JP2024512499A - 新規な組換えマイコバクテリウムスメグマチス菌株およびその用途 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＭＩＦとＩＬ－７を共発現する組換えマイコバクテリウム菌株およびこれを有効成分として含む癌の予防または治療用組成物に関する。本発明は、マイコバクテリア－由来の複製可能プラスミド、具体的には、本発明者らによって開発されたｐＭｙｏｎｇ２シャトルベクターを介してＭＩＦとＩＬ－７を安定的に発現することにより、極大化された抗癌免疫反応を誘導する。このため、本発明は、組換え菌株の単一投与により多角的な細胞性免疫と体液性免疫を誘導する効率的な抗癌生菌ワクチン組成物として有用に利用可能である。
Description
本発明は、マクロファージ遊走阻止因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ；ＭＩＦ）とインターロイキン－７（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－７；ＩＬ－７）を共発現することにより、癌細胞に対する免疫反応が極大化された組換えマイコバクテリウムスメグマチス菌株に関する。
ＷＨＯの報告（Ｇｌｏｂａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｐｏｒｔ ２０１８）によれば、全世界的に２０１８年の１年間で約１千８百万人の新規癌患者が発生し、全体癌患者は約４千４百万人に達し、このうち９百６０余万人の患者が死亡したことにより、癌は疾病による死亡率の２位を占めている。癌は、大きく、血液癌、上皮細胞で発生する癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、そして結合組織である骨、軟骨、リンパ腺、筋肉および血管などで発生した炎症性腫瘍である肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）に区分され、これらはすべて成長速度が速くて無限に分裂する過増殖性（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）疾患である。人体の正常な免疫機能は、身体内で生成される腫瘍細胞を１，０００万個まで死滅させる能力を持っているにもかかわらず、癌細胞の急速な増殖によって正常な免疫反応だけでは癌を完全に除去するのに限界がある。
免疫治療療法は、患者自らが抗体と感作リンパ球を能動的に生産する能動免疫を増進させる治療法と、他の個体ですでに形成された免疫反応の産物を受け入れる受動免疫治療法とに分類される。また、使用される製剤が治療ターゲットに特異性を有するか否かによって、特異的療法と非特異的療法とに区分される。非特異的な能動免疫治療法のうち、サイトカイン療法は、組換えサイトカインの生産と分泌を誘導することにより、細胞毒性Ｔ－リンパ球を刺激し、主組織適合複合体抗原を活性化することを目的とする。
腫瘍免疫療法は、１８９１年、Ｃｏｌｅｙが癌患者の細菌感染が癌治療の一時的な快方を誘導することを発見してから始まり、１９６０年代にはＢＣＧが一部の癌を除去することを確認した。非結核抗酸菌は、複雑な細胞壁の構成成分によって免疫誘導能に優れ、大食細胞やＴ細胞を効率的に活性化させて各種サイトカインの分泌を誘導し、これにより、ナチュラルキラー細胞を活性化することで癌細胞を死滅させることができる。１９９０年代、ＢＣＧは、膀胱癌を適応症として承認を受けた後、現在まで使用しており、初期膀胱癌を除く他の腫瘍には制限的な効果だけを示している。
本明細書全体にわたり多数の論文および特許文献が参照されてその引用が表示されている。引用された論文および特許文献の開示内容は全体として本明細書に参照により組み込まれて、本発明の属する技術分野の水準および本発明の内容がより明確に説明される。
本発明者らは、単一投与により多角的な免疫反応を誘導する効率的な免疫抗癌剤を開発するために、鋭意研究努力してきた。その結果、マイコバクテリア由来の複製開始点を有するプラスミドに先天性細胞媒介免疫反応を調節するＭＩＦ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）と、Ｂ細胞およびＴ細胞の分化を誘導するＩＬ－７（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－７）の２つのサイトカイン遺伝子を挿入してこれを組換えマイコバクテリウム菌株で発現させる場合、大食細胞を刺激し、樹状細胞の成熟を誘導すると同時に、多様な炎症性サイトカイン分泌を著しく増進させて極大化された癌細胞死滅効果を示すことを見出すことにより、本発明を完成するに至った。
そのため、本発明の目的は、ＭＩＦとＩＬ－７を共発現する組換えマイコバクテリウム菌株およびこれを有効成分として含む癌の予防または治療用組成物を提供することである。
本発明の他の目的および利点は下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲および図面によってより明確になる。
本発明の一態様によれば、本発明は、ＭＩＦ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）またはその機能的一部をエンコードする核酸分子；ＩＬ－７（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－７）またはその機能的一部をエンコードする核酸分子；またはこれらの組合せを含むマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）－由来の複製可能（ｒｅｐｌｉｃａｂｌｅ）プラスミドを提供する。
本発明者らは、単一投与により多角的な細胞性および体液性免疫反応を誘導する効率的な免疫抗癌剤を開発するために、鋭意研究努力してきた。その結果、マイコバクテリア由来の複製開始点を有するプラスミドに先天性細胞媒介免疫反応を調節するＭＩＦと、Ｂ細胞およびＴ細胞の分化を誘導するＩＬ－７の２つのサイトカイン遺伝子を挿入してこれを組換えマイコバクテリウム菌株で発現させる場合、大食細胞と樹状細胞を刺激し、多様な炎症性サイトカイン分泌を著しく増進することにより、極大化された癌細胞死滅効果を示すことを見出した。
本明細書において、用語「機能的一部（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｏｒｔｉｏｎ）」は、ＭＩＦおよびＩＬ－７タンパク質のサイトカインとしての生物学的活性を維持するいかなる長さの一部切片をすべて包括する意味である。したがって、ＭＩＦおよびＩＬ－７タンパク質の機能的一部とは、ＣＤ７４と結合して先天免疫を調節したり、Ｂ細胞およびＴ細胞の分化を誘導する炎症性サイトカインとして機能することができる各タンパク質の一部切片を意味する。
本明細書において、用語「タンパク質」は、ペプチド結合によりアミノ酸残基が互いに結合して形成された線状の高分子を意味する。本発明のＭＩＦおよびＩＬ－７タンパク質は、そのアミノ酸配列が公共データベース（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に公開された野生型ヒトタンパク質であってもよく、前記タンパク質のアミノ酸配列に対して実質的同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示すアミノ酸配列も含むものと解釈される。実質的な同一性は、前記公知のアミノ酸配列と任意の他の配列を最大限に対応するようにアラインし、当業界にて通常利用されるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、最小８０％の相同性、具体的には最小９０％の相同性、最も具体的には最小９５％の相同性を示すアミノ酸配列を意味する。また、前記タンパク質と同一であるか、これに相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質変異体も含むことができる。分子の活性を全体的に変更させないタンパク質およびペプチドでのアミノ酸交換は、当該分野にて公知である（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７９）。最も通常起こるアミノ酸交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕおよびＡｓｐ／Ｇｌｙの間の交換である。
本明細書において、用語「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖の形態で存在するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、他に特別に言及されていない限り、自然のヌクレオチドの類似体を含む（Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３－５８４（１９９０））。本発明のＭＩＦおよびＩＬ－７タンパク質をエンコードする各核酸分子は、マイコバクテリア－由来の複製可能（ｒｅｐｌｉｃａｂｌｅ）プラスミドを遺伝子伝達体（ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）としてそれぞれのプラスミドに含まれてもよく、または２つの遺伝子を１つのプラスミドに同時に挿入して発現させてもよい。
本明細書において、用語「発現させる」は、対象体が外来（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）遺伝子を発現させたり、または内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）遺伝子の自然的発現量を増加させるために、遺伝子伝達体を用いて人為的にこれを導入することにより、遺伝子が対象体細胞内で染色体外因子としてまたは染色体の統合完成によって複製可能になることを意味する。したがって、用語「発現」は、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」、「形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」または「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」と同じ意味である。
本明細書において、用語「遺伝子伝達体」は、所望のターゲット遺伝子を対象細胞に導入して発現させるための媒介体を意味する。理想的な遺伝子伝達体は、人体に無害であり、大量生産が容易であり、効率的に遺伝子を伝達できなければならない。
本明細書において、用語「遺伝子伝達」は、遺伝子が細胞内に運搬されることを意味し、遺伝子の細胞内浸透（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）と同じ意味を有する。組織レベルで、前記用語、遺伝子伝達は、遺伝子の拡散（ｓｐｒｅａｄ）と同じ意味を有する。したがって、本発明の遺伝子伝達体は、遺伝子浸透システムおよび遺伝子拡散システムと記載されてもよい。
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明が遺伝子伝達体として使用されるマイコバクテリア－由来プラスミドは、配列リストの第２配列のヌクレオチド配列を含む複製開始点（Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）およびｈｓｐ６５またはｈｓｐ６０遺伝子のプロモーターを追加的に含む。
本明細書において、用語「複製開始点（Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、ＯＲＩ）」は、ゲノム内で複製が開始される特定の保存的配列であって、プラスミドの複製のために必要なヌクレオチドの領域を意味する。本発明では、マイコバクテリウム属の新種バクテリアであるＭ．ｙｏｎｇｏｎｅｎｓｅ（ＤＳＭ ４５１２６Ｔ）で発見された線状プラスミド（ｐＭｙｏｎｇ２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＱ６５７８０６）の複製開始点を使用する（Ｌｅｅ Ｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５；１０（３）：ｅ０１２２８９７）。
本明細書において、用語「プロモーター」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を調節するＤＮＡ配列を意味する。本発明のプラスミドで用いられるプロモーターは、Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧのゲノムＤＮＡから増幅された熱衝撃タンパク質６５（ｈｓｐ６５）遺伝子のプロモーターである。本発明のシャトルベクターにおいて、ＭＩＦおよびＩＬ－７タンパク質－コードヌクレオチド配列は、前記ｈｓｐ６５遺伝子のプロモーターに作動的に結合する。用語「作動的に結合した（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、プロモーターなどの核酸発現調節配列と発現対象核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これにより、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写および／または翻訳を調節する。
本発明で用いられるｈｓｐ６５またはｈｓｐ６０遺伝子のプロモーターは、例えば、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来プロモーターであってもよいし、より具体的には、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来プロモーターであってもよい。
より具体的には、本発明で用いられるプラスミドは、図１Ａに開示されたｐＭｙｏｎｇ２プラスミドである。
本発明の具体的な実施形態によれば、前記プラスミドは、配列リストの第１配列のヌクレオチド配列を含む。
本発明の他の態様によれば、本発明は、前述した本発明のプラスミドを含む組換えマイコバクテリウム菌株を提供する。
本発明の具体的な実施形態によれば、前記マイコバクテリウムは、マイコバクテリウムスメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウムボビスＢＣＧ（Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ）、マイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウムフレイ（Ｍ．ｐｈｌｅｉ）、マイコバクテリウムフォーツイタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウムルフ（Ｍ．ｌｕｆｕ）、マイコバクテリウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒaｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウムハバナ（Ｍ．ｈａｂａｎａ）、マイコバクテリウムスクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）またはマイコバクテリウムイントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）から構成された群より選択される。より具体的には、前記マイコバクテリウムは、マイコバクテリウムスメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）である。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前述した本発明のマイコバクテリウム菌株を有効成分として含む癌の予防または治療用組成物を提供する。
本明細書において、用語「予防」は、疾患または疾病を保有していると診断されたことはないものの、このような疾患または疾病にかかる可能性がある対象体において疾患または疾病の発生を抑制することを意味する。
本明細書において、用語「治療」は、（ａ）疾患、疾病または症状の発展の抑制；（ｂ）疾患、疾病または症状の軽減；または（ｃ）疾患、疾病または症状を除去することを意味する。本発明の組成物を対象体に投与すれば、多角的な免疫反応による極大化された癌細胞死滅効果により癌への進行および症状の発展を抑制したり、これを除去または軽減させる役割を果たす。したがって、本発明の組成物は、それ自体で癌治療の組成物になってもよく、あるいは他の薬理成分と一緒に投与されて癌に対する治療補助剤として適用されてもよい。このため、本明細書において、用語「治療」または「治療剤」は、「治療補助」または「治療補助剤」の意味を含む。
これとともに、本発明の組成物中にＭＩＦをエンコードする核酸分子は、抗原として作用して抗－ＭＩＦ ＩｇＧの抗体価を増加させる体液性免疫反応を誘導するので、本明細書の用語「癌の予防または治療用組成物」は、「抗癌ワクチン組成物」と同じ意味を有する。
本明細書において、用語「投与」または「投与する」は、本発明の組成物の治療的有効量を対象体に直接的に投与することにより、対象体の体内で同一の量が形成されるようにすることをいう。
本発明において、用語「治療的有効量」は、本発明の薬剤学的組成物を投与しようとする個体に組成物中の薬理成分が治療的または予防的効果を提供するのに十分な程度に含有された組成物の含有量を意味し、よって、「予防的有効量」を含む意味である。
本明細書において、用語「対象体」は、制限なく、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、チンパンジー、ヒヒまたはアカゲザルを含む。具体的には、本発明の対象体は、ヒトである。
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明の組成物で予防または治療できる癌は、乳癌、肝癌、肺癌、大腸癌、膀胱癌および膵臓癌から構成された群より選択される。
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明の組成物で予防または治療できる癌は、転移癌であってもよい。
