CN107753943A - 一种h7亚型禽流感dna疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种H7亚型禽流感DNA疫苗及其制备方法。具体由H7亚型禽流感病毒HA基因和真核表达载体连接构建的质粒表达获得所述H7亚型禽流感DNA疫苗。本发明首先获得H7亚型禽流感病毒的HA基因序列，再根据鸡的密码子偏嗜性进行密码子优化，获得优化的optiHA基因序列如SEQ ID NO.4所示；然后以该优化的optiHA基因与真核表达载体连接构建质粒，并表达获得H7亚型禽流感DNA疫苗。所述H7亚型禽流感DNA疫苗能够预防家禽H7亚型禽流感，减少感染，对养殖业与人类健康具有十分重要的意义。

Description

一种H7亚型禽流感DNA疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于疫苗技术领域。更具体地，涉及一种H7亚型禽流感DNA疫苗及其制备方法。

背景技术

目前，制约家禽养殖业快速发展的关键疫病因素依然是禽流感疫情的预防与控制。禽流感（Avian influenza, AI）是禽类感染A型流感病毒引起的疾病综合征(甘孟侯等，1995；高福等，1999)，为区分不同亚型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）对禽类致病性和毒力，可将禽流感分为低致病性禽流感（Low Pathogenic Avian influenza，LPAI）和高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian influenza，HPAI）。它的暴发给养禽业造成了巨大的经济损失。

与此同时对人类的健康产生重大的影响。近年来，禽流感疫情在世界范围内表现出 高频多发的特点。目前，H7N9亚型流感疫情暴发呈现出季节性。过去几年内新发现的感染 病例均有活禽暴露史(Lam et al.,2015；Tanner et al.,2015；Xie et al.,2015)。虽然之前在家禽中有 分离到H7N9亚型禽流感病毒，但并没有出现感染人的情况。目前在中国暴发的H7N9亚型 流感病毒不但会感染家禽而且还会感染人。近两年，H7N9亚型流感病毒感染人的数量比 H5N1亚型禽流感病毒感染人的数量多，且H7N9亚型禽流感病毒貌似更容易感染不同年龄 段的人群。基因分析结果表明该病毒对哺乳动物具有更大的威胁(Tanneret al.,2015)。2016年 新发现的H7N9亚型禽流感也再次警示着新流感疫情的暴发，2017年H7N9禽流感疫情可能 为近四年最为严重的一年。因此，必须高度重视禽流感，禽流感的的防治及疫苗的研究已成 为当务之急。

虽然疫苗控制禽流感仍存在社会争议，但疫苗结合其他防控措施在控制扩散和清除禽流感疫情方面有着良好的临床表现，疫苗接种仍是防控禽流感的保守措施之一。禽流感疫苗临床应用表现良好，但仍存在负面影响和潜在威胁。为解决这些问题，新型的禽流感疫苗的应用有待继续深入探索和研发。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有禽流感疫苗的缺陷和不足，提供一种由H7亚型禽流感病毒HA基因和真核表达载体组成的H7亚型禽流感DNA疫苗，该疫苗能够预防家禽H7亚型禽流感，减少感染，对养殖业与人类健康具有十分重要的意义。

本发明的目的是提供一种H7亚型禽流感DNA疫苗及其制备方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种H7亚型禽流感DNA疫苗的制备方法，由禽流感病毒HA基因和真核表达载体连接构建的质粒表达获得。

具体地，所述禽流感病毒HA基因为H7亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/J133/2013(H7N9)的HA基因，序列如SEQ ID NO.3所示。

具体地，所述H7亚型禽流感病毒的HA基因序列经过密码子优化，优化的optiHA基因序列如SEQ ID NO.4所示。

具体地，所述真核表达载体为限制性内切酶SacI、XhoI同时酶切质粒pCAGGK（卡纳抗性）得到的载体片段。所述真核表达载体质粒pCAGGK（质粒基因图谱见图4）是在载体pCAGGS基础上改造而来，具体是由本课题组（华南农业大学禽病研究室）构建并保存。

更具体优选地，所述H7亚型禽流感DNA疫苗的制备方法，包括如下步骤：

S1.获取野生H7亚型禽流感病毒的HA基因，其序列如SEQ ID NO.3所示（序列如图2和图3中Original所示）；

S2.将H7亚型禽流感病毒的HA基因根据鸡的密码子偏嗜性进行优化，优化的optiHA基因序列如SEQ ID NO.4所示（序列如图2和图3中Optimized所示）；

