD (유전자은행 등재 번호 U17066), YF17D-213 (유전자은행 등재 번호 U17067) 및 Galler et al. (1998, Vaccines, 16(9/10): 1024-1028)에 기술된 균주 YF17DD를 포함한다.
본 발명의 실시에 사용하기에 특히 적합한 키메라 뎅기열 바이러스의 일 예는 "Chimerivax 뎅기열 바이러스"이다. 본원에서, "Chimerivax 뎅기열 바이러스"는, YF17D 또는 YF17D204 (YF-VAX®) 바이러스의 게놈 백본을 포함하는 약독화된 생 키메라 YF/뎅기열 바이러스로서, 이 바이러스는 프리-멤브레인 (prM) 및 외막 (E) 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 뎅기열 바이러스의 해당 구조 단백질을 코딩하는 핵산 서열로 치환된 것이다. 본 발명에 사용하는데 바람직한 키메라 뎅기열 바이러스는, 프리-멤브레인 (prM) 및 외막 (E) 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 뎅기열 바이러스의 해당 구조 단백질을 코딩하는 핵산 서열로 치환된, YF17D 바이러스의 게놈 백본을 포함하는, 약독화된 생 키메라 YF/뎅기열 바이러스이다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 키메라 뎅기열 바이러스는, 프리-멤브레인 (prM) 및 외막 (E) 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 뎅기열 바이러스의 해당 구조 단백질을 코딩하는 핵산 서열로 치환된, YF17D204 (YF-VAX®) 바이러스의 게놈 백본을 포함하는, 약독화된 생 키메라 YF/뎅기열 바이러스이다. 이러한 Chimerivax 바이러스는, Chambers, et al. (1999, J.Virology 73(4):3095-3101)에 교시된 내용에 따라 또는 실질적으로 그 교시된 내용에 따라, 구축할 수 있다. 예로 기술된 특정 Chimerivax (CYD) 뎅기열 바이러스는, DEN 1 PU0359 (TYP1 140), DEN2 PUO218, DEN3 PaH881/88 및 DEN 4 1228 (TVP 980) 균주의 prM 및 E 서열과 YF17D 바이러스의 게놈 백본을 이용함으로써, 구축된 것이다. 이러한 특정 Chimerivax 균주는 본원에서 각각 "CYD-1", "CYD-2", "CYD-3" 및 "CYD-4"로 지칭된다 (본 발명의 실시예 참조). 이들 특정 CYD-1, CYD-2, CYD-3 및 CYD-4 균주들은 그 제조 방법이 국제 특허 출원 WO 98/37911, WO 03/101397, WO 07/021672, WO 08/007021, WO 08/047023 및 WO 08/065315에 상세하게 기술되어 있으며, 이들 문헌들에서 제조 방법에 대한 정확한 설명을 참조한다. 다른 예로, 본 발명의 실시에 유용한 키메라 바이러스, 예를 들어 다른 Chimerivax 뎅기열 혈청형 1 (CYD-1), Chimerivax 뎅기열 혈청형 2 (CYD-2), Chimerivax 뎅기열 혈청형 3 (CYD-3) 및 Chimerivax 뎅기열 혈청형 4 (CYD-4) 균주들 각각을 용이하게 구축하기 위한 핵산 소스로서, 다른 뎅기열 바이러스 균주도 이용할 수 있다. 유익하게는, 본 발명의 백신 조성물, 예컨대 혈청형 2의 키메라 뎅기열 바이러스는, 실시예에 기술된 혈청형 2인 균주들 LAV-2, BID-V585, PR/DB023 또는 MD1280로부터 유래된 prM-E 서열과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 가진 prM-E 서열을 포함할 수 있거나, 또는 서열번호 2에 나타낸 prM-E 서열과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 가진 prM-E 서열을 포함할 수 있다. 유익하게는, 본 발명의 방법에 이용하기 위한, 혈청형 2의, 백신 조성물, 예컨대 키메라 뎅기열 바이러스는, 혈청형 2의 균주들 LAV-2, BID-V585, PR/DB023 또는 MD1280로부터 유래된 prM-E 서열, 또는 실시예에 기술된 서열번호 2로부터 유래된 prM-E 서열을 포함할 수 있다. 이들 키메라 뎅기열 바이러스의 수용체 게놈 백본이 YF-VAX®에서 유래되는 경우, 이 균주는 본원에서 CYD-LAV, CYD-BID, CYD-PR 및 CYD-MD로 지칭된다. 혈청형 2의 균주들 LAV-2 (서열번호 8), BID-V585 (서열번호 9), PR/DB023 (서열번호 10), MD1280 (서열번호 11) 또는 서열번호 2의 prM-E 서열을 이용하여 제조되거나, 또는 혈청형 2의 균주들 LAV-2, BID-V585, PR/DB023, MD1280으로부터 유래된 prM-E 서열 또는 서열번호 2로부터 유래된 prM-E 서열과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 가진 prM-E 서열을 이용하여 제조된, 혈청형 2의 키메라 뎅기열 바이러스를 포함하는 본 발명의 백신 조성물은, 유익하게는, 본 발명에 따른 백신에서 CYD-1, CYD-3 및 CYD-4와 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 예방 방법에 유용한 키메라 뎅기열 바이러스에 대한 다른 예는, 유전자 백본이, (i) 수용체 플라비바이러스의 E 단백질 코딩 서열이 뎅기열 바이러스의 해당 서열로, 그리고 (ii) 수용체 플라비바이러스의 prM 단백질 코딩 서열이 비-뎅기열 플라비바이러스, 예컨대 JEV 바이러스의 해당 서열로 치환됨으로써 변형된, 수용체 플라비바이러스이다. 전형적으로, 이 키메라 바이러스는 약독화된 생 바이러스 또는 불활화된 바이러스일 수 있다. 이런 키메라 뎅기열 바이러스의 예들은 WO2011/138586에 기술되어 있다.
본 발명의 백신 조성물에 사용하기 위한 혈청형 1의 백신용 뎅기열 바이러스는, 예를 들어, VDV1, CYD-1 또는 DEN-1 16007/PDK13 균주의 prM 및 E 아미노산 서열을 포함하는 YF17D/DEN-1 키메라 바이러스일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 혈청형 2의 백신용 뎅기열 바이러스는, 예를 들어, VDV2, CYD-2, DEN-2 16681/PDK53 균주의 prM 및 E 아미노산 서열을 포함하는 YF17D/DEN-2 키메라 바이러스, DEN-2 균주들 LAV-2, BID-V585, PR/DB023 또는 MD1280의 prM 및 E 아미노산 서열을 포함하는 키메라 바이러스, 또는 혈청형 2의 균주들 LAV-2, BID-V585, PR/DB023 또는 MD1280의 prM-E 서열과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나 또는 서열번호 2의 prM-E 서열과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 가진 prM-E 서열을 포함하는 키메라 바이러스일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 혈청형 3의 백신용 뎅기열 바이러스는, 예를 들어 CYD-3 또는 얼터너티브 (alternative) YF17D/DEN-3 키메라 바이러스일 수 있다. 혈청형 4의 백신용 뎅기열 바이러스에 대한 예는 CYD-4 또는 얼터너티브 YF17D/DEN-4 키메라 바이러스이다.
본 발명의 조성물은 하나 이상의 뎅기열 항원을 포함한다. 전형적으로, 본 발명의 조성물은 혈청형 1, 2, 3 및 4 각각의 뎅기열 항원, 예컨대 백신용 뎅기열 바이러스를 포함한다. 각 혈청형의 본 발명의 뎅기열 항원, 예컨대 백신용 뎅기열 바이러스는 본원에 기술된 바와 같을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 유익하게는 하기한 뎅기열 항원 조합들 중 어느 하나를 포함할 수 있다: i) CYD-1의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-LAV의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-3의 prM 및 E 아미노산 서열을 포함하는 키메라 뎅기열 바이러스 및 CYD-4의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원; ii) CYD-1의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-BID의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-3의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원 및 CYD-4의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원; (iii) CYD-1의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-PR의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-3의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, 및 CYD-4의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원; (iv) CYD-1의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-MD의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-3의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, 및 CYD-4의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원. 예를 들어, 본 발명의 조성물은, 또한, 유익하게는, 하기 뎅기열 항원들의 조합들 중 임의의 하나를 포함할 수 있다: i) CYD-1, CYD-LAV, CYD-3 및 CYD-4; ii) CYD-1, CYD-BID, CYD-3 및 CYD-4; (iii) CYD-1, CYD-PR, CYD-3 및 CYD-4 또는 (iv) CYD-1, CYD-MD, CYD-3 및 CYD-4. 또한, 본 발명의 조성물은, 유익하게는 하기 뎅기열 항원들의 조합을 포함할 수 있다: i) CYD-1의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, VDV2, CYD-3의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원 및 CYD-4의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 유익하게는 CYD-1, VDV-2, CYD-3 및 CYD-4를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 본원에 기술된 바와 같이, 유익하게는, CYD-LAV (서열번호 8), CYD-BID (서열번호 9), CYD-PR (서열번호 10) CYD-MD (서열번호 11) 또는 서열번호 2의 prM-E 서열을 포함하는, 혈청형 2의 뎅기열 항원을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 본원에 기술된 바와 같이, 유익하게는, CYD-LAV (서열번호 8), CYD-BID (서열번호 9), CYD-PR (서열번호 10) CYD-MD (서열번호 11) 또는 서열번호 2의 prM-E 서열과 90% 이상의 동일성을 가진 서열을 포함하는, 혈청형 2의 뎅기열 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 서열은 CYD-LAV (서열번호 8), CYD-BID (서열번호 9), CYD-PR (서열번호 10) CYD-MD (서열번호 11) 또는 서열번호 2의 prM-E 서열과 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일할 수 있다.
용어 "바이러스-유사 입자 또는 VLP "은, 본원에서, 비리온 구조와 유사하게 반복 정렬된 어레이에, 복제형 유전 물질을 함유하지 않지만 뎅기열 E 단백질이 그 표면에 존재하는, 바이러스 입자를 지칭한다. 전형적으로, 뎅기열 VLP는 또한 뎅기열 prM 및/또는 M 및 E 단백질을 포함한다. VLP는 시험관내에서 제조될 수 있다 (Zhang et al, J. Virol. (2011) 30 (8):333). 또한, VLP는 생체내에서 제조될 수 있다. 이를 위해, prM 및 E 뎅기열 단백질을 코딩하는 핵산 구조체 (예, DNA 또는 RNA 구조체)를 개체의 세포, 예컨대 인간 개체의 세포로 당해 기술 분야에 공지된 방법을 통해, 예컨대 바이러스 벡터의 사용을 통해 도입시킬 수 있다. prM 및 E 뎅기열 바이러스 서열 둘다를 함유하며 발현할 수 있는 한, 임의의 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 바이러스 벡터에 대한 비-제한적인 예로는, 폭스바이러스 (예, 약독화된 pox Ankara 바이러스) 및 홍역 바이러스를 포함한다. 본 발명에 이용하기 위해, 생체내에서 VLP를 발현하는 특정 카테고리의 바이러스 벡터는, 예를 들어 Replivax™에 따른 기법복제-결핍성 가성감염성 (PIV) 바이러스를 포함한다 (Rumyantsev AA, et al. VACCINE. 2011 Jul 18;29(32):5184-94).
용어 "복제- 결함성 가성감염성 바이러스"는, 본원에서, 복제 사이클의 필수 서열의 게놈, 예를 들어 캡시드 단백질을 코딩하는 서열이 없는, 생체내 복제-결함성 비리온 입자를 지칭한다. 그러나, 비리온 입자는 필수 서열(들)을 트랜스로 제공하는 헬퍼 세포에서 배양하여 증식시킬 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 복제-결함성 가성감염성 바이러스로는 임의 혈청형의 뎅기열 바이러스의 prM 및 E 단백질을 발현할 수 있는 상기한 정의에 따른 임의의 바이러스를 포함한다. 그 예로는 복제 결함성 플라비바이러스 / 뎅기열 키메라, 예컨대 복제 결함성 웨스트 나일 바이러스 / 뎅기열, 일본 뇌염 바이러스 / 뎅기열 및 YF / 뎅기열 키메라를 포함한다.
본 발명의 백신 조성물이 개체에서 면역 반응을 촉발 (즉, 중화 항체의 생산을 유도)시키는 능력 (즉, 중화 항체의 생산을 유도)은, 예를 들어, 조성물에 포함된 뎅기열 바이러스 혈청형(들)에 대해 생성된 중화 항체의 역가를 측정함으로써, 분석할 수 있다. 중화 항체 역가는 플라그 감소 중화 검사 (PRNT50)로 측정할 수 있다. 간략하게는, 중화 항체 역가는 본 발명의 백신 조성물을 투여한 후 적어도 28일 이후에 백신 접종한 개체에서 수집한 혈청에서 측정한다. 연속적인 2배 혈청 희석물 (사전에 열-불활화됨)을 필요에 따라 혈청형 1, 2, 3 또는 4의 뎅기열 바이러스 각각과 일정한 챌린지-용량 (challenge-dose) (PFU/mL으로 표시됨)으로 혼합한다. 이 혼합물을 컨플루언트 Vero 세포 단층이 함유된 마이크로플레이트의 웰에 접종한다. 흡착 후, 세포 단층을 수일간 인큐베이션한다. 뎅기열 바이러스로 감염된 세포의 존재는 감염된 병소 형성에 의해 표시되며, 혈청 샘플내 중화 항체의 존재로 인한 바이러스 감염성 감소를 검출할 수 있다. 보고된 값 (엔드 포인트 중화 역가)은 뎅기열 챌린지 바이러스 (병소 카운트)의 ≥　50 %가 음성 대조군 웰 (100% 바이러스 로드임)에서의 평균 바이러스 병소 카운트와 비교해 중화되는, 최대 혈청 희석이다. 엔드 포인트 중화 역가는 연이은 값들로 표시된다. 분석의 정량 하한 (LLOQ)은 10 (1/dil)이다. 역가가 10 (1/dil) 이상일 때 혈청전환 (seroconversion)이 이루어지는 것으로 통상 간주된다. PRNT 검사가 실험실 내지 다른 곳에 따라 약간씩 달라질 수 있기 때문에, LLOQ 역시 약간씩 달라질 수 있다. 즉, 일반적인 방식으로, 역가가 검사의 LLOQ 보다 높거나 동일할 때 혈청전환이 이루어지는 것으로 간주된다. 중화 항체 역가는 하기 참조 문헌들에 다루어졌지만, 저자들은 예방 상관관계는 확립하지 못하였다 (Guirakhoo et al, J. Virol. (2004) 78 (9): 4761; Libraty et al, PLoS Medicine (2009) 6 (10); Gunther et al, VACCINE (2011) 29: 3895) 및 Endy et al, J. Infect. Dis. (2004), 189(6): 990-1000).
용어 "CCID 50 "은 세포 배양물의 50%를 감염시키는 바이러스 (예, 백신용 바이러스)의 양이다. CCID50 분석은 통계적으로 역가를 계산하는 한계 희석 분석이다 (Morrison D et al J Infect Dis. 2010; 201(3):370-7)).
용어 "인간 개체"는 다양한 연령의 남성과 여성을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 인간 개체는 18세 미만 또는 12세 미만이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 인간 개체는 0-17세, 0-17세, 0-11세, 4-17세, 4-11세, 4-6세, 6-8세, 8-10세, 2-8세, 2-11세, 2-14세, 9-16세, 12-17세 또는 18-45세일 수 있다. 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 인간 개체는 4-11세, 2-14세 또는 9-16세이다. 본 발명에 따른 인간 개체는 9월령 이상 또는 9월령 미만일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 인간 개체는 9월령 - 16세, 9월령 - 14세, 9월령 - 11세 또는 9월령 - 8세일 수 있다. 본 발명에 따른 인간 개체는 적어도 9월령 이상일 수 있으며, 본원에 정의된 백신 조성물의 임의의 구성 성분에 대해 심각한 알레르기 병력이 없으며, 선천성 또는 후천성 면역 결핍이 없으며, 증상성 HIV 감염이 없으며, 상기 개체는 임신 또는 수유기가 아니어야 한다.
본원에서, "플라비바이러스 - 나이브 개체 ( flavivirus -naive subject)"라는 표현은 플라비바이러스에 감염된 적 없거나 플라비바이러스 백신으로 이전에 백신 접종받은 바 없는 개체를 지칭하며, 즉 생체에서 채집한 혈청 샘플이 플라비바이러스 ELISA 또는 PRNT 분석에서 음성 결과를 나타낼 것이다.
본원에서, "뎅기열 나이브 개체"라는 표현은 뎅기열에 감염된 적 없거나 뎅기열 백신으로 이전에 백신 접종받은 바 없는 개체를 지칭하며, 즉 생체에서 채집한 혈청 샘플이 뎅기열 ELISA 또는 PRNT 분석에서 음성 결과를 나타낼 것이다.
본원에서, "플라비바이러스 -면역 개체"라는 표현은 본 발명의 백신 조성물을 투여하기 전에 플라비바이러스에 감염되거나 면역화된 적 있는 개체를 지칭하며, 즉, 생체에서 채집한 혈청 샘플이 플라비바이러스 ELISA 또는 PRNT 분석에서 양성 결과를 나타낼 것이다.
본원에서, "뎅기열 면역 개체"라는 표현은 본 발명의 백신 조성물을 투여하기 전에 뎅기열 바이러스에 감염되거나 뎅기열 백신으로 면역화된 적 있는 개체를 지칭하며, 즉, 생체에서 채집한 혈청 샘플이 뎅기열 ELISA 또는 PRNT 분석에서 양성 결과를 나타낼 것이다.
본 발명에 따라, "예방 방법"은, 본원에서, 뎅기열 바이러스에 노출된 인간 개체에서 뎅기열 질환이 발병될 가능성 또는 중증도를 낮추게 된다. 유익하게는, 이러한 감소는 통계적으로 유의한 수준이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 예방 방법은 본원에 정의된 뎅기열 질환의 하나 이상의 증상의 감소 또는 이들 증상 2가지 이상의 조합의 감소를 야기할 수 있다. 예방은 하기 중 임의의 하나 이상을 달성할 수 있다:
(i) 임의 혈청형의 뎅기열 바이러스에 의해 야기되는 바이러스-확증된 증상성 뎅기열 질환의 발병 또는 가능성의 통계학적으로 유의한 감소, 예컨대 예방;
(ii) 혈청형 1, 3 또는 4 중 임의의 한가지 혈청형의 뎅기열 바이러스에 의해 야기되는 바이러스-확증된 증상성 뎅기열 질환의 발병 또는 가능성의 통계학적으로 유의한 감소, 예컨대 예방;
(iii) 임의 혈청형의 뎅기열 바이러스에 의해 야기되는 증상성 뎅기열 질환의 발병 또는 가능성의 통계학적으로 유의한 감소, 예컨대 예방;
(iv) 혈청형 1, 3 또는 4 중 임의의 한가지 혈청형의 뎅기열 바이러스에 의해 야기되는 증상성 뎅기열 질환의 발병 또는 가능성의 통계학적으로 유의한 감소, 예컨대 예방;
(v) 임의의 혈청형의 뎅기열 바이러스에 의해 야기되는 바이러스-확증된 중증 뎅기열의 발병 또는 가능성의 통계학적으로 유의한 감소, 예컨대 예방;
(vi) 임의의 혈청형의 뎅기열 바이러스에 의해 야기되는 중증 뎅기열 질환의 발병 또는 가능성의 통계학적으로 유의한 감소, 예컨대 예방;
(vii) 임의 혈청형의 뎅기열 바이러스에 의해 야기되는 I - IV 등급의 출혈성 뎅기열의 발병 또는 가능성의 통계학적으로 유의한 감소, 예컨대 예방;
(viii) 임의 혈청형의 뎅기열 바이러스에 의해 야기되는 I 등급의 DHF 사례의 발병 또는 가능성의 통계학적으로 유의한 감소, 예컨대 예방;
(ix) 임의 혈청형의 뎅기열 바이러스에 의해 야기되는 II 등급의 DHF 사례의 발병 또는 가능성의 통계학적으로 유의한 감소, 예컨대 예방;
(x) 임의 혈청형의 뎅기열 바이러스에 의해 야기되는 III 등급의 DHF 사례의 발병 또는 가능성의 통계학적으로 유의한 감소, 예컨대 예방;
(xi) 임의 혈청형의 뎅기열 바이러스에 의해 야기되는 IV 등급의 DHF 사례의 발병 또는 가능성의 통계학적으로 유의한 감소, 예컨대 예방;
(xii) 발열 또는 가능성의 통계학적으로 유의한 감소, 예컨대 예방, 또는 평균 기간 단축 및/또는 발열 수준 감소;
(xiii) 헤모토크릿 변화로 정의되는 혈장 누출 발생 또는 가능성의 통계학적으로 유의한 감소, 예컨대 예방, 또는 헤모토크릿 변화로 정의되는 혈장 누출의 평균치 감소;
(xiv) 혈소판 감소증의 발병 또는 가능성의 통계학적으로 유의한 감소, 예컨대 예방, 또는 혈소판 감소증의 평균 수치 감소;
(xv) 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST)를 비롯한 간 효소의 수준 증가 발생 또는 가능성의 통계학적으로 유의한 감소, 예컨대 예방;
(xvi) 임의 혈청형의 뎅기열 바이러스에 의해 야기되는 바이러스-확증된 뎅기열 질환으로 인한 입원 또는 가능성의 통계학적으로 유의한 감소, 예컨대 예방;
(xvii) 임의 혈청형의 뎅기열 바이러스에 의해 야기되는 뎅기열 질환으로 인한 입원 또는 가능성의 통계학적으로 유의한 감소, 예컨대 예방;
(xviii) 바이러스-확증된 뎅기열 질환으로 인한 입원 기간의 통계학적으로 유의한 단축;
(xix) 뎅기열 질환으로 인한 입원 기간의 통계학적으로 유의한 단축.
열 발생 기간과 발열 강도는 표준 병원 절차에 따라 모니터링하고 기록한다. 인간 개체에서, 열 (즉, 발열 에피소드)은 4시간 이상의 간격으로 2번 측정하였을 때 체온이 37.5℃ 이상인 것으로 정의된다. 헤마토크릿, 혈소판 감소증 및 간 효소 수준 측정은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있는, 예컨대 약전에 기술된 표준 검사이다.
