KR20220132444A - 신규한 재조합 마이코박테리움 스메그마티스 균주 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 재조합 마이코박테리움 스메그마티스 균주 및 이의 용도 Download PDF

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서혜준
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Abstract

본 발명은 MIF와 IL-7을 공발현하는 재조합 마이코박테리움 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 마이코박테리아-유래 복제가능 플라스미드, 구체적으로는 본 발명자들에 의해 개발된 pMyong2 셔틀 벡터를 통해 MIF와 IL-7를 안정적으로 발현함으로써, 극대화된 항암 면역반응을 유도한다. 이에, 본 발명은 재조합 균주의 단일 투여를 통해 다각적인 세포성 면역과 체액성 면역을 유도하는 효율적인 항암 생균백신 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

신규한 재조합 마이코박테리움 스메그마티스 균주 및 이의 용도{Novel Recombinant Mycobacterium smegmatis and Use Thereof}
본 발명은 MIF(macrophage migration inhibitory factor)와 IL-7 (interleukin-7)을 공발현함으로써 암세포에 대한 면역반응이 극대화된 재조합 마이코박테리움 스메그마티스 균주에 관한 것이다.
WHO 보고(Global Cancer Report 2018)에 따르면 전 세계적으로 2018년 한 해동안 약 1천 8백만 명의 신규 암환자가 발생하였으며, 전체 암환자는 약 4천 4백만 명에 이르고, 이중 9백 60여만 명의 환자가 사망함으로써 암은 질병으로 인한 사망률의 2위를 차지하고 있다. 암은 크게 혈액암, 상피세포에서 발생하는 암종 (carcinoma), 그리고 결합조직인 뼈, 연골, 림프선, 근육 및 혈관 등에서 발생된 염증성 종양인 육종(sarcoma)으로 구분되며, 이들은 모두 성장속도가 빠르고 무한히 분열하는 과증식성(hyperproliferative) 질환이다. 인체의 정상적인 면역기능은 신체 내에서 생성되는 종양세포를 1,000만개까지 사멸시킬 능력을 가지고 있음에도 불구하고 암세포의 빠른 증식으로 인해 정상적인 면역반응만으로는 암을 완전히 제거하기에는 한계가 있다.
면역치료 요법은 환자 스스로가 항체와 감작 림프구를 능동적으로 생산하는 능동 면역을 증진시키는 치료법과, 다른 개체에서 이미 형성된 면역 반응의 산물을 수용하는 수동 면역 치료법으로 분류될 수 있다. 또한 사용되는 제제가 치료 타겟에 특이성을 가지는지 여부에 따라 특이적 요법과 비특이적 요법으로 구분된다. 비특이적인 능동면역 치료법 중 사이토카인 요법은 재조합 사이토카인의 생산과 분비를 유도함으로써 세포독성 T-림프구를 자극하고 주조직 적합 복합체 항원을 활성화하는 것을 목적으로 한다.
종양면역요법은 1891년 Coley가 암환자의 세균감염이 일시적인 암 치료의 차도를 유도함을 발견하면서부터 시작되었으며, 1960년대에는 BCG가 일부 암을 제거하는 것을 확인하였다. 비결핵항산균은 복잡한 세포벽 구성성분으로 인하여 면역유도능이 뛰어나 대식 세포나 T세포를 효율적으로 활성화시켜 각종 사이토카인의 분비를 유도하고, 이를 통해 자연살해세포를 활성화함으로써 암세포를 사멸시킬 수 있다. 1990년대에 BCG는 방광암을 적응증으로 하여 승인을 받은 후 현재까지 사용하고 있으며 초기 방광암을 제외하고 다른 종양에는 제한적인 효과만을 보이고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
특허문헌 1. 대한민국 공개공보 제10-2019-0130471호
본 발명자들은 단일 투여에 의해 다각적인 면역반응을 유도하는 효율적인 면역 항암제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 마이코박테리아 유래 복제 개시점을 가지는 플라스미드에 선천성 세포매개 면역반응을 조절하는 MIF(macrophage migration inhibitory factor)와, B 세포 및 T 세포 분화를 유도하는 IL-7(interleukin-7)의 두 가지 사이토카인 유전자를 삽입하여 이를 재조합 마이코박테리움 균주에서 발현시킬 경우, 대식세포를 자극하고 수지상세포의 성숙을 유도함과 동시에 다양한 염증성 사이토카인 분비를 현저히 증진시켜 극대화된 암세포 사멸효과를 보임을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 MIF와 IL-7을 공발현하는 재조합 마이코박테리움 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 MIF(macrophage migration inhibitory factor) 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산분자; IL-7(interleukin-7) 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산분자; 또는 이들의 조합을 포함하는 마이코박테리아(mycobacteria)-유래된 복제가능(replicable) 플라스미드를 제공한다.
본 발명자들은 단일 투여에 의해 다각적인 세포성 및 체액성 면역반응을 유도하는 효율적인 면역 항암제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 마이코박테리아 유래 복제 개시점을 가지는 플라스미드에 선천성 세포매개 면역반응을 조절하는 MIF와, B 세포 및 T 세포 분화를 유도하는 IL-7의 두 가지 사이토카인 유전자를 삽입하여 이를 재조합 마이코박테리움 균주에서 발현시킬 경우, 대식세포와 수지상세포를 자극하고 다양한 염증성 사이토카인 분비를 현저히 증진함으로써 극대화된 암세포 사멸효과를 보임을 발견하였다.
본 명세서에서 용어“기능적 일부(functional portion)”는 MIF 및 IL-7 단백질의 사이토카인으로서의 생물학적 활성을 유지하는 여하한 길이의 일부 절편을 모두 포괄하는 의미이다. 따라서, MIF 및 IL-7 단백질의 기능적 일부라 함은 CD74와 결합하여 선천면역을 조절하거나 B 세포 및 T 세포 분화를 유도하는 염증성 사이토카인으로서 기능할 수 있는 각 단백질의 일부 절편을 의미한다.
본 명세서에서 용어 “단백질”은 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 고분자를 의미한다. 본 발명의 MIF 및 IL-7 단백질은 그 아미노산 서열이 공공 데이터베이스(예를 들어 National Center for Biotechnology Information)에 공개된 야생형 인간 단백질일 수 있고, 상기 단백질의 아미노산 서열에 대해 실질적 동일성(substantial identity)을 나타내는 아미노산 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 실질적인 동일성은, 상기 공지된 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 구체적으로는 최소 90%의 상동성, 가장 구체적으로는 최소 95%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다. 또한, 상기 단백질과 동일하거나 이에 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 아미노산 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 교환이다.
본 명세서에서, 용어“핵산 분자”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 본 발명의 MIF 및 IL-7 단백질을 인코딩하는 각 핵산 분자는 마이코박테리아-유래의 복제가능(replicable) 플라스미드를 유전자 전달체(gene delivery system)로 하여 각각의 플라스미드에 포함될 수도 있고, 또는 두 유전자를 하나의 플라스미드에 동시에 삽입하여 발현시킬 수도 있다.
본 명세서에서 용어“발현시키다”는 대상체가 외래(exogenous) 유전자를 발현하게 하거나 또는 내인성(endogenous) 유전자의 자연적 발현량을 증가시키기 위해 유전자 전달체를 이용하여 인위적으로 이를 도입함으로써 유전자가 대상체 세포 내에서 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 따라서, 용어“발현”은“형질전환(transformation)”, "형질감염(transfection)" 또는 "형질도입(transduction)"과 동일한 의미이다.
본 명세서에서 용어 “유전자 전달체”는 원하는 타겟 유전자를 대상 세포에 도입하여 발현시키기 위한 매개체를 의미한다. 이상적인 유전자 전달체는 인체에 무해하고 대량생산이 용이하며 효율적으로 유전자를 전달할 수 있어야 한다.
본 명세서에서, 용어“유전자 전달”은 유전자가 세포 내로 운반되는 것을 의미하며, 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 조직 수준에서, 상기 용어 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달체는 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명이 유전자 전달체로 사용되는 마이코박테리아-유래 플라스미드는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 복제 개시점(Origin of replication) 및 hsp65 또는 hsp60 유전자의 프로모터를 추가적으로 포함한다.
본 명세서에서 용어“복제 개시점(Origin of replication, ORI)”은 지놈 내에서 복제가 시작되는 특정 보존적 서열로서, 플라스미드의 복제를 위해 필요한 뉴클레오타이드들의 영역을 의미한다. 본 발명에서는 마이코박테리움 속 신종 박테리아인 M. yongonense(DSM 45126T)에서 발견된 선형 플라스미드(pMyong2, GenBank 접근번호 JQ657806)의 복제 개시점을 사용한다(Lee H et al., ,PLoS One. 2015;10(3):e0122897).
본 명세서에서 용어 “프로모터”는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 본 발명의 플라스미드에서 이용되는 프로모터는 M. bovis BCG의 지놈 DNA로부터 증폭된 열충격단백질 65(hsp65) 유전자의 프로모터이다. 본 발명의 셔틀 벡터에서 MIF 및 IL-7 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 상기 hsp65 유전자의 프로모터에 작동적으로 연결된다. 용어 “작동적으로 결합된(operatively linked)”은 프로모터 등의 핵산 발현 조절 서열과 발현 대상 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
본 발명에서 이용되는 hsp65 또는 hsp60 유전자의 프로모터는 예를 들어 마이코박테리움(Mycobacterium) 유래 프로모터일 수 있으며, 보다 구체적으로는 결핵균(M. tuberculosis) 유래 프로모터일 수 있다.
보다 구체적으로는, 본 발명에서 이용되는 플라스미드는 도 1a에 개시된 pMyong2 플라스미드이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 플라스미드는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 플라스미드를 포함하는 재조합 마이코박테리움 균주를 제공한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 마이코박테리움은 마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis), 마이코박테리움 보비스 BCG(M. bovis BCG), 마이코박테리움 아비움(M. avium), 마이코박테리움 플레이(M. phlei), 마이코박테리움 포튜이튬(M. fortuitum), 마이코박테리움 루푸(M. lufu), 마이코박테리움 파튜버큘로시스(M. partuberculosis), 마이코박테리움 하바나(M. habana), 마이코박테리움 스크로퓰라세움(M. scrofulaceum) 또는 마이코박테리움 인트라셀룰라레(M. intracellulare)로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 구체적으로는, 상기 마이코박테리움은 마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis)이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 미코박테리움 균주를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어“예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물을 대상체에 투여하면 다각적인 면역반응을 통한 극대화된 암세포 사멸효과에 의해 암에 진행 및 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 암 치료의 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 암에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.
아울러, 본 발명의 조성물 중 MIF를 인코딩하는 핵산 분자는 항원으로 작용하여 항-MIF IgG의 항체가를 증가시키는 체액성 면역반응을 유도하므로, 본 명세서의 용어“암의 예방 또는 치료용 조성물”은“항암 백신 조성물”과 같은 의미를 가진다.
본 명세서에서 용어“투여”또는“투여하다”는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.
본 발명에서 용어“치료적 유효량”은 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 조성물 내의 약리성분이 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 정도로 함유된 조성물의 함량을 의미하며, 이에“예방적 유효량”을 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 용어“대상체”는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료될 수 있는 암은 유방암, 간암, 폐암, 대장암, 방광암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료될 수 있는 암은 전이암일 수 있다.
