KR102079761B1 - pMyong2 벡터 시스템을 이용하여 HIV-1 p24를 발현하는 재조합 BCG 및 이의 HIV-1 백신으로의 이용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 pMyong2 벡터 시스템을 이용하여 HIV-1 p24를 발현하는 재조합 BCG 및 이의 HIV-1 백신으로의 이용에 관한 것으로, pMyong2 벡터 시스템인 rBCG-pMyong2-p24가 rBCG 및 감염된 항원제시세포(APC)들에서 HIV-1 p24 gag 발현 증가를 유도하며, 벡터 시스템에서 유래된 pAL5000에서 rBCG-pAL-p24와 비교하여 rBCG-pMyong2-p24가 높은 수준의 HIV-1 gag-특이적 CD4 및 CD8 T 림프구 증식, 감마 인터페론 ELISPOT 세포 유도, 항체 생산 및 세포독성 T 세포(CTL) 반응에 의해 입증된 바와 같이 백신 접종한 마우스에서 향상된 p24 특이적 면역 반응을 유도하는 것을 발견하였고, rBCG-pMyong2-p24는 동일한 pMyong2 벡터 시스템에서 rSmeg-pMyong2-p24보다 높은 p24-특이적 Ab 생산 수준을 보이는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 rBCG-pMyong2-p24를 사용하여 HIV-1 p24를 발현하는 재조합 BCG가 마우스 모델 시스템에서 HIV-1 감염에 대해 향상된 면역 반응을 유도하는 것을 확인함으로써, rBCG-pMyong2-p24는 HIV-1 감염에 대한 이종 프라임-부스트 백신 전략에서 주요 백신으로서 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

pMyong2 벡터 시스템을 이용하여 HIV-1 p24를 발현하는 재조합 BCG 및 이의 HIV-1 백신으로의 이용{A recombinant BCG expressing HIV-1 p24 using a pMyong2 vector system and use as a HIV-1 vaccine thereof}
본 발명은 인간면역결핍바이러스 타입-1(human immunodeficiency virus type-I, HIV-1) 감염에 대한 예방 및/또는 치료에 사용되는 신규한 재조합 BCG, 이를 포함하는 백신 조성물, 이의 제조 방법 등에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 신규한 마이코박테리아(mycobacterium)-대장균(Escherichia-coli)용 셔틀 벡터 (이하 “pMyong2”, 대한민국특허등록번호: 1012916680000, 미국특허등록번호: 8,841,432) 시스템을 사용한 재조합 BCG 생백신 플랫폼(live vaccine platform)에 관한 것이다.
HIV-1 감염률은 전세계적으로 점차 감소하고 있는 추세지만, HIV-1에 대한 효율적인 예방 백신은 여전히 시급한 요구사항이다. 재조합 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) BCG(rBCG)는 HIV-1 백신 개발에서 유망한 균주이다. 이에 본 발명에서는 HIV-1 감염에 대한 백신 적용(vaccine application)에서 pMyong2 벡터를 이용한 HIV-1 p24 항원 Gag를 발현하는 rBCG(rBCG-pMyong2-p24)의 잠재력을 개시한다.
HIV 감염 개체에서 HIV의 복제를 제어하는 고활성항바이러스 요법(highly activated antiretroviral therapy, HAART)의 기여에도 불구하고, 장기간의 치료 후 발생하는 약물-내성 바이러스 및 값비싼 약제의 비용 등은 여전히 해결되어야 할 여러 문제점들 중 하나로 남아 있다. 그러므로, 비록 새로운 HIV-1 감염 속도가 전세계적으로 점차 감소하고 있기는 하지만, 바이러스의 추가 확산을 억제하기 위하여 효율적인 예방 백신의 필요성은 여전히 요구되고 있다. HIV 특이적 세포성 면역은 주로 다기능성(poly-functionality), 그리고 면역우성(immunodominant) 바이러스 펩타이드에 대한 증식능력을 갖는 HIV 특이적 T 세포에 의해 유도되며, 이러한 특징으로 인해 HIV-1에 대한 효율적인 면역 반응이 발생할 수 있으므로 이러한 세포성 면역, 특히 바이러스-특이적 세포독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocytes, CTL)는 HIV-1에 대항하기 위한 숙주 면역 체계의 더 중요한 구성요소이어야 한다.
이러한 사실을 기반으로, 살아있는 바이러스 벡터 및 플라스미드 DNA 백신의 사용을 포함하는 강력한 HIV-1-특이적 CTL 및 Th1(Type 1 helper T cell)의 반응을 이끌어내 위한 여러 전략들이 개발 중에 있다. 그러나 이러한 각각의 접근법들에는 안전상의 쟁점을 포함한 여러 문제점들이 관련되어 있어 실제적, 실용적 사용이 제한되고 있다. 현재 전세계적으로 가장 광범위하게 투여되는 백신인 마이코박테리움 보비스 BCG(BCG)는 결핵(tuberculosis, TB)에 대항하기 위해 사용된 유일한 살아있는 약독화 백신으로서 80년 이상 사용되어 왔다. BCG는 아동의 파종성 질환(disseminated disease)을 예방할 수 있기 때문에, 1970년대 초반부터 아동 예방접종을 위한 세계보건기구 예방접종 확대계획(World Health Organization Expanded Program on Immunization(EPI))의 일부로서 사용되어 왔다.
외래 항원을 발현하고 면역 반응을 유도하기 위해 성공적으로 사용되어온 BCG의 재조합 형태, 즉 rBCG는 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 설치류 말라리아(rodent malaria), 레슈마니아(leishmanial), 홍역 바이러스, 인간면역결핍바이러스 1형(HIV-1) 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함한, 다양한 감염성 병원체에 대한 백신 후보로 여겨져 왔다. rBCG 벡터의 가장 실제적·실용적 장점은 높은 안전성이다. 더불어 rBCG는 우수한 면역증강(adjuvant) 특성을 보이며, 적어도 1 내지 2년 동안 유지되는 긴 지속성 세포성 면역 반응을 유도하고, 제조비용이 낮으며, 투여가 용이하고, 대체로 단지 1회 또는 2회의 면역화만을 필요로 한다. 따라서 다른 재조합 백신 접근법들을 능가하는 rBCG-기반 백신의 상기 언급된 장점들은 rBCG가 안전한, 바이러스-특이적 면역 반응을 유도할 수 있는, HIV-1 감염에 대한 강력한 백신일 수 있음을 시사한다.
KR 10-2018-0080999 A1 US 8841432 B1
본 발명의 해결하고자 하는 과제는 HIV-1 유래의 p24 단백질을 발현하는 재조합 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) BCG (rBCG) 및 이를 HIV-1 백신으로 이용을 제공하고자 하는 것이다.
rBCG 벡터는 잠재적인 HIV-1 백신으로서의 가능성에도 불구하고, 이의 HIV-1 백신으로서의 실제적 적용은 rBCG 내에서 외래 유전자들의 이종성(heterologous) 발현의 낮은 안정성 및 양의 결핍으로 인한 낮은 면역원성(immunogenicity)으로 인해 제한된다. 그러므로 충분한 면역원성을 확보하고 방어적 백신의 효능을 끌어내기 위해서는, 인간에서 결핵에 대한 실제 BCG 예방접종에 필요한 용량의 대략 10 내지 100 배의 높은 rBCG 용량이 필요하다. 그러나 고용량의 BCG를 생체내로 투여하는 것은 면역-손상된(immuno-compromised) 백신 투여자의 파종성 BCG의 위험을 증가시키거나, T 세포의 과도한 활성화에 의한 HIV-1의 복제 및 확산을 위한 구동력으로서 작용할 수 있다.
이러한 이유로 안전성 보장을 위해 HIV-1에 대한 예방적 백신접종에서 rBCG의 저용량 면역화가 권장되어 왔고, 따라서 본 발명에서는 인간의 예방접종에 필요한, 더 낮은 용량에서도 효력을 보일 수 있는, HIV-1으로부터의 보호를 위한 rBCG 백신을 개발하고자 하였다.
또한 상기 재조합 마이코박테리움 보비스 BCG의 치료학적 유효량을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 개체에 투여하여 에이즈 및/또는 결핵을 치료 또는 예방하는 방법, 상기 백신을 제조하기 위한 재조합 마이코박테리움 보비스 BCG의 용도 내지 에이즈 및/또는 결핵을 치료 또는 예방하기 위한 재조합 마이코박테리움 보비스 BCG의 용도를 개발하고자 하였다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 마이코박테리움 아비움 복합체(M. avium complex, MAC)의 인간 병원체 구성원인 마이코박테리움 용고넨스(Mycobacterium yongonense)의 DSM 45126T 게놈 분석을 통해, 마이코박테리움 포르투이툼(M. fortuitum)으로부터 유래된 종래의 pAL5000 벡터 시스템을 사용한 것과 비교하여, 재조합 마이코박테리아 스메그마티스(rSmeg) 및 rBCG에서 증가된 이종성 유전자 발현을 유도할 수 있는 선형 플라스미드인 pMyong2의 마이코박테리아 레플리콘(replicon)을 사용하는 신규한 마이코박테리아-대장균 셔틀 벡터 시스템을 도입하였다.
나아가 본 명세서에서는 pMyong2 벡터 시스템을 사용하여 HIV-1 p24 Gag를 발현하는 rSmeg가, pAL5000 벡터 시스템에서 또는 통합형 플라스미드인 pMV306 시스템을 사용하는 rSmeg와 비교하여, 마우스에서 HIV-1 p24 Gag에 대한 향상된 면역 반응을 유도하였음을 보였고, 이것은 rSmeg 백신 적용에서 pMyong2 벡터 시스템의 실행가능성을 시사한다.
HIV-1 Gag-특이적 CD8+ T 세포 반응은 HIV 감염의 면역 조절에 대단히 중요할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 pMyong2 벡터 시스템에서 발현하기 위한 표적 항원으로서 HIV-1 Gag p24를 선택하였다. 그러므로, 본 발명에서는 rBCG(rBCG-pMyong2-p24) 내에서 외래 HIV-1 p24 Gag 유전자의 발현을 향상시키기 위하여 pMyong2 벡터 시스템을 채택하였다. pMyong2 벡터 시스템의 효능, 즉 그것의 향상된 재조합 단백질 제조는 rBCG 및 rBCG로 감염된 일차 골수유래 수지상 세포(bone-marrow derived dendritic cells, 이하 "BMDCs")에서 증명되었다. 더불어, 백신 효능을 증명하기 위하여, 본 발명자들은 예방접종된 마우스에서 HIV Gag 단백질에 대한 그것의 세포성 및 체액성 면역 반응을 탐색하였다.
HIV 백신으로서 rBCG의 잠재력을 개선하기 위한 최상의 전략은, 프라임-부스트(prime-booster) 백신 프로토콜에서 rBCG를 프라임 백신(prime vaccine)으로 사용하고 부스트 백신(booster vaccine)으로서 안전한 재조합 바이러스 벡터를 사용하는 것으로서, 이는 동물 모델에서 예방접종 후에 길게 지속되는 효율적인 바이러스-특이적 세포성 면역을 유도한다. 이러한 맥락에서, rBCG 벡터에 의해 유도된 Th1 반응은 Gag-특이적 CTL 반응을 유도하는 데 기여할 수 있다. 그러나 HIV-1 백신으로서 rBCG의 실제적 사용에 주된 장벽이 되는 것은 rBCG에서 외래 HIV-1 항원의 낮은 발현으로 인하여 바이러스 감염에 대항하기 위한 충분한 바이러스-특이적 CTL 반응을 유도하지 못한다는 것이다.
이러한 한계를 극복하기 위하여, rBCG의 우선적 세포질 위치를 통해 더 큰 CTL 반응을 유도할 수 있는 용혈소(hemolysin)-발현 BCG 균주의 사용 및 rBCG 시스템에서 HIV-1 gag p24 유전자에 대한 코돈 최적화를 포함한 전략을 이용, 본 발명에서는 rBCG에서 HIV-1 gag p24 유전자의 발현을 향상시키기 위하여 pMyong2 셔틀벡터 시스템을 적용하였다.
본 발명에서는 비교를 위해 rBCG-pMyong2-p24가 감염된 대식세포 및 BMDCs에서 종래의 에피솜성(episomal) pAL5000 벡터(rBCG-pAL-p24) 및 통합형 pMV306 벡터(rBCG-pMV306-p24)(도 3a, 3b 및 3h)에서보다 더 많은 p24 단백질을 생성한 것을 확인하였고, BMDCs의 향상된 p24 특이적 T 세포 증식(도 4b 및 4c), T 세포 이펙터(effector) 기능(도 5b 및 5c), 특히 CTLs(도 7), 및 Th1-바이어스된 체액성 면역 반응(도 6)을 포함하여, rBCG-pMyong2-p24의 향상된 바이러스-특이적 백신 효능에 대한 기계론적 기초를 제공하였다.
