KR102014518B1 - HIV 1의 p24 단백질을 발현하는 벡터가 도입된 재조합 마이코박테리움 스메그마티스 균주 및 이를 포함하는 백신 - Google Patents

Abstract

본원은 인간면역결핍바이러스 타입 I의 p24 단백질을 발현하는 재조합 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) 균주 및 이를 포함하는 HIV 감염증에 대한 백신 조성물을 개시한다. 본원에 따른 백신은 항원을 높은 수준으로 발현하여 효과적으로 식세포에 제시가 가능하며, 수지상세포의 T 세포 증식 능력을 향상시키고 접종된 쥐에서 향상된 T 세포 효과기 기능과 Th1 바이어스된 체액 면역 반응을 유도할 수 있어, HIV-1과 결핵과의 동시 감염에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

HIV 1의 p24 단백질을 발현하는 벡터가 도입된 재조합 마이코박테리움 스메그마티스 균주 및 이를 포함하는 백신 {Recombinant Mycobacterium smegmatis with vector expressing Human Immunodeficiency Virus Type 1 p24 and vaccine comprising the same}

본원은 균주 백신과 관련된 기술분야이다.

에이즈 및 결핵과 같은 질병에 대한 백신 개발을 위해 백신의 세포 면역 유도 전략, 특히 CTL1 개발에 초점을 맞추고 있다. 실험동물 및 인간의 초기 임상 실험에 따르면 살아있는 균에 포함된 재조합 벡터가 다양한 병원성 미생물에 대하여 CD4 및 CD8 T- 림프구 반응을 일으킬 수 있다. 특히 주목할 것은, 세포 면역 반응 유도를 위한 가장 효과적인 전략은 이종 프라임/부스트 요법이다. 최근 살아있는 재조합 벡터를 포함하는 rSmeg (recombinant M. smegmatis) 균주는 부스팅 후 활발한 이차 면역 반응을 강화시킴으로써 HIV-1 감염에 대한 세포성 면역반응 유도, 특히 큰 풀의 컴피턴트 CTL를 확장시켜 프라임/부스트 백신 접종의 프라이밍 벡터로 작용할 수 있는 것으로 나타났다.

이는 Smeg가 항원 특이적 메모리 CD8 T 세포로 분화를 유도할 수 있는 능력으로 인한 것이나, 한계점이 있다. 즉, 다른 벡터에 의해 유도된 것과 비교하여 적은 수의 항원 특이적 CD8 T 세포를 유도하는 것이 문제점으로 이러한 한계는 부분적으로 rSmeg에 의해 소량의 항원 만이 생체내에서 발현되는 결과이거나 또는 부분적으로 감염된 식세포의 세포질에 대한 항원의 제한된 접근으로 인해 효율적인 MHC 클래스 I 제시를 방해하기 때문이다.

따라서, 프라임/부스트 백신 요법에서 프라이밍 벡터로서 rSmeg의 효능을 개선하기 위해, 전달된 유전자를 MHC 클래서 I 프로세싱 경로로 유도하는데, 특히 효과적인 적절한 마이코박테리아 벡터 시스템 및 이를 포함하는 균주의 개발이 필요하다.

미국 특허 제7,612,173호 (2007년 10월 18일 공개) 미국 공개공보 제2008/0254061호 (2008년 10월 16일 공개)

본원은 프라임/부스트 백신 요법에서 프라이밍 벡터로서 rSmeg의 효능을 개선하기 위해, 전달된 유전자를 MHC 클래서 I 프로세싱 경로로 유도하는데, 특히 효과적인 적절한 마이코박테리아 벡터 시스템 및 이를 포함하는 균주 및 백신을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 인간면역결핍바이러스 타입 I 유래의 p24 단백질을 발현하는 재조합 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis)를 제공한다.

본원에 따른 균주에서 상기 p24 단백질은 도 1에 개시된 pMyong2-p24 플라스미드에 의해 발현된다.

일 구현예에서 본원에 따른 마이코박테리움 스메그마티스 균주는 2017년 11월 24일자로 기탁번호 KCTC (Korean Collection for Type Cultures) 13403BP로 기탁된 것이다.

본원은 또한 본원에 따른 균주 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 HIV 감염증 또는 HIV 및 결핵균 동시 감염증에 대한 백신 조성물을 제공한다.

본원에 따른 백신에서 상기 균주는 살아있는 것이다.

일 구현예에서 본원에 따른 백신은 추가로 인위적으로 약독화(attenuation)되지 않는 균주이다.

본원에 따른 백신은 특히 프라임-부스트 백신 접종법에서 프라이밍 백신으로 사용될 수 있다.

본원에 따른 백신은 AIDS 또는 결핵에 사용될 수 있다.

본원은 또한 본원에 따른 균주에서 p24 항원의 발현에 사용되는 도 1에 개시된 pMyong2-p24 플라스미드를 제공한다.

본원은 또한 본원에 따른 플라스미드를 포함하는 세포를 제공한다.

본원에 따른 rSmeg-pMyong2-p24 균주는 pAL5000 또는 pMV306 유도 시스템을 사용하는 다른 rSmeg 균주와 비교하여 더 높은 수준의 HIV-1 p24 Gag 단백질 발현을 유도하고 더 많은 p24 항원을 식세포로 전달할 수 있다. 나아가 이러한 균주가 감염된 BMDC의 T 세포 증식 능력을 향상시키고 접종된 쥐에서 향상된 T 세포 효과기 기능과 Th1 바이어스된 체액 면역 반응을 유도하는 것으로 나타났다.

또한 본원에 따른 rSmeg-pMyong2-p24 균주는 초기 성장이 지연되어, 약독화되는 효과를 가져오고, 더 많은 항원을 식세포에 제시하여 보다 강한 면역반응을 유지할 수 있다. 이러한 결과는 본원에 따른 rSmeg-pMyong2-p24가 HIV-1 또는 HIV-1과 결핵과의 동시 감염에 효과적인 후보 백신이 될 수 있음을 나타내는 것이다.

