CN106754380A - 一株cdpk2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株及其制备方法 - Google Patents

一株cdpk2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株，所述的CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株为LZ△CDPK2，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201655；并提供了其制备方法。本发明的有益效果为：本发明提供的一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株及其制备方法，是建立在分子生物学基础上，基于CRISPR/Cas9基因敲除技术，构建的基因缺失虫株，虫株具有不形成包囊的生物学特性，是具有巨大应用价值的虫株，可作为减毒活疫苗的候选虫株。

Description

一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株及其制备方法
技术领域
本发明涉及弓形虫弱毒虫株技术领域，具体涉及一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株及其制备方法。
背景技术
弓形虫病（Toxoplasmosis）是由弓形虫引起的一种人兽共患寄生虫病。全球约有三分之一的人口受其感染，弓形虫可以感染几乎所有的温血动物、传染性强、流行范围大、宿主谱广，目前尚无疫苗可用，因而防治该病的难度极大，对防治技术的要求很高。鉴于药物治疗弓形虫病能力有限且毒副作用大的特点，研制其疫苗已逐渐成为防控弓形虫病势在必行的重大任务。目前，抗弓形虫疫苗的类型主要包括全虫（灭）活疫苗、虫体特异组分疫苗、亚单位疫苗、病毒等活载体疫苗和蛋白及核酸疫苗等，然而大多数疫苗均不是很理想，为了增强免疫效果，提高免疫保护率，减毒活疫苗的疫苗研制将成为一个重要的研究课题。在弓形虫中，Ca2+浓度的变化调控着下游的效应分子，影响着寄生虫入侵、外出宿主细胞、在宿主体内移行等多个重要过程。钙依赖蛋白激酶（Calcium-dependent proteinkinases，CDPKs）就是接收并传导这种Ca2+信号的效应分子之一。CDPKs是一种丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，活性直接受Ca2+的调控而不依赖于钙调素（CaMs）和磷脂弓形虫是较病毒和细菌更为高等的生物。在弓形虫中发现的CDPKs调控虫体入侵细胞、蛋白分泌、运动和分化等许多生理反应。现已证实的弓形虫CDPKs家族成员有13个，不同的家族成员具有不同的生物学功能，研究的较为透彻的是CDPK1、CDPK3、CDPK7等他们在黏附和入侵宿主细胞的功能、弓形虫在宿主体内移行以及弓形虫入侵宿主细胞后其在胞内的分裂增殖等方面具有重要的作用。因此构建CDPK家族基因缺失的弓形虫虫株将有望筛选到具有潜在应用价值的减毒活疫苗虫株。目前国际上仅有的能上市的弓形虫减毒活疫苗是S48，但是它仅限于对山羊和绵羊的应用。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株，所述的CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株为LZ△CDPK2(Toxoplasma gondilLZ △CDPK2)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年11月14日，保藏地址为：武汉武汉大学，邮编430072，保藏编号为CCTCC NO：V201655。
本发明的第二个目的是提供了上述一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株的制备方法，包括以下步骤：
A）pSAG1::Cas9-U6:: sgCDPK2质粒构建：
1）利用网页软件设计CDPK2的sgRNA为GACGACTCCGGGTCCGACAC；
2）利用Q5定点突变试剂盒和扩增引物，以CDPK2的sgRNA替换pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT载体中的sgUPRT，构建成pSAG1::Cas9-U6:: sgCDPK2，扩增引物为gRNA-Fw:GACGACTCCGGGTCCGA CACGTTTTAGAGCTAGAAATAGC和gRNA-Rv: AACTTGACATCCCCATTTAC；
3）PCR过程为：以pSAG1::Cas9-U6:: sgUPRT为模板，利用引物gRNA-Fw和gRNA-Rv进行pSAG1::Cas9-U6:: sgCDPK2载体的PCR扩增，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃复性1min；72℃延伸 5min；25个循环；
4）KLD反应：反应体系为PCR产物1μl，2X KLD Reaction Buffer 5μl，10X KLD Enzymemix 1μl，ddH2O 3μl；在室温25度下反应5分钟；
5）转化：将上述KLD反应产物转化到大肠杆菌DH5α中，挑取若干单菌落，提取质粒，测序鉴定，测序正确的标记为pSAG1::Cas9-U6:: sgCDPK2；
B）质粒大提：
1）挑取含pSAG1::Cas9-U6:: sgCDPK2质粒的阳性菌液于含1000U/mL Amp+的LB固体选择培养基上划线，37℃培养过夜，挑取板上的一个单菌落置于4 mL LB液体选择培养基中，摇床37℃，180～220rpm培养12～16h，将上述培养菌液以1：100的比例接种到装有100mL LB培养基的500mL锥形瓶中，摇床37℃，180～220rpm培养过夜；