본 발명에서는 rBCG-pAL-p24보다 더 낮은 수준의 CFU(colony-forming unit)를 생성한 rBCG-pMyong2-p24에서의 대식세포 감염에서 더 약독화되는 경향이 관찰되었는데(도 2c), 이는 다른 벡터 시스템에서의 그것들보다 rBCG에서 pMyong2의 더 높은 복사물 수로 인한 것으로 추측된다. 더 낮은 용량 또는 보다 약독화(attenuation)된 rBCG로의 면역화는, 불리한 국소 피부 반응, Th2-형 면역 반응과의 가능한 결부, 또는 레트로바이러스 감염의 악화를 포함한 고-투여량 피부 투여와 관련된 위험을 줄일 수 있을 것이라는 점을 고려하면, rBCG-pMyong2-p24는 rBCG를 사용하는 HIV 백신 프로토콜에서 추가적 장점을 가질 수 있다.
다중-복사물 에피솜성 벡터-기반 마이코박테리아-대장균 셔틀 벡터 시스템은, 통합형 플라스미드 시스템과 비교하여, 재조합 마이코박테리아의 안정성 결핍과 관련된 결점을 가지는 것으로 알려져 있다. 실제로, rSmeg (rSmeg-pMyong2-p24)에서의 pMyong2-p24 플라스미드가 항생물질이 없는 매질에서 5회 계대 후에 안정성을 점차 잃어가는 것을 보였다. 그러나 놀랍게도, 본 발명은 동일한 pMyong2 벡터 시스템을 사용함에도 불구하고, rBCG (rBCG-pMyong2-p24)에서 pMyong2-p24 플라스미드가 항생물질의 첨가 여부와 관계없이 12회의 계대 후에도 그것의 안정성을 유지할 수 있다(도 3f). 이는 느리게 성장하는 마이코박테리아 용고넨스로부터 얻은 pMyong2 플라스미드가, Smeg와 같은 빠르게 성장하는 마이코박테리아의 경우 보다 BCG와 같은 느리게 성장하는 마이코박테리아에서 더 안정적일 수 있음을 시사한다. 항생물질이 없는 배지에서 플라스미드를 통합시키는 것의 안정성이 실제 사용하기 위한 재조합 생백신 제조에 중요한 것임을 고려할 때, rBCG-pMyong2-p24는 HIV-1 백신으로서의 적용에서 rSmeg-pMyong2-p24를 능가하는 장점을 가진다.
본 발명에서는 상이한 에피솜성 벡터 시스템에서의 rBCG 균주들, 즉 rBCG-pMyong2-p24 및 rBCG-pAL-p24을 사용하는 것에 더하여, 2개의 상이한 마이코박테리아에서의 HIV-1에 대한 백신 효능, 즉 BCG(rBCG-pMyong2-p24) 및Smeg(rSmeg-pMyong2-p24)를 동일한 pMyong2 시스템을 사용하여 비교하였다. HIV-1 p24 항원에 대한 면역 반응에서, 비록 면역화된 비장세포(splenocytes)로부터의 CTL 반응, 감염된 BMDCs의 T 세포 증식 능력 및 대부분의 IFN-γ ELISPOT 수준이 rBCG-pMyong2-p24 및 rSmeg-pMyong2-p24에서 거의 동일하긴 하였지만, rBCG-pMyong2-p24는 rSmeg-pMyong2-p24와 비교하여 비장세포 및 Th1-바이어스된 체액성 면역 반응에서 상당히 향상된 IL-2 생성을 나타냈고, 이것은 rBCG-pMyong2-p24가 rSmeg-pMyong2-p24보다 HIV-1 백신 양생법(regimen)에서 월등할 수 있음을 시사한다.
더불어, 본 발명에서는 rBCG-pMyong2-p24 및 p24 단백질을 사용하여 2개의 상이한 백신 모듈 사이에서 HIV-1에 대한 백신 효능을 비교하였다. 본 명세서의 데이터는 rBCG-pMyong2-p24가 p24 단백질과 비교하여 향상된 p24 특이적 IFN-γ ELISPOT 수준, CTL 반응 및 Th1-바이어스된 체액성 면역 반응을 가졌음을 나타내며(도 8a~8c), 이는 또한 HIV-1 백신 양생법에서 rBCG-pMyong2-p24가 p24 단백질보다 월등할 수 있음을 시사한다. BCG, 홍역, 유행성이하선염 및 풍진 백신, 및 인플루엔자 백신을 포함하여, 다양한 백신에 대한 반응에는 성별의 차이가 있는 것으로 알려져 있다. 일반적으로, 적응성 면역 반응에서, 여성은 남성과 비교하여 향상된 체액성 및 세포 매개 면역 반응을 나타낸다. 이는 본 발명에서 현재 백신 연구에 오로지 암컷 마우스만을 선택한 이유이다.
본 명세서에서는 pMyong2 벡터 시스템의 rBCG-pMyong2-p24가, pAL5000-(rBCG-pAL-p24) 또는 pMV306-유래 시스템 (rBCG-pMV306-p24)을 사용하는 다른 BCG 균주들보다 rBCG에서 고수준의 HIV-1 p24 Gag 단백질 발현을 유도하고 더 많은 p24 항원을 포식세포(phagocytes)로 전달하는 것을 증명하였다.
또한, 본 명세서에서는 상기 언급된 균주가 rBCG-pAL-p24 또는 rSmeg-pMyong2-p24와 비교하여, 예방 접종된 마우스에서 감염된 BMDCs의 T 세포 증식 능력을 향상시킬 수 있고 개선된 CTL 반응 및 Th1 바이어스된 체액성 면역 반응을 유도할 수 있음을 보였다.
이러한 발견들은 rBCG-pMyong2-p24가 HIV-1 감염에 대한 이종성 프라임-부스트 백신 전략에서 프라임 백신으로서 효율적인 후보일 수 있음을 시사한다.
종합하면, 한 양태에서 본 발명은 HIV-1 유래의 p24 단백질을 발현하는 재조합 마이코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis) BCG (rBCG)를 제공한다.
일 구현예에서 상기 p24 단백질은 도 2a에 개시된 pMyong2-p24 벡터 시스템에 의해 발현되는 것일 수 있다.
일 구현예에서 상기 p24 단백질은 서열번호 2의 염기 서열로 나타내는 인간면역결핍바이러스 타입 1 유래의 Gag 유전자가 코딩된 것일 수 있다.
일 구현예에서 본 발명에 따른 마이코박테리움 보비스 BCG 균주는 Tokyo 172 균주이다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 마이코박테리움 보비스 BCG를 유효성분으로 포함하는, HIV-1 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 마이코박테리움 보비스 BCG의 치료학적 유효량을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 개체에 투여하여 에이즈 및/또는 결핵을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 에이즈 및/또는 결핵의 예방 또는 치료용 백신의 제조를 위한, 재조합 마이코박테리움 보비스 BCG의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 에이즈 및/또는 결핵의 예방 또는 치료를 위한 재조합 마이코박테리움 보비스 BCG의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 마이코박테리움 보비스 BCG를 유효성분으로 포함하는, HIV 감염증 또는 HIV 및 결핵균 동시 감염증에 대한 백신 조성물을 제공한다.
일 구현예에서 본 발명에 따른 백신 조성물에서 상기 재조합 마이코박테리움 보비스 BCG는 살아있는 것이다.
일 구현예에서 본 발명에 따른 백신은 추가로 인위적으로 약독화(attenuation)되지 않는 것이다.
일 구현예에서 본 발명에 따른 백신은 특히 프라임-부스트 백신 접종 프로토콜에서 프라임 백신으로서 사용되는 것일 수 있다.
일 구현예에서 상기 감염증은 에이즈(AIDS, 후천성면역결핍증) 또는 결핵인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 rBCG-pMyong2-p24는 rBCG 및 감염된 항원 제시 세포(APC)에서 향상된 HIV-1 p24 Gag 발현을 이끌어 내는 것으로 나타났다.
또한, 본 발명에 따른 rBCG-pMyong2-p24는, pAL5000 유래 벡터 시스템에서의 rBCG-pAL-p24와 비교하여, 고수준의 HIV-1 Gag-특이적 CD4 및 CD8 T 림프구 증식, 감마 인터페론 ELISPOT 세포 유도, 항체 생성 및 세포독성 T 세포(CTL) 반응에 의해 증명되는, 향상된 p24 특이적 면역 반응을 유도하는 것으로 나타났다.
나아가, 본 발명에 따른 rBCG-pMyong2-p24는 동일한 pMyong2 벡터 시스템에서 rSmeg-pMyong2-p24보다 높은 수준의 p24-특이적 항체를 생성함을 나타냈다.
결론적으로, 본 발명은 pMyong2 벡터 시스템을 사용하여 p24를 발현하는 재조합 BCG, 즉 rBCG-pMyong2-p24가 HIV-1 감염에 대한 향상된 면역 반응을 유도함을 나타낸다. 그러므로, rBCG-pMyong2-p24는 HIV-1 감염에 대한 이종성 프라임-부스트 백신 전략에서 프라임 백신으로서의 잠재력을 가진다.
도 1은 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동법(SDS-PAGE) 및 쿠마시 브릴리언트 블루 염색법(Coomassie brilliant blue staining)을 이용하여 p24 단백질의 순도를 확인한 도면이다. M, 분자량 표준(Elpis Bio, 대전, 대한민국). 레인 1, 정제된 p24 단백질(10μg).
도 2a는 본 명세서에서 개시하는 각각의 p24 발현 벡터의 개열지도를 나타난 도면이다. HIV p24 항원을 발현하는 마이코박테리아-대장균 셔틀 벡터로서 각각 pMV306-p24, pALp24 and pMyong2-p24 벡터가 마이코박테리움 보비스 BCG로부터 유래한 hsp65 프로모터의 조절 아래 p24를 발현한다.
도 2b는 ADC와 100μg/ml의 카나마이신이 첨가 된 7H9 배지에서 p24 rBCG 균주의 성장 곡선을 나타낸 도면이다. 야생형 BCG 배양의 경우, 7H9 배지에서 카나마이신을 제외시켰다. 성장 곡선은 각 시점에서 배양 분취액을 취하고 OD600을 측정 하였다.
도 2c는 마우스 대식세포 J774A.1(왼쪽) 및 마우스 골수유래 수지상 세포(오른쪽)의 감염에서 p24 rBCG 균주의 CFU 수준을 비교하여 나타낸 도면이다. 데이터는 두 가지 독립적인 실험을 대표한다. (결과는 평균 ± 분산값으로 나타냈다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (Student's t-test).
도 3a는 ELISA를 사용하여 rBCG 균주에서의 p24 발현을 확인한 도면이다.
도 3b는 웨스턴 블롯팅 분석을 이용한 rBCG 균주의 p24 발현을 확인한 도면이다. 야생형 BCG (레인 1) 및 rBCG 균주 (레인 2: rBCG-pMV306-p24, 레인 3: rBCG-pAL-p24, 레인 4: rBCG-pMyong2-p24)로부터 단백질을 추출하였다. 양성 대조군으로는 정제된 p24 단백질을 사용하였다(레인 5). M, 분자량 표준(Elpis Bio, 대전, 대한민국). 개별 멤브레인은 흰색 공백으로 구분되며 마커 레인은 검정색 수직선으로 구분된다. 본 도면에는 p24의 발현 수준이 나타나 있으며 웨스턴 블롯팅 이미지는 선명도 향상을 위해 전체-길이 블롯에서 자른 것이다. 전체-길이 블롯팅 이미지는 하기 도 3c에 나타내었다.
도 3c는 상기 도 2c의 자른 이미지의 전체 길이 원본 블롯팅 이미지를 나타낸 도면이다. 웨스턴 블롯팅은 본 도면에 표시한 항체를 이용하여 수행되었다. 자른 부분은 실선으로 표시하였다.
도 3d는 카나마이신을 함유한 7H10 한천 플레이트(agar plate)에서 계대한 rBCG-pMyong2-p24 균주에서 p24 발현의 안정성을 웨스턴 블롯팅을 이용하여 확인한 도면이다. 단백질은 야생형 BCG (레인 1) 및 rBCG-pMyong2-p24 균주에서 각각의 계대 지점에서 추출하였다 (레인 2: 제 1계대, 레인 3: 제 4계대 후, 레인 4: 제 6계대 후, 레인 5: 제 8계대 후, 레인 6: 제 10계대 후, 레인 7: 제 12계대 후). 양성 대조군으로는 정제된 p24 단백질을 사용하였다 (레인 8). M, 분자량 표준(Elpis Bio, 대전, 대한민국). 상위 크기 멤브레인에서 내부 대조군으로서 멤브레인을 잘라낸 뒤 Hsp65 항체(Abcam)를 이용하여 p24를 검출하였다. 개별 멤브레인은 흰색 공백으로 구분되며 마커 레인은 검정색 수직선으로 구분된다.