뎅기열 질환 예방, 예컨대 (i) - (xix)에 기술된 뎅기열 질환 예방은, 특정 뎅기열 바이러스 혈청형에 의해 야기되는 뎅기열 질환에 대해 발휘될 수 있다. 예를 들어, 본원에 정의된 뎅기열 질환의 예방은 혈청형 1의 뎅기열 바이러스, 혈청형 2의 뎅기열 바이러스, 혈청형 3의 뎅기열 바이러스 또는 혈청형 4의 뎅기열 바이러스에 의해 야기되는 뎅기열 질환에 대해 발휘될 수 있다. 유익하게는, 본원에 정의된 뎅기열 질환의 예방은, 예를 들어, 혈청형 1 또는 혈청형 3의 뎅기열 바이러스, 혈청형 1 또는 혈청형 4의 뎅기열 바이러스, 혈청형 3 또는 혈청형 4의 뎅기열 바이러스, 혈청형 1 또는 혈청형 2의 뎅기열 바이러스, 혈청형 2 또는 혈청형 3의 뎅기열 바이러스, 혈청형 2 또는 혈청형 4의 뎅기열 바이러스, 혈청형 1, 2 또는 3의 뎅기열 바이러스, 혈청형 1, 3 또는 4의 뎅기열 바이러스, 혈청형 2, 3 또는 4의 뎅기열 바이러스, 또는 혈청형 1, 2, 3 또는 4의 뎅기열 바이러스에 의해 야기되는 뎅기열 질환에 대해 발휘될 수 있다.
본원에 정의된 뎅기열 질환의 예방은, 유익하게는, 인간 개체의 특정 서브-그룹에서 발휘될 수 있다. 예를 들어, 뎅기열 질환의 예방은, 유익하게는, 18세 미만 또는 12세 미만의 인간 개체에서 달성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 인간 개체는 0-17세, 0-11세, 4-17세, 4-11세, 4-6세, 6-8세, 8-10세, 2-8세, 2-11세, 2-14세, 9-16세, 12-17세 또는 18-45세일 수 있다. 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 인간 개체는 4-11세, 2-14세 또는 9-16세이다. 본 발명에 따른 인간 개체는 9월령 이상 또는 9월령 미만일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 인간 개체는 9월령 - 16세, 9월령 - 14세, 9월령 - 11세 또는 9월령 - 8세일 수 있다. 본 발명에 따른 인간 개체는 9월령 이상일 수 있으며, 본원에 정의된 백신 조성물의 임의의 구성 성분에 대해 심각한 알레르기 병력이 없으며, 선천성 또는 후천성 면역 결핍이 없으며, 증상성 HIV 감염이 없으며, 상기 개체는 임신 또는 수유기가 아니어야 한다.
본원에 정의된 뎅기열 질환의 예방은, 유익하게는, 특정 국가, 지역 또는 전세계에서 달성될 수 있다. 예를 들어, 뎅기열 질환의 예방은 유익하게는 뎅기열 유행 지역에서 달성될 수 있다. 예를 들어, 예방이 달성될 수 있는 본 발명에 따른 뎅기열 유행 지역은 아메리카 국가 또는 열대 및 아열대 지역에 속하는 아메리카 국가를 포함할 수 있다. 예방이 본 발명에 따라 달성될 수 있는 뎅기열 유행 지역은 따라서 하기 국가 중 임의의 하나 이상의 국가를 포함할 수 있다: 브라질, 베네주엘라, 콜로비아, 에콰도르, 페루, 볼리비아, 파라콰이, 파나마, 코스타리카, 니카라구아, 온두라스, 엘살바도르, 과테말라, 벨리즈, 멕시코, 미국 및 카리브해 섬들. 특정 구현예에서, 예방이 달성될 수 있는 본 발명의 뎅기열 유행 지역은 브라질, 콜로비아, 온두라스, 멕시코 및 푸에르토리코로 이루어질 수 있다. 예방이 본 발명에 따라 달성될 수 있는 뎅기열 유행 지역으로, 또한 남아시아 및 열대 및 아열대 지방의 오세아니아 국가들을 포함할 수 있다. 예방이 달성될 수 있는 본 발명에 따른 뎅기열 유행 지역은 따라서 인도, 미얀마 (버마), 타이, 라오스, 베트남, 캄보디아, 인도네시아, 말레이시아, 싱가포르, 필리핀, 타이완, 파푸아뉴기니아 및 호주 중 임의의 하나 이상으로 구성될 수 있다. 예방이 본 발명의 방법에 따라 달성될 수 있는 뎅기열 유행 지역에서, 특정 혈청형, 균주 또는 유전자형의 야생형 뎅기열 바이러스가 우세한 유행 균주일 수 있다. 예를 들어, 혈청형 2의 뎅기열 바이러스는 Asian I 또는 Asian/American 유전자형을 가지는 것으로 특정될 수 있다. Asian/American 유전자형 균주는 prM-16, E-83, E-203, E-226, E-228 및 E-346 위치에 각각 Arg, Asn, Asp, Thr, Gly 및 His 잔기들 중 하나 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상 또는 6개의 존재로 특정된다 (prM-16은 prM 단백질의 16번 위치를 표시하는 것이고, E-83은 E 단백질의 83번 위치를 표시하는 것임). Asian I 유전자형 균주는 prM-16, E-83, E-203, E-226, E-228 및 E-346 위치에 각각 Ile, Lys, Asn, Arg, Glu 및 Tyr 잔기들 중 하나 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상 또는 6개의 존재로 특정된다 (Hang et al., PLoS NTD, 4(7): e757의 표 1 참조). 예방이 본 발명에 따라 달성되는 바람직한 뎅기열 유행 지역은, Asian/American 유전자형 뎅기열 바이러스가 우세한 유행 균주인 지역이며, 즉, 상기 뎅기열 유행 지역에서 뎅기열 질환 사례의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100%가 Asian/American 유전자형을 가진 뎅기열 바이러스에 의해 유발되는 지역이다. 예방이 본 발명에 따라 달성될 수 있는 바람직한 뎅기열 유행 지역은, 혈청형 1, 3 또는 4 중 하나 이상의 임의의 혈청형의 뎅기열 바이러스가 우세한 유행 혈청형(들)인 지역이며, 즉, 뎅기열 질환의 사례 중 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100%가 혈청형 1, 3 또는 4의 뎅기열 바이러스에 의해 야기되는 지역이다.
본원에서, 소정의 DNA 서열의 "RNA 등가체"라는 용어는 데옥시티미딘이 우리딘으로 치환된 서열을 지칭한다. 대상 DNA 서열이 뎅기열 바이러스의 cDNA 서열을 구성하기 때문에, 등가체 RNA 서열은 뎅기열 바이러스의 양성 가닥 RNA를 구성한다.
수종의 구현예들에 대한 개괄
본 발명자들은, 최초로, 인간 개체를 뎅기열 질환으로부터 예방하는 백신 조성물의 효능을 입증하게 되었다.
이에, 본 발명은 인간 개체에서 뎅기열 질환을 예방하는 방법에 사용하기 위한 하기 구성 성분을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다:
(i) 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 뎅기열 항원:
(a) 약독화된 뎅기열 생 바이러스;
(b) 불활화된 뎅기열 바이러스;
(c) 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스 또는 불활화된 키메라 뎅기열 바이러스;
(d) 뎅기열 바이러스-유사 입자 (VLP); 및
(e) (a) - (d) 중 2 이상의 조합;
또는
(ii) 뎅기열 VLP인 뎅기열 항원을 인간 세포에서 발현할 수 있는, 핵산 구조체 또는 바이러스 벡터.
바람직하게는, 본 발명에 따른 뎅기열 질환은 바이러스-확증된 뎅기열 질환이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 인간 개체는 18세 미만 또는 12세 미만이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 인간 개체는 0-17세, 0-11세, 4-17세, 4-11세, 4-6세, 6-8세, 8-10세, 2-8세, 2-11세, 2-14세, 9-16세, 12-17세 또는 18-45세일 수 있다. 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 인간 개체는 4-11세, 2-14세 또는 9-16세이다. 본 발명에 따른 인간 개체는 9월령 이상 또는 9월령 미만일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 인간 개체는 9월령 - 16세, 9월령 - 14세, 9월령 - 11세 또는 9월령 - 8세일 수 있다. 본 발명에 따른 인간 개체는 9월령 이상일 수 있으며, 본원에 정의된 백신 조성물의 임의의 구성 성분에 대해 심각한 알레르기 병력이 없으며, 선천성 또는 후천성 면역 결핍이 없으며, 증상성 HIV 감염이 없으며, 상기 개체는 임신 또는 수유기가 아니어야 한다.
본 발명의 백신 조성물이 투여되는 개체는 바람직하게는 감염 위험성이 있는 사람, 예를 들어 뎅기열이 출현한 지역, 즉 뎅기열 유행 지역을 여행하는 사람, 또는 이 지역의 거주자이다. 본 발명에 따른 뎅기열 유행 지역은 열대 및 아열대 지역 대부분, 예컨대 WHO에 의해 유행 국가로 지정된 모든 국가를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 뎅기열 유행 지역은 아메리카 국가 또는 열대 및 아열대 지역에 속하는 아메리카 국가를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 뎅기열 유행 지역은 따라서 하기 국가 중 임의의 하나 이상의 국가를 포함할 수 있다: 브라질, 베네주엘라, 콜로비아, 에콰도르, 페루, 볼리비아, 파라콰이, 파나마, 코스타리카, 니카라구아, 온두라스, 엘살바도르, 과테말라, 벨리즈, 멕시코, 미국 및 카리브해 섬들. 특정 구현예에서, 본 발명의 뎅기열 유행 지역은 브라질, 콜로비아, 온두라스, 멕시코 및 푸에르토리코로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 뎅기열 유행 지역으로, 또한 남아시아와 열대 및 아열대 지방의 오세아니아 국가들을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 뎅기열 유행 지역은 따라서 인도, 미얀마 (버마), 타이, 라오스, 베트남, 캄보디아, 인도네시아, 말레이시아, 싱가포르, 필리핀, 타이완, 파푸아뉴기니아 및 호주 중 임의의 하나 이상으로 구성될 수 있다. 본 발명의 방법에 따른 뎅기열 유행 지역에서, 특정 혈청형, 균주 또는 유전자형의 야생형 뎅기열 바이러스가 우세한 유행 균주일 수 있다. 예를 들어, 혈청형 2의 뎅기열 바이러스는 Asian I 또는 Asian/American 유전자형을 가지는 것으로 특정될 수 있다. Asian/American 유전자형 균주는 prM-16, E-83, E-203, E-226, E-228 및 E-346 위치에 각각 Arg, Asn, Asp, Thr, Gly 및 His 잔기들 중 하나 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상 또는 6개의 존재로 특정된다 (prM-16은 prM 단백질의 16번 위치를 표시하는 것이고, E-83은 E 단백질의 83번 위치를 표시하는 것임). Asian I 유전자형 균주는 prM-16, E-83, E-203, E-226, E-228 및 E-346 위치에 각각 Ile, Lys, Asn, Arg, Glu 및 Tyr 잔기들 중 하나 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상 또는 6개의 존재로 특정된다 (Hang et al., PLoS NTD, 4(7): e757의 표 1 참조). 본 발명에 따른 바람직한 뎅기열 유행 지역은, Asian/American 유전자형 뎅기열 바이러스가 우세한 유행 균주인 지역이며, 즉, 상기 뎅기열 유행 지역에서 뎅기열 질환 사례의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100%가 Asian/American 유전자형을 가진 뎅기열 바이러스에 의해 유발되는 지역이다. 본 발명에 따른 바람직한 뎅기열 유행 지역은, 혈청형 1, 3 또는 4 중 하나 이상의 임의의 혈청형의 뎅기열 바이러스가 우세한 유행 혈청형(들)인 지역이며, 즉, 뎅기열 질환의 사례 중 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100%가 혈청형 1, 3 또는 4의 뎅기열 바이러스에 의해 야기되는 지역이다.
본 발명의 백신 조성물은 플라비바이러스 면역 개체, 예컨대, 뎅기-면역 개체에게 투여될 수 있거나, 또는 본 발명의 백신 조성물은 플라비바이러스-나이브 개체에게 투여될 수 있다. 유익하게는, 본 발명의 백신 조성물은 플라비바이러스-면역 개체, 예컨대, 뎅기열-면역 개체에게 투여된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물, 예컨대 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 조성물은 DHF 가능성 또는 중증도를 낮추다. DHF 가능성 저하 (즉, DHF와 접촉할 가능성 저하)는, 본 발명에 따른 백신 조성물을 제공받은 개체 그룹에서의 DHF의 발병 건 수를, 본 발명에 따른 백신 조성물을 제공받지 않은 대조군인 개체 그룹에서의 DHF의 발병 건 수와 비교함으로써, 측정할 수 있다. DHF의 중증도 저하는, 본 발명에 따른 백신 조성물은 제공받은 개체 그룹에서 I, II, III 또는 IV 등급 각각의 DHF를 발현하는 개체의 수를 계산하고, 그 수를 본 발명에 따른 백신 조성물을 제공받지 않은 대조군인 개체 그룹의 개체 수와 비교함으로써, 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 조성물은, 바람직하게는, 본 발명에 따른 백신 조성물을 제공받지 않은 대조군인 개체 그룹에서 발병하는 I 등급 DHF, II 등급 DHF, III 등급 DHF 및 IV 등급 DHF의 발병 건 수와 비교해, 본 백신을 제공받는 개체에서의 I 등급 DHF의 발병 건 수, II 등급 DHF의 발병 건 수, III 등급 DHF의 발병 건 수 및/또는 IV 등급 DHF의 발병 건 수를 낮춘다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물, 예컨대 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 조성물은 바이러스-확증된 증상성 뎅기열 질환의 발병 또는 그 가능성을 감소시킨다. 유익하게는, 본 발명에 따른 조성물, 예컨대 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 조성물은 혈청형 1, 3 또는 4의 뎅기열 바이러스에 의해 야기되는 바이러스-확증된 증상성 뎅기열 질환의 발병 또는 그 가능성을 감소시킨다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물, 예컨대 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 조성물은 바이러스-확증된 뎅기열 질환으로 인한 입원율을 낮추며, 즉, 바이러스-확증된 뎅기열 질환의 입원 건수를 감소시킨다. 예를 들어, 본 발명에 따른 조성물, 예컨대 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 조성물은 혈청형 1, 3 또는 4의 뎅기열 바이러스에 의해 유발되는 바이러스-확증된 뎅기열 질환으로 인한 입원율을 낮추며, 즉, 혈청형 1, 3 또는 4의 뎅기열 바이러스에 의해 유발되는 바이러스-확증된 뎅기열 질환의 입원 건수를 감소시킨다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물, 예컨대 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 조성물은 뎅기열 질환의 발병 또는 그 가능성을 감소시킨다. 유익하게는, 본 발명에 따른 조성물, 예컨대 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 조성물은 혈청형 1, 3 또는 4의 뎅기열 바이러스에 의해 유발된 뎅기열 질환의 발병 또는 그 가능성을 감소시킨다. 유익하게는, 본 발명에 따른 조성물, 예컨대 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 조성물은 혈청형 1, 2, 3 또는 4의 뎅기열 바이러스에 의해 유발되는 뎅기열 질환의 발병 또는 그 가능성을 감소시킨다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물, 예컨대 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 조성물은 뎅기열 질환으로 인한 입원율을 낮추며, 즉, 뎅기열 질환의 입원 건수를 감소시킨다. 예를 들어, 본 발명에 따른 조성물, 예컨대 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 조성물은 혈청형 1, 3 또는 4의 뎅기열 바이러스에 의해 유발된 뎅기열 질환으로 인한 입원율을 낮추며, 즉, 혈청형 1, 3 또는 4의 뎅기열 바이러스에 의해 유발된 뎅기열 질환의 입원 검수를 감소시킨다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 다회 투약으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 백신 조성물의 투약은 일차 백신 접종 요법 후 후속적인 부스터 백신 접종으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 백신 조성물은 1회, 2회 또는 3회 또는 4회 이상으로, 예컨대 4회 투여될 수 있다. 바람직하게는, 1차 투여와 3차 투여는 약 12개월 간격으로 투여된다. 예를 들어, 본 발명에 따른 첫 백신 접종 용법은 3회 투약으로 투여되는데, 백신 접종 용법의 1차 투여와 3차 투여는 약 12개월 간격으로 투여된다. 유익하게는, 본 발명에 따른 백신 조성물은 1차 투여, 2차 투여 및 3차 투여로 투여된다. 이러한 구현예에서, 상기 1차 투여와 3차 투여는 약 12개월 간격으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 백신 조성물은 1차 투여, 2차 투여 및 3차 투여로 투여될 수 있는데, 상기 2차 투여는 상기 1차 투여 후 약 6개월 후에 투여되며, 상기 3차 투여는 상기 1차 투여 후 약 12개월 후에 투여되는 것이다. 다른 예로, 3번의 투여는 0개월에, 약 3-4개월에 (예, 약 3달 보름), 그리고 약 12개월에 투여될 수 있다 (즉, 조성물의 2차 투여는 1차 투여 후 약 3달 보름 시점에 투여하고, 조성물의 3차 투여는 1차 투여 후 약 12개월 시점에 투여하는 용법임).
본 발명에 따른 백신 조성물은 2회 투여로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 1차 투여와 2차 투여는 1차 투여 후 대약 6달 - 12개월 이후에 투여되는 것이다. 바람직하게는, 2차 투여는 1차 투여 후 8개월 시점에 투여되는 것이다. 바람직하게는 2차 투여는 1차 투여 후 약 8개월 보름 내지 9개월 시점에 투여된다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 1회 투여로 투여될 수 있다.
본원에 정의된 뎅기열 질환은 2가지 혈청형의 뎅기열 바이러스들 중 임의의 하나에 의해 유발될 수 있다. 예를 들어, 뎅기열 질환은 바람직하게는 혈청형 1 또는 혈청형 3의 뎅기열 바이러스, 혈청형 1 또는 혈청형 4의 뎅기열 바이러스, 혈청형 3 또는 혈청형 4의 뎅기열 바이러스, 혈청형 1 또는 혈청형 2의 뎅기열 바이러스, 혈청형 2 또는 혈청형 3의 뎅기열 바이러스, 혈청형 2 또는 혈청형 4의 뎅기열 바이러스에 의해 유발된다. 본원에 정의된 뎅기열 질환은 바람직하게는 3가지 혈청형의 뎅기열 바이러스들 중 임의의 하나에 의해 유발된다. 예를 들어, 뎅기열 질환은 바람직하게는 혈청형 1, 2 또는 3의 뎅기열 바이러스, 혈청형 1, 3 또는 4의 뎅기열 바이러스, 혈청형 1, 2 또는 4의 뎅기열 바이러스, 혈청형 2, 3 또는 4의 뎅기열 바이러스에 의해 유발된다. 다른 구현예에서, 뎅기열 질환은 혈청형 1의 뎅기열 바이러스, 혈청형 2의 뎅기열 바이러스, 혈청형 3의 뎅기열 바이러스 또는 혈청형 4의 뎅기열 바이러스에 의해 유발된다.
본 발명에 따른 백신 조성물, 예컨대 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 백신 조성물은, 바람직하게는, 혈청형 1의 뎅기열 항원, 혈청형 2의 뎅기열 항원, 혈청형 3의 뎅기열 항원 및 혈청형 4의 뎅기열 항원을 포함한다. 이런 조성물은 본원에 4가 조성물로서 기술될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물, 예컨대 본 발명에 따른 예방 방법에 사용하기 위한 조성물은, 유익하게는, 혈청형 1, 2, 3 및 4의 뎅기열 항원들의 조합들 중 임의의 하나의 조합을 포함할 수 있다: i) CYD-1의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-LAV의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-3의 prM 및 E 서열을 포함하는 키메라 뎅기열 바이러스 및 CYD-4의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원; ii) CYD-1의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-BID의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-3의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원 및 CYD-4의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원; (iii) CYD-1의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-PR의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-3의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원 및 CYD-4의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원; (iv) CYD-1의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-MD의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-3의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원 및 CYD-4의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 또한 유익하게는 하기 뎅기열 항원 조합들 중 임의의 하나의 조합을 포함할 수 있다: i) CYD-1, CYD-LAV, CYD-3 및 CYD-4; ii) CYD-1, CYD-BID, CYD-3 및 CYD-4; (iii) CYD-1, CYD-PR, CYD-3 및 CYD-4 또는 (iv) CYD-1, CYD-MD, CYD-3 및 CYD-4. 또한, 본 발명의 조성물은 유익하게는 하기 뎅기열 항원 조합을 포함할 수 있다: i) CYD-1의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, VDV2, CYD-3의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원 및 CYD-4의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 유익하게는 CYD-1, VDV-2, CYD-3 및 CYD-4를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 본 발명의 조성물은 유익하게는 CYD-LAV (서열번호 8), CYD-BID (서열번호 9), CYD-PR (서열번호 10) CYD-MD (서열번호 11) 또는 서열번호 2의 prM-E 서열을 포함하는 혈청형 2의 뎅기열 항원을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 본 발명의 조성물은 유익하게는 CYD-LAV (서열번호 8), CYD-BID (서열번호 9), CYD-PR (서열번호 10) CYD-MD (서열번호 11) 또는 서열번호 2의 prM-E 서열과 90% 이상의 동일성을 가진 서열을 포함하는, 혈청형 2의 뎅기열 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 서열은 CYD-LAV (서열번호 8), CYD-BID (서열번호 9), CYD-PR (서열번호 10) CYD-MD (서열번호 11) 또는 서열번호 2의 prM-E 서열과 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일할 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물, 예컨대 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 백신 조성물은, 바람직하게는 혈청형 1의 뎅기열 항원, 혈청형 2의 뎅기열 항원, 혈청형 3의 뎅기열 항원 및 혈청형 4의 뎅기열 항원을 포함한다. 이러한 조성물은 본원에 4가 조성물로서 기술될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물, 예컨대 본 발명에 따른 예방 방법에 사용하기 위한 조성물은 유익하게는 혈청형 1, 2, 3 및 4의 뎅기열 항원들의 하기 조합들 중 임의의 하나의 조합을 포함할 수 있다: i) CYD-1의 M 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-LAV의 M 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-3의 M 및 E 서열을 포함하는 키메라 뎅기열 바이러스 및 CYD-4의 M 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원; ii) CYD-1의 M 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-BID의 M 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-3의 M 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원 및 CYD-4의 M 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원; (iii) CYD-1의 M 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-PR의 M 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-3의 M 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원 및 CYD-4의 M 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원; (iv) CYD-1의 M 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-MD의 M 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-3의 M 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원 및 CYD-4의 M 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 또한 유익하게는 하기 뎅기열 항원 조합들 중 임의의 하나의 조합을 포함할 수 있다: i) CYD-1, CYD-LAV, CYD-3 및 CYD-4; ii) CYD-1, CYD-BID, CYD-3 및 CYD-4; (iii) CYD-1, CYD-PR, CYD-3 및 CYD-4 또는 (iv) CYD-1, CYD-MD, CYD-3 및 CYD-4. 본 발명의 조성물은 유익하게는 하기 뎅기열 항원 조합을 포함할 수 있다: i) CYD-1의 M 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, VDV2, CYD-3의 M 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원 및 CYD-4의 M 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 유익하게는 CYD-1, VDV-2, CYD-3 및 CYD-4를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 조성물은, 유익하게는, CYD-LAV (서열번호 13), CYD-BID (서열번호 14), CYD-PR (서열번호 15) CYD-MD (서열번호 16) 또는 서열번호 18의 E 서열을 포함하는, 혈청형 2의 뎅기열 항원을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 조성물은, 유익하게는, CYD-LAV (서열번호 13), CYD-BID (서열번호 14), CYD-PR (서열번호 15) CYD-MD (서열번호 16) 또는 서열번호 18의 E 서열과 90% 이상의 동일성을 가진 서열을 포함하는 혈청형 2의 뎅기열 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 서열은 CYD-LAV (서열번호 13), CYD-BID (서열번호 14), CYD-PR (서열번호 15) CYD-MD (서열번호 16) 또는 서열번호 18의 E 서열과 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일할 수 있다.