2）将细菌培养物置于冰中或4℃冰箱3-5分钟；4℃，9500rpm离心5min，收集细菌培养物沉淀，弃上清，倒置离心管使上清尽量流出，10mL预冷的Solution I重悬菌体，旋涡振荡，使细菌在Solution I中完全分散；
3）加入20mL新配制的Solution II，轻摇并上下颠倒混匀3～5次，再加入15mL预冷的Solution III，立即轻摇混匀，以免产生局部沉淀，冰上或-20℃冰箱放置10min，加Solution II和Solution III的时间间隔控制在5min以内，以免过分裂解；4℃或室温，11000rpm离心10min，利用5层纱布将上清过滤，转移到两个新50mL离心管中；
4）上清与0.6倍体积异丙醇混匀，室温放置10min；室温下，11000rpm离心10min，弃上清，将空管倒置于滤纸上3-5分钟，除去残余，加入3mL ddH2O充分溶解，再加入3mL预冷的5MLiCl溶液，充分混匀，两只离心管合并为一管，冰中或-20℃冰箱放置10min；4℃或室温，11000rpm离心10min，将上清分别转移到一新50mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，充分混匀，室温放置10min；4℃或室温，11000rpm离心10min，弃上清，倒置控干管内液体，倒置10～15min即可，此时管壁会出现白色沉淀物即质粒；
5）加入3mL ddH2O或pH8.0的TE溶液溶解沉淀，并加入30μL 10mg/mL的RNase A，37℃水浴1h除去RNA，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAc溶液，充分混匀，冰中或-20℃冰箱放置20min；4℃，11000rpm离心10min，将上清吸出，并将离心管倒置于滤纸上控干，加入100μL ddH2O或pH8.0的TE溶液，充分洗脱质粒沉淀，利用分光光度计测量所得质粒的浓度并记录，分装封口后于-20℃保存备用；
C）DHFR-Ts* 抗性Marker的扩增：
1）利用引物DHFR-Fv：AAGCTTCGCCAGGCTGTAAA 和DHFR-Rv：GGAATTCATCCTGCAAGTGCATAG 扩增DHFR-Ts* 抗性基因，反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃复性30 sec；72℃延伸 3min30sec；30个循环；
2）使用OMEGA普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段，利用分光光度计测量所得PCR产物的浓度并记录，分装封口后于-20℃保存备用；
D）弓形虫电击转染及获取阳性单克隆：
1）将Ⅱ型虫株PRU接种于75T HFF细胞中，当虫子裂解细胞75%时，用细胞刮子将虫体刮起，过22G的针头3-5次释放细胞内的虫子；
2）利用3.0μm的滤器过滤上述虫子去除细胞碎片，然后400g×10 min离心取沉淀，利用HBSS buffer重悬，再400g×10 min离心取沉淀，然后用Cytomix buffer重悬虫子使其浓度达到4×107个/ml，Cytomix buffer配比为：120 mM KCl，0.15 mM CaCl2，10 mM K2HPO4/KH2PO4，25 mM HEPES，2 mM EDTA，5 mM MgCl2，pH 7.6；
3）转染体系包括：PRU 虫子Cytomix 混合液250μl，DHFR-Ts* 抗性基因片段1.5μg，pSAG1::Cas9-U6:: sgCDPK2载体7.5μg，0.2M、100×的ATP 3μl，0.5M、100×的谷胱甘肽3μl，Cytomix共300μl，将转染体系转移到4mm电击杯利用BTX ECM-830电转仪进行电转，电转程序为：电压1700 V, 电击时间176 μs ，电击两次，中间间隔100 ms，然后将电转的虫子转移到25T HFF细胞中；
4）在37℃，5% CO2温箱培养48h后，加入3μM的乙胺嘧啶，经过7-10天发现耐药性虫子；
5）利用有限稀释法进行耐药虫株的筛选，将耐药性的虫子按照5-10个每孔接种于96孔板，在37℃，5% CO2温箱培养7-10天，显微镜下观察虫斑，选取每孔仅有1个虫斑的接种到24孔板中扩大培养；
6）重复步骤5）的有限稀释法，对虫株进行单克隆化，得到纯度为100%的遗传背景相同的虫株若干株；
7）将步骤6）得到的纯化的虫株接种到24孔板中扩大培养，培养的虫子吸取一部分到1.5ml的离心管中，提取该虫株的基因组；
8）PCR鉴定阳性虫株，将缺失株及野生虫株的基因组同时采用用下列引物： KO-CDPK2-F: TCTACAAGCACGCAGAAAGGA 和R: CGAACCGGAAGTTACCACGAC进行扩增；反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性1min， 55℃复性30 sec；72℃延伸 1min；30个循环；通过电泳检测扩增产物，检测野生株和突变株；
9）将对应的阳性克隆从24孔中接种到25T HFF 中扩大培养，并冻存到液氮中长期保存。
缺失的CDPK2基因核苷酸序列如序列表中SEQ No.1和图3所示。
本发明的有益效果为：本发明提供的一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株及其制备方法，是建立在分子生物学基础上，基于CRISPR/Cas9基因敲除技术，构建的基因缺失虫株，虫株具有毒性减弱、不形成包囊的生物学特性，是具有巨大应用价值的虫株，可作为减毒活疫苗的候选虫株。
附图说明
图1显示为缺失株的构建流程。
图2显示为突变株的PCR鉴定结果。
图3显示为缺失的CDPK2基因核苷酸序列。
具体实施方式
实施例1：
一、pSAG1::Cas9-U6:: sgCDPK2质粒构建：
1、利用网页软件设计CDPK2的sgRNA为GACGACTCCGGGTCCGACAC。
