CN114929266A - 使用新表位编码构建体的核酸疫苗接种 - Google Patents

使用新表位编码构建体的核酸疫苗接种 Download PDF

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Abstract

本公开提供了靶向癌症的DNA疫苗接种的新型手段和方法。具体而言，提供了使用包含编码新表位的区域的基于质粒的疫苗进行抗癌疫苗接种的方法。

Description

使用新表位编码构建体的核酸疫苗接种
技术领域
本发明涉及癌症疗法，特别是癌症免疫治疗。具体而言，本发明涉及通过核酸疫苗接种治疗癌症的方法和产品。
技术背景
对患者恶性肿瘤的治疗常规地集中于通过手术、放射疗法和/或化学疗法根除/去除恶性组织，所述化学疗法在剂量方案中使用细胞毒性药物，其目的在于与杀死非恶性细胞相比优先杀死恶性细胞。
除了使用细胞毒性药物之外，最近的方法集中于靶向癌细胞中的特定生物标志物，以减少经典化学疗法产生的全身性副作用。靶向癌症相关抗原的单克隆抗体疗法已在许多恶性肿瘤被证明在延长预期寿命方面相当有效。尽管是成功的药物，但靶向癌症相关抗原的单克隆抗体在其本质上只能被开发成靶向已知的并出现在多个患者中的表达产物，这意味着绝大多数癌症特异性抗原不能通过这种类型的疗法来应用，因为大量癌症特异性抗原仅出现在单个患者的肿瘤中，参见下文。
早在20世纪50年代末，Burnet和Thomas提出的免疫监视理论认为，淋巴细胞可以识别并清除展示改变的抗原决定簇的自体细胞(包括癌细胞)，如今人们普遍接受免疫系统在很大程度上抑制了癌症发生。然而，免疫监视并不是100％有效的，设计其中寻求提高/刺激免疫系统根除癌细胞的能力的癌症疗法是一项持续的任务。
一种方法是诱导针对癌症相关抗原的免疫，但即使这种方法可能有前途，它也具有与抗体疗法相同的缺点，即只能针对有限数量的抗原。
许多(如果不是全部的话)肿瘤表达突变。这些突变可能产生新的可靶向的抗原(新抗原)，如果有可能在临床相关时间范围内鉴定新抗原及其抗原决定簇，则新抗原可能用于特异性T细胞免疫疗法。由于利用现有技术可以对细胞基因组进行全序列分析，并分析改变的或新的表达产物的存在，因此可以设计基于新抗原的个性化疫苗。然而，迄今为止，提供令人满意的临床终点的尝试基本上都失败了。
自20世纪90年代早期以来已经被详细研究的一种疫苗接种模式是核酸疫苗接种(也称为DNA疫苗接种)，其中将DNA以非病毒质粒的形式向哺乳动物的体细胞施用，导致包含在质粒中的基因的表达；在DNA疫苗接种中，编码的物质是一种或多种免疫原性多肽，其在由体细胞产生后将能够诱发免疫反应。这种方法很有吸引力，因为其避免了使用昂贵的重组表达系统生产临床级纯度的蛋白质免疫原的需要。然而，已经证明很难从施用的DNA中获得足够高的表达水平以在人体中实现令人满意的免疫反应。
因此，需要提供抗癌疫苗，特别是核酸疫苗，其可以有效地靶向新抗原并在接种的人类中诱导临床上显著的免疫反应。
发明目的
本发明实施方案的一个目的是提供用于核酸疫苗接种以治疗或改善大型哺乳动物诸如人中的癌症的方法和产品。
发明内容
发明人已经发现，用编码癌症的已鉴定的新表位的DNA疫苗质粒免疫小鼠能够提供针对癌症的保护性免疫。
因此，在第一方面，本发明涉及在患者体内诱导针对恶性肿瘤的治疗性或改善性免疫反应的方法，其中恶性肿瘤细胞表达编码含新表位的多肽的遗传物质，该方法包括向患者施用至少一种有效剂量的组合物，该组合物包含：
1)至少一种表达载体，其包含编码至少一种多肽的一种或多种核酸，所述多肽展示所述恶性肿瘤的一种或多种新表位，和
2)药学上可接受的运载体或稀释剂，
由此使患者内的体细胞表达编码所述至少一种多肽的所述一种或多种核酸。
在第二方面，本发明涉及组合物，其包含：
1)至少一种表达载体，其包含编码至少一种多肽的一种或多种核酸，所述多肽展示恶性肿瘤的一种或多种新表位，和
2)药学上可接受的运载体或稀释剂，
即与本发明第一方面的方法中施用的组合物相同的组合物。
在第三和第四方面，本发明分别涉及第二方面的组合物：1)用作药物，和2)用于第一方面的方法中。
附图说明
图1：pVAX1的质粒图谱。
细节提供于实施例和SEQ ID NO:1中。
图2：pVAX1 S16A的质粒图谱。
细节提供于实施例中。
图3：显示ISS在pTVG4中的优选位置的质粒图谱。
图4：显示接种和模拟接种的小鼠中肿瘤体积和T细胞诱导的图。
A：在第0、1、4、7、9、11、14、16、18和21天，在13只接种的和13只模拟接种的BALB/c小鼠中测量的平均肿瘤体积。
B：在第0、1、4、7、9、11、14、16、18和21天的过程中，在13只接种的和13只模拟接种的BALB/c小鼠中测量的肿瘤体积曲线下面积(AUC)。
C：用S16A新肽再次刺激后，在接种的和模拟接种的小鼠中产生细胞因子的脾CD8+T细胞和CD4+T细胞。
D：接种的和模拟接种的小鼠中第1天的C22特异性循环CD8+T细胞。
图5：显示接种的和模拟接种的小鼠中肿瘤体积的图。
A：在第0、1、4、7、9、11、14、16、18和21天，在15只接种的和15只模拟接种的BALB/c小鼠中测量的平均肿瘤体积。
B：在第0、1、4、7、9、11、14、16、18和21天的过程中，在15只接种的和15只模拟接种的BALB/c小鼠中测量的肿瘤体积曲线下面积(AUC)。
C：用S16A新肽再次刺激后，接种的和模拟接种的小鼠中产生细胞因子的脾CD8+T细胞和CD4+T细胞。
D：接种的和模拟接种的小鼠中第9天的C22特异性循环CD8+T细胞。
图6：显示接种的和模拟接种的小鼠中肿瘤体积的图。
A：在用肿瘤细胞接种后的第0、5、7、9、12、14、16和19天，在14只接种的和13只模拟接种的BALB/c小鼠中测量的平均肿瘤体积。
B：在第0、5、7、9、12、14、16和19天的过程中，在14只接种的和13只模拟接种的BALB/c小鼠中测量的肿瘤体积曲线下面积(AUC)。
C：在接种和模拟接种的小鼠中第6天的C22特异性循环CD8+T细胞。
图7：显示接种的、模拟接种的和未接种的小鼠中CD8+T细胞诱导的图。
在用模拟质粒和含有pVAX1 S16A的两种不同疫苗制剂(分别在Tyrode’s缓冲液和PBS中)处理的小鼠中，第13天尾静脉血中C22特异性CD8+T细胞的百分比。
具体实施方式
定义
“癌症特异性”抗原是在个体的非恶性体细胞中不作为表达产物出现，但在个体的癌细胞中作为表达产物出现的抗原。这与“癌症相关”抗原相反，后者也出现在正常体细胞中--虽然丰度低，但在至少一些肿瘤细胞中以更高水平存在。
术语“佐剂”具有其在疫苗技术领域中的通常含义，即它是1)本身不能引发针对疫苗的免疫原的特异性免疫反应，但2)仍能增强针对免疫原的免疫反应的物质或物质组合物。或者，换句话说，用佐剂单独接种不能提供针对免疫原的免疫反应，用免疫原接种可能产生或可能不产生针对免疫原的免疫反应，但是用免疫原和佐剂联合接种能够诱导针对免疫原的免疫反应，该免疫反应强于由免疫原单独诱导的免疫反应。
“新表位”是抗原决定簇(通常是MHC I类或II类限制性表位)，由于缺乏编码新表位的基因，其在个体中不作为正常体细胞的表达产物存在，但其在同一个体中作为突变细胞(诸如癌细胞)的表达产物存在。因此，从免疫学的角度来看，新表位确实是非自体的，尽管其是自体来源的，因此可以被表征为其构成表达产物的个体中的肿瘤特异性抗原。由于是非自身的，新表位具有能够在所述个体中引发特异性适应性免疫反应的潜力，其中引发的免疫反应对含有新表位的抗原和细胞是特异性的。另一方面，新表位对个体而言是特异性的，因为相同的新表位在其他个体中作为表达产物的可能性极小。因此，若干特征将新表位与例如肿瘤特异性抗原的表位形成对比：后者通常存在于多种相同类型的癌症中(因为它们可以是活化癌基因的表达产物)，并且/或者由于一种或多种相关基因在癌细胞中的过表达，它们将存在于非恶性细胞中(尽管量很少)。
“新肽”是在其序列中包含本文定义的新表位的肽(即最多约50个氨基酸残基的聚氨基酸)。新肽通常是“天然的”，即新肽的完整氨基酸序列构成可从个体中分离的表达产物的片段，但是新肽也可以是“人工的”，意思是其由新表位的序列和1或2个附加的氨基酸序列构成，所述附加的氨基酸序列中的至少一个不与新表位天然相关。在后一种情况下，附加的氨基酸序列可以只充当新表位的运载体，或者甚至可以改善新表位的免疫原性(例如，通过促进抗原呈递细胞对新肽的加工，改善新肽的生物半衰期，或者改变溶解性)。
“新抗原”是包含新表位的任何抗原。典型地，新抗原将由蛋白质构成，但是新抗原根据其长度也可以与新表位或新肽相同。
术语“氨基酸序列”是其中由肽键连接的氨基酸残基在肽和蛋白质链中的排列顺序。序列通常按N末端至C末端方向排列。
“接头”是被引入到两个其它氨基酸序列之间，以便在空间上将它们分开的氨基酸序列。接头可以是“刚性的”，意味着其基本上不允许其连接的两个氨基酸序列相对于彼此自由移动。同样，“柔性”接头允许通过接头连接的两个序列相对于彼此基本上自由移动。在含有不止一个新表位的编码的表达产物中，两种类型的接头都是有用的。然而，在本发明中有用的一个特别令人感兴趣的接头具有12个氨基酸残基的序列AEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO:9)。
可由本发明中使用的表达载体编码的其它目标接头列于下表中：
Figure BDA0003699304600000061
Figure BDA0003699304600000071
“免疫原性载体”是免疫原或半抗原可以偶联以便增强针对所述免疫原/半抗原的免疫反应或使得能够引发针对所述免疫原/半抗原的免疫反应的分子或部分。免疫原性运载体在典型情况下是相对大的分子(诸如破伤风类毒素、KLH、白喉类毒素等)，其可与免疫原/半抗原融合或缀合，所述免疫原/半抗原本身并没有足够的免疫原性-通常，免疫原性运载体能够引发针对由所述免疫原和免疫原性运载体构成的组合物质的强T辅助淋巴细胞反应，这又提供了B淋巴细胞和细胞毒性淋巴细胞产生的针对免疫原的增强的反应。最近，大的运载体分子在一定程度上被所谓的混杂T-辅助细胞表位(即被群体中大部分HLA单倍型识别并引发T-辅助细胞淋巴细胞反应的较短肽)所取代。
“T-辅助淋巴细胞反应”是基于肽引发的免疫反应，所述肽能够与抗原呈递细胞中的MHC II类分子(例如HLA II类分子)结合，并且由于T-细胞受体识别所述肽与呈递该肽的MHC II类分子之间的复合物而刺激动物物种中的T-辅助淋巴细胞。
“免疫原”是一种能够在其免疫系统面对免疫原的宿主中诱导适应性免疫反应的物质。因此，免疫原是更大组“抗原”的一个子集，其为可被免疫系统特异性识别(例如，当被抗体结合时，或者，当与MHC分子结合的抗原片段被T细胞受体识别时)，但不一定能够诱导免疫的物质，然而，抗原总是能够引发免疫，这意味着对抗原具有已建立的记忆免疫的宿主将产生针对该抗原的特异性免疫反应。
“半抗原”是小分子，其既不能诱导也不能引发免疫反应，但是如果与免疫原性运载体缀合，则当免疫系统面对半抗原运载体缀合物时，可以诱导识别该半抗原的抗体或TCR。
“适应性免疫反应”是响应于面对抗原或免疫原的免疫反应，其中免疫反应对抗原/免疫原的抗原决定簇是特异性的–适应性免疫反应的实例是抗原特异性抗体产生的诱导或T辅助淋巴细胞或细胞毒性淋巴细胞的抗原特异性诱导/活化。
