CN103330947B - 一种用于弓形虫感染预防的疫苗及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于弓形虫感染预防的疫苗，包括选自以下的核苷酸序列：1）SEQ ID No.1中所示的第736-第2385位核苷酸序列；和/或SEQ ID No.3中所示的第759-第2411位核苷酸序列；2）与1）中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；3）对上述1）或2）所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。本发明的疫苗可有效地预防和控制弓形虫动物模型（昆明鼠）的感染，重组质粒的联合使用可更有效地提升单基因疫苗的免疫效果。因此，质粒pVAX-ROP5和pVAX-GRA15可作为DNA疫苗候选抗原抗弓形虫感染，而基于此双基因的重组质粒的联合免疫可以作为鸡尾酒复合疫苗用于抗弓形虫的感染。

Description

一种用于弓形虫感染预防的疫苗及其应用

技术领域

本发明属于免疫学和分子生物学领域，具体地，涉及一种用于弓形虫感染预防的疫苗。

背景技术

弓形虫是一种呈世界性分布的人兽共患致病性原虫。健康的成年人感染后一股无临床症状，但弓形虫对免疫系统缺陷或呈现免疫抑制的人群，如：孕妇，艾滋病患者，器官移植的患者等危害十分严重，甚至引起死亡。另外，弓形虫也常引起家畜如山羊和绵羊的流产或先天性感染，对畜牧业生产造成较为严重的经济损失。而且，被弓形虫感染的家畜也是造成人类感染的主要传播途径。鉴于药物治疗弓形虫病能力有限且毒副作用大的特点，免疫预防已逐渐成为控制弓形虫病流行的有效举措。更重要的是，较之其他传统疫苗，DNA疫苗因更加显著的优势而成为抗弓形虫感染的的有效途径，如：DNA疫苗生产工艺简单，成本低；可诱发机体全身免疫应答，免疫力持久；具有相同的理化性质，可以联合免疫；操作简单，直接DNA接种即可。其接种方式多样，可经肌肉注射、皮内注射、皮下注射、静脉注射、滴鼻及黏膜接种等多种途径。

目前，DNA疫苗已在抗寄生虫如：血吸虫，蛔虫，尤其是在原虫，包括疟原虫、利什曼原虫，锥虫等寄生虫的防治中得到广泛的应用，而且在抗弓形虫感染的疫苗研究也迈入了一个新的阶段，然而研究抗弓形虫的核酸疫苗却未取得较为理想的效果。究其原因，弓形虫生活史复杂，形态多样，宿主范围广泛，不同性质的抗原其免疫原也不同，而其包囊和速殖子的致病机制也存在差异，虽然能找到各种不同的单一抗原成分为基础的疫苗候选抗原，但是由于其含有的淋巴细胞结合位点少、受机体主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MHC)限制性大，而难以形成有效的抵抗力对抗弓形虫不同形态的攻击感染，因此仅靠少数的候选抗原基因也很难达到理想的效果，而找到更多的，更好的来源于不同弓形虫阶段的DNA疫苗候选抗原，尤其是与弓形虫毒力相关的抗原基因是研究抗弓形虫疫苗的一个重要途径。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于弓形虫感染预防的疫苗及其应用。

弓形虫棒状体蛋白5(ROP5)，是一种位于PVM中的棒状体假酶，也是继ROP18和ROP16后又一个重要的弓形虫速殖子毒力因子。弓形虫II型虫株的致密颗粒15(GRA15) 是第一个被发现的能改变宿主信号转导的蛋白，与宿主的免疫应答相关，主要能调节宿主IL-12的表达。因此，弓形虫ROP5和GRA15是理想的疫苗候选抗原，而且这种来源于不同阶段的弓形虫毒力因子也有望成为鸡尾酒疫苗的候选抗原。

本发明提供一种用于弓形虫感染预防的核苷酸序列，其含有选自以下的核苷酸序列：

1)SEQ ID No.1中所示的第736-第2385位核苷酸序列；和/或SEQ ID No.3中所示的第759-第2411位核苷酸序列；

2)与1)中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

3)对上述1)或2)所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。

本发明的第二个目的是提供一种载体，其包括权利要求1所述的核苷酸序列，例如所述载体为pVAX I载体。

本发明的第三个目的是提供一种重组质粒，其为SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列；和/或SEQ ID No.3中所示的核苷酸序列。

本发明的第四个目的是提供一种蛋白，其氨基酸序列由权利要求3所述的重组质粒编码。

本发明的第五个目的是提供一种疫苗，其包括权利要求1所述的核苷酸序列，以及医学上可接受的载体。

本发明的第六个目的是提供权利要求1所述的核苷酸序列、权利要求2所述的载体、权利要求3所述的重组质粒、权利要求4所述的蛋白、权利要求5所述的疫苗在弓形虫感染预防中的应用。

本发明的第七个目的是提供大量制备pVAX I，pVAX-ROP5和pVAX-GRA15重组质粒的方法，步骤如下：

(1)、将含有pVAX I，pVAX-ROP5和pVAX-GRA15质粒的菌液在Kan⁺LB固体选择培养基上过夜培养，接种到Kan⁺LB液体选择培养基中进行扩大培养；

(2)、将步骤(1)得到的细菌培养物离心取沉淀，重悬菌体；

(3)、将步骤(2)得到的菌液先后用Solution II和Solution III混匀，离心取上清；

(4)、将步骤(3)得到的上清用0.6倍体积±1ml的异丙醇混匀，离心取沉淀，将沉淀先用ddH₂O溶解，再加入LiCl溶液混匀，离心取上清，加入异丙醇混匀后离心弃上清，控干，得白色沉淀物；