2、利用Q5定点突变试剂盒 (NEB) 和扩增引物（gRNA-Fw: GACGACTCCGGGTCCGACACGTTTTAGAGCTAGAAATAGC和gRNA-Rv: AACTTGACATCCCCATTTAC）将CDPK2的sgRNA替换pSAG1::Cas9-U6:: sgUPRT载体中sgUPRT构建成pSAG1::Cas9-U6:: sgCDPK2。
3、PCR条件为:以pSAG1::Cas9-U6:: sgUPRT为模板，利用引物gRNA-Fw和gRNA-Rv进行pSAG1::Cas9-U6:: sgCDPK2载体的PCR扩增。反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min， 55℃复性1min；72℃延伸 5min；25个循环。
4、KLD反应。反应体系为PCR产物1μl，2X KLD Reaction Buffer 5μl，10X KLDEnzyme mix 1μl，ddH2O 3μl；在室温25度下反应5分钟。
5、转化。将上述2.2中的反应产物转化到大肠杆菌DH5α中，挑取若干单菌落，提取质粒，测序鉴定。测序正确的标记为pSAG1::Cas9-U6:: sgCDPK2。
二、质粒大提：
1、挑取含pSAG1::Cas9-U6:: sgCDPK2质粒的阳性菌液于LB（含1000U/mL Amp+，下同）固体选择培养基上划线，37℃培养过夜。挑取板上的一个单菌落置于4 mL LB液体选择培养基中，摇床37℃，180～220rpm培养12～16h。将上述培养菌液以1：100的比例接种到装有100mL LB培养基的500mL锥形瓶中，摇床37℃，180～220rpm培养过夜。
2、将细菌培养物置于冰中或4℃冰箱数分钟，4℃，9500rpm离心5min，收集细菌培养物沉淀，弃上清，倒置离心管使上清尽量流出。10mL预冷的Solution I重悬菌体，旋涡振荡，使细菌在Solution I中完全分散。
3、加入20mL新配制的Solution II，轻摇并上下颠倒混匀3～5次。再加入15mL预冷的Solution III，立即轻摇混匀，以免产生局部沉淀。冰上或-20℃冰箱放置10min。加Solution II和Solution III的时间间隔控制在5min以内，以免过分裂解。4℃或室温，11000rpm离心10min，利用5层纱布将上清过滤，转移到两个新50mL离心管中。
4、上清与0.6倍体积异丙醇（15mL）混匀，室温放置10min。室温下，11000rpm离心10min，弃上清，将空管倒置于滤纸上数分钟数分钟，除去残余。加入3mL ddH2O充分溶解（很重要），再加入3mL预冷的5M LiCl溶液，充分混匀（不可吹打）。两只离心管合并为一管，冰中或-20℃冰箱放置10min。4℃或室温，11000rpm离心10min，将上清分别转移到一新50mL离心管中，加入等体积（12mL）预冷的异丙醇，充分混匀，室温放置10min。4℃或室温，11000rpm离心10min，小心弃上清，倒置控干管内液体，一般倒置10～15min即可。此时管壁会出现白色沉淀物即质粒。
5、加入3mL ddH2O或TE溶液（pH8.0）溶解沉淀，并加入30μL 10mg/mL RNase A，37℃水浴1h除去RNA。加入2倍体积（8mL）无水乙醇和1/10体积（300μL）3M NaAc溶液，充分混匀，冰中或-20℃冰箱放置20min。4℃，11000rpm离心10min，小心将上清吸出（勿倒），并将离心管倒置于滤纸上控干（非常重要）。加入100μL ddH2O或TE溶液（pH8.0），充分洗脱质粒沉淀。利用分光光度计测量所得质粒的浓度并记录，分装封口后于-20℃保存备用。
三、DHFR-Ts* 抗性Marker的扩增：
1、利用引物DHFR-Fv：AAGCTTCGCCAGGCTGTAAA 和DHFR-Rv：GGAATTCATCCTGCAAGTGCATAG 扩增DHFR-Ts* 抗性基因。反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性 1min，55℃复性30 sec；72℃延伸 3min30sec；30个循环。
2、按照OMEGA普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的使用说明回收目的片段。利用分光光度计测量所得PCR产物的浓度并记录，分装封口后于-20℃保存备用。
四、弓形虫电击转染及获取阳性单克隆：
1、将Ⅱ型虫株PRU接种于75T HFF细胞中，当虫子裂解细胞75%时，用细胞刮子将虫体刮起，过22G的针头3-5次释放细胞内的虫子。
2、利用3.0μm的滤器过滤上述虫子去除细胞碎片，然后400g×10 min离心取沉淀，然后利用HBSS buffer重悬，再400g×10 min离心取沉淀。然后用Cytomix buffer （120 mMKCl, 0.15 mM CaCl2 , 10 mM K2HPO4/KH2PO4, 25 mM HEPES, 2 mM EDTA, 5 mM MgCl1 ,pH 7.6）重悬虫子使其浓度达到4×107个/ml。
3、转染体系如表1所示，将转染体系转移到4mm电击杯利用BTX ECM-830电转仪进行电转，电转程序如下（1700 V, 176 μs of pulse length, two pulses with 100 msinterval），然后将电转的虫子转移到25T HFF细胞中。
表1
4、在37℃, 5 % CO2温箱培养48h后，加入3μM的乙胺嘧啶，大约经过7-10天发现耐药性虫子。
5、利用有限稀释法进行耐药虫株的筛选，将耐药性的虫子按照5-10个每孔接种于96孔板，在37℃, 5 % CO2温箱培养7-10天，在显微镜观察虫斑，选取每孔仅有1个虫斑的接种到24孔板中扩大培养。
6、重复第5步骤的有限稀释法，对虫株进行单克隆化，得到纯度为100%的遗传背景相同的虫株若干株。
7、将上述纯化的虫株接种到24孔板中扩大培养，培养的虫子吸取一部分到1.5ml的离心管中，提取该虫株的基因组，根据弓形虫PRU株DNA提取的具体方法，具体步骤参照Promega公司试剂盒Wizard® SV Genomic DNA Purification System使用说明进行。
