KR102476552B1 - 관용원성 dna 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 예를 들어, 1형 당뇨병의 예방 및/또는 지연에 유용한 플라스미드에 관한 것이다.

Description

관용원성 DNA 백신
본 발명은 항원-특이적 T 세포 반응성을 감소시키기 위한 관용원성 DNA 면역-요법 백신에 관한 것이다.
전통적인 백신 접근법에 따르면, 정제된 단백질/항원은 특이적으로 상기 단백질/항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위해서 사람/환자/동물에 투여된다. 이러한 백신 접근법은 주로 항체 생산에 영향을 미치는 경향이 있지만, 항원의 T 세포 기억을 생성하는 것 외에는 크게 영향을 받지 않는 경향이 있다. 따라서 전통적인 백신 접근법은 T 세포, 특히 CD8+ T 세포의 활성화가 이러한 질환의 원인 인자인 것으로 간주되기 때문에, 예를 들어, 1형 당뇨병 (T1D)과 같이 T 세포 관련 질환의 치료 및/또는 예방에 관하여 적합하지 않은 것으로 간주된다. 관용원성, 단백질-기반 백신을 이용한 실험적 접근법은 질환 관련 T 세포보다는 주로 항체 생산 B 세포를 표적화하였다.
단백질-기반 백신과는 대조적으로, DNA 기반 백신은 보통 특정 항원을 암호화하는 플라스미드이다 - 이들 플라스미드는 숙주의 체내의 세포에 의해 흡수된다 ("트랜스펙션됨"). 그때 이들 트랜스펙션된 숙주 세포는 항원을 생산하고 면역계, 특히 순환 T 세포에 제공하기 위해 항원을 작은 단편 (T-세포 에피토프)로 처리한다. T 세포는 전체 단백질이 아니라 이들 작은 항원 단편만을 검출할 수 있기 때문에, 이 접근법은 특히, 예를 들어, T1D 병리 상태의 주요 구동물질인 CD8+ T 세포 (또는 세포독성 T 세포)에 대한 T 세포 반응의 변형을 우선적으로 유도한다. 따라서, 단백질 백신보다는 DNA 백신이 T 세포 반응을 유도하는데 적합하다. 현재 어떠한 DNA 백신도 인간 사용에 이용할 수 없지만, 수의과 사용에 대해 허가를 받은 세 개의 자극성 플라스미드 DNA 백신이 존재하며, 말 감염성 빈혈 바이러스(Equine Infectious Anemia Virus), 웨스트 나일 바이러스(West Nile Virus), 및 특정 개 암에 대한 면역력을 유도한다.
자극성 DNA 백신과 달리, 관용원성 DNA 면역-요법 백신은 항원에 대한 면역 반응을 활성화시키는 대신, 항원에 대한 면역 반응성을 억제하는 경향이 있다. 이들 백신은 암호화된 항원에 대한 면역력을 자극하지 않거나, 또는 자극의 유형을 변화시키지 않지만 (예를 들어, 알레르기에 대한 항원 둔감화 백신 접종 접근법이 그런 것처럼), 대신에 자가-반응성 T 세포의 고갈, 및/또는 기능 부족, 및/또는 사멸을 유발한다. 그렇게 하기 위해서는, 항원이 동시-자극 또는 염증 효과 없이 면역계에 제공되어야 하며, 그렇지 않으면 자극성 면역 반응을 일으킬 것이다. 면역계에 의해 무시되거나, 또는 면역계에 의해 용인되는 항원을 제공하는 이 접근법은 전신에서 전체 면역 반응을 억제하기 보다는 질환의 특정 메커니즘이 표적화될 것이기 때문에 자가면역 질환을 치료하는데 있어서 가치가 있을 수 있다. 따라서 관용원성 DNA 면역-요법 백신은 원치않는 면역 반응을 조절하는 가벼운 방법이다.
T1D-특이적 관용원성 DNA 면역-요법 백신의 최종 목표는 베타 세포 기능 및 내인성 인슐린 생산을 보존하는 것이다. 이것은 질환의 예방이나 지연 (특히 소아 및 젊은 성인 코호트(cohort)에서 모니터링이 어렵고 삶의 "정상(normalcy)이 주요 환자 구동물질인 경우 소아 및 젊은 성인 코호트에서 가치있음) 또는 최소 모니터링의 "허니문 단계(honey moon phase)"의 연장 및 T1D 진단 후 처음 6개월 동안 종종 일어나는 인슐린 사용을 통해 일어날 수도 있다.
DNA 기반 백신은 안전한 것으로 알려져 있지만, 임상 연구에서 테스트된 (자극성 또는 관용원성) DNA 백신 중 어느 것도, 예를 들어, T1D의 치료를 위한 독립형 접근법으로서 충분한 효능을 갖지 않는다. 해당 분야에 공지된 관용원성 DNA 백신은 효능이 거의 없는 것으로 나타났고 전형적으로 원하는 효과를 유도하기 위해서는 고도의 인공적인 시스템이 필요했다. 따라서 안전성 프로파일을 손상시키지 않고 바람직하게는 불편한 투여 양생법을 필요로 하지 않으면서, 해당 분야에서 크게 증가된 효능을 가진 관용원성 DNA 면역-요법 백신이 필요하다.
본 발명은 인슐린과 같이 세포적으로 보유된된 항원을 동시-발현/암호화하는 다중-시스트론 벡터/플라스미드, 뿐만 아니라 TGF-β, IL-10, 및 선택적으로 IL-2와 같은 분비된 면역 개질제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 플라스미드를 포함하는 DNA 면역-요법 백신, 뿐만 아니라 이러한 약학적 제제 및 이것의 키트에 관한 것이다. 마지막으로 본 발명은 이러한 제품의 약용, 뿐만 아니라 이러한 플라스미드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
플라스미드/DNA 면역-요법 백신은 예를 들어, 1형 당뇨병 (T1D)과 같이, 주로 T 세포 구동된 자가면역 질환의 치료에 있어서 치료적 가능성을 갖는다.
한 양태에서 본 발명은 다음을 암호화하는 플라스미드를 제공한다:
i. 인슐린 항원;
ii. TGF-β; 및
iii. IL-10.
도 1. 원형 플라스미드 지도.
도 2. 도 1의 플라스미드의 벡터 생성물에 대한 mRNA 및 번역된 단백질 지도.
도 3. G30 바늘을 통한 세 개의 주사 계대에 대한 플라스미드 전단 안전성.
도 4. 30℃에서 성장에 의한 플라스미드 체류 표현형의 확인 (17시간 인큐베이션을 사용한 계대 1-50 및 22시간 인큐베이션을 사용한 계대 51-100).
본 발명의 발명자는 단일 프로모터/다중-시스트론 mRNA로부터의 다수의 분비된 사이토카인의 발현을 구동하는 단일 벡터, 뿐만 아니라 세포적으로 보유된 항원을 제공하였다.
단일 세포에서 요법의 모든 구성요소를 암호화하는 단일 벡터를 이용한 DNA 면역-요법 백신 접종은 상이한 벡터로의 세포의 무작위 트랜스펙션이 주어진 특정 트랜스펙션된 세포의 모든 구성요소, 또는 심지어는 임의의 특정 비율의 구성요소의 발현을 보장하지 않기 때문에 각각 단일 구성요소의 발현을 구동하는 별도의 벡터/플라스미드의 혼합물로의 면역-요법 백신 접종보다 훨씬 바람직하다.
단일 다중-시스트론 플라스미드/벡터의 트랜스펙션은 그 결과로 트랜스펙션된 세포 주위에 특이적으로 조작된 국소 환경/미세환경을 초래한다. 이러한 방식으로, 부작용 및 광범위한 면역억제를 유발할 수 있는 고도의 전신적 면역조절물질을 필요로 하지 않으면서 원하는 면역학적 효과를 강화하도록 면역조절물질의 조합이 항원에 추가될 수 있다.
DNA 면역-요법 백신으로 트랜스펙션된 숙주 세포의 면역조절물질 생산의 이러한 국소적 제약은 T 세포 반응의 변형에 대하여 시너지 효과가 있는 매우 강력한 사이토카인 호르몬의 안전한 사용을 허용하지만, 효과를 얻기에 충분히 빈번하게 투여될 수 없고, 및/또는 허용 불가능한 부작용 없이 원하는 반응을 하도록 적정될 수 없다.
예를 들어, 인터류킨-10 (IL-10) 및 형질전환 성장 인자-베타1 (TGF-β1)은 둘 다 나이브(naive) CD4+ T 세포로부터 조절 T 세포 (Treg)를 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다. 하지만, IL-10/TGF-β1 조합은 두 개의 사이토카인 중 하나 단독보다 Treg를 유도하는데 있어서 시너지 효과를 제공하고 (15 내지 20배 더 효과적임) (US6083919 A) 이 조합은 또한 사이토카인 단독보다 표적 세포의 더 광범위한 집단에서 면역 관용을 유도한다 (Zeller JC, Panoskaltsis-Mortari A, Murphy WJ, et. al. 1999 J Immunol. 163(7):3684-91).
추가적으로, 인터류킨-2 (IL-2)은 Treg를 확장하고 안정화시키는 것으로 알려져 있지만 또한 다른 한편으로는 염증 반응에 기여할 수도 있다. 하지만, IL-2 및 IL-10의 조합은 염증성 자극 대신에 억제성 Treg를 초래한다. 순환 T 세포가 DNA 면역-요법 백신과 트랜스펙션된 세포를 만날 때, 그것들은 차선의 농도의 IL-10 및 IL-2에 일시적으로 노출된다. 순환 T 세포는 관용으로 약간 편향되며, 그것들이 동시-발현된 항원 (예를 들어, 인슐린)에 반응성인 경우, 트랜스펙션된 세포에 결합하여 더 긴 기간의 면역조절물질 노출을 받고 이에 더하여 억제 효과에 대하여 설정/재교육하는 또 다른 신호를 받을 것이다. 이러한 방식으로, 암호화된 항원에 반응성인 상기 T 세포는 트랜스펙션된 세포를 만날 때 억제성 표현형으로 선택적으로 재교육된다. 이러한 방식으로, 암호화된 항원에 반응성인 상기 T 세포는 트랜스펙션된 세포를 만날 때, 선택적으로 억제성 표현형으로 재교육된다.
플라스미드/벡터/DNA 면역-요법 백신은 발현된 사이토카인 호르몬을 통해 질환에 직접적으로 영향을 주는 대신에 자가면역의 부위 (예를 들어, T1D에서 췌장)에서 축적되는 항원 특이적 Treg를 유도하여 질환을 약화시키기 위해 디자인된다.
항원 (T1D의 예에서 인슐린)에 더하여, 벡터/오페론/플라스미드는 함께 시너지 작용하여 항원 제공 세포, 뿐만 아니라 T 세포 기능을 억제하고, Treg의 유도를 구동하는 적어도 두 개의 사이토카인 (예를 들어, TGF-β1 및 IL-10)을 암호화한다. 항원에 대한 효과적인 노출과 조합하여 발생하는 경우에 이 효과가 향상된다.
한 구체예에서, TGF-β1은 기능을 위해 처리 또는 염증성 환경을 필요로 하지 않는 구성적 활성 형태로 되어 있다. Treg는 항원 및 TGF-β1로의 노출을 통해 나이브 T 세포로부터 생산될 수 있지만, Treg는 탈분화하여 Th17 효과기 세포로 전환된 다음, 더 적은 자가면역 파괴가 아닌, 더 많은 자가면역 파괴를 유발한다는 것을 의미하는 "플라스틱(plastic)"이다. IL-10과 TGF-β1의 조합은, 더 강력한 면역조절물질인 것에 더하여, Treg 대신에 병원성 Th17 세포를 생산하는 환경을 억제한다.
한 구체예에서, 다중-시스트론 벡터는 또한 항원, TGF-β1, IL-10에 더하여 IL-2를 암호화한다. IL-2는 Treg 수를 확장시키고 그 표현형을 안정화시키며 (Treg 세포가 효과기 T 세포로 탈분화하는 것을 방지하며) 따라서 염증 표적 조직에서 기능적 수명을 증가시킨다.
따라서 이들 세 개의 사이토카인 (TGF-β1, IL-10, 및 IL-2)은, 항원과 조합하여, 다음 메커니즘에 의해 관용을 유도하기 위해 널리 공지된 시너지 효과를 나타낸다: (i) 항원-특이적 억제성 Treg의 크게 향상된 생성, (ii) 더 긴 Treg 수명, 및 (iii) 염증/자가반응성을 억제하는데 있어서 개개의 Treg 세포 당 더 큰 효능. 하지만, 전신으로 주입된 정제된 사이토카인의 필요한 농도는 다음과 같은 많은 심각한, 또는 심지어는 치명적일 수도 있는 부작용을 갖는다: (i) 과량의 TGF-β1로부터 치명적인 섬유증(fibrosis), (ii) 독감-유사 증상, (iii) 과량의 IL-2로부터 모세혈관 누출 증후군(capillary leak syndrome), (iv) 만성 감염을 유도하는 광범위한 면역억제, (v) 향상된 종양 발달, 뿐만 아니라 (vi) 과량의 IL-10으로부터 빈혈증(anemia).
동일한 벡터/플라스미드로부터 이들 사이토카인을 동시-발현시키고, 그러므로 면역 시스템에 항원을 제공하는 동일한 세포에 의해, 벡터는 고용량 정제된 사이토카인 투여로부터 발생하는 전신 작용 및 상응하는 부작용 없이 관용 유도에 바람직한 국소적 환경을 달성한다.
"네이키드(naked)"/"맨(bare)" 플라스미드/벡터 DNA (벡터 및 버퍼 단독)의 주사는 매우 낮은 흡수 및 트랜스펙션 속도를 갖는다 - 약 100,000개의 플라스미드 분자 중 하나 미만이 세포를 트랜스펙션하는 한편, 나머지는 분해되어 어떠한 생물학적 효과도 없다. 트랜스펙션의 이러한 매우 낮은 비효율은 트랜스펙션 세포를 분배하고 제한하기 위한 안전성 메커니즘을 제공한다.
성숙한 단백질의 투여 또는 고-효율 바이러스 벡터 형질도입에 의한 이들 사이토카인 중 어느 것의 전신 활성량의 투여는 안전하고 유효한 용량에 대하여 적정하는 것이, 불가능하지는 않더라도, 어려울 것이다. 몇몇 고 발현 미세환경에 분포된 매우 작은 전신 용량에 대한 전체 노출을 제한하는 것은 고도로 유리한 안전성 및 효능 프로파일로 이어진다.
항원 및 이들 세 가지 사이토카인의 조합은 T1D 발달로부터의 효율적인 보호를 생산하고 심지어는 질환 진행을 안정적으로 반전시킬 수 있는 것으로 보인다. 맨 DNA 플라스미드/벡터 주사의 낮은 트랜스펙션 효율로 인해, 거의 소수의 세포들이 이들 재조합 단백질을 생산하고 따라서 플라스미드/벡터 암호화된 사이토카인으로부터 혈청 사이토카인 수준이 검출 가능하게 변하지 않았고 그러므로 플라스미드/벡터에 의해 암호화된 항원 (프리-프로인슐린(pre-proinsulin))보다 임의의 다른 항원에 대한 면역 자극 또는 면역-억제가 검출되지 않았다. 이것은 바람직한 안전성 프로파일을 발생시킨다.
보통, DNA 백신은 피하 (s.c.) 주사에 관하여 불량하게 작동하고 그러므로 전형적으로는 근육내 주사 (종종 전기천공법으로)를 사용하여 또는 대안으로 다루기 힘든 디바이스, 뿐만 아니라 상당한 유지보수 및 보정을 필요로 하는 피내 제트(jet) 주사를 사용하여 투여된다. 근육내 주사로 인한 대부분의 부작용 문제가 보조제-관련된 것이기 때문에 (주사 부위 자극) 그러므로 그것들은 맨 DNA 면역-요법 백신 포맷에 대한 문제는 아니다. 추가적으로, 주사된 부피는 보통 비교적 작고 그러므로 큰 근육 팽창 및 통증을 유발하지 않는다. 한 구체예에서, 주사된 부피는 1 ml 이하이다. 또 다른 구체예에서, 주사된 부피는 대략 0.6 또는 0.5 ml이다. 그것과 관계없이, 본원에서 제공된 다수의 사이토카인 플라스미드/벡터는 예상치 못하게 s.c. 경로를 통해 투여될 때에도 T1D로부터의 보호를 제공하며, 이로 인해 환자에게 다수의 잠재적 투약 포맷을 허용하는 것으로 보인다.
국소적인 시너지 효과를 제공하는 것에 더하여, 단일 플라스미드/벡터 및 단일 프로모터에 의해 번역된 생성물 중 셋 또는 넷 모두를 암호화함으로써, 규제 부담 및 약물 물질 방출 기준은 다중-시스트론 플라스미드의 제공으로 더욱 단순화된다.