본 명세서에서 용어“전이암(Metastatic cancer)”은 암세포가 원발성 암(primary tumor) 조직에서 이탈하여 주위의 혈관이나 림프관으로 침투해 이를 통로로 하여 체내의 다른 부위로 원거리 이동하면서 새로이 형성된 종양을 의미한다. 암 환자의 사망원인의 90% 이상은 원발암성 암으로부터의 전이에 기인하므로, 암 환자의 사망률을 개선시키기 위해 암 전이를 억제하는 것은 원발암의 치료에 못지않게 매우 중요한 문제이다. 후술하는 실시예에서 보는 바와 같이 본 발명의 조성물은 암세포의 이동과 침윤 능력이 현저히 저하시키고 암세포 전이와 관련된 인자인 MMP-2 및 MMP-9의 발현을 크게 감소시킴으로서 암의 전이 과정을 효율적으로 차단할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 시스플라틴(cisplatin) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 추가적으로 포함한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 재조합 마이코박테리움 균주는 저분자 항암제인 시스플라틴과 병용 투여될 경우 현저한 상승적 효과를 발휘하여 보다 효율적인 함세포 사멸 능력을 보인다. 병용투여는 하나의 제형에 본 발명의 재조합 마이코박테리움 균주와 시스플라틴이 모두 포함된 채로, 또는 각각의 조성물에 별도로 포함된 채로 동시에 투여되거나 또는 임의의 순서로 적절한 시간 차를 두고 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 면역관문 억제제(Immune checkpoint inhibitor)를 추가적으로 포함한다.
본 명세서에서 용어“면역관문(immune checkpoint)”은 자기-관용을 유지하고 손상을 야기하는 과도한 면역 반응으로부터 조직을 보호하는 세포내 신호전달 체계를 의미한다. 면역관문 단백질은 면역관문을 조절하는 세포막 단백질로서 면역세포의 분화, 증식, 활성을 억제할 수 있으며, 구체적으로 이들은 활성화된 T 세포에서 발현되어 T 세포의 증식, 사이토카인 분비 및 세포독성을 감소시키고, T 세포의 과도한 활성을 억제한다. 일부 면역관문은 종양세포가 환자의 면역반응을 회피하는 주요 메커니즘 중 하나로 작용한다. 이에, 용어 "면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)"는 면역관문 단백질의 발현 또는 활성을 차단함으로써 T 세포 활성을 강화하여 항 종양 면역반응을 촉진하는 항암 성분 또는 항암 보조제 성분을 의미한다.
본 발명에서 이용되는 면역관문 억제제는 예를 들어 세포독성 T-림프구 항원 4(CTLA-4), 세포 예정사 1 단백질 (PD-1), 세포 예정사 1 리간드 1 (PD-L1), 세포 예정사 1 리간드 2 (PD-L2), 림프구 활성화 유전자 3 (LAG3), B7-1, B7-H3, Ig 및 ITIM 도메인을 가진 T 세포 면역수용체 (TIGIT) 및 T 세포 막 단백질 3(TIM3)에 대한 항체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로는, 상기 면역관문 억제제는 항-PD-L1 항체이다. 본 발명의 예시적인 구현예에 따르면, 상기 항-PD-L1 항체로서 예를 들어 항-마우스 PD-L1 B7-H1 (InvivoMab, catalog. BE0101)을 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 이용되는 재조합 마이코박테리움, 이를 포함하는 약제학적 조성물 및 이에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암종에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 MIF와 IL-7을 공발현하는 재조합 마이코박테리움 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 마이코박테리아-유래 복제가능 플라스미드, 구체적으로는 본 발명자들에 의해 개발된 pMyong2 셔틀 벡터를 통해 MIF와 IL-7를 안정적으로 발현함으로써, 극대화된 항암 면역반응을 유도한다.
(c) 본 발명은 재조합 균주의 단일 투여를 통해 다각적인 세포성 면역과 체액성 면역을 유도하는 효율적인 항암 생균백신 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 이용된 마이코박테리아-유래 복제가능 플라스미드인 pMyong2 셔특 벡터의 지도에 대한 모식도(도 1a), pMyong2-TOPO 벡터 내에 Phsp-hMIF::hIL7 유전자의 삽입 위치(도 1b) 및 이들 유전자가 삽입된 pMyong2- hMIF::hIL7 플라스미드에 대한 모식도(도 1c)를 각각 나타낸다.
도 2는 본 발명의 재조합 균주의 백신 효과 평가를 위한 동물실험 스케줄을 나타낸 그림이다.
도 3은 인간 MIF 및 인간 IL-7을 발현하는 플라스미드 DNA 제작 과정을 도식화한 그림이다.
도 4는 phsp-hMIF, phsp-IL-7 및 phsp-TBMC과 이들 단백질의 융합 서열을 pMV306 및 pMyong2 벡터를 이용하여 각각 클로닝 후 대장균 콜로니에 대한 PCR 분석을 수행한 결과를 보여주는 그림이다.
도 5는 콜로니 PCR 상에서 원하는 크기의 유전자가 감지된 대장균 콜로니를 LB 액체배지에서 배양한 후, 플라스미드 DNA를 추출하여 PCR로 염기서열을 확인한 결과를 보여주는 플라스미드 모식도이다.
도 6은 인간 MIF를 발현하는 재조합 M. smegmatis의 유전자 발현을 확인한 PCR 분석 결과이다.
도 7은 인간 IL7을 발현하는 재조합 M. smegmatis의 유전자 발현을 확인한 PCR 분석 결과이다.
도 8은 본 발명에서 제작된 각각의 재조합 M. smegamtis의 hMIF, hIL7 발현율을 비교한 결과를 보여주는 그림이다.
도 9는 재조합 pMV306 및 pMyong2 벡터를 통해 M. bovis BCG에서 여러 단백질을 발현시킨 결과를 보여주는 그림이다.
도 10은 M smegmatis pMyong2-hMIF::IL7가 발현하는 단백질의 안정성을 평가하기 위해 항생제 포함여부를 달리하여 10계대까지 배양한 결과를 보여주는 그림이다.
도 11은 M. smegmatis pMyong2-hMIF::IL7가 발현하는 단백질의 인 비보에서의 안정성을 평가한 결과를 보여주는 그림이다.
도 12는 대식세포에 본 발명의 재조합 균주를 감염시킨 후, 세포 내 CFU를 측정(도 12a)하고 세포 사멸효과를 (도 12b)한 결과를 각각 보여주는 그림이다.
도 13은 마우스 내에서 M smegmatis 야생형과 M smegmatis pMyong2- hMIF::IL7의 CFU를 비교한 결과이다.
도 14는 pMyong2 재조합 M. smegmatis에 의한 수지상세포의 성숙 유도를 확인한 결과를 보여주는 그림이다.
도 15는 pMyong2 재조합 M. smegmatis에 의해 분비되는 염증성 사이토카인을 보여주는 그림이다.
도 16은 재조합 M. smegmatis에 감염된 인간 유래 암세포(도 16a)와 마우스유래 암세포(도 16b)의 대사능력을 비교한 결과를 보여주는 그림이다.
도 17은 본 발명의 재조합 균주로 자극시킨 대식세포와 수지상세포의 암세포 사멸 능력을 보여주는 그림이다.
도 18은 다양한 마우스 유래 암세포(흑색종 B16F10, 유방암세포 EO771, 대장암세포 MC38)의 이동(migration) 특성을 비교한 결과를 보여주는 그림이다.
도 19는 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 감염에 따른 MC38 세포의 침윤 감소를 보여주는 그림이다.
도 20은 마우스 종양 모델에서 각 재조합 M. smegmatis에 의한 항암효과를 보여주는 그림이다.
도 21은 인 비보 모델에서 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7에 의한 항암효과를 확인한 결과를 보여주는 그림이다.
도 22는 마우스 종양 모델의 혈청에서의 면역반응(항-인간 MIF IgG 농도)을 평가한 결과를 보여주는 그림이다.
도 23은 마우스 종양 모델의 혈청에서의 사이토카인 분비를 측정한 결과를 보여주는 그림이다.
도 24는 마우스 종양 모델의 암 조직에서의 Cyclin D1, CD74, MMP-2 및 MMP-9의 mRNA 발현을 보여주는 그림이다.
도 25는 마우스 종양 모델의 암 조직에서의 MIF와 CD74 발현을 면역조직화학 분석을 통해 측정한 결과이다.
도 26은 마우스 종양 모델의 비장에서의 TNF-α를 분비하는 CD8 T 세포와 NK 세포의 증가를 보여주는 그림이다.
도 27은 비장(도 27a) 및 종양 조직(도 27b) 내 면역 세포의 비율을 측정한 결과를 보여주는 그림이다.
도 28은 M. smegmatis_pMyong2-hMIF::IL7의 투여에 의해 종양 조직 내 IFN-ν를 분비하는 CD4 T 세포 및 IFN-ν, TNF-α를 분비하는 CD8 T 세포가 증가함을 보여주는 그림이다.
도 29는 종양 조직 내 그랜자임 B와 퍼포린-1의 발현을 측정한 결과를 나타낸다.
도 30은 본 발명의 재조합 균주와 상용화된 항암제인 시스플라틴과의 병용투여 시의 항암 효과를 보여주는 그림이다.
도 31은 본 발명의 재조합 균주와 시스플라틴의 병용투여 시 마우스의 체중과 비장의 무게 변화는 측정한 결과이다.
도 32는 본 발명의 재조합 균주와 시스플라틴의 병용투여 시 혈청 내 MIF 농도 변화를 보여주는 그림이다.
도 33은 본 발명의 재조합 균주와 시스플라틴의 병용투여 시 혈청 내 MIF에 대한 항체가(총 항-MIF IgG) 증가를 보여주는 그림이다.
도 34는 본 발명의 재조합 균주와 시스플라틴의 병용투여 시 암조직 내 면역반응 증가를 Th1 보조 T 세포와 세포독성 T 세포의 유입 증가(도 34a 및 34b) 및 TCRγδ T 세포의 비율 증가(도 34c)를 통해 보여주는 그림이다.
도 35는 PanO2(도 35a)와 LLC(도 35a)에 대한 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7의 암 성장 저해 효과를 보여주는 그림이다.
도 36은 PanO2(도 36a) 및 LLC(도 36a)-이식 마우스 모델에서 분리한 혈청과 비장세포의 면역반응을 보여주는 그림이다.
도 37은 PanO2-이식 마우스 모델의 종양 조직에서의 IFNγ-분비 TCRγδ T 세포비율(도 37a), 종양 및 비장 조직에서 IFNγ-분비 CD4 보조 T 세포와 TNFα-분비 CD4 보조 T 세포의 비율(도 37b 및 37c), 비장 조직 내 IFNγ과 TNFα을 분비하는 CD4 보조 T 세포와 세포독성 CD8 T 세포의 비율(도 37d)을 각각 측정한 결과를 나타내는 그림이다.
도 38은 LLC-이식 마우스 모델의 종양조직에서의 IFNγ-분비 CD4 보조 T 세포와 세포독성 CD8 T 세포, TNFα-분비 CD4 보조 T 세포의 비율(도 38a) 및 비장 조직 내 IFNγ과 TNFα을 분비하는 CD4 보조 T 세포와 세포독성 CD8 T 세포의 비율(도 38b 및 38c)을 각각 보여주는 그림이다.
도 39는 MC38-이식 마우스에서 분리한 혈청의 MIF 활성 저해 효과를 나타내는 그림으로, 혈청 내 MIF의 생물학적 활성 정도를 토토머라제 어세이로 측정한 결과(도 39a), 세포 내 MIF 관련 암세포의 증식과 전이에 관련된 단백질의 발현량 측정 결과(도 39b) 및 7AAD/아넥신V 아폽토시스 어세이 결과(도 39c)를 각각 보여준다.