S3.用内切酶SacI和XhoI分别酶切处理optiHA基因与真核表达载体；

S4.回收酶切后的目的片段与载体片段，连接、转化、筛选阳性菌落后，提取质粒并进行酶切鉴定；

S5.步骤S4获得的阳性质粒表达获得H7亚型禽流感DNA疫苗。

其中，优选地，步骤S3所述酶切的反应体系为：5μL 10×buffer、5μL阳性质粒、2μL内切酶SacI、2μL 内切酶XhoI、ddH₂O 36μL补足50μL。

优选地，步骤S4所述连接的反应体系和反应条件为：1μL T4 DNA连接酶buffer、1μL T4 DNA连接酶（5U/μL）、1μL 空载体DNA片段 （50ng/μL）、7μL optiHA基因片段；依次将上述试剂震荡混匀后，16℃水浴4-8h。

优选地，步骤S4所述筛选阳性菌落所使用时鉴定PCR的引物为J133-F和J133-R，序列如SEQ ID NO.1和2所示。

另外，由上述方法制备获得的H7亚型禽流感DNA疫苗，以及该DNA疫苗在制备预防或免疫治疗H7亚型禽流感的疫苗或药物方面的应用，以及以DNA疫苗为主要活性成分制备的预防或免疫治疗H7亚型禽流感的疫苗或药物，均应在本发明的保护范围之内。

另外，上述优化的H7亚型禽流感HA基因（optiHA基因），其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，也在本发明的保护范围之内。

该优化的optiHA基因在制备H7亚型禽流感DNA疫苗方面的应用也应在本发明的保护范围之内。

本发明具有以下有益效果：

本发明获得了一种由H7亚型禽流感病毒HA基因和真核表达载体组成的H7亚型禽流感DNA疫苗，该疫苗能够预防家禽H7亚型禽流感，减少感染，对养殖业与人类健康具有十分重要的意义。

本发明的DNA疫苗与现有的传统灭活疫苗相比，其副作用少，安全性高，无需佐剂，免疫应答持续时间长，可因应病毒变种而做出快速应对。

附图说明

图1为本发明J133病毒HA基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果，该图中M：DS2000；1、2：J133病毒HA基因。

图2为优化前后HA核苷酸对比；Original为未优化的HA基因序列；Optimized为优化后的optiHA基因序列；下划线标注的为优化后基因与未优化基因的差异碱基位点。

图3为优化前后HA核苷酸对比；Original为未优化的HA基因序列；Optimized为优化后的optiHA基因序列；下划线标注的为优化后基因与未优化基因的差异碱基位点。

图4为真核表达载体pCAGGK基因图谱。

图5为本发明质粒pUC-optiHA 酶切分析，其中，M：DS5000； 1、2：pUC-optiHA /SacI/XhoI。

图6为本发明质粒pCAGGK-HA 酶切分析，其中M：DS5000；1、2：pCAGGK-HA/SacI/XhoI。

图7为本发明质粒pCAGGK-optiHA酶切分析M：DS5000； 1：pCAGGK-optiHA/SacI；2：pCAGGK-optiHA/XhoI；3、4：pCAGGK-optiHA/SacI/XhoI； 5：pCAGGK-optiHA。

图8为本发明H7亚型DNA疫苗质粒在293T细胞中蛋白表达产物Western-blot结果M：蛋白Marker；1：空白对照组；2：空载体pCAGGK组；3：pCAGGK-HA未优化组；4：pCAGGK-optiHA优化组。

图9为本发明 H7亚型禽流感DNA疫苗免疫鸡后HI抗体的变化。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1

一、实验材料

（1）禽流感病毒：H7亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/J133/2013（H7N9） (以下简称J133)及其阳性血清、抗体的制备由华南农业大学禽病研究室分离、鉴定和保存。

（2）载体质粒：真核表达载体pCAGGK（质粒基因图谱见图4），由华南农业大学禽病研究室构建并保存。

（3）感受态细胞：感受态细胞DH5α，购自于宝生物工程(大连)有限公司。

（4）实验动物：9-10日龄SPF鸡胚，购自于北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。取部分SPF鸡的红细胞制作1%鸡红细胞悬液，用于禽流感病毒的血凝及血凝抑制试验。