그에 반해, 단백질 생성물 각각이 별도의 플라스미드로부터 생산된 경우, 동일한 트랜스펙션된 세포의 동시-발현의 시너지 효과 값은 잠재적으로 상실되거나 감소될 것이며, 각각의 플라스미드/벡터 트랜스펙션은 독립적인 이벤트이고, 상이한 세포를 표적화할 가능성이 크기 때문이다. 2, 3, 또는 4 개의 개개의 플라스미드/벡터로부터 3 내지 4개의 재조합 단백질이 생산되는 경우, 트랜스펙션된 세포의 국소 환경에서의 임의의 시너지 효과는 잠재적으로 상실되고; 이에 더하여, 따라서 여러 개개의 임상 시험이 필요하다 (각각의 플라스미드 및 각각의 조합에 대한 것). 단일 플라스미드/벡터 및 단일 mRNA로부터 모든 단백질을 생산하는 것은 다수의 개개의 분자를 테스트하고 다수의 플라스미드/벡터 포맷에 고유한 이상적인 공동-포장 비율을 결정하기 위한 요건을 완화한다.
본 발명에 적합한 임의의 벡터 포맷, 예컨대 플라스미드 (복제 또는 수동적), 미니-서클(mini-circle), 선형 벡터 (MiLV), 바이러스 벡터 (통합 [예를 들어, 렌티바이러스] 및 비-통합 [예를 들어, 아데노바이러스] 둘 다), 코스미드, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 인간 인공 염색체 (HAC), 등이 본원에서 사용될 수 있다.
또한, 임의의 허용 가능한 트랜스펙션 향상 방법이 본원에서 사용될 수 있다: 예를 들어, 전기천공법, 초음파천공법 (초음파 증강, 미세기포 대비 증강 유무에 관계없음), 지질/폴리머 응집체, 유체역학 (높은 주사 부피를 통한 압력), 생탄도법(bio-ballistics)/유전자 총(gene-gun) (압축 가스를 통해서 피부를 통과하여 침착), 등.
한 구체예에서, 다음으로 인해 비-복제 에피솜 플라스미드 DNA가 본원에서 사용된다: i) 단일 플라스미드 트랜스펙션으로부터 유래된 mRNA의 다수의 카피, 및 ii) mRNA 및 다른 DNA 벡터 포맷에 비해 플라스미드 핵산의 확장된 안정성 및 기능. 따라서, mRNA 및 DNA-기반 발현 시스템이 둘 다 세포내 전달 및 공존을 제공할 수 있지만, 플라스미드 기반 시스템은 더 많은 제어 및 투약의 지속성을 제공한다.
한 구체예에서, 플라스미드/벡터는 네 개의 단백질을 암호화한다:
i) 항원,
ii) TGF 베타 1 (TGF-β1),
iii) 인터류킨-10, 및
iv) 인터류킨-2.
한 구체예에서, 항원은 엔도솜-표적화된 T1D 관련 항원, 예컨대 인슐린 또는 GAD65이다. 엔도솜 표적화는, 예를 들어, Ii/CD74 융합, LIMPII/SCARB 융합, 또는 트랜스페린 수용체 융합을 통해 실행될 수 있다.
한 구체예에서, TGF-β1은 활성화된 형태로 되어 있다.
예를 들어, 원하는 서열이 A) 별도의 프로모터, B) 새로운 리보솜을 모집하여 각각의 세그먼트를 번역하는 IRES (내부 리보솜 진입 부위(Internal Ribosome Entry Site)) 서열, 또는 C) 변역되어 단일 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로부터 별도의 폴리펩타이드를 생산하는 리보솜 중지/건너뛰기(pause/skip)를 유도하는 바이러스 2A 시퀀스 (예를 들어, FMDV 2A 또는 TaV 2A 서열)와 구분되는 경우, 하나의 플라스미드/벡터로부터의 네 개의 단백질의 발현이 가능하다. 하지만, 실제로는, 이들 각각의 전략은 가능하게 하는 것이 복잡하고 어렵다.
단일 플라스미드/벡터로부터의 네 개의 독립적인 단백질의 발현은 각각의 유전자에 대하여 별도의 프로모터를 가짐으로써 대부분 쉽게 달성된다. 하지만, 이 포맷은 A) 다수의 프로모터의 과도한 길이로 인해 플라스미드를 생산하기에 너무 크고, 불안정하고, 어렵고, B) 서로에 관하여 번역된 단백질의 예측 불가능한 행동을 초래하고 (더 이상 서로 고정된 비율로 생산되지 않는다), C) 각각의 프로모터는 독립적으로 침묵되어, 일부 유전자의 선택적 발현을 유도할 수 있지만, 완전한 효능을 위해 필요한 다른 것들은 발현되지 않을 수도 있고, D) 조절의 단순함이 부족하다는 점에서 상당한 단점을 가지고 있다. 그에 반해, IRES 요소 및 2A 서열은 mRNA 및 번역 수준에서 작동하고 단일 프로모터로부터 고정된 비율의 각각의 단백질을 재현 가능하게 동시 발현한다.
IRES 요소의 네 개의 부류 각각은 상이한 보조 인자 요건, 뿐만 아니라 번역될 다운스트림 유전자에 대한 상이한 서열 요건을 갖는다. 예를 들어, EMCV (심내막심근염 바이러스(EndoMyoCarditis Virus)) IRES는 모든 진핵생물 번역 개시 인자를 이용하는 630개의 염기쌍 1형 IRES인 한편, CrPv (귀뚜라미 마비 바이러스(Cricket Paralysis virus)) IRES는 필요한 보조 인자는 없지만 비-표준 개시 코돈을 이용하는 200개의 염기쌍 4형 IRES이다.
상이한 부류의 IRES 요소가 이용될 때, 그것들은 각각의 유형의 IRES 요소가 각각의 플라스미드에서 단지 1회만 사용될 수 있도록 서로 방해하고, 함께 사용될 때에는, 상이한 유형의 IRES 요소는 예측하기 어려운 방식으로 서로를 약화시킨다 (효능을 감소시킨다).
또한, 유전자/IRES 조합의 셔플링은 유전자와 IRES 요소의 상호작용이 고정적이지 않기 때문에 예측 불가능한 비율의 번역된 생성물을 생성하지만 문맥상 플랭킹(flanking) 뉴클레오타이드 서열에 의존적이다. 이에 더하여, IRES 요소는 개시시 또는 개시 직후에 처음 몇몇 아미노산 위치에 제한을 가한다. 예를 들어, CrPv IRES는 처음 아미노산이 표준 메티오닌보다는 알라닌이어야 하고 EMCV IRES는 처음 세 개의 코돈 내에서 P, W, C, R, 또는 K 아미노산을 용인할 수 없다. 한 구체예에서, EMCV IRES에 의해 가해진 N-말단 아미노산 제한을 수용하기 위해서, DNA 백신은 IL-10 유전자의 N-말단에 세 개의 알라닌 연장부를 함유한다.
이에 더하여, 각각의 IRES 요소는 230 bp에서 700 bp를 초과하는 범위에 있는 상당한 수의 염기쌍을 포함하며; 따라서 다수의 IRES 요소의 포함은 다수가 자발적인 결실 및 재조합으로 인해 산업적으로 생산되기에 불안정하고 어려워지는 정도로 플라스미드/벡터의 크기 및 복잡성을 증가사킨다. 또한, IRES 요소가 그것들을 함유하는 전사된 mRNA에 부여하는 고도의 2차 구조로 인해, 그것들은 트랜스펙션된 세포에서 병원체 인식 수용체를 활성화시키고 (Dabo S, Meurs EF. 2012 Viruses 4(11):2598-635) 의도된 관용 유도에 반대되는 자극 효과를 생성할 확률을 증가시킨다.
2A 서열은, IRES 요소와 달리, 서로 상호작용하지 않고 그러므로 안정하고 일관된 성능을 제공한다. 하지만, 그것들은 스스로 번역되어 최종 번역된 단백질 생성물의 폴딩, 기능, 및 안정성에 영향을 미친다. 모든 2A 서열은 분리될 서열의 5' 단부에 중요한 C-말단 융합체 (19-22 aa)를 생성하고 프롤린으로 3' 서열을 시작한다. 일부 단백질은 이들 변형을 허용할 수 있지만, 다른 일부는 그렇지 않으며, 2A 서열의 사용을 실질적으로 제한한다. 예를 들어, 인터류킨-10 생성물은 2A 꼬리를 허용할 수 있지만 인터류킨-2 및 TGF-β1 둘 다는 2A 태그의 업스트림에서 발현되면 잘못 폴딩되어 기능을 상실한다. 그러므로, 2A 서열에 의해 분리된 여러 독립적인 단백질을 발현하는 것이 가능하지만, 네 개의 단백질 중 두 개는 2A 태그에서 종결될 수 없으며 그러므로 다른 전략이 이용되어야 한다.
각 유형의 2A 아미노산 서열은 단백질 번역 중에 리보솜 기능을 변형시키기 때문에, 2A 패밀리의 두 개의 핵심 성질, 즉 (i) 병치된 유전자 생성물의 분리 및 (ii) 제2 유전자 생성물로의 진행도 (재개시)에서 상이한 효율을 나타낼 것이다. 상이한 2A 서열은 펩타이드 백본 (두 개의 별도의 단백질에서 생성됨)을 파괴하는 리보솜 중지를 생성하는데 있어서 상이한 효율을 나타낼 뿐만 아니라, 제2 유전자 생성물의 펩타이드 합성을 재개시하는데 있어서 상이한 효율을 나타낼 것이다.
단백질 생성물을 분리하고 단백질 번역을 재개시하는 2A 서열의 능력은 2A 아미노산 서열에 의존적이다. (Donnelly ML, Hughes LE, Luke G, et. al. 2001 J Gen Virol. 82(Pt 5):1027-41). 2A 아미노산 서열의 작은 변화는 분리되고 융합된 플랭킹 유전자 생성물의 크게 상이한 혼합물을 생성하며, 5% 미만 (>95% 융합)에서 완전히 분리되는 것 (0% 융합 또는 100% 분리)까지의 범위에 있다.
또한, 발명자는 두 개의 플랭킹 단백질 생성물을 암호화하는 인접한 아미노산 서열이 또한 2A 서열의 재개시 및 분리의 효율에 영향을 미치며, 보고된 결과와 유의한 편차를 나타내는 것을 발견하였다. 따라서 재개시 효율은 사용된 2A 아미노산 서열의 유형, 뿐만 아니라 인접한 아미노산 서열에 의해 제공되는 환경에 따라 다르며, 따라서 pre-2A 유전자 생성물의 비율과 단백질 분리는 사용된 2A 아미노산 서열과 그 맥락 둘 다에 의해 결정될 것이다.
한 구체예에서, "FMDV 2A"는 항원 암호화 서열 및 TGF-β1 암호화 서열 사이에 삽입되고; 단백질 생성물의 100% 분리, 뿐만 아니라 1:1 비를 초래한다.
또 다른 구체예에서, "TaV 2A"는 IL-10 암호화 서열 및 IL-2 암호화 서열 사이에 삽입되어, 약 50% 별도의 생성물, 뿐만 아니라 10 내지 6 비율의 단백질 생성물을 발생시킬 수도 있다. 따라서 각각의 트랜스펙션된 세포는 상대적으로 낮은 용량의 인터류킨-2을 전달하며, 즉 효과기 T 세포를 자극할 수 없고 더 높은 용량의 인터류킨-10이 Treg 표현형에 대하여 T 세포를 편향시킨다. 융합된 IL-10/IL-2의 생산은 단점이 있기 때문에, TaV 2A 세그먼트의 증가된 분열 효율을 조작하려는 시도가 이루어졌다. 2A 요소에 대한 업스트림 서열 영향을 감소시키기 위해 TaV 2A의 업스트림에 있는 번역된 영역을 연장시키는 요소인 "절연체 세그먼트"로 2A 세그먼트를 선행하려는 시도는 분리를 개선하지 못 했다. 융합 문제를 해결하기 위한 상이한 시도에서, GSG의 번역된 단백질 서열을 가지고 있는 업스트림 짝풀림제(uncoupler) 세그먼트가 추가되었지만; 이 접근법은 단지 분열 효율의 증분적 개선만을 유도하였다.
이와 같이, TAV 2A에 의한 IL-10 및 IL-2 암호화 유전자의 분리로부터 발생한 사이토카인 융합체는 면역원성일 가능성이 크다.
추가의 구체예에서, 벡터/플라스미드는 "P 2A" 세그먼트를 갖는다. P2A에 의한 IL-10 및 IL-2 암호화 유전자의 분리는 단백질 생성물의 완전한 또는 거의 완전한 분리, 뿐만 아니라 IL-2와 비교하여 IL-10의 적어도 2배 (심지어는 최대 4 또는 5배일 수도 있음) 비율을 발생시킨다.
상기 기술된 IRES-단독 및 2A-단독 시스템의 단점을 해결하기 위해, 네 개의 cDNA 서열 (항원, TGF-β1, IL-10, IL-2)이 단일 IRES 전과 후에 쌍으로 배열된다. 각 쌍은 2A 서열에 의해 더 분리되며, 이는 리보솜 건너뛰기 및 다단백질 쌍의 각각의 서열로부터 독립적인 단백질의 생산을 유도한다. TGF-β1 및 IL-2가 융합체의 N-말단 측면에 있지 않을 수도 있기 때문에, 그것들 중 하나는 중심 IRES 부위에서 종결되어야 하고 다른 하나는 mRNA 서열의 번역된 부분을 끝내야 한다.
그러므로 발현된 단백질 및 IRES/2A 요소의 연대표(chronology)/순서는 다음과 같을 수도 있다: (i) 항원, (ii) FMDV 2A, (iii) TGF 베타 1, (iv) IRES, (v) IL-10, (vi) P 2A, 및 (vii) IL-2. 결과로서, 네 개의 단백질 모두 안정하고 예측 가능한 방식으로 단일 오페론/유전자 세그먼트로부터 독립적으로 발현될 수 있다. 이들 단백질은 각각 단일 mRNA로부터 발현되기 때문에, 각각의 생성물의 비율은 고정된다 - 예를 들어, IL-10에 비해 과량의 IL-2를 생산할 수 없다.
암호화된 유전자의 분리를 위해 IRES 및 2A 요소의 조합을 사용하는 대신에, 대안의 해결책은 2개의 mRNA를 생성하기 위한 양방향성 프로모터의 사용일 수 있다 - 이들 mRNA는 하나의 mRNA 분자에서 네 개 모두가 아니라 한 쌍의 단백질을 암호화할 것이다. 그러므로 양방향성 포유류 프로모터 주위에 적절하게 배열된 발현 카세트의 쌍을 이용하고 2A 서열 및/또는 IRES 요소의 분리를 이용하여 동등한 배열이 구성될 수도 있다. 하지만, 이 접근법은 주로 양방향성 프로모터의 큰 크기, 뿐만 아니라 하나의 약용 제품에 포함된 별도의 mRNA 요소를 가진 잠재적인 규제 부담의 증가로 인한 단점과 관련이 있다. 그러므로 바람직한 구체예는 양방향성 프로모터 대신에 단일 프로모터 및 IRES 및 2A 요소의 조합을 이용한다.
이론상으로는, 일부 2A 서열은 세포내 내인성 프로테아제 민감성 서열과 대체될 수 있다. 하지만, 발명자는 이러한 프로테아제가 상당한 단점 (예를 들어, 융합된 단백질 생성물의 분비를 유도하는 보고된 기능의 결핍)과 관련이 있다는 것을 발견하였다.
항원이 처리되어 플라스미드 암호화된 사이토카인 호르몬의 국소 환경 내에서 면역 시스템에 제공되기 위해서, 항원은 트랜스펙션된 세포 내에 유지되어야 한다. 1형 당뇨병의 경우에, 활성 인슐린의 생산은, 트랜스펙션된 세포로부터 분비되거나 그렇지 않으면 방출되어야 하는 경우, 잠재적으로 바람직하지 않은 혈당 저하로 이어질 것이다.
항원 분비를 방지하기 위해서, 임의의 분비 신호가 항원 암호화 서열로부터 제거될 수 있으며, 예를 들어, 프리-프로인슐린을 암호화하는 핵산 서열로부터 분비 신호 암호화 서열을 제거하여, 프리-프로인슐린 대신에 프로인슐린이 생성되며, 따라서 항원이 트랜스펙션된 세포 내부에 축적된다. 이 번역된 항원 생성물 (예를 들어, 인슐린)은 활발히 분비되지 않지만, CD8+ T 세포에 의한 공격으로부터 발생한 괴사로 인한 용해 중에 방출될 수 있다. 추가적으로, 인슐린의 신호 서열은 질환-관련 에피토프를 함유하는 (잠재적으로 자가면역력을 유도하는) 것으로 알려져 있는 영역이고 그러므로 신호 서열의 포함은 광범위한 관용 유도 및 더 높은 질환 감소 확률을 보장한다.
추가적으로, 항원의 세포질 체류는 단지 프로테아솜을 통한 처리 및 CD8+ T 세포를 통해 세포내 병원체를 검출하는 MHC 부류 I 경로를 통한 제공을 허용한다. CD4+ T 세포는 전염증성 사이토카인에 대한 중요한 기여자이고, 모두는 아니더라도, 대부분의 자가면역 억제 Treg는 CD4+이기 때문에, CD4+ T 세포에 의해 인식되는 MHC 부류 II를 포함하도록 항원의 제공을 확대하는 것이 유리할 수도 있다.