도 40은 MC38-이식 마우스에서 분리한 혈청에 의한 암세포의 이동(도 40a) 및 침윤(도 40b) 능력 저해 효과를 보여주는 그림이다.
도 41은 MC38-이식 마우스에서 분리한 종양 조직 내 단백질 및 RNA 발현을 웨스턴 블롯 측정 결과(도 41a) 및 열지도(도 41b)로 보여주는 그림이다.
도 42는 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7와 상용화된 항암제인 항-PD-L1 항체와 병용 투여에 의한 암세포 성장 저해효능(도 42a), 체액성 면역반응 및 염증성 사이토카인 농도 변화(도 42b) 및 혈청 내 MIF 농도 변화(도 42c)를 각각 나타내는 그림이다.
도 43은 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7와 상용화된 항암제인 항-PD-L1 항체와의 병용 투여에 의한 종양 조직 내 면역 프로파일의 변화를 관찰한 결과이다.
도 44는 본 발명의 재조합 M. smegmatis 균주에 의한 인 비트로 항암 효과를 나타내는 그림으로 암세포에 대한 세포 독성(도 44a), 면역세포의 사이토카인 발현 변화(도 44b) 및 MIF의 농도 변화(도 44c)를 각각 보여준다.
도 45는 본 발명의 재조합 M. smegmatis 균주에 감염된 다양한 암세포의 대사 능력을 비교한 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1
실험방법
인간 MIF 또는IL-7을 발현하는 재조합 M. smegmatis의 제작
hMIF 및 IL-7 발현 벡터의 제작
인간 MIF(macrophage migration inhibitory factor) 및 IL-7을 발현하는 마이코박테리아-셔틀벡터를 제작하기 위해, M. bovis BCG의 지놈 DNA로부터 hsp(heat shock protein) 65 유전자의 프로모터를 증폭하고 hMIF 및 IL-7 증폭 산물과 중첩 PCR을 통해 연결시킴으로써, phsp-hMIF 및 phsp-IL7 서열을 제작하였다. 제작된 phsp-hMIF 및 phsp-IL-7 서열을 pMV306 및 pMyong2_TOPO 벡터에 클로닝하여 인간 MIF 및/또는 IL-7를 발현할 수 있는 마이코박테리아-대장균 셔틀벡터를 제작하였다 (pMV306-hMIF, pMyong2-hMIF, pMV306-IL7, pMyong2-IL7, pMV306-hMIF::hIL7, pMyong2-hMIF::hIL7).
제작된 벡터를 다양한 NTM에 형질전환
각각의 벡터를 M. smegmatis, M. bovis BCG에 전기영동(Gene Pulser II; Bio-RAD, Hercules, CA, USA)하여 형질전환 균주를 확보하였다(도 4). 재조합 균주는 카나미이신 선택 7H10 배지에 계대 유지하였다.
재조합 균주 내 hMIF, IL-7 ELISA 발현 확인
재조합 균주를 라이소자임 100μg/ml, DNase 5U/ml 및 프로티네이즈 억제제가 보충된 B-PER 완충액(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)에 풀어 얼음에서 초음파처리(5분, 펄스: 0.3s, 정지: 0.7 s)하였다. 분쇄액을 13,000 rpm, 15분 간 4℃에서 원심분리하고 상층액을 취하였다. 각 재조합 균주로부터 추출한 단백을 사용하여 hMIF 및 IL-7의 발현량을 ELISA를 통하여 측정하였다.
재조합 균주의 안정성 평가
세포 감염 후 재조합 균주의 hMIF, IL-7 ELISA 발현 확인
마우스 대식세포(J774A.1)를 6웰 플레이트에 씨딩하고 24시간이 지난 후, 10 M.O.I.(multiplicity of infection)의 각 재조합 균주를 감염시켰다. 2시간 또는 4시간 후, 감염된 세포를 PBS로 세척한 후, 세포 외부(extracellular)의 균을 제거하고, 새로운 배지로 교체하였다. 감염 24시간 후, 세포로부터 단백을 추출하여 hMIF, IL-7 ELISA kit를 사용, 각 재조합 균주에 의한 hMIF, IL-7의 발현량을 비교 측정하였다.
인 비보 에서 재조합 균주의 안정성 확인
5 x 106의 재조합 균주를 마우스에 정맥(I.V.) 경로로 감염시킨 후 1주일 뒤에 희생시켜 적출한 비장을 균질화하여 적절한 희석 배수의 균액을 고체 배지에 도말한 뒤 37℃의 배양기에서 배양하여 다수의 단일 콜로니를 확보하였다. 각 콜로니 별로 플라스미드 벡터에 삽입한 유전자 서열을 증폭이 가능한 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭한 뒤 전기영동 진행하는 방법으로 재조합 균주로서의 특성을 유지할 확률을 계산하였다.
재조합 균주의 안전성 평가
LDH, 7AAD 어세이
마우스 유래 대식세포(J774A.1)를 6웰 플레이트에 씨딩하고 24시간이 지난 후, 10 M.O.I.의 각 재조합 균주를 감염시켰다. 2시간 또는 4시간 후, 감염된 세포를 PBS로 세척한 후, 세포 외부의 균을 제거하고, 새로운 배지로 교체하였다. 시간별로 배양액을 이용하여 LDH 어세이를 진행하고, 감염된 세포는 7AAD, Annexin V를 염색하여 유세포 분석을 통해 세포독성을 평가하였다.
인 비트로 에서의 안전성 평가
마우스 유래 마크로파지 세포주(J774A.1)를 6웰 플레이트에 씨딩하고 24시간이 지난 후, 10 M.O.I.의 각 재조합 균주를 감염시켰다. 4시간 후, 감염된 세포를 PBS로 세척한 후, 세포 외부의 균을 제거하고, 새로운 배지로 교체하였다. 시간 별로, PBS 내 0.5% Triton X-100으로 세포를 떼어내어 적절한 희석배수에 해당하는 균액을 OADC가 보충된 7H10 고체배지에 도말하여 약 4주간 37℃ 배양기에서 배양하고 콜로니 카운팅을 통해 CFU(colony forming unit)를 비교 측정하였다.
인 비트로 에서의 안전성 평가
5 x 106의 재조합 균주를 마우스에 정맥으로 감염시킨 후 1주일 뒤 희생시켜 적출한 비장을 균질화하여 적절한 희석 배수의 균액을 고체 배지에 도말하여 37℃에서 배양하였다. 이후 콜로니의 숫자를 세어 CFU를 비교 측정하였다.
재조합 균주의 면역활성능 평가
수지상세포 분화
마우스의 넙다리뼈(femur)와 정강뼈(tibia)를 분리하여 골수 세포(bone marrow cell)를 분리하고 IL-4 및 GM-CSF가 보충된 IMDM 배지에 6일 간 배양하여 수지상세포로의 분화를 유도하였다. 분화된 수지상세포에서 CD11c 마커를 확인하여 80% 이상 분화된 경우에만 실험에 사용하였다.
재조합 균주 감염 시 수지상세포의 성숙 정도를 유세포 분석으로 평가
분화시킨 수지상세포에 각 재조합 균주를 24시간 동안 감염시켰다. 감염된 세포를 떼어내어 비특이적 항체 결합을 억제하기 위해 30분간 블로킹한 후, CD40, CD80, CD86 및 Ⅱ형 MHC 분자에 대한 형광항체로 30분 간 염색한 뒤 세포를 세척하고 FACS 완충액에 부유시킨 후 BD LSRFortessa 기기로 각 형광의 강도를 비교 측정하였다.
수지상세포가 분비하는 사이토카인 측정
각 재조합 균주를 감염시킨 수지상세포 배양액에서 분비된 사이토카인을 측정하기 위해 ELISA를 진행하였다. ELISA 96웰 플레이트에 포집(capture) 항체를 24시간 동안 코팅한 후 세척하여 PBS 내 1% BSA를 각 웰에 넣어 약 1시 동안 블로킹하였다. 세척 후 감염된 수지상세포 배양액을 넣어 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 다시 세척 후, 검출 항체와 함께 2시간 동안 실온에서 배양 후 HRP (horseradish-peroxidase)가 접합된 스트렙타비딘을 30분 동안 반응시켜 발색시켰다. 이후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다(TNF-α, IL-6, IL-10, IL-12 등).
다양한 암세포주에 대한 항암효과 관찰
재조합 균주의 다양한 암세포주에 대한 직접적 세포독성 관찰
재조합 균주가 직접적으로 암세포의 세포독성을 증가시키는지 확인하기 위하여, 인간유래 유방암 세포주인 MCF-7, 간암 세포주인 HepG2, 폐암 세포주인 A549와 마우스 유래 대장암 세포주인 MC38, 방광암 세포주인 Mbt-2를 각각 24 웰 플레이트에 씨딩하고 24시간 뒤 1, 10, 20 M.O.I.의 각 재조합 균주를 감염시켰다. 4시간 후, 감염된 세포를 PBS로 세척한 후, 세포 외부의 균을 제거하고, 새로운 배지로 교체하였다. 시간 별로 배양액을 이용하여 LDH 어세이를 진행하고, 감염된 세포는 7AAD, Annexin V를 염색하여 유세포 분석으로 세포독성을 평가하였다.
대식세포를 통한 암세포주에 대한 세포 독성능 확인
재조합 균주가 대식세포를 자극함으로써 암세포에 대한 면역반응을 유도하는지를 확인하기 위하여, 마우스 대식세포 J774A.1에 1, 10, 20 M.O.I.의 각 재조합 균주를 감염시켰다. 4시간 후, 감염된 세포를 PBS로 세척한 후, 세포 외부의 균을 제거하고, 새로운 배지 교체하였다. 이후 24시간 감염시킨 대식세포와 마우스 유래 대장암 세포주 MC38 및 방광암 세포주 Mbt-2를 공배양하고 세포 배양액 내 LDH를 측정함으로서 세포독성을 평가하였다.
MC38 마우스 대장암 세포주를 이용한 인 비보 항암효과 관찰
1 x 106의 MC38 세포를 피하(S.C.)로 주입 후 3일, 7일, 14일 뒤 1 x 107 CFU의 재조합 균주를 피하로 총 3회 접종하였다. 마지막 재조합 균주 주사 후 일주일 뒤인 실험 종료일까지 종양크기를 측정하고, 각 그룹의 마우스를 희생시켜 종양을 적출하였다. 실험 종료일에 종양의 무게와 실험기간 동안 측정한 종양의 크기를 비교함으로서, 재조합 균주에 의한 항암효과를 평가하였다(도 2).
암 발생 유도된 마우스에서의 면역반응
사이토카인 발현 측정
각 재조합 균주로 항암 효과를 관찰한 마우스의 비장세포를 96 웰 플레이트에 씨딩하고, 여기에 5μg/ml 농도로 MC38 세포용해 항원을 처리하여 재자극시켰다. 24시간 또는 72시간째에 세포의 배양액을 수집하여 -70℃에 보관하였다. 그 후 면역반응 활성화에 관련되거나(TNF-α, IFN-γ), 면역억제에 관련된 사이토카인 (IL-4, IL-10 등)에 대한 ELISA를 수행하여 그 발현 양상을 비교 분석하였다.