“保护性、适应性免疫反应”是在受试者中作为对抗原免疫(人工或天然)的反应诱导的抗原特异性免疫反应，其中该免疫反应能够保护受试者免受随后的抗原或包括该抗原的病理学相关因子的攻击。通常，预防性疫苗接种旨在建立针对一种或多种病原体的保护性适应性免疫反应。
“免疫系统的刺激”意指物质或物质的组合物表现出一般的、非特异性的免疫刺激作用。许多佐剂和推定的佐剂(诸如某些细胞因子)都共有刺激免疫系统的能力。使用免疫刺激剂的结果是增强了免疫系统的“警觉性”，这意味着与单独使用免疫原相比，用免疫原同时或随后免疫诱导了显著更有效的免疫反应。
术语“多肽”在本说明书中旨在指2至50个氨基酸残基的短肽、50至100个氨基酸残基的寡肽和超过100个氨基酸残基的多肽。此外，该术语还旨在包括蛋白质，即包含至少一种多肽的功能性生物分子；当包含至少两种多肽时，它们可以形成复合物，可以共价连接，或者可以非共价连接。蛋白质中的所述多肽可以被糖基化并且/或者被脂质化并且/或者包含辅基。
本发明的第一方面的实施方案
在本文公开的方法中，在患者(优选人)中诱导针对恶性肿瘤的治疗性或改善性免疫反应，其中恶性肿瘤的细胞表达编码含新表位的多肽的遗传物质。该方法包括向患者施用至少一种有效剂量的组合物，该组合物包含：
1)至少一种表达载体，其包含编码至少一种多肽的一种或多种核酸，所述多肽展示该恶性肿瘤的一种或多种新表位，和
2)药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂，
由此使患者的体细胞表达编码所述至少一种多肽的所述一种或多种核酸。
表达载体通常并优选包含在质粒中或由质粒构成，但也可以使用其它表达载体。本发明的组合物旨在确保将“裸”DNA(即DNA表达载体，其不是能够实现将该表达载体导入靶细胞的细菌或病毒的一部分)递送至细胞。因此，用于本发明组合物和方法的载体可以是环状或线性的、单链或双链的，并且除了质粒之外，还可以是例如粘粒、小染色体或附加体。
每个编码(和可表达)区可以存在于同一或不同的载体上；然而，应当理解，一个或多个编码区可以存在于单个载体上，并且这些编码区可以在单个或多个启动子的控制下。这意味着表达载体可以为每个编码的新表位编码单独的肽表达产物，或者表达载体可以编码多种肽表达产物，其中至少一些表现出几个编码的新表位，其中至少一些任选被肽接头分开。
换句话说，在一些情况下，仅施用并表达一种单一表达载体，并且该表达载体可以编码多种分开的蛋白质性质的表达产物或少至2种或甚至仅一种表达产物–在这种情况下，仅与编码的新表位是否被令人满意地呈递至免疫系统相关，因此选择它们以单独或组合的表达产物的形式存在无关紧要。在优选实施方案中，表达载体表达至少5种或约5种，诸如至少10种或约10种，至少15种或约15种，至少20种或约20种，至少25种或约25种，至少30种或约30种蛋白质性质的表达产物。也涵盖更高的数量，并且该限制主要由从特定肿瘤中可能识别的新表位的数量来设定。当然不用说，所述一种或多种表达载体中编码的新表位的数量不能超过在该相关恶性组织中发现的新表位的数量。
使用肽接头分隔编码的新表位表达产物提供了表达产物中表位之间的空间分隔。这可以带来若干有利方面：接头可以确保每个新表位以优化的构型呈递给免疫系统，使用合适的接头也可以使针对在由含有多表位的表达产物中一个新表位的C末端和下一个新表位的相邻N末端构成的区域中出现的“连接表位(junctional epitope)”的不相关免疫反应的问题最小化。
编码的肽接头可以是“柔性的”或“刚性的”，参见上面的定义，其中阐述了优选的编码的接头。此外，还包括在一些实施方案中用于本发明的一种或多种接头可以是可切割的，即包括(a)一种或多种内肽酶(例如诸如弗林蛋白酶、胱天蛋白酶、组织蛋白酶等内肽酶)的一个或多个识别位点。
可以以本身已知的方式鉴定由表达载体编码的新表位：对同一个体中恶性细胞的基因组和健康细胞的基因组或标准健康基因组的“深度测序”可以鉴定提供恶性细胞所特有的潜在免疫原性表达产物的表达的DNA区段。随后可对经鉴定的DNA序列进行密码子优化(通常用于人细胞的表达)，并将所述经鉴定的DNA序列(要么作为单独的表达区域，要么作为较大嵌合构建体的一部分)包含在表达载体中。
为了优化待由载体表达的新表位的鉴定和选择，任何可用于此目的的预测方法实际上都是有用的。现有预测算法的一个实例是NetMHCpan-4.0(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan-4.0/；Jurtz V等人，J Immunol(2017),ji1700893；DOI:10.4049/jimmunol.1700893)。该方法基于经典的MS衍生配体和pMHC亲和数据的组合训练的。另一个实例是NetMHCstabpan-1.0(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCstabpan-1.0/；RasmussenM等人，Accepted for J of Immunol,June 2016)。该方法是使用其中在体外合成每种肽并使其与MHC分子复合的测定，根据体外pMHC稳定性测量的数据集训练的。该测定不涉及细胞处理，并且其中测量pMHC稳定性的环境有些人为。该方法通常不如NetMHCpan-4.0准确。美国专利10,055,540描述了使用经典MS检测的配体鉴定新表位的方法。使用类似技术的其它专利申请公布是WO2019/104203、WO2019/075112、WO2018/195357(MHC II类特异性的)和WO2017106638。最后，MHCflurry:(DOI:doi.org/10.1016/j.cels.2018.05.014；https://github.com/openvax/mhcflurry)就像NetMHCpan一样是根据MS检测的配体数据和pMHC亲和力训练的。在最近的出版物Garde C等人，Immunogenetics,DOI:doi.org/10.1007/s00251-019-01122-z中也公开了肽-MHC II类相互作用的预测方法。在该出版物中，从MHCII类洗脱的天然加工的肽被用作训练集的一部分，如果被证实为配体，则指定结合目标值为1，如果为阴性，则指定结合目标值为0。
通常，这些预测系统采用人工神经网络(ANN)：ANN可以识别非线性相关性：非线性相关性的定量不是一项容易的任务，因为很难通过简单的计算来计算。这主要是由于用于描述非线性相关性的参数比用于描述线性相关性的参数多，并且可能在所有特性被共同考虑时首次出现。因此，需要考虑所有的特性，以便捕捉跨特性的依赖性。
为了进一步提高所选编码的新表位提供有效免疫反应的可能性，可以优选使用2019年9月13日提交的欧洲专利申请第19197295.9号和第19197306.4号中公开的技术。这些申请公开了使得能够测定肽与MHC分子之间的结合稳定性，并且使得能够将新表位的MHC结合稳定性确定为新表位检测和选择的一部分的技术。简言之，从稳定性测定中获得的数据例如被用作ANN的训练集的一部分，并且该ANN可以随后根据它们对相关MHC分子的预测结合稳定性对经鉴定的肽进行排序。
当向患者施用核酸疫苗时，患者体内会产生相应的基因产物(诸如所需的抗原)。在一些实施方案中，可以将包含优化的重组多核苷酸的核酸疫苗载体递送至人，以诱导治疗性或预防性免疫反应。
质粒和其它裸DNA载体通常对基因转移到肌肉组织更高效。还报道了通过口服施用将DNA载体递送至粘膜表面的潜力，并且已经利用DNA质粒将基因直接导入除肌肉外的其它组织。DNA疫苗主要通过肌内注射、通过基因枪递送、通过喷射注射(使用诸如PharmaJet的
Figure BDA0003699304600000111
装置等装置)或通过电穿孔引入动物体内；这些施用方式中的每一种都适用于目前公开的方法。导入后，质粒通常以附加体形式保持而不复制。已证明编码蛋白的表达可持续较长时间，从而刺激B细胞和T细胞两者。
在测定本文公开的治疗方法中待施用的载体的有效量时，医生评估载体毒性、待治疗癌症的进展和抗载体抗体的产生(如果有的话)。可以通过单剂量或分剂量施用，通常是一系列时间上分开的施用。在本文公开的方法中，在时间上分开的系列中，每次免疫的有效人剂量介于0.1μg与500mg之间，其中介于0.1μg达载体之间与25mg表达载体之间的剂量是优选的。也就是说，在本文公开的方法的实践中，通常在人中使用介于0.5μg与20mg之间的剂量，剂量通常介于5μg与15mg之间，介于50μg与10mg之间以及介于500μg与8mg之间，特别令人感兴趣的剂量为约0.0001mg、约0.0005mg、约0.001mg、约0.005mg、约0.01mg、约0.05mg、约0.1mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg和约8mg。
具有有效剂量的一系列免疫通常构成一系列2个、3个、4个、5个、6个或更多个剂量。例如，多个(例如>6个)剂量可能是相关的，以便使恶性肿瘤长时间保持检查，并且在这种情况下，疫苗载体中编码的新表位的精确选择可以响应于恶性细胞的基因组和蛋白质组的变化而随时间改变。当恶性细胞产生新的新表位时以及如果恶性细胞产生新的新表位，这些新表位可被方便地包括作为疫苗的靶标。
本文公开的方法中使用的疫苗包含一种或多种表达载体；例如，疫苗可以包含多种表达载体，每个载体能够在哺乳动物细胞中自主表达核苷酸编码区以产生至少一种免疫原性多肽。表达载体通常包括与一个或多个编码区可操作地连接的真核启动子序列，诸如强真核启动子的核苷酸序列。本文的组合物和方法可涉及任何特定真核启动子的使用，并且已知有多种启动子；诸如CMV或RSV启动子。启动子相对于宿主细胞可以是异源的。所用的启动子可以是组成型启动子。所用的启动子可包括增强子区和内含子区以提高表达水平，诸如使用CMV启动子时的情况。
本领域已知的许多质粒可用于生产核酸疫苗。核酸疫苗的合适实施方案采用使用质粒VR1012(Vical Inc.,San Diego Calif.)、pCMVI.UBF3/2(S.Johnston,University ofTexas)、pTVG4(Johnson等人，2006,Vaccine 24(3)；293-303)、pVAX1(Thermo FisherScientific，参见上文和下面的实施例)或pcDNA3.1(InVitrogen Corporation,Carlsbad,Calif.)作为载体。
另外，根据本发明，载体构建体可以有利地包含免疫刺激序列(ISS)。在疫苗载体中使用此类序列的目的是增强针对编码的新表位的T细胞反应，特别是Th1细胞反应，所述反应是由掺入toll样受体TLR3、TLR7-TLR8和TLR9和/或胞质RNA受体(诸如但不限于RIG-1、MDA5和LGP2)的激动剂的佐剂引发的(Desmet等人2012.Nat.Rev.Imm.12(7),479–491)。
采用ISS的一种可能性是通过用具有一般序列NNCGNN的六个碱基的未甲基化的富含CG的基序(所谓的CpG基序)(其在细菌DNA中的频率为在哺乳动物DNA中的20倍)(要么作为直接施用的小的合成DNA寡聚物(ODN)(其包含部分或完全硫代磷酸酯化的主链)，要么通过在DNA载体主链中掺入CpG基序)刺激来模拟细菌感染激活TLR9。免疫刺激性CpG可以是DNA主链的一部分或者集中在ISS中，其中一个或多个CpG序列通常位于新表位编码序列中的终止密码子与poly-A尾编码序列之间(即ISS位于终止密码子和多腺苷酸化信号之间)。然而，由于CpG序列发挥作用与其在较长DNA分子中的位置无关，原则上它们的位置可处于疫苗载体中的任何位置，只要CpG基序的存在不干扰载体表达疫苗抗原编码区的能力即可。