도 1은 본원에 따른 일 구현예에서 p24 발현 벡터 지도, 제작한 p24 발현 마이코박테리아-대장균 셔틀 벡터 지도를 도식적으로 나타내며, pMV306-p24, pAL-p24 및 pMyong2-p24 벡터는 M. bovis BCG의 hsp65 프로모터의 조절 하에 p24를 발현시키며, insert는 5’->3’ 방향이며, 각 벡터의 XbaI 및 EcoRV 부위로 삽입되었다.
도 2는 본원의 일 구현예 따른 재조합 M. smegmatis (rSmeg) 및 rSmeg 균주에 감염된 마우스 마크로파지등에 의한 p24 발현 정도를 관찰한 결과이다: (a) rSmeg 내 p24 발현을 ELISA로 확인한 결과이다; (b) rSmeg 내 p24 발현을 Western blot으로 확인한 결과로, 각 레인 별로, 야생형 M. smegmatis (lane 1) 및 rSmeg 균주들 (lane 2, rSmeg-pMV306-p24; lane 3, rSmeg-pAL-p24; lane 4, rSmeg-pMyong2-p24)에서 단백질을 추출하여 로딩하였다. 정제된 p24 단백은 양성 대조군으로 사용하였고 (lane 5). M은 molecular weight standard (Elpis Bio, Taejeon, Korea; DokDo-MARK^TM) 이다; (c) rSmeg 균주 (rSmeg-pMV306-p24, rSmeg-pAL-p24, rSmeg-pMyong2-p24)에 감염된 J774A.1 (왼쪽) 및 BMDCs (오른쪽)에서의 p24 발현량을 나타낸다.
도 3은 p24 재조합 M. smegmatis 균주에 감염된 BMDCs로 유도된 T 세포 증식 양상을 나타낸 결과이다: (a) T 세포 증식 분석을 위한 스케줄 모식도이다; (b 및 c) p24 재조합 M. smegmatis 균주가 감염된 BMDCs로 인해 유도된 CFSE-labeled CD4, CD8 T cell의 분열을 유세포 분석기로 분석한 결과이다; (d) Mixed lymphocyte reaction (MLR) assay에 사용된 CD4 (왼쪽)와 CD8 (오른쪽) T cell의 상층액에서의 IL-2 ELISA 측정 결과이다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 대표적인 결과를 나타낸다. 모든 통계 분석은 rSmeg-pMyong2-p24의 값과 비교하여 계산함. 결과는 평균 ± 분산값으로 나타냈다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.
도 4는 p24 rSmeg 균주들에 의해 in vivo에서 유도된 면역 반응 결과이다: (a) in vivo 면역학적 분석에 대한 면역 스케줄의 모식도이다; (b) p24 rSmeg 균주들로 면역된 마우스의 splenocytes를 in vitro로 자극시킨 후 IFN-γ의 분비능을 ELISPOT으로 분석한 결과로, 각 그룹의 ELISPOT 대표 이미지를 그래프 하단에 나타냈다; (c) p24 재조합 rSmeg 균주들로 면역시킨 마우스의 splenocytes를 in vitro에서 p24로 자극한 후 IL-2, IFN-γ, TNF-α, 및 IL-10 cytokine에 대한 ELISA 결과로 IL-2와 TNF-α의 경우 p24로 24시간, IFN-γ과 IL-10의 경우, 72시간 자극하였다; (d) p24 특이적인 면역글로블린 서브타입(IgG2a, IgG1)을 450nm에서 ELISA확인한 결과로, IgG2a와 IgG1 서브타입에 대한 OD 값과 IgG2a/IgG1 비율을 비교하였다. 모든 통계 분석은 rSmeg-pMyong2-p24의 값과 비교하여 계산함. 결과는 평균 ± 분산값으로 나타냈다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.
도 5는 rSmeg 균주로 면역된 마우스의 세포독성 T 림프구 반응을 분석한 결과이다: (a) Ag85B를 형질전환시킨 P815 세포와 in vitro에서 Ag85B로 자극한 splenocytes를 반응시켜 유도된 CTL 반응 결과이다; (b) p24를 형질전환시킨 P815 세포와 in vitro에서 p24로 자극한 splenocytes를 반응시켜 유도된 CTL 반응 결과이다. 두 번의 독립적인 실험을 통해 대표적인 결과를 나타냈다. 모든 통계 분석은 rSmeg-pMyong2-p24의 값과 비교하여 계산하였다. 결과는 평균 ± 분산값으로 나타냈다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.
도 6은 본원의 p24 재조합 균주들 (rSmeg-pMV306-p24, rSmeg-pAL-p24, rSmeg-pMyong2-p24) 및 야생형 M. smegmatis 균주의 생장 곡선을 나타낸다. rSmeg-pMyong2-p24 균주를 다른 비교 균주 (rSmeg-pMV306-p24, rSmeg-pAL-p24 및 wild type M. smegmatis)와 함께 7H9 broth (with 100 μg/ml of kanamycin)에서 5일간 배양했을 때, 배양 초기(6~48시간)에 다른 균주에 비해 성장이 더딘 것을 나타낸다. 이러한 차이는 본원에 따른 벡터가 높은 카피 수를 유지하기 위한 것으로 본원에 따른 rSmeg-pMyong2-p24 균주가 마크로파지 및 마우스 감염에 있어 다른 재조합 균주에 비해 더 약독화된 균주임을 나타내는 간접적 결과로, 백신으로 효과적으로 유리하게 사용될 수 있음을 나타낸다.
도 7은 야생형 M. smegmatis 및 p24 재조합 균주들 (rSmeg-pMV306-p24, rSmeg-pAL-p24, rSmeg-pMyong2-p24)을 macrophage (J774A.1) 및 BMDC에 감염시킨 후 (24시간 infection) 세포를 융해하여, 7H10 고체 배지 (with 100 μg/ml of kanamycin)에서 배양한 결과이다. 본원에 따른 균주 rSmeg-pMyong2-p24를 포함한 다른 재조합 균주를 macrophage 및 BMDC에 감염시켜 세포 내 CFU를 확인한 결과, 본원에 따른 rSmeg-pMyong2-p24 균주가 다른 재조합 균주들에 비해 상대적으로 낮은 CFU를 보이는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본원에 따른 벡터가 도입된 균주가 다른 재조합 균주에 비해 약독화되는 특성을 나타내는 것으로, 이는 백신으로 효과적으로 유리하게 사용될 수 있음을 나타낸다.

본원에서는 HIV-1 p24 Gag 항원을 발현하는 재조합 Mycobacterium smegmatis 균주가 백신에 효과적으로 사용될 수 있다는 발견에 근거한 것이다.

이에 한 양태에서 본원은 인간면역결핍바이러스 타입 I의 p24 단백질을 발현하는 재조합 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis)균주에 관한 것으로, 상기 p24 단백질은, 도 1에 개시된 pMyong2-p24 플라스미드에 의해 발현된다.

본원에 따른 벡터에 의해 발현되는 p24 캡시드 (CA) 단백질은 처리되지 않은 Gag 폴리단백질에서 MA(매트릭스 단백질)의 3’ 말단에 연결되어 있다. p24 캡시드 (CA) 단백질은 N 및 C 말단에 HIV 버딩 및 캡시드 구조에서 중요한 역할을 하는 두 개의 도메인을 포함하고 있다. 본원에 따른 벡터에 의해 발현되는 p24는 인간면역결핍바이러스 타입 I 유래로 그 서열은 GenBank No. KM390026.1d에 포함되어 있거나, 서열번호 1의 서열의 3161 내지 3850 뉴클레오타이드에 해당되며, 본원에 따른 목적을 위해 항원으로 작용하는 한, 이의 서열변이체도 사용될 수 있다. 본원에 따른 균주가 발현하는 p24는 인체에 투여시 HIV 감염에 대한 항원으로 작용할 수 있다.

본원에 따른 균주에서 p24는 특히 도 1에 개시된 pMyong2 벡터에 의해 발현된다. 본원에 따른 pMyong2-p24를 포함하는 Smeg 균주는 pAL5000 또는 pMV306 유도 시스템을 사용하는 다른 rSmeg 균주와 비교하여 더 높은 수준의 HIV-1 p24 단백질 발현을 유도하고 더 많은 p24 항원을 식세포로 전달할 수 있어, 매우 우수한 것으로 나타났다. 일 구현예에서 24는 특히 도 1에 개시된 pMyong2 벡터는 서열번호 1의 서열로 표시된다.

본원에 따른 균주는 2017년 11월 24일, 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁번호 KCTC 13403BP로 기탁되었다.

나아가 본원에 따른 pMyong2-p24를 포함하는 Smeg 재조합 균주가 감염된 BMDC(Bone Marrow-Derived Dendritic Cell)의 T 세포 증식 능력을 향상시키고 접종 된 쥐에서 향상된 T 세포 효과기 기능과 Th1 바이어스된 체액 면역 반응을 유도 할 수 있는 것으로 나타났다. 또한 본원에 따른 rSmeg-pMyong2-p24 균주는 초기 성장이 지연되어, 약독화됨으로써 더 많은 항원을 식세포에 제시하여 보다 강한 면역반응을 유지할 수 있다. 이러한 결과는 본원에 따른 rSmeg-pMyong2-p24가 HIV-1 또는 HIV-1과 결핵과의 동시 감염에 효과적인 후보 백신이 될 수 있음을 나타내는 것이다.

이에 다른 양태에서 본원은 본원에 개시된 균주를 포함하는 HIV 감염증에 대한 면역원성, 백신 또는 면역치료용 조성물에 관한 것이다.

HIV는 인간의 면역체계를 파괴하는 레트로바이러스의 일종으로, HIV에 감염될 경우, 숙주의 면역시스템이 저하되어, AIDS로 진행하며, 세균, 바이러스, 진균 및 기생충 등에 의한 기회감염의 위험이 현저히 증가된다.

AIDS는 후천성면역결핍증으로 HIV 감염의 결과로 인체 면역기능의 저하로 나타나는 여러 가지 증상을 일컫는 것이다.

본원에 따른 백신 조성물은 p24 특이적 면역반응 예를 들면 더 많은 p24 항원을 식세포로 전달하며, BMDC의 T 세포 증식 능력을 향상시키고 접종된 쥐에서 향상된 T 세포 효과기 기능과 Th1 바이어스된 체액 면역 반응을 유도할 수 있어, HIV 감염을 예방하거나 또는 감염으로 인한 증상을 경감, 완화 및/또는 치료할 수 있다.

백신은 통상 프라임-부스트 형태로 2회 이상 투여되는 것이 일반적이다. 이 경우 동일한 백신을 수회 투여하거나(homologus) 또는 동일한 항원을 포함하는 상이한 종류의 백신이 투여(이종, heterologus) 된다.

일 구현예에서 본원에 따른 백신은 상동 또는 이종 프라임-부스트에서 프라이밍 백신으로 사용된다. 본원에 따른 rSmeg-pMyong2-p24 균주는 p24 항원의 발현량이 높고, 항원 제시능이 높아 naive한 개체에 충분한 p24 특이 면역 반응을 유도할 수 있기 때문에 특히 프라이밍 백신으로 사용에 유리하다.

본원에 따른 조성물에 사용되는 마이코박테리아는 앞서 설명한 바와 같으며, 특히, 살아있는 생균이 사용될 수 있다. 특히 본원에 따른 rSmeg-pMyong2-p24 균주는 초기 성장이 지연되어, 자연적으로 약독화됨으로써 더 많은 항원을 식세포에 제시하여 보다 강한 면역반응을 유지할 수 있다.