MHC 부류 II 처리 및 CD4+ T 세포 자극은 정상적으로는 세포내 항원을 포함하지 않으며, 이 경로에 대한 접근이 세포외 항원의 세포내 흡수(endocytosis)를 통해 이루어지기 때문이다. 보통, 트랜스펙션된 세포 내에서 생산된 단백질 생성물은 단지 디폴트(default) 세포내/프로테아솜 처리 경로 및 MHC 부류 I을 통해서만 제공되어, CD4+ T 세포 효과가 아니라 CD8+ T 세포 효과를 초래한다. 면역조절을 위해 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다를 표적화하기 위해서, 바람직한 구체예는 또한 MHC 부류 II 제공을 유도하는 요인들을 포함한다.
원칙적으로, MHC 부류 II 제공을 유도하기 위해서, 항원은 엔도솜 구획으로의 융합을 지시하는 임의의 파트너에 융합될 수 있지만, 활성 및 노출에 있어서 기능적인 차이는 없다. 철 수송 단백질 수용체로도 알려져 있는 트랜스페린 수용체는 원형질막/세포외 공간에서 엔도솜까지의 주기를 융합하고 그러므로 다른 면역 세포를 B 세포, 대식세포, 등과 같은 전체 항원에 노출시킬 수도 있다. LimpII/SCARB 융합체는 엔도솜을 직접 표적화하지만, 우선적으로 조기 엔도솜을 표적화하고 때때로 항원의 과다 처리 및 전체 파괴를 초래한다. MHC 부류 II가 후기 엔도솜 국소화에 사용하는 동일한 샤페론 신호를 이용하는 Ii (CD74) 융합체는 항원 및 MHC 부류 II를 동일한 발달 스테이지의 동일한 소포로 전달하고 MHC 부류 II의 맥락에서 효과적으로 항원을 제공할 가능성을 최대화한다. 추가적으로, Ii 융합체로부터의 엔도솜 선별로, 프리프로인슐린 분비 서열은 비활성 상태가 되어야 하거나 또는 항원이 또한 처리 전에 분비되고 손실될 것이다.
인슐린 항원 분비의 차단은 대안으로 조면 소포체(Rough Endoplasmic Reticulum) 상의 SRP (신호 인식 입자)에 의한 분비 태그 제거에 필요한 두 개의 아미노산을 돌연변이시킴으로써 달성된다. Ala (A)에서 Glu (E)로의 돌연변이는 프리-프로인슐린 성숙화 및 분비를 완전히 폐지하는 한편, 최고의 관용 유도를 위해 필요한 항원의 에피토프 구조를 유지한다.
한 구체예에서, 플라스미드 DNA 백신이 사용된다. 플라스미드는, 예를 들어, 대장균(E. coli)에서 성장/복제되고, 배지로부터 분리/정제되고, 그 이후 액체 제제, 예를 들어, 물, 식염수, PBS 액체 제제로, 또는 피내 제트 주사, 비강내 투여, 또는 흡입용 동결건조 분말로서 제제화된다. 한 구체예에서, 플라스미드는 선택적으로 안정화제를 포함하는 수성 약학적 제제로 제제화된다. 임의의 적합한 미생물 시스템이 플라스미드 생산에 이용될 수도 있다.
제제 중의 안정화제는 DNA의 분해에 수반될 수도 있는 Mg++ 및 Fe+++을 제거하기 위한 킬레이트화제, 예컨대 EDTA, EGTA, 또는 DPTA, 및/또는 비-특이적 분해 효과로부터 플라스미드를 보호하는 시트레이트를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 한 구체예에서, 플라스미드는 등장성 PBS 또는 대안으로 TRIS + 시트레이트 + EDTA에서 제제화될 수 있다. 이러한 플라스미드는 안정하고, 생산하기 쉽고 사용이 안전하고 편리하다는 이점을 갖는다.
또 다른 구체예에서, 전달 작용제, 예컨대 바이러스, 지질, 리포솜, 공동-포장, 등이 본 발명에 관하여 추가될 수 있다. 하지만, 전달 작용제의 사용은 면역력, 바이러스 통합, 등의 잠재적인 문제점을 가지고 있을 수도 있다.
정의
항원: DNA 면역-요법 백신은 항원을 암호화한다. 항원은 면역계의 T 세포 구성요소에 의해 인식될 수 있는 임의의 유형의 면역원성 질환-관련 단백질 또는 이것의 단편일 수도 있다. 예를 들어, 1형 당뇨병 치료 또는 예방의 경우에, 인슐린 항원이 사용될 수도 있다. 한 예에서, 인슐린 항원은 InsB 9-23 면역 우세 펩타이드이다. 다발성 경화증(multiple sclerosis)에 대하여, DNA 면역-요법 백신, 수초 염기성 단백질 (MBP), 수초 올리고덴드로사이트 단백질 (MOG), 및/또는 단백지질 단백질 (PLP) 항원이 항원으로 사용될 수 있다. 탈모(alopecia), 다발근육염(polymyositis)/피부근염(dermatomyositis), 복강 스프루(celiac sprue), 및 단백질 알레르겐 (예를 들어, 땅콩 단백질 ara h 2)의 대표적인 항원에 대한 유사한 단백질 항원 암호화 서열이 또한 DNA 면역-요법 백신에서의 사용에 적합한 항원의 예이다.
항원 표적화: 한 구체예에서, 항원은 엔도솜으로 표적화된다. 항원은 전체 단백질, 분비-결여 단백질원(pre-protein), 또는 이것들의 기능적 또는 면역 우세 펩타이드 단편을 포함한다.
예를 들어, 인슐린 항원은 면역 조절 요법에서 사용되는 항원이고 혈당 저하제는 아니다. 그러므로 그것은 MHC 분자 상에서 순환성 T 세포에 제공된다는 것을 보장하기 위해 완전히 처리/성숙화되거나 분비되어서는 안 된다. 그러므로 DNA 면역-요법 백신은 혈액에서 인슐린 수준을 증가시키는 것이 아니라 오히려 면역계, 특히 T 세포로의 항원의 제공을 증가시킨다.
그러므로, 인슐린 항원은 작은 면역 우세 펩타이드 암호화 단편 (예를 들어, 동등한 T 세포 에피토프를 나타내는 시프트 레지스터(shifted register) 펩타이드를 포함하는, 인슐린 B 사슬 9-23 펩타이드), 필요한 분비 서열이 없지만 그 외에는 온전한 전체 프로인슐린, 또는 분비 서열을 함유하지만 분비 기능을 방지하도록 변형된 프리-프로인슐린 돌연변이 단백질일 수도 있다.
인슐린 항원의 예는 다음을 포함한다:
마우스 프로인슐린 (서열 번호 1):
Figure 112019055034988-pct00001
인간 프로인슐린 (서열 번호 2):
Figure 112019055034988-pct00002
분비되지 않는 변형된 마우스 프리-프로인슐린 (볼드체 및 밑줄로 표시된 wt 프리-프로인슐린 (서열 번호 3)에 관한 치환):
Figure 112019055034988-pct00003
분비되지 않는 변형된 인간 프리-프로인슐린 (볼드체 및 밑줄로 표시된 wt 프리-프로인슐린 (서열 번호 4)에 관한 치환):
Figure 112019055034988-pct00004
마우스 wt 프리-프로인슐린 (서열 번호 5):
Figure 112019055034988-pct00005
인간 wt 프리-프로인슐린 (서열 번호 6):
Figure 112019055034988-pct00006
마우스와 인간 사이에서 동일한 인슐린 펩타이드 "InsB 9-23":
Figure 112019055034988-pct00007
(서열 번호 7)
변형된 InsB 9-23 (볼드체 및 밑줄로 표시된 wt InsB 9-23 (서열 번호 8) 및 (서열 번호 27)에 관한 치환):
Figure 112019055034988-pct00008
및
Figure 112019055034988-pct00009
따라서 인슐린 항원은 트랜스펙션된 숙주 세포의 사이토졸에 축적될 수 있으며 따라서 MHC 부류 I을 통해 제공되거나, 또는 세포 용해시 방출될 수 있다.
MHC 부류 II 제공을 유도하는 엔도솜 표적화는 세포질 "YXXØ" 서열 (상기 식에서 Y는 티로신이고, X는 임의의 아미노산이고, Ø는 부피가 큰 소수성 아미노산, 예컨대 트립토판 또는 아이소류신이다), "[DE]XXXL[LI]" (D 및 E는 각각 아스파르트산 또는 글루탐산인 한편, L 및 I는 각각 류신 및 아이소류신이다), 또는 다음 예시의 서열에서 밑줄 그어진 "DXXLL" 엔도솜/리소솜 선별 신호와 함께 막관통 세그먼트를 형성하는 선도 서열과 항원 서열의 융합을 통해 달성될 수도 있다. 그러므로 엔도솜/리소솜을 표적화하거나 또는 엔도솜/리소솜에 대하여 순환하는 이들 신호를 포함하는 단백질 도메인은 다음을 포함한다: 불변 사슬, MHC II 샤페론, 또는 Ii로도 알려져 있는 트랜스페린 수용체, LimpII, 또는 CD74, 또는 임의의 유사한 도메인.
엔도솜 표적화 도메인의 예는, 제한되는 것이 아니라, 다음을 포함한다:
마우스 CD74/불변 사슬 (Ii) 엔도솜 표적화 도메인 (서열 번호 9):
Figure 112019055034988-pct00010
인간 CD74/불변 사슬 (Ii) 엔도솜 표적화 도메인 (서열 번호 10):
Figure 112019055034988-pct00011
1형 당뇨병: 1형 당뇨병 (T1D)은 자가-공격적 T 세포가 췌장에서 랑게르한스 섬(islets of Langerhans)에 침투하여 특이적으로 인슐린-생산 베타-세포 집단을 파괴함으로써 중요한 역할을 수행하는 만성 자가면역 질환인 것으로 간주된다. 많은 수의 섬세포가 파괴된 경우, 인슐린의 양이 감소되거나, 또는 인슐린 양이 전혀 없으면 환자에서 인슐린 결핍 및 과혈당증(hyper-glycemia)이 발생할 것이다. 따라서 T1D 환자는 충분한 인슐린을 생산할 수 없고 일생동안 정기적인 호르몬 주사가 필요하다. 일부 1형 당뇨병 환자는 "1.5형 당뇨병", "잠복성 자가면역 당뇨병"/LADA, "이중 당뇨병", 등으로 진단되며, 이것들은 1형 당뇨병 및 2형 당뇨병 둘 다의 증상을 가지고 있는 당뇨병성 질환이다 - 따라서 1형 및 2형 당뇨병 둘 다를 가지고 있는 모든 당뇨병성 질환은 또한 본원에서 용어 "1형 당뇨병"에 함유된다.
관용원성 DNA 백신: DNA-기반 면역-요법 백신/벡터/플라스미드는 보통의 건강한 "자가" 세포 파괴의 원인이 되는 면역계의 일부를 정지(switch off)시키거나 또는 하향 조절하여 따라서 T 세포-기반 자가면역을 예방하거나 또는 개선하도록 디자인된다.
용어 "DNA 면역-요법 백신"은 본원에서 사용된 바와 같이 DNA 분자를 포함하고 대상체가 하나 이상의 질환에 걸릴 위험을 감소시키기 위해서 상기 대상체에 투여되는 화합물 또는 조성물을 의미한다.
일부 구체예에서, DNA 기반 면역-요법 백신은 특정 항원을 암호화하는 플라스미드/벡터이다. 백신 접종 후, 이들 플라스미드는 숙주의 체내에서 항원 제공 세포에 의해 흡수되고, 다시 말해서, 항원 제공 세포로 트랜스펙션된다. "트랜스펙션된" 숙주 세포는 항원을 생산하고 면역계, 특히 T 세포에 항원의 작은 단편을 제공한다. 이 접근법은 암호화된 항원에 대한 특이적 T 세포 반응의 변형, 뿐만 아니라 다른 (비-암호화된 또는 "무관한") 항원에 대한 면역 반응의 최소 변형을 유도한다. 극소수의 숙주 세포만이 전형적으로 DNA 백신 플라스미드/벡터로 형질전환되며, 10만 개의 플라스미드/벡터 분자 중 하나 미만, 50만 개의 플라스미드/벡터 분자 중 하나, 또는 심지어는 100만 개의 플라스미드/벡터 분자 중 하나 미만이 결국 숙주 세포로 들어갈 가능성이 크다는 것을 의미한다. 따라서 DNA 백신은 T1D 환자 또는 T1D에 걸릴 위험이 있는 환자에서 인슐린과 같은 항원에 대한 면역 반응을 조절하기 위한 매우 가볍고 구체적인 접근법을 나타낸다.
플라스미드: 플라스미드는 작고, 원형이고, 이중 가닥의 DNA 분자로서 박테리아에서 가장 일반적으로 발견되는 작은 DNA 분자이다. 인공적인 플라스미드는 분자 클로닝에서 벡터로서 널리 사용되며, 숙주 유기체 내에서 재조합 DNA 서열의 복제를 구동하는 역할을 한다. 플라스미드는 면역-요법 DNA 백신으로서 사용에 적합하도록 조작될 수 있다. 플라스미드는 적합한 숙주 내에서 자율적으로 복제 가능한 DNA의 단위인 레플리콘으로 간주된다. 플라스미드는 한 박테리아에서 또 다른 박테리아로 전달될 수 있으며, 이것은 세 가지 주요 메커니즘을 통해 동일하거나 상이한 박테리아 종의 것일 수도 있다: 형질전환, 형질도입, 및 컨쥬게이션. DNA 백신 플라스미드는 수동적 형질전환에 의해 - 보통 상대적으로 느린 속도로 - 숙주 세포에 흡수될 수 있다. 플라스미드는 박테리아에서 효율적으로 복제된다 - 하지만 단백질 발현을 구동하지 않는다. 플라스미드는 또한 인간 및 다른 포유동물, 예를 들어, 마우스에서 단백질 발현을 구동한다 - 하지만 플라스미드의 복제를 구동하지 않는다. 한 구체예에서, pVAX1 벡터 (Invitrogen/LifeTechnologies)는 본 발명의 일부인 요소들을 삽입하기 위한 스캐폴드로서 본원에서 사용된다. 다른 적합한 벡터 스캐폴드는 진핵생물 프로모터 요소, 원핵생물 고 카피 복제 기원, 및 플라스미드 유지용 선택 시스템을 함유하는 임의의 벡터 백본을 포함한다.
선택 유전자 및 선택 시스템: 한 양태에서, DNA 면역-요법 백신은 제조 목적을 위한 선택 유전자/선택 마커를 포함한다. 선택 가능한 마커는, 예를 들어, 세포 독소에 대한 저항성을 부여하는 유전자 - 예를 들어, 앰피실린, 카나마이신, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 등과 같은 항생제 - 이다.
적합한 선택 시스템의 다른 유형은, 예를 들어, 조건부 치명적 침묵 시스템 (예를 들어, CcdA/CcdB 또는 ParD/ParE Hok/Sok 유형 시스템), 또는 생산 세포 균주에서 게놈 결함을 보완하여 생존 불가능한 숙주의 성장을 허용하는 서열 (예를 들어, dapD- 또는 pyrF- 영양 요구성 보완, infA- 번역 개시 보완, 등)을 포함한다.
선택 마커를 포함하는, 플라스미드/DNA 백신을 숨기고 있는 생산 세포는 독소/항생제/병태에 노출될 때 생존하지만, 플라스미드 서열을 차지하지 못한 세포들은 사멸될 것이다. 이와 같이, 한 구체예에서, DNA 백신은 대장균과 같은 생산 세포에서 더 높은 수율/순도 및 더 효율적인 생산/복제를 제공하기 위해 선택 마커를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
항생제 선택이 일반적인 실험실 전략이지만 무항생제 선택 시스템과 관련된 - 예를 들어, 더 효율적인 조절 공정에 관하여 - 이점이 존재할 수도 있다. 미니서클, 합성 선형 벡터, 등과 같은 선택 메커니즘을 함유하지 않은 벡터가 또한 본원에서 사용될 수 있지만, 이러한 구현은 특히 증가된 생산 및 품질 관리 비용으로 인해 생산에서의 특정한 문제점과 관련이 있다.
보완 ("구제") 전략의 예는 선행 기술에 공지되어 있지만, 이들 전략은 여러 가지 단점이 있다.
대사 보완 시스템, 예컨대 dapD [리신 생합성] 또는 pyrF [유리딘 생합성] 시스템은 고밀도 대장균 생산 동안에 종종 "교차-접식(cross-feeding)"을 일으키며, 플라스미드-함유 박테리아는 과량의 필요한 화합물을 생산 및 분비하고 이로 인해 플라스미드가 없는 이웃 박테리아에 대한 선택압을 "완화시킨다".