(5)、将步骤(4)制备的白色沉淀物除RNA，加入无水乙醇和NaAc溶液混匀后离心取沉淀，洗脱沉淀。

进一步地，步骤(2)后不包含加入溶菌酶溶液振荡混匀的步骤。

进一步地，步骤(3)中Solution II和Solution III加入的时间间隔控制在5min以内。

进一步地，步骤(5)中离心取沉淀的方法为将上清吸出，再倒置于滤纸上控干。

本发明质粒DNA疫苗pVAX-ROP5、pVAX-GRA15可有效地预防和控制弓形虫动物模型(昆明鼠)的感染，重组质粒的联合使用可更有效地提升单基因疫苗的免疫效果。因此，质粒pVAX-ROP5和pVAX-GRA15能作为DNA疫苗候选抗原抗弓形虫感染，而基于此双基因的重组质粒的联合免疫能作为鸡尾酒复合疫苗用于抗弓形虫的感染。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是pVAX-ROP5构建路线；

图2是pVAX-GRA15构建路线；

图3是弓形虫RH株死亡情况；

图4是pMD18-T质粒；

图5是pVAX I质粒。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

雌性KM鼠，6w龄左右，体重20±2g，购自兰州大学医学实验中心。

宿主菌，弓形虫RH、PRU株，pVAX I真核表达载体等材料，均为中国农业科学院兰州兽医研究所寄生虫功能基因组学研究室保存并提供。

PrimeScript^TM One Step RT-PCR Kit Ver.2(货号：RR055B)、10×PCR Buffer(Mg²⁺free)、MgCl₂(25mmol/L)、dNTP Mixture(2.5mmol/L each)、Ex-Taq(5U/μL)(货号：DDR100D)、pMD18-T Vector(货号：D103A)、BamH I(货号：D1010A)、XhoI(货号：D1094A)、KpnI(货号：D1068A)、PstI(货号：D1073A)、XbaI(货号：D1093A)、10× M Buffer、10×K Buffer、10×和6×Loading Buffer：购自TaKaRa公司；

SV Genomic DNA Purification System(货号：A2360)、Tris-Cl、EDTA、IPTG、X-gal、T4DNA连接酶：购自Promega公司；

RNAprep Pure Tissue Kit(货号：DP431)、TIANprep Mini Plasmid Kit(货号：DP103-02)、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(货号：货号：DP209-02)、普通DNA产物纯化试剂盒(货号：DP204-02)：购自天根生化科技(北京)有限公司；

氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、琼脂糖：购自Sigma公司；

其他化学试剂如NaCl、、无水乙醇等均为国产分析纯级产品。

一、弓形虫RH株pVAX-ROP5疫苗的制备方法如下：

1.弓形虫RH株总RNA的提取：将弓形虫RH株腹腔接种KM鼠，96h后，经颈椎脱臼致死，无菌收集小鼠腹水1.0mL，在10000转/分钟转速下离心3～5min，弃上清，备用。用天根生化科技(北京)有限公司的试剂盒RNAprep Pure Tissue Kit提取弓形虫RH株总RNA，提取的具体方法和步骤参见说明书。

扩增：以所提取的弓形虫RH株总RNA为模板，用大连宝生物工程公司PrimeScript  ^TMOne Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒进行ROP5基因的RT-PCR扩增，使用方法参见说明书。其中，

上游引物：FROP5：5′-CCGGGATCCATGGCGACGAAGCTCGCTAGACT-3′；

下游引物：RROP5：5′-GCTCTAGATCAAGCGACTGAGGGCGCAG-3′；

PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，60℃复性35s；72℃延伸2min；35个循环，最后，72℃延伸10min。

纯化产物的连接：将步骤2中的扩增产物与pMD18连接，连接反应使用TaKaRa公司pMD^TM18-T Vector，使用方法参见说明书，连接条件为16℃反应2～4h或4℃连接过夜，连接产物标记为pMD18-ROP5。

的序列测定：将经菌液PCR和酶切鉴定均为阳性的菌株，送到上海生工生物工程有限公司测序。测序结果见SEQ ID No.1中所示的第736-第2385位核苷酸序列，其编码的蛋白序列见SEQ ID No.2。

质粒的小量提取：用天根生化科技(北京)有限公司TIANprep Mini Plasmid Kit进行pVAX I质粒提取，使用方法参照说明书。

载体(图5所示)及目的片段ROP5的回收：用BamH I和Xba I分别双酶切pVAX I质粒及pMD18-ROP5重组质粒，并用天根生化科技(北京)有限公司普通琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒回收载体及目的片段，使用方法参照说明书。

载体与目的片段ROP5的连接：将经切胶回收纯化得到的ROP5基因片段定向亚克隆至pVAX I载体中。16℃反应4～6h或4℃连接过夜，产物标记为pVAX-ROP5。其核苷酸序列见SEQ ID No.1，其中，下划线部分(第736-第2385位核苷酸序列)为ROP5基因片段，ROP5基因编码的蛋白序列见SEQ ID No.2。

连接产物的转化与鉴定：将连接产物10μL转化大肠杆菌DH5α中，挑取若干单菌落作菌液PCR鉴定。产物标记为pVAX-ROP5。pVAX-ROP5构建路线见图1。

二、弓形虫PRU株pVAX-GRA15疫苗的制备包括如下步骤：

1.弓形虫PRU株总RNA的提取：将弓形虫PRU株按20个包囊/只的剂量灌胃接种于KM鼠，4周后颈椎脱臼处死小鼠，在75％酒精中浸泡2～3min。取出并于超净工作台中，无菌采集脑组织并将其置于研钵中，加入1mL PBS进行研磨，并搜集备用。用天根生化科技(北京)有限公司的试剂盒RNAprep Pure Tissue Kit提取弓形虫PRU株总RNA提取，提取的具体方法和步骤参见说明书。