본원에 따른 백신 조성물은 전신 또는 국소 투여용으로 제형화 될 수 있으며, 약학적으로 가능한 부형제, 담체 및/또는 매체 예를 들면 인산완충 식염수 용액, 증류수, 수/유 에멀젼, 습윤제, 에멀젼화제, pH 조절제 등을 포함할 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본원에 따른 백신 조성물은 또한 필요한 경우 아주번트, 특히 T-세포 매개 반응을 촉진 또는 증가시킬 수 있는 임의의 물질 또는 화합물을 포함할 수 있다. 일 구현예에서 아주번트는 화학적 또는 열에 의해 사멸된 균이 조성물에 포함되는 경우에 사용될 수 있다. 아주번트는 당업계에 공지되어있으며, 예를 들면 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 포타슘 설페이트, 가교 폴리아크릴산 중합체, DDA (dimethyldioctadecyl-ammonium bromide), 면역 조절물질, 락토페린, 또는 IFN-gamma 유도제 등이 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 가교 폴리아크릴산 중합체는 Carbopol￠c 단일중합체 또는 공중합체를 포함하고, 상기 림포카인은 IFN-gamma, IL-1, IL-2 또는 IL-12를 포함하며, 상기 IFN-gamma 유도제는 poly I:C를 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 일 구현예에서, 합성된 당 폴리머인 상기 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 또는 알루미늄 포타슘 설페이트는 약 0.05 내지 0.1 중량%로 포함되고, 상기 가교 폴리아크릴산 중합체는 0.25 중량%로 포함될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 조성물은 국소 또는 전신 투여될 수 있으며, 일회 또는 다회 투여될 수 있으며, 다양한 경로, 예를 들면 피하, 피내, 근육내 또는 정맥으로 투여되거나, 또는 경구, 비강 또는 흡입 경로로 투여될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 근육내 주사로 일회 투여된다.

본원에 따른 백신 조성물은 투여 경로에 적합한 액상 용액 또는 현탁제로 제조되거나 또는 주사하기 전에 용액에 용해 또는 현탁되는 고형의 형태로 제형화될 수 있다.

백신의 투여량은 투여경로는 물론 환자의 연령, 체중 및/또는 건강상태에 따라 달라질 것이다. 예를 들면 적절한 투여량은 예를 들면 1 내지 10⁹ cfu일 수 있다. 일 구현예에서는 10⁶ cfu가 사용된다. 본원에 따른 균주의 경우, 항원의 발현량이 우수하고, 항원 제시능 등이 우수하여, 이보다 더 적은 투여량 또는 기존 균주 백신과 비교하여 더 적은 투여량을 사용할 수 있음은 물론이다.

또 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 균주에서 p24의 발현에 사용되는 도 1에 개시된 벡터에 관한 것이다.

일 구현예에서 상기 벡터는 서열번호 1의 서열로 나타낸다.

또 다른 양태에서 본원은 또한 상기 벡터로 형질 전환된 세포에 관한 것이다. 상기 세포는 특히 마이코박테리움을 포함한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험방법

마우스와 면역 과정

암컷 BALB/c 마우스 (~25g, 7주령)을 오리엔트 바이오 (Seoul, Korea)에서 구매를 하였고, 8주령이 된 마우스를 사용하여 실험을 진행하였다. 마우스의 꼬리 밑부분에 각 균주 (야생형 M. smegmatis, 재조합 M. smegmatis; rSmeg-pMV306-p24, rSmeg-pAL-p24, rSmeg-pMyong2-p24)를 피하로 접종함 (2주 간격, 2회). 마지막 면역으로부터 2주 후, CO₂ 과호흡을 통해 각 마우스를 안락사시킨 후, 비장을 떼어 내 면역학적 분석에 사용하였다.

사람면역결핍바이러스 (HIV-1) Gag p24 항원을 발현하는 마이코박테리아 -대장균 셔틀벡터의 제작

P24 항원을 발현시킬 수 있는 마이코박테리아-대장균 셔틀 벡터를 제작하기 위해, 열충격단백 65kDa (heat shock protein 65, hsp65)의 프로모터 부분을 M. bovis BCG의 DNA에서 증폭하고, p24 항원에 해당하는 DNA 염기서열을 pNL4-3-deltaE-EGFP vector (NIH AIDS Reagent Program, Germantown, MD, USA)에서 증폭한 후, 오버래핑 PCR (overlapping PCR)을 통해 두 절편을 연결하였다. 이에 사용된 프라이머는 다음과 같다: M. bovis BCG의 hsp65 프로모터 부위를 증폭할 프라이머 시퀀스: Forward: 5’-TTGGTACCGGTGACCACAACGACGCGC-3’(KpnI, 밑줄 친 부위에 해당하는 제한효소); 및 Reverse: 5’-CTGCACTATAGGCATTGCGAAGTGATTCCT-3’. P24 유전자 증폭할 프라이머 시퀀스: Forward: 5’-AGGAATCACTTCGCAATGCCTATAGTGCAG-3’; 및 Reverse: 5’-AATCTAGACTACAAAACTCTTGCCTTATGGCCAGG-3’(XbaI, 밑줄 친 부위에 해당하는 제한효소). 증폭된 두 유전자를 연결하기 위한 오버래핑 PCR을 수행할 때, hsp65 프로모터의 forward와 p24 유전자의 reverse 프라이머를 사용하였다.

이어, 오버래핑 염기서열 (phsp-p24)를 KpnI과 XbaI (NEB, Ipswich, MA, USA) 제한효소로 자르고 T4 ligase (TaKaRa, Kyoto, Japan)으로 마이코박테리아-대장균 셔틀 벡터인 pMV306에 클로닝하였다. 이어 만들어진 pMV306-p24를 주형으로 하여, phsp-p24를 PCR로 증폭하여 pAL-TOPO와 pMyong2-TOPO 벡터에 다시 클로닝하였다. Phsp-p24 염기서열을 증폭한 프라이머 서열은 다음과 같다: forward: 5’-TTGATATCGGTGACCACAACGACGCGC-3’(EcoRV, 밑줄 친 부위에 해당하는 제한효소)및 p24의 reverse 프라이머. 이어 증폭된 PCR product는 EcoRV와 XbaI을 사용하여 자른 후 pAL- 및 pMyong2-TOPO 벡터에 클로닝하였다.

대장균으로부터 재조합 Ag85B와 p24 단백의 생산

재조합 단백의 발현과 정제를 위해 E. coli BL21 균주 (RBC Bioscience, Taipei City, Taiwan)에 pET23a-Ag85B 또는 p24를 형질전환시켰다. 0.4 mM isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG, Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands)를 넣어 단백 발현을 유도시켰다. 형질전환 박테리아를 모아 얼음에서 10분간 초음파처리를 통해 파괴하였다. 이어 초음파 처리된 융해물을 원심분리 (1,600 x g, 20 min, 4℃) 한 후, 펠렛을 4 M urea가 포함된 결합 완충액 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) 에 재부유시켰다. 단백질은 Ni-NTA His binding resin (Merck, Darmstadt, Germany)를 사용하여 정제 후, 4 M urea가 포함된 elution buffer (300 mM NaCl, 50 mM sodium phosphate buffer, 250 mM imidazole)로 녹여 분리하였다. 정제 단백은 용출 완충액에 지속적으로 투석하여 imidazole, urea와 잔염기등을 제거하였다.

HIV-1 p24 Gag를 발현하는 재조합 M. smegmatis ( rSmeg ) 균주의 제작

상기 제작한 pMV306-p24, pAL-p24, pMyong2-p24 플라스미드를 각각 M. smegmatis mc² 155 균주에 전기천공법(electroporation, using the Gene Pulser II electroporation apparatus Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 형질전환시켰다. 형질전환된 재조합 균주들 (rSmeg-pMV306-p24, rSmeg-pAL-p24, rSmeg-pMyong2-p24)을 OADC와 kanamycin (100 μg/ml)이 보충된 Middlebrook 7H10 고체 배지 (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)에서 선별하였다. 선별된 콜로니는 0.5% glycerol, 0.05% Tween-80, 10% ADC와 kanamycin이 보충된 7H9 액체 배지 (Difco Laboratories)에 옮겨 3일간 배양하였다. 야생형 M. smegmatis와 재조합 균주간 성장률을 비교하기 위해, 600 nm에서 0.2 OD로 맞춰진 균주를 사용, 시간별로 흡광도를 측정하여 성장률을 비교하였다.

rSmeg 재조합 균주 내 p24 Gag 발현 양상 비교 측정

상기 제조한 재조합 균주 간 p24 Gag 발현량을 비교하기 위해, Western blot과 ELISA를 다음과 같이 수행하였다. 우선, 배양된 재조합 균주를 lysozyme (100 μg/ml), DNase (5 U/ml), proteinase inhibitor가 보충된 B-PER buffer (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)에 부유시킨 후 얼음에서 5분간 sonication (pulse: 0.3 sec, stop: 0.7 sec)을 진행하였다. 그 후 분쇄액을 원심분리하여 (13,000 rpm, 15 min, 4℃) 상층액을 취해 단백질을 정량하였다 (Quick Start^TM Bradford Protein Assay; Bio-Rad, USA). 이어 각 재조합 균주에서 분리한 단백질 샘플을 샘플 버퍼와 섞어 100℃에서 5분간 가열하였다. 가열된 샘플을 12.5% SDS-PAGE gel에 내린 후 nitrocellulose (NC) membrane에 전달하였다. Membrane을 5% skim milk (in TBST)에 넣어 1시간 동안 상온에서 블락킹하였다. 그 후, mouse anti-p24 monoclonal antibody (Abcam, Cambridge, USA; 1:1,000 dilution)을 넣어 4℃에서 overnight으로 반응시켰다. 그 후, HRP-conjugated goat anti-mouse secondary antibody (Abcam, 1:2,000 dilution)를 넣어 상온에서 한 시간 동안 반응시켰다. 모든 단계에서 TBST (0.05% Tween-20)로 membrane을 세척해 주었다. 면역 반응 신호는 membrane에 WEST-one^TM Western blot Detection System(iNtRON, Kyungkido, Republic of Korea)를 처리하여 LAS-3000 (Fujifilm, Tokyo, Japan)으로 검출하였다. 내부 대조군으로 mycobacterial Hsp65 (Abcam, 1:1,000 dilution)을 사용하여 모든 샘플이 동일한 양으로 내려졌는지 확인함.