본원에 기술된 본 발명의 조성물 (예, 4가 제형, 예컨대 본 발명의 방법에 사용하기 위한 4가 제형)은, 유익하게는, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22 또는 서열번호 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드를 포함하는, 혈청형 2의 항원을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 혈청형 2의 뎅기열 항원은 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 또는 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드를 더 포함한다. 예를 들어, 상기 혈청형 2의 뎅기열 항원은 바람직하게는 하기를 포함한다: i) 서열번호 13의 폴리펩타이드 및 서열번호 19의 폴리펩타이드; ii) 서열번호 14의 폴리펩타이드 및 서열번호 20의 폴리펩타이드; iii) 서열번호 15의 폴리펩타이드 및 서열번호 21의 폴리펩타이드; iv) 서열번호 16의 폴리펩타이드 및 서열번호 22의 폴리펩타이드; 또는 v) 서열번호 18의 폴리펩타이드 및 서열번호 23의 폴리펩타이드.
본원에 기술된 본 발명의 조성물(예, 4가 제형, 예컨대 본 발명의 방법에 사용하기 위한 4가 제형)은, 유익하게는, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22 또는 서열번호 23과 90% 이상의 동일성을 가진 폴리펩타이드를 포함하는, 혈청형 2의 뎅기열 항원을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 혈청형 2의 뎅기열 항원은 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 또는 서열번호 18과 90% 이상의 동일성을 가진 폴리펩타이드를 더 포함한다. 예를 들어, 상기 혈청형 2의 뎅기열 항원은 바람직하게는 하기를 포함한다: i) 서열번호 13과의 서열 동일성이 90% 이상인 폴리펩타이드 및 서열번호 19와의 서열 동일성이 90% 이상인 폴리펩타이드; ii) 서열번호 14와의 서열 동일성이 90% 이상인 폴리펩타이드 및 서열번호 20과의 서열 동일성이 90% 이상인 폴리펩타이드; iii) 서열번호 15와의 서열 동일성이 90% 이상인 폴리펩타이드 및 서열번호 21과의 서열 동일성이 90% 이상인 폴리펩타이드; iv) 서열번호 16과의 서열 동일성이 90% 이상인 폴리펩타이드 및 서열번호 22와의 서열 동일성이 90% 이상인 폴리펩타이드; 또는 v) 서열번호 18과의 서열 동일성이 90% 이상인 폴리펩타이드 및 서열번호 23과의 서열 동일성이 90% 이상인 폴리펩타이드. 바람직한 구현예에서, 본원에서 90% 이상의 동일성은 소정의 서열에 대해 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성으로 해석될 수 있다.
상기 단락들에 기술된 혈청형 2의 뎅기열 항원은, 유익하게는, 본원 도처에 기술된 혈청형 1, 3 및 4의 뎅기열 항원들 중 임의의 항원을 조합하여, 혈청형 1의 뎅기열 항원, 혈청형 2의 뎅기열 항원, 혈청형 3의 뎅기열 항원 및 혈청형 4의 뎅기열 항원을 포함하는 4가 제형을 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 혈청형 1, 2, 3 및 4의 뎅기열 항원들은 각각 독립적으로 약독화된 생 뎅기열 바이러스 또는 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스로부터 선택될 수 있다. 유익하게는, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 조성물은, 혈청형 1, 2, 3 및 4의 뎅기열 항원이 각각 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스인, 혈청형 1, 2, 3 및 4 각각의 뎅기열 항원을 포함한다. 유익하게는, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 조성물은, 혈청형 1, 3 및 4의 뎅기열 항원이 각각 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스이고 상기 혈청형 2의 뎅기열 항원이 약독화된 생 뎅기열 바이러스 및 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 혈청형 1, 2, 3 및 4 각각의 뎅기열 항원을 포함한다.
유익하게는, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 조성물은, 혈청형 1, 3 및 4의 뎅기열 항원이 각각 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스이고 혈청형 2의 뎅기열 항원이 약독화된 생 뎅기열 바이러스인, 혈청형 1, 2, 3 및 4 각각의 뎅기열 항원을 포함한다. 예를 들어, 상기 혈청형 1, 3 및 4의 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스는 DEN-2 16681/PDK53 균주 (LAV2)를 토대로 하는 뎅기열/뎅기열 키메라 등의 뎅기열/뎅기열 키메라일 수 있다. 예를 들어, 상기 혈청형 1, 3 및 4의 뎅기열/뎅기열 키메라는, DEN-2 16681/PDK53 균주의 prM 및 E 유전자가 혈청형 1 균주, 혈청형 2 균주 및 혈청형 3 균주 각각의 prM 및 E 유전자로 치환되도록, DEN-2 16681/PDK53의 게놈이 변형된, 키메라 바이러스일 수 있다. 이러한 키메라 뎅기열/뎅기열 바이러스는 각각 DEN-2/1, DEN-2/3 및 DEN-2/4로 언급될 수 있다. 이 문맥에서, 살아있는 약독화된 바이러스인 혈청형 2의 뎅기열 항원은 DEN-2 16681/PDK53 균주 (LAV2)일 수 있다.
본 발명자들은, 실시예 1에 기술된 바와 같이 CYD-1, CYD-2, CYD-3 및 CYD-4에 의해 발생되는 중화 항체 반응과 비교해, 혈청형 2의 뎅기열 바이러스에 대해 개선된 중화 항체 반응을 제공하는, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 최적화된 4가 뎅기열 백신 조성물 (즉, 혈청형 1, 2, 3 및 4 각각의 뎅기열 항원을 포함하는 백신 조성물)을 제공하고자 한다.
이에, 일 측면에서, 본 발명은 유익하게는, 혈청형 1, 2, 3 및 4 각각의 뎅기열 항원을 포함하며, 혈청형 1, 3 및 4의 뎅기열 항원은 각각 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스이고, 혈청형 2의 뎅기열 항원은 서열번호 24에 기재된 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가진 핵산 서열을 포함하는 약독화된 생 뎅기열 바이러스인, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 백신 조성물을 제공한다.
이에, 다른 측면에서, 본 발명은, 유익하게는, 혈청형 1의 뎅기열 항원, 혈청형 2의 뎅기열 항원, 혈청형 3의 뎅기열 항원 및 혈청형 4의 뎅기열 항원을 포함하며, 하기로 특정되는, 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 백신 조성물을 제공한다:
i) 상기 혈청형 1의 뎅기열 항원은 YF/뎅기열 키메라 뎅기열 바이러스 (즉, YF 바이러스의 prM 및 E 단백질을 코딩하는 서열이 혈청형 1의 뎅기열 바이러스의 대응 서열로 교체됨으로써 YF 바이러스의 유전자 백본이 변형된, 수용체 황열 바이러스)이며;
ii) 상기 혈청형 2의 뎅기열 항원은, 서열번호 24에 기술된 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가진 핵산 서열을 포함하는, 혈청형 2의 약독화된 생 뎅기열 바이러스이며;
iii) 상기 혈청형 3의 뎅기열 항원은 YF/뎅기열 키메라 뎅기열 바이러스 (즉, YF 바이러스의 prM 및 E 단백질을 코딩하는 서열이 혈청형 3의 뎅기열 바이러스의 대응 서열로 교체됨으로써 YF 바이러스의 유전자 백본이 변형된, 수용체 황열 바이러스)이며; 및
iv) 상기 혈청형 4의 뎅기열 항원은 YF/뎅기열 키메라 뎅기열 바이러스 (즉, YF 바이러스의 prM 및 E 단백질을 코딩하는 서열이 혈청형 4의 뎅기열 바이러스의 대응 서열로 교체됨으로써 YF 바이러스의 유전자 백본이 변형된, 수용체 황열 바이러스).
바람직하게는, 상기 수용체 YF 바이러스 (혈청형 1, 3 및 4의 YF/뎅기열 키메라 바이러스의 유전자 백본임)는 약독화된 YF 바이러스이다. 예를 들어, 상기 수용체 YF 바이러스는 YF 17D, YF 17DD 및 YF 17D204로 이루어진 군으로부터 선택되는 약독화된 YF 바이러스일 수 있다. 바람직하게는, 혈청형 1, 3 및 4의 YF/뎅기열 키메라 바이러스는 각각 Chimerivax 뎅기열 혈청형 1 (즉, CYD-1), Chimerivax 뎅기열 혈청형 3 (즉, CYD-3) 및 Chimerivax 뎅기열 혈청형 4 (즉, CYD-4)이다.
서열번호 24에 기재된 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 핵산에 대한 언급은, 바람직하게는 서열번호 24에 기재된 서열과 92% 이상, 94% 이상, 96% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 가진 핵산 서열로서 해석될 수 있다. 바람직하게는, 상기 (서열번호 24에 기재된 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가지는) 핵산 서열들에서, 서열번호 24의 736, 1619, 4723, 5062, 9191, 10063, 10507, 57, 524, 2055, 2579, 4018, 5547, 6599 및 8571번 위치에 해당되는 위치의 뉴클레오티드들은 돌연변이되지 않는다. 유익하게는, 본 발명의 조성물에 사용하기 위한 (예, 전술한 바와 본원 도처에 기술된 바와 같이 혈청형 1, 3 및 4의 뎅기열 항원 (예, 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스, 예컨대 YF/뎅기열 키메라 뎅기열 바이러스인, 혈청형 1, 3 및 4의 뎅기열 항원들)과 조합하여 사용하기 위한) 약독화된 생 뎅기열 바이러스인, 혈청형 2의 뎅기열 항원은, 서열번호 24에 기재된 서열과 서열 동일성이 100%인 핵산 서열을 포함하는 약독화된 생 뎅기열 바이러스이거나, 또는 서열번호 24에 기재된 서열과 비교해 1개 이상 20개 이하의 뉴클레오티드 치환을 포함하는 약독화된 생 뎅기열 바이러스이다. 바람직하게는, 상기 약독화된 생 뎅기열 바이러스는 서열번호 24에 기재된 서열과 비교해 1개 이상에서 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 이하의 뉴클레오티드 치환을 포함한다. 바람직하게는, 상기 핵산 서열에서, 서열번호 24의 736, 1619, 4723, 5062, 9191, 10063, 10507, 57, 524, 2055, 2579, 4018, 5547, 6599 및 8571 위치에 해당되는 위치의 뉴클레오티드는, 돌연변이되지 않는다. 유익하게는, 본 발명의 조성물에 사용하기 위한 약독화된 생 뎅기열 바이러스인 혈청형 2의 뎅기열 항원은, 서열번호 24에 기재된 서열과 비교해 20개 이하의 염기 돌연변이, 결손 또는 삽입을 가지는 핵산을 포함한다. 특정 경우에, 혈청형 2의 약독화된 생 뎅기열 바이러스는 서열번호 24에 기재된 서열과 비교해 15개 이하, 또는 심지어 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 염기 돌연변이, 결손 또는 삽입을 가지는 핵산을 포함한다. 바람직하게는, 상기 핵산 서열에서, 서열번호 24의 736, 1619, 4723, 5062, 9191, 10063, 10507, 57, 524, 2055, 2579, 4018, 5547, 6599 및 8571번 위치에 해당되는 위치의 뉴클레오티드는 돌연변이되지 않는다.
또한, 본 발명의 백신 조성물에 사용하기 위한 혈청형 2의 뎅기열 항원 (예, 혈청형 2의 약독화된 생 뎅기열 바이러스 또는 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스인, 뎅기열 항원)은, 인간에서 중화 항체를 유도할 수 있으며, 4가 뎅기열 백신 조성물로 사용되었을 때 균형잡힌 면역 반응을 유도할 수 있는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 백신 조성물에 사용하기 위한 혈청형 2의 뎅기열 항원 (예, 혈청형 2의 약독화된 생 뎅기열 바이러스 또는 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스인, 뎅기열 항원)은, 인간에서 낮은 수준의 바이러스 혈증을 발생시키거나 또는 발생시키지 않는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 4가 백신 조성물에 사용하기 위한 혈청형 2의 뎅기열 항원 (예, 혈청형 2의 약독화된 생 뎅기열 바이러스 또는 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스인, 뎅기열 항원)은 실시예 1에 기술된 바와 같이 CYD-1, CYD-2, CYD-3 및 CYD-4에 의해 발생된 중화 항체 반응과 비교해, 혈청형 2의 뎅기열 바이러스에 대해 개선된 중화 항체 반응을 제공하는 것이 바람직하다.
유익하게는, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 백신 조성물은 혈청형 1, 2, 3 및 4 각각의 뎅기열 항원을 포함하며, 여기서 혈청형 1, 3 및 4의 뎅기열 항원은 각각 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스이고, 상기 혈청형 2의 뎅기열 항원은 서열번호 24에 기재된 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가진 핵산 서열을 포함하는 약독화된 생 뎅기열 바이러스이며, 상기 혈청형 1, 2, 3 및 4의 뎅기열 항원은 각각 CYD-1, VDV-2, CYD-3 및 CYD-4가 아니거나, 또는 각각 CYD1의 M 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, VDV2, CYD3의 M 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원 및 CYD4의 M 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원이 아니다.
유익하게는, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 백신 조성물은 혈청형 1, 2, 3 및 4 각각의 뎅기열 항원을 포함하며, 여기서: (i) 상기 혈청형 1의 뎅기열 항원은 CYD-1을 제외한 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스이거나, 또는 상기 혈청형 1의 뎅기열 항원은 CYD-1이며; (ii) 상기 혈청형 2의 뎅기열 항원은 VDV-2 이외의 다른 약독화된 생 뎅기열 바이러스이거나, 또는 상기 혈청형 2의 뎅기열 항원은 VDV-2이거나; (iii) 상기 혈청형 3의 뎅기열 항원은 CYD-3 이외의 다른 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스이거나, 또는 상기 혈청형 3의 뎅기열 항원은 CYD-3이며, 및 (iv) 상기 혈청형 4의 뎅기열 항원은 CYD-4 이외의 다른 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스이거나, 또는 상기 혈청형 4의 뎅기열 항원은 CYD-4이다. 여기서, VDV-2 균주는 DEN-2 16681/PDK53 균주 (LAV2)를 Vero 세포에 적응시켜 수득한 균주로서, 이 VDV-2 균주는 DEN-2 16681/PDK53 균주와 비교해 침묵 돌연변이 4개를 비롯하여 10가지의 추가적인 돌연변이를 가지고 있다.
유익하게는, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 조성물은 혈청형 1, 2, 3 및 4 각각의 뎅기열 항원을 포함하며, 여기서: (i) 상기 혈청형 1의 뎅기열 항원은 CYD-1 이외의 다른 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스이거나, 또는 상기 혈청형 1의 뎅기열 항원은 CYD-1이고; (ii) 상기 혈청형 2의 뎅기열 항원은 VDV-2 이외의 다른 약독화된 생 뎅기열 바이러스이거나, 또는 상기 혈청형 2의 뎅기열 항원은 VDV-2이고; (iii) 상기 혈청형 3의 뎅기열 항원은 CYD-3 이외의 다른 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스이거나, 또는 상기 혈청형 3의 뎅기열 항원은 CYD-3이고; 및 (iv) 상기 혈청형 4의 뎅기열 항원은 CYD-4 이외의 다른 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스이거나, 또는 상기 혈청형 4의 뎅기열 항원은 CYD-4이다. 이 문맥에서, VDV-2 균주는 서열번호 24에 기재된 핵산 서열을 포함하는 균주이다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 바람직한 백신 조성물은 혈청형 1의 뎅기열 항원, 혈청형 2의 뎅기열 항원, 혈청형 3의 뎅기열 항원 및 혈청형 4의 뎅기열 항원을 포함하며,
i) 상기 혈청형 1의 뎅기열 항원은 CYD-1 이외의 다른 YF/뎅기열 키메라 뎅기열 바이러스이거나, 또는 상기 혈청형 1의 뎅기열 항원은 CYD-1이고;
ii) 상기 혈청형 2의 뎅기열 항원은, 서열번호 24에 기재된 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가진 핵산 서열을 포함하는, 혈청형 2의 약독화된 생 뎅기열 바이러스이되, 혈청형 2의 뎅기열 항원은 서열번호 24에 기재된 서열과 100% 서열 동일성을 가진 핵산 서열을 포함하는 혈청형 2의 약독화된 생 뎅기열 바이러스가 아니거나, 또는 상기 혈청형 2의 뎅기열 항원은 서열번호 24에 기재된 서열과 100% 서열 동일성을 가진 핵산 서열을 포함하는 혈청형 2의 약독화된 생 뎅기열 바이러스이며;
iii) 상기 혈청형 3의 뎅기열 항원은 CYD-3 이외의 다른 YF/뎅기열 키메라 뎅기열 바이러스이거나, 또는 상기 혈청형 3의 뎅기열 항원은 CYD-3이고; 및
iv) 상기 혈청형 4의 뎅기열 항원은 CYD-4 이외의 다른 YF/뎅기열 키메라 뎅기열 바이러스이거나, 또는 상기 혈청형 4의 뎅기열 항원은 CYD-4이다.
유익하게는, 본 발명의 백신 조성물에 사용하기 위한 (예, 전술한 바와 본원 도처에 기술된 바와 같이 혈청형 1, 3 및 4의 뎅기열 항원 (예, YF/뎅기열 키메라 뎅기열 바이러스인, 혈청형 1, 3 및 4의 뎅기열 항원들)과 조합하여 사용하기 위한) 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스인, 혈청형 2의 뎅기열 항원은, 서열번호 24에 기재된 서열과 서열 동일성이 90% 이상인 핵산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 핵산 서열은 서열번호 24에 기재된 서열과 서열 동일성이 92% 이상, 94% 이상, 96% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 가진다. 바람직하게는, 상기 핵산 서열에서, 서열번호 24의 524, 736, 1619 및 2055번 위치에 해당되는 위치의 뉴클레오티드는 돌연변이되지 않는다 (즉, 서열번호 24에서 그 위치에 있는 뉴클레오티드가 유지됨).