二、实验方法

1、H7HA基因的获取

（1）提取禽流感病毒RNA：针对J133病毒，参考《分子生物学》中RNA的提取相关实验操作步骤进行，提取禽流感病毒RNA，将最后的样品放于-20℃保存备用或取适量直接用于逆转录。

（2）逆转录获得禽流感病毒cDNA：根据普洛麦格生物技术有限公司鼠源逆转录酶产品说明书的操作步骤进行。逆转录体系具体为：5μL病毒RNA，1μL逆转录引物12bp（20pmol/μL）。

取1μL逆转录引物12bp和5μL的禽流感病毒RNA分别加入到DEPC处理的1.5mL离心管，在70℃水浴锅中10min取出后放置于室温中5-10分钟，依次加入以下试剂：5μL 5×M-MLV Buffer、4μL dNTP、1μL 逆转录酶、0.5μL RNA酶抑制剂、3.5μL DEPC水。

上述各种试剂加入后，用振荡器充分混匀后，在37℃中水浴1h，取出逆转录获得的禽流感病毒cDNA，保存在冰箱-20℃备用或直接用于下一步实验。

（3）获得HA基因Original片段序列

根据已知的禽流感病毒J133的HA基因序列设计同时含有SacI和XhoI两个酶切位点的扩增引物为J133-F、J133-R（如表1所示）：

表1 H7HA基因PCR引物

用上述获得的禽流感病毒J133的cDNA作为模版，以J133-F、J133-R为引物，利pfuDNA酶进行PCR扩增。

所述PCR扩增的反应体系为：5μL 10×pfu buffer、4μL dNTP、4μL cDNA模板、0.5μL 引物J133-F、0.5μL 引物J133-R、1μL Pfu DNA聚合酶、35μL ddH₂O补足50μL。

PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃ 1min，53℃ 1min，72℃ 2min30s，30个循环；之后72℃延伸10min，最后-20℃保存。

PCR扩增之后根据Omega公司产品DNA纯化回收试剂盒说明书中的操作步骤进行胶回收，并将其保存于-20℃。

取2μL回收产物进行琼脂糖凝胶电泳（电泳结果如图1所示）或者直接检测浓度，检测回收效果，将部分产物送上海英潍捷基生物有限公司测序，获得含有上述酶切位点的HA基因片段序列，如SEQ ID NO.3所示（如图2和图3中的Original）。

2、H7HA基因的密码子优化

（1）依据测序获得的H7亚型禽流感病毒（J133病毒）的HA序列及鸡的基因组序列，根据鸡的密码子偏嗜性将J133病毒的HA基因的ORF进行优化，优化后的H7HA基因（记为optiHA基因）的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示（如图2和图3中的Optimized），优化前后H7HA基因的核苷酸序列对比如图2和图3所示，图2和图3是连续的，图中下划线表示优化后的差异序列。

将优化的optiHA基因片段以合适的酶切位点（5’SacI 和3’XhoI）连接到载体pUC57-Amp，得到阳性克隆质粒pUC-optiHA（该质粒的酶切电泳分析如图5所示），以便于获得大量克隆，以上操作均有苏州金唯智生物科技有限公司完成。

（2）优化结果分析

数据分析显示：H7HA的基因密码子适用指数（CAI）从0.79提高到0.92，；最优密码子使用频率（FOP）从42%提高到76%；GC含量从42.01%提高到55.67%；HA基因经过密码子优化后的核苷酸相似性为80%与其优化前的一致，氨基酸相似性为100%与其优化前的一致。

3、H7亚型DNA疫苗质粒的构建及抽提

（1）将优化后optiHA基因的阳性克隆质粒pUC-optiHA用SacI和XhoI酶进行双酶切处理，双酶切反应体系为：5μL 10×buffer、5μL阳性质粒、2μL 内切酶SacI、2μL 内切酶XhoI、ddH₂O 36μL补足50μL。

然后将产物用1%琼脂凝胶电泳进行鉴定，将切下双酶切后的目的凝胶片段后，根据Omega公司产品DNA纯化回收试剂盒说明书中的操作步骤进行胶回收。

（2）同时，将空载体质粒pCAGGK用SacI和XhoI酶进行酶切处理，将其产物用1%琼脂凝胶电泳鉴定其大小，凝胶电泳后的酶切空载体DNA片段，将酶切空载体DNA片段凝胶进行胶回收，Omega公司产品DNA纯化回收试剂盒说明书中的操作步骤进行胶回收。