扩增：以所提取的弓形虫PRU株总RNA为模板，用大连宝生物工程公司的PrimeScript^TM One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒进行GRA15基因的RT-PCR扩增，使用方法参见说明书。其中：

上游引物：F_GRA15：5′-CCGGAATTCATGGTGACAACAACCACGCCAAC-3′；

下游引物：R_GRA15：5′-GCTCTAGATCATGGAGTTACCGCTGATTGTG-3′；

PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，58℃复性35s；72℃延伸2min；35个循环。最后，72℃延伸10min。

扩增产物的连接：将步骤2中的扩增产物与pMD连接，连接反应使用TaKaRa公司的pMVD^TM18-T Vector，使用方法参见说明书；连接条件为16℃反应2～4h或4℃连接过夜，连接产物标记为pMD18-GRA15。

的序列测定：将经菌液PCR和酶切鉴定均为阳性的菌株，送到上海生工生物工程有限公司测序。测序结果见SEQ ID No.3中所示的第759-第2411位核苷酸序列，其编码的蛋白序列见SEQ ID No.4。

质粒的小量提取：用天根生化科技(北京)有限公司的TIANprep Mini Plasmid Kit进行pVAX I质粒提取，使用方法参见说明书。

载体(图4所示)及目的片段GRA15的回收：用EcoRI和Xba I分别双酶切pVAX I质粒及pMD18-GRA15重组质粒，用天根生化科技(北京)有限公司的普通琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒回收载体和目的片段GRA15，使用方法参照说明书。

载体与目的片段GRA15的连接：将经切胶回收纯化得到的ROP5基因片段定向亚克隆至pVAX I载体中。16℃反应4～6h或4℃连接过夜，产物标记为pVAX-GRA15。其核苷酸序列见SEQ ID No.3，下划线部分(第759-第2411位核苷酸序列)为GRA15基因片段，其编码的蛋白序列见SEQ ID No.4。

连接产物的转化与鉴定：将连接产物10μL转化大肠杆菌DH5α中，挑取若干单菌落作菌液PCR鉴定。产物标记为pVAX-GRA15。pVAX-GRA15构建路线见图2。

三、培养基和溶液的配制：

a、溶液的配制：

(1)LB液体培养基

称取LB粉末5.0g，加适量的去离子水溶解，并定容至200mL，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。

(2)LB固体培养基 

于LB液体培养基中加入2.0％(m/V)琼脂粉，121℃高压灭菌20min，待其冷却到55℃～65℃时倾注平板，待凝固后4℃保存备用。

(3)Kan⁺LB选择液体培养基

待(1)中制备的LB液体培养基高压灭菌后冷却至50℃～55℃时，加入Kan(卡那霉素)(终浓度为1000IU/mL)，摇晃混匀后4℃保存。

(4)Kan⁺LB固体选择培养基

待(2)中制备的LB固体培养基灭菌后冷却至50℃～55℃时，加入Kan(终浓度为1000IU/mL)并轻轻摇动，混匀后迅速倾注平板，室温凝固并于4℃保存备用。

b、质粒大量提取时溶液的配制：

(1)0.25mol/L Tris-Cl溶液(pH8.0)

称取Tris-Cl粉末6.055g，并将其溶解到100mL ddH₂O中，调节pH值为8.0，定容到200mL，高压灭菌后4℃保存备用。

(2)0.5mol/L EDTA溶液(pH8.0)

称取Na₂EDTA37.22g，溶于200mL ddH₂O中，振荡混匀，调节pH值为8.0，高压灭菌后4℃保存备用。

(3)TE溶液(pH8.0)

先将(1)中制备的0.25mol/L Tris-Cl溶液和(2)中制备的0.5mol/L EDTA溶液(pH8.0) 稀释，并分别吸取10mmol/L Tris-Cl1.0mL与1mmol/L EDTA0.2mL，加入无菌ddH₂O后定容到100mL，4℃保存备用。

(4)10％SDS溶液(pH7.2)

称取SDS(十二烷基磺酸钠)粉末10g，加入去离子水90mL后60℃水浴溶解，用浓HCl将其pH值调为7.2，并定容到100mL，现配现用，不宜长期保存。

(5)2mol/L NaOH溶液

先于烧杯中加入去离子水160mL，称取NaOH粉末16.0g并缓缓加入到去离子水中，边加边混匀，定容到200mL后于塑料瓶中4℃保存。

(6)Solution I

取(1)中制备的0.25mol/L Tris-Cl10mL，(2)中制备的0.5mol/LEDTA2mL，加去离子水定容到100mL，高压蒸汽灭菌后4℃保存。

(7)Solution II

取2mol/L NaOH10mL，10％SDS10mL，加去离子水定容到100mL，现配现用，常温保存，不宜长时间存放。

(8)Solution III

称取KAc粉末58.884g，与冰乙酸23mL混合，加入适量去离子水溶解后定容到200mL，4℃保存。

(9)3mol/L NaAc溶液(pH5.2)