이어 rSmeg-pMyong2-p24 균주에 의한 안정적인 p24의 발현 여부를 확인하기 위해, 다양한 계대 시점 (1, 4, 6, 8, 10 and 12 passages)에서 단백질을 분리한 후 p24의 발현을 확인하였다. 계대는 kanamycin이 포함되거나 포함되지 않은 7H10 고체 배지에서 수행되었으며, 각 계대별로 콜로니를 선택하여 3일간 7H9 액체배지에 배양 후 실험을 수행하였다. 또한 동일한 양의 단백질을 사용, p24 ELISA (ABL, Rockville, USA)를 수행하였다.

마우스 골수 세포 유래 수지상 세포의 분화

8~12주령의 BALB/c 마우스의 골수 세포를 넙다리뼈와 정강뼈로부터 serum-free Iscove’s modified Eagle medium (IMDM; Gibco Invitrogen, UK)을 사용하여 분리한 후, 단일 세포 부유액을 nylon cell strainer (70 μm Nylon mesh; SPL, Korea)를 통해 걸러내고 1 x 10⁶에 해당하는 수의 세포 [in complete IMDM supplemented with 10% FBS (Gibco Invitrogen), recombinant mouse GM-CSF (1.5 ng/ml; PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) 및 mouse IL-4 (1.5 ng/ml; PeproTech, USA), penicillin (100 units/ml; Gibco Invitrogen), streptomycin (100 μg/ml; Gibco Invitrogen), gentamicin (50 μg/ml; Gibco Invitrogen), L-glutamine (2 mM; Gibco Invitrogen), 및 β-mercaptoethanol (50 nM; Gibco Invitrogen)]를 24 웰 플레이트에 분주하여 6일간 분화시켰다.

분화된 미성숙 BMDC (bone-marrow derived dendritic cell, 골수세포유래 수지상세포)에 야생형 M. smegmatis 또는 각 p24 재조합 균주를 감염시키거나 lipopolysaccharide (LPS, 1 μg/ml; Sigma Aldrich)를 18시간 동안 처리하여 수지상 세포를 성숙시켰다.

감염된 수지상 세포 및 J774.1 세포 내 p24 발현 양상 분석

18시간 배양된 J774A.1 및 BMDC (5~10 x 10⁵ cells/well; 24well plate)에 10 M.O.I에 해당하는 각 재조합 균주를 감염시킴. 감염 후 2시간 뒤, 세포 외 박테리아를 제거하기 위해 PBS로 3회 세척하였다. 감염된 J774A.1 및 BMDC를 24시간 배양한 후, RIPA lysis buffer로 세포를 용해시킨 후, 단백을 추출하여 세포 내 p24 발현 양상을 p24 ELISA로 확인하였다.

T 세포 증식 분석

T cell proliferation assay를 수행하기 위해, p24 단백으로 면역된 마우스의 CD4, CD8 T 세포와 야생형 및 재조합 균주가 감염된 DC를 사용하였다. 첫째로, p24 단백을 꼬리정맥에 투여한 마우스를 7일 후 희생시켜 비장세포를 분리하고 분리된 비장세포를 ice-cold FACS buffer [PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA) and 1mM EDTA]로 세척하였다. 그 후, super block solution [10% rat sera (Sigma Aldrich), 10% goat sera (Gibco Invitrogen), 10% mouse sera (Sigma Aldrich), and 2.4G2 monoclonal antibody (10 μg/ml; BD Biosciences, San Diego, CA, USA)]를 넣어 30분간 ice에서 blocking을 진행하였다. 그 후 BV421-conjugated anti-CD4 (Clone GK1.5, BD Biosciences)와 PE-conjugated anti-CD8a (Clone 53-6.7, eBioscience, San Diego, CA, USA)를 붙여 30분간 ice에서 염색한 후, ice-cold FACS buffer로 3회 세척하였다. 그 후 FACS AriaIII 기기 (BD Biosciences)를 통해 CD4와 CD8 T cell population을 분리하였다.

또한 immature DC에 야생형 및 세 종류의 rSmeg 균주 (rSmeg pMV306-p24, pAL-p24 and pMyong2-p24)를 10 M.O.I.로 24시간 감염시켰다. 분리된 CD4와 CD8 T cell을 5 μM의 CFSE로 37℃에서 4분간, 그리고 ice에서 4분간 염색하였다. 그 후 감염된 DC와 CFSE로 염색된 CD4, CD8 T cell을 co-culture한 후, ice에서 30분간 super block solution으로 blocking한 후 BV421-conjugated anti-CD4 antibody와 PE-conjugated anti-CD8a antibody로 30분간 ice에서 염색하였다. 세포 분열 여부는 FACS LSRFortessa (BD Biosciences)를 사용하여 측정하고, Flowjo software를 사용하여 분석함. 모든 실험은 독립적으로 세 번 수행하였다.

IL-2 ELISA 분석

T cell proliferation을 위한 co-cultured cell의 상청액을 취해, IL-2의 발현량을 제조자의 방법대로 ELISA로 측정하였다(BioLegend, San Diego, CA, USA).

Enzyme-Linked Immuno Spot ( ELISPOT ) assay

야생형 및 재조합 균주가 면역된 마우스의 비장세포를 사용하여 ELISPOT assay를 수행하였다. 96-well PVDF membrane ELISPOT plates에 마우스 IFN-γ (3 μg/ml, clone AN-18) capture antibody (BD Biosciences)를 코팅하여 4℃에서 하룻동안 배양하였다. Capture antibody를 버려낸 후, 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지 200μl를 각 well에 넣어 37℃에서 3시간 가량 blocking을 진행하였다. Blocking 후, 각 실험군의 비장세포를 5 x 10⁵cell수준으로 각 well에 넣어줌. 각 실험군에 5 μg/ml의 p24 antigen을 처리하거나 배지를 처리하여주었다 (no stimulation). Positive control로 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (5 μg/ml; Sigma-Aldrich)와 ionomycin (500 ng/ml; Sigma-Aldrich)를 처리하여 사용함. Plate는 37℃에서 하룻동안 배양함. PBST와 PBS로 각각 3회 세척한 후, biotin-labeled mouse IFN-γ (3 μg/ml, clone XMG1.2) detection antibody (BD Biosciences)를 각 well에 처리하여 4℃에서 하룻동안 배양하였다. 각 well을 세척한 후, horseradish peroxidase (HRP)-conjugated streptavidin을 처리한 후, 3-amino -9-ethylcarbazole (AEC) substrate reagent (BD Biosciences)로 발색하였다. ELISPOT reader (AID ELISPOT Reader, Strassberg, Germany) 를 통해 well 당 spot forming units (SFUs)의 수를 계산하였다.

rSmeg 재조합 균주로 면역화된 마우스에서 사이토카인 분석

각각의 균주에 면역된 마우스의 비장세포를 96 well plate에 1 x 10⁶ cell수준으로 seeding한 후 5 μg/ml의 p24 antigen을 각 well에 처리하여 세포를 자극시켰다. 그 후 세포 배양액을 걷어 IL-2 (BioLegend), TNF-α (eBioscience) (24시간 배양), IL-10 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), 그리고 IFN-γ (BioLegend) (72시간 배양)에 대한 ELISA를 수행하였다.

혈청 항체 검출

혈청 내 항체 비율을 측정하기 위해, 각각의 균주로 면역된 마우스를 CO₂ 과호흡으로 안락사시킨 후 heart puncture를 통해 혈청 샘플을 준비하였다. 96 well plate에 p24 protein (5 μg/ml)을 0.05 M carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.6)에 섞어 각 well에 코팅하였다(4℃, overnight). 각 well을 PBST와 PBS로 각각 3회 세척한 후, 5% bovine serum albumin (BSA, in PBST)를 처리하여 상온에서 한 시간 배양함 (blocking). 혈청 샘플을 1:10의 비율로 PBS에 희석하여 각 well에 처리한 후 2시간 동안 상온에서 배양하였다. 그 후, PBST와 PBS로 각각 3회 세척하고, IgG2a와 IgG1 antibody (BD Biosciences, 1:1,000 dilution)으로 상온에서 1시간 처리하였다. 그 후 각 well을 세척하고 HRP conjugated streptavidin을 상온에서 30분간 붙인 후, BD OptEIA substrate (BD Biosciences)로 발색시키고 1 N H₂SO4로 반응을 중지시킴. 분광광도계로 450 nm에서 흡광도(optical density, OD)를 측정하였다.