本明細書において、用語「転移癌（Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）」は、癌細胞が原発性癌（ｐｒｉｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ）組織から離脱して周囲の血管やリンパ管に浸透して、これを通路として体内の他の部位に遠距離移動しながら新たに形成された腫瘍を意味する。癌患者の死亡原因の９０％以上は、原発性癌からの転移に起因するので、癌患者の死亡率を改善させるために癌転移を抑制することは、原発癌の治療に劣らず非常に重要な問題である。後述する実施例に示すように、本発明の組成物は、癌細胞の移動と浸潤能力を著しく低下させ、癌細胞の転移に関連する因子であるＭＭＰ－２およびＭＭＰ－９の発現を大きく減少させることにより、癌の転移過程を効率的に遮断することができる。
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明の組成物は、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）またはその薬剤学的に許容される塩を追加的に含む。
本発明によれば、本発明の組換えマイコバクテリウム菌株は、低分子抗癌剤のシスプラチンと併用投与される場合、著しい相乗的効果を発揮してより効率的な癌細胞死滅能力を示す。併用投与は、１つの剤形に本発明の組換えマイコバクテリウム菌株とシスプラチンとがすべて含まれたまま、またはそれぞれの組成物に別途に含まれたまま同時に投与されたり、または任意の順序で適切な時間差をおいて順次に投与されてもよい。
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明の組成物は、免疫チェックポイント抑制剤（Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を追加的に含む。
本明細書において、用語「免疫チェックポイント（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）」は、自己寛容を維持し、損傷を引き起こす過度の免疫反応から組織を保護する細胞内シグナル伝達体系を意味する。免疫チェックポイントタンパク質は、免疫チェックポイントを調節する細胞膜タンパク質であって、免疫細胞の分化、増殖、活性を抑制することができ、具体的には、これらは活性化されたＴ細胞で発現してＴ細胞の増殖、サイトカイン分泌および細胞毒性を減少させ、Ｔ細胞の過度の活性を抑制する。一部の免疫チェックポイントは、腫瘍細胞が患者の免疫反応を回避する主要メカニズムの１つとして作用する。このため、用語「免疫チェックポイント抑制剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」は、免疫チェックポイントタンパク質の発現または活性を遮断することにより、Ｔ細胞の活性を強化して抗腫瘍免疫反応を促進する抗癌成分または抗癌補助剤成分を意味する。
本発明で用いられる免疫チェックポイント抑制剤は、例えば、細胞毒性Ｔ－リンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死１タンパク質（ＰＤ－１）、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム細胞死１リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、Ｂ７－１、Ｂ７－Ｈ３、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）およびＴ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）に対する抗体を含むが、これに限定されるものではない。
より具体的には、前記免疫チェックポイント抑制剤は、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体である。本発明の例示的な実施形態によれば、前記抗－ＰＤ－Ｌ１抗体として、例えば、抗－マウスＰＤ－Ｌ１ Ｂ７－Ｈ１（ＩｎｖｉｖｏＭａｂ、ｃａｔａｌｏｇ．ＢＥ０１０１）を使用することができる。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前述した本発明の組成物を対象体に投与するステップを含む癌の予防または治療方法を提供する。
本発明で用いられる組換えマイコバクテリウム、これを含む薬剤学的組成物およびこれによって予防または治療できる癌腫についてはすでに詳述したので、過度の重複を避けるためにその記載を省略する。
本発明の特徴および利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）本発明は、ＭＩＦとＩＬ－７を共発現する組換えマイコバクテリウム菌株およびこれを有効成分として含む癌の予防または治療用組成物を提供する。
（ｂ）本発明は、マイコバクテリア－由来の複製可能プラスミド、具体的には、本発明者らによって開発されたｐＭｙｏｎｇ２シャトルベクターを介してＭＩＦとＩＬ－７を安定的に発現することにより、極大化された抗癌免疫反応を誘導する。
（ｃ）本発明は、組換え菌株の単一投与により多角的な細胞性免疫と体液性免疫を誘導する効率的な抗癌生菌ワクチン組成物として有用に利用可能である。
（ａ）本発明は、ＭＩＦとＩＬ－７を共発現する組換えマイコバクテリウム菌株およびこれを有効成分として含む癌の予防または治療用組成物を提供する。
（ｂ）本発明は、マイコバクテリア－由来の複製可能プラスミド、具体的には、本発明者らによって開発されたｐＭｙｏｎｇ２シャトルベクターを介してＭＩＦとＩＬ－７を安定的に発現することにより、極大化された抗癌免疫反応を誘導する。
（ｃ）本発明は、組換え菌株の単一投与により多角的な細胞性免疫と体液性免疫を誘導する効率的な抗癌生菌ワクチン組成物として有用に利用可能である。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
実施例１
実験方法
ヒトＭＩＦまたはＩＬ－７を発現する組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの作製
ｈＭＩＦおよびＩＬ－７発現ベクターの作製
ヒトＭＩＦ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）およびＩＬ－７を発現するマイコバクテリア－シャトルベクターを作製するために、Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧのゲノムＤＮＡからｈｓｐ（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）６５遺伝子のプロモーターを増幅し、ｈＭＩＦおよびＩＬ－７増幅産物とオーバーラップＰＣＲにより連結させることにより、ｐｈｓｐ－ｈＭＩＦおよびｐｈｓｐ－ＩＬ７配列を作製した。作製されたｐｈｓｐ－ｈＭＩＦおよびｐｈｓｐ－ＩＬ－７配列をｐＭＶ３０６およびｐＭｙｏｎｇ２＿ＴＯＰＯベクターにクローニングしてヒトＭＩＦおよび／またはＩＬ－７を発現できるマイコバクテリア－大腸菌シャトルベクターを作製した（ｐＭＶ３０６－ｈＭＩＦ、ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ、ｐＭＶ３０６－ＩＬ７、ｐＭｙｏｎｇ２－ＩＬ７、ｐＭＶ３０６－ｈＭＩＦ：：ｈＩＬ７、ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ｈＩＬ７）。
実験方法
ヒトＭＩＦまたはＩＬ－７を発現する組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの作製
ｈＭＩＦおよびＩＬ－７発現ベクターの作製
ヒトＭＩＦ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）およびＩＬ－７を発現するマイコバクテリア－シャトルベクターを作製するために、Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧのゲノムＤＮＡからｈｓｐ（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）６５遺伝子のプロモーターを増幅し、ｈＭＩＦおよびＩＬ－７増幅産物とオーバーラップＰＣＲにより連結させることにより、ｐｈｓｐ－ｈＭＩＦおよびｐｈｓｐ－ＩＬ７配列を作製した。作製されたｐｈｓｐ－ｈＭＩＦおよびｐｈｓｐ－ＩＬ－７配列をｐＭＶ３０６およびｐＭｙｏｎｇ２＿ＴＯＰＯベクターにクローニングしてヒトＭＩＦおよび／またはＩＬ－７を発現できるマイコバクテリア－大腸菌シャトルベクターを作製した（ｐＭＶ３０６－ｈＭＩＦ、ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ、ｐＭＶ３０６－ＩＬ７、ｐＭｙｏｎｇ２－ＩＬ７、ｐＭＶ３０６－ｈＭＩＦ：：ｈＩＬ７、ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ｈＩＬ７）。
作製されたベクターを多様なＮＴＭに形質転換
それぞれのベクターをＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧに電気泳動（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ；Ｂｉｏ－ＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）して形質転換菌株を確保した（図４）。組換え菌株はカナマイシン選択７Ｈ１０培地に継代維持した。
それぞれのベクターをＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧに電気泳動（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ；Ｂｉｏ－ＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）して形質転換菌株を確保した（図４）。組換え菌株はカナマイシン選択７Ｈ１０培地に継代維持した。
組換え菌株内のｈＭＩＦ、ＩＬ－７ ＥＬＩＳＡ発現確認
組換え菌株をリゾチーム１００μｇ／ｍｌ、ＤＮａｓｅ ５Ｕ／ｍｌおよびプロテイナーゼ抑制剤が補充されたＢ－ＰＥＲ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）に溶解して氷で超音波処理（５分、パルス：０．３ｓ、静止：０．７ｓ）した。粉砕液を１３，０００ｒｐｍ、１５分間４℃で遠心分離し、上層液を取った。各組換え菌株から抽出したタンパクを用いてｈＭＩＦおよびＩＬ－７の発現量をＥＬＩＳＡにより測定した。
組換え菌株をリゾチーム１００μｇ／ｍｌ、ＤＮａｓｅ ５Ｕ／ｍｌおよびプロテイナーゼ抑制剤が補充されたＢ－ＰＥＲ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）に溶解して氷で超音波処理（５分、パルス：０．３ｓ、静止：０．７ｓ）した。粉砕液を１３，０００ｒｐｍ、１５分間４℃で遠心分離し、上層液を取った。各組換え菌株から抽出したタンパクを用いてｈＭＩＦおよびＩＬ－７の発現量をＥＬＩＳＡにより測定した。
組換え菌株の安定性評価
細胞感染後の組換え菌株のｈＭＩＦ、ＩＬ－７ ＥＬＩＳＡ発現確認
マウス大食細胞（Ｊ７７４Ａ．１）を６ウェルプレートにシーディングし、２４時間経た後、１０Ｍ．Ｏ．Ｉ．（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の各組換え菌株を感染させた。２時間または４時間後、感染した細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞外部（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）の菌を除去し、新しい培地に切り替えた。感染２４時間後、細胞からタンパクを抽出してｈＭＩＦ、ＩＬ－７ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔを用いて、各組換え菌株によるｈＭＩＦ、ＩＬ－７の発現量を比較測定した。
細胞感染後の組換え菌株のｈＭＩＦ、ＩＬ－７ ＥＬＩＳＡ発現確認
マウス大食細胞（Ｊ７７４Ａ．１）を６ウェルプレートにシーディングし、２４時間経た後、１０Ｍ．Ｏ．Ｉ．（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の各組換え菌株を感染させた。２時間または４時間後、感染した細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞外部（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）の菌を除去し、新しい培地に切り替えた。感染２４時間後、細胞からタンパクを抽出してｈＭＩＦ、ＩＬ－７ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔを用いて、各組換え菌株によるｈＭＩＦ、ＩＬ－７の発現量を比較測定した。
インビボにおける組換え菌株の安定性確認
５×１０６の組換え菌株をマウスに静脈（Ｉ．Ｖ．）経路で感染させた後、１週間後に犠牲にして、摘出した脾臓を均質化して適切な希釈倍数の菌液を固体培地に塗抹した後、３７℃の培養器で培養して多数の単一コロニーを確保した。各コロニーごとにプラスミドベクターに挿入した遺伝子配列を増幅可能なプライマーを用いてＰＣＲで増幅した後、電気泳動を行う方法により、組換え菌株としての特性を維持する確率を計算した。
５×１０６の組換え菌株をマウスに静脈（Ｉ．Ｖ．）経路で感染させた後、１週間後に犠牲にして、摘出した脾臓を均質化して適切な希釈倍数の菌液を固体培地に塗抹した後、３７℃の培養器で培養して多数の単一コロニーを確保した。各コロニーごとにプラスミドベクターに挿入した遺伝子配列を増幅可能なプライマーを用いてＰＣＲで増幅した後、電気泳動を行う方法により、組換え菌株としての特性を維持する確率を計算した。
組換え菌株の安全性評価
ＬＤＨ、７ＡＡＤアッセイ
マウス由来の大食細胞（Ｊ７７４Ａ．１）を６ウェルプレートにシーディングし、２４時間経た後、１０Ｍ．Ｏ．Ｉ．の各組換え菌株を感染させた。２時間または４時間後、感染した細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞外部の菌を除去し、新しい培地に切り替えた。時間ごとに培養液を用いてＬＤＨアッセイを進行させ、感染した細胞は７ＡＡＤ、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖを染色してフローサイトメトリーにより細胞毒性を評価した。
ＬＤＨ、７ＡＡＤアッセイ
マウス由来の大食細胞（Ｊ７７４Ａ．１）を６ウェルプレートにシーディングし、２４時間経た後、１０Ｍ．Ｏ．Ｉ．の各組換え菌株を感染させた。２時間または４時間後、感染した細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞外部の菌を除去し、新しい培地に切り替えた。時間ごとに培養液を用いてＬＤＨアッセイを進行させ、感染した細胞は７ＡＡＤ、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖを染色してフローサイトメトリーにより細胞毒性を評価した。
インビトロでの安全性評価
マウス由来のマクロファージ細胞株（Ｊ７７４Ａ．１）を６ウェルプレートにシーディングし、２４時間経た後、１０Ｍ．Ｏ．Ｉ．の各組換え菌株を感染させた。４時間後、感染した細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞外部の菌を除去し、新しい培地に切り替えた。時間ごとに、ＰＢＳ中の０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で細胞を切り離して適切な希釈倍数に相当する菌液をＯＡＤＣが補充された７Ｈ１０固体培地に塗抹して、約４週間３７℃の培養器で培養し、コロニーカウンティングによりＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）を比較測定した。
マウス由来のマクロファージ細胞株（Ｊ７７４Ａ．１）を６ウェルプレートにシーディングし、２４時間経た後、１０Ｍ．Ｏ．Ｉ．の各組換え菌株を感染させた。４時間後、感染した細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞外部の菌を除去し、新しい培地に切り替えた。時間ごとに、ＰＢＳ中の０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で細胞を切り離して適切な希釈倍数に相当する菌液をＯＡＤＣが補充された７Ｈ１０固体培地に塗抹して、約４週間３７℃の培養器で培養し、コロニーカウンティングによりＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）を比較測定した。
インビトロでの安全性評価
５×１０６の組換え菌株をマウスに静脈感染させた後、１週間後に犠牲にして、摘出した脾臓を均質化して適切な希釈倍数の菌液を固体培地に塗抹して、３７℃で培養した。以後、コロニーの数字を数えてＣＦＵを比較測定した。
５×１０６の組換え菌株をマウスに静脈感染させた後、１週間後に犠牲にして、摘出した脾臓を均質化して適切な希釈倍数の菌液を固体培地に塗抹して、３７℃で培養した。以後、コロニーの数字を数えてＣＦＵを比較測定した。
組換え菌株の免疫活性能評価
樹状細胞の分化
マウスの大腿骨（ｆｅｍｕｒ）と脛骨（ｔｉｂｉａ）を分離して骨髄細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌ）を分離し、ＩＬ－４およびＧＭ－ＣＳＦが補充されたＩＭＤＭ培地に６日間培養して樹状細胞への分化を誘導した。分化した樹状細胞でＣＤ１１ｃマーカーを確認して８０％以上分化した場合にのみ実験に使用した。
樹状細胞の分化