称取无水NaAc49.22g，加去离子水定容到200mL，高压蒸汽灭菌后4℃保存。

(10)5mol/L LiCl溶液

称取无水LiCl42.4g，加去离子水定容到200mL，高压蒸汽灭菌后4℃保存。

(11)10mg/mL溶菌酶

使用前，称取10mg的溶菌酶，加10mmol/L的Tris-Cl(pH8.0)即刻溶解定容至1mL，-20℃保存。

四、大量制备质粒

1.挑取步骤(一)和(二)中制备的已保存于-20℃的含有目的质粒(pVAX I，pVAX-ROP5和pVAX-GRA15)的阳性菌液于Kan⁺LB固体选择培养基上划线，37℃培养过夜。挑取板上的一个单菌落置于12mL Kan⁺LB液体选择培养基中，摇床37℃，以180～220转/分钟的转速培养12～16h。将上述培养菌液以体积比1∶100的比例接种到装有400mL Kan⁺LB液体选择培养基的1000mL锥形瓶中，摇床37℃，在180～220转/分钟转速下培养过 夜。

2.将步骤1得到的细菌培养物置于冰中或4℃冰箱数分钟，4℃，以9000转/分钟转速离心5min，收集细菌培养物沉淀，弃上清(利用移液器小心吸出上清)，倒置离心管使上清尽量流出。用10mL4℃预冷的Solution I重悬菌体，旋涡振荡，使细菌在Solution I中完全分散。(由于旋涡振荡和Solution I的加入已足够是菌液裂解分散，为了简化操作，此处省去现有技术中进一步裂解分散的步骤：加入1mL新配制的10mg/mL溶菌酶溶液(pH8.0)，震荡混匀)。

3.在步骤2得到的菌液中加入20mL新配制的Solution II，轻摇并上下颠倒混匀2～4次。再加入15mL4℃预冷的Solution III，立即轻摇混匀，以免产生局部沉淀。冰上或-20℃冰箱放置10min。加Solution II和Solution III的时间间隔控制在5min以内，以免过分裂解。4℃或室温，在11000转/分钟下离心10min，利用4层纱布将上清过滤，转移到两个新50mL离心管中。

4.将步骤3得到的上清与14-16mL异丙醇(现有技术中此处需加入0.6倍体积的异丙醇的方法，本申请人通过实验发现，异丙醇的加入量在0.6倍体积上下各1ml的范围内，是不影响产物的提取质量和产量的)混匀，室温放置10min。室温下，在11000转/分钟下离心10min，弃上清，将空管倒置于滤纸上数分钟，除去残余。加入3mL ddH₂O充分溶解，再加入3mL预冷的5mol/L LiCl溶液(此时需先加ddH₂O，后加LiCl，才能使沉淀充分溶解，颠倒步骤易造成沉淀溶解不充分或不溶解)，充分混匀，此处不可用吹打的方式混匀。吹打混匀易使提取的质粒发生断裂，两只离心管合并为一管，冰中或-20℃冰箱放置10min。4℃或室温，在11000转/分钟下离心10min，将上清分别转移到一新50mL离心管中，加入等体积(12mL)预冷的异丙醇，充分混匀，室温放置10min。4℃或室温，在11000转/分钟下离心10min，小心弃上清，倒置控干管内液体，一股倒置10～15min即可。此时管壁会出现白色沉淀物即质粒。

5.在步骤4制备的白色沉淀物中加入3mL ddH₂O或TE溶液(pH8.0)溶解沉淀，并加入30μL10mg/mL RNase A(Takara公司产品)，37℃水浴1h除去RNA。加入2倍体积(8mL)无水乙醇和1/10体积(400μL)。用3mol/L NaAc溶液，充分混匀，冰中或-20℃冰箱放置20min。4℃，在11000转/分钟下离心10min，小心将上清吸出(勿用倾倒的方式除去上清，易造成使吸附于管壁的沉淀分散，而非上清被倒出)，并将离心管倒置于滤纸上控干(主要控干残余的试剂如：乙醇和NaAc，减少杂质，提高质粒的纯度)。加入100μL ddH₂0或TE溶液(pH8.0)，充分洗脱质粒沉淀。利用分光光度计测量所得质粒的浓度并 记录，测出的浓度为10000mg/mL。因此，我们将以保存浓度为1000mg/mL(十倍稀释)的量分装于1.5mL离心管中，即每管保存有1000mg质粒，体积为1mL，分装封口后于-20℃保存备用。

五、质粒DNA的纯度检测 

以ddH₂O或TE(pH8.0)为空白对照，用分光光度计测定波长260nm和280nm下的核酸溶液光密度(OD)值。双链DNA纯品的OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.8，若样品OD₂₆₀/OD₂₈₀值低于1.8，说明样品可能被蛋白质污染，需进一步纯化。

六、重组质粒的免疫效果评价

1.KM鼠免疫与分组：为了降低应激反应，KM鼠买回后需饲养1周，然后将其随机分为6个组，每组30只，具体分组见表1。

表1免疫实验分组情况

以左后腿胫后肌注射途径进行免疫，首先将空载体pVAX I和提取纯化的重组质粒pVAX-ROP5、pVAX-GRA15用PBS(pH7.4)溶液稀释至100μg/100μL，分别给第3～5组中每只小鼠各注射100μL；再将纯化的重组质粒pVAX-ROP5和pVAX-GRA15用PBS(pH7.4)溶液稀释至200μg/100μL，然后将pVAX-ROP5与pVAX-GRA15等体积混合，混匀后于第6组中每只小鼠各注射100μL。初次免疫后，按照同样的剂量，于第2周和第4周对第II组至第VI组加强免疫一次。