Cytotoxic T lymphocyte ( CTL ) 분석

P815 세포 (H-2^d)에 p24 또는 Ag85B-ESAT-6가 포함된 플라스미드 (pcDNA3.3-p24 or Ag85B)를 lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA)로 전달이입시켰다. 각각의 발현 벡터는 p24 (pNL4-3-deltaE-EGFP vector에서 증폭) 또는 합성된 Ag85B-ESAT6 (M. tuberculosis ATCC 27294의 genomic DNA에서 증폭)의 염기서열을 pcDNA^TM 3.3-TOPO® TAcloningvector(Invitrogen)에 클로닝하여 만들었다. 전달이입된 세포를 target cell (5 x 10⁴ cells)로 하여 CTL assay에 사용하였다. Transfection되지 않은 세포를 negative control로 사용하였다. Transfection된 세포에서의 항원 발현 (p24 and Ag85B-ESAT6)을 확인하기 위해, 각 세포의 lysates를 대상으로 western blot을 진행함. Ag85B-ESAT6 발현 확인을 위해, rabbit anti-Mycobacterium tuberculosis Ag85B antibody (Abcam, 1:1,000 dilution)과 HRP-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody (Abcam, 1:2,000 dilution)를 사용하였다. 각 lane에 동일량의 단백이 내려졌는지 확인하기 위한 internal control로 β-actin (Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA; 1:1,000 dilution) 항체를 사용하였다.

각 마우스의 비장세포 (5 x 10⁶ cells/well)에 p24 및 Ag85B 항원 (5 μg/ml)을 처리하여 6일 배양한 후 effector cell로 사용하였다. 또한, HIV-1 gag 특이 CTL 반응을 더 확인하기 위해, MHC class I-restricted p24 peptide, A9I (AMQMLKETI) (10 μg/ml; Peptron, Daejeon, South Korea)와 IL-2 (30 U/ml; PeproTech, Rocky Hill, USA)를 처리한 비장세포도 effector cell로 사용하였다. 이 경우, P815 세포와 A9I peptide (10 μg/ml)을 2시간 동안 같이 배양한 후, target cell로 사용하였다.

세포 독성을 평가하기 위해 lactate dehydrogenase (LDH) assay (CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay; Promega, Madison, USA)를 진행함. Effector cell과 target cell을 각기 다른 effector/target (E/T) 비율 (10:1, 20:1, 50:1)로 6시간 동안 co-culture한 후, 세포 배양액 내 방출된 LDH 값을 490 nm에서 분광광도계로 측정하였다. 항원 특이적인 세포 독성의 비율은 다음과 같은 공식으로 계산함: [(Experimental Effector spontaneous Target spontaneous)/(Target maximum Target spontaneous)] x 100 (%).

생장곡선측정

상기 제조한 각 재조합 균주 (rSmeg-pMV306-p24, rSmeg-pAL-p24, rSmeg-pMyong2-p24)를 7H9 액체배지 (supplemented with 0.5% glycerol, 0.05% Tween-80, 10% ADC and 100 μg/ml kanamycin)에 키운 후, 흡광도(optical density at 600 nm)를 0.2에 맞춰 생장률을 측정하기 위한 실험을 진행하였다. 야생형 M. smegmatis의 경우, kanamycin이 포함되지 않은 7H9 액체배지에 배양하였다. 그 후, 각 시간대 별로 배양액을 취해 OD₆₀₀에서의 흡광도를 측정하여 생장 그래프를 작성하였다.

세포주 감염 실험

마우스 마크로파지 세포주인 J774A.1과 마우스에서 분리한 골수세포유래 수지상세포 (bone marrow derived dendritic cells, BMDCs)는 각각 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, supplemented with 10% FBS, 2mM glutamine, penicillin, streptomycin, essential amino acids)과 Iscove’s modified Eagle medium (IMDM, supplemented with 10% FBS, mouse 1.5 ng/ml GM-CSF, 1.5 ng/ml IL-4, penicillin, streptomycin, gentamicin, L-glutamine, β-mercaptoethanol)에서 배양하였다. 균주 감염 하루 전날, 각 세포를 24 well plate에 5 x 10⁵ cells/well로 분주하여 배양하였다. 각 재조합 균주 (rSmeg-pMV306-p24, rSmeg-pAL-p24, rSmeg-pMyong2-p24) 및 야생형 M. smegmatis 균주를 10 M.O.I.로 준비하여 분주한 세포에 감염시킴. 감염 두 시간 후에 세포 외 미부착 균주를 제거하기 위해 PBS로 3회 washing한 후, 새로운 배지로 갈아주어 24시간 배양하였다. 이어 24시간 후, 세포 배양액은 제거하고, PBS로 3회 washing한 후, 세포를 0.05% Triton X-100으로 떼어내어 융해 (lysis) 하였다. 균질화된 세포 용해액을 적절한 희석배수로 희석하여 7H10 고체 배지 (10% OADC 및 100 μg/ml kanamycin 포함) 도말하여 자란 콜로니를 카운팅, colony forming units (CFUs)를 측정하였다.

실시예 1. 본원에 따른 rSmeg - pMyong2 -p24 균주에 의한 박테리아 및 감염된 쥐 대식 세포 세포주에서HIV -1 p24 Gag 발현 증가

HIV-1 p24 Gag 백신의 생산을 위해 최적의 재조합 균주를 선별하고, 유용성을 분석하기 위해, 총 3가지 유형의 p24 발현 벡터, 즉 rSmeg-pMyong2-p24, rSmeg-pAL-p24 및 rSmeg-pMV306-p24를 발현하는 균주를 제조하였다. 이에 사용된 벡터는 도 1에 개시되어 있다. 상기 세 종류의 균주는 7H9 배지 (100㎍ / ml의 카나마이신 포함)에서 성장 속도를 5일 동안 비교했을 때 본원에 따른 rSmeg-pMyong2-p24 균주는 성장 초기 즉 6시간에서부터 48시간까지 성장이 지연되는 것으로 나타났다. 그러나 48시간이 지난 후에는 3개의 균주 모두 거의 동일한 성장률을 보였다.

세 종류의 rSmeg 균주에서 p24의 발현량을 ELISA와 웨스턴블랏으로 분석하였다. 결과는 도 2a 및 도 2b에 개시되어 있다. 모든 rSmeg 균주에서 p24가 발현되는 것으로 나타났으나, 특히 rSmeg-pMyong2-p24 균주는 다른 두가지 균주와 비교하여 발현량이 약 5 내지 10배 높은 것으로 나타났다.

이어 p24 발현의 안정적인지를 분석하기 위해, p24 발현 농도를 다양한 계대의 rSmeg-pMyong2-p24 균주를 카나마이신 함유 또는 비함유 7H10 한천 플레이트에서 배양하였다. 카나마이신을 포함한 배지에서는 12대 계대 후에도 rSmegpMyong2-p24 균주는 안정한 p24 항원을 발현하는 것으로 나타났다. 그러나, 카나마이신 비함유 배지에서 성장한 경우에는 6 계대 후에 p24의 발현의 안정성이 급격이 저하되었다. 이는 외인성 p24의 과발현을 유도할 수 있는 고카피 수의 pMyong2-TOPO 벡터가 없어지기 때문인 것으로 판단된다.

세 종류의 rSmeg 균주에서 p24의 발현량 차이가 감염된 대식세포 및 감염된 BMDC에서 반복될 수 있는지를 또한 감염된 J774A.1 세포와 마우스 BMDC에서 ELISA를 통해 분석하였다. 결과는 도 2c에 있다. 감염된 J774A.1 세포와 마우스 BMDC에서도 용균된 박테리아에서 관찰된 것과 유사한 경향이 관찰되었으나, 그 차이는 더 두드러졌다. 종합하면, 상기 결과는 rSmeg-pAL-p24 및 rSmeg-pMV306-p24와 비교하여, 본원에 따른 rSmeg-pMyong2-p24는 감염된 대식세포뿐만 아니라 박테리아에서도 p24의 생산량이 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본원에 따른 rSmeg-pAL-p24는 동물 또는 인간에 접종시에, 항원제시 세포에 더 많은 p24 항원을 제시함으로써, 다른 두 균주와 비교하여 향상된 p24 항원 특이적 면역반응을 유도할 가능성을 나타내고, 백신으로서 효과적으로 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 2. rSmeg - pMyong2 -p24 균주에 감염된 BMDC는 HIV-1 p24 Gag에 의해 면역 된 마우스 T 세포로부터의 향상된 T 세포 증식 유도