8、PCR鉴定阳性虫株。将缺失株及野生虫株的基因组同时采用用下列引物： KO-CDPK2-F: TCTACAAGCACGCAGAAAGGA 和R: CGAACCGGAAGTTACCACGAC进行扩增。反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性 1min， 55℃复性30 sec；72℃延伸 1min；30个循环。通过电泳检测扩增产物，检测突变株是否构建成功，如图1所示：野生株能够扩增出条带，缺失株没有条带。
9、将对应的阳性克隆从24孔中接种到25T HFF 中扩大培养，并冻存到液氮中长期保存。
五、毒力检测与包囊形成情况检测：
1、选用野生虫株及缺失虫株LZ△CDPK2进行毒力检测，分别采用野生虫株、缺失虫株；采用10、100、200、500个虫子四种不同的剂量对BABL/c小鼠进行攻毒实验，每组10只小鼠，观察小鼠的发病及死亡情况。结果表明在10、100、200、500 这四种剂量下缺失株不能造成小鼠的死亡。
2、选用野生虫株及缺失虫株LZ△CDPK2进行包囊形成情况检测，分别采用野生虫株、缺失虫株；采用500个虫子的剂量对BABL/c小鼠进行攻毒实验，每组10只小鼠，观察小鼠脑部包囊的情况。缺失株看不到包囊的形成，而野生株有包囊形成。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序 列 表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株及其制备方法
<210> 1
<211> 3672
<212> DNA
<213> 缺失的CDPK2基因核苷酸序列
<400> 1
atgccgctca agacttcctg gcattgttcg tgcaacgcca cctttccagg tgacttgctc 60
atggttgttg ctaaccacga tcgcgtgggc aactggaatc ctcagaactc ggtggttctt 120
tcgacagacg catcctcttt cccgacatgg cgctctggcg aggtctgctt cgacgagcag 180
cagcccgtcc ggctcgagta caagctgatt attcgccgcg cctcaggaga aatttactgg 240
gagccgattc ccaccaaccg cgtagtcacg ctgactgcga atacgtcctc agtcatcgaa 300
aacgtttggg gttcgctggc cacttgctcc atcaccttct tcccgctgca gccgattccg 360
tccccgtcct tctacaagca cgcagaaagg acgaagaaag aggccagttc cgtccatctg 420
cactccgcct ccatttccga cgactccggg tccgacactg ggacatgttc acaggtcgac 480
gaatcgcgaa cgcaacgcaa cgtccgcgga cagcctgcct ccgtggggac ggggaaggcc 540
acagccgccg agagaggcgg caaaggatac gtcatgccgc atcaccagtg cagcaccagc 600
cagagacgcc actccatcag tacgcaagct gcggacgaag cggccggcgg agggaatcgc 660
gtttccttca aacgctccgc cttcattttg gccaacactg gtcccatcac aaactactac 720
acagtctcaa agacaattgg tacggtgttc gctgatctga aaagaaagct gcacaacgtg 780
ccggcttcgt cgtggtaact tccggttcga acgtggcgac gcggctgtat gtacacccgc 840
cttttttctg cttccaaggc gccgaaaggc tgaaagtgtt aggacatgtg gtgtaagatt 900
gctgcgcagc cgcgccaaga cttttggctg ggaagggggt gcatgccgcc gtcgtatgtt 960
tttcggtata tgccccgggg tcacgtctgc cttacctgaa taagaagttg cgtgtcgtgt 1020
gagaagttcg tcgcgttttt gggaactgca gagtctgaga tcacaccaga accgaagggt 1080
ttggaaaagg tgaaagactt agaaactcta gaagaaacac ggagacacaa gtggtgacgg 1140
atctgagccc agcggtcttg tcgatctttc tgcgtttttc cgagcagggc gtggcacctg 1200
gggagaagtg aagctggtca ttgacaacgg gaccggagcg cgtcgcgcgg cgaagaagat 1260
tcccaagtgt tacgttgaag acgccgaccg ttttcgtcag gaaatcgaga tcatgaagag 1320
cctcgaccac ccaaacattg tgcggctcta cgagactttc gaggatatga cggacttcta 1380
cctggtgatg gagtactgca ctgggggcga gctctttgat cgcttggttc accagggtgt 1440
cttcacagag gctctggcct gccgcatcat gcggcagatt ctcgcagctg ttgcttattg 1500
ccatgcccac cgcgtcgccc accgagacct gaagccggag aacttcctgt ttttgcatga 1560