マウスの大腿骨（ｆｅｍｕｒ）と脛骨（ｔｉｂｉａ）を分離して骨髄細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌ）を分離し、ＩＬ－４およびＧＭ－ＣＳＦが補充されたＩＭＤＭ培地に６日間培養して樹状細胞への分化を誘導した。分化した樹状細胞でＣＤ１１ｃマーカーを確認して８０％以上分化した場合にのみ実験に使用した。
組換え菌株感染時の樹状細胞の成熟程度をフローサイトメトリーで評価
分化させた樹状細胞に各組換え菌株を２４時間感染させた。感染した細胞を切り離して非特異的抗体結合を抑制するために３０分間ブロッキングした後、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＩＩ型ＭＨＣ分子に対する蛍光抗体で３０分間染色した後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に浮遊させた後、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ機器で各蛍光の強度を比較測定した。
分化させた樹状細胞に各組換え菌株を２４時間感染させた。感染した細胞を切り離して非特異的抗体結合を抑制するために３０分間ブロッキングした後、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＩＩ型ＭＨＣ分子に対する蛍光抗体で３０分間染色した後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に浮遊させた後、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ機器で各蛍光の強度を比較測定した。
樹状細胞が分泌するサイトカイン測定
各組換え菌株を感染させた樹状細胞培養液で分泌したサイトカインを測定するためにＥＬＩＳＡを進行させた。ＥＬＩＳＡ９６ウェルプレートに捕集（ｃａｐｔｕｒｅ）抗体を２４時間コーティングした後、洗浄して、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡを各ウェルに入れて、約１時間ブロッキングした。洗浄後、感染した樹状細胞培養液を入れて、２時間室温で培養した。再度洗浄後、検出抗体とともに２時間室温で培養後、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ－ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が接合されたストレプトアビジンを３０分間反応させて発色させた。以後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した（ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２など）。
各組換え菌株を感染させた樹状細胞培養液で分泌したサイトカインを測定するためにＥＬＩＳＡを進行させた。ＥＬＩＳＡ９６ウェルプレートに捕集（ｃａｐｔｕｒｅ）抗体を２４時間コーティングした後、洗浄して、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡを各ウェルに入れて、約１時間ブロッキングした。洗浄後、感染した樹状細胞培養液を入れて、２時間室温で培養した。再度洗浄後、検出抗体とともに２時間室温で培養後、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ－ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が接合されたストレプトアビジンを３０分間反応させて発色させた。以後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した（ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２など）。
多様な癌細胞株に対する抗癌効果観察
組換え菌株の多様な癌細胞株に対する直接的細胞毒性観察
組換え菌株が直接的に癌細胞の細胞毒性を増加させるかを確認するために、ヒト由来の乳癌細胞株のＭＣＦ－７、肝癌細胞株のＨｅｐＧ２、肺癌細胞株のＡ５４９と、マウス由来の大腸癌細胞株のＭＣ３８、膀胱癌細胞株のＭｂｔ－２をそれぞれ２４ウェルプレートにシーディングし、２４時間後、１、１０、２０Ｍ．Ｏ．Ｉ．の各組換え菌株を感染させた。４時間後、感染した細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞外部の菌を除去し、新しい培地に切り替えた。時間ごとに培養液を用いてＬＤＨアッセイを進行させ、感染した細胞は７ＡＡＤ、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖを染色してフローサイトメトリーで細胞毒性を評価した。
組換え菌株の多様な癌細胞株に対する直接的細胞毒性観察
組換え菌株が直接的に癌細胞の細胞毒性を増加させるかを確認するために、ヒト由来の乳癌細胞株のＭＣＦ－７、肝癌細胞株のＨｅｐＧ２、肺癌細胞株のＡ５４９と、マウス由来の大腸癌細胞株のＭＣ３８、膀胱癌細胞株のＭｂｔ－２をそれぞれ２４ウェルプレートにシーディングし、２４時間後、１、１０、２０Ｍ．Ｏ．Ｉ．の各組換え菌株を感染させた。４時間後、感染した細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞外部の菌を除去し、新しい培地に切り替えた。時間ごとに培養液を用いてＬＤＨアッセイを進行させ、感染した細胞は７ＡＡＤ、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖを染色してフローサイトメトリーで細胞毒性を評価した。
大食細胞による癌細胞株に対する細胞毒性能確認
組換え菌株が大食細胞を刺激することで癌細胞に対する免疫反応を誘導するかを確認するために、マウス大食細胞Ｊ７７４Ａ．１に１、１０、２０Ｍ．Ｏ．Ｉ．の各組換え菌株を感染させた。４時間後、感染した細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞外部の菌を除去し、新しい培地に切り替えた。以後、２４時間感染させた大食細胞とマウス由来の大腸癌細胞株ＭＣ３８および膀胱癌細胞株Ｍｂｔ－２を共培養し、細胞培養液中のＬＤＨを測定することにより、細胞毒性を評価した。
組換え菌株が大食細胞を刺激することで癌細胞に対する免疫反応を誘導するかを確認するために、マウス大食細胞Ｊ７７４Ａ．１に１、１０、２０Ｍ．Ｏ．Ｉ．の各組換え菌株を感染させた。４時間後、感染した細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞外部の菌を除去し、新しい培地に切り替えた。以後、２４時間感染させた大食細胞とマウス由来の大腸癌細胞株ＭＣ３８および膀胱癌細胞株Ｍｂｔ－２を共培養し、細胞培養液中のＬＤＨを測定することにより、細胞毒性を評価した。
ＭＣ３８マウス大腸癌細胞株を用いたインビボ抗癌効果観察
１×１０６のＭＣ３８細胞を皮下（Ｓ．Ｃ．）注入後、３日、７日、１４日後に１×１０７ＣＦＵの組換え菌株を皮下で計３回接種した。最後の組換え菌株注射後１週間後の実験終了日まで腫瘍の大きさを測定し、各グループのマウスを犠牲にして、腫瘍を摘出した。実験終了日に腫瘍の重量と実験期間に測定した腫瘍の大きさを比較することにより、組換え菌株による抗癌効果を評価した（図２）。
１×１０６のＭＣ３８細胞を皮下（Ｓ．Ｃ．）注入後、３日、７日、１４日後に１×１０７ＣＦＵの組換え菌株を皮下で計３回接種した。最後の組換え菌株注射後１週間後の実験終了日まで腫瘍の大きさを測定し、各グループのマウスを犠牲にして、腫瘍を摘出した。実験終了日に腫瘍の重量と実験期間に測定した腫瘍の大きさを比較することにより、組換え菌株による抗癌効果を評価した（図２）。
癌発生誘導されたマウスにおける免疫反応
サイトカインの発現測定
各組換え菌株で抗癌効果を観察したマウスの脾臓細胞を９６ウェルプレートにシーディングし、これに５μｇ／ｍｌの濃度でＭＣ３８細胞溶解抗原を処理して再刺激させた。２４時間または７２時間目に細胞の培養液を収集して、－７０℃に保管した。その後、免疫反応の活性化に関連したり（ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ）、免疫抑制に関連するサイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－１０など）に対するＥＬＩＳＡを行って、その発現様相を比較分析した。
サイトカインの発現測定
各組換え菌株で抗癌効果を観察したマウスの脾臓細胞を９６ウェルプレートにシーディングし、これに５μｇ／ｍｌの濃度でＭＣ３８細胞溶解抗原を処理して再刺激させた。２４時間または７２時間目に細胞の培養液を収集して、－７０℃に保管した。その後、免疫反応の活性化に関連したり（ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ）、免疫抑制に関連するサイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－１０など）に対するＥＬＩＳＡを行って、その発現様相を比較分析した。
サイトカイン発現するＮＫおよびＴ細胞観察
各組換え菌株で抗癌効果を観察したマウスの脾臓細胞を９６ウェルプレートにシーディングし、これに５μｇ／ｍｌの濃度のＭＣ３８細胞溶解抗原で再刺激させた。４８時間後、ＥＲ（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）内タンパク質を取っておくｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａを４時間処理した後、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８分子に対する蛍光抗体で染色した。この後、細胞内ＩＦＮ－γを染色するために、ｆｉｘ／ｐｅｒｍ処理後、ＩＦＮ－γに対する蛍光抗体で染色し、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａを用いてＩＦＮ－γの発現比率を比較分析した。
各組換え菌株で抗癌効果を観察したマウスの脾臓細胞を９６ウェルプレートにシーディングし、これに５μｇ／ｍｌの濃度のＭＣ３８細胞溶解抗原で再刺激させた。４８時間後、ＥＲ（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）内タンパク質を取っておくｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａを４時間処理した後、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８分子に対する蛍光抗体で染色した。この後、細胞内ＩＦＮ－γを染色するために、ｆｉｘ／ｐｅｒｍ処理後、ＩＦＮ－γに対する蛍光抗体で染色し、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａを用いてＩＦＮ－γの発現比率を比較分析した。
抗癌剤との併用効果観察
組換え菌株の抗癌効果を極大化するために、抗癌剤との併用療法を行った。１×１０６のＭＣ３８細胞を皮下注入し、３日、７日、１４日後に１×１０７ＣＦＵの組換え菌株を皮下で計３回接種した。併用投与効果を確認するために、組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｉｓとシスプラチン（５０μｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。最後の組換え菌株注射後１週間後の実験終了日まで腫瘍の大きさを測定し、各グループのマウスを犠牲にして、腫瘍を摘出した。実験終了日に腫瘍の重量と実験期間に測定した腫瘍の大きさを比較することにより、組換え菌株による抗癌効果を観察した。
組換え菌株の抗癌効果を極大化するために、抗癌剤との併用療法を行った。１×１０６のＭＣ３８細胞を皮下注入し、３日、７日、１４日後に１×１０７ＣＦＵの組換え菌株を皮下で計３回接種した。併用投与効果を確認するために、組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｉｓとシスプラチン（５０μｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。最後の組換え菌株注射後１週間後の実験終了日まで腫瘍の大きさを測定し、各グループのマウスを犠牲にして、腫瘍を摘出した。実験終了日に腫瘍の重量と実験期間に測定した腫瘍の大きさを比較することにより、組換え菌株による抗癌効果を観察した。
実験結果
ヒトＭＩＦまたはヒトＩＬ－７を発現するプラスミドＤＮＡ生成
組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌株作製のために、ＩｎｔｅｇｒａｔｉｏｎベクターのｐＭＶ３０６と新規なマイコバクテリア－大腸菌シャトルベクターのｐＭｙｏｎｇ２に、ヒトＭＩＦまたはヒトＩＬ－７遺伝子を含むプラスミドを構築した。ヒトＭＩＦおよびＩＬ－７を発現するマイコバクテリア－シャトルベクターを作製するために、Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧのゲノムＤＮＡからｈｓｐ６５遺伝子のプロモーターを増幅してｐｈｓｐ－ｈＭＩＦおよびｐｈｓｐ－ＩＬ７配列を作製した（図３）。また、追加的に免疫反応を誘導可能な結核菌由来タンパク質のＴＢＣＭを作製し、ｈＭＩＦ、ｈＩＬ７、ＴＢＣＭの融合タンパクを発現するベクターも一緒に作製した。
ヒトＭＩＦまたはヒトＩＬ－７を発現するプラスミドＤＮＡ生成
組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌株作製のために、ＩｎｔｅｇｒａｔｉｏｎベクターのｐＭＶ３０６と新規なマイコバクテリア－大腸菌シャトルベクターのｐＭｙｏｎｇ２に、ヒトＭＩＦまたはヒトＩＬ－７遺伝子を含むプラスミドを構築した。ヒトＭＩＦおよびＩＬ－７を発現するマイコバクテリア－シャトルベクターを作製するために、Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧのゲノムＤＮＡからｈｓｐ６５遺伝子のプロモーターを増幅してｐｈｓｐ－ｈＭＩＦおよびｐｈｓｐ－ＩＬ７配列を作製した（図３）。また、追加的に免疫反応を誘導可能な結核菌由来タンパク質のＴＢＣＭを作製し、ｈＭＩＦ、ｈＩＬ７、ＴＢＣＭの融合タンパクを発現するベクターも一緒に作製した。
作製されたｐｈｓｐ－ｈＭＩＦ、ｐｈｓｐ－ＩＬ－７およびｐｈｓｐ－ＴＢＭＣと３つのタンパク質の融合配列をｐＭＶ３０６およびｐＭｙｏｎｇ２ベクターにクローニングしてヒトＭＩＦおよびＩＬ－７を発現可能なマイコバクテリア－大腸菌シャトルベクターを作製し、大腸菌にｈｅａｔ－ｓｈｏｃｋにより注入させた後、カナマイシン抗生剤が含まれたＬＢ固形培地に塗抹した。抗生剤耐性遺伝子を含むことでカナマイシンが含まれた培地で生存したコロニーを選択し、注入した遺伝子をターゲッティングするプライマーでＰＣＲを進行させた。コロニーＰＣＲ上で所望する大きさの遺伝子が検知された大腸菌コロニーをＬＢ液体培地で培養した後、プラスミドＤＮＡを抽出してシーケンシングを進行させた（図５）。以上のような方法で免疫反応を増進させることができるタンパク質－コード遺伝子の塩基配列を含む下記の１２種類のプラスミドＤＮＡを確保した：ｐＭＶ３０６－ｈＭＩＦ、ｐＭＶ３０６－ｈＩＬ７、ｐＭＶ３０６－ＴＢＣＭ、ｐＭＶ３０６－ｈＭＩＦ：：ｈＩＬ７、ｐＭＶ３０６－ｈＭＩＦ：：ＴＢＣＭ、ｐＭＶ３０６－ＴＢＣＭ：：ｈＭＩＦ、ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ、ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＩＬ７、ｐＭｙｏｎｇ２－ＴＢＣＭ、ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ｈＩＬ７、ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＴＢＣＭ、ｐＭｙｏｎｇ２－ＴＢＣＭ：：ｈＭＩＦ。
ヒトＭＩＦまたはヒトＩＬ－７を発現する組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌の作製
免疫反応を誘導する組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを生成するために、塩基配列を確認した各ベクターをＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌に形質転換させ、ｈＭＩＦ、ＴＢＣＭ、ｈＭＩＦ：：ＴＢＣＭ、ＴＢＣＭ：：ｈＭＩＦ（図６）およびｈＩＬ７、ｈＭＩＦ：：ｈＩＬ７、ＴＢＣＭ：：ｈＩＬ７（図７）を発現する組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓはカナマイシン抗生剤が含まれた７Ｈ１０固形培地上で選別され、選別された菌はコロニーＰＣＲにより所望の遺伝子を発現しているかを確認することにより、ｈＭＩＦ、ｈＩＬ７、ＴＢＣＭおよび融合タンパク質を発現する下記の組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを確保した：ｒＳｍｅｇ－ｐＭＶ３０６－ｈＭＩＦ、ｒＳｍｅｇ－ｐＭＶ３０６－ｈＩＬ７、ｒＳｍｅｇ－ｐＭＶ３０６－ＴＢＣＭ、ｒＳｍｅｇ－ｐＭＶ３０６－ｈＭＩＦ：：ｈＩＬ７、ｒＳｍｅｇ－ｐＭＶ３０６－ｈＭＩＦ：：ＴＢＣＭ、ｒＳｍｅｇ－ｐＭＶ３０６－ＴＢＣＭ：：ｈＭＩＦ、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＩＬ７、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ＴＢＣＭ、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ｈＩＬ７、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＴＢＣＭ、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ＴＢＣＭ：：ｈＭＩＦ。