적합한 선택 시스템의 또 다른 예는 infA와 같은 필수 단백질을 암호화하는 플라스미드이며, 단백질 합성에 필요한 IF1/개시 인자 1을 암호화한다. 이 선택 시스템에서, infA 단백질이 분비되지 않기 때문에 교차-접식이 일어나지 않는다. 하지만, 필요한 단백질/infA를 외부에서 보완하는 방법이 없기 때문에, 플라스미드를 더 변형시키거나 또는 플라스미드-결핍 세포를 확장하는 것은 불가능하다 (J Bacteriol. 1994 Jan;176(1):198-205 및 J Biotechnol. 2004 Jul 1;111(1):17-30).
infA 선택 시스템과 관련된 단점을 피하기 위해서, 리스테리아 모노사이토게네스(L. monocytogenes)의 침입 단백질 유전자 prfA의 온도-민감성 번역 스위치 (또는 "온도 센서")를 가진 대안의 선택 시스템이 본원에서 제공되었다 (Cell. 2002 Sep 6;110(5):551-61). 표준 재조합 기술을 통해 RNA "온도 센서" 서열의 헤어핀(hairpin) 형성 부분을 infA의 대장균 게놈 카피의 업스트림에 배치함으로써, 그 발현은 발효 온도의 제어를 통해 조절되며, 37℃에서 플라스미드가 없는 세포의 느린 성장, 및 <30℃에서 빠른 세포 사멸을 가능하게 한다. 따라서 wt infA를 발현하는 플라스미드로의, 조작된 열 민감성 대장균 생산 균주의 형질전환은 모든 온도에서 완전히 정상적인 성장 속도를 허용하며, 37℃에서 무 플라스미드 확장, 뿐만 아니라 30℃에서 플라스미드에 대한 엄중 선택을 허용한다. 추가적으로, 이 시스템은 플라스미드를 보유하기 위해 wt 대장균에 대한 선택압을 생성하지 않고 따라서 배양 중에 8시간 내에 상실된다 - 치료적 플라스미드의 환경적 지속성을 보장하지 않는다.
wt 대장균 infA 뉴클레오타이드 서열 (서열 번호 11):
Figure 112019055034988-pct00012
infA 유전자의 번역으로부터 발생한 wt 대장균 IF1 단백질 서열 (prfA 융합체에 포함되지 않은 처음 메티오닌/M - (서열 번호 12)):
Figure 112019055034988-pct00013
따라서 본원에서 DNA 면역-요법 백신 플라스미드의 생산에 사용된 대장균 생산 세포주는 다음 열 민감성 prfA 뉴클레오타이드 서열을 숨길 수도 있다.
wt 리스테리아 모노사이토게네스 prfA ("열 센서 헤어핀") 뉴클레오타이드 서열 (샤인 델가르노(Shine Dalgarno)는 밑줄 그어져 있고, ATG는 볼드체로 시작한다 - (서열 번호 13)):
Figure 112019055034988-pct00014
wt 리스테리아 모노사이토게네스 prfA 단백질 서열 (대장균 IF1의 업스트림에 융합됨 - 서열 번호 13의 번역으로부터 발생함):
Figure 112019055034988-pct00015
복제 기원 (origin of replication; " Ori "): 복제 기원(replication origin)이라고도 불리는, 복제 기원은 DNA 가닥의 복제가 개시되는 게놈 내 특정 서열이다. 한 구체예에서, 복제 기원 부위는 박테리아 대장균 생산 세포주에서 복제를 허용하는 - 하지만 포유류 숙주 세포, 즉, 백신 접종된 대상체/사람/환자의 신체의 세포에서는 허용하지 않는 - "pUC Ori"를 포함한다. 다른 적합한 박테리아 복제 기원은, 제한되는 것은 아니지만, R6K, pBR322, ColE1, pMB1, 15A, pSC101, 등을 포함한다. 한 양태에서, 복제의 기원은 더 효율적인 생산을 위해 높은 플라스미드/생물량 비율을 획득하는 높은 카피 버젼이다. 복제의 기원을 함유하지 않은 벡터, 예컨대 미니서클, 합성 선형 벡터, 등이 또한 본원에서 사용될 수 있다.
프로모터: 프로모터는 특정 유전자의 전사를 개시하는 DNA 영역이다. 프로모터는 동일한 가닥에서 유전자의 전사 시작 부위 근처에 및 센스 가닥의 5' 영역을 향하는 DNA 상의 업스트림에 위치한다. 전사가 일어나기 위해서는, RNA 폴리머라아제가 유전자에 가까운 DNA에 부착되어야 한다. 프로모터는 RNA 폴리머라아제 및 RNA 폴리머라아제를 모집하는 전사 인자에 안전한 초기 결합 부위를 제공하는 특이적인 DNA 서열, 예컨대 반응 요소를 함유한다. 전사 인자는 특이적인 프로모터에 부착되어 유전자 발현을 조절하는 특이적인 활성화 또는 억제 서열을 갖는다. 따라서 프로모터는 주어진 유전자의 전사의 수준을 지시하기 위해 다른 조절 영역, 예컨대 인핸서, 사일런서(silencer), 경계 요소/절연체와 협력하여 작용할 수 있는 중요한 요소를 나타낸다. 고전적인 프로모터는 단일 메신저 RNA (mRNA)의 생산을 구동하는 반면에, 양방향성 프로모터는 프로모터의 업스트림 및 다운스트림 둘 다에서 프로모터에 바로 인접한 두 개의 mRNA의 생산을 구동한다.
한 구체예에서, 진핵생물 프로모터가 본원에 사용된다. 진핵생물 프로모터는 하나의 유전자/하나의 프로모터 규칙, 예컨대 여러 바이러스 프로모터, 뿐만 아니라 광범위한 발현을 나타내는 (즉, 좁은 세포 유형 특이성, 예컨대 뉴런-전용 발현을 나타내지 않는) 프로모터 규칙을 반드시 따르는 것은 아니다. 큰 다수의 유전자 mRNA 분자의 광범위한 전사를 구동할 수 있는 프로모터의 예는 다음을 포함한다: 바이러스 CMV 급초기 (IE) 및 SV40 프로모터; 내인성 EF1a, PGK1, Ubc, 및 베타 액틴 프로모터; 및 합성 프로모터, 예컨대 CAG 하이브리드(hybrid) 프로모터. 많은 다른 적합한 포유류 프로모터가 존재하고 합성 생물학적 노력을 통해 더 많은 것들이 디자인되고 있다. 인간 세포에서 원하는 발현 특성을 나타내는 임의의 프로모터가 DNA 면역-요법 백신 플라스미드에 사용될 수도 있다.
인핸서 : 인핸서는 mRNA 전사물을 생산하는데 있어서 프로모터의 효율을 증가시키는 DNA 요소이다. 인핸서는 매치되거나 (예를 들어, SV40 인핸서/CMV 프로모터) 또는 매치되지 않을 수도 있다. 진핵생물 기능에 적합한 임의의 인핸서/프로모터 조합이 본원에서 사용될 수 있다.
진핵생물 번역 시작: 진핵생물 번역 시작 서열은 보통 "코자크(Kozak)" 공통 서열이라고 불린다. mRNA 분자 상의 코자크 서열은 단백질이 암호화되는 번역 시작 부위로서 리보솜에 의해 인식된다. 진핵생물 리보솜은 단백질 번역을 개시하기 위해 이 서열, 또는 그 변이체를 필요로 한다. 코자크 서열은 퇴화되거나 가변적이고 공통 서열과 거의 매치되지 않는다. 실제로, 공통 코자크 서열은 전형적으로 포유류 mRNA로부터 분리된 야생형 변이체보다 덜 효율적이다. 약한 코자크 서열은 고유한 mRNA로부터 규칙적으로 분리되고 저 풍부 단백질의 번역 제어에서 역할을 할 가능성이 크지만, DNA 면역-요법 백신은 바람직하게는 중간 또는 높은 효율의 코자크 서열을 암호화한다. 유용한 코자크 서열의 예는 다음 뉴클레오타이드 서열을 포함한다: gccRccATGG (서열 번호 14), 여기서 소문자 염기는 가장 일반적인 뉴클레오타이드이지만 달라질 수도 있는 한편, 대문자 뉴클레오타이드는 고정되어 있고 (R은 A 또는 G 염기에 대한 IUPAC 불확실성 코드이고), ATG는 위치 +1에서 메티오닌 코돈의 번역 시작 부위를 나타낸다.
엔도솜 선별 신호: 엔도솜은 진핵생물 세포 내부에 막-결합된 구획이다. 일부 단백질은 엔도솜으로 수송되어 그 안에서 펩타이드 단편으로 분해될 수 있다. 펩타이드 단편은 엔도솜에 존재하는 MHC 분자에 결합하여 MHC/펩타이드 복합체를 형성할 수 있으며, 이것은 이후에 순환 T 세포, 특히 CD4+ T 세포에 제공되도록 세포 표면으로 수송될 수 있다. 엔도솜에 대한 단백질의 선별은 단백질의 사이토졸 도메인 내에 존재하는 신호에 의해 매개된다. 엔도솜 신호는 보통 짧은 선형 아미노산 서열이다. 항원은 바람직하게는, 예를 들어, YXXØ, [DE]XXXL[LI], 또는 DXXLL 엔도솜/리소솜 선별 신호와 같은 엔도솜 선별 신호를 사용하여 엔도솜으로 표적화된다. 엔도솜 선별 신호는 다양한 자연 발생 또는 합성 엔도솜 선별 신호를 포함한다. 예는 Cd74/불변 사슬/Ii, LimpII/SCARB, 또는 트랜스페린 수용체에 존재하는 엔도솜 선별 신호를 포함한다. 약학적으로 허용 가능하고 원하는 기능을 제공하는 임의의 엔도솜 표적화 도메인이 이용될 수도 있다. 항원으로의 이러한 엔도솜 표적화 도메인의 융합은 번역시 효능의 증가를 위해 그것들을 엔도솜 구획으로 유도한다. 항원의 엔도솜 선별은 관용의 더 완벽하고 강력한 유도 및 Treg의 가능한 확장 (이것은 MHC 부류 I/항원 복합체를 통해서는 달성될 수 없다)를 위해, MHC 부류 I 복합체에서의 구성적 제공에 더하여, MHC 부류 II 복합체에서 처리 및 면역계로의 제공을 부여한다. 한 구체예에서, 관용원성 DNA 백신은 항원과 CD74/불변 사슬/Ii의 융합체를 암호화하여 엔도솜 표적화 및 MHC 부류 II를 통한 항원의 제공을 구동한다.
인트론 : 인트론은 mRNA 내 비-암호화 서열이다. 일부 인트론은 mRNA의 번역 및 기능을 크게 증가시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, 인트론 서열을 포함시키는 것이 또한 본원에서 사용될 수도 있다. 표준 인트론, 예컨대 베타-글로빈, 또는 포유류 스플라이싱 관례에 따르는 임의의 인트론, 예컨대 MCM7이 이용될 수도 있다. 한 구체예에서, DNA 면역-요법 백신 벡터는 하나 이상의 인트론을 암호화하는 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, DNA 면역요법 백신 벡터는 인트론을 암호화하는 서열을 소유하지 않는다.
리보솜 중지 태그: 본 발명에 관하여, 단백질 생성물을 분리하기 위해 DNA 면역-요법 백신 벡터/플라스미드에서 단백질 암호화 서열 사이에 하나 이상의 리보솜 중지 태그 서열(-s)을 포함하는 것이 이점일 수도 있다.
예는 바이러스 "FMDV 2A 태그" (구제역(Foot-and-mouth disease) 바이러스 바이러스 2A 태그이다). FMDV 2A의 번역된 아미노산 서열은 APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP - (서열 번호 15)이다. FMDV 2A 태그는 리보솜을 중시키시고 재개시할 수 있다. FMDV 2A 태그 전과 후의 번역된 생성물의 비는 1:1에 가깝고 결과로 생성된 단백질 생성물은 일반적으로 완전히 분리된다. 이들 유형의 리보솜 태그는 이전에 재조합 항체 생산에서 두 개의 상이한 도메인, 예를 들어, 중쇄 및 경쇄의 동시-발현에 관하여 사용되었다. 하지만, 본 발명의 발명자는 그것들이 다중-시스트론 DNA 백신에 관하여 플랭킹 생성물의 분리 및 리보솜 재개시의 고유한 효율로 인한 발현된 단백질의 비율의 제어 둘 다에 유용하다는 놀라운 발견을 하였다. 번역된 생성물의 1:1 비를 선호하는 서열 태그는 바람직하게는, 예를 들어, 인슐린 항원 및 예를 들어, 강력한 사이토카인, 예컨대 TGF-β와 같이, 바람직하게는 1:1 비로 (또는 그것에 가까움) 생산되어야 하는 두 개의 단백질 암호화 서열 사이에 삽입된다.
리보솜 중지 태그 서열의 또 다른 예는 바이러스 서열 태그 "TaV 2A" (토세아 아시그나(Thosea asigna virus) 바이러스 2A - TaV 2A의 번역된 아미노산 서열: RAEGRGSLLTCGDVEENPGP (서열 번호 16))이다. 이 태그 이전/업스트림과 이후/다운스트림에서 번역된 생성물의 비는 50:1 (또는 그것에 가까움)인 것으로 보고된다. 본 발명의 발명자는 이 유형의 태그가 한 번역된 생성물이 다른 것보다 절대적으로 두드러지는 것이 필수적인 경우에 발현 수준을 제어하는데 사용될 수 있지만, 플랭킹 사이토카인 생성물의 분리는 문헌에서 나타난 서열에 비해 50% 미만이고 따라서 발현 비는 약 10:6이라는 놀라운 발견을 하였다. 본 발명과 관련하여, 2A 유형의 리보솜 중지 태그 서열은 바람직하게는 동일한 벡터/플라스미드에 의해 암호화된 두 개의 단백질의 상이한 발현 수준을 초래해야 한다. 항-염증성 사이토카인, 예컨대 IL-10에 비해 소량의 다면 발현성 사이토카인 (예컨대 IL-2)의 발현이 바람직하고 융합된 생성물은 바람직하지 않다.
리보솜 중지 태그 아미노산 서열의 추가의 예는 바이러스 서열 "P 2A" (돼지 테스코바이러스(Porcine teschovirus)-1 2A, ATNFSLLKQAGDVEENPGP - (서열 번호 17))이다. P 2A 서열은 IL-10 및 IL-2 사이에 삽입될 때 적절하게 기능하고, IL-10 및 IL-2 사이에서 >5:1의 발현비로 거의 완전한 분리를 유도한다.
대안으로, 플라스미드 발현된 다단백질 사이에서 내인성 분열을 허용하는 프로테이나아제 민감성 서열이 본원에 사용될 수도 있다. 퓨린 민감성 서열 (RAKR 모티프를 인식함) 또는 카르복시펩티다아제 민감성 서열 (RRRR, RKRR, 또는 RRKR 모티프를 인식함)이 본원에서 단백질 생성물을 분리하는데 사용될 수도 있다. 하지만, 본 발명의 발명자는 퓨린 및 카르복시펩티다아제 분열 서열 둘 다가 분리된 생성물을 발생시키지 않으며 따라서 원치않는 IL-10/IL-2 융합 단백질의 분비를 유도한다는 놀라운 발견을 하였다.
TGF -b/β/ β1 (형질전환 성장 인자 베타/β1): TGF-β는 대부분의 세포에서 증식, 세포 분화, 및 다른 기능을 제어하는 분비된 단백질이다. TGF-β는 맥락-의존적 방식으로, 예를 들어, 동시에 받아진 다른 사이토카인 신호에 따라 세포의 운명 및 표현형에 상당한 효과를 갖는 매우 강력한 사이토카인이다. 내인성 TGF-β는 생산 세포의 외막 표면과 회합된 잠복 형태로 생산되고 활성 형태의 성숙화 및 방출을 위해 활성화를 필요로 한다 (예를 들어, CD36 및 플라스민 프로테이나아제를 발현하는 염증성 대식세포에 의해). 한 구체예에서, TGF-β는 구성적으로 활성인 변형된 형태이다. 이것은 위치 223 및 225의 시스테인을 이황화 브릿지를 형성할 수 없는 아미노산으로 대체함으로써 달성된다. 예를 들어, 세린 또는 발린이 위치 223 및 225에서 시스테인을 대체하는데 사용된다. 이것은 국소 미세환경으로 방출되는 활성 프로-단백질 구조를 발생시킨다.
인간 내인성 TGF-β1서열 - 서열 번호 18:
Figure 112019055034988-pct00016
구성적으로 활성이고 분비되는 변형된 인간 TGF-β1서열 (볼드체 및 밑줄로 표시된 wt TGF-β1에 관한 치환) - 서열 번호 19:
Figure 112019055034988-pct00017
사용될 수도 있는 또 다른 변형된 인간 TGF-β1 서열은 서열 번호 25이다:
Figure 112019055034988-pct00018
Figure 112019055034988-pct00019
종결자 서열: 전사 종결자는 전사 중에 유전자의 단부를 표시하는 핵산 서열의 부분이다. 전사 복합체의 방출은 새로운 mRNA의 전사를 시작하기 위해 RNA 폴리머라제 및 관련 전사 기기를 자유롭게 한다. 추가적으로, 동일한 세포 인자는 mRNA의 수명 및 기능성을 크게 향상시키는 비-주형 "폴리-A 꼬리"를 추가한다. 적합한 전사 종결자의 예는 다음 "bGH_PA" 종결자를 포함한다:
Figure 112019055034988-pct00020
임의의 허용 가능한 종결자 서열이 본원에서 이용될 수도 있다. 변화는 양방향성 프로모터가 두 개의 반대 방향으로 배향된 mRNA를 생산하는 순간에 두 개의 상이한 플랭킹 종결자 서열의 사용을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 플라스미드는 서열 번호 24에서 나열된 서열을 갖는다.