caaccccgaa tctcccatca agctcatcga cttcggcctc gccgctcgtt tcaagcctgg 1620
acagcccatg aggacgagag ccgggacgcc ttactatgta tcgccgcagg tacagagcac 1680
agacaagaag tcaaatctcc ctctgttttt tctccaggct aggcgacgat taaatttcac 1740
tcgcccgatg ctgccatgtt tgtaatttag ggtcttcgtt aactcgacac atgttcgttg 1800
tgtttctcca ttctgcccat atatttatat acgtaagctg tttttgtcga tgtgtaagac 1860
cgtacatctt tcgtgtcttt taatcaagcg tatgtgtact ctgtggcgtt tgccgattga 1920
aatacggttc agcgctggcc tggtatctag ttctctctcc acgttgcaca cggtacgtcg 1980
ccagtcctct atggggatgc gtttgctgtg cccgcttttc ctggctcttc ataaaggctt 2040
ggacttcaca caaagaacgc atttcacata accaaaaaga attcggaaac tgctctgctc 2100
tgtgtgcgcc tgcaggtgct ggagggacgg tacggcccag agtgcgacgt ctggtccgcc 2160
ggagtcatga tgtacattct gctttgtggg tatcctccgt tcaatgcgcc gtcggacagg 2220
gcgattatga acaaagtgcg tgcgggacat tacaccttcc cagacagcga atggagtcga 2280
gtgtcactac aggccaagga tctcatctcg cgtcttcttg atcgccatcc gcgcactcga 2340
atcagtgccg agcaagcgct tcgacacgcc tggttcgcca tgcatgctcc gggagaccat 2400
tttgagcctc taggtgagac ccgaagtctt ttccgaggaa tttatgtcag gcggaagaac 2460
cctcgaaaga taactctcac acacatgctt atctttctgc gtagagatat gtataggtgg 2520
cttgtctttc tgagttgtgg catctcgagt gtagccactg gcggcgaagg tgggtcatcc 2580
gattttttgg atcgtcagtt acgcgggttg tccgcgtgta gagcggcatg cgttttttca 2640
aaagcaggtg acgagaaact cttgtttgtt tccacctccg caggcttgga cattttgagc 2700
aaatttcggc gattccaggg cttgagtcga ctgaagaagc tggctctgac ggttattgca 2760
cagcatttgg aggactcgga aatcgagggt ctcaagaact tgttcactca gctcgacacc 2820
gagggtgacg gtgtcctgac agtggaggaa attcgcaagg gcatcgagcg gagcggcgtc 2880
cacttacctc cggacatggt cctcgaagat gtcttgaggg aagtggacac cgctggcact 2940
ggaagcattg attacacaga gttcattgca gcttgcctcc accagtccca ctacatccga 3000
gaggaggcgt gtcgagctgc tttccgcgtg ctagatatca atggagacgg cctcgtcagg 3060
tgagttttca ggcgtatttc accagtcagc ttcacgccgg cagagaaagg gtgttgatgc 3120
agcttccatg tttcgattgc agacgccaga acatgtgtgt cagtttctat ctgtgagcag 3180
gggctgctcc ccggcttttt cgagagacgc gccgtcgcgt tctaccgctt cttttgaaca 3240
gtgaaaaagg gcatctgctg tatagacgca atcgtgtcag atcggatatt gatgcacaag 3300
cgtccccaga aagcacaact gatctagaca gagaccgcac attgccctta ccattcgtct 3360
tttcttgtgg aggtcacagc cagctgcgtt gacatgcatg cgggttccgc cctttttttg 3420
cgtgtgtgca gtgctcaaga actgcgccag gtgttccaca tggctggtga tttggagaca 3480
gacgcggcgg cggagttgct ggaggcagac gcggatggtg acgggcacat cactttcgat 3540
gagttttgcg gactcatgcg gaaggtgcct tcgctcgcct tggtcacgga gcacacagtg 3600
tcgatgatgc ggcgaacgtg ttcgcgcaca aacatcagcg aagccagtct gacgcctcgc 3660
gctacggggt aa 3672
序 列 表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株及其制备方法