腹腔注射感染弓形虫RH株：弓形虫RH株的复苏需在攻虫前2周进行。从液氮罐中取出保存有弓形虫RH株虫体的冻存管，并立即将其放入37℃温水中进行解冻。将冻存管中的液体混匀，每只小鼠腹腔注射200μL，进行第一次传代。待感染小鼠发病(4～6d)，颈椎脱臼处死后无菌采集小鼠腹水1～2mL。混匀后，吸取10μL腹水进行镜检。按照上述方式进行第二和第三次传代。将经第三次传代纯化后所得虫体按1×10³个速殖子/只的剂量，腹腔接种各组小鼠各15只，观察并记录其存活时间。见表2。

灌胃感染弓形虫PRU株：弓形虫PRU株的准备需在攻虫前30天进行。颈椎脱臼处 死被弓形虫PRU株感染的小鼠，75％酒精浸泡2～3min。取出并于超净工作台中，无菌采集脑组织并将其置于研钵中，加入1mL生理盐水进行研磨。待研磨完全后，吸取10μL进行镜检，并观察计数。按10个包囊/只的剂量，以灌胃的方式感染各组小鼠各6只，攻虫后30天进行脑包囊计数。见表3。

本发明的有益效果将通过以下数据说明：

表2弓形虫RH株死亡情况：

表3PRU脑包囊计数和减虫率：

如图2所示，与对照组(Control，PBS和pVAX I)相比，实验组小鼠存活时间均显著性增加，pVAX-ROP5+pVAX-GRA15，pVAX-ROP5和pVAX-GRA15的存活时间分别为22.7±7.21^D，194±4.88^C，17.8±3.76^B；与pVAX-ROP5或pVAX-GRA15相比，pVAX-ROP5+pVAX-GRA15更能显著性增加实验鼠感染T.gondii RH株后的存活天数；9d内对照组小鼠无存活。

从上述表格可以看出，无论是减少PRU脑包囊数目，还是延缓RH的死亡时间，都说明重组质粒pVAX-ROP5和pVAX-GRA15可有效地起到良好的免疫效果，可以作为弓形虫感染预防的疫苗使用。而分别源于弓形虫速殖子和包囊的抗原重组质粒pVAX-ROP5与pVAX-GRA15的联合使用能更有效地提升单基因的免疫效果，可作为一种良好的复合DNA疫苗用于实际的弓形虫感染预防中。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>  中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>  一种用于弓形虫感染预防的疫苗及其应用  