두 번째 구체예에서, 본 발명의 플라스미드는 서열 번호 26의 서열을 갖는다: 전체 (비-주석) 플라스미드 서열
Figure 112019055034988-pct00021
Figure 112019055034988-pct00022
Figure 112019055034988-pct00023
Figure 112019055034988-pct00024
세 번째 구체예에서, 본 발명의 플라스미드는 서열 번호 28의 서열을 갖는다: 전체 (비-주석) 플라스미드 서열
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Figure 112019055034988-pct00026
Figure 112019055034988-pct00027
Figure 112019055034988-pct00028
네 번째 구체예에서, 본 발명의 플라스미드는 서열 번호 29의 서열을 갖는다: 전체 (비-주석) 플라스미드 서열
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Figure 112019055034988-pct00030
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용어 "GLP-1/GLP-1 펩타이드 /GLP-1R 아고니스트 펩타이드"는 본원에서 사용된 바와 같이 GLP-1 수용체의 아고니스트임을 의미하는 GLP-1R 아고니스트 기능을 가진 분자인 GLP-1 분자/펩타이드/단백질/변이체/아고니스트를 말한다. 이 부류의 약물은 일반적으로 당뇨병, 특히 2형 당뇨병의 치료에 사용된다. 성숙한 "인간 GLP-1"의 아미노산 서열은 다음과 같다:
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(서열 번호: 21).
용어 "GLP-1 유사체(analogue)"는 본원에서 사용된 바와 같이 GLP-1의 변이체인 펩타이드 또는 화합물을 말한다 (서열 번호: 15). 용어 "GLP-1 유사체(analog)" 및 "유사체"는 본원에서 교체 가능하게 사용될 수 있다.
GLP-1 유사체는 i) 변형된 아미노산 잔기에 상응하는 인간 GLP-1 (서열 번호: 15)에서 아미노산 잔기의 수 (즉 GLP-1 (서열 번호: 15)의 상응하는 위치), 및 ii) 실제의 변형을 참조하여 기술될 수도 있다.
용어 GLP-1 유도체는 GLP-1 유사체의 유도체를 말한다. 용어 "유도체"는 GLP-1 유사체의 맥락에서 본원에서 사용된 바와 같이 하나 이상의 치환기가 GLP-1 유사체에 공유 부착된 화학적으로 변형된 GLP-1 유사체를 의미한다. 용어 "치환기"는 본원에서 사용된 바와 같이 GLP-1 단백질/아고니스트/유사체에 컨쥬게이션된 화학적 모이어티 또는 기/측기를 의미한다. 유도체는 아미드, 탄수화물, 알킬 기, 아실 기, 에스터 등으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함할 수도 있다.
일부 구체예에서, 치환기는, 예를 들어, 위치 22, 23, 27, 34, 35, 및 36으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 위치 중 하나에서 상기 폴리펩타이드의 아미노산 잔기를 통해 공유 부착된다.
일부 구체예에서, GLP-1 유도체는 친유성 모이어티를 포함하는 치환기를 포함한다. 용어 "친유성 모이어티"는 본원에서 사용된 바와 같이 6개 초과 및 30개 미만의 탄소 원자를 가진 지방족 또는 환형 탄화수소 모이어티를 의미하며, 상기 탄화수소 모이어티는 추가적인 치환기를 포함할 수도 있다.
GLP-1 아고니스트의 예는 엑세나티드, 리라글루티드, 릭시센티드, 알비글루티드, 둘라글루티드, 타스포글루티드, 및 세마글루티드를 포함한다 (하지만 이에 제한되는 것은 아니다). 플라스미드를 사용하는 DNA 면역-요법 백신은, 예를 들어, 최근 발병 T1D 환자의 치료시 병행 GLP-1R 아고니스트 치료와 초기에 조합될 수도 있다. GLP-1 동시-투여는 만성적이거나 또는 일시적일 수도 있고 비경구 투여에 더하여 경구 투여를 포함한다.
리라글루티드: (서열 번호 22):
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세마글루티드 (서열 번호 23):
Figure 112019055034988-pct00035
약학적 조성물은 적어도 50% 물, 더 바람직하게는 적어도 60% 물, 더 바람직하게는 적어도 75% 물, 더 바람직하게는 적어도 90% 물, 더 바람직하게는 적어도 95% 물, 및 가장 바람직하게는 적어도 99% 물을 포함하는 바람직하게는 수성 제제이다. 약학적 조성물은 대안으로 복원, 흡입, 비강내 점적, 피내 투여, 등이 의도된 건식 제제일 수도 있다.
약학적 제제는 바람직하게는 형질전환을 향상시키는 방법, 예컨대 전기천공법을 사용하지 않고 투여된다. 한 구체예에서, 약학적 제제는 비경구 투여, 예를 들어, 피하 투여, 피내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 등이 의도된다. 또 다른 구체예에서, 약학적 조성물은 또한 국부적으로, 경구로, 직장으로, 또는 흡입에 의해 투여될 수도 있다.
약학적 조성물은 바람직하게는 임의의 응결제 또는 국소적 반응을 유도할 수도 있는 다른 부형제가 추가되지 않는다. 제제는 바람직하게는 수성 플라스미드 DNA의 안정성을 향상시키기 위해 유리 라디칼 스캐빈저(scavenger) (예를 들어, 1% 에탄올) 및/또는 예를 들어, 2가 양이온 스캐빈저 (예를 들어, EDTA [CAS #60-00-4], EGTA [CAS #67-42-5], 또는 DPTA [CAS #67-43-6])와 같은 킬레이터를 함유한다. 약학적 조성물은 또한 식염수 용액 및/또는 버퍼 용액의 형태로 되어 있거나 또는 식염수 용액을 포함하고 및/또는 버퍼 용액 (예를 들어, PBS - 포스페이트 완충된 식염수, TRIS 버퍼, 또는 동등한 약학적으로 허용 가능한 버퍼)을 포함한다. 약학적 제제는 바람직하게는 임의의 보조제, 뿐만 아니라, 예를 들어, 알루미늄 하이드록시드, 페놀, 소르비톨, 규소, 등과 같은 다른 전형적인 백신 성분이 없다.
투여: DNA 면역-요법 백신은 T1D 환자, 또는 T1D에 걸릴 위험이 있는 환자에게 투여될 수도 있다. 백신은, 예를 들어, 매일, 이틀마다, 주 2회, 주 1회, 월 2회, 월 1회, 두 달마다, 연 4회, 또는 연 1회 투여될 수도 있다 - 빈도는 일반적인 또는 개인의 필요에 따라 조정될 수도 있다. 면역-요법은 만성적일 수도 있다. 요법의 기간은, 예를 들어, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 또는 10년일 수도 있다.
구체예
다음 구체예는 본 발명을 예시하지만 임의의 제한하는 방법으로 이해되어서는 안 된다. 모든 구체예는 모든 가능한 방법으로 조합될 수 있는 것으로 이해된다.
1. 다음을 암호화하는 플라스미드:
i. 항원;
ii. TGF-β; 및
iii. IL-10.
2. 구체예 1의 플라스미드로서, 상기 항원은 인슐린 항원이다.
3. 다음을 동시-발현/암호화하는 플라스미드 (바람직하게는 단일 오페론으로부터): (i) 항원, 예를 들어, 인슐린 항원; (ii) TGF-β/TGF-β1 (예컨대 구성적으로 활성 형태); 및 (iii) IL-10.
4. 구체예 1 내지 구체예 3 중 어느 것의 플라스미드로서, 상기 인슐린 항원은 프로인슐린, 분비-불가능 프리-프로인슐린, 또는 이것들의 기능적 또는 면역 우세 펩타이드 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.
5. 구체예 1 내지 구체예 4 중 어느 것의 플라스미드로서, 상기 인슐린 항원은 프로인슐린, 프리-프로인슐린, 및 이것들의 기능적 또는 면역 우세 펩타이드 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.
6. 구체예 1 내지 구체예 5 중 어느 것의 플라스미드로서, 상기 인슐린 항원은 엔도솜으로 표적화된 인슐린이다.
7. 구체예 1 내지 구체예 6 중 어느 것의 플라스미드로서, 상기 플라스미드는 약 1:1의 비로 인슐린 항원 및 TGF-β를 발현한다.
8. 구체예 1 내지 구체예 7 중 어느 것의 플라스미드로서, 상기 플라스미드는 IL-10보다 적어도 200배 더 적은 양으로 인슐린 항원 및 TGF-β를 발현한다.
9. 구체예 1 내지 구체예 8 중 어느 것의 플라스미드로서, 상기 플라스미드는 IL-10보다 적어도 2배 더 적은 양으로 인슐린 항원 및 TGF-β를 발현한다.
10. 구체예 1 내지 구체예 9 중 어느 것의 플라스미드로서, 상기 플라스미드는 또한 인터류킨-2 (IL-2)를 동시-발현한다.
11. 구체예 1 내지 구체예 10 중 어느 것의 플라스미드로서, 상기 플라스미드는 항원 (예를 들어, 인슐린) 및 TGF-β에 비해 과량의 IL-10 및 IL-2를 발현한다.
12. 구체예 1 내지 구체예 11 중 어느 것의 플라스미드로서, 상기 플라스미드는 TGF-β 및 인슐린 항원에 비해 IL-10 및 IL-2를 적어도 약 1배, 2배, 5배 또는 적어도 약 100배 발현한다 (IL-10+IL-2 대 인슐린+TGF-β의 비는 적어도 1:1, 또는 2:1, 또는 5:1 또는 100:1일 수도 있다).
13. 구체예 1 내지 구체예 12 중 어느 것의 플라스미드로서, 상기 플라스미드는 TGF-β 및 인슐린 항원에 비해 IL-10 및 IL-2를 적어도 약 100배, 200배, 500배 또는 적어도 약 1000배 발현한다 (IL-10+IL-2 대 인슐린+TGF-β의 비는 적어도 100:1, 또는 200:1, 또는 500:1 또는 1000:1일 수도 있다).
14. 구체예 1 내지 구체예 13 중 어느 것의 플라스미드로서, 상기 플라스미드는 약 1:1 - 100:1, 예를 들어, 1:1 - 50:1, 예를 들어, 1:1 - 25:1, 예를 들어, 1:1 - 10:1, 대안으로 1:1 - 5:1, 대안으로 1:1 - 3:1, 대안으로 1:1 - 2:1의 비로 IL-10 및 IL-2를 발현한다. 대안으로, 발현된 IL-10과 발현된 IL-2 사이의 비는 약 1:1, 1:0.9, 1:0.8, 1:0,7, 1:0.6, 1:0.5, 1:0.4; 1:0.3, 1:0.2, 또는 1:0.1일 수도 있다.
15. 구체예 1 내지 구체예 14 중 어느 것의 플라스미드로서, 상기 플라스미드는 다음을 포함한다: (i) 인슐린 항원 암호화 서열 및 TGF-β 암호화 서열을 분리하는 FMDV 2A 요소, (ii) TGF-β 암호화 서열 및 IL-10 암호화 서열을 분리하는 EMCV IRES 요소, 및 (iii) IL-10 암호화 서열 및 IL-2 암호화 서열을 분리하는 2A 요소.
16. 구체예 1 내지 구체예 15 중 어느 것의 플라스미드로서, 상기 플라스미드는 다음을 포함한다:
(i) 인슐린 항원 암호화 서열 및 TGF-β 암호화 서열을 분리하는 2A 요소 (예컨대 FMDV 2A 또는 P 2A 요소),
(ii) TGF-β 암호화 서열 및 IL-10 암호화 서열을 분리하는 EMCV IRES 요소 (대안으로 양방향성 프로모터) (바람직하게는, 세 개의 알라닌 아미노산이 IL-10 유전자에 대하여 바로 N-말단에서 암호화된다), 및
(iii) IL-10 암호화 서열 및 IL-2 암호화 서열을 분리하는 2A 요소 (예컨대 P 2A 요소)
17. 구체예 1 내지 구체예 16 중 어느 것의 플라스미드로서, TGF-β 암호화 서열은 구성적으로 활성인 TGF-β, 바람직하게는 구성적으로 활성인 인간 TGF-β1을 암호화한다.
18. 구체예 1 내지 구체예 17 중 어느 것의 플라스미드로서, 상기 플라스미드는 다음을 포함한다: (i) 엔도솜으로 표적화된 프리-프로-인슐린 암호화 서열, (ii) FMDV 2A 요소, (iii) TGF-β 암호화 서열, (iv) EMCV IRES 요소, (v) IL-10 암호화 서열, (vi) P 2A 요소, (vii) IL-2 암호화 서열, (viii) 폴리아데닐화/종결 요소, (ix) 선택 유전자, (x) 복제 기원, (xi) 진핵생물 프로모터 요소, (xii) 진핵생물 번역 시작 서열, (xiii) 엔도솜 선별 서열, 및 (xiv) 선택적으로 인트론.
19. 구체예 1 내지 구체예 18 중 어느 것의 플라스미드로서, 상기 플라스미드는 다음 요소를 포함한다:
(i) 프로모터 (예컨대 CMV IE 프로모터),
(ii) 인트론 (비암호화 선도 서열 내에 위치함), 및
(iii) 진핵생물 번역 시작 서열 (예컨대 코자크 요소),
(iv) 엔도솜으로 표적화된 항원 암호화 서열 (예컨대 엔도솜으로 표적화된 인간 분비-결함 프리-프로-인슐린 암호화 서열),
(v) 바람직하게는 항원 암호화 서열 및 TGF-β 암호화 서열을 분리하는 FMDV 2A 요소,
(vi) TGF-β 암호화 서열 (예컨대 구성적으로 활성인 인간 TGF-β 암호화 서열, 바람직하게는 구성적으로 활성인 인간 TGF-β1 암호화 서열),
(vii) TGF-β 암호화 서열 및 IL-10 암호화 서열을 분리하는 EMCV IRES 요소 (또는 대안으로 양방향성 진핵생물 프로모터),
(viii) IL-10 암호화 서열 (예컨대 세 개의 알라닌 아미노산 N-말단 추가된 인간 IL-10 암호화 서열),
(ix) IL-10 암호화 서열 및 IL-2 암호화 서열을 분리하는 2A 요소, 예컨대 P 2A 요소,
(x) IL-2 암호화 서열 (예컨대 인간 IL-2 암호화 서열),
(xi) 종결 요소 (예컨대 bGH_PA 종결 요소),
(xii) 선택 유전자 (예컨대 카나마이신 암호화 서열 또는 wt infA 암호화 서열),
(xiii) 복제 기원 (예컨대 pUC ori와 같은 원핵생물 복제 기원).
20. 구체예 18의 플라스미드로서, 요소 (i)-(xiii)은 발현 순서로 배열된다.
21. 구체예 1 내지 구체예 20 중 어느 것의 플라스미드로서, 플라스미드의 DNA 서열은 서열 번호 24에서 제시된 바와 같거나, 또는 근본적으로 서열 번호 24에서 제시된 바와 같다.
22. 구체예 21의 플라스미드로서, 예를 들어, 항원 및/또는 사이토카인 중 하나 이상에서 하나, 두 개, 세 개, 또는 네 개의 아미노산 치환을 발생시키는 소수의 작은 변형이 서열 번호 24에서 이루어진다.
23. 구체예 1 내지 구체예 20 중 어느 것의 플라스미드로서, 플라스미드의 DNA 서열은 서열 번호:26 또는 항원 및/또는 사이토카인 중 하나 이상에서 하나, 두 개, 세 개 또는 네 개의 아미노산 치환을 발생시키는 서열 번호 26의 변형, 또는 서열 번호:26과 같은 폴리펩타이드 서열의 발현을 일으키는 서열 번호:26의 변형에서 제시된 바와 같다.
24. 구체예 1 내지 구체예 20 중 어느 것의 플라스미드로서, 플라스미드의 DNA 서열은 서열 번호:26 또는 서열 번호:26과 상이한 100개 미만의 염기를 가진 서열 번호:26의 변형에서 제시된 바와 같다.
25. 구체예 1 내지 구체예 20 중 어느 것의 플라스미드로서, 플라스미드의 DNA 서열은 서열 번호:28 또는 항원 및/또는 사이토카인 중 하나 이상에서 하나, 두 개, 세 개 또는 네 개의 아미노산 치환을 발생시키는 서열 번호:28의 변형, 또는 서열 번호:28과 동일한 폴리펩타이드 서열의 발현을 일으키는 서열 번호:28의 변형에서 제시된 바와 같다.