본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 조성물은, 유익하게는, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 뎅기열 항원을 포함할 수 있으며: (a) 약독화된 생 뎅기열 바이러스; (b) 불활화된 뎅기열 바이러스; (c) 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스 또는 불활화된 키메라 뎅기열 바이러스 및 (d) (a) 내지 (c) 중 2 이상의 조합, 이때, 상기 뎅기열 항원은 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 조성물은, 유익하게는, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 뎅기열 항원을 포함할 수 있으며: (a) 약독화된 생 뎅기열 바이러스; (b) 불활화된 뎅기열 바이러스; (c) 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스 또는 불활화된 키메라 뎅기열 바이러스; 및 (d) (a) 내지 (c) 중 2 이상의 조합, 이때 상기 뎅기열 항원은 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 조성물은, 유익하게는, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 뎅기열 항원을 포함할 수 있으며: (a) 약독화된 생 뎅기열 바이러스; (b) 불활화된 뎅기열 바이러스; (c) 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스 또는 불활화된 키메라 뎅기열 바이러스; 및 (d) (a) 내지 (c) 중 2 이상의 조합, 이때 상기 뎅기열 항원은 본원에 기술된 바와 같이 M 및 E 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 조성물, 예컨대 본 발명에 따른 예방 방법에 사용하기 위한 조성물은, 유익하게는, 혈청형 1, 2, 3 및 4의 뎅기열 항원들의 하기 조합들 중 임의의 하나의 조합을 포함할 수 있다: i) CYD-1, CYD-LAV, CYD-3 및 CYD-4; ii) CYD-1, CYD-BID, CYD-3 및 CYD-4; (iii) CYD-1, CYD-PR, CYD-3 및 CYD-4 또는 (iv) CYD-1, CYD-MD, CYD-3 및 CYD-4. 또한, 본 발명의 조성물은 유익하게는 하기 뎅기열 항원 조합을 포함할 수 있다: i) CYD-1의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, VDV2, CYD-3의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원 및 CYD-4의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 유익하게는 CYD-1, VDV-2, CYD-3 및 CYD-4를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 조성물은, 유익하게는, CYD-LAV (서열번호 8), CYD-BID (서열번호 9), CYD-PR (서열번호 10) CYD-MD (서열번호 11) 또는 서열번호 2의 prM-E 서열을 포함하는, 혈청형 2의 뎅기열 항원을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 조성물은, 유익하게는, CYD-LAV (서열번호 8), CYD-BID (서열번호 9), CYD-PR (서열번호 10) CYD-MD (서열번호 11) 또는 서열번호 2의 prM-E 서열과 90% 이상의 동일성을 가진 서열을 포함하는, 혈청형 2의 뎅기열 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 서열은 CYD-LAV (서열번호 8), CYD-BID (서열번호 9), CYD-PR (서열번호 10) CYD-MD (서열번호 11) 또는 서열번호 2의 prM-E 서열과 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 가진 서열일 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한, 예컨대 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 백신 조성물은, 바람직하게는, 백신용 뎅기열 바이러스인 뎅기열 항원을 포함한다. 상기한 백신용 뎅기열 바이러스는, 예를 들어, 불활화된 바이러스, 약독화된 생 바이러스 및 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스를 포함한다. 바람직하게는, 백신용 뎅기열 바이러스는 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스는 다양한 플라비바이러스로부터 유래된 1종 이상의 단백질과 뎅기열 바이러스로부터 유래된 1종 이상의 단백질을 포함한다. 유익하게는, 상기 다양한 플라비바이러스는 황열 바이러스, 예를 들어 YF 17D 황열 바이러스 균주이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 키메라 뎅기열 바이러스는 뎅기열 바이러스의 prM-E 아미노산 서열을 포함하며, 예를 들어, 본 발명에 따른 키메라 뎅기열 바이러스는 prM-E 서열이 뎅기열 바이러스의 prM-E 서열로 치환된 황열 바이러스 게놈을 포함한다. 유익하게는, 본 발명에 따른, 예컨대 본 발명의 방법에 사용하기 위한 백신 조성물은, CYD-1, CYD-2, CYD-3 및 CYD-4를 포함한다. 본 발명의 조성물은 유익하게는 하기 뎅기열 항원 조합들 중 임의의 하나의 조합을 포함할 수 있다: i) CYD-1의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-LAV의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-3의 prM 및 E 서열을 포함하는 키메라 뎅기열 바이러스 및 CYD-4의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원; ii) CYD-1의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-BID의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-3의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원 및 CYD-4의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원; (iii) CYD-1의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-PR의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-3의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원 및 CYD-4의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원; (iv) CYD-1의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-MD의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, CYD-3의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원 및 CYD-4의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원. 예를 들어, 본 발명의 조성물은, 또한, 유익하게는, 하기 뎅기열 항원 조합들 중 임의의 하나의 조합을 포함할 수 있다: i) CYD-1, CYD-LAV, CYD-3 및 CYD-4; ii) CYD-1, CYD-BID, CYD-3 및 CYD-4; (iii) CYD-1, CYD-PR, CYD-3 및 CYD-4 또는 (iv) CYD-1, CYD-MD, CYD-3 및 CYD-4. 또한, 본 발명의 조성물은 유익하게는 하기 뎅기열 항원 조합을 포함할 수 있다: i) CYD-1의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원, VDV2, CYD-3의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원 및 CYD-4의 prM 및 E 서열을 포함하는 뎅기열 항원. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 유익하게는 CYD-1, VDV-2, CYD-3 및 CYD-4를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 조성물은, 유익하게는, CYD-LAV (서열번호 8), CYD-BID (서열번호 9), CYD-PR (서열번호 10) CYD-MD (서열번호 11) 또는 서열번호 2의 prM-E 서열을 포함하는, 혈청형 2의 뎅기열 항원을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 조성물은, 유익하게는, CYD-LAV (서열번호 8), CYD-BID (서열번호 9), CYD-PR (서열번호 10) CYD-MD (서열번호 11) 또는 서열번호 2의 prM-E 서열과 90% 이상의 동일성을 가진 서열을 포함하는, 혈청형 2의 뎅기열 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 서열은 CYD-LAV (서열번호 8), CYD-BID (서열번호 9), CYD-PR (서열번호 10) CYD-MD (서열번호 11) 또는 서열번호 2의 prM-E 서열과 적어도 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일할 수 있다.
본 발명의 백신용 뎅기열 바이러스의 실제 투여량은 백신을 투여받는 환자의 연령과 체중, 투여 빈도 및 조성물에 함유된 다른 성분 (예, 보강제)에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 백신 조성물에 포함되는 약독화된 생 뎅기열 바이러스의 양은 약 103 - 약 107 CCID50 범위이다. 일반적으로, 혈청형 1-4의 약독화된 생 뎅기열 바이러스 각각의 양은 약 103 - 약 106 CCID50 또는 약 103 - 약 107 CCID50의 범위이며, 예를 들어 약 5 x 103 - 약 5 x 105 CCID50, 예를 들어 약 1 x 104 - 약 1 x 105 CCID50, 예를 들어 약 105 CCID50이다. 본 발명의 백신 조성물에 포함되는 혈청형 1-4의 약독화된 생 뎅기열 바이러스 각각의 양은 또한 약 104 - 약 107 CCID50, 예를 들어 약 106 CCID50 일 수 있다. 본 발명의 4가 조성물에 포함되는 혈청형 1-4의 약독화된 생 뎅기열 바이러스 각각의 양은 동일할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 4가 조성물은 혈청형 1-4의 약독화된 생 뎅기열 바이러스 각각을 약 105 CCID50으로 포함할 수 있다. 다른 예로, 본 발명의 4가 조성물은 혈청형 1-4의 약독화된 생 뎅기열 바이러스 각각을 약 106 CCID50으로 포함할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물에 포함되는 키메라 뎅기열 바이러스 (예, 본원에 기술된 바와 같은, YF/뎅기열 키메라 또는 Chimerivax (CYD) 백신용 바이러스)의 양은 약 105 CCID50 또는 약106 CCID50이다. 본 발명의 백신 조성물에 포함되는, VDV-2 등의 살아있는 약독화된 바이러스의 양은 약 104 CCID50이다. 일반적으로, 본 발명의 조성물에 포함되는 혈청형 1-4의 불활화된 뎅기열 바이러스 각각의 양은 약 104 - 약 108 CCID50 당량, 바람직하게는 약 5 x 104 - 약 5 x 107 CCID50 당량, 바람직하게는 약 1 x 104 - 약 1 x 106 CCID50 당량, 바람직하게는 약 105 CCID50 당량일 수 있다. 일반적으로, 본 조성물에 포함되는 혈청형 1-4 각각의 VLP의 양은 약 100ng - 약 100㎍, 바람직하게는 약 100ng - 약 50㎍, 바람직하게는 약 100ng - 약 20㎍, 바람직하게는 약 1㎍ - 10㎍이다. VLP의 양은 ELISA로 검출할 수 있다. 유익하게는, 본 발명에 따른 백신 조성물은 본원에 정의된 바와 같은 뎅기열 항원을 유효량으로 포함한다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제는, 활성 성분의 안정성, 멸균성 및 전달성을 강화하기 위해 약제 및 백신의 제형화에 통상적으로 사용되며, 이차 반응, 예컨대 알레르기 반응을 인간에서 발생시키지 않는, 임의의 용매 또는 분산 매질 등을 의미한다. 부형제는 선택한 약제 형태, 투여 방법과 경로를 토대로 정해진다. 적절한 부형제와 약제 제형화와 관련된 요건들은 "Remington's Pharmaceutical Sciences" (19th Edition, A.R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995))에 기술되어 있다. 약제학적으로 허용가능한 부형제에 대한 구체적인 예로는 물, 포스페이트-완충화된 염수 (PBS) 용액 및 0.3% 글리신 용액을 포함한다. 본 발명에 따른 백신 조성물은 유익하게는 0.4% 염수 및 2.5% 인간 혈청 알부민 (HSA)를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 백신 조성물은, 선택적으로, pH 조절제, 완충화제, 긴장성 조절제, 습윤제 등의 생리학적 조건을 최적화하는데 필요한 약제학적으로 허용가능한 보조 물질, 예컨대 소듐 아세테이트, 소듐 락테이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올리에이트, 인간 혈청 알부민, 필수 아미노산, 비-필수 아미노산, L-아르기닌 하이드로클로레이트, 사카로스, D-트레할로스 데하이드레이트, 소르비톨, 트리스 (하이드록시메틸) 아미노메탄 및/또는 우레아를 함유할 수 있다. 아울러, 백신 조성물은, 선택적으로, 예를 들어, 희석제, 결합제, 안정화제 및 보존제 등의 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 더 포함할 수 있다. 바람직한 안정화제는 WO 2010/003670에 기재되어 있다.
본 발명의 백신 조성물은 뎅기열 면역 단백질인 뎅기열 항원을 포함할 수 있다. 뎅기열 면역단백질은, 본원에서, 면역적격 개체에게 투여시 혈청형 1, 2, 3 또는 4의 뎅기열 바이러스에 대한 중화 항체를 유도하는, 뎅기열 외막 (E) 단백질, 또는 이의 유도체 또는 단편이다. 뎅기열 면역단백질은 화학 접합체, 면역학적 단편 및 융합 단백질을 비롯한 뎅기열 E 단백질의 천연 형태 및 유도체화된 형태를 포함한다.
뎅기열 면역단백질, 또는 이의 유도체 또는 단편은 담체 분자에 접합될 수 있다. 이러한 접합체는 뎅기열 면역단백질 또는 이의 유도체나 단편 및 담체 분자를 포함하는 융합 단백질을 재조합 발현하거나 또는 화학적인 접합 기법을 통해 수득할 수 있다. 접합체 제조에 사용될 수 있는 담체 분자의 예로는, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 파상풍 톡소이드의 단편 C, 디프테리아 독소의 돌연변이체, 예컨대 CRM 197, CRM 176, CRM228, CRM 45, CRM 9, CRM 45, CRM 102, CRM 103 및 CRM 107, 폐렴 구균의 뉴몰리신, OMPC, 열 충격 단백질, 백일해균 단백질, 폐렴 구균의 표면 단백질 PspA 또는 클로스트리듐 디피실 (Clostridium difficile)의 독소 A 또는 B를 포함한다.
본 발명의 백신 조성물은 뎅기열 항원의 면역원성을 강화하기 위해 하나 이상의 보강제를 포함할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면 본 발명에 적합한 보강제를 선택할 수 있을 것이다. 보강제는 바람직하게는 불활화된 바이러스 또는 VLP 또는 뎅기열 구조 단백질을 포함하는 본 발명의 백신 조성물에 사용된다. 보강제는 보강제가 복제에 영향을 미치지 않는 한 살아있는 약독화된 바이러스를 포함하는 본 발명의 백신 조성물에 사용될 수 있다.
적정 보강제로는 알루미늄 하이드록사이드 겔, 알루미늄 포스페이트 또는 알럼 (alum)과 같은 알루미늄 염을 포함하며, 또한 칼슘, 마그네슘, 철 또는 아연의 염일 수 있다. 다른 적합한 보강제로는 아실화된 티로신 또는 아실화된 당의 불용성 현탁물, 양으로 또는 음으로 유도체화된 사카라이드 또는 폴리포스파젠을 포함한다. 다른 예로, 보강제는 수중유 유제 보강제 (EP 0 399 843B) 뿐 아니라 수중유 유제와 기타 활성 물질의 조합일 수 있다 (WO 95/17210; WO 98/56414; WO 99/12565 및 WO 99/11241). 유중수 유제 (미국 특허 5,422, 109; EP 0 480 982 B2) 및 수중유중수 유제 (미국 특허 5,424,067; EP 0 480 981 B)와 같은 다른 오일 유제 보강제도 개시되어 있다. 이러한 보강제의 예로는 MF59, AF03 (WO 2007/006939), AF04 (WO 2007/080308), AF05, AF06 및 이들의 유도체를 포함한다. 또한, 보강제는 사포닌 지질 Z 또는 이의 유도체, 면역자극성 올리고뉴클레오티드, 알킬 글루코스아미드 포스페이트, 수중유제 유제 또는 이들의 조합일 수 있다. 사포닌의 예로는 Quil A와 이의 정제 단편, 예컨대 QS7 및 QS21을 포함한다.
당업자가 숙지하는 바와 같이, 본 발명의 백신 조성물은 의도한 투여 경로에 적합하게 적절히 제형화된다. 적합한 투여 경로의 예로는, 예컨대, 근육내, 경피, 피하, 비강내, 경구 또는 진피내를 포함한다. 유익하게는, 투여 경로는 피하이다.
본 발명의 백신 조성물은 Becton Dickinson Corporation (Franklin Lakes, NJ, USA) 사로부터 상업적으로 구입가능한 제품과 같은 일반적인 피하주사용 시린지 또는 세이피티 시린지, 또는 제트 인젝터를 이용하여 투여할 수 있다. 진피내 투여를 위해서는, 일반적인 피하 주사용 시린지가 Mantoux 기법을 이용하여 채택되거나, 또는 BD Soluvia(TM) 미세주입 시스템 (Becton Dickinson Corporation, Franklin Lakes, NJ, USA)과 같은 특수 진피내 전달 디바이스가 사용될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물의 투여 부피는 투여 방법에 따라 달라질 것이다. 피하 주사의 경우, 부피는 일반적으로 0.1 - 1.0 ml이며, 바람직하게는 대략 0.5 ml이다.
선택적으로, 본 발명에 따른 백신 조성물의 부스터 투여가, 예를 들어 1차 면역화 후 (즉, 처음 면역화 용법에서 계획된 마지막 투약을 투여한 후), 6개월에서 10년 사이에, 예컨대 6개월, 1년, 3년, 5년 또는 10년 시점에 적용될 수 있다.
일 구현예로, 본 발명은 또한 본 발명의 백신 조성물과 인간 개체에서 뎅기열 질환을 예방하는 방법에 있어 상기 백신 조성물의 사용에 대한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 본 키트는 본원에 기술된 임의의 백신 조성물을 적어도 1회분으로 (전형적으로 시린지 안에) 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 키트는 본원에 기술된 임의의 백신 조성물을 다중-투약 제형으로 (전형적으로 바이얼 안에) 포함할 수 있다. 키트는 아울러 상기 백신의 뎅기열 질환 방지 용도 또는 뎅기열 질환 예방 용도가 언급된 인쇄물을 포함한다. 인쇄물은 백신 용법과 백신 투여할 인간 개체 집단을 추가로 언급할 수 있다.
뎅기열 질환 가능성 또는 중증도를 낮추는데 있어 본 발명의 백신 조성물의 효능은 다양한 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 바이러스-확증된 증상성 뎅기열 질환의 가능성 또는 중증도를 낮추는데 있어 본 발명의 백신 조성물의 효능은, 상기 백신 조성물을 1회 이상 투여한 후 (예, 상기 백신 조성물을 1회, 2회 또는 3회 투여한 후), 상기 백신 조성물을 제공받은 개체 그룹에서 하기를 측정하고:
(i) 임의 혈청형의 뎅기열 바이러스에 의해 유발되는 바이러스-확증된 증상성 뎅기열 질환의 발병율;
(ii) 임의 혈청형의 뎅기열 바이러스에 의해 유발되는 바이러스-확증된 중증의 뎅기열 질환의 발병율;
(iii) 임의 혈청형의 뎅기열 바이러스에 의해 유발되는 I - IV 등급의 출혈성 뎅기열의 발병율;
(iv) 임의 혈청형의 뎅기열 바이러스에 의해 유발되는 I 등급의 DHF 발병율;
(v) 임의 혈청형의 뎅기열 바이러스에 의해 유발되는 II 등급의 DHF 발병율;
(vi) 임의 혈청형의 뎅기열 바이러스에 의해 유발되는 III 등급의 DHF 발병율;
(vii) 임의 혈청형의 뎅기열 바이러스에 의해 유발되는 IV 등급의 DHF 발병율;
(viii) 임의 혈청형의 뎅기열 바이러스에 의해 유발되는 바이러스-확증된 뎅기열로 인한 매년 입원율; 및/또는
(ix) 임의 혈청형의 뎅기열 바이러스에 의해 유발되는 바이러스-확증된 증상성 뎅기열로 인한 입원 기간.
상기 측정 결과를 상기 백신 조성물을 제공받지 않은 대조군 개체에서의 동일한 측정 결과와 비교함으로써, 계산할 수 있으며, 상기 양 그룹의 개체들은 뎅기열 유행 지역에 거주하는 개체이다. 비-백신 접종 대조군 개체와 비교해, 백신 접종군의 개체에서 상기 (i) - (ix) 중 어느 한가지 이상의 통계학적으로 유의한 감소는, 본 발명에 따른 백신 조성물의 효능을 나타내는 것이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 백신 조성물의 효능은 상기에 따른 측정 결과들 중 하나 이상의 통계학적으로 유의한 감소에 의해 입증되며, 이때 DHF 또는 뎅기열 사례는 혈청형 1, 3 또는 4의 뎅기열 바이러스에 의해 유발된 것이다.
뎅기열 질환의 발병 가능성 또는 중증도를 낮추는데 있어 본 발명에 따른 백신 조성물의 효능은, 또한, 상기 백신 조성물을 제공받았으며 바이러스-확증된 뎅기열 질환이 발병한 그룹의 개체에서, 상기 백신 조성물을 1회 이상 투여한 후 (예, 상기 백신 조성물을 1회, 2회 또는 3회 투여한 후) 하기 사항을 측정하고:
(i) 평균 발열 기간 및/또는 강도;
(iii) 헤마토크릿 변화로 규정되는 평균 혈장 누출치;
(iii) 평균 혈소판 감소치 (혈소판 카운트); 및/또는
(iv) 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST)를 비롯한 간 효소의 평균 수치;
상기 측정 결과를, 상기 백신 조성물을 제공받지 않았으며 바이러스-확증된 뎅기열 질환이 발병한 대조군 개체에서의 해당 측정 결과와 비교함으로써, 계산할 수 있다. 바이러스-확증된 뎅기열 질환이 발병한 대조군 개체와 비교해, 바이러스-확증된 뎅기열 질환이 발병된 백신 접종군의 개체에서 상기 (i) - (v) 중 어느 한가지 이상의 통계학적으로 유의한 감소는, 뎅기열 질환의 발병 가능성 또는 중증도를 낮추는데 있어서의 본 발명에 따른 백신 조성물의 효능을 의미하는 것이다.
전형적으로, 실시예 1에 기술된 방법에 의해 측정되는 바와 같이 ((VE=100*(1-IDCYD/IDControl), ID는 각 그룹에서의 발병률 (즉, 위험 인년 수로 나눈 바이러스-확증된 뎅기열에 걸린 인간 개체의 수), 뎅기열 질환에 대한 본 발명의 예방 방법의 효과는, 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상이며, 이때 상기 뎅기열 질환은 혈청형 1, 3 또는 4에 의해 유발된 것이다. 본 예방 방법의 효과는 유익하게는 혈청형 3 또는 4에 의해 유발되는 뎅기열 질환에 대해 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상이다. 혈청형 4에 의해 유발되는 뎅기열 질환에 대해서는, 본 예방 방법의 효과는 유익하게는 90% 이상이다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 뉴클레오티드 서열 간의 동일성 %는, 예를 들어, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol., 215: 403-410에 언급된 Basic Local Alignment Tool (BLAST), Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol., 48: 444-453의 알고리즘; Meyers et al. (1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17의 알고리즘; 또는 Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett., 174: 247-250, 등과 같은 표준 정렬 알고리즘을 통해, 구한다. 이들 알고리즘은 BLASTN, BLASTP 및 "BLAST 2 Sequences" 프로그램 (www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST)에 통합되어 있다. 이들 프로그램의 이용시 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열의 경우, "BLAST 2 Sequences"에서 다음과 같은 설정을 사용할 수 있다: 프로그램 BLASTN, 매치 보상 (reward for match) 2, 미스-매치 패널치 (penalty for mismatch)-2, 오픈 갭 및 연장 갭 패널티는 각각 5 및 2, 갭 x~드롭오프 50, expect 10, 글자 크기 11, 필터 온. 아미노산 서열의 경우, "BLAST 2 Sequences"에서 다음과 같은 설정을 사용할 수 있다: 프로그램 BLASTP, matrix BLOSUM62, 오픈 갭 및 연장 갭 패널티는 각각 11 및 1, 갭 x~드롭오프 50, expect 10, 글자 크기 3, 필터 온.
본원에 개시된 본 발명에 대한 다양한 특징들과 바람직한 구현예들은 서로 조합될 수 있는 것으로 이해된다.
본원 전체에서 여러가지 문헌들이 인용되어 있다. 이들 문헌의 내용들은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
본 발명은 아래 실시예들을 들어 더욱 설명될 것이다. 하지만, 본 발명은 청구항에 의해 정의되며, 이들 실시예들은 본 발명의 예시로서만 제공되는 것일 뿐 본 발명을 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되진 않아야 한다.
실시예
실시예 1 : 태국에서의 Chimerivax ™ DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4를 포함하는 4가 뎅기열 백신 (TDV) 조성물을 환자에게 백신 주사 후 1년간 추적 검사
방법
실험 설계 및 참가자
바이러스-확증된 뎅기열 질환에 대한 4가 Chimerivax™ 백신 효능에 대한 관찰자-맹검의, 무작위, 대조군, 단일 센터, IIb 상 실험을 수행한다 (즉, DEN1 PU0359 (TYP 1 140)의 prM 및 E 서열로부터 구축된 특정 CYD-1 균주, DEN2 PUO218의 prM 및 E 서열로부터 구축된 특정 CYD-2 균주, DEN3 PaH881/88의 prM 및 E 서열로부터 구축된 특정 CYD-3 균주 및 DEN4 1228 (TVP 980)의 prM 및 E 서열로부터 구축된 특정 CYD-4 균주를 포함하는, 4가 백신, WO 03/101397 및 Guy et al., 백신 (2011), 29(42): 7229-41을 참조함). 의학적인 병력과 신체 검사에서 건강이 양호한 4-11세의 학생 4002명이 이 실험에 참여한다. 본 실험은 태국 무앙 디스트릭트 랏차부리주 랏차부리 지역 병원 (RRH)에서 수행된다. 등록시 급성 열병을 앓고 있는 어린이, 선천성 또는 후천성 면역결핍성 어린이, 그리고 면역억제요법 또는 그외 금지 치료제나 백신을 제공받는 어린이는 제외된다. 참가자들은 2:1로 무작위로 나누어, 뎅기열 백신 3회 투여군 또는 대조군 제품을 0, 6개월 및 12개월에 제공한다.