（3）连接转化：

然后将上述回收的禽流感病毒J133的optiHA基因片段和空载体DNA片段进行连接，optiHA基因与载体质粒pCAGGK（线性）连接。连接反应体系和反应条件为：1μL T4 DNA连接酶buffer、1μL T4 DNA连接酶（5U/μL）、1μL 空载体DNA片段 （50ng/μL）、7μL optiHA基因片段。依次将上述试剂震荡混匀后，16℃水浴4-8h。

将60uL感受态细胞DH5α移入含有10μL上述的连接产物的离心管中，吹打充分混匀后，在冰上预冷30min；然后42℃热击1min，最后快速冰浴5min；接着加入600μL不含抗生素的LB液体培养基，在37℃摇床中，以200rpm旋转摇45min；然后取培养后菌液均匀地涂布在含有卡纳霉素的LB固体选择培养基上，待菌液完全吸收，最后倒置在37℃培养箱中培养12h。

（4）LB固体培养基平板中任意挑取5个单菌落接种于10ml含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃ 200rpm摇床中摇动12h后，将菌液用凯杰公司的质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体方法参照该说明书中的操作步骤进行。将抽提的质粒用1%的凝胶电泳进行鉴定。然后确定疑似阳性克隆，疑似阳性质粒进行PCR鉴定或酶切鉴定，最后同时送往上海英潍捷基生物技术有限公司测序。

参照Promega公司的DNA质粒大量提取试剂盒中说明书中的步骤提取质粒，然后用1%琼脂凝胶电泳验证提取的DNA大小是否正确以及DNA的性状，再用DNA浓度测定仪检测获得的质粒的最终浓度，得到H7亚型DNA疫苗质粒，在4℃或-20℃中备用。

（5）同时，同样制备得到未优化的质粒pCAGGK-HA（该质粒的酶切电泳分析如图6所示），优化的质粒pCAGGK-optiHA酶切电泳分析如图7所示。

4、H7亚型疫苗质粒的体外表达检测

参照《分子生物学》及《细胞实验技术》中相关实验步骤进行转染和Western blot方法检测目的蛋白的表达。

Western blot结果分析表明，空白对照组和转染空载体pCAGGK组都没有出现条带，但是转染pCAGGK-HA未优化HA基因组和转染pCAGGK-optiHA优化HA基因组都可见约62KD的目的条带，并且优化组的蛋白浓度高于非优化组。因此，说明优化的质粒pCAGGK-optiHA和未优化的质粒pCAGGK-HA都可以在293T细胞中高效地表达出目的蛋白HA（血凝素），并且优化后的血凝素蛋白表达效率明显高于未优化的，如图8所示。

5、SPF鸡的免疫

将5周龄SPF鸡随机分为2组，每组6只，分别免疫200ug DNA质粒pCAGGK和pCAGGK-optiHA，一免后二周以同等剂量进行二免，采用大腿肌肉多点注射免疫方式。具体分组情况如表2所示：

表2 实验分组情况

备注：DNA质粒提取试剂盒提取的200ug DNA质粒，其超螺旋比例约为70%，因此免疫动物后实际有效表达的DNA质粒量约为140 ug。

6、HI抗体检测

在整个DNA免疫期间从对每组鸡每周按时用注射器进行静脉采血，将获得的静脉血凝固分离出血清保存在-20℃冰箱中备用。利用血凝和血凝抑制实验（HI）检测血清中的抗体滴度。应用血凝实验测定禽流感病毒J133的效价，具体参考《WHO动物流感培训手册》中的具体试验步骤执行。参照已经检测的禽病毒的血凝价，配制4单位抗原。

血凝抑制实验（HI）根据《WHO动物流感培训手册》中具体操作步骤执行。记录血凝抑制结果。

从表3和图9可以看出，pCAGGK对照组无HI抗体产生；在一免后一周密码子优化型pCAGGK-optiHA质粒免疫组的HI抗体滴度均值为0log2，一免后二周，pCAGGK-optiHA质粒免疫组血清HI均值为0.6log2；二免后一周，pCAGGK-optiHA质粒免疫组血清HI均值为4.7log2；二免后二周，pCAGGK-optiHA质粒免疫组血清HI均值为4.8log2。

表3 免疫后HI抗体的动态变化

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其架构形式能够灵活多变，可以派生系列产品。只是做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种H7亚型禽流感DNA疫苗及其制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 鸡(chicken)