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  4593

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta     60

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata    120

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat    180

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga    240

ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc    300

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt    360

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat    420

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag    480

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc    540

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga    600

ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga    660

aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt    720

accgagctcg gatccatggc gacgaagctc gctagactag ccacgtggct tgtcttggta    780

ggttgcctgt tgtggcgggc gggggcagtt cagctctctc cgccaaactc caggacgaat    840

gatctggctt cgggaacccc gcatgtggct cgcggggaca ctgaggcgca gtcaggaact    900

ggagacgatt cagatttccc gcagggcgtg gtcgaagagg tggcagatat gagcggcggc    960

agagttcccc gagtgccagc atcgtctacc accacatctg cgtccgaggg gattttcaga   1020

agattagttc gcagacttcg tcggggaaga ggaaccgcag atggcgcagg agttgctgac   1080

gaaacgcatc aggggccgcg cccgccactt cggaagagac ttgctcagca cttccgtagg   1140

ctgaggggct tcttcggacg ccttacgccg aggtggctct ccggtctcgg ccgccgggcg   1200

caaagatggt ggagagggag acagagaccg ctgctggacc cttcgtttca tgggttggaa   1260

gctggagatt cgttcatgcg cgacctgctg aaacatgaaa aagagctgat tggatactgt   1320

cgcgaagaag cgttgaaaga acctgcagcg atggttgagg ctgtcatggc aactgtatgg   1380

ccgcaaaatg ctgaaacaac cgtggattca cttttgagtc agggagagcg gaagttgaaa   1440

ttggtggagc ctcttcgagt cggtgaccga tctgtcgtat ttttagtaag ggatgtagag   1500

cgcctggagt atttcgctct gaaggtcttc actatgggtg ccgagaattc ccgatcagag   1560

ctggagcggt tgcatgaagc gacttttgcg gcagcgaggt tgcttgggga gagtccagag   1620

gaggcacggg acagacgcag gcttttactt ccctccgatg ctgtggcagt tcagtctcag   1680

ccccctttcg ctcagctgag tccaggacag agcgactatg cagtcgcgaa ctatttcctt   1740

ctcatgcccg ctgcgtcggt ggatcttgaa ttgctcttta ggacattgga cttcgtgtat   1800

gtattcaggg gggaagaagg tattttagcg cgtcacttac taacggcaca gctgatccgt   1860

ctggcagcca acctgcagag caaaggactt gtgcatggac gcttcacacc ggataacctt   1920

tttcttatgg ggtatggccc cgtgatgctg ggggatgcat ccgcattgtg gaaggtcgga   1980

acccgaggac cggcatcaag cgtcccggtt acctatgcgc ctcgggagtt cttgaatgca   2040

aacacggcaa catttacaca cgcgctcaat gcgtggcaac tgggtcttag catataccgg   2100

gtttggtgcc tagtcttgcc tttcggactc gtgacacctg ggatcaaacg gacatggaaa   2160

agaccaagtc tacgagttcc agggactgac agtctgctat tcgactcatg tatacctgtg   2220

cctgacttcg tgcagacact tactagacgg ttcctcaact tcgataggcg gcgacgcctg   2280

cttcccttgg aggccatgga gacgccagag ttcctccagc tccaaaacga aatatcgagc   2340

agcctatcaa caggacaacc tactgctgcg ccctcagtcg cttgatctag agggcccgtt   2400

taaacccgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc   2460

tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat   2520

gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg   2580

caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc   2640

tctatggctt ctactgggcg gttttatgga cagcaagcga accggaattg ccagctgggg   2700

cgccctctgg taaggttggg aagccctgca aagtaaactg gatggctttc tcgccgccaa   2760

ggatctgatg gcgcagggga tcaagctctg atcaagagac aggatgagga tcgtttcgca   2820

tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg   2880

gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag   2940

cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc   3000

aagacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc   3060

tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg   3120

atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc   3180

ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca   3240

tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag   3300

agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgagc atgcccgacg   3360

gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg   3420

gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca   3480

tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc   3540

tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg   3600

acgagttctt ctgaattatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt ctccttacgc   3660

atctgtgcgg tatttcacac cgcatacagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac   3720

ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc   3780

ctgataaatg cttcaataat agcacgtgct aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta   3840

ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca   3900

ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg   3960

cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga   4020

tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa   4080

tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc   4140

tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg   4200

tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac   4260

ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct   4320

acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc   4380

ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg   4440

gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg   4500

ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct   4560

gggcttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctt                                4593

 

<210>  2

<211>  549

<212>  PRT

<213>  人工蛋白

 

<400>  2

 

Met Ala Thr Lys Leu Ala Arg Leu Ala Thr Trp Leu Val Leu Val Gly

1               5                   10                  15     

Cys Leu Leu Trp Arg Ala Gly Ala Val Gln Leu Ser Pro Pro Asn Ser

            20                  25                  30         

Arg Thr Asn Asp Leu Ala Ser Gly Thr Pro His Val Ala Arg Gly Asp

        35                  40                  45             

Thr Glu Ala Gln Ser Gly Thr Gly Asp Asp Ser Asp Phe Pro Gln Gly

    50                  55                  60                 

Val Val Glu Glu Val Ala Asp Met Ser Gly Gly Arg Val Pro Arg Val

65                  70                  75                  80 

Pro Ala Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ala Ser Glu Gly Ile Phe Arg Arg

                85                  90                  95     

Leu Val Arg Arg Leu Arg Arg Gly Arg Gly Thr Ala Asp Gly Ala Gly

            100                 105                 110        

Val Ala Asp Glu Thr His Gln Gly Pro Arg Pro Pro Leu Arg Lys Arg

        115                 120                 125            

Leu Ala Gln His Phe Arg Arg Leu Arg Gly Phe Phe Gly Arg Leu Thr

    130                 135                 140                

Pro Arg Trp Leu Ser Gly Leu Gly Arg Arg Ala Gln Arg Trp Trp Arg

145                 150                 155                 160

Gly Arg Gln Arg Pro Leu Leu Asp Pro Ser Phe His Gly Leu Glu Ala

                165                 170                 175    

Gly Asp Ser Phe Met Arg Asp Leu Leu Lys His Glu Lys Glu Leu Ile

            180                 185                 190        

Gly Tyr Cys Arg Glu Glu Ala Leu Lys Glu Pro Ala Ala Met Val Glu

        195                 200                 205            

Ala Val Met Ala Thr Val Trp Pro Gln Asn Ala Glu Thr Thr Val Asp

    210                 215                 220                

Ser Leu Leu Ser Gln Gly Glu Arg Lys Leu Lys Leu Val Glu Pro Leu

225                 230                 235                 240

Arg Val Gly Asp Arg Ser Val Val Phe Leu Val Arg Asp Val Glu Arg

                245                 250                 255    

Leu Glu Tyr Phe Ala Leu Lys Val Phe Thr Met Gly Ala Glu Asn Ser

            260                 265                 270        

Arg Ser Glu Leu Glu Arg Leu His Glu Ala Thr Phe Ala Ala Ala Arg

        275                 280                 285            

Leu Leu Gly Glu Ser Pro Glu Glu Ala Arg Asp Arg Arg Arg Leu Leu

    290                 295                 300                

Leu Pro Ser Asp Ala Val Ala Val Gln Ser Gln Pro Pro Phe Ala Gln

305                 310                 315                 320

Leu Ser Pro Gly Gln Ser Asp Tyr Ala Val Ala Asn Tyr Phe Leu Leu

                325                 330                 335    

Met Pro Ala Ala Ser Val Asp Leu Glu Leu Leu Phe Arg Thr Leu Asp

            340                 345                 350        

Phe Val Tyr Val Phe Arg Gly Glu Glu Gly Ile Leu Ala Arg His Leu

        355                 360                 365            

Leu Thr Ala Gln Leu Ile Arg Leu Ala Ala Asn Leu Gln Ser Lys Gly

    370                 375                 380                

Leu Val His Gly Arg Phe Thr Pro Asp Asn Leu Phe Leu Met Gly Tyr

385                 390                 395                 400

Gly Pro Val Met Leu Gly Asp Ala Ser Ala Leu Trp Lys Val Gly Thr

                405                 410                 415    

Arg Gly Pro Ala Ser Ser Val Pro Val Thr Tyr Ala Pro Arg Glu Phe

            420                 425                 430        

Leu Asn Ala Asn Thr Ala Thr Phe Thr His Ala Leu Asn Ala Trp Gln

        435                 440                 445            

Leu Gly Leu Ser Ile Tyr Arg Val Trp Cys Leu Val Leu Pro Phe Gly

    450                 455                 460                

Leu Val Thr Pro Gly Ile Lys Arg Thr Trp Lys Arg Pro Ser Leu Arg

465                 470                 475                 480

Val Pro Gly Thr Asp Ser Leu Leu Phe Asp Ser Cys Ile Pro Val Pro

                485                 490                 495    

Asp Phe Val Gln Thr Leu Thr Arg Arg Phe Leu Asn Phe Asp Arg Arg

            500                 505                 510        

Arg Arg Leu Leu Pro Leu Glu Ala Met Glu Thr Pro Glu Phe Leu Gln

        515                 520                 525            

Leu Gln Asn Glu Ile Ser Ser Ser Leu Ser Thr Gly Gln Pro Thr Ala

    530                 535                 540                

Ala Pro Ser Val Ala

545                

 