26. 구체예 1 내지 구체예 20 중 어느 것의 플라스미드로서, 플라스미드의 DNA 서열은 서열 번호:28 또는 서열 번호:28과 상이한 100개 미만의 염기를 가진 서열 번호:28의 변형에서 제시된 바와 같다.
27. 구체예 1 내지 구체예 20 중 어느 것의 플라스미드로서, 플라스미드의 DNA 서열은 서열 번호:29 또는 항원 및/또는 사이토카인 중 하나 이상에서 하나, 두 개, 세 개 또는 네 개의 아미노산 치환을 발생시키는 서열 번호:29의 변형, 또는 서열 번호:29와 동일한 폴리펩타이드 서열의 발현을 일으키는 서열 번호:29의 변형에서 제시된 바와 같다.
28. 구체예 1 내지 구체예 20 중 어느 것의 플라스미드로서, 플라스미드의 DNA 서열은 서열 번호:29 또는 서열 번호:29와 상이한 100개 미만의 염기를 가진 서열 번호:29의 변형에서 제시된 바와 같다.
29. 구체예 1 내지 구체예 20 중 어느 것의 플라스미드로서, 상기 플라스미드는 서열 번호:25 또는 10개 미만의 염기 치환을 가진 서열 번호:25를 포함하는 TGF-β 유전자를 포함한다.
30. Igud 당뇨병을 지연하거나 예방하는데 사용되는 구체예 1 내지 구체예 29 중 어느 것의 플라스미드.
31. 근육내, 피내, 비강내, 또는 피하 투여용 구체예 1 내지 구체예 30 중 어느 것의 플라스미드.
32. 피하 투여용 구체예 31의 플라스미드.
33. 근육내 주사용 구체예 31의 플라스미드.
34. 대상체에서, 예를 들어, I형 당뇨병, 조기 발병 I형 당뇨병, 또는 I형 당뇨병 (1,5형 당뇨병 유형의 병태를 포함)에 걸릴 위험 증가와 같은 의학적 병태를 치료하는데 사용을 위한 구체예 1 내지 구체예 33 중 어느 것의 플라스미드.
35. 구체예 1 내지 구체예 34 중 어느 것의 플라스미드를 포함하는 DNA 면역-요법 백신.
36. I형 당뇨병을 지연하거나 예방하는데 사용을 위한 구체예 31의 DNA 면역-요법 백신.
37. 근육내, 피내, 비강내, 또는 피하 투여용 구체예 35 또는 구체예 36의 DNA 면역-요법 백신.
38. 피하 투여용 구체예 37의 DNA 면역-요법 백신.
39. 근육내 투여용 구체예 37의 DNA 면역-요법 백신.
40. 이식된 세포의 생존 및 효능을 연장시키기 위해, 예를 들어, 베타 세포/베타 줄기 세포 요법, 베타 세포/베타 줄기 세포 이식, 등과 같은 다른 유형의 의학적 치료와 공동으로, 또는 병행하여 사용되는 구체예 35 내지 구체예 39 중 어느 것의 DNA 면역-요법 백신.
41. 구체예 34 내지 구체예 39 중 어느 것의 DNA 면역-요법 백신, 또는 구체예 1 내지 구체예 34 중 어느 것의 플라스미드를 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 약학적 조성물은 식염수 용액 및/또는 버퍼 및/또는 킬레이터를 포함한다.
42. 구체예 35 내지 구체예 40 중 어느 것의 DNA 면역-요법 백신, 또는 구체예 1 내지 구체예 34 중 어느 것의 플라스미드를 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 약학적 조성물은 식염수 용액 및/또는 버퍼 및/또는 킬레이터 및/또는 에탄올을 포함한다.
43. 구체예 41 또는 구체예 42의 약학적 조성물로서, 에탄올의 부피/부피 퍼센트는 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2%, 또는 1% 미만이다.
44. 구체예 41 내지 구체예 43 중 어느 것의 약학적 조성물로서, 상기 조성물은 임의의 바이러스, 지질 공동-포장제, 또는 응결제를 포함하지 않는다.
45. 구체예 41 내지 구체예 44 중 어느 것의 약학적 조성물로서, 상기 조성물은 GLP-1R 아고니스트를 더 포함한다.
46. 구체예 41 내지 구체예 44 중 어느 것의 약학적 조성물로서, 상기 조성물은 또한 GLP-1 유사체/GLP-1R 아고니스트를 더 포함한다.
47. 구체예 45 또는 구체예 46의 약학적 조성물로서, 상기 GLP-1 유사체 또는 상기 GLP-1R 아고니스트는 리라글루티드, 세마글루티드 또는 이것들의 혼합물로부터 선택된다.
48. 구체예 41 내지 구체예 47 중 어느 것의 약학적 조성물 및 GLP-1 유사체/GLP-1R 아고니스트 (예를 들어, 리라글루티드 및/또는 세마글루티드)를 포함하는 약학적 조성물을 포함하는 키트.
49. 구체예 1 내지 구체예 34 중 어느 것의 플라스미드를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 (i) 적합한 조건 하에서 숙주 세포, 예컨대 상기 플라스미드로 트랜스펙션된 박테리아 기원의 숙주 세포 (예를 들어, 대장균)를 인큐베이션하는 단계 및 (ii) 상기 플라스미드를 회수/정제하는 단계를 포함한다.
50. 구체예 49의 방법으로서, 상기 숙주 세포는 대장균 infA 열 민감성 균주이다.
51. T1D에 걸릴 위험에 있거나, 또는 최근 T1D로 진단된 환자에서 1형 당뇨병 (T1D) 또는 그 증상의 발병을 지연하는 방법으로서, 상기 방법은 선택적으로 GLP-1 유사체/GLP-1R 아고니스트와 조합하여 구체예 1 내지 구체예 31 중 어느 것의 플라스미드를 포함하는 DNA 면역-요법 백신을 투여하는 단계를 포함한다.
52. 개체에서 베타 세포 기능 및/또는 내인성 인슐린 생산을 보존하는 방법으로서, 상기 방법은 선택적으로 GLP-1 유사체/GLP-1R 아고니스트와 조합하여 구체예 1 내지 구체예 34 중 어느 것의 플라스미드를 포함하는 DNA 면역-요법 백신을 투여하는 단계를 포함한다.
53. 당뇨병성 개체를 치료하는 방법으로서 선택적으로 GLP-1 유사체/GLP-1R 아고니스트 (예를 들어, 리라글루티드 및/또는 세마글루티드)와 조합하여 구체예 1 내지 구체예 34 중 어느 것의 플라스미드를 포함하는 백신을 투여하는 단계를 포함한다.
54. T1D에 걸릴 위험이 있거나, 또는 최근 이것으로 진단된 환자에서 1형 당뇨병 (T1D)의 발병을 예방하거나 지연하기 위한 백신으로서 상기 백신은 구체예 1 내지 구체예 34 중 어느 것의 플라스미드를 포함한다.
55. 1형 당뇨병 (T1D)에 걸린 개체, 또는 T1D에 걸릴 위험이 있는 사람에서 인슐린의 투약량을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 선택적으로 GLP-1 유사체/GLP-1R 아고니스트 (예를 들어, 리라글루티드 및/또는 세마글루티드)와 조합하여 구체예 1 내지 구체예 33 중 어느 것의 플라스미드를 포함하는 DNA 면역-요법 백신을 투여하는 단계를 포함한다.
실시예
비 비만성 당뇨병성 마우스 (1형 당뇨병의 NOD 마우스 모델): 자가면역의 면역 기능은 시험관 내에서 충분히 평가할 수 없는 세포 상호작용의 복잡한 네트워크에 의존한다.
질환 억제 및/또는 질환 평가를 NOD 마우스 모델에서 수행하였는데, 이 모델은 대부분의 마우스에서 12주령 내지 30주령 사이에서 평가된 혈당 농도 (BGV, 혈당 값, 꼬리-정맥 주사침(needlestick) 및 휴대용 측정기로 결정됨)가 상승한 다유전자성 자발적 발병 모델이다. 질환의 발병률 및 진행은 예측할 수 없으며, 전체 발병률은 30주령 (WoA)에 60% 내지 95%의 범위에 있고 진단 (>250의 두 개의 순차적인 BGV 판독값)에서 종결 (600 이상의 두 개의 순차적인 BGV 판독값)까지의 진행은 2일 내지 4주의 범위에 있다. 순차적 판독값에서 높아진 BGV이 복제가 필요하다. 마우스는 임의로 음식과 물이 허용되어 면역-병리 상태에 의해 유발되는 중간 BGV 변동성을 벗어나게 되기 때문에 순차적 판독값에서 증가된 BGV의 복제가 필요하다.
플라스미드 뉴클레오타이드 서열의 예:
서열 번호 24: 전체 (비-주석) 플라스미드 서열 (6,401개 염기쌍)
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Figure 112019055034988-pct00037
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Figure 112019055034988-pct00039
실시예 1 - 항원 + IL-10 암호화 플라스미드와 비교되는 항원 암호화 플라스미드:
선행 기술에서 플라스미드 백본에서 면역 자극 CpG 서열의 고갈이 T1D의 효과적인 DNA 면역-요법 치료에 필요하다는 것을 암시하였다. 따라서 이 실험을 이전에 공개된 실험을 본떠서 수행하였다 (2008 J Immunol. 181(12):8298-307).
NOD 마우스에 제9 주 (나이)에 시작하여 주 1회 용량의 플라스미드를 8회 제공하였다: 빈 벡터 (pVAX1, 50 ug), 또는 pVAX1-프로인슐린 Ag (엔도솜으로 표적화되지 않음, 프리프로인슐린 아님), 또는 CpG 고갈된 pVAX1-프로인슐린 Ag, 또는 이시스트론 구조체 pVAX1-IL10-IRES-프로인슐린 Ag를 등몰비로 제공하였다.
모든 투여는 아이소플루란 마취 하에 좌측 사두근의 근육내로 이루어졌고 PBS + EDTA 중 플라스미드만을 함유하였다. 매주 모든 마우스에서 BGV를 평가하였고 1형 당뇨병의 발병률을 250 mg/dl을 초과하는 두 개의 BGV 판독값에 기초하여 점수를 매겼다. 30주령 또는 600의 BGV에 도달할 때까지 마우스를 평가한 후 이어서, 희생시켰다.
이 실험의 결과 (표 1)는 A) CpG 고갈이 효능에 필수적이지 않고 유익하지도 않으며, B) 면역조절 사이토카인의 포함이 효능을 크게 증가시키고, C) 플라스미드 백본 (빈 벡터)은 미처리군과 동등하다는 것을 입증한다.
30주령의 NOD 마우스에서 T1D 발병률
플라스미드 30주령에 T1D 질환 발병률
병력상 미처리 콜로니 발병률 77.8%
pVAX1 (빈 벡터 음성 대조군) 23/29 = 79.3%
CpG 고갈된 pVAX1-프로인슐린 Ag
(항원+변형된 벡터)		 24/29 = 82.7%
pVAX1-프로인슐린 Ag
(항원)		 18/30 = 60%
pVAX1-IL10-IRES-프로인슐린 Ag
(항원+IL-10)		 10/26 = 38.5%
실시예 2 - 플라스미드 암호화 항원, IL-10, IL-2 및 TGF -β으로부터 생성된 발현된 단백질 생성물
다중-시스트론 플라스미드를 생성하여 TGF-β, IL-10, 및 선택적으로 IL-2를 동시-발현시켰다. Freestyle293 세포를 일과성으로 트랜스펙션하고 무혈청 배지에서 배양하였다. 72시간 후 상층액을 수거하고 ELISA 정량하였다.
하기 표 2의 결과는 A) 다수의 독립적인 사이토카인의 발현이 단일 벡터로부터 달성되고, B) 각각의 사이토카인의 상당한 양이 예상된 비로 생산되고, C) 소량의 서열 변화가 1세대 IL10/프로인슐린 플라스미드로부터의 IL-10 발현을 크게 개선하고, D) 항원 (IIAg)의 플라스미드 백본 (빈 벡터) 또는 엔도솜 표적화가 사이토카인 생산 또는 조절 장애를 유도하지 않는다는 것을 나타낸다.
발현된 단백질 생성물의 ELISA 정량
플라스미드 활성 TGF -b1 (ng/ml) 인터류킨-10 (ng/ml) 인터류킨 -2 (ng/ml)
pVAX1 (빈 벡터) <0.0035 <0.0027 <0.0009
pVAX1-IL10/프로인슐린
(항원+IL-10)		 <0.0035 85.3 <0.0009
pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/
(항원+TGFβ+IL-10)		 7.35 1,238.8 <0.0009
pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2
(항원+TGFβ+IL-10+IL-2)		 2.39 1,259.5 777.0
실시예 3 - 질환 억제에 대한 TGF -β 및 IL-2의 영향
희생될 때까지 (당뇨병 발병) 또는 제30주까지 주 1회 투약을 계속했다는 것을 제외하고, 실시예 1에서와 같이 다중-시스트론 플라스미드를 NOD 마우스에서 질환 예방에 대하여 평가하였다. 각 군의 한 마리 마우스 (처음 n=24)를 투약 10주 후 전체 부검하였다 - 10개의 표준 고도로 관류된 조직에서의 병리 상태, 완전 혈구 측정, 및 임상 화학법 포함. 주사 부위의 기계적 외상으로 인한 소량의 근육 파괴 및 재성장 외에, 투여되지 않은 동물들과의 편차는 없었다.
하기 표 3의 결과는 A) TGFβ의 추가가 효능을 크게 증가시키고, B) 인터류킨-2의 포함이 효능을 증가시킬 수도 있고 병리 상태를 유도하지 않으며, C) IL-10 및 항원을 발현하는 플라스미드로의 만성 투약은 질환 예방에 있어서 효능을 증가시키고, D) TGFβ, IL-10 및 IL-2를 발현하는 플라스미드로의 만성 투약은 임의의 안전성 신호를 발생시키지 않으면서 효능을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
NOD 마우스에서 T1D 발병률
플라스미드 30주령에 질환 발병률
병력상 미처리 콜로니 발병률 77.8%
미처리 (음성 대조군) 18/21 = 85.7%
pVAX1-Ag/IL10
(항원+IL-10)		 5/23 = 21.7%
pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10
(항원+TGFβ+IL-10)		 2/23 = 8.7%
pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2
(항원+TGFβ+IL-10+IL-2)		 1/23 = 4.3%
실시예 4 IRES 요소, 인트론 , 뿐만 아니라 피하 투여의 평가
만성 소아 투여를 더 잘 모방하기 위해서 투약을 조기에 (제5 주에) 시작했다는 것을 제외하고, 실시예 3에서와 같이 다중-시스트론 플라스미드를 NOD 마우스에서 질환 예방에 대하여 평가하였다. 인트론을 함유하는 pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10 및 pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2 플라스미드를 입증하기 위해서, 다른 대조군을 검사하였다. 구체적으로, 필요성을 평가하기 위한 인트론 세그먼트의 결실과 마찬가지로, 상이한 IRES 세그먼트 (EMCV [뇌심근염 바이러스(EncephaloMyoCarditis Virus)의 것]와 대조적으로 CrPV [귀뚜라미 마비 바이러스의 것])를 예상되는 효능의 증가에 대하여 평가하였다. 모 플라스미드 (pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2)에 비해 효능의 명백한 부족으로 인해, CrPV 및 무인트론 (n.i. = 인트론 없음) 군을 조기에 종결하였다. 이에 더하여, 이 실험에 이용된 마우스의 코호트는 이전의 코호트보다 더 빠르게 질환을 진행시켰으며, 진단에서 희생까지의 시간은 그 평균이 이전 실험의 2.75주보다는 1.25주였다. 마지막으로, 피하 투여군을 추가하였다. 이 군에 마취 없이 목덜미의 s.c. 공간에 주 1회 주사로 3중 사이토카인 플라스미드 (pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2)를 투여하였다.
표 4의 결과는 A) EMCV IRES 요소가 CrPV IRES보다 훨씬 더 양호한 효능을 제공하고, B) 인트론의 포함 (CD74 엔도솜 표적화 영역 내에 위치한 이 플라스미드에서) 효능을 크게 증가시키고, C) IL-2의 포함은 가벼운 질환 설정에서 최소한의 이점을 제공하는 한편 그것의 존재는 공격적인 질환 설정에서 치료의 효능 및 강도를 크게 증가시키고, D) 대부분의 DNA 백신 적용에서 비효율적인 피하 투약은 최적화 없이도 보통의 효능 및 질환의 상당한 지연을 보여준다는 것을 나타낸다.
NOD 마우스에서 T1D 발병률
치료 유형 당뇨병/전체 % 당뇨병
병력상 대조군 80% @ 30주
미처리 15/21 71.4% @ 30주
빈 벡터 대조군 i.m. 13/21 61.9% @ 30주
pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2 (인트론 없음) i.m. 10/24 41.6% @ 22주
pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2 (EMCV IRES 대신에 CrPv IRES) i.m. 7/22 31.8% @ 22주
pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10 i.m. (IL-2 없음) 12/42 28.6%@ 30주
pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2 i.m. 1/42 2.4% @ 30주
pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2 s.c. 12/42 28.6% @ 30주
실시예 5 상업적 무항생제 선택과 항생제 선택 시스템의 비교
유럽 의약품 기구(European Medicines Agency) 지침에 따르도록 카나마이신 저항성을 제거할 목적으로 대안의 플라스미드 백본을 평가하였다. 동일한 삽입부 (IIAg/TGFβ/IL10/IL2, 인트론 포함)를 Nature Technology NTC9385R "나노플라스미드" 백본에 클로닝하였다. 치료를 제11 주에 시작하였고 (늦은 시작) NTC9385R-기반 플라스미드의 실패로 인해 조기 종결되었다는 것을 제외하고, 실시예 3에서와 같이 결과로 생성된 플라스미드를 NOD 마우스에서 평가하였다.