제품
WO 03/101397, Guy et al, Hum. VACCINEs (2010) 6 (9): 696; Guy et al, VACCINE (2010) 28: 632; Guirakhoo et al, J. Virol. (2000) 74 : 5477 ; Guirakhoo et al, J. Virol. (2001) 75 (16)　: 7290　; Guirakhoo et al, Virol. (June 20, 2002) 298: 146; 및 Guirakhoo et al, J. Virol. (2004) 78 (9): 4761에 기술된 바와 같이 각 키메라 바이러스를 준비하여 Vero 세포에서 배양한다.
백신은 동결건조 분말 (2-8℃의 온도에서 저장됨)로 제공되며, 이를 주사 용매 (2.5% 인간 혈청 알부민이 함유된 0.4% NaCl) 0.5 ml로 재구성한다. 재구성시, 각 백신 용량 0.5 mL에는 각 키메라 뎅기열 혈청형 (1, 2, 3 및 4) 5 ± 1 log10 CCID50와 부형제 (필수 아미노산, 비-필수 아미노산, L-아르기닌 클로르하이드레이트, 사카로스, D-트레할로스 데하이드레이트, 소르비톨, 트리스(하이드록시메틸)아미노에탄 및 우레아)가 함유된다. 대조군 제품은 대조군으로 무작위 할당된 처음 50명에서 1차 주사하는 광견병 불활화 백신 (Verorab®, Sanofi Pasteur, Lyon France)과, 그외 접종들에 사용되는 0.9 % NaCl 식염수 위약이다. 제품들 모두 상완 삼각근 부위에 피하로 주사한다.
평가
어린이들 모두 적극적으로 추적하여, 장기 부재시 학기 중에는 학적부의 매일 기록 사항을 토대로, 그리고 방학시에는 매주 2회 가정 방문, 전화 통화 또는 핸드폰 문자 메세지로 급성 열 질환을 파악한다. 임의의 열 질환 (4시간 이상의 간격으로 체온이 ≥37.5℃로 2번 관찰되는 질환으로서 정의됨)에서, 부모에게 진단 및 치료를 위해 어린이를 RRH에 데리고 가도록 요청한다. 또한, 감시 시스템으로 RRH에서의 자발적인 상담도 입수한다. 14일 이상의 무-증상 간격으로 발생되는 연속적인 발열 현상은 분리된 에피소드 (separate episode)로 간주한다. 발현 시 (즉, 급성 샘플, 발열 후 7일 이내에 채집함) 및 7-14일 후 (예후 샘플), 쌍으로 혈청 샘플을 수집하고, 사노피 파스테르의 글로벌 클리니컬 면역학 (GCI) 연구소 (Swiftwater, PA, USA)와 백신 개발 센터 (CVD, Mahidol University, Thailand)에 보낸다. 급성 샘플에서는 임의의 플라비바이러스의 존재를 검출하는 처음 RT-PCR (고도로 보존된 플라비바이러스 서열들로 구성된 프라이머를 사용함)을 이용하여 플라비바이러스의 존재를 스크리닝한다. 양성 샘플은 혈청형-특이 정량적인 RT-PCR을 본원에 기술된 바와 같이 사용하여 야생형 뎅기열 바이러스를 테스트한다. 이와 병행하여, 모든 급성 샘플들에서는 시판 ELISA 키트 (Platelia™, Bio-Rad Laboratories, Marnes-La-Coquette, France)를 사용하여 뎅기열 NS1 항원의 존재를 테스트한다. 혈청형-특이 RT-PCR 또는 NS1 항원 ELISA에서 양성 결과가 나타나면, 뎅기열 질환의 바이러스-확증된 에피소드는 양성으로 규정된다.
각 참가자들에게 3차 백신 접종 후 13개월 이상 추적할 때까지, 그리고 IDMC (Independent Data Monitoring Committee)에서 PP (per-protocol) 집단에서 사례가 27건 이상이라는 것을 검증할 때까지, 적극적인 감시를 유지한다.
마지막 백신 접종 후 6개월까지 모든 심각한 이상 반응 (SAE)들은 기록하고, 이후 임의의 치명적인 SAE 또는 백신-관련 SAE를 기록한다.
뎅기열 면역 반응을 일차 300명의 참여 어린이들에서 RRH에서 등록시와 각 주사 후 28일 시점에 수집한 혈청으로부터 분석한다. 또한, 3차 주사 후 28일 시점에 모든 참가자들로부터 혈청을 예비로 수집하여, 이 시점에 발병되는 바이러스-확증된 뎅기열을 앓고 있는 어린이에서 면역 반응을 평가한다. 본원에 기술된 바와 같이 플라그-감소 중화 테스트 (PRNT50)를 이용하여, CYD 모 뎅기열 바이러스에 대한 혈청형-특이 중화 항체 역가를 측정하기 위해, 혈청을 GCI에 보낸다. 분석의 정량 한계는 10 (1/dil)이다. 이 수치 미만의 샘플은 역가 5로 지정되며, 혈청 음성으로 간주된다.
통계학적 분석
일차 목적은 참여하여 계획에 따라 백신 접종받은 어린이들에서 3차 백신 접종 후 28일 이후에 발생하는 바이러스-확증된 증상성 뎅기열 사례에 대한 백신 효능 (VE)을 등식: VE =100*(1-IDCYD/IDControl) (ID는 발병률 (즉, 각 그룹에서 바이러스-확증된 뎅기열에 걸린 어린이의 수를 위험 인년수로 나눈 것임)에 따라 구하는 것이다. 질환 발병률 1.3%, 진성 VE 70%, 3차 백신 주사 후 최소 추적 기간 1년, pp (per protocol) 개체 감소율 7.5%/year로 가정하면, 뎅기열 백신 또는 대조군으로 2:1 비율로 할당한 개체 4002명은, 효과 (power) 82% 이상 신뢰 구간 95%, 즉 VE가 nul이 아님이라는 것이 입증되어야 한다. 분석은 Exact method (Breslow NE, Day NE. Statistical Methods in Cancer Research, Volume II - The Design and Analysis of Cohort Studies. International Agency for Research on Cancer (IARC scientific publication No. 82), Lyon, France)으로 계산된 VE의 양측 95% 신뢰 구간 (CI)을 토대로 한다. 1차 분석은 PP 개체군, 즉 0, 6개월 (±15일) 및 12 (±30일)에 지정된 백신을 3회 모두 정확하게 투여하는, 참여 기준을 만족시키는 개체군에서 수행하며, 그룹 할당은 공개하였다. 본 분석은 3회의 주사를 제공받은 개체군에서 전체 효능 분석 세트에서 반복한다. 2번째 목적은, 뎅기열에 대한 VE를 3회 백신 투여하는 용법을 완료하기 전에 확인하는 것이다. 비-맹검 후 규명된 분석에서, 각 혈청형에 대한 VE를 각각 조사한다. 안전성 및 면역원성 엔드포이트 분석은 95% CI을 이용하여 기술한다.
결과
참여한 어린이 4002명들에서, 95.9%가 백신 접종을 완료하였고, 91.8%가 PP (per protocol) 효능 분석 세트에 포함되었다. 백신군과 대조군은 연령과 성별이 유사하였다. 베이스라인에서 샘플링한 샘플의 90% 이상이 뎅기열 또는 JEV 항체에 양성이었다.
효능
실험하는 동안, 뎅기열 131명 (어린이 131명이 136건의 에피소드를 가짐)에서 바이러스가 검축되었다. 이들 중, PP 개체군에서 3차 주사 후 28일 이후에 77건이 발생하였으며, 이들은 일차 분석에 포함시켰다: 백신군에서의 위험 인년은 45/2522이고, 대조군의 경우 위험 인년은 32/1251이었다. 대응되는 백신의 효능은 30.2% (95%CI: -13.4 - 56.6)이었다. 이 결과는 전체 분석 세트에서 검증되었다 (아래 표 1 참조). 1회 이상의 주사한 이후의 효능은 33.4% (95%CI: 4.1-53.5)이고, 2회 이상 주사한 이후의 효능은 35.3% (95%CI: 3.3-56.5)이다.
표 1: 바이러스-확증된 뎅기열 질환에 대한 CYD 4가 뎅기열 백신의 혈청-특이적인 전체 효능
뎅기열 백신 대조군 효능
위험 인년 사례 또는 에피소드* 위험 인년 사례 또는 에피소드* % (95% CI)
3회 주사 후 >28일
(퍼-프로토콜 분석)
사례 2522 45 1251 32 30.2 (-13.4-56.6)
혈청형 1 에피소드 2536 9 1251 10 55.6 (-21.6-84.0)
혈청형 2 에피소드 2510 31 1250 17 9.2 (-75.3-51.3)
혈청형 3 에피소드 2541 1 1257 2 75.3 (-375.0-99.6)
혈청형 4 에피소드 2542 0 1263 4 100 (24.8-100)
오직 NS1 항원 양성 에피소드 2542 4 1265 0 ND ND
3회 주사 후 >28일
(전체 분석 세트)
사례 2620 46 1307 34 32.5 (-8.5-57.6)
혈청형 1 에피소드 2633 9 1308 10 55.3 (-22.5-83.9)
혈청형 2 에피소드 2608 32 1307 19 15.6 (-57.6-53.6)
혈청형 3 에피소드 2638 1 1312 2 75.1 (-378-99.6)
혈청형 4 에피소드 2641 0 1320 4 100 　(-24.3-100)
오직 NS1 항원 양성 에피소드 2640 4 1322 0 ND ND
적어도 1회 주사 후 >28일
(전체 분석 세트)
사례 5089 75 2532 56 33.4 (4.1-53.5)
혈청형 1 에피소드 5139 14 2564 18 61.2 (17.4-82.1)
혈청형 2 에피소드 5107 51 2560 26 1.7 (-64.3-39.8)
혈청형 3 에피소드 5144 4 2565 10 80.1 (30.9-95.4)
혈청형 4 에피소드 5149 1 2577 5 90.0 (10.5-99.8)
오직 NS1 항원 양성 에피소드 5147 5 2579 1 -150.5 (-11750-72.0)
데이타는 표시된 경우를 제외하고는 숫자이다. ND: 측정 안 됨. * '사례'는 혈청형-특이 PCR 또는 NS1 항원 ELISA로 바이러스-확증된 뎅기열의 첫번째 에피소드로서 정의된다. 혈청-특이적인 효능은 그 혈청형 에피소드 전체를 포괄하여 계산하는데; 실험하는 동안에 바이러스 검증된 뎅기열 에피소드가 2번 있었던 어린이 5명은 따라서 혈청-특이 분석에서 2번 포함됨.
나중 분석 (Post-hoc analyse)에서 혈청형에 따른 효능 차이가 확인되었다 (표 1). 1회 이상 주사 후 DENV1, DENV3 및 DENV4에 대한 효능은 61.2%-90.0% 범위인데 반해, DEN2는 1.7%이었다. 3번의 주사 후, DENV1, DENV3 및 DENV4에 대한 효능은 55.3%-100% 범위이고, DENV2는 15.6%이었다.바이러스-확증된 후천성 뎅기열 개체들의 경우, 백신군에서는 대조군에 비해 연간 입원율이 통계학적으로 유의하게 감소되는 것으로 관찰되었다. 3번의 투여 후 상대적인 위험성 (RR)은 0.523이었다 (표 2).
표 2: 실험하는 동안 바이러스-확증된 뎅기열로 인한 입원 건수
기간 CYD 뎅기열 백신군
(N=2666)		 대조군
(N=1331)		 상대적인 위험성
M 사례 연간 발생율 (95%CI) 발생 건수, n M 사례 연간 발생율 (95%CI) 발생 건수, n RR (95%CI)
1년 2666 8 0.3
(0.1; 0.6)		 8 1331 7 0.5
(0.2; 1.1)		 7 0.571 (0.181, 1.85)
2년 2557 24 0.9
(0.5; 1.3)		 24 1282 23 1.7
(1.0; 2.5)		 23 0.523 (0.283, 0.970)
1년 = D0 - 3차 주사　; 2년 = 3차 주사 - 활동기 (Active Phase) 종료
표 3: 혈청형에 따른 입원율
　 백신군 (%) 대조군(%)
혈청형 1 8/14 (57.1) 9/18 (50%)
혈청형 2 20/52 (38.5) 15/27 (55.6)
혈청형 3 1/4 (25) 3/11 (27.3)
혈청형 4 0/1 2/5 (40)
혈청형 x
NS1 양성		 3/5 (60) 1/1 (100)
총 32/76 (42.1) 30/62 (48.4)
면역원성
per-protocol 분석 세트에서 3차 주사 후 28일 시점에, 뎅기열 혈청형 1-4에 대한 중화 항체의 기하 평균 역가 (GMT)는, 각각 백신군의 경우 146 (95%CI: 98.5-217), 310 (224-431), 405 (307-534) 및 155 (123-196)이다. 대조군의 경우, 그 값은 각각 23.9 (14.0-40.9), 52.2 (26.8-102), 48.9 (25.5-93.9) 및 19.4 (11.6-32.2)이다. 과거 1년 GMT는 혈청형 1, 2, 3 및 4에 따라 각각 76.5; 122; 94 및 153이다.
안전성
실험의 본 단계 수행시 SAE는 584건이었으며, 366건은 백신군 참가자들 중 11.8% (315/2666)에서 기록되었고, 218건은 대조군 참가자들 중 13.2% (176/1331)에서 기록되었다. 뎅기열 그룹에서 백신-관련 SAE는 없었으며, 대조군은 1건 있었다. 관찰된 SAE는 연령군과 일치하는 의학적 상태였으며, 백신 주사 후 7일 또는 28일 이내에 몰려있지 않았다.
백신에서의 비약적인 진보로서 발생하는 바이러스-확증된 뎅기열 사례들은 대조군에서 발생하는 사례 보다 심각한 것은 아니었다.
실험시 유행한 야생형 혈청형 2 균주의 prM-E 영역의 서열
실험시 DEN-2 사례를 유발한 혈청형 2의 야생형 균주의 prM-E 영역에 대한 뉴클레오티드 서열과 아미노산 서열을 확인하였다. 이는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2로 나타낸다. 실험시 DEN-2 사례를 유발한 혈청형 2 균주의 M 및 E 아미노산 서열들은 각각 서열번호 18 및 23으로 표시한다.
>뉴클레오티드 서열 (서열번호 1)
Figure pat00001
>아미노산 서열 (서열번호 2)
Figure pat00002
Figure pat00003
>아미노산 서열 (서열번호 18)
Figure pat00004
>아미노산 서열 (서열번호 23)
Figure pat00005
고찰
본 실험에서 주된 발견 사실은, 키메라 CYD 바이러스를 기본으로 하는 뎅기열에 대한 안전하고 효과적인 백신이 가능하다는 것이다. DENV1, 3 및 4에 대한 추정 효능은 70% 추측과 일치되는 범위이며, 1회 이상의 백신 투여 후 통계학적으로 유의하였다. 70% 추측에 부합되는 범위에 해당되는 효능은 DENV2에 대해서는 관찰되지 않았다. DENV2는 본 실험시 유행 혈청형이었으므로, 이러한 상황에서 전체 백신 효능이 떨어졌다.
백신의 안전성 및 반응원성 (reactogenicity) 프로파일은 양호하며, 백신으로 인한 SAE와 안전성 신호는 2600명 이상의 백신 투여개체를 적극적으로 2년간 추적 조사하는 동안 수집한 AE와 SAE에 대한 검토에서 확인되지 않았다. 4종의 뎅기열 혈청형에 대해 불완전한 면역 반응으로 인해 뎅기열 질환의 발병률 또는 중증도를 높일 가능성에 대한 이론적인 안전성 문제가 지금까지 백신 개발에 장애가 되어 왔다. 본 실험에서는, 유행성 DENV2 바이러스에 대한 불완전한 면역 반응의 존재로 인한 질환 강화가 없다는 것이 중요하며, 안심되는 결과이다. 예를 들어, 백신군의 사례들은, 열 지속 기간 또는 출혈, 혈장 누출 또는 혈소판 감소와 같은 고전적인 뎅기열 임상 신호 측면에서 대조군의 사례들과 다르지 않았다. 아울러, 중증 뎅기열은 실험 시 모든 시점에서 백신에서의 빈도가 대조군 보다 높지 않았다.
또한, 바이러스-확증된 후천성 뎅기열인 개체에서, 통계적으로 유의한 연간 입원율 감소가 대조군에 비해 백신군에서 관찰되는 것으로 입증되었다. 이러한 감소는 혈청형 2의 바이러스-확증된 후천성 뎅기열인 개체들에서 관찰되었다 (표 3).
DENV2에서 관찰되는 결과는, 여러가지 기여 인자들로 해석될 수 있다. 예를 들어, 실험에서 질환을 유발하는 CYD2 백신 바이러스와 DENV2 바이러스 간에 항원 미스매치가 존재할 가능성이 있다. 1990년대에, 기존에 유행한 Asian/American 계통의 바이러스 대신, DENV2의 Asian 1 유전자형이 동남아에서 출현하였다. E 단백질의 도메인 2에서 확인된 몇가지 돌연변이 (E83, 특히 E226 및 E228)는 바이러스 적격성 (viral fitness)과 항원성을 바꾸는 것으로 보인다. CYD2 백신의 공여 야생형 바이러스 (및 PRNT50에서 사용된 챌린지 균주)는 1980년에 방콕에서 임상적으로 분리되었다 (Guirakhoo F et al., J Virol 2000, 74: 5477-85). 이 바이러스는 또한 Asian I 유전자형에 속하는 것으로 분류되며, 이 바이러스 (즉 CYD2)에서 전술한 주요 아미노산 잔기들은 Asian/American 유전자형의 아미노산 잔기들과 일치한다 (Hang et al PLoS Negl Trop Dis. 2010 Jul 20;4(7):e757).
부가적으로, 미스매치형 면역 반응에 또한 기여할 수 있는 CYD2 백신의 prM-E 서열에 매우 드물게 2개의 돌연변이가 존재한다. 이 돌연변이는 prM24 및 E251에 위치한다 (Guirakhoo et al, J. Virol. (2004) 78 (9): 4761).
DENV2에서 관찰되는 결과는 PRNT50 분석에서의 면역원성 부재로 나타나지 않는다. DENV2에 대한 백신 접종 후 중화 항체 반응은 DENV1과 DENV3에 대한 면역 반응 보다 높다.
결론적으로, 본 실험은, 안전하고 효과적인 뎅기열 백신이 가능하며 뎅기열 백신 개발에 매우 획기적이라는 것을 최초로 입증해준다.
실시예 2 : 혈청형 2의 최적화된 뎅기열 백신 균주의 동정
본 실시예의 목적은, 본 발명에 따른 방법에 사용하였을 때 Chimerivax™ CYD-2에 비해 향상된 효능을 제공하는, 혈청형 2의 뎅기열 바이러스에 대한 최적화된 뎅기열 백신 조성물을 제조하기 위한 토대가 되는, 혈청형 2의 뎅기열 바이러스 균주를 동정하는 것이다.
유니버셜 뎅기열 2 항원을 결정하기 위한 최적화된 균주를 선정하는 기준은 다음과 같다: (i) 최근 유행 균주; (ii) 아시아 균주 및 아메리카 균주 간의 균형적인 선택; (iii) 최적화된 균주는 혈청형 2의 뎅기열 바이러스의 이용가능한 prM-E 서열들을 정렬함으로써 입수한 계산된 글로벌 컨센서스 서열과 가능한 유사한 prM-E 서열을 가져야 함; (iv) 항체 인지에 영향을 줄 것으로 추측되는 아미노산 변형은 피해야 함; (v) prM 및 E 서열, 특히 E 단백질 엑토도메인에서 특정 위치에서 드문 아미노산은 피해야 함 (특정 위치에 드문 아미노산은 정렬시킨 서열들에서 그 위치에서 15% 미만으로 존재하는 아미노산으로 정의됨); (vi) 기존에 실험실에서 일부 다루어진 적이 있는 것이 최적화된 균주로서 바람직함; 및 (vii) 4가 조성물로 균형적인 면역 반응을 유도하는 뎅기열 항원.
지역적인 뎅기열 2 항원에 대해 최적화된 균주 (즉, 특정 지역에서 유행하는 야생형 뎅기열 바이러스에 대해 특히 효과적임)를 선정하는 기준은 기준 (i)와 (vii)이다.
방법
데이타베이스
NCBI (National Center for Biotechnology Information) 뎅기열 바이러스 배리에이션 데이타베이스 (www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/VirusVariation/Database/nph-select.cgi?tax_id=12637)에서 서열을 검색한다.
서열 분석
MUSCLE 알고리즘을 이용하여 서열을 정렬한다 (Edgar, R. C. (2004) MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res, 32(5):1792-1797).
서열 정렬 결과는 Vector NTi version 9, module AlignX (Invitrogen)로 산출한다. 서열 유사성 검색은 BLAST 알고리즘 (Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., and Lipman, D. J. (1990) Basic local alignment search tool. J Mol Biol, 215(3):403-410)을 이용하여 수행한다.
prM-E 서열에 대한 서열 넘버링
prM-E 서열에 포함된 서브-서열들은 다양한 방식으로 넘버링할 수 있다: (i) 전체 prM-E 단백질 서열을 1번 위치에서 661번 위치로 넘버링하여, preM 단백질 서열은 1번 위치에서 90/91번 위치로 지정되고, M 단백질 서열은 91/92번 위치에서 166번 위치로 지정되고, E 단백질 서열은 167번 위치에서 661번 위치로 지정됨; (ii) prM 및 M 단백질 서열은 함께 넘버링되어, 즉, 전체 서열은 1번 위치에서 166번 위치이고, E는 1번 위치에서 495번 위치로 구별하여 넘버링됨; (iii) prM, M 및 E 서열들이 각각 넘버링되며, 즉, prM은 1번 위치에서 90/91번 위치, M은 1번 위치에서 75/76번 위치, E는 1번 위치에서 495번 위치로 지정됨.
결과
공공 서열 검색
NCBI 뎅기열 데이타베이스로부터 이용가능한 모든 뎅기열 바이러스 혈청형 2의 전장 prM 및 E 단백질 서열들은 다운로드한다. 서열 다운로드는 2010년 10월 4일과 2011년에 2번 행하였다. 1차에 서열 669개를 다운받았으며, 2차시에는 약 3200개의 서열을 다운받았다.