도 3e는 상기 도 2d의 자른 이미지의 전체 길이 원본 블롯팅 이미지를 나타낸 도면이다. 웨스턴 블롯팅은 본 도면에 표시한 항체를 이용하여 수행되었다. 자른 부분은 실선으로 표시하였다.
도 3f는 카나마이신이 없는 7H10 한천(agar) 플레이트에서 계대한 rBCG-pMyong2-p24 균주에서 p24 발현의 안정성을 웨스턴 블롯팅을 이용하여 확인한 도면이다. 단백질은 야생형 BCG (레인 1) 및 rBCG-pMyong2-p24 균주에서 각각의 계대 지점에서 추출하였다 (레인 2: 제 1계대, 레인 3: 제 4계대 후, 레인 4: 제 5계대 후, 레인 5: 제 6계대 후, 레인 6: 제 7계대 후, 레인 7: 제 8계대 후, 레인 8: 제 9계대 후, 레인 9: 제 10계대 후, 레인 10: 제 11계대 후, 레인 11: 제 12계대 후). 양성 대조군으로는 정제된 p24 단백질을 사용하였다 (레인 12). M, 분자량 표준(Elpis Bio, 대전, 대한민국). 상위 크기 멤브레인에서 내부 대조군으로서 멤브레인을 잘라낸 뒤 Hsp65 항체(Abcam)를 이용하여 p24를 검출하였다. 개별 멤브레인은 흰색 공백으로 구분되며 마커 레인은 검정색 수직선으로 구분된다.
도 3g는 상기 도 2f의 자른 이미지의 전체 길이 원본 블롯팅 이미지를 나타낸 도면이다. 웨스턴 블롯팅은 본 도면에 표시한 항체를 이용하여 수행되었다. 자른 부분은 실선으로 표시하였다.
도 3h는 마우스 대식세포 J774A.1(왼쪽) 및 마우스 골수유래 수지상 세포(오른쪽)에서 각각 야생형 BCG 및 rBCG 균주 (rBCG-pMV306-p24, -pAL-p24, 및 -pMyong2-p24) 감염 후, p24의 발현 수준을 측정한 도면이다. 데이터는 두 가지 독립적인 실험을 대표한다. (결과는 평균 ± 분산값으로 나타냈다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (Student's t-test).
도 3i는 1일차 및 3일차에서 rBCG-pAL-p24 및 rBCG-pMyong2-p24 균주의 상이한 M.O.I.(1 및 10 M.O.I.; multiplicity of infection)에 감염된 BMDCs로부터 p24의 발현 수준을 ELISA를 이용하여 비교한 도면이다. 결과는 중복된 웰(duplicate wells)에서 평균 ± 분산값으로 나타냈다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (Student's t-test).
도 4a 내지 4d는 p24 rBCG 균주에 감염된 BMDCs에 의해 유도된 T 세포 증식 수준을 나타낸 도면들이다: (도 4a) T 세포 증식 분석 일정의 개략도. 마우스 2 마리에 p24 단백질(30㎍/마우스)을 주사하였고, 7일 후에 상기 마우스의 비장세포를 CD4 및 CD8 T 세포로 분류하고 CFSE로 표지하였다. 공동 배양하기 하루 전, DC를 각 균주(10 M.O.I.)에 감염시켰다. CFSE로 표지된 CD4 / CD8 T 세포 및 감염된 DC를 4일 동안 공동 배양한 후, 위 세포를 T 세포 증식에 대해 분석 하였다; (도 4b 및 4c) p24 rBCG 균주에 감염된 BMDCs의 CFSE-표지 CD4 및 CD8 T 세포 증식에 대한 유동세포계측분석(Flow cytometric analysis) 결과; (도 4d) MLR 분석법을 사용하여 CD4(좌측 패널) 및 CD8(우측 패널) 세포의 상등액에서 방출 된 IL-2의 ELISA 측정. 데이터는 세 가지의 독립적인 실험을 대표한다. 결과는 평균 ± 분산값으로 나타냈다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (Student's t-test).
도 5a 내지 5c는 각각 p24 rBCG 균주에 의해 유도된 생체 내 면역 반응을 나타낸 도면이다: (도 5a) 생체 내 면역학적 분석을 위해 수행 된 면역화의 개략도. 4주 간격으로 각 군(5 마리/그룹)을 야생형 BCG, 두 종류의 rBCG 균주 및 rSmeg 균주로 각각 2회 면역시켰다. 최종 면역화 4주 후, 마우스를 희생시키고 면역 분석을 위해 비장 및 혈액 샘플을 수집하였다; (도 5b) p24 rBCG 균주를 접종한 마우스의 비장세포를 시험관 내 자극한 후 IFN-γ 분비 수준 ELISPOT 분석을 사용하여 검출하였다. 각 그룹의 ELISPOT 멤브레인 대표 이미지는 그래프 아래에 표시하였다. (-), 음성 대조군; (+), 양성 대조군; (도 5c) p24 rBCG 균주를 접종한 마우스의 비장세포를 p24로 시험관 내 자극한 후 IL-2, IFN-γ 및 IL-6 사이토카인(cytokine)의 수준을 ELISA 분석을 사용하여 검출하였다. 그룹 당 총 5마리의 마우스를 분석하였다. 데이터는 두 가지의 독립적인 실험을 대표한다. 결과는 평균 ± 분산값으로 나타냈다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (Student's t-test).
도 6은 p24 rBCG 균주에 의해 유도된 체액성 면역 반응을 나타낸 도면이다. p24 특이 면역 글로불린 아형(IgG2a, IgG1 및 총 IgG)은 450nm에서 ELISA를 이용하여 측정하고, IgG2a 및 IgG1 아형에 대한 OD 값 및 IgG2a / IgG1의 비율을 비교 하였다. 그룹 당 5 마리의 마우스 혈청 샘플을 분석하였다. 데이터는 두 가지의 독립적인 실험을 대표한다. 결과는 평균 ± 분산값으로 나타냈다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (Student's t-test).
도 7은 rBCG 균주로 면역화된 마우스에서의 세포 독성 T 림프구 반응을 나타낸 도면이다. CTL 반응은 시험관 내에서 p24에 의해 자극된 비장세포(이펙터 세포) 및 p24 에피토프 펩타이드 (A9I)가 P815 세포(표적 세포)를 반응시킴으로써 일어난다. 그룹 당 총 3마리의 마우스를 분석하였다. 데이터는 두 가지의 독립적인 실험을 대표한다. 결과는 평균 ± 분산값으로 나타냈다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (Student's t-test).
도 8a 내지 8c는 p24 단백질의 주사와 rBCG-pMyong2-p24 균주의 상이한 M.O.I.에 의한 p24 특이적 면역 반응의 비교 결과를 나타낸 도면들이다: (도 8a) p24 단백질 (30㎍/마우스) 및 상이한 CFUs (1 × 106 및 1 × 107 CFU)의 rBCG-pMyong2-p24 균주(1주 간격, 2회 주사)를 피하주사 한 마우스(3 마리/그룹)로부터 얻은 비장세포를 시험관 내 자극한 후 IFN-γ 분비 수준을 비교하기 위해 ELISPOT 분석한 결과이다. 각 그룹의 ELISPOT 멤브레인 대표 이미지는 그래프 아래에 표시하였다. (-), 음성 대조군; (+), 양성 대조군. 결과는 triplicate에서 평균 ± 분산값으로 나타냈다. **P<0.01; ***P<0.001 (Student's t-test); (도 8b) p24 특이적 면역 글로불린 아형 (IgG2a, IgG1 및 총 IgG)을 ELISA에 의해 검출한 결과이다. 그룹 당 3 마리 마우스의 혈청 샘플을 분석하였다. 결과는 triplicate에서 평균 ± 분산값으로 나타냈다. **P<0.01; ***P<0.001 (Student's t-test); (도 8c) p24 단백질 및 rBCG-pMyong2-p24 주입 마우스로부터 얻은 비장세포(A9I, p24 에피토프 펩타이드로 자극 됨; 이펙터 세포) 및 A9I 펩타이드 펄스된 P815 세포(표적 세포)의 반응으로 인한 세포 독성 T 림프구 반응을 나타내고 있는 도면이다. 그룹 당 3 마리 마우스의 혈청 샘플을 분석하였다. 결과는 triplicate에서 평균 ± 분산값으로 나타냈다. **P<0.01; ***P<0.001 (Student's t-test).
본 발명은 HIV-1 p24 항원을 발현하는 재조합 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) BCG 균주가 백신에 효과적으로 사용될 수 있다는 발견에 근거한 것이다.
이에 한 양태에서 본 발명은 HIV-1의 p24 단백질을 발현하는 재조합 마이코박테리움 보비스 BCG 균주에 관한 것으로, 상기 p24 단백질은, 도 2a에 개시된 pMyong2-p24 벡터에 의해 발현된다.
본 발명에 따른 벡터에 의해 발현되는 p24 캡시드(CA) 단백질은 처리되지 않은 Gag 폴리단백질에서 MA(매트릭스 단백질)의 3' 말단에 연결되어 있다. p24 캡시드 (CA) 단백질은 N 및 C 말단에 HIV 버딩 및 캡시드 구조에서 중요한 역할을 하는 두 개의 도메인을 포함하고 있다. 본 발명에 따른 벡터에 의해 발현되는 p24는 HIV-1 유래로 그 서열은 GenBank No. KM390026.1d에 포함되어 있거나, 서열번호 1의 아미노산 또는 서열번호 4의 서열의 3161 내지 3856 뉴클레오타이드에 해당되며, 본원에 따른 목적을 위해 항원으로 작용하는 한, 이의 서열변이체도 사용될 수 있다. 본원에 따른 균주가 발현하는 p24는 인체에 투여시 HIV 감염에 대한 항원으로 작용할 수 있다.
본 발명에 따른 균주에서 p24는 특히 도 2a에 개시된 pMyong2 벡터에 의해 발현된다. 본 발명에 따른 pMyong2-p24를 포함하는 재조합 BCG 균주는 pAL5000 또는 pMV306 유도 시스템을 사용하는 다른 rBCG 균주와 비교하여 더 높은 수준의 HIV-1 p24 단백질 발현을 유도하고 더 많은 p24 항원을 대식세포로 전달할 수 있어, 매우 우수한 것으로 나타났다.
나아가 본원에 따른 pMyong2-p24를 포함하는 BCG 재조합 균주가 감염된 BMDCs(Bone Marrow-Derived Dendritic Cells)의 T 세포 증식 능력을 향상시키고 접종 된 마우스에서 향상된 T 세포 이펙터 기능과 Th1-바이어스된 체액성 면역 반응을 유도 할 수 있는 것으로 나타났다. 또한 본원에 따른 rBCG-pMyong2-p24 균주는 초기 성장이 지연되어, 약독화됨으로써 더 많은 항원을 식세포에 제시하여 보다 강한 면역반응을 유지할 수 있다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 rBCG-pMyong2-p24가 HIV-1 또는 HIV-1과 결핵과의 동시 감염에 효과적인 후보 백신이 될 수 있음을 나타내는 것이다.
이에 다른 양태에서 본 발명은 본 명세서에 개시된 균주를 포함하는 HIV 감염증에 대한 면역원성, 백신 또는 면역치료용 조성물에 관한 것이다. HIV는 인간의 면역체계를 파괴하는 레트로바이러스의 일종으로, HIV에 감염될 경우, 숙주의 면역시스템이 저하되어, 에이즈로 진행하며, 세균, 바이러스, 진균 및 기생충 등에 의한 기회감염의 위험이 현저히 증가된다. 에이즈는 후천성면역결핍증으로 HIV 감염의 결과로 인체 면역기능의 저하로 나타나는 여러 가지 증상을 일컫는 것이다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 p24 특이적 면역반응 예를 들면 더 많은 p24 항원을 식세포로 전달하며, BMDCs의 T세포 증식 능력을 향상시키고 접종된 쥐에서 향상된 T 세포 이펙터 기능과 Th1-바이어스된 체액 면역 반응을 유도할 수 있어, HIV 감염을 예방하거나 또는 감염으로 인한 증상을 경감, 완화 및/또는 치료할 수 있다.