<210> 1
<211> 3672
<212> DNA
<213> 缺失的CDPK2基因核苷酸序列
<400> 1
atgccgctca agacttcctg gcattgttcg tgcaacgcca cctttccagg tgacttgctc 60
atggttgttg ctaaccacga tcgcgtgggc aactggaatc ctcagaactc ggtggttctt 120
tcgacagacg catcctcttt cccgacatgg cgctctggcg aggtctgctt cgacgagcag 180
cagcccgtcc ggctcgagta caagctgatt attcgccgcg cctcaggaga aatttactgg 240
gagccgattc ccaccaaccg cgtagtcacg ctgactgcga atacgtcctc agtcatcgaa 300
aacgtttggg gttcgctggc cacttgctcc atcaccttct tcccgctgca gccgattccg 360
tccccgtcct tctacaagca cgcagaaagg acgaagaaag aggccagttc cgtccatctg 420
cactccgcct ccatttccga cgactccggg tccgacactg ggacatgttc acaggtcgac 480
gaatcgcgaa cgcaacgcaa cgtccgcgga cagcctgcct ccgtggggac ggggaaggcc 540
acagccgccg agagaggcgg caaaggatac gtcatgccgc atcaccagtg cagcaccagc 600
cagagacgcc actccatcag tacgcaagct gcggacgaag cggccggcgg agggaatcgc 660
gtttccttca aacgctccgc cttcattttg gccaacactg gtcccatcac aaactactac 720
acagtctcaa agacaattgg tacggtgttc gctgatctga aaagaaagct gcacaacgtg 780
ccggcttcgt cgtggtaact tccggttcga acgtggcgac gcggctgtat gtacacccgc 840
cttttttctg cttccaaggc gccgaaaggc tgaaagtgtt aggacatgtg gtgtaagatt 900
gctgcgcagc cgcgccaaga cttttggctg ggaagggggt gcatgccgcc gtcgtatgtt 960
tttcggtata tgccccgggg tcacgtctgc cttacctgaa taagaagttg cgtgtcgtgt 1020
gagaagttcg tcgcgttttt gggaactgca gagtctgaga tcacaccaga accgaagggt 1080
ttggaaaagg tgaaagactt agaaactcta gaagaaacac ggagacacaa gtggtgacgg 1140
atctgagccc agcggtcttg tcgatctttc tgcgtttttc cgagcagggc gtggcacctg 1200
gggagaagtg aagctggtca ttgacaacgg gaccggagcg cgtcgcgcgg cgaagaagat 1260
tcccaagtgt tacgttgaag acgccgaccg ttttcgtcag gaaatcgaga tcatgaagag 1320
cctcgaccac ccaaacattg tgcggctcta cgagactttc gaggatatga cggacttcta 1380
cctggtgatg gagtactgca ctgggggcga gctctttgat cgcttggttc accagggtgt 1440
cttcacagag gctctggcct gccgcatcat gcggcagatt ctcgcagctg ttgcttattg 1500
ccatgcccac cgcgtcgccc accgagacct gaagccggag aacttcctgt ttttgcatga 1560
caaccccgaa tctcccatca agctcatcga cttcggcctc gccgctcgtt tcaagcctgg 1620
acagcccatg aggacgagag ccgggacgcc ttactatgta tcgccgcagg tacagagcac 1680
agacaagaag tcaaatctcc ctctgttttt tctccaggct aggcgacgat taaatttcac 1740
tcgcccgatg ctgccatgtt tgtaatttag ggtcttcgtt aactcgacac atgttcgttg 1800
tgtttctcca ttctgcccat atatttatat acgtaagctg tttttgtcga tgtgtaagac 1860
cgtacatctt tcgtgtcttt taatcaagcg tatgtgtact ctgtggcgtt tgccgattga 1920
aatacggttc agcgctggcc tggtatctag ttctctctcc acgttgcaca cggtacgtcg 1980
ccagtcctct atggggatgc gtttgctgtg cccgcttttc ctggctcttc ataaaggctt 2040
ggacttcaca caaagaacgc atttcacata accaaaaaga attcggaaac tgctctgctc 2100
tgtgtgcgcc tgcaggtgct ggagggacgg tacggcccag agtgcgacgt ctggtccgcc 2160