rSmeg-pMyong2-p24에 의한 p24 단백질 생산 증가가 T 세포 증식능을 향상시켰는지 여부를 시험하기 위해, T 세포 증식 능력을 향상시켰고, 우리는 감염된 T 세포 증식 분석을 실시하였다. Smeg-pMyong2-p24, rSmeg-pAL-p24 및 rSmeg-pMV306-p24의 3가지 다른 종류의 균주로 감염된 BMDC의 T 세포 증식 분석 및 대조군으로서 야생형 균주에서 혼합 림프구 반응 (MLR) 분석에서 CFSE 염료 희석을 측정하였다. T 세포 증식 분석을위한 개략도는 도 3a에 기재되어있다. 4종류 Smeg 균주 (3종류 rSmeg 및 야생형)로 감염된 모든 BMDC는, M.smegmatis 균주에 감염되지 않은 BMDC와 비교하여 유의하게 높은 수준으로 CD4 T 세포 증식을 유도했다. 특히 주목할 것은, rSmeg-pMyong2-p24에 감염된 BMDC는 다른 두 종류의 rSmeg 및 야생형에 비해 CD4와 CD8 T 세포의 증식이 유의하게 높았다. rSmeg 균주 rSmeg-pAL-p24와 rSmeg-pMV306-p24는 차이가 없는 것으로 나타났다. CD4 T 세포 증식에서도 rSmeg-pAL-p24 또는 rSmeg-pMV306-p24에 감염된 BMDC는 야생형과 유사한 증식 수준을 보였다 (도 3b 및 c). 자극된 CD4 및 CD8 T 세포로부터의 IL-2 양의 비교 결과도 T 세포 증식 분석의 결과와 유사한 경향을 보였다. 그 결과, rSmeg-pMyong2-p24에 감염된 BMDC는 다른 두 종류의 rSmeg 균주에 감염된 BMDC 및 야생형과 비교하여, CD4 및 CD8 T 세포 모두로부터 유의하게 높은 수준의 IL-2 분비를 유도한 것으로 나타났다(도 3d). 종합하면, 이러한 결과는 본원에 따른 rSmeg-pMyong2-p24가 DC와 같은 항원 제시 세포로의 항원제시를 증가시킴으로써 T 세포 증식을 유도하여 백신의 효능을 강화시킬 수 있음을 나타낸다.

실시예 3. rSmeg - pMyong2 -p24 균주의 피하 면역화피하 면역화에 의해 생성된 마우스 비장에서 향상된 HIV-1 p24 Gag 특이적 IFN -γ 스팟 형성 세포 ( SFC ) 유도.

백신 접종 후 rSmeg-pMyong2-p24가 T 세포 반응을 개선하였는지 여부를 테스트하기 위해 세가지 종류의 rSmeg 균주, rSmeg-pMyong2-p24, rSmeg-pAL-p24, rSmeg-pMV306-p24 (~ 10⁶ CFU) 및 야생형 균주 각각으로 피하 면역화된 BALB / c 마우스의 비장으로부터 비장 세포를 분리하여, IFN-γ ELISPOT 분석을 사용하여 HIV-1 p24 Gag 특이적 T 세포 반응을 검정하였다 (도 4a). 두 종류의 rSmeg 균주, rSmeg-pMyong2-p24 및 rSmeg-pAL-p24로 면역환된 마우스의 비장세포는 대조군 rSmeg-pMV306-p24 균주의 경우보다 유의적으로 높은 SFU를 나타냈다. 주목할 점은 rSmeg-pMyong2-p24 (146.33 ± 66.91 SFU / 5 × 10⁵ 췌장 세포)로 면역화한 마우스의 비장 세포는 rSmeg-pAL-p24 (63.63 ± 15.72 SFU / 5 × 10⁵ 비장 세포) 및 rSmeg-pMV306-p24 (63.63 ± 15.72 SFU / 5 × 10⁵ 비장 세포)로 면역화된 비장세포와 비교하여 유의적으로 높은 SFU를 나타냈다 (도 4b). 흥미롭게도 SFC 수치의 유의한 차이는, T 세포 증식이나 p24 발현에는 차이가 거의 나타나지 않은 rSmeg-pAL-p24와 rSmeg-pMV306-p24의 두 가지 rSmeg 균주간에 관찰되었다. 상기 결과는 rSmeg-pMyong2-p24으로 백신이 접종된 동물에서 향상된 효과가 T 세포 기능을 유도할 수 있음을 나타낸다.

실시예 4. rSmeg - pMyong2 -p24 균주에 의한 Th1 면역 반응과 관련된 사이토 카인을 생성.

rSmeg 균주로 2차 면역화 한 지 2주 후에 얻은 비장 세포(도 4a)를 정제 p24 단백질 (5㎍ / ml)로 시험관내에서 자극하고, IL-2, IFN-γ, TNF-α 및 IL -10 사이토카인을 세포 배양 상등액에서 측정하였다. rSmeg-pMyong2-p24 면역화된 비장 세포의 경우, 모든 Th1 면역 반응 관련 사이토카의 농도는 다음과 같이 대조군 및 다른 두 균주와 비교하여 유의적으로 높았다: IL-2, rSmeg-pMV306-p24 대 rSmeg-pAL-p24 대 rSmeg-pMyong2-p24 : 1.37 ± 0.37 vs. 2.27 ± 0.54 vs. 5.95 ± 0.66 pg/ml; IFN-γ : 11.78 ± 2.16 대 22.67 ± 5.44 대 42.95 ± 3.21 pg / ml 및 TNF-α : 16.00 ± 2.26 vs.21.08 ± 3.77 vs. 28.92 ± 3.41 pg / ml. rSmeg-pMyong2-p24 균주 또한 IL-10 방출 수준을 증가시키는 것으로 나타났으나, 사용된 모든 균주에서 유사한 수준이었다: rSmeg-pMV306-p24 대 rSmeg-pAL-p24 대 rSmeg-pMyong2-p24 : 43.88 ± 3.87 대 52.12 ± 3.85 대 55.72 ± 3.12 pg / ml)을 보였다 (도 4c ).

실시예 5. rSmeg - pMyong2 -p24 균주로 면역화된 마우스에서 HIV-1 p24 Gag 특이적 Th1 바이어스 체액 반응 유도

면역화된 쥐에서. rSmeg-pMyong2-p24가 Th1- 바이어스 체액 반응을 유도하는지를 시험하기 위해, Th1 및 Th2 반응에 대한 마커로 알려진 HIV-1 p24 Gag 특이적 IgG2a 및 IgG1의 농도를 각각 분석하였다. 세 종류의 rSmeg-pMyong2-p24, rSmeg-pAL-p24 및 rSmeg-pMV306-p24의 상이한 균주로 피하 면역화된 BALB / c 마우스 및 대조군으로서 야생형 균주의 혈청을 분석하였다. 결과로 도 4d에 나타난 바와 같이, rSmeg-pMV306-p24를 제외하고, rSmeg-pMyong2-p24 및 rSmeg-pAL-p24는 모두 야생형보다 유의하게 높은 수준의 IgG2a 아이소 타입을 유도하였다. IgG1 이소 타입과 관련하여, rSmeg-pMyong2-p24는 rSmeg-pAL-p24보다 낮은 수준의 IgG1을 유도했다; 그러나 이는 통계적으로 유의하지 않았다 (P = 0.146). IgG2a / IgG1 비율이 높으면, 더 높은 Th1- 바이아스 체액 면역 반응을 나타내며, IgG2a / IgG1 비율은, 다른 유형의 Smeg (야생형 = 1.05; rSmeg-pAL-p24 = 1.03; rSmeg-pMV306-p24 = 0.97)에 의해 면역된 것과 비교하여, rSmeg-pMyong2-p24 균주 (1.21)로 면역화된 혈청에서 가장 높은 것으로 나타났다(도 4d), 이러한 결과는 rSmeg-pMyong2-p24 균주가 면역화된 마우스에서 향상된 HIV-1 p24 Gag 특이적 Th1- 바이어스 체액 반응을 유도하고, 그 결과 백신으로서 효과적으로 사용될 수 있음을 나타낸다.