<400> 1

actgagctca tgaacactca aatcctg 27

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 鸡(chicken)

<400> 2

ccgctcgagt tatatacaaa tagtgcac 28

<210> 3

<211> 1683

<212> DNA

<213> 鸡(chicken)

<400> 3

atgaacactc aaatcctggt attcgctctg attgcgatca ttccaacaaa tgcagacaaa 60

atctgcctcg gacatcatgc cgtgtcaaac ggaaccaaag taaacacatt aactgaaaga 120

ggagtggaag tcgtcaatgc aactgaaaca gtggaacgaa caaacatccc caggatctgc 180

tcaaaaggga aaaggacagt tgacctcggt caatgtggac tcctggggac aatcactgga 240

ccacctcaat gtgaccaatt cctagaattt tcagccgatt taattattga gaggcgagaa 300

ggaagtgatg tctgttatcc tgggaaattc gtgaatgaag aagctctgag gcaaattctc 360

agagaatcag gcggaattga caaggaagca atgggattca catacagtgg aataagaact 420

aatggagcaa ccagtgcatg taggagatca ggatcttcat tctatgcaga aatgaaatgg 480

ctcctgtcaa acacagatga tgctgcattc ccgcagatga ctaagtcata taaaaataca 540

agaaaaagcc cagctctaat agtatggggg atccatcatt ccgtatcaac tgcagagcaa 600

accaagctat atgggagtgg aaacaaactg gtgacagttg ggagttctaa ttatcaacaa 660

tcttttgtac cgagtccagg agcgagacca caagttaatg gtctatctgg aagaattgac 720

tttcattggc taatgctaaa tcccaatgat acagtcactt tcagtttcaa tggggctttc 780

atagctccag accgtgcaag cttcctgaga ggaaaatcta tgggaatcca gagtggagta 840

caggttgatg ccaattgtga aggggactgc tatcatagtg gagggacaat aataagtaac 900

ttgccatttc agaacataga tagcagggca gttggaaaat gtccgagata tgttaagcaa 960

aggagtctgc tgctagcaac agggatgaag aatgttcctg agattccaaa gggaagaggc 1020

ctatttggtg ctatagcggg tttcattgaa aatggatggg aaggcctaat tgatggttgg 1080

tatggtttca gacaccagaa tgcacaggga gagggaactg ctgcagatta caaaagcact 1140

caatcggcaa ttgatcaaat aacaggaaaa ttaaaccggc ttatagaaaa aaccaaccaa 1200

caatttgagt tgatagacaa tgaattcaat gaggtagaga agcaaatcgg taatgtgata 1260

aattggacca gagattctat aacagaagtg tggtcataca atgctgaact cttggtagca 1320

atggagaacc agcatacaat tgatctggct gattcagaaa tggacaaact gtacgaacga 1380

gtgaaaagac agctgagaga gaatgctgaa gaagatggca ctggttgctt tgaaatattt 1440

cacaagtgtg atgatgactg tatggccagt attagaaata acacctatga tcacagcaaa 1500

tacagggaag aggcaatgca aaatagaata cagattgacc cagtcaaact aagcagcggc 1560

tacaaagatg tgatactttg gtttagcttc ggggcatcat gtttcatact tctagccatt 1620

gtaatgggcc ttgtcttcat atgtgtaaag aatggaaaca tgcggtgcac tatttgtata 1680

taa 1683

<210> 4

<211> 1683

<212> DNA

<213> 鸡(chicken)