如果作为单独的ODN存在于疫苗中(其中ODN起免疫佐剂的作用)，则通常通过选择的递送技术将含有CpG基序的寡核苷酸与DNA疫苗一起共施用/配制，并且所述CpG基序通常将构成包含序列NNCGNN或反向互补序列的DNA的六聚体或更长的多聚体。用于此目的的有用的ODN例如可从InivoGen,5Rue Jean Rodier,F-31400,Toulouse,France商购获得，InivoGen销售一系列A类、B类和C类ODN。实例为：
ODN1585(5'-ggGGTCAACGTTGAgggggg-3'),SEQ ID NO:21
ODN2216(5’-ggGGGACGATCGTCgggggg-3’),SEQ ID NO:22
ODN2336(5’-gggGACGACGTCGTGgggggg-3’),SEQ ID NO:23
ODN1668(5’-tccatgacgttcctgatgct-3’),SEQ ID NO:24
ODN1826(5’-tccatgacgttcctgacgtt-3’),SEQ ID NO:25
ODN2006(5’-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’),SEQ ID NO:26
ODN2007(5’-tcgtcgttgtcgttttgtcgtt-3’),SEQ ID NO:27
ODNBW006(5’-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’),SEQ ID NO:28
ODN D-SL01(5’-tcgcgacgttcgcccgacgttcggta-3’),SEQ ID NO:29
ODN2395(5’-tcgtcgttttcggcgcgcgccg-3’),SEQ ID NO:30
ODN M362(5’-tcgtcgtcgttcgaacgacgttgat-3’),SEQ ID NO:31
ODN D-SL03(5’-tcgcgaacgttcgccgcgttcgaacgcgg-3’),SEQ ID NO:32
在这12种ODN中，大写核苷酸是磷酸二酯，小写核苷酸是硫代磷酸酯，下划线表示回文序列。
当CpG序列存在于质粒主链中时(其因此成为“自我佐剂化”)，根据本发明，可以存在任何数量的可能的NNGCNN或NNCGNN序列，其要么作为CpG基序的相同序列存在，要么以CpG基序的不同序列的形式存在，要么以可以形成茎环结构的回文序列的形式存在。例如，以下CpG基序是令人感兴趣的：AACGAC和GTCGTT，以及CTCGTT和GCTGTT。使用此类CpG编码序列的一个实例是以下从商购可得的pTVG4疫苗载体主链选择的序列(以其整体示意性地显示在图3和SEQ ID NO:34中)：
…agatctaacgacaaaacgacaaaacgacaaggcgccagatctggcgtttcgttttgtcgttttgtc gttagatct…(SEQ ID NO:33)，其中加以下划线的核苷酸构成了存在于pTVG4质粒载体序列中的CpG。
另一种可能性是通过添加双链(ds)RNA来模拟RNA病毒感染以激活TLR3，所述双链(ds)RNA可以是合成的RNA寡核苷酸，诸如Poly I:C(聚肌苷酸-聚胞苷酸)、poly IC:U12(尿苷取代的poly I:C)，或者呈合成RNA寡核苷酸(ORN)的形式；就ODN方法而言，将这些RNA分子添加到疫苗中是获得佐剂作用的一种方式。或者，dsRNA可以在DNA载体主链中编码，将在接种后转录成RNA–在这种情况下，DNA疫苗因此编码所述免疫佐剂。这种方法可以包括编码长度长达100个碱基对的发夹RNA的DNA序列，其中该序列是非特异性的。DNA也可以同时包括ODN和编码具有已知序列的ORN；因此，所述DNA都可以转录成能够激活TLR3和/或胞质RNA受体诸如RIG-1、MDA5和LGP2，同时包含激活TLR9的ODN的双链RNA。包含/编码免疫刺激性CpG和dsRNA的特定DNA序列的实例是例如5'-GGTGCATCGA TGCAGGGGGG-3'(SEQ ID NO:35)和5'-GGTGCATCGA TGCAGGGGGG TATATATATA TTGAGGACAG GTTAAGCTCC CCCCAGCTTAACCTGTCCTT CAATATATA TATA-3'(SEQ ID NO:36)(参考：Wu等人2011,Vaccine 29(44):7624-30)。
当ISS存在于DNA疫苗载体中时，将使用CpG基序激活TLR9的方法与激活TLR3和/或胞质RNA受体诸如RIG-1、MDA5和LGP2的免疫刺激性RNA的编码序列的存在相结合是可能的并且是有利的；参考Grossmann C等人2009,BMC.Immunology 10:43 and Desmet等人2012.Nat.Rev.Imm.12(7),479–491。同样，将ORN和ODN作为单独的佐剂(单独或组合)掺入疫苗中可以与将两种类型的ISS掺入DNA疫苗载体中相结合。
如同CpG基序的情况一样，编码免疫刺激性RNA ISS的DNA优选存在于终止密码子与多腺苷酸化信号之间，但也可以存在于载体的任何部分，只要这不损害预期多肽表达产物的产生。
在特别重要的实施方案中，ISS包含在疫苗组合物中，并且在特别重要的实施方案中，这通过掺入免疫活性和药学上可接受量的poly I:C和/或poly IC:U12来实现。Poly I:C由错配的双链RNA(dsRNA)构成，其中一条链是肌苷酸的聚合物，另一条链是胞苷酸的聚合物。Poly IC:U12是poly I:C的变体，其中尿苷被引入Poly I:C链。在该情况下，这两种物质将起免疫佐剂的作用，即它们本身不引发特异性的适应性免疫反应，但能增强针对疫苗抗原(或在本发明的情况下，编码的抗原)的特异性适应性免疫反应的物质。
Poly I:C或poly IC:U12(诸如
Figure BDA0003699304600000161
)将优选存在于组合物中，以达到每次施用有效剂量的表达载体有0.1至20mg的施用剂量；也就是说，调整组合物中存在的量以达到每次施用的此类剂量。优选地，poly I:C或poly IC:U12的施用剂量为每次施用有效剂量的表达载体为0.2至15mg，诸如0.3至12mg、0.4至10mg和0.5至8mg，优选约0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.1mg、1.2mg、1.3mg、1.4mg、1.5mg、1.6mg、1.7mg、1.8mg、1.9mg、2.1mg、2.2mg、2.3mg、2.4mg、2.5mg、2.6mg、2.7mg、2.8mg、2.9mg、3.1mg、3.2mg、3.3mg、3.4mg、3.5mg、3.6mg、3.7mg、3.8mg、3.9mg和4.0mg。特别优选的是在每次施用为0.5至2.0mg的范围内。
核酸疫苗也可以编码包含含有新表位的一种或多种免疫原性多肽的融合产物。也可以使用减毒细菌作为递送系统来递送质粒DNA，该方法适用于口服施用的DNA疫苗。用独立复制的质粒转化细菌，在宿主细胞中减毒细菌死亡后，所述质粒被释放到宿主细胞细胞质中。
可以以任何合适的形式(包括单独的片段、线性化质粒、环状质粒、能够复制的质粒、附加体、RNA等)将DNA疫苗，包括编码所需抗原的DNA，引入宿主细胞。优选地，将基因包含在质粒中。在某些实施方案中，质粒是表达载体。能够表达遗传物质的单个表达载体可以使用标准重组技术产生。
施用途径包括但不限于肌内、鼻内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和口服以及局部、经皮、通过吸入或栓剂或向粘膜组织施用(诸如通过灌洗阴道、直肠、尿道、口腔和舌下组织)。换句话说，施用途径可以选自任一种肠胃外途径，诸如通过肌内途径、皮内途径、经皮途径、皮下途径、静脉内途径、动脉内途径、鞘内途径、髓内途径、鞘内途径、心室内途径、腹膜内途径、鼻内途径、阴道途径、眼内途径或肺部途径；通过口服途径、舌下途径、口腔途径或肛门途径施用；或者局部施用。
典型的施用途径包括肌内、腹膜内、皮内和皮下注射。基因构建体可以通过包括但不限于常规注射器、无针注射装置、“微粒轰击基因枪”或其它物理方法诸如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声波的方式施用。DNA疫苗可通过任何可用于递送DNA的方法来递送，只要该DNA在细胞中表达且所需抗原在该细胞中产生即可。
在一些实施方案中，本文公开的DNA疫苗组合物通过已知的转染试剂或结合已知的转染试剂递送，所述转染试剂为诸如阳离子脂质体、碳氟化合物乳剂、cochleate、小管、金颗粒、可生物降解的微球或阳离子聚合物。cochleate递送媒介物是由磷脂酰丝氨酸、胆固醇和钙组成的稳定磷脂钙沉淀剂；这种无毒和非炎性的转染试剂可以存在于消化系统中。可生物降解的微球包含聚合物，诸如聚(丙交酯-共-乙交酯)，一种可用于生产DNA的微胶囊用于转染的聚酯。基于脂质的微管通常由其边缘相互连接而堆积的螺旋缠绕的两层的脂质组成。当使用小管时，可以将核酸置于其中心中空部分，用于递送和控制释放到动物体内。
DNA疫苗也可以通过微球递送到粘膜表面。生物粘附性微球(Bioadhesivemicrosphere)可以使用不同的技术制备，并且可被定制成粘附于任何粘膜组织，包括在眼、鼻腔、尿道、结肠和胃肠道中发现的那些粘膜组织，提供了疫苗的局部以及全身性受控释放的可能性。将生物粘附性微球应用于特定粘膜组织也可用于局部疫苗作用。在一些实施方案中，粘膜疫苗递送的替代方法是将编码特定蛋白抗原的基因的质粒DNA表达载体直接施用到粘膜表面。
公开的DNA质粒疫苗是根据要使用的施用方式配制的。通常，DNA质粒疫苗是可注射的组合物，它们是无菌的，并且/或者是无热原的并且/或者无颗粒的。在一些实施方案中，优选使用等渗制剂。通常，用于等渗的添加剂可以包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在一些实施方案中，等渗溶液诸如磷酸盐缓冲盐水是优选的；一种优选溶液是Tyrode氏缓冲液。在一些实施方案中，稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，将允许制剂在室温或环境温度下长时间稳定的稳定剂，诸如LGS或其它聚阳离子或聚阴离子加入到制剂中。
本文公开的组合物中的第二成分是药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其优选呈缓冲溶液的形式。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括液体和营养补充剂、电解质补充剂诸如基于林格氏葡萄糖的补充剂等。防腐剂和抗菌剂包括抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。优选防腐剂包括福尔马林、硫柳汞、新霉素、多粘菌素B和两性霉素B。