사이토카인 발현하는 NK 및 T 세포 관찰
각 재조합 균주로 항암효과를 관찰한 마우스의 비장세포를 96 웰 플레이트에 씨딩하고, 이에 5μg/ml 농도의 MC38 세포용해 항원으로 재자극시켰다. 48시간 이후, ER(endoplasmic reticulum) 내 단백질을 잡아두는 brefeldin A를 4시간 처리한 후 CD3, CD4 및 CD8 분자에 대한 형광 항체로 염색하였다. 이 후 세포 내 IFN-γ를 염색하기 위해 fix/perm 처리 후 IFN-γ에 대한 형광 항체로 염색하고, BD LSRFortessa를 이용하여 IFN-γ의 발현 비율을 비교 분석하였다.
항암제와의 병용효과 관찰
재조합 균주의 항암효과를 극대화하기 위하여 항암제와의 병용요법을 수행하였다. 1 x 106의 MC38 세포를 피하로 주입하고 3일, 7일, 14일 뒤 1 x 107 CFU의 재조합 균주를 피하로 총 3회 접종하였다. 병용투여 효과를 확인하기 위해 재조합 M. smegmais와 시스플라틴(50μg/kg)을 복강 내 투여하였다. 마지막 재조합 균주 주사 후 일주일 뒤인 실험 종료일까지 종양크기를 측정하고, 각 그룹의 마우스를 희생시켜 종양을 적출하였다. 실험 종료일에 종양의 무게와 실험기간 동안 측정한 종양의 크기를 비교함으로서, 재조합 균주에 의한 항암효과를 관찰하였다.
실험결과
인간 MIF 또는 인간 IL-7을 발현하는 플라스미드 DNA 생성
재조합 M. smegmatis 균주 제작을 위해 Integration 벡터인 pMV306와 신규한 마이코박테리아-대장균 셔틀 벡터인 pMyong2에 인간 MIF 또는 인간 IL-7 유전자를 포함하는 플라스미드를 구축하였다. 인간 MIF 및 IL-7을 발현하는 마이코박테리아-셔틀벡터를 제작하기 위해, M. bovis BCG의 지놈 DNA로부터 hsp65 유전자의 프로모터를 증폭하여 phsp-hMIF 및 phsp-IL7 서열을 제작하였다(도 3). 또한 추가적으로 면역반응을 유도할 수 있는 결핵균 유래 단백질인 TBCM을 제작하였으며, hMIF, hIL7, TBCM의 융합단백을 발현하는 벡터 역시 함께 제작하였다.
제작된 phsp-hMIF, phsp-IL-7 및 phsp-TBMC과 세 단백질의 융합서열을 pMV306 및 pMyong2 벡터에 클로닝하여 인간 MIF 및 IL-7를 발현할 수 있는 마이코박테리아-대장균 셔틀벡터를 제작하고, 대장균에 heat-shock을 통해 주입시킨 후 카나마이신 항생제가 포함된 LB 고형배지에 도말하였다. 항생제 내성 유전자를 포함하여 카나마이신이 포함된 배지에서 생존한 콜로니를 선택하고 주입한 유전자를 타겟팅하는 프라이머로 PCR을 진행하였다. 콜로니 PCR 상에서 원하는 크기의 유전자가 감지된 대장균 콜로니를 LB 액체배지에서 배양한 후, 플라스미드 DNA를 추출하여 시퀀싱을 진행하였다(도 5). 이상과 같은 방법으로 면역반응을 증진시킬 수 있는 단백질-코딩 유전자의 염기서열을 포함하는 다음 12종류의 플라스미드 DNA를 확보하였다: pMV306-hMIF, pMV306-hIL7, pMV306-TBCM, pMV306-hMIF::hIL7, pMV306-hMIF::TBCM, pMV306-TBCM::hMIF, pMyong2-hMIF, pMyong2-hIL7, pMyong2-TBCM, pMyong2-hMIF::hIL7, pMyong2-hMIF::TBCM, pMyong2-TBCM::hMIF.
인간 MIF 또는 인간 IL-7을 발현하는 재조합 M. smegmatis 균의 제작
면역반응을 유도하는 재조합 M. smegmatis를 생성하기 위하여, 염기서열을 확인한 각 벡터를 M.smegmatis 균에 형질전환시켰으며, hMIF, TBCM, hMIF::TBCM, TBCM::hMIF(도 6) 및 hIL7, hMIF::hIL7, TBCM::hIL7(도 7)를 발현하는 재조합 M. smegmatis는 카나마이신 항생제가 포함된 7H10 고형배지 상에서 선별되었고, 선별된 균은 콜로니 PCR을 통하여 원하는 유전자를 발현하고 있는지 확인함으로써 hMIF, hIL7, TBCM 및 융합단백질을 발현하는 다음의 재조합 M. smegmatis를 확보하였다: rSmeg-pMV306-hMIF, rSmeg-pMV306-hIL7, rSmeg-pMV306-TBCM, rSmeg-pMV306-hMIF::hIL7, rSmeg-pMV306-hMIF::TBCM, rSmeg-pMV306-TBCM::hMIF, rSmeg-pMyong2-hMIF, rSmeg-pMyong2-hIL7, rSmeg-pMyong2-TBCM, rSmeg-pMyong2-hMIF::hIL7, rSmeg-pMyong2-hMIF::TBCM, rSmeg-pMyong2-TBCM::hMIF.
각 각의 재조합 M. smegmatis를 한 균주 이상 확보하고, 이들을 물리적(초음파처리), 화학적(라이소좀 및 DNase를 포함하는 B-per 용액) 방법으로 용해시켜 발현하고 있는 단백질을 측정하였다. 그 결과, hIL7을 제외한 모든 단백질이 pMV306 벡터를 이용하였을 때에 비하여 pMyong2 벡터를 이용한 경우에 현저히 고발현됨을 알 수 있었다(도 8). 아울러, 양성 대조군으로서 M. bovis BCG에도 pMV306 및 pMyong2 벡터에 여러 단백질을 발현하는 재조합 균주를 구축하였다(도 9).
M smegmatis pMyong2-hMIF::IL7의 안정성 평가
M smegmatis pMyong2-hMIF::IL7가 발현하는 단백질의 안정성을 확인하기 위하여, 항생제를 포함시키거나 포함시키지 않은 배지에서 10계대까지 배양한 결과, pMyong2 벡터에 발현되고 있는 단백질 모두 10계대까지 발현이 유지되는 것을 확인하였으며(도 10), 이를 통해 pMyong2 벡터를 포함하는 재조합 균주는 안정적으로 단백질을 발현함을 확인하였다. 아울러 M smegmatis pMyong2-hMIF::IL7가 항생제 선별이 불가능한 인 비보 환경에서도 안정적으로 단백질을 발현하는지를 확인하기 위하여 마우스에 정맥 주사한 후 일주일 뒤 비장 내에서의 단일 균들을 PCR 방법으로 확인한 결과, M smegmatis pMyong2-hMIF::IL7가 인 비보 환경에서도 플라스미드 벡터를 안정적으로 보유하고 있음을 확인하였다(도 11).
재조합 균주의 안전성 평가
본 발명의 재조합 균주가 치료용 백신으로서의 안전성을 확보하고 있는지를 확인하기 위해 대식세포에 각 재조합 균주를 감염시킨 후 24 및 48시간째의 재조합 균주의 CFU를 측정한 결과, pMV306-hMIF::hIL7과 pMyong2-hMIF::hIL7 균주에서 야생형의 M. smegmatis보다 감염율이 높음을 감염 후 24시간에 확인하였으며, 모든 재조합 균주가 감염 후 48시간에 야생형의 M. smegmatis보다 감염율이 높은 것으로 확인되었다(도 12a). 뿐만 아니라, 감염된 대식세포의 배양액에서 대부분의 세포에서 존재하는 효소로서 세포가 손상되거나 파괴될 때 분비되는 LDH(lactate dehydrogenase)를 측정한 결과, pMV306-hMIF, -hIL7 및 pMyong2-hMIF::IL7를 발현하는 재조합 균주에 의한 세포독성은 병원성이 낮은 M. smegmatis 야생형 보다 현저히 낮은 수준이었으며, pMyong2-hMIF::IL7를 발현하는 M. smegmatis에 감염된 경우, 어떠한 균에도 감염되지 않은 PBS 군과 유사한 수준의 세포독성을 확인하였다(도 12b). 이를 통해 재조합 균주들은 야생형과 비교하여 대식세포 내 높은 세포 감염율에도 불구하고, 세포독성은 높지 않음을 확인하였다. 특히 rSmeg-pMyong2- hMIF::hIL7 균주는 높은 세포 내 감염율을 보이기 때문에 재조합 균주가 발현하는 단백질에 의해 면역세포의 활성화가 유도될 것으로 기대되었으나, rSmeg-pMyong2- hMIF::hIL7 감염으로 인한 면역세포의 사멸이 유도되지 않기 때문에 치료용 백신으로 사용하기에 최적화된 장점을 보이는 것으로 판단되었다.
M smegmatis pMyong2-hMIF::IL7가 인 비보 환경에서 야생형과 비교해 장기 내 감염율을 확인하기 위하여 마우스에 정맥 주사(100μl PBS 내 5 x 106) 후 일주일 뒤 비장을 균질화하여 CFU를 비교한 결과, 재조합 균주가 야생형과 비교하여 통계학 유의성이 없음을 확인하였다(p=0.1887)(도 13).
재조합 M. smegmatis의 면역 증진능 평가
면역반응을 유발하여 항암효과를 증진시키기 위해서는 후천면역을 활성화시키는 수지상세포가 중요한 세포로 작용하기 때문에, pMyong2 재조합 M, smegmatis가 항원제시세포인 수지상세포의 성숙을 유도하는지를 확인하고자 하였다. 마우스의 골수세포로부터 GM-CSF(Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor)를 이용하여 분화한 수지상세포에 재조합 균주를 감염시킨 후 수지상세포의 대표적인 성숙 마커인 MHCⅡ, CD40, CD80, CD86의 발현을 FACS로 확인한 결과, 모든 재조합 M. smegmatis와 야생형 M. smegmatis를 감염시켰을 때 CD40, CD86, MHCⅡ를 발현하는 수지상세포가 아무것도 처리하지 않은 수지상세포보다 현저히 증가하는 것을 모든 M.O.I 조건에서 확인하였다. 이를 통해 모든 재조합 M. smegmats는 야생형 M. smegmatis 수준으로 수지상세포를 자극하여 성숙시킴을 알 수 있었음(도 14). 뿐만 아니라 활성화된 수지상세포에서 분비되는 염증성 사이토카인 IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α를 ELISA로 측정한 결과, 모든 재조합 M. smegmatis와 야생형 M. smegmatis를 감염시켰을 때 아무 것도 처리하지 않은 수지상세포보다 현저히 증가함을 관찰하였다(도 15). 이를 통해 모든 재조합 M. smegamtis는 야생형 M. smegmatis의 특성을 유지한 채 수지상세포를 자극하여 염증성사이토카인의 분비를 유도하는 것을 알 수 있었다. 결론적으로, 본 발명의 pMyong2 재조합 M. smegmatis는 효과적으로 면역반응을 유도하였다.