글로벌 컨센서스 서열 구축
각 다운로드시, 검색된 단백질 서열 모두 정렬시켜, 혈청형 2의 뎅기열 바이러스의 prM 및 E 단백질들에 대한 글로벌 컨센서스 서열을 구축하였다. 정의에 따르면, 글로벌 컨센서스 서열은 각 위치에서 가장 높은 빈도로 존재하는 아미노산을 포함하는 인공 서열이다. 2010년 정렬과 2011년 정렬에서 글로벌 컨센서스 서열들은 상호 아미노산 2개의 차이만 있었다. 2010 정렬에서, 글로벌 컨센서스 서열은 (E 서열을 1-495로 넘버링한 경우) 129번과 308번 위치에 각각 이소루신과 발린을 포함하지만, 2011년 정렬에서는, (E 서열을 1-495로 넘버링한 경우) E 단백질의 129번 및 308번 위치에 발린과 이소루신을 각각 포함하였다. 2010년과 2011년의 글로벌 컨센서스 서열들의 차이는 이들 위치에 발린 또는 이소루신을 포함하는 각 균주의 비율이 50%에 가깝다는 사실로 설명된다. 따라서, prM-E 서열의 글로벌 컨센서스 서열은 아래와 같이 제시된다:
Figure pat00006
E 서열의 글로벌 컨센서스 서열은 아래와 같이 제시된다:
Figure pat00007
상기 서열에서, 글로벌 컨센서스 prM 서열은 소문자로 표시되며, E 서열은 대문자로 표시된다. X (E 서열의 129번 위치) 및 Z (E 서열의 308번 위치)로 표시된 아미노산 위치들은 각각 독립적으로 Val 또는 Ile이며, 즉, 그 위치에 Val 또는 Ile을 포함하는 정렬된 아미노산 서열들의 비율은 50%에 가깝다.
마이너 아미노산 잔기 결정 및 Chimerivax™ CYD2의 서열 분석
가변적인 아미노산 위치들에 대한 리스트는 모든 아미노산 위치들이 포함된 글로벌 정렬로부터 확립되며, 정렬된 서열들에서 5% 이상의 차이가 있다. 아울러, 글로벌 컨센서스 서열과 매칭되지 않는 Chimerivax™ CYD2의 prM 및 E 단백질에서 모든 아미노산 서열을 동정한다. 그 결과는 표 4에 나타낸다 (N.B., 표에서, prM 및 M 단백질 서열들은 함께 넘버링되며, 즉, 전체 서열이 1번 위치에서 166번 위치이고, E는 별도로 1번 위치에서 495번 위치로 넘버링됨).
표 4: 혈청형 2의 뎅기열 바이러스의 가변적인 잔기들과 CYD2 비교
Figure pat00008
정렬된 서열들 중 5% 이상에서 글로벌 컨센서스 서열과 다르거나 및/또는 CYD2의 prM 및 E 단백질의 서열과 다른, 총 41곳의 아미노산 위치들이 prM 및 E 서열에서 동정되었다. CYD2의 prM 및 E 단백질 서열에서 아미노산 10곳이 글로벌 컨센서스 서열과 상이하였다 (E에서 5곳, M에서 2곳 및 이의 전구체 파트에서 3곳, 표 4 참조). 상이한 잔기 10개 중 5개는 50:50에 가까운 변이 분포를 나타내어, 이는 자연적인 가변성 위치로 보인다. CYD2 prM-E 서열에서 3곳만 매우 드문 변이인 것으로 보인다 (pr-24 Val, M-125 Ile 및 E-251 Phe).
E 및 M 단백질에서의 차이가 미치는 영향 분석
가변 위치, E 단백질 엑토도메인 (아미노산 1-395)에서의 변화에 대한 식견을 얻기 위해, 면역계에 의한 혈청중화에 가장 중요한 도메인을 추가로 분석하였다.
혈청형 2의 뎅기열 바이러스의 E 단백질의 가용성 엑토도메인의 공개된 3D 구조로부터 입수가능한 정보를 이용하여 (Modis, Y., et al. (2003) Proc Natl Acad Sci U S A, 100(12):6986-6991), 뎅기열 바이러스 입자 표면에 대한 3D 모델을 재구축하였다. 이로써, E 엑토도메인의 각 아미노산에 대한 접근가능성을 미세하게 조정하여 평가할 수 있으며, 그래서 가변성 수준 및 아미노산 변화 특성과 관련하여 이용함으로써, 항체 인지에 대한 CYD2 변이가 미치는 잠재적인 영향을 분석할 수 있다.
본 분석은, Chimerivax™ CYD2에서 글로벌 컨센서스 서열 (E 단백질의 Val 141 및 Val 164)로부터의 2가지 변이는 3D 구조에 완전히 묻혀, 비리온 표면에서 항체와 직접 상호작용할 수 없는 것으로 확인된다. E 단백질의 129번 위치에서 Val (Chimerivax™ CYD2)과 Ile (글로벌 컨센서스 서열) 간의 아미노산 위치 가변성은 50:50이며, 치환 역시 완전한 보존적인 변화이다. 이들 변이의 잠재적인 영향은 따라서 매우 제한적으로 것으로 간주된다.
E 단백질 (Chimerivax™ CYD2에서 Asn와 글로벌 컨센서스 서열에서 Asp)의 203번 위치에서의 차이는 잠재적으로 영향을 미칠 수 있지만 (충분히 노출된 잔기, 전하 변화), 균주 간의 차이 분포는 50:50에 가까워, 이는 천연적으로 가변적인 위치로 보인다.
Chimerivax™ CYD2의 E 단백질에서 251번 위치에서의 변이 (Chimerivax™에서의 Phe와 글로벌 컨센서스 서열에서의 Val)는 검색 균주들 간에 매우 드문편이다. 이러한 변이는 드물지만 비리온의 표면에서 충분히 노출되어 (29%) 있기 보다는 비-보존적인 아미노산 변화에 해당되기 때문에, 항체에 의한 인지에 일부 영향을 미칠 수 있다.
전술한 모델링 분석에서는, 항체 인지에 잠재적인 영향을 미칠 수 있는 E 단백질의 다른 위치 (226번 및 228번 위치)에서 2개의 변이를 인지하였지만, Chimerivax™ CYD2는 글로벌 컨센서스 서열들과 상기 위치들에서 차이가 없었다. 따라서, 최적화된 혈청형 2의 균주들을 동정함에 있어, 글로벌 컨센서스 서열에서 상기한 위치에서의 변이 (즉, 226번의 Thr과 228번의 글리신)는 바람직하게는 유니버셜 뎅기열 2 백신에 해당되지 않는다.
이론으로 결부되지 않으나, 본 발명자들은, 아미노산 변이 효과를 관련 인자의 수를 고려하는 점수 평가 방법을 이용하여 평가할 수 있는 것으로 본다. 특히, 이 방법은 게놈에서의 변이 위치 (G), 아미노산의 전하 특성 (B), 3D 맵핑 (M) 및 대상 위치에서의 공지된 변이체 (DB)를 고려하며, 스코어는 G x B x M x DB로 계산한다. 스코어 0은 영향 없음, 스코어 0 초과 10 이하는 예상되는 영향력 낮음, 스코어 10 초과 25 이하는 예상되는 영향력 중간, 및 스코어 25 초과는 예상되는 영향력 높음으로 분류될 것이다.
아미노산이 prM/M 단백질의 M 파트 (즉, prM/M 서열의 92-166번 위치) 또는 E 단백질의 396-495번 위치에 위치하는 경우, 게놈 위치 (G) 스코어는 0이다. 아미노산이 prM/M 단백질의 prM 파트 (즉, prM/M 서열의 1-91번 위치) 또는 E 단백질의 1-395번 위치에 위치하는 경우, 게놈 위치 스코어는 1이다.
아미노산 변화 특성 (B) 관련 스코어는 B = 100 - [(Blosum95 score + 6) x 10]으로 계산되며, 여러가지 아미노산 치환에 대한 Blosum95 스코어는 하기 표 5에 나타낸 바와 같다.
표 5
Figure pat00009
B = Asx, Z = Glx, X = 임의의 아미노산 및 * = 정지
아미노산이 prM/E 인터페이스에 위치하거나 위치하지 않는 지에 따라 M 값이 결정된다. 예를 들어, 실시예 1에 사용된 바와 같이 CYD2의 경우, 인터페이스에 위치된 아미노산은 prM 잔기 6, 7, 39, 40, 46-54, 56, 59-65, 67, 74 및 77이고 E 잔기 64-72, 82-84, 101-104, 106-108 및 244-247이다. 아미노산이 인터페이스에 위치하는 경우, M은 1이다. 아미노산이 인터페이스에 위치하지 않는 경우, M = Y x SAS %이다. 아미노산이 "상위" 위치 (즉, 외부 환경 쪽으로 향해진 위치)에 위치하는 경우 Y는 1이고; 아미노산이 분자의 "측면" (즉, 아미노산이 외부 환경 쪽도 아니로 캡시드 쪽으로도 아님)에 위치하는 경우에는 Y는 0.5이고; 아미노산이 "하위" 위치 (즉, 캡시드 쪽으로)에 위치하는 경우 Y는 0이다. 용매 접근 면적 % (SAS %) 값은 디스커버리 스튜디어 3D 모델링 소프트웨어 (Accelrys, Inc., CA, USA)를 이용하여 구한다.
아미노산 치환으로 치환 위치에, GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에 존재하는 뎅기열 서열의 그 위치에서 가장 일반적인 아미노산인 아미노산이 있게 되는 경우, DB 값은 0이다. 아미노산 치환으로 치환 위치에 데이타베이스에 존재하는 뎅기열 서열의 5% 이상으로 발견되는 (하지만, 그 위치에서 가장 빈번한 아미노산은 아님) 아미노산이 있게 되는 경우, DB 값은 0.25이다. 아미노산 치환으로 치환 위치에 데이타베이스에 존재하는 뎅기열 서열의 5% 미만으로 발견되는 (고유 치환은 제외됨) 아미노산이 있게 되는 경우, DB 값은 0.50이다. 치환 아미노산이 고유한 경우, DB 값은 1이다.
바이러스는, 복제하는 동안, 아미노산 치환을 일으키는 돌연변이를 획득할 수 있다. 전술한 방법은 돌연변이된 바이러스의 자손에서 이들 돌연변이에 대한 효과를 확인하기 위한 수단을 제공해준다.
바람직한 서열 (즉, 동정된 컨센서스 서열에 충분히 가까운 것으로 간주되는 서열)은, (i) 가장-영향력이 높은 아미노산 치환이 최대 3개, 바람직하게는 1개 또는 0개; (ii) 영향력이 보통인 아미노산 치환이 최대 3개, 바람직하게는 2, 1 또는 0개; 및/또는 (iii) 영향력이 낮은 아미노산 치환이 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개를 가질 수 있다.
최적화된 혈청형 2의 균주 동정
최적화된 혈청형 2의 균주는 전술한 선택 기준으로 동정한다.
BLAST 검색은 이용가능한 서열 전체에서 prM-E 글로벌 컨센서스 서열과 가장 가까운 서열을 가진 균주를 동정하기 위해 수행한다. prM-E 글로벌 컨센서스 서열과 100% 동일한 서열은 발견되지 않지만, 최고의 히트 (hit)는 균주 BID-V585 유래 서열 (NCBI 단백질 ID no. ACA58343; Genome ID no. EU529706; 2006년 푸에르토리코에서 분리됨)이며, 이는 글로벌 컨센서스 서열에서 단 하나의 변이를 91번 위치에서 나타낸다 (글로벌 컨센서스 서열에서 Val, BID-V585에서 Ile). BID-V585 prM-E 서열은 Chimerivax™ CYD-2 prM-E 서열과 13개의 변이를 포함한다.
균주 오리진에 지역적인 밸런스를 제공하기 위해, 추가적인 균주 선별을 행하였다. 이에, BLAST 분석에서 우수한 스코어를 나타낸 최근 분리된 Asian 균주 (균주 MD-1280; NCBI 단백질 ID no. CAR65175; Genome ID no. FM21043; 2004년에 베트남에서 분리됨)를 선택하였다. 글로벌 컨센서스 서열과 prM-E에서 6개의 변이를 나타냄에도 불구하고, 변이 6개 중 3개가 균주들 30% 이상에서 천연적으로 차이가 있는 다목적 위치 (versatile position)로서 동정되었다. MD-1280 prM-E 서열은 Chimerivax™ CYD-2 prM-E 서열에서 15개의 변이를 포함하고 있다.
기존에 균주를 통해 축적된 상당한 경험을 토대로 추가적인 균주 선별을 행하였다. 선별된 균주는 마히돌 대학의 혈청형 2의 뎅기열 16681 균주로부터 유래된 살아있는 약독화된 바이러스인 LAV-2 균주라고도 하는 PDK53-16681 균주이다 (NCBI 단백질 ID no. AAA73186; Genome ID no. M84728; 1964년에 태국에서 분리됨; Blok, J., et al. (1992); Virology 187 (2), 573-590). LAV-2 prM-E 서열은 글로벌 컨센서스 서열과 비교해 10개의 변이와 Chimerivax™ CYD-2 prM-E 서열과 비교에 13개의 변이를 포함한다.
전술한 기준을 토대로 선별된 추가적인 균주는 균주 PR/DB023 (NCBI 단백질 ID no. AEN71248; Genome ID no. JF804036; 2007년에 푸에르토리코에서 분리됨)이다. PR/DB023 prM-E 서열은 글로벌 컨센서스 서열과 비교해 3개의 변이를 Chimerivax™ CYD-2 prM-E 서열과 비교해 13개의 변이를 포함하고 있다.
선별된 균주들 모두 Chimerivax™ CYD-2 prM-E 서열에 존재하는 희귀 아미노산, 즉 prM-24의 Val, M-125의 Ile 및 E-251의 Phe를 포함한다.
선별 균주 4종의 PrM - E 뉴클레오티드 서열
>LAV-2 prME 뉴클레오티드 서열 (서열번호 4)
Figure pat00010
Figure pat00011
Figure pat00012
대문자: E 코딩 서열; 소문자: prM 코딩 서열
> BID/V585 - prME 뉴클레오티드 서열 (서열번호 5)
Figure pat00013
Figure pat00014
>PR/DB023 prME 뉴클레오티드 서열 (서열번호 6)
Figure pat00015
>MD1280 prME 뉴클레오티드 서열 (서열번호 7)
Figure pat00016
Figure pat00017
선별 균주 4종의 대응되는 prM - E 단백질 서열
>LAV2 prME 단백질 서열 (서열번호 8)
Figure pat00018
>LAV2 E 단백질 서열 (서열번호 13)
Figure pat00019
>LAV2 M 단백질 서열 (서열번호 19)
Figure pat00020
>BID/V585 prME 단백질 서열 (서열번호 9)
Figure pat00021
>BID/V585 E 단백질 서열 (서열번호 14)
Figure pat00022
>BID/V585 M 단백질 서열 (서열번호 20)
Figure pat00023
>PR/DB023 prME 단백질 서열 (서열번호 10)
Figure pat00024
>PR/DB023 E 단백질 서열 (서열번호 15)
Figure pat00025
>PR/DB023 M 단백질 서열 (서열번호 21)
Figure pat00026
>MD1280 prME 단백질 서열 (서열번호 11)
Figure pat00027
>MD1280 E 단백질 서열 (서열번호 16)
Figure pat00028
>MD1280 M 단백질 서열 (서열번호 22)
Figure pat00029
>컨센서스 M 서열 (서열번호 17)
Figure pat00030
실시예 3: 최적화된 혈청형 2 키메라 바이러스에 해당되는 cDNA 클론 구축 및 코딩된 바이러스 생산
최적화된 혈청형 2의 균주에 해당되는 키메라 뎅기열 바이러스를, Chambers, et al. (1999, J.Virology 73(4):3095-3101)에 교시된 바에 따라 실질적으로 Chimerivax™ 기법을 이용하여 구축하였다. 또한, 국제 특허 출원s WO 98/37911, WO 03/101397, WO 07/021672, WO 08/007021, WO 08/047023 및 WO 08/065315를 참조하며, 이들 문헌에는 CYD-1, CYD2, CYD-3 및 CYD-4를 구축하는데 사용되는 유사 공정들이 상세히 기술되어 있다. 간략하게는, 최적화된 혈청형 2의 균주에 해당되는 키메라 뎅기열 바이러스를 (N.B. the optimized chimera dengue virus are constructed using the genome backbone of YF strain YF17D204 (YF-VAX(R), Sanofi-Pasteur, Swiftwater, PA, USA)에 따라 구축한다.
플라스미드 pSP1101 구축
YF-VAX cDNA 클론 - pJSY2284.1 (pACYC YF-Vax 5-3)의 구축
감염성의 YF-VAX 전장 cDNA 클론을 구축하였다. 감염성의 전장 cDNA 클론은 YF-VAX 서열을 기초로 한다. 저카피 수의 플라스미드 pACYC177 (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, USA)을 이용하여 전장 cDNA 클론을 조립하였다.
SP6 YF-Vax 5-3로 명명된 DNA 서열을 GeneArt®에서 합성하였다. SP6 YF-Vax 5-3 서열은 전장 YF-Vax cDNA 클론의 용이한 조립을 촉진하는 방식으로 설계된다. 서열은 2897 bp 길이에, Xma I-SP6 프로모터, YF-Vax 5'UTR, 캡시드, prM, M, Apa I에서 연장되며 조립을 위한 고유 사이트 Mlu I-Sap I-Ngo MI-Aat II-Cla I가 이어서 배치된 E 파트, NS5 파트를 포함하며, 3' UTR까지 연장되며, 그 다음으로 Nru I 사이트가 있으며, 이는 런-오프로 사용된다. 이렇게 합성한 DNA 서열 양 옆으로 EcoR V와 XHo I 사이트가 위치한다. EcoR V/Xho I으로 분해한 후, DNA 단편을 저카피 수 플라스미드 pACYC177의 Aat II/Xho I 사이트에 클로닝하여, 1615bp Aat II/Xho I 단편을 치환한다. 제조되는 플라스미드 pJSY2284.1 (pACYC YF-Vax 5-3)은 서열 분석으로 검증한다.
Apa I, Mlu I, Sap I, Ngo MI, Aat II 및 Cla I 사이트로부터 스패닝 YF - Vax cDNA 단편의 RT- PCR 및 클로닝 , 및 감염성 YF -vax 전장 cDNA 클론 ( pJSY2374 . 5)의 조립
황열 백신 YF-VAX를 Vero 세포에서 배양하고, 바이러스 입자를 농축하였다. YF-VAX의 바이러스 RNA를 농축시킨 바이러스에서 추출하고, 역전사효소에 의해 cDNA 카피를 제조하였다. 본원에 나타낸 cDNA 단편 5개를 PCR 증폭하고, TOPO 클로닝한 후, 서열분석 한 다음 YF-VAX 2003 서열과 비교하였다. 각 단편에서 확인된 PCR 에러는 부위 특이적인 돌연변이 유발 또는 단편 스위칭에 의해 교정하였다. TOPO 클로닝 후 Ngo MI-Aat II 단편에서 발현되는 서열 차이가 매우 많아, 이 단편은 GeneArt® 사에서 합성하였다. 최종 서열을 검증한 후, DNA 단편 5개; Apa I-Mlu I, Mlu I-Sap I, Sap I-Ngo M1, Ngo MI-Aat II 및 Aat II-Cla I을 분리하고, 단계적으로 플라스미드 pJSY2284.1에 고유 사이트 Apa I, Mlu I, Sap I, Ngo MI, Aat II 및 Cla I을 통해 클로닝하였으며, 이것이 YF-VAX 전장 cDNA의 바른 서열을 함유하는 것을 검증하였다.
LAV2 균주 유래 최적화된 키메라 뎅기열 바이러스의 cDNA 구축 (pSP1101)
전략으로부터 유래된 cDNA의 구축은, 기존에 Chimerivax™ 기법을 이용하여 CYD-1, CYD-2, CYD-3 및 CYD-4 뎅기열 백신을 구축하기 위해 행한 바와 같이, YF-VAX 게놈을 함유한 pJSY2374.5 플라스미드에서 YF-VAX® 백신 균주의 prM 및 E 유전자를 LAV2 균주의 것으로 치환하기 위한 것이다. 제조되는 플라스미드는 pSP1101이다.
pJSY2374에서, 클로닝에 사용되는 제한효소 부위는 Xma I과 Mlu I이다. 이들 사이트는 SP6 프로모터, YF17D 5'UTR, YF17D-캡시드, YF17D-prM, YF17D-E 및 YF17D-NS1의 N 말단을 포함하는 3000 bp 단편의 상류와 하류에 위치한다. 이 단편에 해당되지만, Xma I과 Mlu I 사이트가 측면에 위치한 LAV2의 prM 및 E 유전자들을 대신 포함하는 서열을 GeneArt® 사에서 합성하여, 플라스미드 pMK-RQ (GeneArt®, Life Technologies Ltd, Paisley, U.K.)에 클로닝하여, 플라스미드 pMK-RQ-Seq1을 구축하였다. 플라스미드 pJSY2374.5와 pMK-RQ-Seq1을 Xma I과 Mlu 1으로 분해하였다. pMK-RQ-Seq1의 Xma I-Mlu I 단편을 플라스미드 pJSY2374.5에 삽입하여, 플라스미드 pSP1101을 구축하였다. XL-10 Gold Ultracompetent bacteria (Agilent Technologies, CA, USA)는 큰 플라스미드에 적합하기에, 형질전환에 사용하였다. 2번째 단계로, 양성 클론을 큰 사이즈의 플라스미드를 대량 증폭할 수 있는 One Shot® TOP10 E. coli (Life Technologies Ltd, Paisley, U.K.)에 형질전환하였다.
따라서, 플라스미드 pSP1101은 YF-VAX 복제 엔진으로 LAV2 균주의 prM 단백질과 E 단백질을 발현할 수 있다. 제조된 키메라 바이러스는 CYD-LAV로 명명하였다. 서열 분석에서 오리지날 서열과 비교해 돌연변이는 보이지 않았다.
BID-V585, PR/DB023 및 MD1280 균주들에 대한 각각의 플라스미드 구축
전술한 전략과 유사한 전략을 사용하여, 혈청형 2의 균주들 BID-V585, PR/DB023 및 MD1280에 해당되는 플라스미드를 구축하였다. 이들 플라스미드는 pSP1102 (BID-V585), pSP1103 (PR/DB023) 및 pSP1104 (MD1280)로 명명된다. 이들 플라스미드로 제조된 키메라 바이러스는 CYD-BID, CYD-PR 및 CYD-MD로 명명된다. 제조한 플라스미드에 대한 서열 분석에서 오리지날 서열과 비교해 돌연변이는 보이지 않았다.