在优选实施方案中，缓冲溶液是被称为“Tyrode氏缓冲液”的溶液，并且在优选实施方案中，Tyrode氏缓冲液具有140mM NaCl、6mM KCl、3mM CaCl2、2mM MgCl2、10mM 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(Hepes)pH 7.4和10mM葡萄糖的组成。Tyrode氏缓冲液(或替代物)的浓度通常约为35％v/v，但根据悬浮质粒的水含量，浓度可能会有很大变化–因为缓冲液是生理上可接受的，所以其可以构成组合物的任何百分比的水相。
可以包括附加的载体物质，并且其可以包含蛋白质、糖等。此类运载体可以是水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水性运载体的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油和可注射的有机酯诸如油酸乙酯。水性运载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水。
第二方面–疫苗组合物
构成本发明第二方面的疫苗组合物是在本发明第一方面和权利要求中描述的组合物。因此，与本文公开的方法中使用的组合物有关的每一个特征和考虑，在加以必要的修正后，适用于本发明的第二方面的组合物。
本发明的第三和第四以及相关方面
这两个方面是相关的，因为它们涉及第二方面的组合物用于治疗用途，即本发明的第二方面的组合物分别用作药物或用于根据本发明第一方面的方法中。
同样，本发明的第四方面还涵盖第二方面的组合物在第一方面的方法中的用途，以及第二方面的组合物的组分用于制备用于治疗恶性肿瘤的药物组合物的用途。
实施例1
实验疫苗研究
研究的目的是测试本发明的DNA疫苗诱导新肽特异性T细胞并监测疫苗对接种小鼠健康的影响的能力。
用于DNA疫苗接种的质粒在最初的两个实验中基于可从Thermo fisherScientific/Invitrogen获得的商购可得的pVAX1TM载体。在第三实验中，载体主链是pTVG4载体，参考上文。
根据制造商的文件，pVAX1TM是3.0kb的质粒载体，其允许在大肠杆菌(E.coli)中高拷贝数复制，并在大多数哺乳动物细胞中高水平瞬时表达目标编码蛋白。该载体(见图1)包含以下元件：
1)用于在多种哺乳动物细胞中高水平表达的人巨细胞病毒立即早期(CMV)启动子，
2)用于mRNA的高效转录终止和多腺苷酸化的牛生长激素(BGH)多腺苷酸化信号，和
3)用于在大肠杆菌中选择的卡那霉素抗性基因。
pVAX1TM质粒的完整序列示于SEQ ID NO:1中。为了用作所选细胞系中转染和表达的阳性对照，可以使用对照质粒pVAX1TM/lacZ，其序列示于SEQ ID NO:2中。
如下构建pVAX1 S16A：
首先通过小鼠结肠癌细胞系CT26和来自BALB/c小鼠的正常组织样品的全外显子组测序以及通过选择仅在癌细胞中发现的肽来鉴定新肽/新表位。在实验中，评估了小鼠产生有效的针对已鉴定的新表位的抗肿瘤免疫反应的能力。
通过将经密码子优化的(用于在小鼠中表达的)编码肽的DNA连接到pVAX1表达盒中来构建pVAX1 S16A，所述肽含有顺序偶联的5个新表位C22、C23、C25、C30和C38(SEQ IDNOs:11-15)。插入子还包括Kozak共有序列以有效启动翻译。下表列出了实验中使用的编码氨基酸序列：
肽 AA序列 SEQ ID NO:
C22 QIETQQRKFKASRASILSEMKMLKEKR 11
C23 VILPQAPSGPSYATYLQPAQAQMLTPP 12
C25 DTLSAMSNPRAMQVLLQIQQGLQTLAT 13
C30 DGQLELLAQGALDNALSSMGALHALPR 14
C38 RLHVVKLLASALSTNAAALTQELLVLD 15
在第一个实验(EXP0233)中，用质粒pVAX1 S16A在第-13天、第-6天、第1天、第7天和第14天在左胫骨前肌和右胫骨前肌中肌内(i.m.)免疫13只BALB/c小鼠。在第0天，用CT26肿瘤细胞接种小鼠。此外，用CT26肿瘤细胞接种13只模拟接种的BALB/c小鼠对照组。第21天，处死两组小鼠。每个免疫日，施用468.0μl H20和349.1μl Tyrode氏缓冲液的混合物中的总共100μg DNA，每条大腿中施用50μg DNA。
两组小鼠中的肿瘤体积随时间的发展如图4A所示，其中显示了平均肿瘤体积随时间的发展。在图4B中显示了每只测试动物的曲线下面积(AUC),并显示了平均值。接种组的肿瘤生长显著慢于模拟接种组：对于这两组，新表位接种组和模拟接种组第0-21天的AUC值分别为322(SEM＝138)和2712(SEM＝577)。
此外，通过在肽再刺激时测量脾T细胞活化来研究疫苗的T细胞诱导。用对应于S16A五聚体的新表位内容物的27聚体新肽(C22、C23、C25、C30、C38)的混合物重新刺激脾细胞：结果表明，利用100μg pVAX1 S16A新载体DNA的免疫诱导了S16A新表位反应性脾CD8+T细胞(图4C，左图)，显示为在S16A新肽刺激和ICS后是细胞因子产生者，而在来自模拟处理对照的样品中没有细胞因子信号或细胞因子信号很低。利用100μg S16A新载体DNA的免疫也诱导了S16A新表位反应性脾CD4+T细胞(图4C，右图)，显示为在S16A新肽刺激和ICS后是细胞因子生产者。在来自模拟处理对照的对照样品中检测低细胞因子信号或无细胞因子信号。在用裸S16A新载体免疫的小鼠中，从研究第1天(第三次免疫后一天)的尾静脉血中观察到对CT26新肽C22(H-2Kd最小结合剂KFKASRASI)特异的CD8+T细胞(图4D)。
在类似的第二实验(EXP0264)中，在用pVAX1 S16A裸质粒和不含质粒的
Figure BDA0003699304600000211
P188溶液处理的两组(n＝15)BALB/c小鼠中测试pVAX1 S16A的抗肿瘤作用。疫苗组成、剂量、施用途径、CT26接种和动物处死与第一实验相同。
对肿瘤细胞生长的影响(以肿瘤体积测量的)如图5A和图5B所示(分别显示每组15只小鼠随时间的平均肿瘤尺寸和肿瘤体积AUC)。在两组中以AUC表示，pVAX1 16A处理的小鼠表现出明显低于模拟接种的小鼠的生长：接种组的平均AUC为394(SEM＝102)，而模拟质粒处理组的平均AUC为1702(SEM＝439)，中位AUC为1427。
对T细胞诱导的分析(如实验1中进行)揭示了利用100μg pVAS1 S16A新载体的免疫诱导了CD8+T细胞，其在S16A肽混合物刺激下产生细胞因子IFNγ和TNFα(图5C，左图)。在S16A肽混合物刺激后，利用100μg S16A新载体的免疫诱导了相似水平的产生高于背景的细胞因子IFNγ和TNFα的CD4+T细胞(图5C，右图)。
另外，发现在研究第9天，在用pVAX1 S16A新载体免疫的小鼠的尾静脉血中观察到对CT26新肽C22特异的CD8+T细胞。在来自对照免疫小鼠的尾静脉血中未观察到C22特异性CD8+T细胞，参考图5D。
在第三实验(EXP0287)中，S16A五肽编码序列被引入pVTG4载体(参考上文)并在如第一个实验中的设置中测试其抗肿瘤活性：在相对于利用CT26细胞的接种而言第-14天、第-7天、第1天、第7天和第14天免疫14只BALB/c小鼠，并在接种后记录肿瘤体积。从图6A和图6B中显而易见，当与第一实验的未处理对照相比时，这种载体形式也提供了对肿瘤生长的显著抑制，并且如在前两个实验中所观察到的，在第9天，在经处理的小鼠组中发现了从尾静脉血中分离的循环CD8+T细胞。
最后，在第四实验(EXP0372)中，用配制在PBS或Tyrode氏缓冲液中的pVAX1 S16A免疫各组小鼠，或者用模拟质粒免疫各组小鼠。在第0天、第7天、第15天、第21天和第28天施用免疫。在第5天、第13天和第20天收集尾静脉血液。如图7所示，接受两种pVAX1 S16A制剂的接种小鼠在第13天(即在2次免疫后)在循环中表现出C22特异性CD8+T细胞，而模拟免疫的动物则没有出现该现象。
序列表
<110> Evaxion Biotech ApS
<120> 使用新表位编码构建体的核酸疫苗接种
<130> 22220PCT00
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2999
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pVAX1 DNA疫苗载体
<400> 1
gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240
ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600
ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660
aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720
accgagctcg gatccactag tccagtgtgg tggaattctg cagatatcca gcacagtggc 780
ggccgctcga gtctagaggg cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta 840
gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 900
ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 960
attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 1020
gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctac tgggcggttt tatggacagc 1080
aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag gttgggaagc cctgcaaagt 1140
aaactggatg gctttctcgc cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa gctctgatca 1200
agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc 1260
ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc 1320
tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga 1380
cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac 1440
gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct 1500
gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa 1560
agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc 1620
attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct 1680
tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc 1740
caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg 1800
cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct 1860
gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct 1920
tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca 1980
gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga attattaacg cttacaattt 2040
cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tacaggtggc 2100
acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat 2160
atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatagca cgtgctaaaa 2220
cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 2280
atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 2340
tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 2400
ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 2460
ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 2520
cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 2580
gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 2640
gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 2700
acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 2760
gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 2820
agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 2880
tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 2940
agcaacgcgg cctttttacg gttcctgggc ttttgctggc cttttgctca catgttctt 2999
<210> 2
<211> 6050
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pVAX1/LacZ DNA疫苗载体
<400> 2
gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240
ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600
ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660
aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720
accgagctcg gatccactag tccagtgtgg tggaattctg cagatcgaaa cgatgataga 780
tcccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct 840
tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc 900
ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgcttt gcctggtttc cggtaccaga 960
agcggtgccg gaaagctggc tggagtgcga tcttcctgag gccgatactg tcgtcgtccc 1020
ctcaaactgg cagatgcacg gttacgatgc gcccatctac accaacgtaa cctatcccat 1080
tacggtcaat ccgccgtttg ttcccacgga gaatccgacg ggttgttact cgctcacatt 1140
taatgttgat gaaagctggc tacaggaagg ccagacgcga attatttttg atggcgttaa 1200
ctcggcgttt catctgtggt gcaacgggcg ctgggtcggt tacggccagg acagtcgttt 1260
gccgtctgaa tttgacctga gcgcattttt acgcgccgga gaaaaccgcc tcgcggtgat 1320
ggtgctgcgt tggagtgacg gcagttatct ggaagatcag gatatgtggc ggatgagcgg 1380
cattttccgt gacgtctcgt tgctgcataa accgactaca caaatcagcg atttccatgt 1440
tgccactcgc tttaatgatg atttcagccg cgctgtactg gaggctgaag ttcagatgtg 1500
cggcgagttg cgtgactacc tacgggtaac agtttcttta tggcagggtg aaacgcaggt 1560
cgccagcggc accgcgcctt tcggcggtga aattatcgat gagcgtggtg gttatgccga 1620
tcgcgtcaca ctacgtctga acgtcgaaaa cccgaaactg tggagcgccg aaatcccgaa 1680
tctctatcgt gcggtggttg aactgcacac cgccgacggc acgctgattg aagcagaagc 1740
ctgcgatgtc ggtttccgcg aggtgcggat tgaaaatggt ctgctgctgc tgaacggcaa 1800
gccgttgctg attcgaggcg ttaaccgtca cgagcatcat cctctgcatg gtcaggtcat 1860
ggatgagcag acgatggtgc aggatatcct gctgatgaag cagaacaact ttaacgccgt 1920
gcgctgttcg cattatccga accatccgct gtggtacacg ctgtgcgacc gctacggcct 1980
gtatgtggtg gatgaagcca atattgaaac ccacggcatg gtgccaatga atcgtctgac 2040
cgatgatccg cgctggctac cggcgatgag cgaacgcgta acgcgaatgg tgcagcgcga 2100
tcgtaatcac ccgagtgtga tcatctggtc gctggggaat gaatcaggcc acggcgctaa 2160
tcacgacgcg ctgtatcgct ggatcaaatc tgtcgatcct tcccgcccgg tgcagtatga 2220
aggcggcgga gccgacacca cggccaccga tattatttgc ccgatgtacg cgcgcgtgga 2280
tgaagaccag cccttcccgg ctgtgccgaa atggtccatc aaaaaatggc tttcgctacc 2340
tggagagacg cgcccgctga tcctttgcga atacgcccac gcgatgggta acagtcttgg 2400
cggtttcgct aaatactggc aggcgtttcg tcagtatccc cgtttacagg gcggcttcgt 2460
ctgggactgg gtggatcagt cgctgattaa atatgatgaa aacggcaacc cgtggtcggc 2520
ttacggcggt gattttggcg atacgccgaa cgatcgccag ttctgtatga acggtctggt 2580
ctttgccgac cgcacgccgc atccagcgct gacggaagca aaacaccagc agcagttttt 2640
ccagttccgt ttatccgggc aaaccatcga agtgaccagc gaatacctgt tccgtcatag 2700
cgataacgag ctcctgcact ggatggtggc gctggatggt aagccgctgg caagcggtga 2760
agtgcctctg gatgtcgctc cacaaggtaa acagttgatt gaactgcctg aactaccgca 2820
gccggagagc gccgggcaac tctggctcac agtacgcgta gtgcaaccga acgcgaccgc 2880
atggtcagaa gccgggcaca tcagcgcctg gcagcagtgg cgtctggcgg aaaacctcag 2940
tgtgacgctc cccgccgcgt cccacgccat cccgcatctg accaccagcg aaatggattt 3000
ttgcatcgag ctgggtaata agcgttggca atttaaccgc cagtcaggct ttctttcaca 3060
gatgtggatt ggcgataaaa aacaactgct gacgccgctg cgcgatcagt tcacccgtgc 3120
accgctggat aacgacattg gcgtaagtga agcgacccgc attgacccta acgcctgggt 3180
cgaacgctgg aaggcggcgg gccattacca ggccgaagca gcgttgttgc agtgcacggc 3240
agatacactt gctgatgcgg tgctgattac gaccgctcac gcgtggcagc atcaggggaa 3300