다양한 암세포주에 대한 항암효과 관찰
이상에서 확인된 본 발명의 재조합 균주들의 항암효과를 인 비트로에서 확인하고자, 인간 유방암 세포 MDA231과 MCF7, 마우스 대장암 세포 MC38, 마우스 유방암 세포 EO771에 각각 재조합 균주를 감염시킨 후 암세포의 대사활성 측정을 통해 재조합 균주의 세포 사멸능 확인하였다. 세포의 대사 활성은 MTS 세포증식 어세이 킷(Promega, USA)을 이용하여 측정였다. 인간 유래 암세포(도 16a)와 마우스유래 암세포(도 16b)에서 모두 pMyong2 벡터가 형질전환된 재조합 균주가 pMV306 벡터가 형질전환된 재조합 균주보다 암세포에 대한 높은 세포독성을 보임이 확인되었다. 이는 앞서 관찰된 재조합 균주의 성능에서 확인된 바와 같이 pMyong2-TOPO 벡터가 pMV306 벡터 보다 인간 MIF와 인간 IL-7의 발현량이 월등히 높기 때문인 것으로 추정된다. 또한 인간 MIF와 인간 IL-7을 각각 발현하는 균주는 공벡터를 가진 균주에 비해 더 높은 세포독성을 가지는 경향을 보였으며, 인간 MIF와 인간 IL-7이 각각 발현되는 경우 보다 두 가지 단백이 융합된 형태로 발현될 경우 암세포에 대한 가장 높은 세포독성을 보이는 것을 확인하였다.
또한 재조합 균주에 의해 활성화되는 대식세포와 수지상세포가 암세포에 대한 세포 독성을 가지는지를 확인하기 위하여, 재조합 균주로 자극시킨 대식세포와 수지상세포를 암세포와 공동배양하여 암세포에 대한 세포독성을 관찰한 결과, 야생형의 M. smegmatis에 비해 모든 재조합 균주에 의하여 자극된 대식세포와 수지상세포는 암세포 사멸효과가 더 높았으며, 특히 pMyong2-hMIF::IL7는 다른 재조합 M. smegmatis보다 이들 면역세포의 항암효과를 극대화시킴을 확인하였다(도 17). 이를 통해 재조합 M. smegmatis는 직접적으로 암세포의 대사를 저해할 뿐 아니라 대식세포와 수지상세포를 자극하여 암세포 사멸을 유도함을 알 수 있었으며, 재조합 균주 중에서도 pMyong2 벡터에 융합단백 hMIF::IL7을 형질전환시킨 M. smegmatis가 가장 우수한 항암효과를 보임을 확인하였다.
M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7에 의한 암세포 이동 및 침윤 억제
암이 진행됨에 따라 암세포는 다른 장기로 전이하기 위하여 이동 및 다른 조직으로 침윤할 수 있는 특성을 획득하는데, 이는 암 치료의 한계를 야기한다. M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7가 암세포의 전이에 관련된 이동 및 침윤에도 영향을 미치는지를 확인하기 위하여, 다양한 마우스 유래 암세포(흑색종 B16F10, 유방암세포 EO771, 대장암세포 MC38)에 PBS, M. smegmatis, M. smegmatis-pMyong2_ hMIF::IL7를 감염시킨 후 200μl 피펫 팁으로 긁어낸 다음 시간에 따른 이동 정도를 확인하였다. 그 결과, B16F10과 EO771에서 M. smegmatis와 M. smegmatis- pMyong2_hMIF::IL7에서 감염시키지 않은 세포에 비해 이동이 억제됨을 확인 할 수 있었다(도 18). 특히 MC38 대장암세포주의 경우 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7균주만이 이동을 억제시킴을 확인하였다. 뿐만 아니라, 암세포는 효소를 이용하여 세포외기질(ECM)을 손상시켜 혈관벽을 뚫는 침윤(invasion) 과정을 통해 전이가 일어나기 때문에, M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7에 의한 침윤 억제를 조사하고자 마트리젤이 코팅된 트랜스웰에서 MC38 대장암 세포주에 PBS, M. smegmatis, M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7를 감염시킨 후 48시간 뒤 세포를 hoechst로 염색하였고, 마트리젤을 통과한 세포 외 다른 세포는 제거한 후 현광현미경으로 관찰하였다. 현광현미경 상에서 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7에 감염된 MC38 세포는 침윤이 감소됨을 확인 할 수 있었으며, 이를 수치화시켰을 때 PBS 및 M. smegmatis에 비해 통계적으로 유의한 결과임을 알 수 있었다(도 19). 이를 통해 M. smegmatis -pMyong2_hMIF::IL7 균주가 마우스유래 대장암 세포주 MC38의 이동 및 침윤을 억제함을 알 수 있었다.
MC38 마우스 대장암 세포주를 이용한 인 비보 항암효과 관찰
마우스 유래 대장암 세포 MC38를 C57BL/6 마우스에 주입한 후, 재조합 균주를 림프절 근처에 주사하여 종앙 크기의 변화를 관찰한 결과, hMIF::IL7을 형질전환시킨 M. smegmatis를 주입한 마우스에서 종양의 크기는 야생형 M. smegmatis를 처리한 마우스에서보다 현저히 감소함을 주입 15일째부터 관찰할 수 있었으며 마우스에서 종양을 분리하였을 때 시각적으로 확연한 크기 차이를 확인할 수 있었다. 또한 마우스에서 분리한 종양의 무게는 hMIF::IL7을 형질전환시킨 M. smegmatis를 주입한 경우 가장 낮은 수치를 보였으며 아무것도 처리하지 않을 경우 대비 80%의 마우스에서만 종양이 형성되었다(도 20). 뿐만 아니라, M. smegmatis-pMyong2_ hMIF::IL7에 의한 항암효과를 방광암의 치료제로 사용하고 있는 BCG와 비교한 결과, 암세포 주입 후 15일째부터 BCG 처리 마우스에 비해 현저히 감소된 종양 크기를 보였다(도 21). 이를 통해 M. smegmatis_pMyong2-hMIF::IL7의 항암효과를 인 비보에서 검증하였을 뿐 아니라, 양성 대조군인 BCG보다 뛰어난 항암 효과를 보임을 알 수 있었다.
암 발생 유도된 마우스의 혈청 내 반응 관찰
인 비보에서 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7로 인해 혈청 내 염증성 사이토카인의 변화를 ELISA를 통하여 조사한 결과, M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7를 처리한 마우스에서 얻은 혈청에서는 아무것도 처리하지 않은 마우스와 야생형 M. smegmatis를 처리한 마우스에 비해 혈청 내 마우스 MIF 의 분비량이 현저하게 줄어들었음을 확인할 수 있었다(도 22a). 이를 통해 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7의 처리에 의해 MIF에 대한 IgG 농도가 혈청 내 증가하였을 것으로 판단되었다. 아울러 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7를 처리한 마우스에서 얻은 혈청에서는 아무것도 처리하지 않은 마우스와 야생형 M. smegmatis를 처리한 마우스에 비해 항-인간 MIF IgG의 농도가 감소됨을 확인하였다(도 22b). 뿐만 아니라 아무것도 처리하지 않은 마우스와 야생형 M. smegmatis를 처리한 마우스에 비해 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 군 마우스에서 얻은 혈청에서는 TNF-α, IFN-γ, IL-6 분비가 현저하게 증가되어 있음을 확인하였다(도 23). 이를 통해 M. smegmatis- pMyong2_hMIF::IL7의 처리를 통해 마우스 내 전반적 면역 활성이 증가되었음을 알 수 있었다. 종합하면, M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7를 처리한 마우스에서 혈청 내 인간 MIF에 대한 IgG의 농도가 대조군들에 비해 현저하게 증가함에 따라 혈청 내 마우스 MIF의 농도가 낮아짐을 확인하였으며, 이를 통해 M. smegmatis-pMyong2_ hMIF::IL7가 인 비보에서 hMIF에 대한 체액성 면역반응을 효율적으로 유도함을 알 수 있었다.
암 발생 유도된 마우스의 암 조직 내에서의 유전자와 단백 발현 관찰
M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7를 주사한 마우스에서 혈청 내 항-인간 MIF IgG의 양이 증가하고 마우스 MIF의 양이 감소함을 확인하였으므로, 마우스 암 조직 내의 MIF 관련 유전자와 단백질의 발현도 감소하는지를 RT-PCR과 IHC 염색을 통하여 조사하고자 하였다. 그 결과 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7를 처리한 군의 암 조직에서 아무것도 처리하지 않은 마우스와 야생형 M. smegmatis를 처리한 마우스에 비해 세포주기와 관련한 Cyclin D1, MIF에 대한 수용체인 CD74, 그리고 암 성장과 관련한 MMP-2와 MMP-9의 mRNA 발현량이 현저하게 감소함을 확인하였다(도 24). 아울러 각 마우스에서 추출한 암 조직의 IHC 염색으로 단백질 발현을 조사한 결과 역시 아무것도 처리하지 않은 마우스와 야생형 M. smegmatis를 처리한 마우스에 비해 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7를 처리한 마우스에서 얻은 암 조직 내에서 MIF의 수용체인 CD74와 세포질 내의 MIF 단백질의 발현이 현저하게 감소됨을 확인하였다(도 25). 이를 통해, M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7이 BCG, 야생형 M. smegmatis에 비해 MIF에 대한 면역반응을 효율적으로 유도함으로서 암 성장 관련 유전자 및 단백질의 발현을 감소시킴으로써 암의 성장 및 증식을 가장 효과적으로 억제함을 알 수 있었다.
암 발생이 유도된 마우스에서의 면역반응 관찰
첫 번째 인 비보 실험에서 관찰된 항암 효과는 재조합 균주를 림프절 근처에 주사하였기 때문에 면역기관인 비장 내 면역세포의 비율에 차이가 있을 것으로 판단하고, 이를 유세포분석기를 통하여 확인하였다. 그 결과, M. smegmatis_ pMyong2-hMIF::IL7군 마우스에서 추출한 비장세포는 아무것도 처리하지 않거나 야생형 M. smegmatis를 처리한 마우스에 비해 TNF-α를 분비하는 NK 및 CD8 T 세포의 비율이 현저하게 증가되어 있음을 확인하였다(도 26). 아울러, 종양 주변 환경에 직접 주사한 두 번째 인 비보 실험에서도 비장 및 종양 내 면역 세포의 비율을 유세포분석을 통해 관찰한 결과 비장 내 대식세포의 비율이 M. smegmatis_ pMyong2-hMIF::IL7를 주사한 마우스에서 현저히 감소됨을 확인하였다(도 27a). 또한 암 조직을 콜라게나아제 IV와 DNase I으로 처리하여 단순세포로 분리한 후 마찬가지로 면역세포의 비율을 비교한 결과, 비장세포에서와 마찬가지로 M. smegmatis_ pMyong2-hMIF::IL7를 주사한 마우스에서 대식세포의 비율이 감소되어 있었다. 흥미롭게도 암세포를 제거하는 기능을 가진 CD8 세포독성 T 세포는 M. smegmatis_ pMyong2-hMIF::IL7에 의해 증가되었다(도 27b).
종양조직 내에서 증가한 CD8 T 세포가 실제로 암세포를 사멸시키거나 주변 면역세포를 더욱 활성화시키기 위해서는 TNF-α 및 IFN-γ와 같은 사이토카인을 분비하여야 한다. 이에 M. smegmatis_pMyong2-hMIF::IL7에 의해 종양조직 내에서 증가한 CD8 T 세포가 TNF-α 및 IFN-γ를 분비하여 실질적인 항암기능을 발휘하는지, 또한 IFN-γ를 분비하여 CD8 T 세포를 활성화시키는 CD4 T 세포가 증가하는지를 확인하기 위해 유세포분석기로 관찰한 결과, M. smegmatis_pMyong2-hMIF::IL7에 의해 IFN-γ를 분비하는 CD4 T와 CD8 T 세포의 비율이 현저히 증가함을 확인할 수 있었으며, 이는 BCG, M. smegmatis 군에 비해서 월등히 뛰어났다. 뿐만 아니라 실제 암세포를 죽이는 TNF-α를 분비하는 CD8 T 세포의 경우 PBS와 M. smegmatis 군에 비하여 현저히 증가되어있음을 확인하였다(도 28).