하기 표 5의 결과는 A) 플라스미드 백본의 선택 시스템에 대한 변화가 놀랍게도 플라스미드의 효과에 대한 상당한 증가를 유도하고, B) 치료에 대한 늦은 시작이 조기 전환을 유도한다는 것을 나타낸다. 다른 관련된 실험의 데이터는 이들 관용원성 DNA 백신 플라스미드로의 투약이 효능을 나타내는데 2 내지 4주가 필요하며, 이로 인해 치료에 대한 늦은 시작은 치료가 효과를 나타내기 전에 여러 당뇨병 조기 사례를 유도한다는 것을 나타낸다.
NOD 마우스에서 T1D 질환 발병률
플라스미드 30주령에 질환 발병률
병력상 미처리 콜로니 발병률 77.8%
미처리 (음성 대조군) 16/21 = 76.2%
인트론을 가지고 있는 pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2 (카나마이신 저항성) 5/21 = 23.8%
인트론을 가지고 있는 pNTC9385R-IIAg/TGFβ/IL10/IL2 (상업적 무 항생제 선택 시스템) 13/21 = 61.9%
실시예 6 항원이 있거나 없는 플라스미드로의 질환 억제 효능
플라스미드의 기능에서 암호화된 항원의 기능을 결정하기 위해서 두 번의 실험을 수행하였다 (실시예 6 및 7). 항원 (프리-프로인슐린) 암호화 영역을 제거하는 한편 CD74 표적화 도메인 및 세 개의 분비된 사이토카인 모두를 보유할 목적으로 대안의 플라스미드를 평가하였다. 치료가 제11 주에 시작했다는 것을 제외하고 (늦은 시작) 실시예 3에서와 같이 결과로 생성된 플라스미드를 NOD 마우스에서 평가하였다.
이 실험은 항원 부분이 전체 효능에 필요하고 그것이 단지 플라스미드 기능을 구동하는 사이토카인 생산이 아니라는 것을 입증한다. 이것이 치료의 항원-특이성을 입증하는데 필요한 두 개의 기준 중 하나이다.
NOD 마우스에서 T1D 발병률
플라스미드 30주령에 질환 발병률
병력상 미처리 콜로니 발병률 77.8%
pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2
(항원+사이토카인)		 2/22 = 9.1%
pVAX1-II/TGFβ/IL10/IL2
(항원 없음+사이토카인)		 15/28 = 53.5%
실시예 7 미처리 항원 백신의 효율에 대한 항원 면역-요법의 영향
플라스미드의 기능에서 암호화된 항원의 기능을 결정하기 위해서 두 번의 실험을 수행하였다 (실시예 6 및 7). 실시예 3에서와 같이 NOD 마우스에 PBS 주사로 샴(sham) 처리하거나 또는 pVAX1-IIAg/TGFβ/IL10/IL2 플라스미드로 처리하였다. 4회 투여 후 (즉, 13주령에) 각각의 마우스를 1:1 명반(alum) 현탁액 100 μl 중의 무관한 항원 (닭 오발부민, OVA) 50 μg으로 i.p.로 면역화하였다. 혈청이 수거되는 시점인 면역화 후 3주 (21일)에 희생될 때까지 계속해서 샴 또는 플라스미드를 주 1회 처리하였다. 오발부민 항원에 대한 부류 스위치된 (전체 IgG 및 IgG2a) 항체를 상업적 ELISA 키트를 통해 결정하였다. 전체 항-OVS IgG 수준에서는 플라스미드 및 샴 처리군 사이에서 유의한 차이가 관찰되지 않았고, 어느 군도 항-OVA IgG2a를 생산하지 않았다.
하기 표 7의 결과는 플라스미드가 표적화된 질환에 관련된 면역 반응을 억제하지만, 무관한 항원 (즉, 플라스미드에 의해 암호화되지 않는 임의의 항원)에 대한 면역 반응성을 억제하지는 않는다는 것을 나타낸다. 이것은 치료의 항원-특이성을 입증하는데 필요한 두 개의 기준 중 두 번째이다. 소아 환자의 치료는 표준 아동 백신 접종의 부수적인 투여를 수반하기 때문에 이것은 메토트렉세이트 또는 사이클로스포린 A와 같은 작용제를 통한 전신적/포괄적 면역억제보다 중요한 이점이다.
T1D에 대한 DNA 면역-요법 백신 접종을 받은 NOD 마우스에서 무관한 항원에 대한 반응
처리 # 샘플 평균 ug 항-OVA IgG /mL 혈청 오차
플라스미드 처리 8 7.517 +/- 0.967
PBS (샴) 처리 5 8.954 +/- 1.227
이 값들은 0.377의 유의하지 않은 p 값 및 -1.99 내지 4.87의 신뢰 구간을 발생시킨다. 이 결과는 면역 조절 플라스미드로의 처리가 플라스미드에 의해 암호화되지 않는 다른 항원에 대한 면역 반응에 영향을 미치지 않고, 그러므로 광범위한 또는 전신적인 면역 억제를 일으키지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 8 플라스미드로부터 발현된 개개의 단백질 생성물
TaV 2A 요소는 예상치 못한 IL-10+IL-2 융합 생성물을 발생시켰고 (데이터 미도시) 그러므로 다른 분리 전략을 평가하였다. 초기 분리 기술은 TaV 2A 서열의 업스트림 연장 (분비된 IL-10의 빠른 분해 및 결핍으로 이어짐) 및 또는 카르복시펩티다아제 분열 부위 (트랜스펙션된 세포주의 사멸을 유도함)를 포함하였다. 평가된 추가의 분리 전략은 GSG-TaV 2A, 퓨린 분열 부위, 퓨린 부위, 이어서 TaV 2A, P 2A, 및 E 2A (말 비염 바이러스 A(equine rhinitis virus A))였다.
Freestyle293 세포를 일과성으로 트랜스펙션하였고 무혈청 배지에서 배양하였다. 72시간 후 세포 펠릿 및 상층액 둘 다를 수거하고 반-정량적 다색 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
하기 표 8의 결과는 A) 예상치 못하게, 단백질 용해 분열 부위가 IL-10 및 IL-2 유전자 사이에서 기능하는데 실패하고, B) IL-10과 IL-2 사이의 GSG 태그 (디커플러(decoupler) 서열)은 연장된 절연체 서열에 바람직하고, C) P 2A는 TaV 2A 또는 E 2A에 바람직하고, D) 2A 서열은 IL-10과 같은 발현된 업스트림 단백질의 분해 및 분비에 대하여 상당하고 예상치 못한 효과를 나타낼 수도 있다는 것을 나타낸다.
발현된 IL-10 및 IL-2 단백질 생성물의 분리
플라스미드 세포
인터류킨-10 		분비된
인터류킨-10 		세포
인터류킨-2 		분비된
인터류킨-2 		세포
융합
생성물 		분비된
융합
생성물
GSG-TaV 2A ++++ ++ - +++ ++ -
퓨린 분열 부위 + - - - ++++ ++
퓨린/TaV 2A +++ ++ - ++ ++ +
P 2A ++ ++++ - +++ + -
E 2A +++ ++ - ++ ++ -
실시예 9 상업적 선택 시스템과 본원에서 제공된 열 민감성 선택 시스템의 비교, 뿐만 아니라 IL-2를 암호화하는 플라스미드 및 IL-2를 암호화하지 않는 플라스미드 (피하 투여)의 비교
유럽 의약품 기구 지침에 따르도록 카나마이신 저항성을 제거할 목적으로 플라스미드 백본을 생성하고 평가하였다. 수정된 삽입부 (IIAg/GSG-FMDV 2A/TGFβ/EMCV IRES/IL10/GSG-P 2A/IL2, 업스트림 비암호화 영역에서 인트론 포함)를 Nature Technology "RNA-OUT" 선택 마커를 함유하는 개조된/최소 변형된 pVAX1 벡터 또는 백본으로서 wt infA ("pNN")를 암호화하는 동등한 최소 변형된 pVAX1 벡터에 클로닝하였다. 추가적으로, 추가적인 SV40 인핸서 요소를 함유하거나 또는 IL-2가 결핍된 플라스미드를 생산하였다. 투여가 주 1회 또는 주 3회 (바람직함) s.c.로 이루어지는 것을 제외하고 실시예 3에서와 같이 결과로 생성된 플라스미드를 NOD 마우스에서 평가하였다.
하기 표 9+10에서 나타난 결과는 A) pVAX1 백본에서 카나마이신 항생제 저항성에 대한 RNA-OUT의 상업적으로 이용 가능한 교체는 여전히 예상치 못하게 성능이 저조하고, B) infA 보완성 무 항생제 선택 시스템은 모체 pVAX1 벡터와 동등한 성능을 나타내고, C) 인터류킨-2는 최적의 효능에 필요하고, D) SV40 인핸서 요소의 추가는 효능을 개선하지 않고, E) 수정된 3중 사이토카인 삽입부는 완전한 기능성을 보유하고 있다는 것을 나타낸다.
NOD 마우스에서 T1D 발병률
플라스미드, 매주 3x 투여됨 (최적) 30주령에 질환 발병률
병력상 미처리 콜로니 발병률 78.9%
미처리 (음성 대조군) 12/15 = 80%
pNN 빈 벡터
(열 민감성 선택을 가지고 있지만 단백질 암호화 서열이 없는 음성 대조군)		 12/16 = 75%
pVAX1-IIAg/FMDV/TGFβ/IL10/TaV2A/IL2
(카나마이신 선택 및 단백질 암호화 서열)		 1/16 = 6.3%
pNN-IIAg/FMDV/TGFβ/IL10/P2A/IL2
(온도 선택 시스템 및 단백질 암호화 서열)		 1/23 = 4.3%
pVAX1-RNA-OUT-IIAg/FMDV/TGFβ/IL10/P2A/IL2
(상업적 선택 시스템 및 단백질 암호화 서열)		 9/23 = 39.1%
NOD 마우스에서 T1D 발병률
플라스미드, 매주 1x 투여됨 (차선) 27주령에 질환 발병률
병력상 미처리 콜로니 발병률 78.9%
미처리 (음성 대조군) 12/15 = 80%
pNN-IIAg/FMDV/TGFβ/IL10/P2A/IL2
(온도 선택 시스템 및 단백질 암호화 서열)		 16/37 = 43.2%
pNN-SV40e-IIAg/FMDV/TGFβ/IL10/P2A/IL2
(온도 선택 시스템 및 단백질 암호화 서열, 뿐만 아니라 인핸서)		 20/37 = 54%
pNN-IIAg/FMDV/TGFβ/IL10 (IL-2 결핍)
(온도 선택 시스템 및 단백질 암호화 서열 - IL-2 제외)		 25/40 = 62.5%
pVAX1-RNA-OUT-IIAg/FMDV/TGFβ/IL10/P2A/IL2
(온도 선택 시스템 및 단백질 암호화 서열)		 27/38 = 71%
실시예 10 플라스미드 회수 후 관용 효과의 기간의 검사
이전 실험에서 (표 9에서 표시됨), pNN-IIAg/FMDV/TGFβ/IL10/P2A/IL2 군을 30주령에 희생시키지 않았지만, 플라스미드로의 투약을 중단하였다. 혈당값을 추가 십 (10) 주 동안, 총 40주령까지 추적 관찰하여, 플라스미드가 관용의 내구성 상태를 유도했는지 또는 지속적인 투약이 효능에 필요한지를 평가하였다.
하기 표 11에서 나타난 결과는 30주령까지의 안정한 무 질환 상태가 투약 중단 후 빠르게 악화되었기 때문에 지속적인 투약이 관용의 내구성에 필요하다는 것을 나타낸다. 이것은 유익한 안전성 프로파일을 나타내며, 플라스미드 투약과 직면하게 될 수도 있는 임의의 부작용이 또한 투약과 함께 중단될 것으로 예상되기 때문이다.
플라스미드 투약 중단 후 NOD 마우스에서 T1D 발병률
30주령에 질환 발병률 40주령에 질환 발병률
1/23 = 4.3% 9/23 = 39.1%
실시예 11 주사에 대한 플라스미드 안정성 및 내구성 검사
플라스미드 투여의 중요한 문제는 투여시 분해되는 것이다. 주사의 경우에, 압력 하에 얇은 바늘을 통과하는 크고 점성인 플라스미드 분자에 의해 직면하는 전단력은 플라스미드의 공유 결합된 폐쇄 원형 구조의 파괴로 이어진다 - 그것을 선형이 되게 하여 트랜스펙션 능력 및 빠른 파괴를 감소시켰다. 대부분의 플라스미드는 임상적 용도로 허용 가능한 크기의 바늘을 통한 주사시 선형 형태로의 5 내지 50% 분해를 나타내며, 이는 손실을 보충하기 위해 감소된 효능 또는 더 큰 초기 용량에 대한 필요성을 유도한다. 플라스미드 풀기 및 전단 분해에 대한 민감성으로 이어질 수도 있는 여러 유형의 서열 구조는 개시된 플라스미드에서 의도적으로 최소화되며, 주사 프로토콜로 견고성 및 확실성을 증가시키려는 의도이다. 점성 및 그러므로 농도에 따라 달라질 수 있는 플라스미드의 전단 분해를 평가하기 위해서, 인간 선도 플라스미드를 Tris EDTA 버퍼에 5, 7, 및 9 mg/ml의 농도로 재현탁하고 G30 바늘 (배출되고, 주사기로 다시 끌려 들어간 다음, 재배출됨)을 3회 통과시켰고, 일 (1) 마이크로 샘플을 주사 과정을 통과하지 않은 참조 샘플에 대하여 아가로스 겔 상에서 실행하였다.
도 3에서 도시된 결과는, 놀랍게도, 플라스미드가 임의의 테스트된 농도 또는 점성에서 세 번의 투사 통과에 의해 두드러지게 분해되지 않는다는 것을 나타낸다. 플라스미드 분해는 (6 Kb의 주요 슈퍼코일드(supercoiled) 밴드와 겔의 바닥 또는 대략 600 bp의 작은 공정 순도 밴드 사이에서) 더 작은 밴드의 번짐으로서 가시화될 것이다. 이러한 선형화/분해 자국은 주사 공정을 통과한 임의의 샘플에 대해서는 볼 수 없다. 투여시 이 강력한 물리적 안정성은 매우 바람직하고 예측된 것 또는 이전에 문헌에 보고된 것보다 더 크다.
실시예 12 infA 보완 시스템으로 플라스미드 체류의 입증
infA-기반 플라스미드 체류 선택 시스템이 원하는 대로 기능하였는지를 입증하기 위해서, 플라스미드 형질전환된 박테리아를 100회 계대 배양을 통해 키웠다 (계대 배양 당 대략 36회의 배가/생성, 잠재적 이동 또는 검사된 플라스미드 손실의 총 3,600 세대에 대하여). 계대 배양 1-100을 주 당 11에서 생성하였고, 평일마다 37℃에서 2회 계대 배양하였고 주말마다 30℃에서 1회 계대 배양하였다.
모든 것을 15 마이크로그램/ml 날라딕스산 (플라스미드 존재에 대해서가 아니라, DH5α 기반 균주에 대하여 선택함)으로 보충된 액체 무 동물 LB 배지 (Teknova soy-tone)에서 수행하였다. 글리세롤 스톡을 각각의 계대 배양으로부터 생성하였고 동시 처리를 위해 모두 100개의 계대 배양이 얻어질 때까지 유지하였다.
글리세롤 스톡의 스크레이프(scrape)를 밤새도록 5 ml 배양을 접종하는데 사용하였으며 이것을 Qiagen 미니프렙 키트 상의 공급자 설명서를 통해 진공 다기관을 사용하여 처리하였다 (실행 당 16 또는 32개 배양물, 겔 크기 제약으로 인해). 세포 입력값 표준화를 위해 OD600 판독값을 수거하기 위한 노력이 이루어지지 않았으며, 모든 프렙을 표준 부피를 기준으로 실행하였다. 각각의 미니프렙으로부터 발생하는 플라스미드 농도에 대한 보정 없이, 삽입부 (대략 4 Kbp)로부터 백본 (대략 2.4 Kbp)을 분해하기 위해 각각의 미니프렙의 1마이크로리터에 PstI/XhoI 분해를 실시하였다. 각각의 겔을 플랭킹 Tridye 2-Log 래더 (NEB https://www.neb.com/products/n3200-2-log-dna-ladder-01-100-kb), 미분해 플라스미드의 제1 샘플 레인과 함께 실시하였고, SybrSafe 염료로 가시화하였다. 겔의 이미지에서, 핵산의 양에 대한 대조군이 없음에도, 모든 분해 레인은 플라스미드에 대한 존재 및 예상된 분해 패턴을 나타낸다 (계대 배양 1-16, 17-48, 49-80, 및 81-100에 대한 이미지에서 볼 수 있음).