aaccttattt atcagccgga aaacctaccg gattgatggt agtggtcaaa tggcgattac 3360
cgttgatgtt gaagtggcga gcgatacacc gcatccggcg cggattggcc tgaactgcca 3420
gctggcgcag gtagcagagc gggtaaactg gctcggatta gggccgcaag aaaactatcc 3480
cgaccgcctt actgccgcct gttttgaccg ctgggatctg ccattgtcag acatgtatac 3540
cccgtacgtc ttcccgagcg aaaacggtct gcgctgcggg acgcgcgaat tgaattatgg 3600
cccacaccag tggcgcggcg acttccagtt caacatcagc cgctacagtc aacagcaact 3660
gatggaaacc agccatcgcc atctgctgca cgcggaagaa ggcacatggc tgaatatcga 3720
cggtttccat atggggattg gtggcgacga ctcctggagc ccgtcagtat cggcggaatt 3780
ccagctgagc gccggtcgct accattacca gttggtctgg tgtcaaaaag cggccgctcg 3840
agtctagagg gcccgtttaa acccgctgat cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc 3900
catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg 3960
tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc 4020
tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg 4080
ctggggatgc ggtgggctct atggcttcta ctgggcggtt ttatggacag caagcgaacc 4140
ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag ccctgcaaag taaactggat 4200
ggctttctcg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca agctctgatc aagagacagg 4260
atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg 4320
ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc 4380
cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg 4440
tgccctgaat gaactgcaag acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt 4500
tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg 4560
cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat 4620
catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca 4680
ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca 4740
ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa 4800
ggcgagcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa 4860
tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc 4920
ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga 4980
atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc 5040
cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg aattattaac gcttacaatt tcctgatgcg 5100
gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atacaggtgg cacttttcgg 5160
ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 5220
ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatagc acgtgctaaa acttcatttt 5280
taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa 5340
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 5400
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 5460
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 5520
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 5580
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 5640
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 5700
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 5760
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 5820
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 5880
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 5940
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 6000
gcctttttac ggttcctggg cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt 6050
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头肽
<400> 3
Gly Ser Gly Gly Gly Ala
1 5
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头肽
<400> 4
Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头肽
<400> 5
Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ala
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头肽
<400> 6
Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ala
20
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头肽
<400> 7
Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 刚性接头肽
<400> 8
Lys Pro Glu Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro
1 5 10
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 刚性接头肽
<400> 9
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
1 5 10
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 刚性接头肽
<400> 10
Ser Ala Cys Tyr Cys Glu Leu Ser
1 5
<210> 11
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 新表位
<400> 11
Gln Ile Glu Thr Gln Gln Arg Lys Phe Lys Ala Ser Arg Ala Ser Ile
1 5 10 15
Leu Ser Glu Met Lys Met Leu Lys Glu Lys Arg
20 25
<210> 12
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 新表位
<400> 12
Val Ile Leu Pro Gln Ala Pro Ser Gly Pro Ser Tyr Ala Thr Tyr Leu
1 5 10 15
Gln Pro Ala Gln Ala Gln Met Leu Thr Pro Pro
20 25
<210> 13
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 新表位
<400> 13
Asp Thr Leu Ser Ala Met Ser Asn Pro Arg Ala Met Gln Val Leu Leu
1 5 10 15
Gln Ile Gln Gln Gly Leu Gln Thr Leu Ala Thr
20 25
<210> 14
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 新表位
<400> 14
Asp Gly Gln Leu Glu Leu Leu Ala Gln Gly Ala Leu Asp Asn Ala Leu
1 5 10 15
Ser Ser Met Gly Ala Leu His Ala Leu Pro Arg
20 25
<210> 15
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 新表位
<400> 15
Arg Leu His Val Val Lys Leu Leu Ala Ser Ala Leu Ser Thr Asn Ala