실시예 6. rSmeg - pMyong2 -p24 균주로 면역화 된 마우스에서 향상된 HIV-1 p24 Gag 특이적 세포 독성 T 림프구 반응 유도

rSmeg-pMyong2-p24로 면역화된 마우스에서 향상된 HIV-1 p24 Gag 특이적 세포 독성 T 림프구 (CTL) 반응을 유도하는지를 시험하기 위해, 4가지 다른 유형의 Smeg 균주, 즉 3 rSmeg: rSmeg-pMyong2-p24, rSmeg-pAL-p24 및rSmeg-pMV306-p24 및 야생형 균주로 면역화 된 비장 세포의 CTL 활성을 LDH 세포 독성 분석을 사용하여 분석하였다. 면역화 된 절차는 도 4a에 기술되어있다. p24 또는 Ag85B-ESAT-6 융합 유전자 (pcDNA3.3-p24 또는 pcDNA3.3-Ag85B-ESAT-6)를 갖는 플라스미드로 형질 감염된 P815 세포 (H-2^d)는 표적 세포로 사용되었고 이펙터 (E)/ 표적 세포 (T)의 비는 각각 10:1, 20:1 및 50:1 이다. 각 형질 감염된 P815 세포의 발현은 웨스턴 블랏 분석에 의해 확인되었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 50:1의 E:T 비율에서, rSmeg-pMyong2-p24로 면역화된 마우스의 CTL은 다른 Smeg 균주와 비교하여 현저하게 높은 수준의 HIV-1 p24 Gag 특이적 표적 세포 융해를 유도하였다(도 5b). 이러한 결과는 rSmeg-pMyong2-p24가 4가지 유형의 Smeg 균주 중 항원 제시 세포 (APCs)로 발현된 p24를 가장 많이 제시하기 때문으로 판단된다. 그러나 4 균주 중 Ag85B 특이적 CTL 사멸에는 유의한 차이가 없었다 (도 5a). 그 이유는 벡터 유형 또는 Smeg 균주에 관계없이 거의 동일한 수준의 Ag85B가 APC에 제시될 수 있기 때문으로 판단된다. 사실, M. tuberculosis Ag85B와 70% 초과하는 아미노산 서열 상동성을 갖는 Ag85B orthologue (diacylglycerol acyltransferase / mycolyltransferase, fbpB) (GenBank 수탁 번호 NC_008596)가 M. smegmatis 균주 700084 / mc² 155 (NC_008596, NC_008596) 게놈에서도 발견되었다. 따라서 Smeg 균주 (야생형 1개와 재조합 3개의 균주)로 백신 접종된 마우스 사이에서 발견되는 유사한 수준의 Ag85B 특이적 CTL 반응은 균주간에 유사한 양으로 발현될 수 있는 M. smegmatis Ag85B orthologue의 존재 때문으로 판단된다. 하지만 도 5a의 결과는 결핵 항원인 Ag85B에 대한 cytotoxic T lymphocyte 반응을 유도시키는 것으로 나타났기 때문에, 이는 본원에 따른 균주가 결핵 백신으로 작용할 수 있음을 나타낸다. 또한 rSmeg 균주에 의한 p24 특이 CTL 반응을 확인 및 비교하기 위해, p24 펩티드 A9I를 세포 독성 분석에도 사용하였다. 이 펩티드는 BALB / c 마우스 (H-2^d) 의 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 제한 p24 에피토프로 알려져 있다. 그 결과는 rSmeg-pMyong2-p24 균주가 다른 rSmeg 균주와 비교하여 A9I 펩타이드로 펄스 된 P815 표적 세포와 비교하여 더 강한 CTL 반응 (세포 독성의 50% 이상)을 유도할 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본원에 따른 rSmeg-pMyong2-p24 균주가 면역화 된 마우스에서 향상된 HIV-1 p24 Gag 특이성 CTL 반응을 유도 할 수 있어, 효과적 백신으로 사용될 수 있음을 나타낸다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본원에서는 기존의 문제점을 해결할 수 있는 rSmeg의 백신 효능을 촉진하는 적절한 Mycobacterium 벡터 시스템을 탐색하기 위해, mycobacterial hsp65 promoter 하의 3개의 상이한 벡터 시스템 (2개의 에피조말 벡터, 세포 당 2-6개의 복제를 갖는 pAL5000 유도 벡터 및 복제 수가 pAL5000 벡터보다 37배 더 많은 pMyong2 유래 벡터 및 하나의 인테그레이팅 벡터 pMV306)을 비교하였다. 그 결과는 pMyong2 벡터를 갖는 rSmeg-pMyong2-p24에서 최상의 발현이 달성되었다(도 2a 및 b). 또한, rSmeg-pMyong2-p24는 12 계대 이후에도 안정하게 p24 항원을 발현하였다. 또한, p24 발현의 더욱 현저한 차이는 감염된 식세포에서 나타났으며(도 2c), 이는 BMDC의 향상된 p24 특이적 T 세포 증식과 관련된 바이어스(도 3b 및 c), T 세포 이펙터 기능(도 4b 및 c), 특히 CTL(도 5), 및 rSmeg-pMyong2-p24의 Th1- 바이어스된 체액성 면역 반응(도 4d)에서도 관찰되었다.

7H9 배지에서 3 rSmeg 균주의 성장 속도의 비교는 다른 rSmeg와 비교하여 rSmeg-pMyong2-p24 균주가 0 내지 48시간의 간격 동안 성장 지연이 있는 것으로 나타났다. 이러한 차이는 본원에 따른 벡터의 높은 카피수가 압력으로 작용했기 때문일 수 있다. 이러한 발견은 rSmeg-pMyong2-p24가 다른 rSmeg 균주보다 대식세포 또는 생체 내 마우스 감염에서 더 약독화(attenuated)될 수 있음을 암시한다. 실제 본원에서는 대식세포의 감염 후 rSmeg-pMyong2-p24가 rSmeg-pAL-p24나 rSmeg-pMV306-p24 보다 2-3배 적은 콜로니(CFU)를 형성한다는 것을 발견했다. 이러한 발견은 약독화된 Smeg가 야생형 보다 더 많은 항원을 식세포에 제시하여 보다 강한 면역반응을 유지한다고 알려져 Junqueira-Kipnis, A. P. et al. Prime-Boost with Mycobacterium smegmatis Recombinant Vaccine Improves Protection in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis. PLoS One 8, doi: 10.1371/journal.pone.0078639 (2013)) 있는 것을 고려하면, 이러한 결과는 본원에 따른 rSmeg-pMyong2-p24 균주가 백신으로 보다 효과적으로 작용할 수 있다는 부가의 장점을 나타낸다.

요약하면, 본원에서는 본원에 따른 rSmeg-pMyong2-p24가 pAL5000 또는 pMV306 유도 시스템을 사용하는 다른 rSmeg 균주와 비교하여 더 높은 수준의 HIV-1 p24 Gag 단백질 발현을 유도하고 더 많은 p24 항원을 식세포로 전달할 수 있음을 입증했다. 나아가 이러한 균주가 감염된 BMDC의 T 세포 증식 능력을 향상시키고 접종된 쥐에서 향상된 T 세포 효과기 기능과 Th1 바이어스된 체액 면역 반응을 유도할 수 있음을 보여 주었다. 이러한 결과는 본원에 따른 rSmeg-pMyong2-p24가 HIV-1 또는 HIV-1과 결핵과의 동시 감염에 효과적인 후보 백신이 될 수 있음을 나타내는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