비장세포, 세포독성 T 세포 및 Th1 세포가 증가함을 관찰하였으므로, 암 조직에서의 세포 용해성 단백질인 그랜자임(Granzyme) B와 퍼포린(perforin)-1의 발현을 IHC 염색을 통하여 확인한 결과, M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7를 처리한 마우스에서 얻은 암조직 내에서 아무것도 처리하지 않은 마우스와 야생형 M. smegmatis를 처리한 마우스에 비해 그랜자임 B와 퍼포린-1 단백질의 발현이 현저하게 증가함을 확인하였다(도 29). 이를 종합하면, M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7는 암 조직과 비장세포에서 염증성 사이토카인을 분비를 유도하는 면역세포를 활성화시켜 BCG, 야생형 M. smegmatis 보다 뛰어난 항암효과를 보이며, 이를 암 조직에서의 세포 용해성 단백질 발현을 통해서도 확인할 수 있었다.
시스플라틴과의 병용 효과 확인
MC38 암세포주가 이식된 마우스 모델에서 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7과 상용화된 항암제인 시스플라틴과의 병용 효과를 관찰하고자 MC38 암세포 주입 후 3일, 7일, 14일째 M. smegmatis 와 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7을 2 x 106씩 주입하고, 7일 및 14일째 시스플라틴을 함께 주입하였다. 그 결과, M. smegmatis와 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7를 주입한 마우스의 경우 아무 처리 하지 않은 마우스에 비해 암 크기의 성장 속도가 줄어드는 것을 확인할 수 있었으며, hMIF::IL7을 발현하는 M. smegmatis의 경우 야생형에 비해 암 조직의 성장 속도를 지연시킴을 확인하였다. 또한 적출한 암 조직의 무게는 M. smegmatis 와 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7를 주입한 경우 아무 처리 하지 않은 군에 비해 통계적으로 유의한 수준으로 떨어졌으며 hMIF::IL7 단백질을 발현하는 M. smegmatis가 야생형을 처리한 군에 암의 무게를 감소시킴을 확인하였다(도 30). 이에, 시스플라틴과 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7을 병용 처리 시 항암제의 단독 투여에 비해 암 성장 저해 효과가 현저히 증가하였다.
시스플라틴과 병용 투여시 마우스의 몸무게와 비장 무게 확인
MC38 암세포주 이식 모델에서의 시스플라틴과의 병용 효과를 추가적으로 확인하기 위해 암의 밀도에 비례한 지표가 되는 마우스의 체중과 면역 세포의 유입과 활성화를 반영하는 비장의 무게를 측정하였다. 그 결과, 아무 처리 하지 않은 마우스의 경우 암세포 주입 후 시간이 경과함에 따라 몸무게가 꾸준히 증가한 반면 M. smegmatis와 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7를 주입한 마우스의 경우 체중이 감소하였다(도 31a). 시스플라틴과 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7의 병용 처리는 항암제 단독 투여의 경우에 비해 체중이 더 감소함을 확인하였다. 비장의 경우, M. smegmatis 와 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7를 주입한 경우 모두 아무 처리 하지 않은 마우스에 비해 육안으로 비장의 크기 증가가 확인되었으며 체중 대비한 비장의 무게 또한 증가하였고, 시스플라틴 병용 투여군 역시 체중 대비 비장 무게가 현저히 감소하였다. 이를 종합하면 시스플라틴과 M. smegmatis-pMyong2_ hMIF::IL7의 병용 투여로 인해 면역세포의 비장으로의 유입이 유도된 것으로 판단된다.
시스플라틴과의 병용 투여시 혈청 내 MIF 농도 변화
MC38 암세포주 이식 모델에서의 시스플라틴과의 병용 효과를 추가적으로 확인하기 위해 암세포 주입 후 4일 마다 안와채혈을 통해 혈청을 분리하여 혈청 내 MIF 농도 변화를 토토머라제(tautomerase) 어세이로 측정한 결과, 아무 처리하지 않은 마우스의 경우 암세포 주입 이후 꾸준히 혈청 내 MIF 농도가 증가하는 반면 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7을 처리한 군의 경우 통계적으로 유의한 수준으로 MIF 농도가 떨어지는 것을 확인하였다(도 32a).
시스플라틴, 항-PD-L1 및 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7을 함께 투여한 경우 아무 처리하지 않은 군에 비해 역시 혈청 내 MIF 농도가 떨어지는 것을 확인하였으며, 시스플라틴과 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7을 병용 처리한 경우 시스플라틴 단독 투여의 경우에 비해 통계적으로 유의한 수준으로 MIF 농도가 더 감소하였다(도 32a).
또한, 혈청 내 MIF의 생물학적 활성을 확인하기 위해 혈청을 0, 1, 5, 10, 50% 농도로 배지에 희석하여 토토머라제 어세이를 진행한 결과 M. smegmatis와 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7를 처리한 경우 아무 처리하지 않은 군에 비해 기질을 환원시키는 전환율이 높음을 확인하였으며 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7는 야생형 M. smegmatis에 비해서도 기질의 환원 정도가 높았다.
아울러, 시스플라틴과 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7을 함께 투여한 경우 아무 처리하지 않은 군은 물론 시스플라틴 단독 투여군에 비해서도 혈청의 기질이 환원되는 전환율이 높음을 토토머라제 어세이 결과로 확인하였다. 이를 통해 시스플라틴을 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7와 함께 투여할 경우 암 발생 마우스의 혈청 내 MIF의 농도와 생물학적 활성이 각 성분의 단독 투여 시에 비해 감소함을 알 수 있었다.
시스플라틴과의 병용 투여 시 암발생 마우스의 혈청 내 MIF에 대한 항체가
MC38 암세포주를 이식한 마우스 모델에서 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7과 시스플라틴을 병용 투여한 결과 혈청 내 MIF의 농도와 생물학적 활성이 감소하였으므로, MIF에 대한 항체 생성이 증가했을 것으로 판단하였으며, 체내의 면역활성 증가의 척도가 되는 혈청 내 사이토카인의 생성 또한 증가되었을 것으로 기대되었다. 혈청 내 MIF에 대한 항체가를 여러 단위에서 확인한 결과 M. smegmatis- pMyong2_hMIF::IL7을 처리하자 미처리 군에 비해 총 항-MIF IgG가 통계적으로 유의한 수준으로 증가하였다(도 33). 혈청 내 사이토카인 수치 역시 시스플라틴 단독 투여군, M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 처리 군 및 이들의 병용 처리군에서 IFN-γ와 TNF-α의 수준이 대조군에 비해 현저히 증가하였다(도 33).
시스플라틴과의 병용 투여 시 암발생 마우스의 암 조직 내 면역반응 관찰
MC38 암세포주를 이식한 마우스 모델에 시스플라틴과의 M. smegmatis- pMyong2_hMIF::IL7을 병용 처리할 경우 IFN-γ와 TNF-α를 분비하는 면역세포가 증가하는지를 확인하기 위해 암세포 주입 후 23일째 암조직을 적출한 후 콜라게나아제 Ⅳ와 DNaseⅠ을 처리한 후 strainer를 통과시켜 단일 세포로 분리하였다. 이후 PMA와 Ionomycin을 처리하여 암세포 내의 사이토카인을 누적시킨 뒤 형광 접합 항체와 반응시켜 유세포 분석기로 면역세포를 관찰하였다. 그 결과, 암조직 내 IFN-γ와 TNF-α를 생성하는 Th1 보조 T 세포와 세포독성 T 세포가 아무 처리하지 않은 마우스에 비해 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7을 처리한 마우스와 시스플라틴을 처리한 마우스 및 병용 처리한 마우스의 암 조직 내에서 유입이 증가하는 것을 확인하였다(도 34a 및 34b). 암조직 내 IFN-γ를 분비하는 TCRγδ T 세포의 비율이 또한 M. smegmatis와 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7을 처리한 마우스에서 대조군에 비해 통계적으로 유의한 수준으로 증가하였으며, 또한 시스플라틴을 투여한 마우스와 시스플라틴과 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7을 병용 처리한 마우스의 암 조직 내에서 TCRγδ T 세포의 유입이 증가하였다(도 34c). 이를 통해 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7가 M. smegmatis 야생형에 비해 Th1 보조 T 세포와 세포 독성 T 세포를 성숙시키는 TCRγδ T 세포의 생성과 암조직으로의 유입을 증가시켜 항암 면역 반응을 증진시킴을 알 수 있었다.
실시예 2
추가적인 암세포주에 대한 항암효과 확인
MC38 암세포주 외 추가적인 다양한 암세포주에 대한 M. smegmatis-pMyong2_hMIF:: IL7의 항암 효과를 관찰하고자 MC38을 이용한 실험과 동일한 방식으로, 마우스 췌장암 세포주인 PanO2와 마우스 폐암 세포주 LLC를 피하 주사로 마우스의 허벅지 윗부분에 주입한 다음 3일, 7일, 14일째에 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7를 총 3회 종양 주위(peritumoral) 주입한 다음 암 크기를 관찰하였다.
M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7를 주입한 마우스에서 종양의 크기는 아무 처리를 하지 않은 마우스에 비하여 현저히 감소하였음을 PanO2, LLC 암세포를 주입한 후 21일, 24일째부터 관찰할 수 있었으며 마우스에서 종양을 분리하였을 때 시각적으로 확연한 크기 차이를 확인할 수 있었다. 또한 마우스에서 분리하여 측정한 종양의 무게는 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7을 주입한 경우 아무 처리 하지 않은 마우스에 비하여 낮은 수치로 측정됨을 확인할 수 있었다(도 35).
MC38을 이용한 실험과 동일한 방법으로 PanO2와 LLC를 이용한 종양-이식 마우스 모델에서 분리한 혈청, 비장세포, 종양을 이용하여 추가 실험을 진행하였다. 아울러, MIF에 대한 면역반응 증가로 인해 종양 내 침투된 면역세포의 활성이 증가하였는지 확인하고자 종양과 비장 조직 내 활성화된 면역세포를 유세포분석을 수행하였다.
PanO2와 LLC를 이용한 종양-이식 마우스 모델에서 분리한 혈청을 이용하여 인간 MIF에 대한 IgG 생성을 확인하여 MIF에 대한 체액성 면역반응을 확인하였고, 그에 따른 혈청의 MIF 농도를 확인하였다. 또한 비장세포에서 적혈구를 제거하여 단일세포로 분리한 다음 각 암세포 용해물 항원과 MIF 항원 단백질을 함께 배양하였을 때 염증성 사이토카인이 유도됨을 확인하였다.
PanO2, LLC-이식 마우스 모델에서 분리한 혈청에서 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7을 처리한 마우스의 경우 아무 처리 하지 않은 마우스에 비하여 인간 MIF에 대한 IgG 수준이 증가하였고 혈청의 마우스 MIF 수치가 줄어들었다. 이를 통해 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7을 마우스에 주입하였을 경우 마우스 체내에서 MIF에 대한 체액성 면역반응이 증가하여 혈청의 MIF 수치가 줄어들었을음을 알 수 있었다(도 36).
PanO2, LLC-이식 마우스 모델에서 분리한 비장세포에 종양세포의 항원과 인간항원 단백을 각각 함께 배양한 결과 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7을 처리한 마우스의 비장세포의 경우 아무 처리 하지 않은 마우스에 비하여 종양세포와 MIF 항원에 대한 세포성 면역반응이 증가하였다(도 36).