1 5 10 15
Ala Ala Leu Thr Gln Glu Leu Leu Val Leu Asp
20 25
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 16
Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 17
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 18
Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 19
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 20
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CpG 基序
<400> 21
ggggtcaacg ttgagggggg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CpG 基序
<400> 22
gggggacgat cgtcgggggg 20
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CpG 基序
<400> 23
ggggacgacg tcgtgggggg g 21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CpG 基序
<400> 24
tccatgacgt tcctgatgct 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CpG 基序
<400> 25
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CpG 基序
<400> 26
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CpG 基序
<400> 27
tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 22
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CpG 基序
<400> 28
tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23
<210> 29
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CpG 基序
<400> 29
tcgcgacgtt cgcccgacgt tcggta 26
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CpG 基序
<400> 30
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CpG 基序
<400> 31
tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CpG 基序
<400> 32
tcgcgaacgt tcgccgcgtt cgaacgcgg 29
<210> 33
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pTVG4疫苗载体的片段
<400> 33
agatctaacg acaaaacgac aaaacgacaa ggcgccagat ctggcgtttc gttttgtcgt 60
tttgtcgtta gatct 75
<210> 34
<211> 4099
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pTVG4疫苗载体
<400> 34
tggccattgc atacgttgta tccatatcat aatatgtaca tttatattgg ctcatgtcca 60
acattaccgc catgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg 120
tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg 180
cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata 240
gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc 300
cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac 360
ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg 420
cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc 480
aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc 540
aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc 600
gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct 660
cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga 720
agacaccggg accgatccag cctccgcggc cgggaacggt gcattggaac gcggattccc 780
cgtgccaaga gtgacgtaag taccgcctat agactctata ggcacacccc tttggctctt 840
atgcatgcta tactgttttt ggcttggggc ctatacaccc ccgcttcctt atgctatagg 900
tgatggtata gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca ctccaacggt 960
ggagggcagt gtagtctgag cagtactcgt tgctgccgcg cgcgccacca gacataatag 1020
ctgacagact aacagactgt tcctttccat gggtcttttc tgcagtcacc gtcgtcgacg 1080
gtatcgataa gcttgatatc gaattcacgt gggcccggta ccgtatactc tagagcggcc 1140
gcggatccag atctaacgac aaaacgacaa aacgacaagg cgccagatct ggcgtttcgt 1200
tttgtcgttt tgtcgttaga tctttttccc tctgccaaaa attatgggga catcatgaag 1260
ccccttgagc atctgacttc tggctaataa aggaaattta ttttcattgc aatagtgtgt 1320
tggaattttt tgtgtctctc actcggaagg acatatggga gggcaaatca tttaaaacat 1380
cagaatgagt atttggttta gagtttggca acatatgccc attcttccgc ttcctcgctc 1440
actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 1500
gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 1560
cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 1620
ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 1680
ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 1740
ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 1800
agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 1860
cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 1920
aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 1980
gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 2040
agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 2100
ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 2160
cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 2220
tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 2280
aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 2340
tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 2400
atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactcgggg ggggggggcg ctgaggtctg 2460
cctcgtgaag aaggtgttgc tgactcatac caggcctgaa tcgccccatc atccagccag 2520
aaagtgaggg agccacggtt gatgagagct ttgttgtagg tggaccagtt ggtgattttg 2580
aacttttgct ttgccacgga acggtctgcg ttgtcgggaa gatgcgtgat ctgatccttc 2640
aactcagcaa aagttcgatt tattcaacaa agccgccgtc ccgtcaagtc agcgtaatgc 2700
tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg agcatcaaat 2760
gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa agccgtttct 2820
gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc tggtatcggt 2880
ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg tcaaaaataa 2940
ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat ggcaaaagct 3000
tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca tcaaaatcac 3060
tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga aatacgcgat 3120
cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg aacactgcca 3180
gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg aatgctgttt 3240
tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata aaatgcttga 3300
tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca tctgtaacat 3360
cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg ggcttcccat 3420
acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat ttatacccat 3480
ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt tcccgttgaa 3540
tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacagtttt attgttcatg 3600
atgatatatt tttatcttgt gcaatgtaac atcagagatt ttgagacaca acgtggcttt 3660
cccccccccc ccattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 3720
ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 3780
cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca 3840
cgaggccctt tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc 3900
tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg 3960
gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga 4020
ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat 4080
accgcatcag attggctat 4099
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPG编码序列
<400> 35
ggtgcatcga tgcagggggg 20
<210> 36
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPG编码序列
<400> 36
ggtgcatcga tgcagggggg tatatatata ttgaggacag gttaagctcc ccccagctta 60
acctgtcctt caatatatat ata 83

Claims (29)

1.一种在患者体内诱导针对恶性肿瘤的治疗性或改善性免疫反应的方法，其中所述恶性肿瘤的细胞表达编码含新表位的多肽的遗传物质，所述方法包括向所述患者施用至少一种有效剂量的组合物，所述组合物包含：
1)至少一种表达载体，其包含编码至少一种多肽的一种或多种核酸，所述多肽展示所述恶性肿瘤的一个或多个新表位，和
2)药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂，
由此使所述患者的体细胞表达编码所述至少一种多肽的一种或多种核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂是水性缓冲溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述水性缓冲溶液是Tyrode氏缓冲液。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述Tyrode氏缓冲液具有140mM NaCl、6mM KCl、3mM CaCl2、2mM MgCl2、10mM 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(Hepes)pH 7.4和10mM葡萄糖的组成。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述Tyrode氏缓冲液的浓度为约35％v/v。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含至少一个免疫刺激序列(ISS)。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述ISS是包含至少一个CpG基序的寡脱氧核糖核苷酸(ODN)，并且其中所述ODN优选包含硫代磷酸酯基团。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述ISS是或包含寡核糖核苷酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其包含免疫活性和药学上可接受的量的Toll样受体3(TLR-3)和/或MDA5和/或RIG-1的刺激物，诸如polyI:C和/或polyIC:U12。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述组合物中存在polyI:C或polyI:CU12，从而每次施用有效剂量的所述表达载体达到0.1至20mg的施用剂量。
11.根据权利要求10所述的方法，其中poly I:C或poly I:CU12的所述施用剂量为每次施用有效剂量的所述表达载体为0.2mg至15mg，诸如0.3mg至12mg、0.4mg至10mg和0.5mg至8mg，优选约为0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.1mg、1.2mg、1.3mg、1.4mg、1.5mg、1.6mg、1.7mg、1.8mg、1.9mg、2.1mg、2.2mg、2.3mg、2.4mg、2.5mg、2.6mg、2.7mg、2.8mg、2.9mg、3.1mg、3.2mg、3.3mg、3.4mg、3.5mg、3.6mg、3.7mg、3.8mg、3.9mg和4.0mg。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述有效剂量包含0.1μg至25mg，诸如0.5μg至20mg、5μg至15mg、50μg至10mg以及500μg至8mg，尤其是约0.0001mg、约0.0005mg、约0.001mg、约0.005mg、约0.01mg、约0.05mg、约0.1mg、约0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg和约8mg的所述表达载体。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表达载体表达至少5种或约5种，诸如至少10种或约10种，至少15种或约15种，至少20种或约20种，至少25种或约25种，以及至少30种或约30种新表位。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表达载体对于每种编码的新表位编码单独的肽。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表达载体编码多种肽，其中至少一种肽展示几个编码的新表位，其中至少一些新表位任选地被肽接头分隔。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表达载体还包含或编码至少一种免疫刺激序列(ISS)。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述至少一种ISS或ISS编码序列位于新表位编码序列的终止密码子与多腺苷酸化信号之间。
18.根据权利要求16-17中任一项所述的方法，其中所述至少一种ISS包含在所述表达载体中。
19.根据权利要求16-17中任一项所述的方法，其中所述至少一种ISS编码序列由所述表达载体编码。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述ISS是或包含激活Toll样受体9(TLR-9)的序列，诸如CpG基序。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述ISS编码激活Toll样受体3(TLR-3)和/或胞质RNA受体诸如RIG-1、MDA5和LGP2的RNA序列，诸如形成RNA发夹或构成免疫刺激性RNA序列的RNA序列。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表达载体包含在质粒中或构成质粒。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种有效剂量是一系列剂量，诸如一系列2个、3个、4个、5个、6个或更多个剂量。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者是人类。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述有效剂量通过肠胃外，诸如通过肌内途径、皮内途径、经皮途径、皮下途径、静脉内途径、动脉内途径、鞘内途径、髓内途径、鞘内途径、心室内途径、腹膜内途径、鼻内途径、阴道途径、眼内途径或肺部途径施用；通过口服途径、舌下途径、口腔途径或肛门途径施用；或者局部施用。
26.一种组合物，其包含
1)至少一种表达载体，其包含编码至少一种多肽的一种或多种核酸，所述多肽展示恶性肿瘤的一种或多种新表位，和
2)Tyrode氏缓冲液。
27.根据权利要求26所述的组合物，其为权利要求1-22中任一项所定义的组合物。
28.如权利要求1-22中任一项所定义的组合物，其用作药物。
29.根据权利要求1-22中任一项所述的组合物，其用于根据权利要求1-14中任一项所述的方法。
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