ggagtcatga tgtacattct gctttgtggg tatcctccgt tcaatgcgcc gtcggacagg 2220
gcgattatga acaaagtgcg tgcgggacat tacaccttcc cagacagcga atggagtcga 2280
gtgtcactac aggccaagga tctcatctcg cgtcttcttg atcgccatcc gcgcactcga 2340
atcagtgccg agcaagcgct tcgacacgcc tggttcgcca tgcatgctcc gggagaccat 2400
tttgagcctc taggtgagac ccgaagtctt ttccgaggaa tttatgtcag gcggaagaac 2460
cctcgaaaga taactctcac acacatgctt atctttctgc gtagagatat gtataggtgg 2520
cttgtctttc tgagttgtgg catctcgagt gtagccactg gcggcgaagg tgggtcatcc 2580
gattttttgg atcgtcagtt acgcgggttg tccgcgtgta gagcggcatg cgttttttca 2640
aaagcaggtg acgagaaact cttgtttgtt tccacctccg caggcttgga cattttgagc 2700
aaatttcggc gattccaggg cttgagtcga ctgaagaagc tggctctgac ggttattgca 2760
cagcatttgg aggactcgga aatcgagggt ctcaagaact tgttcactca gctcgacacc 2820
gagggtgacg gtgtcctgac agtggaggaa attcgcaagg gcatcgagcg gagcggcgtc 2880
cacttacctc cggacatggt cctcgaagat gtcttgaggg aagtggacac cgctggcact 2940
ggaagcattg attacacaga gttcattgca gcttgcctcc accagtccca ctacatccga 3000
gaggaggcgt gtcgagctgc tttccgcgtg ctagatatca atggagacgg cctcgtcagg 3060
tgagttttca ggcgtatttc accagtcagc ttcacgccgg cagagaaagg gtgttgatgc 3120
agcttccatg tttcgattgc agacgccaga acatgtgtgt cagtttctat ctgtgagcag 3180
gggctgctcc ccggcttttt cgagagacgc gccgtcgcgt tctaccgctt cttttgaaca 3240
gtgaaaaagg gcatctgctg tatagacgca atcgtgtcag atcggatatt gatgcacaag 3300
cgtccccaga aagcacaact gatctagaca gagaccgcac attgccctta ccattcgtct 3360
tttcttgtgg aggtcacagc cagctgcgtt gacatgcatg cgggttccgc cctttttttg 3420
cgtgtgtgca gtgctcaaga actgcgccag gtgttccaca tggctggtga tttggagaca 3480
gacgcggcgg cggagttgct ggaggcagac gcggatggtg acgggcacat cactttcgat 3540
gagttttgcg gactcatgcg gaaggtgcct tcgctcgcct tggtcacgga gcacacagtg 3600
tcgatgatgc ggcgaacgtg ttcgcgcaca aacatcagcg aagccagtct gacgcctcgc 3660
gctacggggt aa 3672

Claims (2)

1.一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株，其特征在于，所述的CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株为LZ△CDPK2，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：V201655。
2.根据权利要求1所述的一株CDPK2基因缺失的弓形虫弱毒虫突变株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A）pSAG1::Cas9-U6:: sgCDPK2质粒构建：
1）利用网页软件设计CDPK2的sgRNA为GACGACTCCGGGTCCGACAC；
2）利用Q5定点突变试剂盒和扩增引物，以CDPK2的sgRNA替换pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT载体中的sgUPRT，构建成pSAG1::Cas9-U6:: sgCDPK2，扩增引物为gRNA-Fw:GACGACTCCGGGTCCGA CACGTTTTAGAGCTAGAAATAGC和gRNA-Rv: AACTTGACATCCCCATTTAC；
3）PCR过程为：以pSAG1::Cas9-U6:: sgUPRT为模板，利用引物gRNA-Fw和gRNA-Rv进行pSAG1::Cas9-U6:: sgCDPK2载体的PCR扩增，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃复性1min；72℃延伸 5min；25个循环；
4）KLD反应：反应体系为PCR产物1μl，2X KLD Reaction Buffer 5μl，10X KLD Enzymemix 1μl，ddH2O 3μl；在室温25度下反应5分钟；