백신은 통상 프라임-부스트(prime-booster) 형태로 2회 이상 투여되는 것이 일반적이다. 이 경우 동일한 백신을 수회 투여하거나(homologus) 또는 동일한 항원을 포함하는 상이한 종류의 백신이 투여(이종, heterologus) 된다. 일 구현예에서 본원에 따른 백신은 상동 또는 이종 프라임-부스트에서 프라임 백신(prime vaccine)으로 사용된다. 본원에 따른 rBCG-pMyong2-p24 균주는 p24 항원의 발현량이 높고, 항원 제시능이 높아 naive한 개체에 충분한 p24-특이 면역 반응을 유도할 수 있기 때문에 특히 프라임 백신으로의 사용에 유리하다.
본 발명에 따른 조성물에 사용되는 마이코박테리아는 앞서 설명한 바와 같으며, 특히, 살아있는 생균이 사용될 수 있다. 특히 본 발명에 따른 rBCG-pMyong2-p24 균주는 초기 성장이 지연되어, 자연적으로 약독화됨으로써 더 많은 항원을 식세포에 제시하여 보다 강한 면역반응을 유지할 수 있다.
본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원성 물질을 함유한 생물학적인 제제로서, 에이즈 및/또는 결핵의 예방 또는 치료를 위하여 생물체에 주입 또는 주사하여 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 "면역 반응"은 제공된 DNA 플라스미드 백신을 통해 HIV-1 항원, 예를 들면, 보편적인 HIV-1 항원의 도입에 대한 응답으로, 숙주의 면역계, 예를 들면, 포유동물의 면역계의 활성화를 의미하기 위해 본원에서 이용된다. 면역 반응은 세포성 또는 체액성 반응, 또는 둘 모두의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 전신 또는 국소 투여용으로 제형화 될 수 있으며, 약학적으로 가능한 부형제, 담체 및/또는 매체 예를 들면 인산완충 식염수 용액, 증류수, 수/유 에멀젼, 습윤제, 에멀젼화제, pH 조절제 등을 포함할 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 필요한 경우 면역보조제(adjuvant), 특히 T-세포 매개 반응을 촉진 또는 증가시킬 수 있는 임의의 물질 또는 화합물을 포함할 수 있다. 일 구현예에서 상기 면역보조제는 화학적 또는 열에 의해 사멸된 균이 조성물에 포함되는 경우에 사용될 수 있다. 면역보조제는 당업계에 공지되어있으며, 예를 들면 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 포타슘 설페이트, 가교 폴리아크릴산 중합체, DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide), 면역 조절물질, 락토페린, 또는 IFN-gamma 유도제 등이 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 가교 폴리아크릴산 중합체는 Carbopol￠c 단일중합체 또는 공중합체를 포함하고, 상기 림포카인은 IFNgamma, IL-1, IL-2 또는 IL-12를 포함하며, 상기 IFN-gamma 유도제는 poly I:C를 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 일 구현예에서, 합성된 당 폴리머인 상기 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 또는 알루미늄 포타슘 설페이트는 약 0.05 내지 0.1 중량%로 포함되고, 상기 가교 폴리아크릴산 중합체는 0.25중량%로 포함될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물은 국소 또는 전신 투여될 수 있으며, 일회 또는 다회 투여될 수 있으며, 다양한 경로, 예를 들면 피하, 피내, 근육내 또는 정맥으로 투여되거나, 또는 경구, 비강 또는 흡입 경로로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 일 구현예에서는 근육내 주사로 일회 투여된다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 투여 경로에 적합한 액상 용액 또는 현탁제로 제조되거나 또는 주사하기 전에 용액에 용해 또는 현탁되는 고형의 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명에서 "치료학적 유효량"이란 인간면역결핍바이러스 타입 1에 감염될 확률 또는 감염의 심각성을 상당히 감소시킬 수 있을 정도의 항체를 유발하는데 필요한 투여량을 말한다. 상기 유효량은 투여되는 질환 종류 및 중증도, 환자의 연령 및 성별, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정되며 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
백신의 투여량은 투여경로는 물론 환자의 연령, 체중 및/또는 건강상태에 따라 달라질 것이다. 예를 들면 적절한 투여량은 예를 들면 1 내지 109 CFU 일 수 있다. 일 구현예에서는 106 CFU가 사용된다. 본 발명에 따른 균주의 경우, 항원의 발현량이 우수하고, 항원 제시능 등이 우수하여, 이보다 더 적은 투여량 또는 기존 균주 백신과 비교하여 더 적은 투여량을 사용할 수 있음은 물론이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 백신 조성물의 투여에 의해 에이즈 및/또는 결핵을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 백신 조성물의 투여에 의해 에이즈 및/또는 결핵에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
또 다른 양태에서 본 발명은 본 발명에 따른 균주에서 p24의 발현에 사용되는 도 2a에 개시된 벡터에 관한 것이다.
일 구현예에서 상기 벡터는 가장 바람직하게는 서열번호 4의 염기서열로 나타낸다.
또 다른 양태에서 본 발명은 또한 상기 벡터로 형질 전환된 세포에 관한 것이다. 상기 세포는 특히 마이코박테리움(Mycobacterium)을 포함한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
[실험 방법]
1. 마우스 및 면역화 과정
암컷 BALB/c 마우스(약 25 g, 생후 7주령)를 Orient-Bio사(한국, 서울)로부터 구매하였고 생후 8주령이 되었을 때 실험에 사용하였다. 마우스들은 그룹 당 5마리의 마우스로 구성되는 4개 그룹으로 무작위로 나누었다.
T 세포 증식 분석을 위해, p24 단백질을 꼬리 정맥을 통해 2마리의 마우스(BALB/c)에 주사하고(30μg/마우스) 5마리의 마우스(BALB/c)를 각 테스트에서 골수유래 수지상 세포(BMDCs) 제조에 사용하였다.
예방 접종(vaccination) 테스트를 위해, BALB/c 마우스를 야생형, 2 종류의 재조합 BCG 균주(rBCG-pAL-p24 및 rBCG-pMyong2-p24) 또는 rSmeg-pMyong2-p24 균주로 2회(100μl PBS 중의 1 Х 106 CFU; 4주 간격으로) 꼬리 기부에서 피하로 면역화하였다. 음성 대조군 그룹의 경우, PBS를 피하로 주사하였다. 최종 면역화 후 4주 후에, 마우스를 각 시점에서 CO2 흡입에 의해 안락사 시킨 후, 마우스들의 혈액 및 비장을 제거하여 IFN-γ ELISPOT, 사이토카인 측정, 혈청 항체 검출(5마리/그룹) 및 CTL 분석(3마리/그룹)과 같은 면역학적 검정에 사용하였다.
또한, p24 단백질 처리에 의해 유도된 면역 반응들의 차이 및 상이한 박테리아 수를 비교하기 위하여 독립적인 생체 내 테스트를 수행하였다. 이 경우, 1주 간격으로, BALB/c 마우스(3마리/그룹)를 p24 단백질(30μg/마우스) 및 상이한 수의 rBCG-pMyong2-p24 균주(1 Х 106 및 1 Х 107 CFU)으로 2회 피하 주사하였다. 음성 대조군 그룹의 경우, PBS를 피하로 주사하였다. 최종 면역화 후 1주 뒤 마우스를 각 시점에서 CO2 흡입에 의해 안락사 시키고, 마우스들의 혈액 및 비장을 제거하여 IFN-γ ELISPOT, 혈청 항체 검출 및 CTL 분석과 같은 면역학적 검정에 사용하였다.
2. HIV-1 p24 Gag를 발현하는 rBCG 균주의 생성
HIV-1 p24 Gag를 발현하는 rBCG 균주의 3개의 상이한 유형, 즉 pMyong2-p24 플라스미드를 갖는 BCG(rBCG-pMyong2-p24), pAL-p24 플라스미드를 갖는 BCG(rBCG-pAL-p24), 및 pMV306-p24 플라스미드를 갖는 BCG(rBCG-pMV306-p24)를 생성하기 위하여, 3개의 구성된 플라스미드, 즉 pMV306-p24, pAL-p24 및 pMyong2-p24를 컴피턴트 BCG 균주 (Tokyo 172)에 Gene Pulser II 전기천공 장치(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 전기천공 하였다. 형질전환체는 카나마이신(100μg/ml) 및 OADC가 함유된 Middlebrook 7H10 배지(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 상에서 선택하였다. 전형적으로, 형질전환체 콜로니를 플레이트로부터 선택하고, 0.5% 글리세롤, 0.05% Tween-80, 10% ADC 및 카나마이신이 보충된 7H9 배지(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)로 옮겨서 3주 내지 4주 동안 배양하였다. rBCG 균주의 성장률을 600 nm에서의 광학 밀도(OD)에 의해 측정하였다.
3. 대장균(E. coli)으로부터의 p24 단백질의 생산
재조합 p24 단백질은 앞서 기술된 것에서 약간 변형시켜서 대장균으로부터 정제하였다. 융합 단백질의 발현 및 정제를 위해, 대장균 BL21 균주(RBC Bioscience, Taipei City, 대만)을 pET23a-p24로 형질전환시켰다. 단백질의 발현은 0.4 mM의 아이소프로필 β-D-싸이오갈락토시드 (IPTG, DuchefaBiochemie, Haarlem, 네덜란드)를 첨가함으로써 유도하였다. 박테리아 세포를 수득하고 얼음에서 10분 동안 초음파처리에 의해 파괴하였다. 초음파처리된 용해물을 1600 Х g에서 20분 동안 4℃에서 원심분리하고, p24 단백질을 함유한 펠릿을 4M 유레아(Urea, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 함유한 결합 완충액에 재현탁하였다. 단백질을 Ni-NTA His 결합 수지(Merck, Darmstadt, 독일)를 사용하여 정제하고, 4M 유레아를 함유한 용출 완충액(300 mM NaCl, 50 mM 인산 나트륨 완충액, 250 mM 이미다졸)으로 용출하였다. 정제된 단백질을 용출 완충액에 대해 연속적으로 투석하여 이미다졸, 유레아 및 잔류 염을 제거하였다. p24 단백질의 순도를 도데실 황산 나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE; 12% 겔)에 의해 평가하였다. 겔은 쿠마시 브릴리언트 블루 염색 방법을 사용하여 시각화하였다(도 1).
4. 마우스에서 골수 유래 수지상 세포의 생산
골수유래 수지상 세포(Bone marrow derived dendritic cells, BMDCs)를 앞서 기술한 것과 같이 8주 내지 12주령 BALB/c 마우스의 골수(BM)로부터 제조하였다. 간단히 설명하면, BM 세포를 serum-free Iscove's modified Eagle medium (IMDM; Gibco Invitrogen, UK)를 사용하여 대퇴골 및 경골에서 제거하였다. 단일 세포 현탁액을 24-well 플레이트에 10% FBS(Gibco Invitrogen), 재조합 마우스 GM-CSF(1.5ng/ml; PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) 및 마우스 IL-4(1.5ng/ml; PeproTech, USA), 페니실린(100units/ml; Gibco Invitrogen), 스트렙토마이신(100 μg/ml; Gibco Invitrogen), 겐타마이신(50μg/ml; Gibco Invitrogen), L-글루타민(2 mM; Gibco Invitrogen) 및 β-머캡토에탄올(50nM; GibcoInvitrogen)이 보충된 최종 부피 2 ml의 complete IMDM에 well 당 1 Х 106 세포의 농도로 시딩(seeding)하였다. 배지의 절반을 6일 동안 격일로 동등한 부피의 complete IMDM으로 교체하였다. BMDCs를 이용한 각각의 실험을 준비하기 위하여 5마리의 마우스를 사용하였고, BMDCs를 분화시키기 위하여 5개의 24-well 플레이트를 사용하였다.
5. rBCG 균주로 감염된 J774A.1 및 BMDCs에서의 CFU 검정
마우스의 대식세포 세포주 J774.1(American Type Culture Collection, ATCC TIB-67)을 37℃ 및 5% CO2에서 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS), 2 mM 글루타민, 및 필수 아미노산이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM; Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)에서 유지시켰다. 앞서 기술된 바와 같이 마우스 골수로부터 BMDCs를 생성시켰고 37℃ 및 5% CO2에서 10% FBS(Gibco Invitrogen), 재조합 마우스 GM-CSF(1.5ng/ml; PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA), 마우스 IL-4(1.5ng/ml; PeproTech, USA), 페니실린(100units/ml; Gibco Invitrogen), 스트렙토마이신(100μg/ml; Gibco Invitrogen), 겐타마이신(50μg/ml; Gibco Invitrogen), L-글루타민(2mM; Gibco Invitrogen) 및 β-머캡토에탄올(50nM; Gibco Invitrogen)이 보충된 Iscove's modified Eagle medium(IMDM; Gibco Invitrogen, UK)에서 유지시켰다.