PanO2-이식 마우스 모델에서 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 처리에 의해 MIF에 대한 체액성 면역반응과 세포성 면역반응이 증가함을 확인하였으므로, MIF에 대한 면역반응 증가로 인해 종양 내 침투된 면역세포의 활성이 증가하였는지 확인하고자 종양과 비장 조직 내 활성화된 면역세포를 유세포 분석으로 측정하였다.
종양 조직과 비장 조직 내 침투한 IFNγ-분비 TCRγδ T 세포의 비율은 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 처리에 의해 증가하였다. IFNγ-분비 TCRγδ T 세포는 T 세포의 성숙과 활성화를 유도하는 subset으로 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 처리에 의해 증가한 IFNγ-분비 TCRγδ T 세포는 다른 T 세포의 활성화를 유도할 것으로 기대되었다(도 37a).
PanO2-이식 마우스 모델에서 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 처리한 마우스의 종양과 비장 조직에서 IFNγ-분비 CD4 보조 T 세포와 TNFα-분비 CD4 보조 T 세포가 아무 처리 하지 않은 마우스에 비하여 증가하였다(도 36b 및 36c). 또한 비장 조직 내 IFNγ과 TNFα을 분비하는 CD4 보조 T 세포와 세포독성 CD8 T 세포가 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 처리한 마우스에서 증가하였다(도 36d).
이러한 결과를 통하여 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 주입에 의해 PanO2-이식 마우스에서 T 세포 성숙과 활성화를 유도하는 IFNγ-분비 TCRγδ T 세포가 증가하였고, 이로 인해 종양세포를 직접적으로 죽일 수 있는 사이토카인인 IFNγ과 TNFα을 분비하는 CD4 보조 T 세포가 종양 조직과 비장조직 내 증가하였음을 확인하였다.
LLC-이식 마우스 모델에서 M. smegmatis-pMyong2-hMIF::IL7을 주입하였을 경우 인간MIF에 대한 체액성 면역반응과 세포성 면역반응이 모두 증가함을 확인하였다. MIF에 대한 면역반응 증가로 인해 종양 내 침투한 면역세포의 활성이 증가하였는지 확인하고자 종양과 비장 조직 내 활성화된 면역 세포를 유세포 분석으로 측정하였다.
종양 조직 내 침투한 IFNγ-분비 CD4 보조 T 세포와 세포독성 CD8 T 세포 그리고 TNFα-분비 CD4 보조 T 세포가 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 처리에 의해 증가하였으며 (도 38a), 또한 비장 조직 내 IFNγ과 TNFα을 분비하는 CD4 보조 T 세포와 세포독성 CD8 T 세포 역시 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 처리한 마우스에서 증가하였다(도 38b 및 38c).
이러한 결과를 통하여 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 주입에 의해 LLC-이식 마우스에서 종양세포를 직접적으로 사멸시킬 수 있는 사이토카인인 IFNγ과 TNFα을 분비하는 CD4 보조 T 세포와 세포 독성 CD8 T 세포가 종양 조직과 비장조직 내 증가하였음을 확인하였으며, 이를 통해 MC38-이식 마우스 모델에서 확인하였던 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 주입에 의한 MIF에 대한 면역반응 증가와 종양과 비장 조직 내 활성화된 면역세포의 증가는 다양한 암세포주 PanO2와 LLC에 대해서도 동일한 항암효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
MC38 이식 마우스 모델에서 분리한 혈청의 MIF 활성 저해 능력 확인
MC38 암세포주 이식 마우스 모델에서 분리한 혈청을 이용하여 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7의 MIF 활성 저해 능력을 확인하고자 하였다. 마우스에서 분리한 혈청을 MC38 세포주 배양을 위한 DMEM 배지에 50% 넣은 후 48시간, 72시간째에 표면의 MIF 수용체인 CD74 발현을 유세포분석 방법으로 확인하였다. 또한 마찬가지의 실험에서 배양 24시간째에 세포 내 MIF 다운스트림 신호 단백질의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 측정하였고, 7AAD/아넥신 V 아폽토시스 어세이를 통해 MIF 활성 저해에 따른 세포 생장 억제능을 조사하였다.
혈청 내 MIF의 생물학적 활성 정도를 토토머라제 어세이를 통해 측정하였을 때 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 군의 혈청에서 M. smegmatis 야생형에 비하여 MIF의 활성이 감소하였음을 확인하였다(도 39a).
혈청을 포함한 배지에서 배양한 MC38 세포는 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7에서 분리한 혈청에 의해 배양 48시간, 72시간째에 세포 표면의 MIF 수용체인 CD74의 발현이 BCG와 M. smegmatis 야생형을 처리한 경우에 비하여 현저히 감소하였다. 이는 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 주입에 의해 마우스 혈청 내 MIF의 수치 감소와 MIF에 대한 체액성 면역반응 증가로 인해 MC38 세포주 배양액의 MIF 양이 줄어들었으며, 이로 인해 MC38의 수용체 발현 증가가 저해된 데에 기인하는 것으로 보인다(도 51a).
또한 동일한 방식의 실험에서 세포 내 MIF 관련 암세포의 증식 및 전이와 관련된 단백질 발현을 확인하자, M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 군의 혈청을 처리한 경우 M. smegmatis 야생형에 비하여 감소한 것을 관찰할 수 있었다. 이는 또한 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 군의 혈청에 의해 MC38 세포 배양액의 MIF 양이 줄어듦으로 인해 암세포 생장에 대한 단백 발현이 저해된 것으로 생되었다(도 39b).
또한 7AAD/아넥신 V 아폽토시스 어세이 결과 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 군의 혈청을 처리한 경우 BCG와 M. smegmatis 야생형의 경우에 비하여 아폽토시스된 MC38 세포가 증가함을 확인하였다. 마찬가지로 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 혈청의 MIF 활성 저해 능력으로 인해 감소한 세포 배양액의 MIF가 MC38 세포의 아폽토시스를 증가시켰을 것으로 생각되었다(도 39c).
이러한 결과를 통하여 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 주입에 의해 증가한 MIF에 대한 체액성 면역반응은 직접적으로 MIF의 활성을 감소시킴으로써 암세포의 생장과 생존을 떨어뜨린다는 것을 알 수 있었다.
M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 주입에 의해 마우스 혈청에서 증가한 MIF에 대한 체액성 면역반응으로 인해 MC38 세포주의 이동과 침윤 능력을 확인함으로써 암세포의 생장 뿐만 아니라 암세포의 전이를 저해하는 능력을 확인하고자 하였다. 이동 어세이와 침윤 어세이를 위해 각 MC38 세포 배양액에 MC38-이식 마우스의 혈청을 각각 50% 및 20% 첨가하여24시간 동안 세포를 배양한 결과, BCG와 M. smegmatis 야생형에 비해 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 을 처리한 군의 혈청에 의해 암세포의 이동과 침윤 능력이 현저히 저해됨을 확인하였다(도 52). 이를 통해, M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7는 세포 배양액의 MIF 활성을 감소시킴으로써 MC38 세포의 생장을 억제하고 이동 능력을 저해하여 궁극적으로 암의 전이를 억제할 수 있음을 확인하였다.
MC38 이식 마우스 모델에서 분리한 종양 조직 내 단백질과 RNA 발현 확인
MC38 암세포주 이식 마우스 모델에서 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7에 의한 종양 조직 내 단백질 및 RNA 발현 변화를 측정하고자, MC38 종양 조직을 균질화한 다음 세포 내 단백을 추출하고 Trizol 시약을 이용하여 종양 조직 내 RNA를 추출하였다. 단백질은 정량 후 웨스턴 블롯으로 암세포 생장과 전이와 관련된 단백질 발현을 확인하고, RNA는 cDNA 합성 후 RT-qPCR을 통해 세포 생장과 아폽토시스, 혈관신생 및 전이와 관련된 전사인자의 발현을 확인하였다.
종양 조직 내 단백질 발현량을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과, MIF에 직접적으로 활성화되는 PI3K(Phosphoinositide 3-kinase)/Akt(protein kinase B) 경로가 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 을 처리한 군에서 가장 감소함을 확인하였으며, 또한 암세포 전이와 관련된 MMP-2와 MMP-9 단백질의 발현이 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 을 처리한 군의 종양 조직에서 가장 감소하였음을 확인하였다(도 41a).
또한 종양 조직의 RNA 발현을 RT-qPCR을 이용해 확인할 결과, PI3K/Akt pathway와 관련한 세포 생장, 대사와 관련한 RNA 발현이 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 을 처리한 군의 종양 조직에서 가장 현저하게 줄어들었음을 확인함. 뿐만 아니라, 암세포의 아폽토시스와 혈관신생 및 전이와 관련한 전사인자가 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7을 처리한 군의 종양 조직에서 가장 현저하게 감소하였다(도 41b).
이러한 결과를 통해 볼 때 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 처리에 의해 MC38-이식 마우스 의 종양에서 MIF와 관련한 PI3K/Akt 신호경로의 단백질과 RNA 발현, 그리고 암세포 혈관신생과 전이에 관련된 RNA의 발현이 감소하여 종양 조직의 성장이 저해되었을 것으로 생각되었다.
항-PD-L1 과 병용 투여 시 항암 효능
MC38 암세포주 이식 마우스 모델에서 상용화된 항암제인 항-PD-L1(항-마우스 PD-L1 B7-H1, InvivoMab, catalog# BE0101)과의 병용 효과를 관찰하였다. 이전과 동일한 방식으로 마이코박테리아를 암세포 주입 후 3일, 7일, 14일째 주입하였으며 항-PD-L1의 경우 암세포 주입 후 7일, 14일째 복강 주사로 2회 주입하였다. 이후 종양 조직의 크기와 적출 시 무게, 혈청 내 MIF 수치 변화를 측정하였다.
그 결과, 항-PD-L1과 병용 투여 시 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7을 단독 투여한 경우에 비하여 암 성장이 현저히 저해되었으며 암 적출 시 종양의 무게 또한 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7과 항-PD-L1을 단독 투여한 경우에 비하여 병용 투여 시 크게 감소하였음을 확인하였다(도 42a).
또한 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7을 단독 투여 시 혈청 내 MIF에 대한 체액성 면역반응이 증가하였고 이러한 면역반응은 항-PD-L1과 병용 투여 시 더욱 효과적으로 증가하는 것을 확인하였을 뿐 아니라, 혈청 내 염증성 사이토카인 농도는 M.smegmatis-pMyong2_hMIF: :IL7을 단독으로 투여한 경우에 비하여 항-PD-L1과 병용 투여 시 효과적으로 증가하였으며, 혈청 내 MIF의 농도는 병용 투여 시 변화가 가장 적음을 확인하였다(도 42b). 따라서 혈청 내 MIF 농도는 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7와 항-PD-L1을 병용 투여 시 가장 낮아지며, 혈청 MIF의 생물학적인 활성, 즉 토토머라제 활성 또한 병용 투여 시 가장 낮음을 알 수 있었다(도 42c).
이러한 결과를 볼 때, 이전에 관찰되었던 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 단독 투여로 인한 암 성장 저해 효능과 혈청 내 MIF에 대한 면역반응은 상용화된 항암제 항-PD-L1 과 병용 투여 시 그 효과가 극대화된다는 것을 확인하였다.