<400> 4

atgaacaccc agattctggt gttcgctctc atcgccatca tcccaacaaa cgccgataag 60

atctgcctcg gccatcacgc cgtgagcaac ggaaccaagg tgaacaccct caccgagagg 120

ggagtcgagg tcgtcaacgc caccgagacc gtggaaagaa ccaacatccc aaggatctgc 180

tccaagggca agagaacagt cgatctggga cagtgtggac tcctgggaac cattacaggc 240

cccccccaat gcgatcagtt cctggagttc agcgccgacc tgatcattga gaggagggaa 300

ggctccgatg tctgctaccc cggcaagttc gtgaacgaag aggccctgag acaaatcctc 360

agagagagcg gcggaatcga caaggaagcc atgggcttca cctactccgg cattagaaca 420

aacggcgcta catccgcttg caggagatcc ggatccagct tctatgccga gatgaagtgg 480

ctcctcagca acaccgacga cgccgccttc ccccagatga ccaagtccta taagaatacc 540

agaaaaagcc ccgccctcat tgtgtggggc attcaccaca gcgtgagcac agccgagcaa 600

accaagctct acggatccgg caacaagctc gtgaccgtgg gatcctccaa ctaccaacaa 660

tccttcgtcc caagcccagg cgccagacca caagtcaacg gcctcagcgg caggatcgat 720

ttccactggc tgatgctcaa ccccaatgac accgtgacct tctcctttaa cggcgccttc 780

atcgctccag acagggccag cttcctcaga ggaaagtcca tgggcattca gtccggcgtg 840

caagtcgatg ctaattgcga gggcgattgc tatcatagcg gcggaaccat catctccaac 900

ctccccttcc agaacatcga cagcagggcc gtcggaaagt gccccaggta cgtgaagcag 960

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ctcttcggcg ctatcgccgg cttcattgaa aacggctggg agggactcat cgatggctgg 1080

tacggcttca ggcaccagaa cgctcaaggc gaaggaaccg ccgccgatta taagagcacc 1140

cagagcgcta tcgaccagat caccggcaag ctcaacagac tcatcgagaa aaccaatcaa 1200

cagtttgaac tgatcgacaa tgaattcaac gaggtggaga aacagatcgg caacgtgatt 1260

aactggacca gagacagcat caccgaagtc tggtcctaca acgctgagct gctcgtggcc 1320

atggagaacc agcataccat cgacctggct gactccgaga tggacaagct ctacgagagg 1380

gtgaagaggc agctcaggga gaatgccgaa gaggacggaa ccggctgttt cgaaatcttc 1440

cacaaatgtg acgacgactg catggctagc atcagaaaca atacctatga ccacagcaag 1500

tatagggagg aggccatgca gaatagaatc cagatcgacc ccgtcaagct gagcagcggc 1560

tacaaggacg tcatcctgtg gttcagcttc ggcgccagct gcttcatcct gctggctatc 1620

gtgatgggac tggtcttcat ctgcgtcaaa aacggcaaca tgaggtgtac aatctgtatt 1680

tga 1683

Claims (10)

1.一种H7亚型禽流感DNA疫苗的制备方法，其特征在于，由H7亚型禽流感病毒HA基因和真核表达载体连接构建的质粒表达获得所述H7亚型禽流感DNA疫苗，所述禽流感病毒HA基因为H7亚型禽流感病毒的HA基因，序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述H7亚型禽流感病毒的HA基因序列根据鸡的密码子偏嗜性进行密码子优化，优化的optiHA基因序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述真核表达载体为限制性内切酶SacI、XhoI同时酶切质粒pCAGGK得到的载体片段。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.获取野生H7亚型禽流感病毒的HA基因，其序列如SEQ ID NO.3所示；

S2.将H7亚型禽流感病毒的HA基因根据鸡的密码子偏嗜性进行优化，优化的optiHA基因序列如SEQ ID NO.4所示；

S3.用内切酶SacI和XhoI分别酶切处理optiHA基因与真核表达载体；

S4.回收酶切后的目的片段与载体片段，连接、转化、筛选阳性菌落后，提取阳性质粒；

S5.步骤S4获得的阳性质粒表达获得H7亚型禽流感DNA疫苗。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述酶切的反应体系为：5μL10×buffer、5μL阳性质粒、2μL 内切酶SacI、2μL 内切酶XhoI、ddH₂O 36μL补足50μL；步骤S4所述连接的反应体系和反应条件为：1μL T4 DNA连接酶buffer、1μL T4 DNA连接酶（5U/μL）、1μL 空载体DNA片段 （50ng/μL）、7μL optiHA基因片段；依次将上述试剂震荡混匀后，16℃水浴4-8h。

6.根据权利要求1-5任一所述方法制备获得的H7亚型禽流感DNA疫苗。

7.权利要求6所述H7亚型禽流感DNA疫苗在制备预防或免疫治疗H7亚型禽流感的疫苗或药物方面的应用。

8.以权利要求6所述H7亚型禽流感DNA疫苗为主要活性成分制备的预防或免疫治疗H7亚型禽流感的疫苗或药物。

9.一种优化的H7亚型禽流感HA基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

10.权利要求9所述优化的H7亚型禽流感HA基因在制备H7亚型禽流感DNA疫苗方面的应用。