J774A.1 세포 및 BMDCs를 rBCG 균주들, 즉 rBCG-pMyong2-p24, -pAL-p24, 및 -pMV306-p24 및 야생형 BCG 균주(10 M.O.I.)(3개 한 벌로)으로 4시간 동안 감염시키고, 이어서 PBS로 3회 세척 후 새로운 배지와 함께 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 감염된 세포들을 0.5% Triton X-100으로 용해시켰다. 세포 용해물을 PBS로 희석하고 콜로니 형성 단위(CFUs)의 계산을 위해 OADC가 보충된 Middlebrook 7H10 한천(agar) 플레이트 위에 플레이팅하였다. 모든 감염 그룹을 각 실험에서 3개 한 벌로 분석하였고, 총 2개의 독립 실험을 수행하였다.
6. rBCG 균주에서 p24 Gag 발현 수준의 측정
rBCG 균주들에서 p24 Gag 발현 수준을 측정하기 위하여, 웨스턴 블롯팅 및 ELISA 분석을 수행하였다. 간단히 말하면, 배양된 rBCG 균주들의 펠릿(pellet)을 라이소자임(100μg/ml), DNase(5U/ml), 및 단백질 가수분해효소 억제제가 보충된 B-PER 완충액(Thermo scientific, Rockford, IL, USA)에 현탁시켰다. 그런 후, 현탁액을 얼음에서 5분 동안 초음파처리하고(펄스: 0.3초, 중단: 0.7초) 13,000 rpm에서 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 수성 상(aqueous phase)의 동일한 양의 단백질을 웨스턴 블롯팅 분석에 사용하였다. 각 rBCG 균주에서 p24의 발현 수준은 마우스 항-p24 단클론성 항체(Abcam, Cambridge, USA; 1:1,000 희석)를 사용하여 측정하였다. 단백질 농도가 모든 샘플에서 동등했는지를 확인하기 위하여 마이코박테리아 Hsp65(Abcam, 1:1,000 희석)를 내부 대조군으로서 사용하였다. p24의 안정적인 발현을 평가하기 위하여, 다양한 계대 지점(1, 4, 6, 8, 10 및 12회 계대 후)에서 rBCG-pMyong2-p24 균주의 p24 발현 수준 또한 측정하였다. 계대 과정은 플레이트에서 플레이트로(카나마이신이 있거나 없는 7H10 한천 플레이트) 수행하였고, 각 계대로부터 얻은 콜로니들을 7H9 broth medium에서 3주 동안 배양한 후에 각각의 실험을 수행하였다. 추가적으로, p24 ELISA 키트를 사용 (제조사에 의해 제안된 방법으로)하여 동일한 양의 단백질에서 p24 수준의 검출을 위해 사용하였다(3개 한 벌의 well에서)(ABL, Rockville, USA). 모든 그룹을 2개의 독립적인 실험으로 분석하였다.
7. rBCG 균주로 감염된 BMDCs 및 J774.1 세포에서 p24 Gag 발현 수준의 측정
rBCG 감염을 위해, J774.1 세포 및 BMDCs를 well 당 5~10 Х 105 개의 세포로(24-well 플레이트, 3개 한 벌) 시딩하고 18시간 동안 배양하였다. 3개의 상이한 rBCG 균주를 세포에 10의 감염 다중성(multiplicity of infection, M.O.I.)으로 감염시켰다. 또한, 상이한 M.O.I.(1 및 10 M.O.I.)의 rBCG-pMyong2-p24 균주를 BMDCs에 감염시켜서 상이한 M.O.I.에 의한 p24발현의 차이를 비교하였다. J774.1 세포 및 BMDCs를 4시간 동안 인큐베이션하여 박테리아의 식세포 작용을 허용하였고, 세포외 박테리아를 PBS로 3회 세척하여 제거하였다. 감염된 J774.1 세포 및 BMDCs는 24시간 및/또는 72시간 동안 인큐베이션하였다.
세포에서의 p24 발현을 분석하기 위하여, 세포 펠릿 중의 총 단백질을 RIPA 용해 완충액에서의 현탁에 의해 제조하고 p24 ELISA 키트(ABL)(3개 한 벌의 well에서)를 사용하여 제조사 설명서에 따라 p24 수준의 측정을 위해 사용하였다. 모든 감염 그룹을 각 실험에서 3개 한 벌로 분석하였고, 총 2개의 독립적인 실험을 수행하였다.
8. T 세포 증식 분석
T 세포 증식 분석을 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 마우스 2 마리에 p24 단백질(30μg/마우스)을 정맥내 주사하였다. 7일 후, 비장세포(splenocytes)를 극저온 FACS 완충액 [1% 소 혈청 알부민(BSA) 및 1mM EDTA를 함유한 PBS]으로 세척하고 얼음에서 30분 동안 10% 래트 혈청(Sigma Aldrich), 10% 염소 혈청(Gibco Invitrogen), 10% 마우스 혈청(Sigma Aldrich), 및 2.4G2 단클론성 항체(10 μg/ml; BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 함유한 수퍼 블럭(super block) 용액으로 블로킹(blocking)하였다. 세포를 계속해서 BV421-콘쥬게이트된 항-CD4(Clone GK1.5, BD Biosciences) 및 PE-콘쥬게이트된 항-CD8a(Clone 53-6.7, eBioscience, San Diego, CA, USA)으로 30분 동안 4℃에서 염색하고 극저온 FACS 완충액으로 3회 세척하였다. FACS AriaIII 기기(BD Biosciences)를 사용하여 CD4 및 CD8 T 세포 집단을 분류하였다. 또한 공동 배양하기 하루 전 날, 미성숙 BMDCs를 야생형, 2개의 rBCG(rBCG-pMyong2-p24 및 -pAL-p24) 또는 rSmeg-pMyong2-p24 균주로 10의 M.O.I.에서 24시간 동안 감염시켰다. 증식 분석은 형광 세포질 추적 염료인 CFSE(Invitrogen, Carlsbad, USA)를 사용하여 수행하였다. 분류된 CD4 및 CD8 T 세포를 5μM CFSE로 4분 동안 37℃에서 및 4분 동안 얼음에서 염색하였다. 그런 후, CFSE가 표지된 T 세포 및 감염된 BMDCs를 4일 동안 공동 배양하였다.
T 세포와 감염된 BMDCs을 공동 배양한지 4일 뒤에, 공동 배양된 세포(3개 한 벌의 well)를 얼음에서 30분 동안 수퍼 블락(super block) 용액으로 블로킹하고 CD4 BV421-콘쥬게이트된 항-CD4(Clone GK1.5, BD Biosciences) 및 PE-콘쥬게이트된 항-CD8a(Clone 53-6.7, eBioscience)로 30분 동안 4℃에서 염색하였다. 세포 사이클 프로파일은 FACS LSRFortessa(BD Biosciences)를 사용하여 측정하였고, 측정값은 Flowjo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다(도 4a). 모든 실험은 3개 한 벌로 수행하였다.
9. IL-2 ELISA
상기 T 세포 증식 분석 과정에서 공동 배양된 상층액(3개 한 벌의 well)의 마우스 IL-2의 양을 ELISA를 사용하여 제조사의 설명서(BioLegend, USA)를 따라 측정하였다. 모든 실험을 이중으로 수행하였다.
10. Enzyme-Linked ImmunoSpot (ELISPOT) 분석
야생형 및 rBCG 균주로 면역화된 마우스(5 마리/그룹)로부터 얻은 비장세포를 사용하여 다음과 같이 ELISPOT 검정을 수행하였다. 간단히 설명하면, 96- well ELISPOT 플레이트(PVDF 막)를 PBS 중의 마우스 IFN-γ(3μg/ml, 클론: AN-18) 포획 항체(BD-Biosciences, San Diego, CA, USA)로 코팅하고 밤새 4℃에서 인큐베이션 하였다. 포획 항체를 버리고, 플레이트를 0.05% Tween-20 (PBST)을 함유한 PBS 및 PBS(각각 3회)로 세척하고, 플레이트를 10% FBS를 포함한 200μl의 RPMI 1640 배지로 3시간 동안 37℃에서 블로킹하였다. 블로킹 후, 예방접종된 마우스로부터 채취한 비장세포를 각 well 당 5 x 105개씩 로딩하였다. 각각의 치료 그룹에 대해, 세포를 3개 한 벌로 총 200μl의 부피 중 5μg/ml의 정제된 p24 항원 또는 배지 단독으로 자극하였다. 그 후 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 양성 대조군으로서 5ng/ml의 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) 및 500ng/ml의 이오노마이신(Sigma-Aldrich)으로 자극하였다. PBST 및 PBS(각각 3회)로 세척한 후, 각 well을 비오틴(biotin)이 표지된 마우스 IFN-γ(3μg/ml, 클론: XMG1.2) 검출 항체(BD-Biosciences)로 처리하고 플레이트를 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 다시 세척하고 양고추냉이 과산화효소(HRP)-콘쥬게이트된 스트렙트아비딘(streptavidin)을 각 well에 첨가하였다. HRP 반응은 3-아미노-9-에틸카르바졸(AEC) 기질 시약 세트(BD-Biosciences)를 사용하여 전개하였다. well 당 스팟 형성 단위(SFUs)의 수를 ELISPOT 판독기(AID ELISPOT 판독기, Strasburg, 독일)를 사용하여 자동으로 계수하였다. 모든 그룹을 3개 한 벌로 분석하였고 2개의 독립적인 실험을 수행하였다.
11. rBCG 균주로 면역화된 마우스에서 사이토카인 생성의 측정
면역화된 마우스(5마리/그룹)로부터 얻은 비장세포를 10% FBS를 포함한 RPMI 1640 배지에서 1 Х 106 세포/웰(96-well 마이크로 플레이트, 200μl 부피, 3개 한 벌로)의 농도로 조정하고, 정제된 p24 단백질을 시험관 내 자극을 위해 5μg/ml의 농도로 첨가하였다. 세포를 배양하고, 상층액을 ELISA 키트를 사용하여 IL-2(BioLegend, San Diego, CA, USA), IL-6(eBioscience) 및 IFN-γ(BioLegend) 사이토카인 측정을 위해 수득하였다. 모든 그룹을 3개 한 벌로 분석하였고 2개의 독립적인 실험을 수행하였다.
12. 혈청 항체 검출
혈청 항체 비율을 검출하기 위하여, 면역화된 마우스(5마리/그룹)로부터 CO2의 과호흡을 통한 안락사 후에 심장 천공 방법을 사용하여 혈청 샘플을 수집하였다. 96-well 플레이트를 밤새 4℃에서 0.05 M 탄산염-중탄산염 완충액(pH 9.6) 중의 정제된 p24 단백질(5μg/ml)로 코팅하였다. 플레이트를 PBST 및 PBS로 3회 세척하고 상온(RT)에서 1시간 동안 5% 소 혈청 알부민(PBST 중의 BSA)으로 블로킹하였다. 혈청 샘플을 PBS로 1:10의 비율로 희석하고, 100μl를 각 well에 첨가하였다(3개 한 벌로). 플레이트를 2시간 동안 상온에서 인큐베이션하고, PBST 및 PBS로 3회 세척하고, 1시간 동안 비오티닐화(biotinylated)된 래트 항-마우스 IgG2a, IgG1(BD Biosciences, 1:1,000 희석) 및 총 IgG(eBioscience, 1:1,000 희석) 항체와 함께 인큐베이션하였다. 그런 후, 플레이트를 다시 세척하고, HRP 콘쥬게이트된 스트렙트아비딘(eBioscience)과 함께 30분 동안 상온에서 인큐베이션하였다. 최종 세척 단계 후에, 모든 well을 BD OptEIA 기질(BD Biosciences)과 10분 동안 반응시킨 후 반응을 1N H2SO4를 사용하여 반응을 중단시켰다. 분광계를 사용하여 450 nm의 파장에서 광학 밀도(OD)를 측정하였다.
13. 세포독성 T 림프구(Cytotoxic T lymphocyte, CTL) 분석
유도된 CTL 반응은 앞서 기술된 것에서 약간의 변형을 가하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 이펙터 세포의 경우, 각각의 면역화된 그룹의 마우스로부터 얻은 비장세포를 주요 조직적합성 복합체(MHC) class I-제한 p24 펩타이드 A9I (AMQMLKETI)(10μg/ml; Peptron, 대전, 대한민국)를 사용하여 펄스하고 6일 동안 IL-2(30U/ml; PeproTech, Rocky Hill, USA)와 함께 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 표적 세포, 즉 P815 세포(H-2d)를 A9I 펩타이드(10μg/ml)와 함께 2시간 동안 인큐베이션한 후 이펙터 및 표적 세포의 공동 배양에 의해 제조하였다. 세포의 세포독성을 U자형 바닥 96-well 플레이트에서 락트산 탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH) 분석법에 의해 제조사의 프로토콜(CytoTox 96 비-방사성 세포독성 분석; Promega, Madison, USA)을 따라 평가하였다. 간단히 말하면, 이펙터 세포(항원에 의해 자극된 비장세포)를 표적 세포(p24 펄스된 P815 세포)에 3개 한 벌로 상이한 이펙터/표적(E/T) 비율(10:1, 20:1 내지 50:1의 범위)로 6시간 동안 첨가하였다; 그런 후, 배양된 상층액으로부터 방출된 LDH값을 490nm에서 분광계를 사용하여 검출하였다. 특이적 세포 용해의 백분율을 다음 식을 사용하여 계산하였다: [{실험(Experimental) - 자생적 이펙터(Effector spontaneous) - 자생적 표적(Target spontaneous)}/{최대 표적(Target maximum) - 자생적 표적(Target spontaneous)}] x 100(%). 모든 그룹을 3개 한 벌로 분석하였고 2개의 독립적인 실험을 수행하였다.