<110> Seoul National R&DB Foundaton <120> Recombinant Mycobacterium smegmatis with vector expressing Human Immunodeficiency Virus Type I p24 and vaccine comprising the same <130> DP201712003P <150> KR 10-2017-0001715 <151> 2017-01-05 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7445 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMyong2-p24 <220> <221> CDS <222> (3161)..(3856) <223> HIV type 1, p24 <220> <221> misc_feature <222> (2780)..(2785) <223> EcoRV restriction site for cloning <220> <221> misc_feature <222> (3860)..(3865) <223> XbaI restriction site for clonning <400> 1 agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60 acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120 tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180 ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcttg 240 gtaccgagct cggatccact agtaacggcc gccagtgtgc tggaattcgc ccttaggcgg 300 gcaacacgac atctcaatag ttggcacgga gctcctaaac gacgacagcc ccgctaatgc 360 ggggccgcaa cgtcgatttg gctctacttc gtctctggag tttcgtctct ggagtttcag 420 gtccgagcgg ctaactcggt cctaggcgtc tcccgtgccg cgcccccgaa gggacagtct 480 tgctggactg gtctcacggt agcgcatacc cgaatcagat tcgtggtgac gcgcaaaacc 540 gtgatctcac atttacagat tcccgtgcat ccgtgtgcac ggattcacgc ccatctgggc 600 attcacgtgg ccgttttggt gcctccgtct gggctctcgt cgctcccggc ggcgcgtcgt 660 ggtgacaacc gcgttcgacg cggcagagat tgccgccgcg gtcccggaat ctggctcacc 720 gtgcagcggt acagcgtcag ctcgactgcg cagaatccgc gccaaggaag cccgcagggc 780 gtcgatcgaa cgctgtgggg cggtgccggc cgcggtgccg atgtggtcgt cgcgggagtt 840 gtggactgcc gatctgcggg tgcttttgtc gggtccggag ttcagcacgc gccgggtgat 900 ttcggcggcg acggtgctcg ctgtcgcggt ggcgatggcc gagttcgccg accatgccac 960 gggccgcaat gtggcggtga caaacgaggt tctggccgag cgcgcgaggt gttctaagcg 1020 ttcggtgacc gcggcgcgcg gggtgttgaa agcgttgggt gtcgcggtgg aagcggtacg 1080 tgggcatggc tctgcgacca cacacacggt cggtaatcga ccgagcattt ggcacctggt 1140 aagccgacgc cagcccacca tcgacaaccc gcccacggcc ccgcagaacg gccgcggcga 1200 gcctgccgat acggtgcccg atcgcggcca gagcgcgccc gtggctgtgg agacttgcga 1260 cctaccacca tcccgtaggg ataggtgggt aactcctgtt gagaattact caccaagcac 1320 gcgcgagcgc gcgagcgcgg aaaattcttc cccaaaacaa acacaaccgg cgcggtcgcg 1380 gcggcgctac cgcgccacgc cgcgccccct ggacgttcag cgactcgccg ccggcctggt 1440 cacgccggca gtcggccacg gcccagacaa cgacgggcgg cgaaccgcgc tgatcgccgg 1500 cctggagcag ggccatatcg gggccatctg cgacgcgatc acgacggccg gcatcgacgc 1560 gaccgcctgg actccgaaga cgctcacggc ggcactgaac gccgacgcgc gggtgaccgg 1620 ctggtcgtgg ccggatcgca tcgaacgtcc tggcgcgttc ctggcgtcgc ggctgcgccg 1680 cctgcccgca cggcccgaca ccagtggccc ggttgacaac ggcctggatc aggcccgtag 1740 gacacccgtt gagccgtcag cggcccgtgt agcgccggta cagacggccg ctggccgcgc 1800 gtacgcccgt gcgttgttcg ccgagcagcg acggcaccgg gtgaccgccg ccaatgccca 1860 gtcagccgcg gtgccggtgc gccaaagtgc gccagaaacc gcggtgtgcg caacgtgcgg 1920 atgctcggac gcaccacggc ggcggttcct gccaacgcgg cgggctcaca tttgcgatgc 1980 ctgtttccaa ggatgtggtg gtgggcaggc gcgtactggt cgcgtcggaa cggtcggcag 2040 cagttccgcg gtgccacagt gccagtagtc gggcagggct tgcacgggga tgcggaccca 2100 tccgccggcc gcggccggcg atgggtccag tgtcgcgtta gggccgtcgt ccagccgcgc 2160 cagctcgcgg tcggatgcga tcagcttggc accgtagatg tcgtcgtggc ggcggtccca 2220 cgtgttggtg atgcggtcgc ggtaccagcc tgtccagtct tcgccggtgc cgccggcggt 2280 gagcccggcc cggtaccacg cttcgaggcg atcacggccc cgtgcgtggt tgatggtctg 2340 ggccgcagcc cagtccgcgt cacggagggc tctgtcggct tcgtccatga acccgcgccg 2400 ggtcatgtcg atgatggctg gcgacggggc gtcgtagggg cctggcatgg gcggaggcag 2460 tcggaactgt tgcggtttgc ttgcgttcag ttcctcgtcc tgctggtggg tgcggtcgtg 2520 cagggcaagg ctgtcgcggt accaggcgtc gagcgcggtg cgccagtccc cgccagtggc 2580 gtagggctcc cacggttgcg gtggcagggt ggtgaactcg tgcaggacca ggccgtcgat 2640 gtcgtcgcgc agttcttcac cggcgatggc ggcgatgcgg gcgcagtagc cgggcagatg 2700 gctacgccag tcggcgggca gttcgccgct gcgcgcccac cgcagcacat cggcccacaa 2760 cccaagggcg aattctgcag atatcggtga ccacaacgac gcgcccgctt tgatcgggga 2820 cgtctgcggc cgaccattta cgggtcttgt tgtcgttggc ggtcatgggc cgaacatact 2880 cacccggatc ggagggccga ggacaaggtc gaacgagggg catgacccgg tgcggggctt 2940 cttgcactcg gcataggcga gtgctaagaa taacgttggc actcgcgacc ggtgagtcgt 3000 aggtcgggac ggtgaggcca ggcccgtcgt cgcagcgagt ggcagcgagg acaacttgag 3060 ccgtccgtcg cgggcactgc gcccggccag cgtaagtagc ggggttgccg tcacccggtg 3120 acccccggtt tcatccccga tccggaggaa tcacttcgca atg cct ata gtg cag 3175 Met Pro Ile Val Gln 1 5 aac ctc cag ggg caa atg gta cat cag gcc ata tca cct aga act tta 3223 Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu 10 15 20 aat gca tgg gta aaa gta gta gaa gag aag gct ttc agc cca gaa gta 3271 Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val 25 30 35 ata ccc atg ttt tca gca tta tca gaa gga gcc acc cca caa gat tta 3319 Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu 40 45 50 aat acc atg cta aac aca gtg ggg gga cat caa gca gcc atg caa atg 3367 Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met 55 60 65 tta aaa gag acc atc aat gag gaa gct gca gaa tgg gat aga ttg cat 3415 Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Leu His 70 75 80 85 cca gtg cat gca ggg cct att gca cca ggc cag atg aga gaa cca agg 3463 Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg 90 95 100 gga agt gac ata gca gga act act agt acc ctt cag gaa caa ata gga 3511 Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly 105 110 115 tgg atg aca cat aat cca cct atc cca gta gga gaa atc tat aaa aga 3559 Trp Met Thr His Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg 120 125 130 tgg ata atc ctg gga tta aat aaa ata gta aga atg tat agc cct acc 3607 Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr 135 140 145 agc att ctg gac ata aga caa gga cca aag gaa ccc ttt aga gac tat 3655 Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr 150 155 160 165 gta gac cga ttc tat aaa act cta aga gcc gag caa gct tca caa gag 3703 Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu 170 175 180 gta aaa aat tgg atg aca gaa acc ttg ttg gtc caa aat gcg aac cca 3751 Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro 185 190 195 gat tgt aag act att tta aaa gca ttg gga cca gga gcg aca cta gaa 3799 Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Gly Ala Thr Leu Glu 200 205 210 gaa atg atg aca gca tgt cag gga gtg ggg gga cct ggc cat aag gca 3847 Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala 215 220 225 aga gtt ttg tagt ctagagggcc caattcgccc tatagtgagt cgtattacaa 3900 Arg Val Leu 230 ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa 3960 tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga 4020 tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg acgcgccctg tagcggcgca 4080 ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta 4140 gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt 4200 caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac 4260 cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt 4320 tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga 4380 acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg 4440 gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaatt 4500 cagggcgcaa gggctgctaa aggaagcgga acacgtagaa agccagtccg cagaaacggt 4560 gctgaccccg gatgaatgtc agctactggg ctatctggac aagggaaaac gcaagcgcaa 4620 agagaaagca ggtagcttgc agtgggctta catggcgata gctagactgg gcggttttat 4680 ggacagcaag cgaaccggaa ttgccagctg gggcgccctc tggtaaggtt gggaagccct 4740 gcaaagtaaa ctggatggct ttcttgccgc caaggatctg atggcgcagg ggatcaagat 4800 ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag 4860 gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg 4920 gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca 4980 agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc 5040 tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg 5100 actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatcccac cttgctcctg 5160 ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta 5220 cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag 5280 ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac 5340 tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg 5400 atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg 5460 gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg 5520 aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg 5580 attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgaatt gaaaaaggaa 5640 gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct 5700 tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg 5760 tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg 5820 ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt 5880 atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga 5940 cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga 6000 attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac 6060 gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg 6120 ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac 6180 gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct 6240 agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct 6300 gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg 6360 gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat 6420 ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg 6480 tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat 6540 tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct 6600 catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa 6660 gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 6720 aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 6780 gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta 6840 gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct 6900 gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 6960 atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 7020 cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 7080 cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 7140 agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 7200 tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 7260 gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca 7320 catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg 7380 agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 7440 ggaag 7445

Claims (10)

1. 인간면역결핍바이러스 타입 1 유래의 p24 단백질을 발현하는 재조합 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis)로, 상기 p24 단백질은 도 1에 개시된 pMyong2-p24 플라스미드에 의해 발현되는 것인, 재조합 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) 균주.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 마이코박테리움 스메그마티스 균주는 KCTC 13403BP로 기탁된 것인, 마이코박테리움 스메그마티스 균주.
   
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 균주 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 HIV 감염증 또는 HIV 및 결핵균 동시 감염증에 대한 백신 조성물로, 상기 균주는 살아있는 것인, HIV 감염 또는 HIV 및 결핵균 동시 감염에 대한 백신 조성물.
   
4. 제 3 항에 있어서, 상기 백신은 추가로 약독화(attenuation) 되지 않은 것인, HIV 감염 또는 HIV 및 결핵균 동시 감염에 대한 백신 조성물.
   
5. 제 3 항에 있어서, 상기 백신은 프라임-부스트 백신 접종법에서 프라이밍 백신으로 사용되는 것인, HIV 감염 또는 HIV 및 결핵균 동시 감염에 대한 백신 조성물.
   
6. 제 3 항에 있어서, 상기 감염증은 AIDS 또는 결핵인, HIV 감염 또는 HIV 및 결핵균 동시 감염에 대한 백신 조성물.
   
7. 제 1 항 또는 제 2 항의 균주에 포함된 도 1에 개시된 pMyong2-p24 플라스미드.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 플라스미드는 서열번호 1의 서열로 표시되는 것인, pMyong2-p24 플라스미드.
   
9. 제 7 항에 따른 플라스미드를 포함하는, 인간을 제외한 세포.
   
10. 제 8 항에 따른 플라스미드를 포함하는, 인간을 제외한 세포.
    

Images