플라스미드 pSP1101 , pSP1102 , pSP1103 및 pSP1104로부터 키메라 바이러스 제조
전술한 바와 같이 시험관내 RNA 전사 및 바이러스 제조를 수행하였다 (Guirakhoo F et al. J. Virol. 2001; 75:7290-304).
실시예 4. 멕시코에서 수행된 플라비바이러스 - 나이브 성인에 대한 4가 뎅기열 백신 제형의 평가
본 실험의 목적은 CYD-1 (즉, DEN1 PU0359 (TYP 1 140)의 prM 및 E 서열로부터 제조된 특정 Chimerivax 뎅기열 혈청형 1 (CYD-1) 균주), VDV2, CYD-3 (즉, DEN3 PaH881/88의 prM 및 E 서열로부터 제조된 특정 Chimerivax 뎅기열 혈청형 3 (CYD-3)) 및 CYD-4 (즉, DEN4 1228 (TVP 980)의 prM 및 E 서열로부터 제조된 특정 Chimerivax 뎅기열 혈청형 4 (CYD-4) 균주)를 포함하는 블랜드형 4가 뎅기열 백신의 면역원성과 바이러스 혈증을, CYD-1, CYD-2 (즉, DEN2 PUO218의 prM 및 E 서열로부터 제조된 특정 Chimerivax 뎅기열 혈청형 2 (CYD-2) 균주), CYD-3 및 CYD-4를 포함하는 4가 뎅기열 백신의 면역원성 및 바이러스 혈증과 비교하는 것이었다. 본 실험에 사용되는 구체적인 CYD-1, CYD-2, CYD-3 및 CYD-4에 대한 보다 상세한 내용은 실시예 1을 참조한다.
VDV2 균주의 해당 뉴클레오티드 서열과 단백질 서열은 다음과 같다:
>VDV2 뉴클레오티드 서열 (서열번호 24)
Figure pat00031
Figure pat00032
Figure pat00033
Figure pat00034
Figure pat00035
>VDV2 prME 뉴클레오티드 서열 (서열번호 25)
Figure pat00036
>VDV2 E 단백질 서열 (서열번호 26)
Figure pat00037
>VDV2 M 단백질 서열 (서열번호 27)
Figure pat00038
실험 설계
개방형, 무작위, 대조군, IIa상 실험에, 18-45세의 건강한 성인 150명이 멕시코 시티의 2 기관에 등록하였으며, 이 곳은 뎅기열 비-유행 지역이다. 주요 제외 기준은 다음과 같다: 임신 또는 수유, 인간 면역결핍성 바이러스, B형 간염 또는 C형 간염에 대한 혈청 양성, 면역결핍 또는 결과에 방해가 될 수 있는 임의의 다른 만성적인 질환, 과거에 뎅기열 유행성이 높은 지역에 2주 이상 거주 또는 여행, 플라비바이러스 감염 병력 또는 플라비바이러스 질환에 대해 과거 백신 접종 이력. 가임기 여성은 1차 주사 전 4주 이상 부터 마지막 주사 후 적어도 4주까지 효과적인 피임 또는 금욕법을 사용하여야 하였다.
참가자들을 2개의 그룹으로 무작위 분할하고, 0일과 105일 (±15일)에 백신 접종을 수행하였다. 그룹들에는 아래 제형들을 제공하였다:
1 그룹: 블렌드형 CYD/VDV2 4가 제형, 즉, CYD-1, CYD-3, CYD4 및 VDV2를 포함하는 제형.
2 그룹: 대조군 4가 제형 (CYD-TDV), 즉, CYD-1, CYD-2, CYD-3 및 CYD-4.
제형은 CYD 바이러스의 각 혈청형을 105 CCID50로 포함하고 있으며, 그룹 1에게 투여되는 제형에는 VDV02 바이러스가 104 CCID50로 포함되었다.
바이러스 혈증
백신의 안정성을 평가하기 위해, CYD-1-4 또는 VDV-2의 존재를 각 주사 후 7, 14 및 21일에 수집한 혈청에서 분석하였다. 분석은 Global Clinical Immunology laboratory (Sanofi Pasteur, Swiftwater, PA, USA)에서 수행하였다.
CYD-1-4 바이러스 혈증을, Poo et al., Pediatr Infect Dis J (2011) 30: e9에 기존에 기술된 바와 같이, 2 단계를 분석하였다. 간략하게는, 1차, 비-혈청형-특이, 역전사효소-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 이용하여, 4종의 CYD 바이러스의 존재를 검출하였다. 이 1차 테스트에서 양성인 샘플은 CYD 혈청형-특이 정량 RT-PCR을 이용하여 분석하였다. 비-혈청형-특이 RT-PCR에서, 시판 키트를 이용하여 혈청에서 RNA를 추출하고, 황열 코어 유전자 서열로부터 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 수행하였다. 혈청형-특이 RT-PCR에서, 시판 키트를 사용하여 혈청에서 RNA를 다시 추출하고, 각 혈청형에 대한 외막 비-구조 단백질 1 정션 유전자 서열로부터 혈청형-특이 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 1 그룹에 투여되는 4가 블렌딩 제형에는 VDV-2 바이러스가 포함되어 있기 때문에, 1 그룹에서 혈청형 2에 대한 뎅기열 RT-PCR을 수행하였다.
면역원성
4종의 뎅기열 바이러스 혈청형 각각에 대한 항체 수준은, 각 주사 후 28일 시점 수집한 혈청과 1차 주사 후 365일 시점에 수집한 혈청을 대상으로 50% 플라그 감소 중화 검사를 통해 측정하였다. 간략하게는, 열-불활화된 혈청의 연속적인 2배 희석물을 일정한 챌린지 용량의 각 혈청형 뎅기열 DEN-1, -2, -3, 또는 -4 (플라그 형성 단위 [PFU]/ml로 표현됨)와 혼합하였다. 이 혼합물을 컨플루언트 Vero 세포 단층이 함유죈 24웰 플레이트의 웰에 접종하였다. 수일간 인큐베이션한 후, 뎅기열 바이러스 감염은 플라그의 형성으로 표시된다. 중화 항체 역가는 바이러스 플라크 카운트의 ≥50% 감소(PRNT50)가 관찰되는 혈청의 최고 희석의 역수 (1/dil)로 계산된다. 뎅기열 PRNT50의 정량 하한은 10이고, 역가가 ≥10인 샘플은 혈청양성으로 간주하였다.
결과
1그룹과 2그룹에, 실험 0일 및 105일에 제형들을 참가자들에게 투여하였다. 주사 부위나 1차 또는 2차 백신 접종 후 전신 반응원성에 대해서는 2개의 그룹들 간에 차이는 없었다. 각 주사 후 7, 14 및 21일에 채집한 혈청에서 바이러스 혈증을 분석하였다 (표 6). 각 주사 후 28일 시점과 1차 주사 후 365일 시점에 중화 항체의 역가를 측정하였다 (표 7).
표 6. 1차 및 2차 주사 후 7, 14 또는 21일 시점의 백신 바이러스 혈증 ( 검출가능하며 정량가능한 바이러스 혈증을 가진 n (%))
1차 주사 2차 주사
1 그룹
블렌드형
CYD/VDV		 2 그룹
4가
CYD-TDV		 1 그룹
블렌드형
CYD/VDV		 2 그룹
4가
CYD-TDV
비-혈청형 특이적인
N 29 31 28 29
검출가능한 바이러스 혈증 27 (93%) 25 (81%) 1 (4%) 1 (3%)
정량가능한 바이러스 혈증 1 (3%) 2 (6%) 0 0
DENV-1
검출가능한 바이러스 혈증 1 (3%) 4 (13%) 0 0
정량가능한 바이러스 혈증 0 2 (7%) 0 0
DENV-2
검출가능한 바이러스 혈증 0 2 (6%) 0 0
정량가능한 바이러스 혈증 0 0 0 0
DENV-3
검출가능한 바이러스 혈증 8 (28%) 7 (23%) 1 (4%) 0
정량가능한 바이러스 혈증 0 0 0 0
DENV-4
검출가능한 바이러스 혈증 24 (83%) 21 (68%) 0 0
정량가능한 바이러스 혈증 0 3 (1%) 0 0
1차 주사 후, 비-혈청형 특이 RT-PCR 검사를 통해 측정된 검출가능한 바이러스 혈증은 양쪽 그룹들의 참가자들에서 비슷한 비율로 관찰되었다 (표 6 참조). 대부분의 사례들에서, 바이러스 혈증은 정량 하한 보다 낮았다. 혈청형-특이적인 분석으로 분석한 결과, CYD-4가 가장 흔하게 검출되는 혈청형이었고, 다음으로 CYD-3이었다. 블렌드형 CYD/VDV 백신을 1 그룹에게 또는 CYD-TDV 백신을 2 그룹에게 2차 주사한 후, 바이러스 혈증은 비-혈청형-특이 분석에서 그룹 당 1명의 참가자에서만 검출되었다.즉, 블렌드형 CYD/VDV 및 CYD-TDV에 의해 유발되는 바이러스 혈증의 수준 간에는 유의한 차이가 없었다.
표 7. 1차 주사 및 2차 주사 후 28일 및 1차 주사 후 365일 시점의 뎅기열 항체의 기하 평균 역가 (신뢰 구간 95%)
1 그룹
CYD/VDV 블렌드형 		2 그룹
CYD-TDV
1차 주사
혈청형 1 15 (9;28) 17 (10;31)
혈청형 2 17 (8;33) 32 (16;65)
혈청형 3 64 (31;133) 23 (13;39)
혈청형 4 552 (299;1019) 468 (226;968)
2차 주사
혈청형 1 54 (30;96) 28 (15;50)
혈청형 2 152 (79;293) 43 (23;79)
혈청형 3 127 (71;229) 46 (29;73)
혈청형 4 246 (159;382) 173 (97;307)
1회 투여 후 365일
혈청형 1 14 (9;22) 18 (10;30)
혈청형 2 55 (32;94) 16 (9;29)
혈청형 3 36 (20;64) 11 (7;16)
혈청형 4 103 (69;155) 72 (44;117)
표 7에서 알 수 있는 바와 같이, 블렌드형 CYD/VDV 백신 (1 그룹)의 2차 주사는 CYD-TDV 백신 (2 그룹)과 비교해 혈청형 2의 뎅기열 바이러스에 대해 더 높은 GMT를 유도하였다. 또한, 블렌드형 CYD/VDV 그룹에서 혈청형 2에 대해 개선된 반응은 1차 주사 후 365일에도 관찰되었다.아울러, 블렌드형 CYD/VDV 백신 (1 그룹)을 2차 주사하면, CYD-TDV 백신을 투여한 그룹 (2 그룹)과 비교해, 모든 혈청형의 뎅기열 바이러스에 대해 개선된 중화 항체 반응이 형성되었다. 중요하게도, 블렌드형 CYD/VDV 제형 그룹은 1차 주사 후 365일 시점에 CYD-TDV에 비해 보다 지속적인 중화 항체 반응을 나타내었다.
즉, 본 실시예는, 전체적으로 블렌드형 CYD-1, 3, 4/VDV2 백신 제형이 CYD-TDV 백신과 비교해 뎅기열 바이러스 혈청형들에 대해 보다 강하고 지속적인 면역 반응을 유도하면서도, 바이러스 혈증으로 측정된 바와 같이 비슷한 안전성 프로파일을 나타냄을 보여준다.
서열 목록
서열번호 서열
1 prM+E CYD23 유행 균주 뉴클레오티드 서열
2 prM+E CYD23 유행 균주 단백질 서열
3 prM+E 컨센서스 혈청형 2 단백질 서열
4 prM+E LAV2 뉴클레오티드 서열
5 prM+E BID/V585 뉴클레오티드 서열
6 prM+E PR/DB023 뉴클레오티드 서열
7 prM+E MD1280 뉴클레오티드 서열
8 prM+E LAV2 단백질 서열
9 prM+E BID/V585 단백질 서열
10 prM+E PR/DB023 단백질 서열
11 prM+E MD1280 단백질 서열
12 E 컨센서스 혈청형 2 단백질 서열
13 E LAV2 단백질 서열
14 E BID/V585 단백질 서열
15 E PR/DB023 단백질 서열
16 E MD1280 단백질 서열
17 M 컨센서스 혈청형 2 단백질 서열
18 E CYD23 유행 균주 단백질 서열
19 M LAV2 단백질 서열
20 M BID/V585 단백질 서열
21 M PR/DB023 단백질 서열
22 M MD1280 단백질 서열
23 M CYD23 유행 균주 단백질 서열
24 VDV2의 전체 뉴클레오티드 서열 of VDV2 (RNA에 해당됨)
25 prM+E VDV2 뉴클레오티드 서열 (RNA에 해당됨)
26 E VDV2 단백질 서열
27 M VDV2 단백질 서열
뉴클레오티드 서열 리스트에서, 뉴클레오티드 서열이 DNA인 경우, 뉴클레오티드 T를 뉴클레오티드 U로 치환하면 DNA 서열이 동일한 RNA 등가체가 된다. 마찬가지로, 뉴클레오티드 서열이 RNA인 경우, 뉴클레오티드 U를 뉴클레오티드 T로 치환하면 등가의 DNA 서열이 된다. 상기 DNA 서열 목록은 언급된 뎅기열 바이러스의 cDNA로 구성되며, 따라서 등가의 RNA 서열은 뎅기열 바이러스의 + 가닥 RNA를 구성한다.
SEQUENCE LISTING <110> Sanofi Pasteur <120> Vaccine Compositions <130> P39478WO <150> EP12305912.3 <151> 2012-07-25 <150> EP12305907.3 <151> 2012-07-24 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1983 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clinical trial circulating strain <400> 1 ttccatctaa ccacacgcaa cggagaacca cacatgatcg tcggtataca ggagaaaggg 60 aaaagtcttc tgttcaaaac agaggatggt gtgaacatgt gcaccctcat ggctatggac 120 cttggtgaat tgtgtgaaga cacaatcacg tacaagtgtc ctcttctcag gcagaatgag 180 ccagaagaca tagactgttg gtgcaactcc acgtccacgt gggtaaccta tgggacctgt 240 accactacgg gagaacatag gagagaaaaa agatcagtgg cactcgttcc acatgtggga 300 atgggactgg agacgcgaac cgaaacatgg atgtcatcag aaggggcttg gaaacatgcc 360 cagagaattg aaacttggat cctgagacat ccaggcttca ccataatggc agcaatcctg 420 gcatacacca taggaacgac acatttccag agagtcctga ttttcatcct actgacagct 480 gtcgctcctt caatgacaat gcgttgcata ggaatatcaa atagagactt tgtagaaggg 540 gtttcaggag gaagttgggt tgacatagtc ttagaacatg gaagctgtgt gacgacgatg 600 gcaaaaaaca aaccaacatt ggatttcgaa ctgataaaaa cggaagccaa acagcctgcc 660 accctaagga agtactgcat agaagcaaaa ctaaccaaca caacaacaga atcccgttgc 720 ccaacacaag gggaacccag cctaaaagaa gagcaggaca agaggttcgt ctgcaaacac 780 tccatggtag acagaggatg gggaaatgga tgtggattat ttggaaaggg aggcattgtg 840 acctgtgcta tgttcacatg caaaaagaac atggaaggga aaatcgtgca accagaaaac 900 ttggaataca ccattgtggt aacacctcac tcaggggaag agcatgcggt cggaaatgac 960 acaggaaaac acggcaagga aatcaaagta acaccacaga gttccatcac agaagcagaa 1020 ctgacaggtt atggcaccgt cacgatggag tgctccccga gaacaggcct cgacttcaat 1080 gagatggtgt tgctgcagat ggaaaataaa gcttggctgg tgcataggca atggtttcta 1140 gacctgccat taccatggct gcccggagcg gataaacaag aatcaaattg gatacagaaa 1200 gaaacattgg tcactttcaa aaatccccat gcgaagaaac aggatgttgt tgttttagga 1260 tcccaagaag gggccatgca tacagcactc acaggagcca cagaaatcca aatgtcgtca 1320 ggaaacttgc tcttcactgg acatctcaag tgcaggctga gaatggacaa gctacagctt 1380 aaaggaatgt catactctat gtgcacagga aagtttaaag ttgtgaagga aatagcagaa 1440 acacaacatg 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Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile 50 55 60 Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Val 85 90 95 Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser 100 105 110 Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu 115 120 125 Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile 130 135 140 Gly Thr Thr His Phe Gln Arg Val Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala 145 150 155 160 Val Ala Pro Ser Met Thr Met Arg Cys Ile Gly Ile Ser Asn Arg Asp 165 170 175 Phe Val Glu Gly Val Ser Gly Gly Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu 180 185 190 His Gly Ser Cys Val Thr Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp 195 200 205 Phe Glu Leu Ile Lys Thr Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys 210 215 220 Tyr Cys Ile Glu Ala Lys Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys 225 230 235 240 Pro Thr Gln Gly Glu Pro Ser Leu Lys Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe 245 250 255 Val Cys Lys His Ser Met Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly 260 265 270 Leu Phe Gly Lys Gly Gly Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Thr Cys Lys 275 280 285 Lys Asn Met Glu Gly Lys Ile Val Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr 290 295 300 Ile Val Val Thr Pro His Ser Gly Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp 305 310 315 320 Thr Gly Lys His Gly Lys Glu Ile Lys Val Thr Pro Gln Ser Ser Ile 325 330 335 Thr Glu Ala Glu Leu Thr Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser 340 345 350 Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Gln Met Glu 355 360 365 Asn Lys Ala Trp Leu Val His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu 370 375 380 Pro Trp Leu Pro Gly Ala Asp Lys Gln Glu Ser Asn Trp Ile Gln Lys 385 390 395 400 Glu Thr Leu Val Thr Phe Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val 405 410 415 Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly 420 425 430 Ala Thr Glu Ile Gln Met Ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His 435 440 445 Leu Lys Cys Arg Leu Arg Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser 450 455 460 Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Val Val Lys 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auuccaacag ugauggcguu ccauuuaacc acacguaacg gagaaccaca caugaucguc 480 agcagacaag agaaagggaa aagucuucug uuuaaaacag agguuggcgu gaacaugugu 540 acccucaugg ccauggaccu uggugaauug ugugaagaca caaucacgua caaguguccc 600 cuucucaggc agaaugagcc agaagacaua gacuguuggu gcaacucuac guccacgugg 660 guaacuuaug ggacguguac caccauggga gaacauagaa gagaaaaaag aucaguggca 720 cucguuccac augugcgaau gggacuggag acacgaacug aaacauggau gucaucagaa 780 ggggccugga aacaugucca gagaauugaa acuuggaucu ugagacaucc aggcuucacc 840 augauggcag caauccuggc auacaccaua ggaacgacac auuuccaaag agcccugauu 900 uucaucuuac ugacagcugu cacuccuuca augacaaugc guugcauagg aaugucaaau 960 agagacuuug uggaaggggu uucaggagga agcuggguug acauagucuu agaacaugga 1020 agcuguguga cgacgauggc aaaaaacaaa ccaacauugg auuuugaacu gauaaaaaca 1080 gaagccaaac agccugccac ccuaaggaag uacuguauag aggcaaagcu aaccaacaca 1140 acaacagaau cucgcugccc aacacaaggg gaacccagcc uaaaugaaga gcaggacaaa 1200 agguucgucu gcaaacacuc caugguagac agaggauggg gaaauggaug uggacuauuu 1260 ggaaagggag gcauugugac cugugcuaug uucagaugca aaaagaacau ggaaggaaaa 1320 guugugcaac cagaaaacuu ggaauacacc auugugauaa caccucacuc aggggaagag 1380 caugcagucg gaaaugacac aggaaaacau ggcaaggaaa ucaaaauaac accacagagu 1440 uccaucacag aagcagaauu gacagguuau ggcacuguca caauggagug cucuccaaga 1500 acgggccucg acuucaauga gaugguguug cugcagaugg aaaauaaagc uuggcuggug 1560 cacaggcaau gguuccuaga ccugccguua ccaugguugc ccggagcgga cacacaagag 1620 ucaaauugga uacagaagga gacauugguc acuuucaaaa auccccaugc gaagaaacag 1680 gauguuguug uuuuaggauc ccaagaaggg gccaugcaca cagcacuuac aggggccaca 1740 gaaauccaaa ugucaucagg aaacuuacuc uucacaggac aucucaagug caggcugaga 1800 auggacaagc uacagcucaa aggaauguca uacucuaugu gcacaggaaa guuuaaaguu 1860 gugaaggaaa uagcagaaac acaacaugga acaauaguua ucagagugca auaugaaggg 1920 gacggcucuc caugcaagau cccuuuugag auaauggauu uggaaaaaag acaugucuua 1980 ggucgccuga uuacagucaa cccaauugug acagaaaaag auagcccagu caacauagaa 2040 gcagaaccuc cauuuggaga cagcuacauc aucauaggag uagagccggg acaacugaag 2100 cucaacuggu uuaagaaagg aaguucuauc ggccaaaugu uugagacaac aaugaggggg 2160 gcgaagagaa uggccauuuu aggugacaca gccugggauu uuggauccuu gggaggagug 2220 uuuacaucua uaggaaaggc ucuccaccaa gucuuuggag caaucuaugg agcugccuuc 2280 agugggguuu cauggacuau gaaaauccuc auaggaguca uuaucacaug gauaggaaug 2340 aauucacgca gcaccucacu gucugugaca cuaguauugg ugggaauugu gacacuguau 2400 uugggaguca uggugcaggc cgauaguggu ugcguuguga gcuggaaaaa caaagaacug 2460 aaauguggca gugggauuuu caucacagac aacgugcaca cauggacaga acaauacaaa 2520 uuccaaccag aauccccuuc aaaacuagcu ucagcuaucc agaaagccca ugaagaggac 2580 auuuguggaa uccgcucagu aacaagacug gagaaucuga uguggaaaca aauaacacca 2640 gaauugaauc acauucuauc agaaaaugag gugaaguuaa cuauuaugac aggagacauc 2700 aaaggaauca ugcaggcagg aaaacgaucu cugcggccuc agcccacuga gcugaaguau 2760 ucauggaaaa cauggggcaa agcaaaaaug cucucuacag agucucauaa ccagaccuuu 2820 cucauugaug gccccgaaac agcagaaugc cccaacacaa auagagcuug gaauucguug 2880 gaaguugaag acuauggcuu uggaguauuc accaccaaua uauggcuaaa auugaaagaa 2940 aaacaggaug uauucugcga cucaaaacuc augucagcgg ccauaaaaga caacagagcc 3000 guccaugccg auauggguua uuggauagaa agugcacuca augacacaug gaagauagag 3060 aaagccucuu ucauugaagu uaaaaacugc cacuggccaa aaucacacac ccucuggagc 3120 aauggagugc uagaaaguga gaugauaauu ccaaagaauc ucgcuggacc agugucucaa 3180 cacaacuaua gaccaggcua ccauacacaa auaacaggac cauggcaucu agguaagcuu 3240 gagauggacu uugauuucug ugauggaaca acagugguag ugacugagga cugcggaaau 3300 agaggacccu cuuugagaac aaccacugcc ucuggaaaac ucauaacaga auggugcugc 3360 cgaucuugca cauuaccacc gcuaagauac agaggugagg augggugcug guacgggaug 3420 gaaaucagac cauugaagga gaaagaagag aauuugguca acuccuuggu cacagcugga 3480 caugggcagg ucgacaacuu uucacuagga gucuugggaa uggcauuguu ccuggaggaa 3540 augcuuagga cccgaguagg aacgaaacau gcaauacuac uaguugcagu uucuuuugug 3600 acauugauca cagggaacau guccuuuaga gaccugggaa gagugauggu uaugguaggc 3660 gccacuauga cggaugacau agguaugggc gugacuuauc uugcccuacu agcagccuuc 3720 aaagucagac caacuuuugc agcuggacua cucuugagaa agcugaccuc caaggaauug 3780 augaugacua cuauaggaau uguacuccuc ucccagagca ccauaccaga gaccauucuu 3840 gaguugacug augcguuagc cuuaggcaug augguccuca aaauggugag aaauauggaa 3900 aaguaucaau uggcagugac uaucauggcu aucuugugcg ucccaaacgc agugauauua 3960 caaaacgcau ggaaagugag uugcacaaua uuggcagugg uguccguuuc cccacuguuc 4020 uuaacauccu cacagcaaaa aacagauugg auaccauuag cauugacgau caaaggucuc 4080 aauccaacag cuauuuuucu aacaacccuc ucaagaacca gcaagaaaag gagcuggcca 4140 uuaaaugagg cuaucauggc agucgggaug gugagcauuu