免疫反応を誘導する組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを生成するために、塩基配列を確認した各ベクターをＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌に形質転換させ、ｈＭＩＦ、ＴＢＣＭ、ｈＭＩＦ：：ＴＢＣＭ、ＴＢＣＭ：：ｈＭＩＦ（図６）およびｈＩＬ７、ｈＭＩＦ：：ｈＩＬ７、ＴＢＣＭ：：ｈＩＬ７（図７）を発現する組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓはカナマイシン抗生剤が含まれた７Ｈ１０固形培地上で選別され、選別された菌はコロニーＰＣＲにより所望の遺伝子を発現しているかを確認することにより、ｈＭＩＦ、ｈＩＬ７、ＴＢＣＭおよび融合タンパク質を発現する下記の組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを確保した：ｒＳｍｅｇ－ｐＭＶ３０６－ｈＭＩＦ、ｒＳｍｅｇ－ｐＭＶ３０６－ｈＩＬ７、ｒＳｍｅｇ－ｐＭＶ３０６－ＴＢＣＭ、ｒＳｍｅｇ－ｐＭＶ３０６－ｈＭＩＦ：：ｈＩＬ７、ｒＳｍｅｇ－ｐＭＶ３０６－ｈＭＩＦ：：ＴＢＣＭ、ｒＳｍｅｇ－ｐＭＶ３０６－ＴＢＣＭ：：ｈＭＩＦ、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＩＬ７、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ＴＢＣＭ、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ｈＩＬ７、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＴＢＣＭ、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ＴＢＣＭ：：ｈＭＩＦ。
それぞれの組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを１菌株以上確保し、これらを物理的（超音波処理）、化学的（リソソームおよびＤＮａｓｅを含むＢ－ｐｅｒ溶液）方法で溶解させて発現しているタンパク質を測定した。その結果、ｈＩＬ７を除いたすべてのタンパク質がｐＭＶ３０６ベクターを用いた時に比べて、ｐＭｙｏｎｇ２ベクターを用いた場合に著しく高発現することが分かった（図８）。これとともに、陽性対照群としてＭ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧにもｐＭＶ３０６およびｐＭｙｏｎｇ２ベクターに様々なタンパク質を発現する組換え菌株を構築した（図９）。
Ｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７の安定性評価
Ｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７が発現するタンパク質の安定性を確認するために、抗生剤を含めたり、含めていない培地で１０継代まで培養した結果、ｐＭｙｏｎｇ２ベクターに発現しているタンパク質がすべて１０継代まで発現維持されることを確認し（図１０）、これにより、ｐＭｙｏｎｇ２ベクターを含む組換え菌株は安定的にタンパク質を発現することを確認した。これとともに、Ｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７が抗生剤の選別が不可能なインビボ環境でも安定的にタンパク質を発現するかを確認するために、マウスに静脈注射した後、１週間後に脾臓内での単一菌をＰＣＲ方法で確認した結果、Ｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７がインビボ環境でもプラスミドベクターを安定的に保有していることを確認した（図１１）。
Ｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７が発現するタンパク質の安定性を確認するために、抗生剤を含めたり、含めていない培地で１０継代まで培養した結果、ｐＭｙｏｎｇ２ベクターに発現しているタンパク質がすべて１０継代まで発現維持されることを確認し（図１０）、これにより、ｐＭｙｏｎｇ２ベクターを含む組換え菌株は安定的にタンパク質を発現することを確認した。これとともに、Ｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７が抗生剤の選別が不可能なインビボ環境でも安定的にタンパク質を発現するかを確認するために、マウスに静脈注射した後、１週間後に脾臓内での単一菌をＰＣＲ方法で確認した結果、Ｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７がインビボ環境でもプラスミドベクターを安定的に保有していることを確認した（図１１）。
組換え菌株の安全性評価
本発明の組換え菌株が治療用ワクチンとしての安全性を確保しているかを確認するために、大食細胞に各組換え菌株を感染させた後、２４および４８時間目の組換え菌株のＣＦＵを測定した結果、ｐＭＶ３０６－ｈＭＩＦ：：ｈＩＬ７とｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ｈＩＬ７菌株において野生型のＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓより感染率が高いことを感染後２４時間で確認し、すべての組換え菌株が感染後４８時間で野生型のＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓより感染率が高いことが確認された（図１２Ａ）。それだけでなく、感染した大食細胞の培養液において大部分の細胞で存在する酵素として細胞が損傷したり破壊される時に分泌するＬＤＨ（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を測定した結果、ｐＭＶ３０６－ｈＭＩＦ、－ｈＩＬ７およびｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を発現する組換え菌株による細胞毒性は、病原性の低いＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ野生型より著しく低いレベルであり、ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を発現するＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓに感染した場合、どの菌にも感染しないＰＢＳ群と類似レベルの細胞毒性を確認した（図１２Ｂ）。これにより、組換え菌株は、野生型と比較して大食細胞内の高い細胞感染率にもかかわらず、細胞毒性は高くないことを確認した。特に、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ｈＩＬ７菌株は高い細胞内感染率を示すため、組換え菌株が発現するタンパク質によって免疫細胞の活性化が誘導されると期待されたが、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ｈＩＬ７の感染による免疫細胞の死滅が誘導されないため、治療用ワクチンとしての使用に最適化されたというメリットを示すと判断された。
本発明の組換え菌株が治療用ワクチンとしての安全性を確保しているかを確認するために、大食細胞に各組換え菌株を感染させた後、２４および４８時間目の組換え菌株のＣＦＵを測定した結果、ｐＭＶ３０６－ｈＭＩＦ：：ｈＩＬ７とｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ｈＩＬ７菌株において野生型のＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓより感染率が高いことを感染後２４時間で確認し、すべての組換え菌株が感染後４８時間で野生型のＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓより感染率が高いことが確認された（図１２Ａ）。それだけでなく、感染した大食細胞の培養液において大部分の細胞で存在する酵素として細胞が損傷したり破壊される時に分泌するＬＤＨ（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を測定した結果、ｐＭＶ３０６－ｈＭＩＦ、－ｈＩＬ７およびｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を発現する組換え菌株による細胞毒性は、病原性の低いＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ野生型より著しく低いレベルであり、ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を発現するＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓに感染した場合、どの菌にも感染しないＰＢＳ群と類似レベルの細胞毒性を確認した（図１２Ｂ）。これにより、組換え菌株は、野生型と比較して大食細胞内の高い細胞感染率にもかかわらず、細胞毒性は高くないことを確認した。特に、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ｈＩＬ７菌株は高い細胞内感染率を示すため、組換え菌株が発現するタンパク質によって免疫細胞の活性化が誘導されると期待されたが、ｒＳｍｅｇ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ｈＩＬ７の感染による免疫細胞の死滅が誘導されないため、治療用ワクチンとしての使用に最適化されたというメリットを示すと判断された。
Ｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７がインビボ環境で野生型と比較して臓器内感染率を確認するために、マウスに静脈注射（１００μｌ ＰＢＳ中５×１０６）後、１週間後に脾臓を均質化してＣＦＵを比較した結果、組換え菌株が野生型と比較して統計学有意性がないことを確認した（ｐ＝０．１８８７）（図１３）。
組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの免疫増進能評価
免疫反応を誘発して抗癌効果を増進させるためには、後天免疫を活性化させる樹状細胞が重要な細胞として作用するため、ｐＭｙｏｎｇ２組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓが抗原提示細胞である樹状細胞の成熟を誘導するかを確認しようとした。マウスの骨髄細胞からＧＭ－ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）を用いて分化した樹状細胞に組換え菌株を感染させた後、樹状細胞の代表的な成熟マーカーであるＭＨＣＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６の発現をＦＡＣＳで確認した結果、すべての組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓと野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを感染させた時、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＭＨＣＩＩを発現する樹状細胞が、何も処理しない樹状細胞より著しく増加することをすべてのＭ．Ｏ．Ｉ条件で確認した。これにより、すべての組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｓは、野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓレベルに樹状細胞を刺激して成熟させることが分かった（図１４）。それだけでなく、活性化された樹状細胞で分泌する炎症性サイトカインＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－αをＥＬＩＳＡで測定した結果、すべての組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓと野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを感染させた時、何も処理しない樹状細胞より著しく増加することを観察した（図１５）。これにより、すべての組換えＭ．ｓｍｅｇａｍｔｉｓは、野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの特性を維持したまま樹状細胞を刺激して炎症性サイトカインの分泌を誘導することが分かった。結論として、本発明のｐＭｙｏｎｇ２組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓは効果的に免疫反応を誘導した。
免疫反応を誘発して抗癌効果を増進させるためには、後天免疫を活性化させる樹状細胞が重要な細胞として作用するため、ｐＭｙｏｎｇ２組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓが抗原提示細胞である樹状細胞の成熟を誘導するかを確認しようとした。マウスの骨髄細胞からＧＭ－ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）を用いて分化した樹状細胞に組換え菌株を感染させた後、樹状細胞の代表的な成熟マーカーであるＭＨＣＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６の発現をＦＡＣＳで確認した結果、すべての組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓと野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを感染させた時、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＭＨＣＩＩを発現する樹状細胞が、何も処理しない樹状細胞より著しく増加することをすべてのＭ．Ｏ．Ｉ条件で確認した。これにより、すべての組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｓは、野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓレベルに樹状細胞を刺激して成熟させることが分かった（図１４）。それだけでなく、活性化された樹状細胞で分泌する炎症性サイトカインＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－αをＥＬＩＳＡで測定した結果、すべての組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓと野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを感染させた時、何も処理しない樹状細胞より著しく増加することを観察した（図１５）。これにより、すべての組換えＭ．ｓｍｅｇａｍｔｉｓは、野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの特性を維持したまま樹状細胞を刺激して炎症性サイトカインの分泌を誘導することが分かった。結論として、本発明のｐＭｙｏｎｇ２組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓは効果的に免疫反応を誘導した。
多様な癌細胞株に対する抗癌効果観察
以上から確認された本発明の組換え菌株の抗癌効果をインビトロで確認すべく、ヒト乳癌細胞ＭＤＡ２３１とＭＣＦ７、マウス大腸癌細胞ＭＣ３８、マウス乳癌細胞ＥＯ７７１にそれぞれ組換え菌株を感染させた後、癌細胞の代謝活性の測定により組換え菌株の細胞死滅能を確認した。細胞の代謝活性はＭＴＳ細胞増殖アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いて測定した。ヒト由来の癌細胞（図１６Ａ）とマウス由来の癌細胞（図１６Ｂ）ともにおいて、ｐＭｙｏｎｇ２ベクターが形質転換された組換え菌株が、ｐＭＶ３０６ベクターが形質転換された組換え菌株より癌細胞に対する高い細胞毒性を示すことが確認された。これは、先に観察された組換え菌株の性能から確認されたように、ｐＭｙｏｎｇ２－ＴＯＰＯベクターがｐＭＶ３０６ベクターよりヒトＭＩＦとヒトＩＬ－７の発現量がはるかに高いためであると推定される。さらに、ヒトＭＩＦとヒトＩＬ－７をそれぞれ発現する菌株は、空ベクターを有する菌株に比べてより高い細胞毒性を有する傾向を示しており、ヒトＭＩＦとヒトＩＬ－７がそれぞれ発現する場合より、２つのタンパクが融合した形態で発現する場合、癌細胞に対する最も高い細胞毒性を示すことを確認した。
以上から確認された本発明の組換え菌株の抗癌効果をインビトロで確認すべく、ヒト乳癌細胞ＭＤＡ２３１とＭＣＦ７、マウス大腸癌細胞ＭＣ３８、マウス乳癌細胞ＥＯ７７１にそれぞれ組換え菌株を感染させた後、癌細胞の代謝活性の測定により組換え菌株の細胞死滅能を確認した。細胞の代謝活性はＭＴＳ細胞増殖アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いて測定した。ヒト由来の癌細胞（図１６Ａ）とマウス由来の癌細胞（図１６Ｂ）ともにおいて、ｐＭｙｏｎｇ２ベクターが形質転換された組換え菌株が、ｐＭＶ３０６ベクターが形質転換された組換え菌株より癌細胞に対する高い細胞毒性を示すことが確認された。これは、先に観察された組換え菌株の性能から確認されたように、ｐＭｙｏｎｇ２－ＴＯＰＯベクターがｐＭＶ３０６ベクターよりヒトＭＩＦとヒトＩＬ－７の発現量がはるかに高いためであると推定される。さらに、ヒトＭＩＦとヒトＩＬ－７をそれぞれ発現する菌株は、空ベクターを有する菌株に比べてより高い細胞毒性を有する傾向を示しており、ヒトＭＩＦとヒトＩＬ－７がそれぞれ発現する場合より、２つのタンパクが融合した形態で発現する場合、癌細胞に対する最も高い細胞毒性を示すことを確認した。