<210>  3

<211>  4619

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta     60

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata    120

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat    180

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga    240

ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc    300

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt    360

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat    420

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag    480

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc    540

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga    600

ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga    660

aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt    720

accgagctcg gatccactag tccagtgtgg tggaattcat ggtgacaaca accacgccaa    780

cgccacccgg tgcgccggca gtggtgccca tcttcgacgt tgtctatcaa ctgaatccgc    840

acgtgtttag aagtcgcttt tccaggagga atcgcgccag gcgtgttgcg agcagcaagt    900

cacgctcgat aattcggtgg cttgggtatc ttacggtgct cgctgccgtc attttgctag    960

gagcgtatgc agtaaggcgt gtatcgcgcg atctgtccga ctcagtgcgg gaaacacgac   1020

gaggcaggag aattacaggc agcgtacctc ccgggactac ccgtccccgt tcagagtctt   1080

gtactggcac acaagtggac ggcggctgcg gcgctgacac gtcaaccgat ggaaagtctg   1140

agagtgaaca gaccgaaaac ggggaggact cacgcttttc cacccggacc cctattcatg   1200

tcactgcatc gacttcccca ttcgcgacgc gcaaggcggc ggaagaacgc tcttcgagtc   1260

cgagagacag aaaagttccg gagggtgccc aactccccac gtcgtcgaca cctcatgcac   1320

aaagaaagga ctcaggtagt gatagccgga acccatctac actcatacct tcaccaggta   1380

ccaacacgtt taacatgaac ttttatatta tcggagcagg ctcttcagcg ctcgatttta   1440

ttttcccgca cactccggat gctcaggcta cagtcgtctc ccccccccgc agcgcggcgg   1500

ccgcaccaac tgtcgaaaca gttccaaggg ttcgcactta ctcgacacca acaacattaa   1560

ccctaccaac ggcaccagcg accgccacta gcaaccacat gcatgcctca gcgactccct   1620

cgccaccgga acgtcctcaa aacttccgtg ggggactcat gcggcaaaac ggcatggttg   1680

aggggacatc gttaacgact accgaggctg ggatgccagc gccgttacaa agccctcaac   1740

acattgagac ggaggcgagg ttaacgtact caaatcatct caagagcccg catacaccag   1800

aaactccaac tgtccactca atagaccccg ttgtcggcac cagtggccat tccgtagcgg   1860

tgggatcgca gtctccagcc ggtggacctc ctacagatag ccgcacccca gcggcactga   1920

cccccacaag ttcttctttc tcacatgcag attctcttga aacctctgag catccgcaaa   1980

gtggaccgtc gcttcatcca ttaatctccg ggatacaaga tgccgtgcaa agccaacttc   2040

cactatcaca acaggagact ctccctgtgg tagaaaatgc gactttcttc gggccgcaac   2100

agactccacc gtggatggac gaaactgcag ctgctgcaat tccactcgct ccctcacaac   2160

cagggtcacg tacacaaccc atctcgtctc cgcatactct actttcccgt agcggcggtg   2220

tgtcagctgt gccaggacca cccagaacag aaaaccctcg gcaaccacaa gttccaggcg   2280

aaaactctta ctactctgta ccaactgagc ggacgatctc tgatccaggt ccccaaaggg   2340

cgggtgcggc tcaggctgat ggtatcgggg ctggaggccc acgggacaca caatcagcgg   2400

taactccatg atctagaggg cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta   2460

gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca   2520

ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc   2580

attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata   2640

gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctac tgggcggttt tatggacagc   2700

aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag gttgggaagc cctgcaaagt   2760

aaactggatg gctttctcgc cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa gctctgatca   2820

agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc   2880

ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc   2940

tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga   3000

cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac   3060

gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct   3120

gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa   3180

agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc   3240

attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct   3300

tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc   3360

caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg   3420

cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct   3480

gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct   3540

tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca   3600

gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga attattaacg cttacaattt   3660

cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tacaggtggc   3720

acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat   3780

atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatagca cgtgctaaaa   3840

cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa   3900

atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga   3960

tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg   4020

ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact   4080

ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac   4140

cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg   4200

gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg   4260

gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga   4320

acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc   4380

gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg   4440

agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc   4500

tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc   4560

agcaacgcgg cctttttacg gttcctgggc ttttgctggc cttttgctca catgttctt    4619

 

<210>  4

<211>  550

<212>  PRT

<213>  人工蛋白

 

<400>  4

 