14. 통계적 분석
제공된 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차로서 표시하였다. 스튜던트 t-테스트는 변량을 비교하기 위해 마이크로소프트 엑셀 소프트웨어를 이용하여 수행하였고, 가능성 값(probability values)이 0.05보다 적을 때 차이를 통계학적으로 유의미한 것으로 간주하였다.
[실시예]
실시예 1. rBCG-pMyong2-p24 균주는 박테리아 및 감염 세포에서 향상된 HIV-1 p24 Gag 발현을 유도한다
본 발명에서는 HIV-1 p24 Gag 예방접종을 위한 rBCG의 제조에서 pMyong2 벡터 시스템의 유용성을 조사하기 위하여, 상이한 마이코박테리움-대장균 셔틀 벡터, 즉 pMyong2-TOPO, pAL-TOPO, 및 pMV306을 각각 사용하여 p24를 발현하는 3가지 유형의 rBCG 균주, 즉 rBCG-pMyong2-p24, rBCG-pAL-p24 및 rBCG-pMV306-p24를 생성하였다(도 2a). 7H9 broth(100μg/ml의 카나마이신 포함)에서 30일 동안 3개의 rBCG 균주의 성장률을 비교하였고, 그 결과 rBCG 및 야생형 BCG 균주가 거의 동일한 성장률을 나타냈다(도 2b). 추가적으로, 대식세포 및 DCs에서 이러한 rBCG 균주들의 생존을 조사하기 위하여, 감염된 세포를 0.05% Triton X-100(in PBS)으로 용해시키고 7H10 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 두 세포에서 모두, 아마도 향상된 p24 발현에 의한 박테리아 부담(bacterial burden)으로 인해 rBCG-pMyong2-p24 균주는 다른 균주들(즉 rBCG-pAL-p24, -pMyong2-p24 및 야생형 BCG 균주)보다 더 적은 CFU를 나타냈다(도 2c).
3개의 rBCG 균주의 박테리아에서 p24의 발현 수준을 비교하기 위하여, 배양된 박테리아의 용해 후에 p24에 대한 ELISA(도 3a) 및 웨스턴 블롯팅(도 3b) 분석을 수행하였다. 모든 rBCG 균주는 p24 단백질을 발현할 수 있었다. rSmeg-pMyong2-p24 균주와 유사하게, rBCG-pMyong2-p24 균주는 다른 벡터 시스템에서의 균주보다 대략 2 또는 3배 더 높은 수준의 p24를 발현하였다. rBCG-pAL-p24는 rBCG-pMV306-p24보다 약간 더 높은 수준의 p24를 생성하였다(도 3a 및 3b).
p24의 안정적인 발현을 평가하기 위하여, 카나마이신이 있거나 없는 7H10 한천 플레이트 상에서 다양한 계대 지점에서의 rBCG-pMyong2-p24에서 p24의 발현 수준을 또한 웨스턴 블롯팅 분석에 의해 측정하였다. rBCG-pMyong2-p24 균주는 카나마이신이 있거나 없는 7H10 한천 플레이트 상에서 12회의 계대 후에도 안정적인 p24 발현을 보였다(도 3d 및 3f). 추가적으로, 3개의 rBCG 균주로 감염된 마우스 대식세포(J774A.1) 및 BMDCs에서 p24의 발현 수준을 ELISA를 이용하여 조사하였다. 관찰된 경향은 용해된 rBCG 균주로 관찰된 것과 유사하였다(도 3h).
또한, 상이한 M.O.I.에 따르는 p24 발현 수준을 비교하기 위하여, BMDCs를 rBCG-pAL-p24 및 rBCG-pMyong2-p24의 상이한 M.O.I.(1 및 10 M.O.I.)로 1일 및 3일 동안 감염시켰다. 그 결과는 두 가지 균주의 증가된 M.O.I.가 p24 발현 증가에 영향을 미친 것으로 나타났다. 그러나, 상기에서 제시된 것과 같이, rBCG-pMyong2-p24는 rBCG-pAL-p24 균주보다 더 많은 p24 발현을 유도하였다(도 3i).
전체적으로, 다른 두 개의 rBCG 균주, 즉 rBCG-pAL-p24 및 rBCG-pMV306-p24와 비교하여, rBCG-pMyong2-p24는 감염된 항원 제시 세포(APC) 및 박테리아에서 p24의 생성을 증가시켰다.
실시예 2. rBCG-pMyong2-p24 균주로 감염된 BMDCs는 HIV-1 p24 Gag로 면역화된 마우스에서 향상된 T 세포 증식을 유도한다
본 발명에서는 향상된 p24 단백질 생성을 보이는 rBCG-pMyong2-p24가 T 세포 증식 능력을 개선시킬 수 있는지의 여부를 측정하기 위하여, 4개의 상이한 균주, 즉 야생형 BCG(대조군으로서), 2가지 유형의 rBCG(rBCG-pMyong2-p24 및 rBCG-pAL-p24), 및 rSmeg-pMyong2-p24으로 각각 감염된 BMDCs에서의 T 세포 증식을 혼합된 림프구 반응(mixed lymphocyte response, MLR)을 통한 CFSE 희석 방법을 사용하여 분석을 수행하였다. 동일한 pMyong2 벡터 시스템, 즉 rBCG-pMyong2-p24 및 rSmeg-pMyong2-p24를 사용하여 2개의 상이한 종 사이의 HIV-1 p24 Gag 특이적 면역 반응을 유도하는 능력을 비교하기 위하여 rSmeg-pMyong2-p24 균주를 또한 포함시켰다. T 세포 증식 분석의 개략적인 내용은 도 4a에 도시하였다.
결과적으로 2개의 rBCG 및 1개의 rSmeg 균주로 감염된 모든 BMDCs는 감염되지 않은 BMDCs보다 상당히 더 높은 수준의 CD4 및 CD8 T 세포 증식을 유도하였다. 특히, rBCG-pMyong2-p24로 감염된 BMDCs는 다른 2개의 재조합 균주(rBCG-pAL-p24 및 rSmeg-pMyong2-p24 균주) 및 야생형 BCG 균주로 감염된 것들보다 상당히 더 높은 수준의 CD4 및 CD8 T 세포 증식을 유도하였다. 그러나, rBCG-pAL-p24로 감염된 BMDCs와 rSmeg-pMyong2-p24로 감염된 것들 사이에서는 CD4 및 CD8 T 세포 둘 다의 증식에서 유의한 차이는 관찰되지 않았다(도 4b 및 4c). 자극된 CD4 및 CD8 T 세포에서 IL-2 수준의 비교는 또한 T 세포 증식 분석에서 관찰된 것들과 유사한 경향성을 나타냈다(도 4d).
실시예 3. rBCG-pMyong2-p24 균주는 피하 면역화에 의해 생성된 마우스 비장에서 향상된 HIV-1 p24 Gag 특이적 IFN-γ 스팟 형성 세포(spot forming cells, SFC)를 유도한다
rBCG-pMyong2-p24의 예방접종 후에 T 세포 반응이 개선되었는지 여부를 측정하기 위하여, 3개의 상이한 균주, 즉 2개 유형의 rBCG 균주(rBCG-pMyong2-p24 및 -pAL-p24), rSmeg-pMyong2-p24(도 5a) 및 대조군으로서 야생형 BCG 균주(~106 CFU)으로 피하(subcutaneously) 면역화된 BALB/c 마우스(5마리/그룹)의 비장으로부터 비장세포를 분리하고 IFN-γ ELISPOT 분석법을 사용하여 HIV-1 p24 Gag- 특이적 T 세포 반응에 대해 분석하였다. 3개의 재조합 균주로 피하 면역화된 마우스로부터 얻은 비장세포는 야생형 BCG 균주로 면역화된 마우스로부터 얻은 비장세포보다 상당히 더 높은 SFUs를 나타냈다. 특히, rBCG-pMyong2-p24 (987.78 ± 195.11 SFUs/106 비장세포)로 면역화된 마우스로부터 채취한 비장세포는 다른 2개의 균주, 즉 rBCG-pAL-p24(479.56 ± 213.90 SFUs/106 비장세포) 및 rSmeg-pMyong2-p24 (647.00 ± 151.01 SFUs/106 비장세포)로 면역화된 마우스로부터 채취한 비장세포보다 상당히 더 높은 SFUs를 유발하였다(도 5b). 그러나, 예방 접종된 마우스로부터의 p24 특이적 IFN-γ SFUs에서 rBCG-pAL-24와 rSmeg-pMyong2-p24 균주 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다(도 5b).
종합하면, 본 발명의 데이터는 rBCG-pMyong2-p24가, Th-1 시그니처 사이토카인인, IFN-γ의 향상된 HIV-1 p24 Gag-특이적 생성을 유도하였고, Th-1형 면역 반응을 왜곡시킴으로써 백신 효능을 향상시키기 위한 실행가능성을 보여준다.
실시예 4. rBCG-pMyong2-p24 균주는 예방접종된 마우스에서 얻은 비장세포에서 Th1 또는 전-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인의 향상된 생성을 유도한다
rBCG 균주 및 rSmeg-pMyong2-p24로 두 번 면역화한 후 4주 뒤에 얻어진 비장세포(5마리/그룹)(도 5a)를 정제된 p24 단백질(5μg/ml)로 3개 한 벌로 시험관 내에서 자극시키고, 세포 배양 상층액 중의 IL-2, IFN-γ 및 IL-6의 유도된 사이토카인 생성을 검출하였다. 두 종류의 Th1형 사이토카인, 즉 IL-2 및 IFN-γ, 그리고 하나의 전-염증성 사이토카인, 즉 IL-6에서, rBCG-pMyong2-p24 균주는 야생형 또는 다른 2개의 재조합 균주에서보다 항상, 모든 시점(1일차 및 3일차)에서, 예방 접종된 마우스로부터 얻은 비장세포에서 보다 더 높은 수준의 사이토카인을 생성하였다(도 5c 및 표 1).
Figure 112019030794692-pat00001
실시예 5. rBCG-pMyong2-p24 균주는 면역화된 마우스에서 HIV-1 p24 Gag-특이적 Th1-바이어스된 체액성 반응을 유도한다
본 발명에서는 rBCG-pMyong2-p24가 면역화된 마우스에서 Th1-바이어스된 체액성 반응을 유도하는지의 여부를 측정하기 위하여, 각각 Th1 및 Th2 반응의 공지된 마커인 HIV-1 p24 Gag-특이적 IgG2a 및 IgG1의 수준을 분석하였다. 도 6에서 나타난 바와 같이, 2개의 rBCG 및 rSmeg-pMyong2-p24 균주는 야생형보다 상당히 더 높은 수준의 IgG2a 동형(isotype)을 유도하였다. IgG1 동형과 관련하여, 3개의 재조합 균주가 유사한 수준의 IgG1을 유도하였다; 그러나, 그 결과는 통계학적 유의미성에는 도달하지 못하였다. 총 IgG의 경우에, rBCG-pMyong2-p24는 다른 두 개의 재조합 균주(즉 rBCG-pAL-p24 및 rSmeg-pMyong2-p24)보다 상당히 더 높은 수준의 총 IgG를 나타냈다(도 6).
종합적으로, IgG2a/IgG1 비율은 더 높을수록 더욱 Th1-바이어스된 체액성 면역 반응을 나타내며, 상기 비율은 rBCG-pMyong2-p24(1.03 ± 0.02)로 면역화된 마우스에서 채취한 혈청에서, 다른 균주들(야생형 BCG = 0.91 ± 0.71; rBCG-pAL-p24 = 0.88 ± 0.21; rSmeg-pMyong2-p24 = 1.01 ± 0.17)로 면역화된 마우스에서 채취한 혈청에서의 비율보다 더 높았고, 이러한 결과는 rBCG-pMyong2-p24 균주가 면역화된 마우스에서 향상된 HIV-1 p24 Gag-특이적 Th1-바이어스된 체액성 반응을 유도할 수 있음을 보여준다.