また、組換え菌株によって活性化される大食細胞と樹状細胞が癌細胞に対する細胞毒性を有するかを確認するために、組換え菌株で刺激させた大食細胞と樹状細胞を癌細胞と共同培養して癌細胞に対する細胞毒性を観察した結果、野生型のＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓに比べてすべての組換え菌株によって刺激された大食細胞と樹状細胞は癌細胞死滅効果がより高く、特に、ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７は、他の組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓよりこれら免疫細胞の抗癌効果を極大化させることを確認した（図１７）。これにより、組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓは、直接的に癌細胞の代謝を阻害するだけでなく、大食細胞と樹状細胞を刺激して癌細胞の死滅を誘導することが分かり、組換え菌株の中でもｐＭｙｏｎｇ２ベクターに融合タンパクｈＭＩＦ：：ＩＬ７を形質転換させたＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓが最も優れた抗癌効果を示すことを確認した。
Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７による癌細胞の移動および浸潤抑制
癌の進行に伴い、癌細胞は他の臓器に転移するために移動および他の組織に浸潤できる特性を得るが、これは、癌治療の限界を引き起こす。Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７が癌細胞の転移に関連する移動および浸潤にも影響を及ぼすかを確認するために、多様なマウス由来の癌細胞（黒色腫Ｂ１６Ｆ１０、乳癌細胞ＥＯ７７１、大腸癌細胞ＭＣ３８）にＰＢＳ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を感染させた後、２００μｌのピペットチップで掻き取った後、時間による移動の程度を確認した。その結果、Ｂ１６Ｆ１０とＥＯ７７１において、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７で感染させない細胞に比べて移動が抑制されることを確認することができた（図１８）。特に、ＭＣ３８大腸癌細胞株の場合、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７菌株のみが移動を抑制させることを確認した。それだけでなく、癌細胞は酵素を用いて細胞外基質（ＥＣＭ）を損傷させて血管壁を貫く浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）過程により転移が起こるため、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７による浸潤抑制を調べるべく、マトリゲルがコーティングされたトランスウェルでＭＣ３８大腸癌細胞株にＰＢＳ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を感染させた後、４８時間後に細胞をｈｏｅｃｈｓｔで染色し、マトリゲルを通過した細胞以外の他の細胞は除去した後、蛍光顕微鏡で観察した。蛍光顕微鏡上でＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７に感染したＭＣ３８細胞は浸潤が減少したことを確認することができ、これを数値化させた時、ＰＢＳおよびＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓに比べて統計的に有意な結果であることが分かった（図１９）。これにより、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７菌株がマウス由来の大腸癌細胞株ＭＣ３８の移動および浸潤を抑制することが分かった。
癌の進行に伴い、癌細胞は他の臓器に転移するために移動および他の組織に浸潤できる特性を得るが、これは、癌治療の限界を引き起こす。Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７が癌細胞の転移に関連する移動および浸潤にも影響を及ぼすかを確認するために、多様なマウス由来の癌細胞（黒色腫Ｂ１６Ｆ１０、乳癌細胞ＥＯ７７１、大腸癌細胞ＭＣ３８）にＰＢＳ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を感染させた後、２００μｌのピペットチップで掻き取った後、時間による移動の程度を確認した。その結果、Ｂ１６Ｆ１０とＥＯ７７１において、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７で感染させない細胞に比べて移動が抑制されることを確認することができた（図１８）。特に、ＭＣ３８大腸癌細胞株の場合、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７菌株のみが移動を抑制させることを確認した。それだけでなく、癌細胞は酵素を用いて細胞外基質（ＥＣＭ）を損傷させて血管壁を貫く浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）過程により転移が起こるため、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７による浸潤抑制を調べるべく、マトリゲルがコーティングされたトランスウェルでＭＣ３８大腸癌細胞株にＰＢＳ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を感染させた後、４８時間後に細胞をｈｏｅｃｈｓｔで染色し、マトリゲルを通過した細胞以外の他の細胞は除去した後、蛍光顕微鏡で観察した。蛍光顕微鏡上でＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７に感染したＭＣ３８細胞は浸潤が減少したことを確認することができ、これを数値化させた時、ＰＢＳおよびＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓに比べて統計的に有意な結果であることが分かった（図１９）。これにより、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７菌株がマウス由来の大腸癌細胞株ＭＣ３８の移動および浸潤を抑制することが分かった。
ＭＣ３８マウス大腸癌細胞株を用いたインビボ抗癌効果観察
マウス由来の大腸癌細胞ＭＣ３８をＣ５７ＢＬ／６マウスに注入した後、組換え菌株をリンパ節付近に注射して腫瘍サイズの変化を観察した結果、ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を形質転換させたＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを注入したマウスにおいて、腫瘍の大きさは野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを処理したマウスでより著しく減少することを注入１５日目から観察することができ、マウスから腫瘍を分離した時、視覚的に確実な大きさの差を確認することができた。また、マウスから分離した腫瘍の重量は、ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を形質転換させたＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを注入した場合に最も低い数値を示し、何も処理しない場合に比べて８０％のマウスでのみ腫瘍が形成された（図２０）。それだけでなく、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７による抗癌効果を膀胱癌の治療剤として使用しているＢＣＧと比較した結果、癌細胞注入後１５日目からＢＣＧ処理マウスに比べて著しく減少した腫瘍サイズを示した（図２１）。これにより、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ＿ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７の抗癌効果をインビボで検証しただけでなく、陽性対照群のＢＣＧより優れた抗癌効果を示すことが分かった。
マウス由来の大腸癌細胞ＭＣ３８をＣ５７ＢＬ／６マウスに注入した後、組換え菌株をリンパ節付近に注射して腫瘍サイズの変化を観察した結果、ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を形質転換させたＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを注入したマウスにおいて、腫瘍の大きさは野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを処理したマウスでより著しく減少することを注入１５日目から観察することができ、マウスから腫瘍を分離した時、視覚的に確実な大きさの差を確認することができた。また、マウスから分離した腫瘍の重量は、ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を形質転換させたＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを注入した場合に最も低い数値を示し、何も処理しない場合に比べて８０％のマウスでのみ腫瘍が形成された（図２０）。それだけでなく、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７による抗癌効果を膀胱癌の治療剤として使用しているＢＣＧと比較した結果、癌細胞注入後１５日目からＢＣＧ処理マウスに比べて著しく減少した腫瘍サイズを示した（図２１）。これにより、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ＿ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７の抗癌効果をインビボで検証しただけでなく、陽性対照群のＢＣＧより優れた抗癌効果を示すことが分かった。
癌発生誘導されたマウスの血清内反応観察
インビボでＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７によって血清内炎症性サイトカインの変化をＥＬＩＳＡにより調べた結果、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理したマウスから得た血清では、何も処理しないマウスと野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを処理したマウスに比べて血清内マウスＭＩＦの分泌量が著しく減少したことを確認することができた（図２２Ａ）。これにより、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７の処理によってＭＩＦに対するＩｇＧの濃度が血清内に増加したと判断された。これとともに、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理したマウスから得た血清では、何も処理しないマウスと野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを処理したマウスに比べて抗－ヒトＭＩＦ ＩｇＧの濃度が減少することを確認した（図２２Ｂ）。それだけでなく、何も処理しないマウスと野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを処理したマウスに比べて、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７群のマウスから得た血清では、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６の分泌が著しく増加していることを確認した（図２３）。これにより、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７の処理によりマウス内の全般的な免疫活性が増加したことが分かった。まとめると、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理したマウスにおいて、血清内ヒトＭＩＦに対するＩｇＧの濃度が対照群に比べて著しく増加したことで血清内マウスＭＩＦの濃度が低くなることを確認し、これにより、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７がインビボでｈＭＩＦに対する体液性免疫反応を効率的に誘導することが分かった。
インビボでＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７によって血清内炎症性サイトカインの変化をＥＬＩＳＡにより調べた結果、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理したマウスから得た血清では、何も処理しないマウスと野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを処理したマウスに比べて血清内マウスＭＩＦの分泌量が著しく減少したことを確認することができた（図２２Ａ）。これにより、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７の処理によってＭＩＦに対するＩｇＧの濃度が血清内に増加したと判断された。これとともに、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理したマウスから得た血清では、何も処理しないマウスと野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを処理したマウスに比べて抗－ヒトＭＩＦ ＩｇＧの濃度が減少することを確認した（図２２Ｂ）。それだけでなく、何も処理しないマウスと野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを処理したマウスに比べて、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７群のマウスから得た血清では、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６の分泌が著しく増加していることを確認した（図２３）。これにより、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７の処理によりマウス内の全般的な免疫活性が増加したことが分かった。まとめると、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理したマウスにおいて、血清内ヒトＭＩＦに対するＩｇＧの濃度が対照群に比べて著しく増加したことで血清内マウスＭＩＦの濃度が低くなることを確認し、これにより、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７がインビボでｈＭＩＦに対する体液性免疫反応を効率的に誘導することが分かった。
癌発生誘導されたマウスの癌組織内における遺伝子とタンパクの発現観察
Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を注射したマウスにおいて血清内抗－ヒトＭＩＦ ＩｇＧの量が増加し、マウスＭＩＦの量が減少することを確認したので、マウス癌組織内のＭＩＦ関連遺伝子とタンパク質の発現も減少するかをＲＴ－ＰＣＲとＩＨＣ染色により調べようとした。その結果、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理した群の癌組織において、何も処理しないマウスと野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを処理したマウスに比べて細胞週期に関連するＣｙｃｌｉｎ Ｄ１、ＭＩＦに対する受容体であるＣＤ７４、そして癌成長に関連するＭＭＰ－２とＭＭＰ－９のｍＲＮＡ発現量が著しく減少することを確認した（図２４）。これとともに、各マウスから抽出した癌組織のＩＨＣ染色でタンパク質の発現を調べた結果も、何も処理しないマウスと野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを処理したマウスに比べて、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理したマウスから得た癌組織内でＭＩＦの受容体であるＣＤ７４と細胞質内のＭＩＦタンパク質の発現が著しく減少することを確認した（図２５）。これにより、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７がＢＣＧ、野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓに比べてＭＩＦに対する免疫反応を効率的に誘導することで癌成長関連遺伝子およびタンパク質の発現を減少させることにより、癌の成長および増殖を最も効果的に抑制することが分かった。
Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を注射したマウスにおいて血清内抗－ヒトＭＩＦ ＩｇＧの量が増加し、マウスＭＩＦの量が減少することを確認したので、マウス癌組織内のＭＩＦ関連遺伝子とタンパク質の発現も減少するかをＲＴ－ＰＣＲとＩＨＣ染色により調べようとした。その結果、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理した群の癌組織において、何も処理しないマウスと野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを処理したマウスに比べて細胞週期に関連するＣｙｃｌｉｎ Ｄ１、ＭＩＦに対する受容体であるＣＤ７４、そして癌成長に関連するＭＭＰ－２とＭＭＰ－９のｍＲＮＡ発現量が著しく減少することを確認した（図２４）。これとともに、各マウスから抽出した癌組織のＩＨＣ染色でタンパク質の発現を調べた結果も、何も処理しないマウスと野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを処理したマウスに比べて、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理したマウスから得た癌組織内でＭＩＦの受容体であるＣＤ７４と細胞質内のＭＩＦタンパク質の発現が著しく減少することを確認した（図２５）。これにより、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７がＢＣＧ、野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓに比べてＭＩＦに対する免疫反応を効率的に誘導することで癌成長関連遺伝子およびタンパク質の発現を減少させることにより、癌の成長および増殖を最も効果的に抑制することが分かった。