uagccaguuc ucuccuaaaa 4200 aaugauauuc ccaugacagg accauuagug gcuggagggc uccucacugu gugcuacgug 4260 cucacuggac gaucggccga uuuggaacug gagagagcag ccgaugucaa augggaagac 4320 caggcagaga uaucaggaag caguccaauc cugucaauaa caauaucaga agaugguagc 4380 augucgauaa aaaaugaaga ggaagaacaa acacugacca uacucauuag aacaggauug 4440 cuggugaucu caggacuuuu uccuguauca auaccaauca cggcagcagc augguaccug 4500 ugggaaguga agaaacaacg ggccggagua uugugggaug uuccuucacc cccacccaug 4560 ggaaaggcug aacuggaaga uggagccuau agaauuaagc aaaaagggau ucuuggauau 4620 ucccagaucg 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cucccccggg aagcagagac ccauuuccuc agagcaaugc accaaucaua 5520 gaugaagaaa gagaaauccc ugaacgcucg uggaauuccg gacaugaaug ggucacggau 5580 uuuaaaggga agacuguuug guucguucca aguauaaaag caggaaauga uauagcagcu 5640 ugccugagga aaaauggaaa gaaagugaua caacucagua ggaagaccuu ugauucugag 5700 uaugucaaga cuagaaccaa ugauugggac uucgugguua caacugacau uucagaaaug 5760 ggugccaauu ucaaggcuga gaggguuaua gaccccagac gcugcaugaa accagucaua 5820 cuaacagaug gugaagagcg ggugauucug gcaggaccua ugccagugac ccacucuagu 5880 gcagcacaaa gaagagggag aauaggaaga aauccaaaaa augagaauga ccaguacaua 5940 uacauggggg aaccucugga aaaugaugaa gacugugcac acuggaaaga agcuaaaaug 6000 cuccuagaua acaucaacac gccagaagga aucauuccua gcauguucga accagagcgu 6060 gaaaaggugg augccauuga uggcgaauac cgcuugagag gagaagcaag gaaaaccuuu 6120 guagacuuaa ugagaagagg agaccuacca gucugguugg ccuacagagu ggcagcugaa 6180 ggcaucaacu acgcagacag aagguggugu uuugauggag ucaagaacaa ccaaauccua 6240 gaagaaaacg uggaaguuga aaucuggaca aaagaagggg aaaggaagaa auugaaaccc 6300 agaugguugg augcuaggau cuauucugac ccacuggcgc uaaaagaauu uaaggaauuu 6360 gcagccggaa gaaagucucu gacccugaac cuaaucacag aaauggguag gcucccaacc 6420 uucaugacuc agaaggcaag agacgcacug gacaacuuag cagugcugca cacggcugag 6480 gcagguggaa gggcguacaa ccaugcucuc agugaacugc cggagacccu ggagacauug 6540 cuuuuacuga cacuucuggc uacagucacg ggagggaucu uuuuauucuu gaugagcgca 6600 aggggcauag ggaagaugac ccugggaaug ugcugcauaa ucacggcuag cauccuccua 6660 ugguacgcac aaauacagcc acacuggaua gcagcuucaa uaauacugga guuuuuucuc 6720 auaguuuugc uuauuccaga accugaaaaa cagagaacac cccaagacaa ccaacugacc 6780 uacguuguca uagccauccu cacaguggug gccgcaacca uggcaaacga gauggguuuc 6840 cuagaaaaaa cgaagaaaga ucucggauug ggaagcauug caacccagca acccgagagc 6900 aacauccugg acauagaucu acguccugca ucagcaugga cgcuguaugc cguggccaca 6960 acauuuguua caccaauguu gagacauagc auugaaaauu ccucagugaa ugugucccua 7020 acagcuauag ccaaccaagc cacaguguua augggucucg ggaaaggaug gccauuguca 7080 aagauggaca ucggaguucc ccuucucgcc auuggaugcu acucacaagu caaccccaua 7140 acucucacag cagcucuuuu cuuauuggua gcacauuaug ccaucauagg gccaggacuc 7200 caagcaaaag caaccagaga agcucagaaa agagcagcgg cgggcaucau gaaaaaccca 7260 acugucgaug gaauaacagu gauugaccua gauccaauac cuuaugaucc aaaguuugaa 7320 aagcaguugg gacaaguaau gcuccuaguc cucugcguga cucaaguauu gaugaugagg 7380 acuacauggg cucuguguga ggcuuuaacc uuagcuaccg ggcccaucuc cacauugugg 7440 gaaggaaauc cagggagguu uuggaacacu accauugcgg ugucaauggc uaacauuuuu 7500 agagggaguu acuuggccgg agcuggacuu cucuuuucua uuaugaagaa cacaaccaac 7560 acaagaaggg gaacuggcaa cauaggagag acgcuuggag agaaauggaa aagccgauug 7620 aacgcauugg gaaaaaguga auuccagauc uacaagaaaa guggaaucca ggaaguggau 7680 agaaccuuag caaaagaagg cauuaaaaga ggagaaacgg accaucacgc ugugucgcga 7740 ggcucagcaa aacugagaug guucguugag agaaacaugg ucacaccaga agggaaagua 7800 guggaccucg guuguggcag aggaggcugg ucauacuauu guggaggacu aaagaaugua 7860 agagaaguca aaggccuaac aaaaggagga ccaggacacg aagaacccau ccccauguca 7920 acauaugggu ggaaucuagu gcgucuucaa aguggaguug acguuuucuu caucccgcca 7980 gaaaagugug acacauuauu gugugacaua ggggagucau caccaaaucc cacaguggaa 8040 gcaggacgaa cacucagagu ccuuaacuua guagaaaauu gguugaacaa caacacucaa 8100 uuuugcauaa agguucucaa cccauauaug cccucaguca uagaaaaaau ggaagcacua 8160 caaaggaaau auggaggagc cuuagugagg aauccacucu cacgaaacuc cacacaugag 8220 auguacuggg uauccaaugc uuccgggaac auagugucau cagugaacau gauuucaagg 8280 auguugauca acagauuuac aaugagauac aagaaagcca cuuacgagcc ggauguugac 8340 cucggaagcg gaacccguaa caucgggauu gaaagugaga uaccaaaccu agauauaauu 8400 gggaaaagaa uagaaaaaau aaagcaagag caugaaacau cauggcacua ugaccaagac 8460 cacccauaca aaacgugggc auaccauggu agcuaugaaa caaaacagac uggaucagca 8520 ucauccaugg ucaacggagu ggucaggcug cugacaaaac cuugggacgu uguccccaug 8580 gugacacaga uggcaaugac agacacgacu ccauuuggac aacagcgcgu uuuuaaagag 8640 aaaguggaca cgagaaccca agaaccgaaa gaaggcacga agaaacuaau gaaaauaaca 8700 gcagaguggc uuuggaaaga auuagggaag aaaaagacac ccaggaugug caccagagaa 8760 gaauucacaa gaaaggugag aagcaaugca gccuuggggg ccauauucac ugaugagaac 8820 aaguggaagu cggcacguga ggcuguugaa gauaguaggu uuugggagcu gguugacaag 8880 gaaaggaauc uccaucuuga aggaaagugu gaaacaugug uguacaacau gaugggaaaa 8940 agagagaaga agcuagggga auucggcaag gcaaaaggca gcagagccau augguacaug 9000 uggcuuggag cacgcuucuu agaguuugaa gcccuaggau ucuuaaauga agaucacugg 9060 uucuccagag agaacucccu gaguggagug gaaggagaag ggcugcacaa gcuagguuac 9120 auucuaagag acgugagcaa gaaagaggga ggagcaaugu augccgauga caccgcagga 9180 ugggauacaa aaaucacacu agaagaccua aaaaaugaag agaugguaac aaaccacaug 9240 gaaggagaac acaagaaacu agccgaggcc auuuucaaac uaacguacca aaacaaggug 9300 gugcgugugc aaagaccaac accaagaggc acaguaaugg acaucauauc gagaagagac 9360 caaagaggua guggacaagu uggcaccuau ggacucaaua cuuucaccaa uauggaagcc 9420 caacuaauca gacagaugga gggagaagga gucuuuaaaa gcauucagca ccuaacaauc 9480 acagaagaaa ucgcugugca aaacugguua gcaagagugg ggcgcgaaag guuaucaaga 9540 auggccauca guggagauga uuguguugug aaaccuuuag augacagguu cgcaagcgcu 9600 uuaacagcuc uaaaugacau gggaaagauu aggaaagaca uacaacaaug ggaaccuuca 9660 agaggaugga augauuggac acaagugccc uucuguucac accauuucca ugaguuaauc 9720 augaaagacg gucgcguacu cguuguucca uguagaaacc aagaugaacu gauuggcaga 9780 gcccgaaucu cccaaggagc aggguggucu uugcgggaga cggccuguuu ggggaagucu 9840 uacgcccaaa uguggagcuu gauguacuuc cacagacgcg accucaggcu ggcggcaaau 9900 gcuauuugcu cggcaguacc aucacauugg guuccaacaa gucgaacaac cugguccaua 9960 caugcuaaac augaauggau gacaacggaa gacaugcuga cagucuggaa cagggugugg 10020 auucaagaaa acccauggau ggaagacaaa acuccagugg aaacauggga ggaaauccca 10080 uacuugggga aaagagaaga ccaauggugc ggcucauuga uuggguuaac aagcagggcc 10140 accugggcaa agaacaucca agcagcaaua aaucaaguua gaucccuuau aggcaaugaa 10200 gaauacacag auuacaugcc auccaugaaa agauucagaa gagaagagga agaagcagga 10260 guucuguggu agaaagcaaa acuaacauga aacaaggcua gaagucaggu cggauuaagc 10320 cauaguacgg aaaaaacuau gcuaccugug agccccgucc aaggacguua aaagaaguca 10380 ggccaucaua aaugccauag cuugaguaaa cuaugcagcc uguagcucca ccugagaagg 10440 uguaaaaaau ccgggaggcc acaaaccaug gaagcuguac gcauggcgua guggacuagc 10500 gguuagggga gaccccuccc uuacaaaucg cagcaacaau gggggcccaa ggcgagauga 10560 agcuguaguc ucgcuggaag gacuagaggu uagaggagac ccccccgaaa caaaaaacag 10620 cauauugacg cugggaaaga ccagagaucc ugcugucucc ucagcaucau uccaggcaca 10680 gaacgccaga aaauggaaug gugcuguuga aucaacaggu ucu 10723 <210> 25 <211> 1983 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> prM+E VDV2 <400> 25 uuccauuuaa ccacacguaa cggagaacca cacaugaucg ucagcagaca agagaaaggg 60 aaaagucuuc uguuuaaaac agagguuggc gugaacaugu guacccucau ggccauggac 120 cuuggugaau ugugugaaga cacaaucacg uacaaguguc cccuucucag gcagaaugag 180 ccagaagaca uagacuguug gugcaacucu acguccacgu ggguaacuua ugggacgugu 240 accaccaugg gagaacauag aagagaaaaa agaucagugg cacucguucc acaugugcga 300 augggacugg agacacgaac ugaaacaugg augucaucag aaggggccug gaaacauguc 360 cagagaauug aaacuuggau cuugagacau ccaggcuuca ccaugauggc agcaauccug 420 gcauacacca uaggaacgac acauuuccaa agagcccuga uuuucaucuu acugacagcu 480 gucacuccuu caaugacaau gcguugcaua ggaaugucaa auagagacuu uguggaaggg 540 guuucaggag gaagcugggu ugacauaguc uuagaacaug gaagcugugu gacgacgaug 600 gcaaaaaaca aaccaacauu ggauuuugaa cugauaaaaa cagaagccaa acagccugcc 660 acccuaagga aguacuguau agaggcaaag cuaaccaaca caacaacaga aucucgcugc 720 ccaacacaag gggaacccag ccuaaaugaa gagcaggaca aaagguucgu cugcaaacac 780 uccaugguag acagaggaug gggaaaugga uguggacuau uuggaaaggg aggcauugug 840 accugugcua uguucagaug caaaaagaac auggaaggaa aaguugugca accagaaaac 900 uuggaauaca ccauugugau aacaccucac ucaggggaag agcaugcagu cggaaaugac 960 acaggaaaac auggcaagga aaucaaaaua acaccacaga guuccaucac agaagcagaa 1020 uugacagguu auggcacugu cacaauggag ugcucuccaa gaacgggccu cgacuucaau 1080 gagauggugu ugcugcagau ggaaaauaaa gcuuggcugg ugcacaggca augguuccua 1140 gaccugccgu uaccaugguu gcccggagcg gacacacaag agucaaauug gauacagaag 1200 gagacauugg ucacuuucaa aaauccccau gcgaagaaac aggauguugu uguuuuagga 1260 ucccaagaag gggccaugca cacagcacuu acaggggcca cagaaaucca aaugucauca 1320 ggaaacuuac ucuucacagg acaucucaag ugcaggcuga gaauggacaa gcuacagcuc 1380 aaaggaaugu cauacucuau gugcacagga aaguuuaaag uugugaagga aauagcagaa 1440 acacaacaug gaacaauagu uaucagagug caauaugaag gggacggcuc uccaugcaag 1500 aucccuuuug agauaaugga uuuggaaaaa agacaugucu uaggucgccu gauuacaguc 1560 aacccaauug ugacagaaaa agauagccca gucaacauag aagcagaacc uccauuugga 1620 gacagcuaca ucaucauagg aguagagccg ggacaacuga agcucaacug guuuaagaaa 1680 ggaaguucua ucggccaaau guuugagaca acaaugaggg gggcgaagag aauggccauu 1740 uuaggugaca cagccuggga uuuuggaucc uugggaggag uguuuacauc uauaggaaag 1800 gcucuccacc aagucuuugg agcaaucuau ggagcugccu ucaguggggu uucauggacu 1860 augaaaaucc ucauaggagu cauuaucaca uggauaggaa ugaauucacg cagcaccuca 1920 cugucuguga cacuaguauu ggugggaauu gugacacugu auuugggagu cauggugcag 1980 gcc 1983 <210> 26 <211> 495 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E VDV2 <400> 26 Met Arg Cys Ile Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr 35 40 45 Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Cys Ile Glu Ala Lys 50 55 60 Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro 65 70 75 80 Ser Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Val Cys Lys His Ser Met 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly 100 105 110 Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Arg Cys Lys Lys Asn Met Glu Gly Lys 115 120 125 Val Val Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Ile Val Ile Thr Pro His 130 135 140 Ser Gly Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys 145 150 155 160 Glu Ile Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr 165 170 175 Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp 180 185 190 Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Gln Met Glu Asn Lys Ala Trp Leu Val 195 200 205 His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala 210 215 220 Asp Thr Gln Glu Ser Asn Trp Ile Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe 225 230 235 240 Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Met 260 265 270 Ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg 275 280 285 Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly 290 295 300 Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile 305 310 315 320 Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro 325 330 335 Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile 340 345 350 Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu 355 360 365 Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro 370 375 380 Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln 385 390 395 400 Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly 405 410 415 Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Leu Gly Gly Val Phe Thr Ser Ile 420 425 430 Gly Lys Ala Leu His Gln Val Phe Gly Ala Ile Tyr Gly Ala Ala Phe 435 440 445 Ser Gly Val Ser Trp Thr Met Lys Ile Leu Ile Gly Val Ile Ile Thr 450 455 460 Trp Ile Gly Met Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser Val Thr Leu Val 465 470 475 480 Leu Val Gly Ile Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val Met Val Gln Ala 485 490 495 <210> 27 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M VDV2 <400> 27 Ser Val Ala Leu Val Pro His Val Arg Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr 1 5 10 15 Glu Thr Trp Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Val Gln Arg Ile 20 25 30 Glu Thr Trp Ile Leu Arg His Pro Gly Phe Thr Met Met Ala Ala Ile 35 40 45 Leu Ala Tyr Thr Ile Gly Thr Thr His Phe Gln Arg Ala Leu Ile Phe 50 55 60 Ile Leu Leu Thr Ala Val Thr Pro Ser Met Thr 65 70 75

Claims (21)

  1. 인간 개체에서 뎅기열 질환을 예방하는 방법에 사용하기 위한 백신 조성물로서,
    상기 조성물은 혈청형 1의 뎅기열 항원, 혈청형 2의 뎅기열 항원, 혈청형 3의 뎅기열 항원 및 혈청형 4의 뎅기열 항원을 포함하고,
    상기 뎅기열 항원은 각각 독립적으로 약독화된 생 뎅기열 바이러스 또는 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스로부터 선택되는,
    백신 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혈청형 1의 뎅기열 항원, 혈청형 3의 뎅기열 항원, 및 혈청형 4의 뎅기열 항원은 약독화된 생 키메라 뎅기열 바이러스이고, 상기 혈청형 2의 뎅기열 항원은 약독화된 생 뎅기열 바이러스인, 백신 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인간 개체는 뎅기열 면역 개체이고, 상기 백신 조성물을 투여하기 전에 뎅기열 바이러스에 감염되거나 뎅기열 백신으로 면역화된 적이 있는 개체인, 백신 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 방법은 뎅기열 바이러스에 노출된 인간 개체에서 뎅기열 질환이 발병될 가능성을 통계적으로 유의한 수준으로 감소시키는 방법인, 백신 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 뎅기열 질환은 중증 뎅기열 질환인, 백신 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 인간은 9-45세인, 백신 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 개체는 뎅기열 유행 지역에 거주하는, 백신 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 뎅기열 질환은 혈청형 1의 뎅기열 바이러스, 혈청형 3의 뎅기열 바이러스, 또는 혈청형 4의 뎅기열 바이러스에 의해 유발되는, 백신 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 방법은 상기 조성물을 다회 투여로 투여하는 단계를 포함하는, 백신 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 방법은 상기 조성물을 1차 투여 및 2차 투여로 투여하는 단계를 포함하고, 상기 2차 투여는 상기 1차 투여 후 6개월 시점에 투여하는, 백신 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 방법은 상기 조성물을 1차 투여, 2차 투여 및 3차 투여로 투여하는 단계를 포함하고, 상기 2차 투여는 상기 1차 투여 후 6개월 시점에 투여하며, 상기 3차 투여는 상기 1차 투여 후 12개월 시점에 투여하는, 백신 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 키메라 뎅기열 바이러스는 한 뎅기열 바이러스로부터 유래되는 하나 이상의 단백질 및 다른 플라비바이러스로부터 유래되는 하나 이상의 단백질을 포함하는, 백신 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 키메라 뎅기열 바이러스는 한가지 혈청형의 뎅기열 바이러스로부터 유래되는 하나 이상의 단백질 및 다른 혈청형의 뎅기열 바이러스로부터 유래되는 하나 이상의 단백질을 포함하는, 백신 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 다른 플라비바이러스는 황열 바이러스인, 백신 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 키메라 뎅기열 바이러스는 뎅기열 바이러스의 prM-E 서열을 포함하는, 백신 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 키메라 뎅기열 바이러스는 황열 바이러스의 prM-E 서열이 뎅기열 바이러스의 prM-E 서열로 치환된 황열 바이러스 게놈을 포함하는, 백신 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 키메라 뎅기열 바이러스는 제1 뎅기열 바이러스의 prM-E 서열이 제2 뎅기열 바이러스의 prM-E 서열로 치환된 제1 뎅기열 바이러스 게놈을 포함하는, 백신 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 동결건조된, 백신 조성물.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 백신 조성물.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 조성물 유효량을 첨가하는 단계를 포함하는, 인간 개체를 뎅기열 질환으로부터 예방하는 약제의 제조 방법.
  21. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 조성물, 및
    상기 조성물을 인간 개체에서 뎅기열 질환 예방 방법에 사용하기 위한 설명서
    를 포함하는, 키트.
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