다음으로 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7과 항-PD-L1과의 병용 투여로 인한 종양 조직 내 세포성 면역반응의 활성화 정도를 확인하고자 종양 조직을 분리하여 유세포분석을 통해 사이토카인을 분비하는 T 세포를 측정하였다. 앞선 실험과 동일하게 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7을 단독 투여 시 종양 조직 내 침투한 면역세포 중 항암 효능이 있는 사이토카인 IFNγ와 TNFα을 분비하는 CD4 보조 T 세포와 세포 독성 CD8 T 세포의 비율이 증가하였으며 이러한 효과는 항-PD-L1과 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7을 병용투여 시 더욱 증가하였다(도 43a).
위의 실험 결과들을 종합해볼 때, M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7을 단독 투여 시 관찰되었던 MIF에 대한 면역반응 증가와 종양 내 사이토카인을 분비하는 면역세포의 증가는 현재 상용화된 항암제 항-PD-L1과 병용 투여 시 더욱 효과적으로 증가함을 알 수 있었다.
재조합 균주를 감염한 면역 세포에 의한 MC38에 대한 세포독성 확인
M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7를 감염시킨 수지상세포와 비장에서 BD Aria를 이용해 분리 한 naive CD8 T 세포를 각 4일간 공배양함하였다(수지상세포 : T 세포 = 1 : 10). 이후 MC38 암세포를 T 세포와 1:5 비율로 2일간 공배양하여 7AAD/아넥신V 아폽토시스 어세이를 이용하여 재조합 균주에 감염된 면역세포의 암세포에 대한 세포독성 능력을 확인하였고, 동일한 시점에서 면역세포의 사이토카인 발현 정도를 비교하였다.
M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7를 감염한 수지상세포와 CD8 T 세포를 공배양한 경우 다른 재조합 균주에 비하여 MC38 암세포의 죽은 세포의 비율이 가장 증가한 것으로 보아 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7는 hMIF와 hIL7의 각각의 단일 단백질을 도입한 재조합 균주에 비하여 암세포에 대한 세포 독성이 보다 효과적으로 유도됨을 확인하였다(도 44a).
또한 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7에 의해 유도된 암세포에 대한 세포독성능은 면역세포의 사이토카인 발현을 통해 확인되었다. 즉, M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 감염된 면역세포의 경우 다른 재조합 균주를 감염한 경우에 비하여 암세포와 공배양시 항암효능을 가지는 IFNγ와 TNFα를 분비하는 면역세포의 비율이 가장 높게 나타났으며 이로 인해 암세포가 가장 많이 사멸되었음을 알 수 있었다(도 44b).
감염된 면역세포와 암세포와의 공배양액에서 MIF의 농도를 ELISA를 통해 확인한 결과 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7를 감염시킨 경우 다른 재조합 균주에 비해 현저히 MIF의 농도가 감소함을 확인하였다(도 44c). 이는 M. smegmatis-pMyong2_hMIF::IL7 감염으로 인해 사멸된 암세포의 비율이 증가하여 암세포에서 유래 MIF의 양이 감소하였던 때문으로 생각된다(도 44c).
다양한 암세포주에 대한 항암효과 관찰
전술한 실시예에서 확보한 재조합 균주들의 항암효과를 인 비트로에서 확인하고자, 인간 및마우스 유래 다양한 암세포(인간 유래 간암세포인 Huh7과 HepG2, 마우스 췌장암 세포인 PanO2, 마우스 폐상피세포인 TC-1, 마우스 폐암 세포인 LLC, 마우스 흑색종 세포인 B16F10)에 본 발명의 재조합 균주를 감염시킨 후 암세포의 대사활성을 MTS 세포증식 어세이 킷(Promega, USA)으로 측정함으로써 재조합 균주의 암세포에 대한 독성을 평가하였다.
그 결과, Huh7, HepG2, TC-1, PanO2, LLC, B16F10 세포주 모두에서 pMyong2 벡터가 형질전환된 재조합 균주가 pMV306 벡터가 형질전환된 재조합 균주보다 암세포에 대한 세포독성능이 우수함을 확인하였다(도 45). 이러한 특성은 앞서 관찰된 재조합 균주의 성능에서 확인된 바와 같이 pMyong2-TOPO 벡터가 pMV306 벡터 보다 인간 MIF와 인간 IL-7의 발현량이 월등히 높기 때문인 것으로 생각되며, 각 단백질 단복 발현의 경우보다 인간 MIF와 인간 IL-7가 융합된 형태로 발현될 경우 현저한 상승효과가 나타남을 다양한 암세포를 이용하여 다시한번 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> CLIPS BnC <120> Novel Recombinant Mycobacterium smegmatis and Use Thereof <130> PDPB214201k01 <150> KR 10-2021-0036586 <151> 2021-03-22 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6412 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMyong2 plasmid <400> 1 agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60 acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120 tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180 ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcttg 240 gtaccgagct cggatccact agtaacggcc gccagtgtgc tggaattcgc ccttaagctt 300 aggcgggcaa cacgacatct caatagttgg cacggagctc ctaaacgacg acagccccgc 360 taatgcgggg ccgcaacgtc gatttggctc tacttcgtct ctggagtttc gtctctggag 420 tttcaggtcc gagcggctaa ctcggtccta ggcgtctccc gtgccgcgcc cccgaaggga 480 cagtcttgct ggactggtct cacggtagcg catacccgaa tcagattcgt ggtgacgcgc 540 aaaaccgtga tctcacattt acagattccc gtgcatccgt gtgcacggat tcacgcccat 600 ctgggcattc acgtggccgt tttggtgcct 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gggcggcgaa ccgcgctgat 1500 cgccggcctg gagcagggcc atatcggggc catctgcgac gcgatcacga cggccggcat 1560 cgacgcgacc gcctggactc cgaagacgct cacggcggca ctgaacgccg acgcgcgggt 1620 gaccggctgg tcgtggccgg atcgcatcga acgtcctggc gcgttcctgg cgtcgcggct 1680 gcgccgcctg cccgcacggc ccgacaccag tggcccggtt gacaacggcc tggatcaggc 1740 ccgtaggaca cccgttgagc cgtcagcggc ccgtgtagcg ccggtacaga cggccgctgg 1800 ccgcgcgtac gcccgtgcgt tgttcgccga gcagcgacgg caccgggtga ccgccgccaa 1860 tgcccagtca gccgcggtgc cggtgcgcca aagtgcgcca gaaaccgcgg tgtgcgcaac 1920 gtgcggatgc tcggacgcac cacggcggcg gttcctgcca acgcggcggg ctcacatttg 1980 cgatgcctgt ttccaaggat gtggtggtgg gcaggcgcgt actggtcgcg tcggaacggt 2040 cggcagcagt tccgcggtgc cacagtgcca gtagtcgggc agggcttgca cggggatgcg 2100 gacccatccg ccggccgcgg ccggcgatgg gtccagtgtc gcgttagggc cgtcgtccag 2160 ccgcgccagc tcgcggtcgg atgcgatcag cttggcaccg tagatgtcgt cgtggcggcg 2220 gtcccacgtg ttggtgatgc ggtcgcggta ccagcctgtc cagtcttcgc cggtgccgcc 2280 ggcggtgagc ccggcccggt accacgcttc gaggcgatca cggccccgtg cgtggttgat 2340 ggtctgggcc gcagcccagt ccgcgtcacg gagggctctg tcggcttcgt ccatgaaccc 2400 gcgccgggtc atgtcgatga tggctggcga cggggcgtcg taggggcctg gcatgggcgg 2460 aggcagtcgg aactgttgcg gtttgcttgc gttcagttcc tcgtcctgct ggtgggtgcg 2520 gtcgtgcagg gcaaggctgt cgcggtacca ggcgtcgagc gcggtgcgcc agtccccgcc 2580 agtggcgtag ggctcccacg gttgcggtgg cagggtggtg aactcgtgca ggaccaggcc 2640 gtcgatgtcg tcgcgcagtt cttcaccggc gatggcggcg atgcgggcgc agtagccggg 2700 cagatggcta cgccagtcgg cgggcagttc gccgctgcgc gcccaccgca gcacatcggc 2760 ccacaacccc catggaaggg cgaattctgc agatatccat cacactggcg gccgctcgag 2820 catgcatcta gagggcccaa ttcgccctat agtgagtcgt attacaattc actggccgtc 2880 gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca 2940 catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa 3000 cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg 3060 gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt 3120 tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc 3180 gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg 3240 attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga 3300 cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc 3360 ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa 3420 aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaattcag ggcgcaaggg 3480 ctgctaaagg aagcggaaca cgtagaaagc cagtccgcag aaacggtgct gaccccggat 3540 gaatgtcagc tactgggcta tctggacaag ggaaaacgca agcgcaaaga gaaagcaggt 3600 agcttgcagt gggcttacat ggcgatagct agactgggcg gttttatgga cagcaagcga 3660 accggaattg ccagctgggg cgccctctgg taaggttggg aagccctgca aagtaaactg 3720 gatggctttc ttgccgccaa ggatctgatg gcgcagggga tcaagatctg atcaagagac 3780 aggatgagga tcgtttcgca tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc 3840 ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc 3900 cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc 3960 cggtgccctg aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta 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cggtattatc ccgtattgac 4860 gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac 4920 tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct 4980 gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg 5040 aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg 5100 gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca 5160 atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa 5220 caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt 5280 ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc 5340 attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg 5400 agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt 5460 aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt 5520 catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc 5580 ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct 5640 tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 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ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg 4560 gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaatt 4620 cagggcgcaa gggctgctaa aggaagcgga acacgtagaa agccagtccg cagaaacggt 4680 gctgaccccg gatgaatgtc agctactggg ctatctggac aagggaaaac gcaagcgcaa 4740 agagaaagca ggtagcttgc agtgggctta catggcgata gctagactgg gcggttttat 4800 ggacagcaag cgaaccggaa ttgccagctg gggcgccctc tggtaaggtt gggaagccct 4860 gcaaagtaaa ctggatggct ttcttgccgc caaggatctg atggcgcagg ggatcaagat 4920 ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag 4980 gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg 5040 gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca 5100 agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc 5160 tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg 5220 actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatcccac cttgctcctg 5280 ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta 5340 cctgcccatt cgaccaccaa 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Claims (12)

  1. MIF(macrophage migration inhibitory factor) 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산분자; IL-7(interleukin-7) 또는 이의 기능적 일부를 인코딩하는 핵산분자; 또는 이들의 조합을 포함하는 마이코박테리아(mycobacteria)-유래된 복제가능(replicable) 플라스미드.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 플라스미드는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 복제 개시점(Origin of replication) 및 hsp65 또는 hsp60 유전자의 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 플라스미드는 도 1a에 개시된 pMyong2 플라스미드인 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 플라스미드는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 플라스미드를 포함하는 재조합 마이코박테리움 균주.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 마이코박테리움은 마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis), 마이코박테리움 보비스 BCG(M. bovis BCG), 마이코박테리움 아비움(M. avium), 마이코박테리움 플레이(M. phlei), 마이코박테리움 포튜이튬(M. fortuitum), 마이코박테리움 루푸(M. lufu), 마이코박테리움 파튜버큘로시스(M. partuberculosis), 마이코박테리움 하바나(M. habana), 마이코박테리움 스크로퓰라세움(M. scrofulaceum) 또는 마이코박테리움 인트라셀룰라레(M. intracellulare)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 균주.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 마이코박테리움은 마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis)인 것을 특징으로 하는 균주.
  8. 제 5 항의 균주를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 암은 전이암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 조성물은 시스플라틴(cisplatin) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 조성물은 면역관문 억제제(Immune checkpoint inhibitor)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 항-PD-L1 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
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