癌発生が誘導されたマウスにおける免疫反応観察
１番目のインビボ実験で観察された抗癌効果は、組換え菌株をリンパ節付近に注射したため、免疫器官である脾臓内免疫細胞の比率に差があると判断し、これをフローサイトメーターにより確認した。その結果、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ＿ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７群のマウスから抽出した脾臓細胞は、何も処理しなかったり野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを処理したマウスに比べてＴＮＦ－αを分泌するＮＫおよびＣＤ８ Ｔ細胞の比率が著しく増加していることを確認した（図２６）。これとともに、腫瘍の周辺環境に直接注射した２番目のインビボ実験でも、脾臓および腫瘍内免疫細胞の比率をフローサイトメトリーにより観察した結果、脾臓内大食細胞の比率がＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ＿ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を注射したマウスで著しく減少することを確認した（図２７Ａ）。また、癌組織をコラゲナーゼＩＶとＤＮａｓｅ Ｉで処理して単純細胞として分離した後、同じく免疫細胞の比率を比較した結果、脾臓細胞におけるのと同じく、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ＿ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を注射したマウスで大食細胞の比率が減少していた。興味深いことに、癌細胞を除去する機能を有するＣＤ８細胞毒性Ｔ細胞はＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ＿ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７によって増加した（図２７Ｂ）。
１番目のインビボ実験で観察された抗癌効果は、組換え菌株をリンパ節付近に注射したため、免疫器官である脾臓内免疫細胞の比率に差があると判断し、これをフローサイトメーターにより確認した。その結果、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ＿ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７群のマウスから抽出した脾臓細胞は、何も処理しなかったり野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを処理したマウスに比べてＴＮＦ－αを分泌するＮＫおよびＣＤ８ Ｔ細胞の比率が著しく増加していることを確認した（図２６）。これとともに、腫瘍の周辺環境に直接注射した２番目のインビボ実験でも、脾臓および腫瘍内免疫細胞の比率をフローサイトメトリーにより観察した結果、脾臓内大食細胞の比率がＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ＿ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を注射したマウスで著しく減少することを確認した（図２７Ａ）。また、癌組織をコラゲナーゼＩＶとＤＮａｓｅ Ｉで処理して単純細胞として分離した後、同じく免疫細胞の比率を比較した結果、脾臓細胞におけるのと同じく、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ＿ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を注射したマウスで大食細胞の比率が減少していた。興味深いことに、癌細胞を除去する機能を有するＣＤ８細胞毒性Ｔ細胞はＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ＿ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７によって増加した（図２７Ｂ）。
腫瘍組織内で増加したＣＤ８ Ｔ細胞が実際に癌細胞を死滅させたり周辺の免疫細胞をさらに活性化させるためには、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γのようなサイトカインを分泌しなければならない。このため、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ＿ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７によって腫瘍組織内で増加したＣＤ８ Ｔ細胞がＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－νを分泌して実質的な抗癌機能を発揮するか、さらに、ＩＦＮ－νを分泌してＣＤ８ Ｔ細胞を活性化させるＣＤ４ Ｔ細胞が増加するかを確認するためにフローサイトメーターで観察した結果、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ＿ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７によってＩＦＮ－νを分泌するＣＤ４ ＴとＣＤ８ Ｔ細胞の比率が著しく増加することを確認することができ、これは、ＢＣＧ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ群に比べてはるかに優れていた。それだけでなく、実際に癌細胞を殺すＴＮＦ－αを分泌するＣＤ８ Ｔ細胞の場合、ＰＢＳとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ群に比べて著しく増加していることを確認した（図２８）。
脾臓細胞、細胞毒性Ｔ細胞およびＴｈ１細胞が増加することを観察したので、癌組織での細胞溶解性タンパク質であるグランザイム（Ｇｒａｎｚｙｍｅ）Ｂとパーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）－１の発現をＩＨＣ染色により確認した結果、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理したマウスから得た癌組織内において、何も処理しないマウスと野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを処理したマウスに比べてグランザイムＢとパーフォリン－１タンパク質の発現が著しく増加することを確認した（図２９）。これをまとめると、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７は、癌組織と脾臓細胞で炎症性サイトカインの分泌を誘導する免疫細胞を活性化させて、ＢＣＧ、野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓより優れた抗癌効果を示し、これを癌組織における細胞溶解性タンパク質の発現によっても確認することができた。
シスプラチンとの併用効果確認
ＭＣ３８癌細胞株が移植されたマウスモデルにおいてＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７と商用化された抗癌剤であるシスプラチンとの併用効果を観察すべく、ＭＣ３８癌細胞の注入後、３日、７日、１４日目にＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を２×１０６ずつ注入し、７日および１４日目にシスプラチンを一緒に注入した。その結果、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を注入したマウスの場合、何も処理しないマウスに比べて癌サイズの成長速度が減少することを確認することができ、ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を発現するＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの場合、野生型に比べて癌組織の成長速度を遅延させることを確認した。また、摘出した癌組織の重量は、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を注入した場合、何も処理しない群に比べて統計的に有意なレベルに低下し、ｈＭＩＦ：：ＩＬ７タンパク質を発現するＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓが野生型を処理した群に癌の重量を減少させることを確認した（図３０）。このため、シスプラチンとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７とを併用処理時、抗癌剤の単独投与に比べて癌成長阻害効果が著しく増加した。
ＭＣ３８癌細胞株が移植されたマウスモデルにおいてＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７と商用化された抗癌剤であるシスプラチンとの併用効果を観察すべく、ＭＣ３８癌細胞の注入後、３日、７日、１４日目にＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を２×１０６ずつ注入し、７日および１４日目にシスプラチンを一緒に注入した。その結果、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を注入したマウスの場合、何も処理しないマウスに比べて癌サイズの成長速度が減少することを確認することができ、ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を発現するＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの場合、野生型に比べて癌組織の成長速度を遅延させることを確認した。また、摘出した癌組織の重量は、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を注入した場合、何も処理しない群に比べて統計的に有意なレベルに低下し、ｈＭＩＦ：：ＩＬ７タンパク質を発現するＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓが野生型を処理した群に癌の重量を減少させることを確認した（図３０）。このため、シスプラチンとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７とを併用処理時、抗癌剤の単独投与に比べて癌成長阻害効果が著しく増加した。
シスプラチンとの併用投与時のマウスの体重と脾臓の重量確認
ＭＣ３８癌細胞株移植モデルにおけるシスプラチンとの併用効果を追加的に確認するために、癌の密度に比例した指標になるマウスの体重と免疫細胞の流入と活性化を反映する脾臓の重量を測定した。その結果、何も処理しないマウスの場合、癌細胞注入後の時間経過とともに体重が着実に増加したのに対し、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を注入したマウスの場合に体重が減少した（図３１Ａ）。シスプラチンとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７との併用処理は、抗癌剤単独投与の場合に比べて体重がより減少することを確認した。脾臓の場合、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を注入した場合とも、何も処理しないマウスに比べて肉眼で脾臓の大きさ増加が確認され、体重対比の脾臓の重量も増加し、シスプラチン併用投与群も、体重対比の脾臓の重量が著しく減少した。これをまとめると、シスプラチンとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７との併用投与により免疫細胞の脾臓への流入が誘導されたと判断される。
ＭＣ３８癌細胞株移植モデルにおけるシスプラチンとの併用効果を追加的に確認するために、癌の密度に比例した指標になるマウスの体重と免疫細胞の流入と活性化を反映する脾臓の重量を測定した。その結果、何も処理しないマウスの場合、癌細胞注入後の時間経過とともに体重が着実に増加したのに対し、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を注入したマウスの場合に体重が減少した（図３１Ａ）。シスプラチンとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７との併用処理は、抗癌剤単独投与の場合に比べて体重がより減少することを確認した。脾臓の場合、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を注入した場合とも、何も処理しないマウスに比べて肉眼で脾臓の大きさ増加が確認され、体重対比の脾臓の重量も増加し、シスプラチン併用投与群も、体重対比の脾臓の重量が著しく減少した。これをまとめると、シスプラチンとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７との併用投与により免疫細胞の脾臓への流入が誘導されたと判断される。
シスプラチンとの併用投与時の血清内ＭＩＦの濃度変化
ＭＣ３８癌細胞株移植モデルにおけるシスプラチンとの併用効果を追加的に確認するために、癌細胞注入後、４日ごとに眼窩採血により血清を分離して血清内ＭＩＦの濃度変化をトートメラーゼ（ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ）アッセイで測定した結果、何も処理しないマウスの場合、癌細胞注入後、着実に血清内ＭＩＦの濃度が増加するのに対し、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理した群の場合、統計的に有意なレベルにＭＩＦの濃度が低下することを確認した（図３２Ａ）。
ＭＣ３８癌細胞株移植モデルにおけるシスプラチンとの併用効果を追加的に確認するために、癌細胞注入後、４日ごとに眼窩採血により血清を分離して血清内ＭＩＦの濃度変化をトートメラーゼ（ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ）アッセイで測定した結果、何も処理しないマウスの場合、癌細胞注入後、着実に血清内ＭＩＦの濃度が増加するのに対し、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理した群の場合、統計的に有意なレベルにＭＩＦの濃度が低下することを確認した（図３２Ａ）。
シスプラチン、抗－ＰＤ－Ｌ１およびＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を一緒に投与した場合、何も処理しない群に比べて同じく血清内ＭＩＦの濃度が低下することを確認し、シスプラチンとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７とを併用処理した場合、シスプラチン単独投与の場合に比べて統計的に有意なレベルにＭＩＦの濃度がより減少した（図３２Ａ）。
また、血清内ＭＩＦの生物学的活性を確認するために、血清を０、１、５、１０、５０％の濃度で培地に希釈してトートメラーゼアッセイを進行させた結果、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理した場合、何も処理しない群に比べて基質を還元させる転換率が高いことを確認し、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７は、野生型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓに比べても基質の還元程度が高かった。
これとともに、シスプラチンとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７とを一緒に投与した場合、何も処理しない群はもちろん、シスプラチン単独投与群に比べても血清の基質が還元される転換率が高いことをトートメラーゼアッセイの結果から確認した。これにより、シスプラチンをＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７と一緒に投与する場合、癌発生マウスの血清内ＭＩＦの濃度と生物学的活性が各成分の単独投与時に比べて減少することが分かった。
シスプラチンとの併用投与時の癌発生マウスの血清内ＭＩＦに対する抗体価
ＭＣ３８癌細胞株を移植したマウスモデルにおいてＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７とシスプラチンとを併用投与した結果、血清内ＭＩＦの濃度と生物学的活性が減少したので、ＭＩＦに対する抗体の生成が増加したと判断し、体内の免疫活性増加の尺度になる血清内サイトカインの生成も増加したものと期待された。血清内ＭＩＦに対する抗体価を様々な単位で確認した結果、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理すると、未処理群に比べて総抗－ＭＩＦ ＩｇＧが統計的に有意なレベルに増加した（図３３）。血清内サイトカインの数値も、シスプラチン単独投与群、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７処理群およびこれらの併用処理群においてＩＦＮ－γとＴＮＦ－αのレベルが対照群に比べて著しく増加した（図３３）。