Met Val Thr Thr Thr Thr Pro Thr Pro Pro Gly Ala Pro Ala Val Val

1               5                   10                  15     

Pro Ile Phe Asp Val Val Tyr Gln Leu Asn Pro His Val Phe Arg Ser

            20                  25                  30         

Arg Phe Ser Arg Arg Asn Arg Ala Arg Arg Val Ala Ser Ser Lys Ser

        35                  40                  45             

Arg Ser Ile Ile Arg Trp Leu Gly Tyr Leu Thr Val Leu Ala Ala Val

    50                  55                  60                 

Ile Leu Leu Gly Ala Tyr Ala Val Arg Arg Val Ser Arg Asp Leu Ser

65                  70                  75                  80 

Asp Ser Val Arg Glu Thr Arg Arg Gly Arg Arg Ile Thr Gly Ser Val

                85                  90                  95     

Pro Pro Gly Thr Thr Arg Pro Arg Ser Glu Ser Cys Thr Gly Thr Gln

            100                 105                 110        

Val Asp Gly Gly Cys Gly Ala Asp Thr Ser Thr Asp Gly Lys Ser Glu

        115                 120                 125            

Ser Glu Gln Thr Glu Asn Gly Glu Asp Ser Arg Phe Ser Thr Arg Thr

    130                 135                 140                

Pro Ile His Val Thr Ala Ser Thr Ser Pro Phe Ala Thr Arg Lys Ala

145                 150                 155                 160

Ala Glu Glu Arg Ser Ser Ser Pro Arg Asp Arg Lys Val Pro Glu Gly

                165                 170                 175    

Ala Gln Leu Pro Thr Ser Ser Thr Pro His Ala Gln Arg Lys Asp Ser

            180                 185                 190        

Gly Ser Asp Ser Arg Asn Pro Ser Thr Leu Ile Pro Ser Pro Gly Thr

        195                 200                 205            

Asn Thr Phe Asn Met Asn Phe Tyr Ile Ile Gly Ala Gly Ser Ser Ala

    210                 215                 220                

Leu Asp Phe Ile Phe Pro His Thr Pro Asp Ala Gln Ala Thr Val Val

225                 230                 235                 240

Ser Pro Pro Arg Ser Ala Ala Ala Ala Pro Thr Val Glu Thr Val Pro

                245                 250                 255    

Arg Val Arg Thr Tyr Ser Thr Pro Thr Thr Leu Thr Leu Pro Thr Ala

            260                 265                 270        

Pro Ala Thr Ala Thr Ser Asn His Met His Ala Ser Ala Thr Pro Ser

        275                 280                 285            

Pro Pro Glu Arg Pro Gln Asn Phe Arg Gly Gly Leu Met Arg Gln Asn

    290                 295                 300                

Gly Met Val Glu Gly Thr Ser Leu Thr Thr Thr Glu Ala Gly Met Pro

305                 310                 315                 320

Ala Pro Leu Gln Ser Pro Gln His Ile Glu Thr Glu Ala Arg Leu Thr

                325                 330                 335    

Tyr Ser Asn His Leu Lys Ser Pro His Thr Pro Glu Thr Pro Thr Val

            340                 345                 350        

His Ser Ile Asp Pro Val Val Gly Thr Ser Gly His Ser Val Ala Val

        355                 360                 365            

Gly Ser Gln Ser Pro Ala Gly Gly Pro Pro Thr Asp Ser Arg Thr Pro

    370                 375                 380                

Ala Ala Leu Thr Pro Thr Ser Ser Ser Phe Ser His Ala Asp Ser Leu

385                 390                 395                 400

Glu Thr Ser Glu His Pro Gln Ser Gly Pro Ser Leu His Pro Leu Ile

                405                 410                 415    

Ser Gly Ile Gln Asp Ala Val Gln Ser Gln Leu Pro Leu Ser Gln Gln

            420                 425                 430        

Glu Thr Leu Pro Val Val Glu Asn Ala Thr Phe Phe Gly Pro Gln Gln

        435                 440                 445            

Thr Pro Pro Trp Met Asp Glu Thr Ala Ala Ala Ala Ile Pro Leu Ala

    450                 455                 460                

Pro Ser Gln Pro Gly Ser Arg Thr Gln Pro Ile Ser Ser Pro His Thr

465                 470                 475                 480

Leu Leu Ser Arg Ser Gly Gly Val Ser Ala Val Pro Gly Pro Pro Arg

                485                 490                 495    

Thr Glu Asn Pro Arg Gln Pro Gln Val Pro Gly Glu Asn Ser Tyr Tyr

            500                 505                 510        

Ser Val Pro Thr Glu Arg Thr Ile Ser Asp Pro Gly Pro Gln Arg Ala

        515                 520                 525            

Gly Ala Ala Gln Ala Asp Gly Ile Gly Ala Gly Gly Pro Arg Asp Thr

    530                 535                 540                

Gln Ser Ala Val Thr Pro

545                 550

Claims (5)

1.核苷酸序列在制备预防弓形虫感染的疫苗中的应用；其中所述核苷酸序列为序号1）或2）中所述核苷酸序列：

1）SEQ ID No.1中所示的第736-第2385位核苷酸序列；和SEQ ID No.3中所示的第759-第2411位核苷酸序列；

2）与1）中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

2.载体在制备预防弓形虫感染的疫苗中的应用；其中所述载体包括权利要求1中序号1）或2）所述的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：骨架载体为pVAX I载体。

4.蛋白在制备预防弓形虫感染的疫苗中的应用，其中，所述蛋白的氨基酸序列由权利要求3中的载体编码。

5.疫苗在制备预防弓形虫感染的药物中的应用，其中，所述疫苗包括权利要求1中序号1）或2）所述的核苷酸序列，以及医学上可接受的载体。