실시예 6. rBCG-pMyong2-p24 균주는 면역화된 마우스에서 향상된 HIV-1 p24 Gag-특이적 세포독성 T 림프구 반응을 유도한다
본 발명에서는 rBCG-pMyong2-p24가 면역화된 마우스에서 향상된 HIV-1 p24 Gag-특이적 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 유도하는지의 여부를 측정하기 위하여, 2개의 rBCG(rBCG-pMyong2-p24, -pAL-p24), rSmeg-pMyong2-p24 또는 야생형 BCG 균주로 면역화된 마우스로부터의 비장세포에서 CTL 활성을 LDH 세포독성 분석을 통해 평가하였다. 면역화 과정은 도 5a에서 기술하였다. A9I 펩타이드로 2시간 동안 펄스된 P815 세포(H-2d)가 표적 세포로서 사용되었고, 이펙터/표적 비율은 앞서 기술된 것과 같이 10:1, 20:1, 및 50:1이었다. 도 7에서 나타난 바와 같이, 50:1의 E:T 비율에서, rBCG-pMyong2-p24로 면역화된 마우스의 CTL이 다른 균주들로 면역화된 것들보다 상당히 더 높은 수준의 HIV-1 p24 Gag 특이적 표적 세포 용해(lysis)를 유도할 수 있음을 보여준다(도 7). 그러나, rBCG-pMyong2-p24와 rSmeg-pMyong2-p24 균주 사이에서 유의미한 차이는 관찰되지 않았다(도 7).
실시예 7. rBCG-pMyong2-p24 균주는 p24 단백질 예방접종과 비교하여, 면역화된 마우스에서 향상된 HIV-1 p24 Gag-특이적 체액성 및 세포 매개된 면역 반응을 유도한다
본 발명에서는 p24 단백질과 rBCG-pMyong2-p24 균주들의 상이한 CFU 사이의 p24 특이적 면역 반응을 비교하기 위하여, 다음과 같은 그룹으로 독립적인 생체내 실험을 수행하였다. i) PBS 대조군, ii) p24 단백질(30μg/마우스) 주사, iii) rBCG-pMyong2-p24(1 Х 106 CFU) 주사, 및 iv) rBCG-pMyong2-p24(1 Х 107 CFU) 주사(1주 간격, 2회 피하 주사) 그룹. 면역화 과정은 실험 방법 단락에서 기술하였다. 마지막 면역화 후에, p24-특이적 IFN-γ ELISPOT, IgG 아형 분석 및 CTL 분석을 수행하였다. IFN-γ ELISPOT 분석의 경우, p24 특이적 IFN-γ SFU가 CFU 의존적 방식으로 증가하였다. 그러나, p24 단백질이 주사된 마우스로부터 얻은 비장세포는 p24 특이적 IFN-γ SFU를 유도할 수 없었다(도 8a). 이와 유사하게, 각각의 면역화된 마우스로부터 얻은 혈청 샘플에서 p24 특이적 IgG2a 항체 또한 CFU 의존적 방식으로 증가하였다. 그러나, p24 단백질이 주사된 마우스의 혈청에서 p24 특이적 IgG2a 항체는 rBCG-pMyong2-p24 주사 그룹의 그것들과 비교하여 더 낮은 수준을 나타냈다(도 8b).
또한 p24 단백질과 rBCG-pMyong2-p24 균주들의 상이한 CFU 사이의 p24 특이적 CTL 반응을 비교하였다. 본 명세서의 데이터는 rBCG-pMyong2-p24의 p24 특이적 CTL 반응이 CFU 의존적 방식으로 증가하였고 항상 p24 단백질의 그것보다 상당히 더 높았음을 나타냈다(도 8c).
종합적으로, 본 명세서의 데이터는 rBCG-pMyong2-p24가 CFU 의존적 방식으로 p24-특이적 Th1-바이어스된 세포성 및 체액성 면역 반응을 유도할 수 있고, p24 단백질 예방접종 모듈과 비교하여, HIV-1 백신 양생법으로서의 장점을 가질 수 있음을 보여준다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
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Gly Pro Arg Thr Arg Ser Asn Glu Gly His Asp 945 950 955 960 Pro Val Arg Gly Phe Leu His Ser Ala Ala Ser Ala Lys Asn Asn Val 965 970 975 Gly Thr Arg Asp Arg Val Val Gly Arg Asp Gly Glu Ala Arg Pro Val 980 985 990 Val Ala Ala Ser Gly Ser Glu Asp Asn Leu Ser Arg Pro Ser Arg Ala 995 1000 1005 Leu Arg Pro Ala Ser Val Ser Ser Gly Val Ala Val Thr Arg Pro Pro 1010 1015 1020 Val Ser Ser Pro Ile Arg Arg Asn His Phe Ala Met Pro Ile Val Gln 1025 1030 1035 1040 Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu 1045 1050 1055 Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val 1060 1065 1070 Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu 1075 1080 1085 Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met 1090 1095 1100 Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Leu His 1105 1110 1115 1120 Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg 1125 1130 1135 Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly 1140 1145 1150 Trp Met Thr His Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg 1155 1160 1165 Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr 1170 1175 1180 Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr 1185 1190 1195 1200 Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu 1205 1210 1215 Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro 1220 1225 1230 Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Gly Ala Thr Leu Glu 1235 1240 1245 Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala 1250 1255 1260 Arg Val Leu Ser Arg Gly Pro Asn Ser Pro Tyr Ser Glu Ser Tyr Tyr 1265 1270 1275 1280 Asn Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp Glu Asn Pro Gly 1285 1290 1295 Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro Pro Phe Ala Ser Trp 1300 1305 1310 Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg Thr Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg 1315 1320 1325 Ser Leu Asn Gly Glu Trp Thr Arg Pro Val Ala Ala His Ala Arg Arg 1330 1335 1340 Val Trp Trp Leu Arg Ala Ala Pro Leu His Leu Pro Ala Pro Arg Pro 1345 1350 1355 1360 Leu Leu Ser Leu Ser Ser Leu Pro Phe Ser Pro Arg Ser Pro Ala Phe 1365 1370 1375 Pro Val Lys Leu Ile Gly Gly Ser Leu Gly Ser Asp Leu Val Leu Tyr 1380 1385 1390 Gly Thr Ser Thr Pro Lys Asn Leu Ile Arg Val Met Val His Val Val 1395 1400 1405 Gly His Arg Pro Asp Arg Arg Phe Phe Ala Leu Arg Trp Ser Pro Arg 1410 1415 1420 Ser Leu Ile Val Asp Ser Cys Ser Lys Leu Glu Gln His Ser Thr Leu 1425 1430 1435 1440 Ser Arg Ser Ile Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Phe Cys Arg Phe Arg Pro 1445 1450 1455 Ile Gly Lys Met Ser Phe Asn Lys Asn Leu Thr Arg Ile Leu Thr Lys 1460 1465 1470 Phe Arg Ala Gln Gly Leu Leu Lys Glu Ala Glu His Val Glu Ser Gln 1475 1480 1485 Ser Ala Glu Thr Val Leu Thr Pro Asp Glu Cys Gln Leu Leu Gly Tyr 1490 1495 1500 Leu Asp Lys Gly Lys Arg Lys Arg Lys Glu Lys Ala Gly Ser Leu Gln 1505 1510 1515 1520 Trp Ala Tyr Met Ala Ile Ala Arg Leu Gly Gly Phe Met Asp Ser Lys 1525 1530 1535 Arg Thr Gly Ile Ala Ser Trp Gly Ala Leu Trp Gly Trp Glu Ala Leu 1540 1545 1550 Gln Ser Lys Leu Asp Gly Phe Leu Ala Ala Lys Asp Leu Met Ala Gln 1555 1560 1565 Gly Ile Lys Ile Ser Arg Asp Arg Met Arg Ile Val Ser His Asp Thr 1570 1575 1580 Arg Trp Ile Ala Arg Arg Phe Ser Gly Arg Leu Gly Gly Glu Ala Ile 1585 1590 1595 1600 Arg Leu Leu Gly Thr Thr Asp Asn Arg Leu Leu Cys Arg Arg Val Pro 1605 1610 1615 Ala Val Ser Ala Gly Ala Pro Gly Ser Phe Cys Gln Asp Arg Pro Val 1620 1625 1630 Arg Cys Pro Glu Thr Ala Gly Arg Gly Ser Ala Ala Ile Val Ala Gly 1635 1640 1645 His Asp Gly Arg Ser Leu Arg Ser Cys Ala Arg Arg Cys His Ser Gly 1650 1655 1660 Lys Gly Leu Ala Ala Ile Gly Arg Ser Ala Gly Ala Gly Ser Pro Val 1665 1670 1675 1680 Ile Pro Pro Cys Ser Cys Arg Glu Ser Ile His His Gly Cys Asn Ala 1685 1690 1695 Ala Ala Ala Tyr Ala Ser Gly Tyr Leu Pro Ile Arg Pro Pro Ser Glu 1700 1705 1710 Thr Ser His Arg Ala Ser Thr Tyr Ser Asp Gly Ser Arg Ser Cys Arg 1715 1720 1725 Ser Gly Ser Gly Arg Arg Ala Ser Gly Ala Arg Ala Ser Arg Thr Val 1730 1735 1740 Arg Gln Ala Gln Gly Ala His Ala Arg Arg Arg Gly Ser Arg Arg Asp 1745 1750 1755 1760 Pro Trp Arg Cys Leu Leu Ala Glu Tyr His Gly Gly Lys Trp Pro Leu 1765 1770 1775 Phe Trp Ile His Arg Leu Trp Pro Ala Gly Cys Gly Gly Pro Leu Ser 1780 1785 1790 Gly His Ser Val Gly Tyr Pro Tyr Cys Arg Ala Trp Arg Arg Met Gly 1795 1800 1805 Pro Leu Pro Arg Ala Leu Arg Tyr Arg Arg Ser Arg Phe Ala Ala His 1810 1815 1820 Arg Leu Leu Ser Pro Ser Arg Val Leu Leu Asn Lys Arg Lys Ser Met 1825 1830 1835 1840 Ser Ile Gln His Phe Arg Val Ala Leu Ile Pro Phe Phe Ala Ala Phe 1845 1850 1855 Cys Leu Pro Val Phe Ala His Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys Asp 1860 1865 1870 Ala Glu Asp Gln Leu Gly Ala Arg Val Gly Tyr Ile Glu Leu Asp Leu 1875 1880 1885 Asn Ser Gly Lys Ile Leu Glu Ser Phe Arg Pro Glu Glu Arg Phe Pro 1890 1895 1900 Met Met Ser Thr Phe Lys Val Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Ser Arg 1905 1910 1915 1920 Ile Asp Ala Gly Gln Glu Gln Leu Gly Arg Arg Ile His Tyr Ser Gln 1925 1930 1935 Asn Asp Leu Val Glu Tyr Ser Pro Val Thr Glu Lys His Leu Thr Asp 1940 1945 1950 Gly Met Thr Val Arg Glu Leu Cys Ser Ala Ala Ile Thr Met Ser Asp 1955 1960 1965 Asn Thr Ala Ala Asn Leu Leu Leu Thr Thr Ile Gly Gly Pro Lys Glu 1970 1975 1980 Leu Thr Ala Phe Leu His Asn Met Gly Asp His Val Thr Arg Leu Asp 1985 1990 1995 2000 Arg Trp Glu Pro Glu Leu Asn Glu Ala Ile Pro Asn Asp Glu Arg Asp 2005 2010 2015 Thr Thr Met Pro Val Ala Met Ala Thr Thr Leu Arg Lys Leu Leu Thr 2020 2025 2030 Gly Glu Leu Leu Thr Leu Ala Ser Arg Gln Gln Leu Ile Asp Trp Met 2035 2040 2045 Glu Ala Asp Lys Val Ala Gly Pro Leu Leu Arg Ser Ala Leu Pro Ala 2050 2055 2060 Gly Trp Phe Ile Ala Asp Lys Ser Gly Ala Gly Glu Arg Gly Ser Arg 2065 2070 2075 2080 Gly Ile Ile Ala Ala Leu Gly Pro Asp Gly Lys Pro Ser Arg Ile Val 2085 2090 2095 Val Ile Tyr Thr Thr Gly Ser Gln Ala Thr Met Asp Glu Arg Asn Arg 2100 2105 2110 Gln Ile Ala Glu Ile Gly Ala Ser Leu Ile Lys His Trp Leu Ser Asp 2115 2120 2125 Gln Val Tyr Ser Tyr Ile Leu Ile Asp Leu Lys Leu His Phe Phe Lys 2130 2135 2140 Arg Ile Val Lys Ile Leu Phe Asp Asn Leu Met Thr Lys Ile Pro Arg 2145 2150 2155 2160 Glu Phe Ser Phe His Ala Ser Asp Pro Val Glu Lys Ile Lys Gly Ser 2165 2170 2175 Ser Asp Pro Phe Phe Leu Arg Val Ile Cys Cys Leu Gln Thr Lys Lys 2180 2185 2190 Pro Pro Leu Pro Ala Val Val Cys Leu Pro Asp Gln Glu Leu Pro Thr 2195 2200 2205 Leu Phe Pro Lys Val Thr Gly Phe Ser Arg Ala Gln Ile Pro Asn Thr 2210 2215 2220 Val Leu Leu Val Pro Leu Gly His His Phe Lys Asn Ser Val Ala Pro 2225 2230 2235 2240 Pro Thr Tyr Leu Ala Leu Leu Ile Leu Leu Pro Val Ala Ala Ala Ser 2245 2250 2255 Gly Asp Lys Ser Cys Leu Thr Gly Leu Asp Ser Arg Arg Leu Pro Asp 2260 2265 2270 Lys Ala Gln Arg Ser Gly Thr Gly Gly Ser Cys Thr Gln Pro Ser Leu 2275 2280 2285 Glu Arg Thr Thr Tyr Thr Glu Leu Arg Tyr Leu Gln Arg Glu Leu Glu 2290 2295 2300 Ser Ala Thr Leu Pro Glu Gly Arg Lys Ala Asp Arg Tyr Pro Val Ser 2305 2310 2315 2320 Gly Arg Val Gly Thr Gly Glu Arg Thr Arg Glu Leu Pro Gly Gly Asn 2325 2330 2335 Ala Trp Tyr Leu Tyr Ser Pro Val Gly Phe Arg His Leu Leu Glu Arg 2340 2345 2350 Arg Phe Leu Cys Ser Ser Gly Gly Arg Ser Leu Trp Lys Asn Ala Ser 2355 2360 2365 Asn Ala Ala Phe Leu Arg Phe Leu Ala Phe Cys Trp Pro Phe Ala His 2370 2375 2380 Met Phe Phe Pro Ala Leu Ser Pro Asp Ser Val Asp Asn Arg Ile Thr 2385 2390 2395 2400 Ala Phe Glu Ala Asp Thr Ala Arg Arg Ser Arg Thr Thr Glu Arg Ser 2405 2410 2415 Glu Ser Val Ser Glu Glu Ala Glu 2420 <210> 4 <211> 7445 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of full vector <400> 4 agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60 acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120 tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180 ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcttg 240 gtaccgagct cggatccact agtaacggcc gccagtgtgc tggaattcgc ccttaggcgg 300 gcaacacgac atctcaatag ttggcacgga gctcctaaac gacgacagcc ccgctaatgc 360 ggggccgcaa cgtcgatttg gctctacttc gtctctggag tttcgtctct ggagtttcag 420 gtccgagcgg ctaactcggt cctaggcgtc tcccgtgccg cgcccccgaa gggacagtct 480 tgctggactg gtctcacggt agcgcatacc cgaatcagat tcgtggtgac gcgcaaaacc 540 gtgatctcac atttacagat tcccgtgcat ccgtgtgcac ggattcacgc ccatctgggc 600 attcacgtgg ccgttttggt gcctccgtct gggctctcgt cgctcccggc ggcgcgtcgt 660 ggtgacaacc gcgttcgacg cggcagagat tgccgccgcg gtcccggaat ctggctcacc 720 gtgcagcggt acagcgtcag ctcgactgcg cagaatccgc gccaaggaag cccgcagggc 780 gtcgatcgaa cgctgtgggg cggtgccggc cgcggtgccg atgtggtcgt cgcgggagtt 840 gtggactgcc gatctgcggg tgcttttgtc gggtccggag ttcagcacgc gccgggtgat 900 ttcggcggcg acggtgctcg ctgtcgcggt ggcgatggcc gagttcgccg accatgccac 960 gggccgcaat gtggcggtga caaacgaggt tctggccgag cgcgcgaggt gttctaagcg 1020 ttcggtgacc gcggcgcgcg gggtgttgaa agcgttgggt gtcgcggtgg aagcggtacg 1080 tgggcatggc tctgcgacca cacacacggt cggtaatcga ccgagcattt ggcacctggt 1140 aagccgacgc cagcccacca tcgacaaccc gcccacggcc ccgcagaacg gccgcggcga 1200 gcctgccgat acggtgcccg atcgcggcca gagcgcgccc gtggctgtgg agacttgcga 1260 cctaccacca tcccgtaggg ataggtgggt aactcctgtt gagaattact caccaagcac 1320 gcgcgagcgc gcgagcgcgg aaaattcttc cccaaaacaa acacaaccgg cgcggtcgcg 1380 gcggcgctac cgcgccacgc cgcgccccct ggacgttcag cgactcgccg ccggcctggt 1440 cacgccggca gtcggccacg gcccagacaa cgacgggcgg cgaaccgcgc tgatcgccgg 1500 cctggagcag ggccatatcg gggccatctg cgacgcgatc acgacggccg gcatcgacgc 1560 gaccgcctgg actccgaaga cgctcacggc ggcactgaac gccgacgcgc gggtgaccgg 1620 ctggtcgtgg ccggatcgca tcgaacgtcc tggcgcgttc ctggcgtcgc ggctgcgccg 1680 cctgcccgca cggcccgaca ccagtggccc ggttgacaac ggcctggatc aggcccgtag 1740 gacacccgtt gagccgtcag cggcccgtgt agcgccggta cagacggccg ctggccgcgc 1800 gtacgcccgt gcgttgttcg ccgagcagcg acggcaccgg gtgaccgccg ccaatgccca 1860 gtcagccgcg gtgccggtgc gccaaagtgc gccagaaacc gcggtgtgcg caacgtgcgg 1920 atgctcggac gcaccacggc ggcggttcct gccaacgcgg cgggctcaca tttgcgatgc 1980 ctgtttccaa ggatgtggtg gtgggcaggc gcgtactggt cgcgtcggaa cggtcggcag 2040 cagttccgcg gtgccacagt gccagtagtc gggcagggct tgcacgggga tgcggaccca 2100 tccgccggcc gcggccggcg atgggtccag tgtcgcgtta gggccgtcgt ccagccgcgc 2160 cagctcgcgg tcggatgcga tcagcttggc accgtagatg tcgtcgtggc ggcggtccca 2220 cgtgttggtg atgcggtcgc ggtaccagcc tgtccagtct tcgccggtgc cgccggcggt 2280 gagcccggcc cggtaccacg cttcgaggcg atcacggccc cgtgcgtggt tgatggtctg 2340 ggccgcagcc cagtccgcgt cacggagggc tctgtcggct tcgtccatga acccgcgccg 2400 ggtcatgtcg atgatggctg gcgacggggc gtcgtagggg cctggcatgg gcggaggcag 2460 tcggaactgt tgcggtttgc ttgcgttcag ttcctcgtcc tgctggtggg tgcggtcgtg 2520 cagggcaagg ctgtcgcggt accaggcgtc gagcgcggtg cgccagtccc cgccagtggc 2580 gtagggctcc cacggttgcg gtggcagggt ggtgaactcg tgcaggacca ggccgtcgat 2640 gtcgtcgcgc agttcttcac cggcgatggc ggcgatgcgg gcgcagtagc cgggcagatg 2700 gctacgccag tcggcgggca gttcgccgct gcgcgcccac cgcagcacat cggcccacaa 2760 cccaagggcg aattctgcag atatcggtga ccacaacgac gcgcccgctt tgatcgggga 2820 cgtctgcggc cgaccattta cgggtcttgt tgtcgttggc ggtcatgggc cgaacatact 2880 cacccggatc ggagggccga ggacaaggtc gaacgagggg catgacccgg tgcggggctt 2940 cttgcactcg gcataggcga gtgctaagaa taacgttggc actcgcgacc ggtgagtcgt 3000 aggtcgggac ggtgaggcca ggcccgtcgt cgcagcgagt ggcagcgagg acaacttgag 3060 ccgtccgtcg cgggcactgc gcccggccag cgtaagtagc ggggttgccg tcacccggtg 3120 acccccggtt tcatccccga tccggaggaa tcacttcgca atgcctatag tgcagaacct 3180 ccaggggcaa atggtacatc aggccatatc acctagaact ttaaatgcat gggtaaaagt 3240 agtagaagag aaggctttca gcccagaagt aatacccatg ttttcagcat tatcagaagg 3300 agccacccca caagatttaa ataccatgct aaacacagtg gggggacatc aagcagccat 3360 gcaaatgtta aaagagacca tcaatgagga agctgcagaa tgggatagat tgcatccagt 3420 gcatgcaggg cctattgcac caggccagat gagagaacca aggggaagtg acatagcagg 3480 aactactagt acccttcagg aacaaatagg atggatgaca cataatccac ctatcccagt 3540 aggagaaatc tataaaagat ggataatcct gggattaaat aaaatagtaa gaatgtatag 3600 ccctaccagc attctggaca taagacaagg accaaaggaa ccctttagag actatgtaga 3660 ccgattctat aaaactctaa gagccgagca agcttcacaa gaggtaaaaa attggatgac 3720 agaaaccttg ttggtccaaa atgcgaaccc agattgtaag actattttaa aagcattggg 3780 accaggagcg acactagaag aaatgatgac agcatgtcag ggagtggggg gacctggcca 3840 taaggcaaga gttttgtagt ctagagggcc caattcgccc tatagtgagt cgtattacaa 3900 ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa 3960 tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga 4020 tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg acgcgccctg tagcggcgca 4080 ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta 4140 gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt 4200 caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac 4260 cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt 4320 tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga 4380 acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg 4440 gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaatt 4500 cagggcgcaa gggctgctaa aggaagcgga acacgtagaa agccagtccg cagaaacggt 4560 gctgaccccg gatgaatgtc agctactggg ctatctggac aagggaaaac gcaagcgcaa 4620 agagaaagca ggtagcttgc agtgggctta catggcgata gctagactgg gcggttttat 4680 ggacagcaag cgaaccggaa ttgccagctg gggcgccctc tggtaaggtt gggaagccct 4740 gcaaagtaaa ctggatggct ttcttgccgc caaggatctg atggcgcagg ggatcaagat 4800 ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag 4860 gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg 4920 gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca 4980 agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc 5040 tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg 5100 actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatcccac cttgctcctg 5160 ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta 5220 cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag 5280 ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac 5340 tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg 5400 atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg 5460 gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg 5520 aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg 5580 attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgaatt gaaaaaggaa 5640 gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct 5700 tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg 5760 tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg 5820 ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt 5880 atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga 5940 cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga 6000 attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac 6060 gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg 6120 ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac 6180 gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct 6240 agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct 6300 gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg 6360 gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat 6420 ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg 6480 tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat 6540 tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct 6600 catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa 6660 gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 6720 aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 6780 gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta 6840 gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct 6900 gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 6960 atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 7020 cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 7080 cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 7140 agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 7200 tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 7260 gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca 7320 catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg 7380 agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 7440 ggaag 7445

Claims (9)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 나타내는 인간면역결핍바이러스 타입 1 유래의 p24 단백질을 발현하는 재조합 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) BCG로서, 상기 p24 단백질은 도 2a에 개시된 pMyong2-p24 벡터 시스템에 의해 발현되는 것을 특징으로 하는, 재조합 마이코박테리움 보비스 BCG.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 p24 단백질은 서열번호 2의 염기 서열로 나타내는 인간면역결핍바이러스 타입 1 유래의 Gag 유전자가 코딩된 것인, 재조합 마이코박테리움 보비스 BCG.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 마이코박테리움 보비스 BCG는, Tokyo 172 균주인 것인, 재조합 마이코박테리움 보비스 BCG.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 마이코박테리움 보비스 BCG를 유효성분으로 포함하는, HIV-1 백신 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 마이코박테리움 보비스 BCG를 유효성분으로 포함하는, HIV 감염증 또는 HIV 및 결핵균 동시 감염증에 대한 백신 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 재조합 마이코박테리움 보비스 BCG는 살아있는 것인, 백신 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 백신은 추가로 약독화(attenuation) 되지 않은 것인, 백신 조성물.
  8. 제 5 항에 있어서,
    상기 백신은 프라임-부스트 백신 접종법에서 프라임 백신으로 사용되는 것인, 백신 조성물.
  9. 제 5 항에 있어서,
    상기 감염증은 에이즈 또는 결핵인, 백신 조성물.
KR1020190034183A 2018-05-14 2019-03-26 pMyong2 벡터 시스템을 이용하여 HIV-1 p24를 발현하는 재조합 BCG 및 이의 HIV-1 백신으로의 이용 KR102079761B1 (ko)

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