ＭＣ３８癌細胞株を移植したマウスモデルにおいてＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７とシスプラチンとを併用投与した結果、血清内ＭＩＦの濃度と生物学的活性が減少したので、ＭＩＦに対する抗体の生成が増加したと判断し、体内の免疫活性増加の尺度になる血清内サイトカインの生成も増加したものと期待された。血清内ＭＩＦに対する抗体価を様々な単位で確認した結果、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理すると、未処理群に比べて総抗－ＭＩＦ ＩｇＧが統計的に有意なレベルに増加した（図３３）。血清内サイトカインの数値も、シスプラチン単独投与群、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７処理群およびこれらの併用処理群においてＩＦＮ－γとＴＮＦ－αのレベルが対照群に比べて著しく増加した（図３３）。
シスプラチンとの併用投与時の癌発生マウスの癌組織内の免疫反応観察
ＭＣ３８癌細胞株を移植したマウスモデルにシスプラチンとのＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を併用処理する場合、ＩＦＮ－γとＴＮＦ－αを分泌する免疫細胞が増加するかを確認するために、癌細胞注入後、２３日目に癌組織を摘出した後、コラゲナーゼＩＶとＤＮａｓｅＩを処理した後、ｓｔｒａｉｎｅｒを通過させて単一細胞として分離した。以後、ＰＭＡとＩｏｎｏｍｙｃｉｎを処理して癌細胞内のサイトカインを累積させた後、蛍光接合抗体と反応させてフローサイトメーターで免疫細胞を観察した。その結果、癌組織内のＩＦＮ－γとＴＮＦ－αを生成するＴｈ１ヘルパーＴ細胞と細胞毒性Ｔ細胞が、何も処理しないマウスに比べて、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理したマウスとシスプラチンを処理したマウスおよび併用処理したマウスの癌組織内で流入が増加することを確認した（図３４Ａおよび３４Ｂ）。癌組織内のＩＦＮ－γを分泌するＴＣＲγδ Ｔ細胞の比率も、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理したマウスにおいて対照群に比べて統計的に有意なレベルに増加し、また、シスプラチンを投与したマウスとシスプラチンとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７とを併用処理したマウスの癌組織内でＴＣＲγδ Ｔ細胞の流入が増加した（図３４Ｃ）。これにより、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７が、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ野生型に比べてＴｈ１ヘルパーＴ細胞と細胞毒性Ｔ細胞を成熟させるＴＣＲγδ Ｔ細胞の生成と癌組織への流入を増加させて抗癌免疫反応を増進させることが分かった。
ＭＣ３８癌細胞株を移植したマウスモデルにシスプラチンとのＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を併用処理する場合、ＩＦＮ－γとＴＮＦ－αを分泌する免疫細胞が増加するかを確認するために、癌細胞注入後、２３日目に癌組織を摘出した後、コラゲナーゼＩＶとＤＮａｓｅＩを処理した後、ｓｔｒａｉｎｅｒを通過させて単一細胞として分離した。以後、ＰＭＡとＩｏｎｏｍｙｃｉｎを処理して癌細胞内のサイトカインを累積させた後、蛍光接合抗体と反応させてフローサイトメーターで免疫細胞を観察した。その結果、癌組織内のＩＦＮ－γとＴＮＦ－αを生成するＴｈ１ヘルパーＴ細胞と細胞毒性Ｔ細胞が、何も処理しないマウスに比べて、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理したマウスとシスプラチンを処理したマウスおよび併用処理したマウスの癌組織内で流入が増加することを確認した（図３４Ａおよび３４Ｂ）。癌組織内のＩＦＮ－γを分泌するＴＣＲγδ Ｔ細胞の比率も、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理したマウスにおいて対照群に比べて統計的に有意なレベルに増加し、また、シスプラチンを投与したマウスとシスプラチンとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７とを併用処理したマウスの癌組織内でＴＣＲγδ Ｔ細胞の流入が増加した（図３４Ｃ）。これにより、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７が、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ野生型に比べてＴｈ１ヘルパーＴ細胞と細胞毒性Ｔ細胞を成熟させるＴＣＲγδ Ｔ細胞の生成と癌組織への流入を増加させて抗癌免疫反応を増進させることが分かった。
実施例２
追加的な癌細胞株に対する抗癌効果確認
ＭＣ３８癌細胞株以外の追加的な多様な癌細胞株に対するＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７の抗癌効果を観察すべく、ＭＣ３８を用いた実験と同一の方式により、マウス膵臓癌細胞株のＰａｎＯ２とマウス肺癌細胞株ＬＬＣを皮下注射でマウスの大腿上部に注入した後、３日、７日、１４日目にＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を計３回腫瘍周囲（ｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌ）に注入した後、癌サイズを観察した。
追加的な癌細胞株に対する抗癌効果確認
ＭＣ３８癌細胞株以外の追加的な多様な癌細胞株に対するＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７の抗癌効果を観察すべく、ＭＣ３８を用いた実験と同一の方式により、マウス膵臓癌細胞株のＰａｎＯ２とマウス肺癌細胞株ＬＬＣを皮下注射でマウスの大腿上部に注入した後、３日、７日、１４日目にＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を計３回腫瘍周囲（ｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌ）に注入した後、癌サイズを観察した。
Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を注入したマウスにおける腫瘍の大きさは、何も処理をしないマウスに比べて著しく減少したことを、ＰａｎＯ２、ＬＬＣ癌細胞を注入した後、２１日、２４日目から観察することができ、マウスから腫瘍を分離した時、視覚的に確実な大きさの差を確認することができた。また、マウスから分離して測定した腫瘍の重量は、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を注入した場合、何も処理しないマウスに比べて低い数値で測定されることを確認することができた（図３５）。
ＭＣ３８を用いた実験と同一の方法により、ＰａｎＯ２とＬＬＣを用いた腫瘍－移植マウスモデルから分離した血清、脾臓細胞、腫瘍を用いて追加実験を進行させた。これとともに、ＭＩＦに対する免疫反応の増加によって腫瘍内に浸透された免疫細胞の活性が増加したかを確認すべく、腫瘍と脾臓組織内の活性化された免疫細胞をフローサイトメトリーで行った。
ＰａｎＯ２とＬＬＣを用いた腫瘍－移植マウスモデルから分離した血清を用いて、ヒトＭＩＦに対するＩｇＧの生成を確認してＭＩＦに対する体液性免疫反応を確認し、それによる血清のＭＩＦの濃度を確認した。また、脾臓細胞から赤血球を除去して単一細胞として分離した後、各癌細胞溶解物抗原とＭＩＦ抗原タンパク質を一緒に培養した時、炎症性サイトカインが誘導されることを確認した。
ＰａｎＯ２、ＬＬＣ－移植マウスモデルから分離した血清において、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理したマウスの場合、何も処理しないマウスに比べてヒトＭＩＦに対するＩｇＧレベルが増加し、血清のマウスＭＩＦの数値が減少した。これにより、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７をマウスに注入した場合、マウス体内でＭＩＦに対する体液性免疫反応が増加して血清のＭＩＦの数値が減少したことが分かった（図３６）。
ＰａｎＯ２、ＬＬＣ－移植マウスモデルから分離した脾臓細胞に腫瘍細胞の抗原とヒト抗原タンパクをそれぞれ一緒に培養した結果、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理したマウスの脾臓細胞の場合、何も処理しないマウスに比べて腫瘍細胞とＭＩＦ抗原に対する細胞性免疫反応が増加した（図３６）。
ＰａｎＯ２－移植マウスモデルにおいてＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７の処理によってＭＩＦに対する体液性免疫反応と細胞性免疫反応が増加することを確認したので、ＭＩＦに対する免疫反応の増加によって腫瘍内に浸透された免疫細胞の活性が増加したかを確認すべく、腫瘍と脾臓組織内の活性化された免疫細胞をフローサイトメトリーで測定した。
腫瘍組織と脾臓組織内に浸透したＩＦＮγ－分泌ＴＣＲγδ Ｔ細胞の比率は、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７の処理によって増加した。ＩＦＮγ－分泌ＴＣＲγδ Ｔ細胞はＴ細胞の成熟と活性化を誘導するｓｕｂｓｅｔで、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７の処理によって増加したＩＦＮγ－分泌ＴＣＲγδ Ｔ細胞は他のＴ細胞の活性化を誘導するものと期待された（図３７Ａ）。
ＰａｎＯ２－移植マウスモデルにおいてＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７処理したマウスの腫瘍と脾臓組織において、ＩＦＮγ－分泌ＣＤ４ヘルパーＴ細胞とＴＮＦα－分泌ＣＤ４ヘルパーＴ細胞が、何も処理しないマウスに比べて増加した（図３６Ｂおよび３６Ｃ）。また、脾臓組織内のＩＦＮγとＴＮＦαを分泌するＣＤ４ヘルパーＴ細胞と細胞毒性ＣＤ８ Ｔ細胞が、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７処理したマウスで増加した（図３６Ｄ）。
このような結果を通して、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７の注入によってＰａｎＯ２－移植マウスにおいてＴ細胞の成熟と活性化を誘導するＩＦＮγ－分泌ＴＣＲγδ Ｔ細胞が増加し、これにより、腫瘍細胞を直接的に殺すことができるサイトカインであるＩＦＮγとＴＮＦαを分泌するＣＤ４ヘルパーＴ細胞が腫瘍組織と脾臓組織内に増加したことを確認した。
ＬＬＣ－移植マウスモデルにおいてＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２－ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を注入した場合、ヒトＭＩＦに対する体液性免疫反応と細胞性免疫反応がすべて増加することを確認した。ＭＩＦに対する免疫反応の増加によって腫瘍内に浸透した免疫細胞の活性が増加したかを確認すべく、腫瘍と脾臓組織内の活性化された免疫細胞をフローサイトメトリーで測定した。
腫瘍組織内に浸透したＩＦＮγ－分泌ＣＤ４ヘルパーＴ細胞と細胞毒性ＣＤ８ Ｔ細胞、そしてＴＮＦα－分泌ＣＤ４ヘルパーＴ細胞が、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７の処理によって増加し（図３８Ａ）、また、脾臓組織内のＩＦＮγとＴＮＦαを分泌するＣＤ４ヘルパーＴ細胞と細胞毒性ＣＤ８ Ｔ細胞も、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７処理したマウスで増加した（図３８Ｂおよび３８Ｃ）。
このような結果を通して、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７の注入によってＬＬＣ－移植マウスにおいて腫瘍細胞を直接的に死滅させることができるサイトカインであるＩＦＮγとＴＮＦαを分泌するＣＤ４ヘルパーＴ細胞と細胞毒性ＣＤ８ Ｔ細胞が腫瘍組織と脾臓組織内に増加したことを確認し、これにより、ＭＣ３８－移植マウスモデルから確認していたＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７の注入によるＭＩＦに対する免疫反応の増加と腫瘍と脾臓組織内の活性化された免疫細胞の増加は、多様な癌細胞株ＰａｎＯ２とＬＬＣに対しても同一の抗癌効果を示すことを確認することができた。
ＭＣ３８移植マウスモデルから分離した血清のＭＩＦ活性阻害能力確認
ＭＣ３８癌細胞株移植マウスモデルから分離した血清を用いてＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７のＭＩＦ活性阻害能力を確認しようとした。マウスから分離した血清をＭＣ３８細胞株培養のためのＤＭＥＭ培地に５０％入れた後、４８時間、７２時間目に表面のＭＩＦ受容体であるＣＤ７４の発現をフローサイトメトリー方法で確認した。また、同様の実験において培養２４時間目に細胞内ＭＩＦダウンストリームシグナルタンパク質の発現をウェスタンブロットにより測定し、７ＡＡＤ／アネキシンＶアポトーシスアッセイによりＭＩＦ活性阻害による細胞生長抑制能を調べた。
ＭＣ３８癌細胞株移植マウスモデルから分離した血清を用いてＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７のＭＩＦ活性阻害能力を確認しようとした。マウスから分離した血清をＭＣ３８細胞株培養のためのＤＭＥＭ培地に５０％入れた後、４８時間、７２時間目に表面のＭＩＦ受容体であるＣＤ７４の発現をフローサイトメトリー方法で確認した。また、同様の実験において培養２４時間目に細胞内ＭＩＦダウンストリームシグナルタンパク質の発現をウェスタンブロットにより測定し、７ＡＡＤ／アネキシンＶアポトーシスアッセイによりＭＩＦ活性阻害による細胞生長抑制能を調べた。
血清内ＭＩＦの生物学的活性程度をトートメラーゼアッセイにより測定した時、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７群の血清においてＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ野生型に比べてＭＩＦの活性が減少したことを確認した（図３９Ａ）。
血清を含む培地で培養したＭＣ３８細胞は、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７から分離した血清によって培養４８時間、７２時間目に細胞表面のＭＩＦ受容体であるＣＤ７４の発現が、ＢＣＧとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ野生型を処理した場合に比べて著しく減少した。これは、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７の注入によってマウス血清内ＭＩＦの数値減少とＭＩＦに対する体液性免疫反応の増加によってＭＣ３８細胞株培養液のＭＩＦ量が減少し、これにより、ＭＣ３８の受容体の発現増加が阻害されたことに起因すると見られる（図５１Ａ）。
また、同一の方式の実験において細胞内ＭＩＦ関連癌細胞の増殖および転移に関連するタンパク質の発現を確認すると、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７群の血清を処理した場合、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ野生型に比べて減少したことを観察することができた。これはさらに、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７群の血清によってＭＣ３８細胞培養液のＭＩＦの量が減少することにより、癌細胞の生長に対するタンパクの発現が阻害されたものと考えられた（図３９Ｂ）。
また、７ＡＡＤ／アネキシンＶアポトーシスアッセイの結果、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７群の血清を処理した場合、ＢＣＧとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ野生型の場合に比べてアポトーシスされたＭＣ３８細胞が増加することを確認した。同じく、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７血清のＭＩＦ活性阻害能力によって減少した細胞培養液のＭＩＦがＭＣ３８細胞のアポトーシスを増加させたものと考えられた（図３９Ｃ）。
このような結果を通して、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７の注入によって増加したＭＩＦに対する体液性免疫反応は、直接的にＭＩＦの活性を減少させることにより、癌細胞の生長と生存を低下させることが分かった。
Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７の注入によってマウス血清で増加したＭＩＦに対する体液性免疫反応によってＭＣ３８細胞株の移動と浸潤能力を確認することにより、癌細胞の生長だけでなく、癌細胞の転移を阻害する能力を確認しようとした。移動アッセイと浸潤アッセイのために、各ＭＣ３８細胞培養液にＭＣ３８－移植マウスの血清をそれぞれ５０％および２０％添加して２４時間細胞を培養した結果、ＢＣＧとＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ野生型に比べてＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理した群の血清によって癌細胞の移動と浸潤能力が著しく阻害されることを確認した（図５２）。これにより、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７は、細胞培養液のＭＩＦ活性を減少させることにより、ＭＣ３８細胞の生長を抑制し、移動能力を阻害して、窮極的に癌の転移を抑制できることを確認した。
ＭＣ３８移植マウスモデルから分離した腫瘍組織内のタンパク質とＲＮＡ発現確認
ＭＣ３８癌細胞株移植マウスモデルにおいてＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７による腫瘍組織内のタンパク質およびＲＮＡ発現の変化を測定すべく、ＭＣ３８腫瘍組織を均質化した後、細胞内タンパクを抽出し、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を用いて腫瘍組織内のＲＮＡを抽出した。タンパク質は、定量後、ウェスタンブロットで癌細胞の生長と転位に関連するタンパク質の発現を確認し、ＲＮＡは、ｃＤＮＡ合成後、ＲＴ－ｑＰＣＲにより細胞生長とアポトーシス、血管新生および転移に関連する転写因子の発現を確認した。
ＭＣ３８癌細胞株移植マウスモデルにおいてＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７による腫瘍組織内のタンパク質およびＲＮＡ発現の変化を測定すべく、ＭＣ３８腫瘍組織を均質化した後、細胞内タンパクを抽出し、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を用いて腫瘍組織内のＲＮＡを抽出した。タンパク質は、定量後、ウェスタンブロットで癌細胞の生長と転位に関連するタンパク質の発現を確認し、ＲＮＡは、ｃＤＮＡ合成後、ＲＴ－ｑＰＣＲにより細胞生長とアポトーシス、血管新生および転移に関連する転写因子の発現を確認した。
腫瘍組織内のタンパク質の発現量をウェスタンブロットで確認した結果、ＭＩＦに直接的に活性化されるＰＩ３Ｋ（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３－ｋｉｎａｓｅ）／Ａｋｔ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｂ）経路がＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理した群で最も減少することを確認し、さらに、癌細胞の転移に関連するＭＭＰ－２とＭＭＰ－９タンパク質の発現がＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理した群の腫瘍組織で最も減少したことを確認した（図４１Ａ）。
また、腫瘍組織のＲＮＡ発現をＲＴ－ｑＰＣＲを用いて確認した結果、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ ｐａｔｈｗａｙに関連する細胞生長、代謝に関連するＲＮＡ発現がＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理した群の腫瘍組織で最も著しく減少したことを確認した。それだけでなく、癌細胞のアポトーシスと血管新生および転移に関連する転写因子がＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を処理した群の腫瘍組織で最も著しく減少した（図４１Ｂ）。
このような結果からみて、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７の処理によってＭＣ３８－移植マウスの腫瘍でＭＩＦに関連するＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル経路のタンパク質とＲＮＡ発現、そして癌細胞の血管新生と転移に関連するＲＮＡの発現が減少して腫瘍組織の成長が阻害されたものと考えられた。
抗－ＰＤ－Ｌ１と併用投与時の抗癌効能
ＭＣ３８癌細胞株移植マウスモデルにおいて商用化された抗癌剤である抗－ＰＤ－Ｌ１（抗－マウスＰＤ－Ｌ１ Ｂ７－Ｈ１、ＩｎｖｉｖｏＭａｂ、ｃａｔａｌｏｇ＃ＢＥ０１０１）との併用効果を観察した。以前と同一の方式でマイコバクテリアを癌細胞注入後３日、７日、１４日目に注入し、抗－ＰＤ－Ｌ１の場合、癌細胞注入後７日、１４日目に腹腔注射で２回注入した。以後、腫瘍組織の大きさと摘出時の重量、血清内ＭＩＦの数値変化を測定した。
ＭＣ３８癌細胞株移植マウスモデルにおいて商用化された抗癌剤である抗－ＰＤ－Ｌ１（抗－マウスＰＤ－Ｌ１ Ｂ７－Ｈ１、ＩｎｖｉｖｏＭａｂ、ｃａｔａｌｏｇ＃ＢＥ０１０１）との併用効果を観察した。以前と同一の方式でマイコバクテリアを癌細胞注入後３日、７日、１４日目に注入し、抗－ＰＤ－Ｌ１の場合、癌細胞注入後７日、１４日目に腹腔注射で２回注入した。以後、腫瘍組織の大きさと摘出時の重量、血清内ＭＩＦの数値変化を測定した。
その結果、抗－ＰＤ－Ｌ１と併用投与時、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を単独投与した場合に比べて癌成長が著しく阻害され、癌摘出時の腫瘍の重量も、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７と抗－ＰＤ－Ｌ１を単独投与した場合に比べて併用投与時に大きく減少したことを確認した（図４２Ａ）。
また、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を単独投与時、血清内ＭＩＦに対する体液性免疫反応が増加し、このような免疫反応は、抗－ＰＤ－Ｌ１と併用投与時にさらに効果的に増加することを確認しただけなく、血清内炎症性サイトカインの濃度は、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を単独投与した場合に比べて、抗－ＰＤ－Ｌ１と併用投与時に効果的に増加し、血清内ＭＩＦの濃度は併用投与時に変化が最も少ないことを確認した（図４２Ｂ）。したがって、血清内ＭＩＦの濃度は、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７と抗－ＰＤ－Ｌ１とを併用投与時に最も低くなり、血清ＭＩＦの生物学的な活性、すなわちトートメラーゼ活性も併用投与時に最も底いことが分かった（図４２Ｃ）。
このような結果からみて、以前に観察されていたＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７の単独投与による癌成長阻害効能と血清内ＭＩＦに対する免疫反応は、商用化された抗癌剤の抗－ＰＤ－Ｌ１と併用投与時にその効果が極大化されることを確認した。
次に、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７と抗－ＰＤ－Ｌ１との併用投与による腫瘍組織内の細胞性免疫反応の活性化程度を確認すべく、腫瘍組織を分離してフローサイトメトリーによりサイトカインを分泌するＴ細胞を測定した。上記の実験と同様に、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を単独投与時、腫瘍組織内に浸透した免疫細胞のうち抗癌効能があるサイトカインＩＦＮγとＴＮＦαを分泌するＣＤ４ヘルパーＴ細胞と細胞毒性ＣＤ８ Ｔ細胞の比率が増加し、このような効果は、抗－ＰＤ－Ｌ１とＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７とを併用投与時にさらに増加した（図４３Ａ）。
次に、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７と抗－ＰＤ－Ｌ１との併用投与による腫瘍組織内の細胞性免疫反応の活性化程度を確認すべく、腫瘍組織を分離してフローサイトメトリーによりサイトカインを分泌するＴ細胞を測定した。上記の実験と同様に、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を単独投与時、腫瘍組織内に浸透した免疫細胞のうち抗癌効能があるサイトカインＩＦＮγとＴＮＦαを分泌するＣＤ４ヘルパーＴ細胞と細胞毒性ＣＤ８ Ｔ細胞の比率が増加し、このような効果は、抗－ＰＤ－Ｌ１とＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７とを併用投与時にさらに増加した（図４３Ａ）。
上記の実験結果をまとめると、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を単独投与時に観察されていたＭＩＦに対する免疫反応の増加と腫瘍内のサイトカインを分泌する免疫細胞の増加は、現在商用化された抗癌剤の抗－ＰＤ－Ｌ１と併用投与時にさらに効果的に増加することが分かった。
組換え菌株を感染した免疫細胞によるＭＣ３８に対する細胞毒性確認
Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を感染させた樹状細胞と脾臓からＢＤ Ａｒｉａを用いて分離したｎａｉｖｅ ＣＤ８ Ｔ細胞を各４日間共培養した（樹状細胞：Ｔ細胞＝１：１０）。以後、ＭＣ３８癌細胞をＴ細胞と１：５の比率で２日間共培養して、７ＡＡＤ／アネキシンＶアポトーシスアッセイを用いて組換え菌株に感染した免疫細胞の癌細胞に対する細胞毒性能力を確認し、同一の時点で免疫細胞のサイトカインの発現程度を比較した。
Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を感染させた樹状細胞と脾臓からＢＤ Ａｒｉａを用いて分離したｎａｉｖｅ ＣＤ８ Ｔ細胞を各４日間共培養した（樹状細胞：Ｔ細胞＝１：１０）。以後、ＭＣ３８癌細胞をＴ細胞と１：５の比率で２日間共培養して、７ＡＡＤ／アネキシンＶアポトーシスアッセイを用いて組換え菌株に感染した免疫細胞の癌細胞に対する細胞毒性能力を確認し、同一の時点で免疫細胞のサイトカインの発現程度を比較した。
Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を感染した樹状細胞とＣＤ８ Ｔ細胞を共培養した場合、他の組換え菌株に比べてＭＣ３８癌細胞の死んだ細胞の比率が最も増加したことからみて、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７は、ｈＭＩＦとｈＩＬ７のそれぞれの単一タンパク質を導入した組換え菌株に比べて癌細胞に対する細胞毒性がより効果的に誘導されることを確認した（図４４Ａ）。
また、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７によって誘導された癌細胞に対する細胞毒性能は、免疫細胞のサイトカインの発現により確認された。すなわち、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７感染した免疫細胞の場合、他の組換え菌株を感染した場合に比べて癌細胞と共培養時に抗癌効能を有するＩＦＮγとＴＮＦαを分泌する免疫細胞の比率が最も高くなり、これにより、癌細胞が最も多く死滅されたことが分かった（図４４Ｂ）。
感染した免疫細胞と癌細胞との共培養液でＭＩＦの濃度をＥＬＩＳＡにより確認した結果、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７を感染させた場合、他の組換え菌株に比べて著しくＭＩＦの濃度が減少することを確認した（図４４Ｃ）。これは、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｐＭｙｏｎｇ２＿ｈＭＩＦ：：ＩＬ７の感染によって死滅された癌細胞の比率が増加して癌細胞に由来するＭＩＦの量が減少したためと考えられる（図４４Ｃ）。
多様な癌細胞株に対する抗癌効果観察
前述した実施例で確保した組換え菌株の抗癌効果をインビトロで確認すべく、ヒトおよびマウス由来の多様な癌細胞（ヒト由来の肝癌細胞のＨｕｈ７とＨｅｐＧ２、マウス膵臓癌細胞のＰａｎＯ２、マウス肺上皮細胞のＴＣ－１、マウス肺癌細胞のＬＬＣ、マウス黒色腫細胞のＢ１６Ｆ１０）に本発明の組換え菌株を感染させた後、癌細胞の代謝活性をＭＴＳ細胞増殖アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）で測定することにより、組換え菌株の癌細胞に対する毒性を評価した。
前述した実施例で確保した組換え菌株の抗癌効果をインビトロで確認すべく、ヒトおよびマウス由来の多様な癌細胞（ヒト由来の肝癌細胞のＨｕｈ７とＨｅｐＧ２、マウス膵臓癌細胞のＰａｎＯ２、マウス肺上皮細胞のＴＣ－１、マウス肺癌細胞のＬＬＣ、マウス黒色腫細胞のＢ１６Ｆ１０）に本発明の組換え菌株を感染させた後、癌細胞の代謝活性をＭＴＳ細胞増殖アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）で測定することにより、組換え菌株の癌細胞に対する毒性を評価した。
その結果、Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２、ＴＣ－１、ＰａｎＯ２、ＬＬＣ、Ｂ１６Ｆ１０細胞株ともにおいて、ｐＭｙｏｎｇ２ベクターが形質転換された組換え菌株が、ｐＭＶ３０６ベクターが形質転換された組換え菌株より癌細胞に対する細胞毒性能に優れていることを確認した（図４５）。このような特性は、先に観察された組換え菌株の性能から確認されたように、ｐＭｙｏｎｇ２－ＴＯＰＯベクターがｐＭＶ３０６ベクターよりヒトＭＩＦとヒトＩＬ－７の発現量がはるかに高いためと考えられ、各タンパク質の単独発現の場合より、ヒトＭＩＦとヒトＩＬ－７とが融合した形態で発現する場合に著しい相乗効果が現れることを、多様な癌細胞を用いてもう一度確認した。
以上、本発明の特定部分を詳細に述べたが、当業界における通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好ましい実施形態に過ぎず、よって、本発明の範囲が制限されるものではないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は添付した請求項とその等価物によってのみ定義される。
Claims (12)
- ＭＩＦ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）またはその機能的一部をエンコードする核酸分子；ＩＬ－７（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－７）またはその機能的一部をエンコードする核酸分子；またはこれらの組合せを含むマイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）－由来の複製可能（ｒｅｐｌｉｃａｂｌｅ）プラスミド。
- 前記プラスミドは、配列リストの第２配列のヌクレオチド配列を含む複製開始点（Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）およびｈｓｐ６５またはｈｓｐ６０遺伝子のプロモーターを含むことを特徴とする請求項１に記載のプラスミド。
- 前記プラスミドは、図１Ａに開示されたｐＭｙｏｎｇ２プラスミドであることを特徴とする請求項２に記載のプラスミド。
- 前記プラスミドは、配列リストの第１配列のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項３に記載のプラスミド。
- 請求項１～４のいずれか１項に記載のプラスミドを含む組換えマイコバクテリウム菌株。
- 前記マイコバクテリウムは、マイコバクテリウムスメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウムボビスＢＣＧ（Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ）、マイコバクテリウムアビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウムフレイ（Ｍ．ｐｈｌｅｉ）、マイコバクテリウムフォーツイタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウムルフ（Ｍ．ｌｕｆｕ）、マイコバクテリウムパラチュバキュロシス（Ｍ．ｐａｒaｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウムハバナ（Ｍ．ｈａｂａｎａ）、マイコバクテリウムスクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）またはマイコバクテリウムイントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）から構成された群より選択されることを特徴とする請求項５に記載の菌株。
- 前記マイコバクテリウムは、マイコバクテリウムスメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）であることを特徴とする請求項６に記載の菌株。
- 請求項５に記載の菌株を有効成分として含む癌の予防または治療用組成物。
- 前記癌は、転移癌であることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
- 前記組成物は、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）またはその薬剤学的に許容される塩を追加的に含むことを特徴とする請求項８に記載の組成物。
- 前記組成物は、免疫チェックポイント抑制剤（Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を追加的に含むことを特徴とする請求項８に記載の組成物。
- 前記免疫チェックポイント抑制剤は、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体であることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
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