5）转化：将上述KLD反应产物转化到大肠杆菌DH5α中，挑取若干单菌落，提取质粒，测序鉴定，测序正确的标记为pSAG1::Cas9-U6:: sgCDPK2；
B）质粒大提：
1）挑取含pSAG1::Cas9-U6:: sgCDPK2质粒的阳性菌液于含1000U/mL Amp+的LB固体选择培养基上划线，37℃培养过夜，挑取板上的一个单菌落置于4 mL LB液体选择培养基中，摇床37℃，180～220rpm培养12～16h，将上述培养菌液以1：100的比例接种到装有100mL LB培养基的500mL锥形瓶中，摇床37℃，180～220rpm培养过夜；
2）将细菌培养物置于冰中或4℃冰箱3-5分钟；4℃，9500rpm离心5min，收集细菌培养物沉淀，弃上清，倒置离心管使上清尽量流出，10mL预冷的Solution I重悬菌体，旋涡振荡，使细菌在Solution I中完全分散；
3）加入20mL新配制的Solution II，轻摇并上下颠倒混匀3～5次，再加入15mL预冷的Solution III，立即轻摇混匀，以免产生局部沉淀，冰上或-20℃冰箱放置10min，加Solution II和Solution III的时间间隔控制在5min以内，以免过分裂解；4℃或室温，11000rpm离心10min，利用5层纱布将上清过滤，转移到两个新50mL离心管中；
4）上清与0.6倍体积异丙醇混匀，室温放置10min；室温下，11000rpm离心10min，弃上清，将空管倒置于滤纸上3-5分钟，除去残余，加入3mL ddH2O充分溶解，再加入3mL预冷的5MLiCl溶液，充分混匀，两只离心管合并为一管，冰中或-20℃冰箱放置10min；4℃或室温，11000rpm离心10min，将上清分别转移到一新50mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，充分混匀，室温放置10min；4℃或室温，11000rpm离心10min，弃上清，倒置控干管内液体，倒置10～15min即可，此时管壁会出现白色沉淀物即质粒；
5）加入3mL ddH2O或pH8.0的TE溶液溶解沉淀，并加入30μL 10mg/mL的RNase A，37℃水浴1h除去RNA，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAc溶液，充分混匀，冰中或-20℃冰箱放置20min；4℃，11000rpm离心10min，将上清吸出，并将离心管倒置于滤纸上控干，加入100μL ddH2O或pH8.0的TE溶液，充分洗脱质粒沉淀，利用分光光度计测量所得质粒的浓度并记录，分装封口后于-20℃保存备用；
C）DHFR-Ts* 抗性Marker的扩增：
1）利用引物DHFR-Fv：AAGCTTCGCCAGGCTGTAAA 和DHFR-Rv：GGAATTCATCCTGCAAGTGCATAG 扩增DHFR-Ts* 抗性基因，反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃复性30 sec；72℃延伸 3min30sec；30个循环；
2）使用OMEGA普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段，利用分光光度计测量所得PCR产物的浓度并记录，分装封口后于-20℃保存备用；
D）弓形虫电击转染及获取阳性单克隆：
1）将Ⅱ型虫株PRU接种于75T HFF细胞中，当虫子裂解细胞75%时，用细胞刮子将虫体刮起，过22G的针头3-5次释放细胞内的虫子；
2）利用3.0μm的滤器过滤上述虫子去除细胞碎片，然后400g×10 min离心取沉淀，利用HBSS buffer重悬，再400g×10 min离心取沉淀，然后用Cytomix buffer重悬虫子使其浓度达到4×107个/ml，Cytomix buffer配比为：120 mM KCl，0.15 mM CaCl2 ，10 mM K2HPO4/KH2PO4，25 mM HEPES，2 mM EDTA，5 mM MgCl2，pH 7.6；
3）转染体系包括：PRU 虫子Cytomix 混合液250μl，DHFR-Ts* 抗性基因片段1.5μg，pSAG1::Cas9-U6:: sgCDPK2载体7.5μg，0.2M、100×的ATP 3μl，0.5M、100×的谷胱甘肽3μl，Cytomix共300μl，将转染体系转移到4mm电击杯利用BTX ECM-830电转仪进行电转，电转程序为：电压1700 V, 电击时间176 μs ，电击两次，中间间隔100 ms，然后将电转的虫子转移到25T HFF细胞中；
4）在37℃，5% CO2温箱培养48h后，加入3μM的乙胺嘧啶，经过7-10天发现耐药性虫子；
5）利用有限稀释法进行耐药虫株的筛选，将耐药性的虫子按照5-10个每孔接种于96孔板，在37℃，5% CO2温箱培养7-10天，显微镜下观察虫斑，选取每孔仅有1个虫斑的接种到24孔板中扩大培养；
6）重复步骤5）的有限稀释法，对虫株进行单克隆化，得到纯度为100%的遗传背景相同的虫株若干株；
7）将步骤6）得到的纯化的虫株接种到24孔板中扩大培养，培养的虫子吸取一部分到1.5ml的离心管中，提取该虫株的基因组；
8）PCR鉴定阳性虫株，将缺失株及野生虫株的基因组同时采用用下列引物： KO-CDPK2-F: TCTACAAGCACGCAGAAAGGA 和R: CGAACCGGAAGTTACCACGAC进行扩增；反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性1min， 55℃复性30 sec；72℃延伸 1min；30个循环；通过电泳检测扩增产物，检测野生株和突变株；
9）将对应的阳性克隆从24孔中接种到25T HFF 中扩大培养，并冻存到液氮中长期保存。
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