추가적인 확인으로서, 계대 배양 1-100에 대한 글리세롤 스톡을 모두 50 섹터 무 항생제 및 무 동물 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹(streak)하였고 30℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 접종물 스트릭에 대한 제어에 대하여 어떠한 시도도 이루어지지 않았다. 도 4에서 나타난 바와 같이, 모든 글리세롤 스톡 대표 스트릭이 눈에 띄게 성장하였고 따라서 플라스미드가 체류하였다.
실시예 13 infA 보완 시스템을 이용한 확장에 대한 적합성
infA-기반 플라스미드 체류 선택 시스템이 생산 규모에서 원하는 대로 기능했는지 입증하기 위해서, 플라스미드 형질전환된 박테리아를 특이적 수율 향상 온도 이동 단계로 50 L 예비 유가 배양(fed-batch) 발효기 실행에 사용하였다. 효모 추출물이 추가된 최소 배지를 이용하여, 배가 속도를 0.88/시간으로 감소시켰다. 유가 배양을 접종 후 17h00에 시작하였고 30%에서 용존 산소량의 조절은 pO2 캐스케이드 파라미터의 연속적인 증가에 의해 실현되었다 (32h15에서 교반, 40h30에서 압력, 이어서 45h40에서 기류). 생물량 증가 속도는 예상된 바와 같이 42℃로 이동 후 즉시 줄어들었다. 생산된 플라스미드 DNA의 양을 용해 직후 수율을 모방하는 소규모 플라스미드 추출 과정을 사용하여 1.03 ± 0.17 g/L로 추정하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> Tolerogenic DNA vaccine <130> 150042WO01 <150> US 62/415717 <151> 2016-11-01 <150> EP 17150037.4 <151> 2017-01-02 <150> EP 17169019.1 <151> 2017-05-02 <150> EP 17177289.0 <151> 2017-06-22 <150> EP 17198041.0 <151> 2017-10-24 <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 86 <212> PRT <213> mus musculus <400> 1 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 2 <211> 86 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 65 70 75 80 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 <210> 3 <211> 110 <212> PRT <213> synthetic <400> 3 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Gly Pro Asp Pro Glu Gln Glu Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly 50 55 60 Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 85 90 95 Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 4 <211> 110 <212> PRT <213> synthetic <400> 4 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Gly Pro Asp Pro Glu Gln Glu Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 20 25 30 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe 35 40 45 Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly 50 55 60 Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys 85 90 95 Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 110 <210> 5 <211> 109 <212> PRT <213> mus musculus <400> 5 Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu Trp 1 5 10 15 Gly Pro Asp Pro Ala Gln Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser 20 25 30 His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe 35 40 45 Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln 50 55 60 Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala 65 70 75 80 Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr 85 90 95 Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100 105 <210> 6 <211> 110 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 6 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu 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Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys Leu 50 55 60 Thr Ile Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Ser Leu Arg Met Lys Leu 65 70 75 80 Pro <210> 10 <211> 98 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 10 Met His Arg Arg Arg Ser Arg Ser Cys Arg Glu Asp Gln Lys Pro Val 1 5 10 15 Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met 20 25 30 Leu Gly Arg Arg Pro Gly Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala 35 40 45 Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln 50 55 60 Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys 65 70 75 80 Leu Thr Ile Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Ser Leu Arg Met Lys 85 90 95 Leu Pro <210> 11 <211> 219 <212> DNA <213> E. coli <400> 11 atggccaaag aagacaatat tgaaatgcaa ggtaccgttc ttgaaacgtt gcctaatacc 60 atgttccgcg tagagttaga aaacggtcac gtggttactg cacacatctc cggtaaaatg 120 cgcaaaaact acatccgcat cctgacgggc gacaaagtga ctgttgaact gaccccgtac 180 gacctgagca aaggccgcat tgtcttccgt agtcgctga 219 <210> 12 <211> 72 <212> PRT <213> E. coli <400> 12 Met Ala Lys Glu Asp Asn Ile Glu Met Gln Gly Thr Val Leu Glu Thr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Thr Met Phe Arg Val Glu Leu Glu Asn Gly His Val Val 20 25 30 Thr Ala His Ile Ser Gly Lys Met Arg Lys Asn Tyr Ile Arg Ile Leu 35 40 45 Thr Gly Asp Lys Val Thr Val Glu Leu Thr Pro Tyr Asp Leu Ser Lys 50 55 60 Gly Arg Ile Val Phe Arg Ser Arg 65 70 <210> 13 <211> 127 <212> DNA <213> L. monocytogenes <400> 13 tgtaaaaaac atcatttagc gtgactttct ttcaacagct aacaattgtt gttactgcct 60 aatgttttta gggtatttta aaaaagggcg ataaaaaacg attgggggat gagaaatgaa 120 cgctcaa 127 <210> 14 <211> 10 <212> DNA <213> synthetic <400> 14 gccrccatgg 10 <210> 15 <211> 24 <212> PRT <213> synthetic <400> 15 Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> Thosea asigna <400> 16 Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 17 <211> 19 <212> PRT <213> synthetic <400> 17 Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 18 <211> 390 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 18 Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr 20 25 30 Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala 35 40 45 Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser 50 55 60 Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu 85 90 95 Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu 100 105 110 Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr 115 120 125 His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val 130 135 140 Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu 145 150 155 160 Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn 165 170 175 Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp Ser 180 185 190 Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu 195 200 205 Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys Ser 210 215 220 Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe Thr 225 230 235 240 Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro 245 250 255 Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu Gln 260 265 270 Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser 275 280 285 Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys 290 295 300 Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn 305 310 315 320 Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr 325 330 335 Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala 340 345 350 Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr 355 360 365 Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val 370 375 380 Arg Ser Cys Lys Cys Ser 385 390 <210> 19 <211> 390 <212> PRT <213> synthetic <400> 19 Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr 20 25 30 Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala 35 40 45 Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser 50 55 60 Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu 85 90 95 Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu 100 105 110 Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr 115 120 125 His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val 130 135 140 Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu 145 150 155 160 Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn 165 170 175 Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp Ser 180 185 190 Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu 195 200 205 Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Val Ser 210 215 220 Val Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe Thr 225 230 235 240 Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro 245 250 255 Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu Gln 260 265 270 Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser 275 280 285 Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys 290 295 300 Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn 305 310 315 320 Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr 325 330 335 Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala 340 345 350 Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr 355 360 365 Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val 370 375 380 Arg Ser Cys Lys Cys Ser 385 390 <210> 20 <211> 228 <212> DNA <213> synthetic <400> 20 cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga 60 ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt 120 gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg 180 attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatgg 228 <210> 21 <211> 31 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 21 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 22 <211> 31 <212> PRT <213> synthetic <400> 22 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 23 <211> 31 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> 2-aminoisobutyric acid <400> 23 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 24 <211> 6401 <212> DNA <213> synthetic <400> 24 gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60 atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120 acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180 aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240 ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300 ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360 atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420 gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480 tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540 aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600 ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660 aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720 accgagctcg gatccactag tccagtgtgg tggaattctg cactgcagct cgcatctctc 780 cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc 840 cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca 900 ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc cttggagcct acctagactc agccggctct 960 ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac tctaggtaag ttaatgagac agatagaaac 1020 tggtcttgta gaaacagagt agtcgcctgc ttttctgcca ggtgctgact tctctcccct 1080 gggctttttt ctttttctca ggttgaaaag aagaagacga agaagacgaa gaagacaaac 1140 cgtcgtcgac tgccatgcgc cgctgattaa cgccgccacc atggcccacc gacgcagatc 1200 cagaagctgc cgtgaggacc agaagcccgt gatggatgat cagagggacc ttatctctaa 1260 caatgaacaa ctgccaatgc tcggcagacg gcctggggcc ccggagagca agtgcagcag 1320 aggagccttg tacacggggt tctccatttt agtgactctc cttctcgccg gccaagctac 1380 caccgcctac tttctgtacc aacagcaagg cagactagac aaactgacaa tcacaagcca 1440 gaaccttcag ctggagtctc tgcggatgaa gctgcccgct ttgtggatga gattgcttcc 1500 tctacttgct ctcctggcgc tctggggacc tgaccccgag caagagtttg ttaatcagca 1560 cctgtgtggg agtcatctgg tggaggcact ctatttagtg tgcggagaga ggggcttctt 1620 ctacactcca aagaccagac gggaggccga agaccttcaa gtggggcaag tagaactggg 1680 tggcggaccc ggtgccggga gccttcagcc gctcgccctg gagggctctc ttcagaaacg 1740 cggcatcgtg gagcagtgtt gcacatccat ttgctcactc taccagctgg agaactactg 1800 caacggaagc ggagtgaagc agacgttgaa ttttgatttg ttgaagttgg cgggggatgt 1860 ggagagcaat ccggggccga tgccccctag tggcctcaga cttttgttat tgttattacc 1920 gcttttatgg ctcttggtgc tgacaccggg ccgtccggct gctggcttgt cgacttgtaa 1980 gacaattgat atggaattgg tgaaacgaaa acggattgag gccatccgag gacagatttt 2040 gagcaagctg cggcttgcct cgccaccctc gcaaggggaa gtcccacccg gacctctacc 2100 agaagcagtc ctagcgctgt acaacagtac aagagataga gtggccgggg aatccgcaga 2160 accagagcct gagcctgaag ccgattatta tgcaaaggaa gtgactaggg tcctgatggt 2220 cgagacccat aacgaaatct acgacaaatt caaacaaagt acccactcta tctacatgtt 2280 cttcaacacc agtgagctaa gagaagccgt gcccgaacct gtgcttcttt cccgcgcaga 2340 actccgcctc ttgagactca aattgaaagt tgaacaacac gtagagcttt accagaaata 2400 ctctaataat tcatggcgat atctttctaa tcgtctcctc gccccatctg acagccctga 2460 atggctctcc ttcgacgtta cgggagttgt gcgccagtgg ctcagcagag gcggagagat 2520 agagggcttt cggctgagcg cacatgtatc tgtggactca agggacaaca cattgcaagt 2580 ggatattaac ggttttacaa ctggacggag aggggacctg gcgaccatcc acggcatgaa 2640 tagacctttc ctgctgctga tggctactcc cctggagagg gcacagcact tacagtcttc 2700 cagacaccgg cgcgccctgg atacaaacta ctgcttcagc tccaccgaaa agaactgttg 2760 cgtgcggcag ctgtacattg acttcagaaa ggatctgggc tggaagtgga ttcatgagcc 2820 caaggggtat catgccaact tctgtcttgg gccatgccca tacatctggt cactggatac 2880 ccagtactcc aaagttctgg ccttgtacaa tcaacacaac cctggagctt ccgccgctcc 2940 ttgctgtgtg ccccaagccc tagagcccct gcccatcgtt tattatgtcg gacgcaagcc 3000 caaagtagaa cagctatcaa atatgatcgt gagaagctgc aagtgtagct gataaacgcg 3060 tcgagcatgc atctagggcg gccaattccg cccctctccc ccccacccct ctccctcccc 3120 cccccctaac gttactggcc gaagccgctt ggaataaggc cggtgtgcgt ttgtctatat 3180 gttattttcc accatattgc cgtcttttgg caatgtgagg gcccggaaac ctggccctgt 3240 cttcttgacg agcattccta ggggtctttc ccctctcgcc aaaggaatgc aaggtctgtt 3300 gaatgtcgtg aaggaagcag ttcctctgga agcttcttga agacaaacaa cgtctgtagc 3360 gaccctttgt agacagcgga accccccacc tggcgataga tgcctctgcg gccaaaagcc 3420 acgtgtataa gatacacctg caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg tgagttggat 3480 agttgtggaa agagtcaaat ggctctcctc aagcgtattc aacaaggggc tgaaggatgc 3540 ccagaaggta ccccattgta tgggatctga tctggggcct cggtgcacat gctttacatg 3600 tgtttagtcg aggttaaaaa acgtctaggc cccccgaacc acggggacgt ggttttcctt 3660 tgaaaaacac gatgataata tggctgccgc tcattctagt gcccttcttt gctgcctggt 3720 cctgctcacc ggggtgcgag ctagccctgg acaagggaca caatccgaaa actcgtgcac 3780 ccacttcccg ggcaacctcc ctaacatgct gagggacctc cgtgatgcct tcagtagagt 3840 gaagacgttc ttccaaatga aagatcagtt agataacctg ctcctgaagg agtcactctt 3900 agaagacttc aaaggatacc tcggctgcca agcacttagc gagatgattc aattctactt 3960 agaagaagtc atgcctcaag ctgagaatca agaccccgac atcaaagctc atgtgaattc 4020 tttgggagaa aatttgaaga ctttgcggct gcggctgcgg agatgtcacc gctttctgcc 4080 ctgtgagaac aaatcaaaag cggtcgagca agttaagaat gccttcaata agctacaaga 4140 gaagggcatc tacaaagcaa tgagcgagtt tgatatcttt atcaattaca ttgaagccta 4200 catgacaatg aagattagga atgccgcggg gagcggcgct actaacttca gcctgctgaa 4260 gcaggctgga gacgtggagg agaaccctgg acctatgtac agaatgcagc tgctgagctg 4320 catcgccctg agcctggccc tggtgaccaa cagcgcaccc acgtcctcta gcaccaagaa 4380 gacccagtta cagttggagc atctactttt agacctgcaa atgattttga acggcatcaa 4440 caactacaag aatcctaaac ttactcgcat gcttaccttc aaattttaca tgcccaagaa 4500 ggccaccgaa ctgaagcact tgcaatgtct ggaggaagaa ctcaagccgc tggaggaagt 4560 tctcaacctc gcgcagtcca agaatttcca cctccggcca agagacctga tcagtaacat 4620 taatgtgata gtgctggagc tgaagggaag cgagactaca tttatgtgcg agtacgccga 4680 tgaaaccgct acaatcgtcg agttcctgaa tagatggatc acattttgcc agtcaattat 4740 ctctactctg acatgataac tcgaggtcta gagggcccgt ttaaacccgc tgatcagcct 4800 cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga 4860 ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt 4920 gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg 4980 attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctactgggc 5040 ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg 5100 gaagccctgc aaagtaaact 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ctgggggaga 4020 acctgaagac cctcaggctg aggctacggc gctgtcatcg atttcttccc tgtgaaaaca 4080 agagcaaggc cgtggagcag gtgaagaatg cctttaataa gctccaagag aaaggcatct 4140 acaaagccat gagtgagttt gacatcttca tcaactacat agaagcctac atgacaatga 4200 agatacgaaa cgggagcggc gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg 4260 aggagaaccc tggacctatg tacagaatgc agctgctgag ctgcatcgcc ctgagcctgg 4320 ccctggtgac caacagcgca cccacgtcct ctagcaccaa gaagacccag ttacagttgg 4380 agcatctact tttagacctg caaatgattt tgaacggcat caacaactac aagaatccta 4440 aacttactcg catgcttacc ttcaaatttt acatgcccaa gaaggccacc gaactgaagc 4500 acttgcaatg tctggaggaa gaactcaagc cgctggagga agttctcaac ctcgcgcagt 4560 ccaagaattt ccacctccgg ccaagagacc tgatcagtaa cattaatgtg atagtgctgg 4620 agctgaaggg aagcgagact acatttatgt gcgagtacgc cgatgaaacc gctacaatcg 4680 tcgagttcct gaatagatgg atcacatttt gccagtcaat tatctctact ctgacatgat 4740 aactcgagtc tagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt 4800 gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc 4860 ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt 4920 ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca 4980 ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctactgg gcggttttat ggacagcaag 5040 cgaaccggaa ttgccagctg gggcgccctc tggtaaggtt gggaagccct gcaaagtaaa 5100 ctggatggct ttctcgccgc caaggatctg atggcgcagg ggatcaagct ctgatcaaga 5160 gacaggatga ggatcgtttc gcatggccaa agaagacaat attgaaatgc aaggtaccgt 5220 tcttgaaacg ttgcctaata ccatgttccg cgtagagtta gaaaacggtc acgtggttac 5280 tgcacacatc tccggtaaaa tgcgcaaaaa ctacatccgc atcctgacgg gcgacaaagt 5340 gactgttgaa ctgaccccgt acgacctgag caaaggccgc attgtcttcc gtagtcgctg 5400 ataaattatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg 5460 tatttcacac cgcatacagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt 5520 ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg 5580 cttcaataat agcacgtgct aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 5640 ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca 5700 gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc 5760 tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta 5820 ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt 5880 ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc 5940 gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg 6000 ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg 6060 tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag 6120 ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc 6180 agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat 6240 agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg 6300 gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct gggcttttgc 6360 tggccttttg ctcacatgtt ctt 6383 <210> 29 <211> 6383 <212> DNA <213> synthetic <400> 29 gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60 atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120 acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180 aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240 ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300 ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360 atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420 gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480 tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540 aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600 ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660 aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720 accgagctcg gatccactag tccagtgtgg tggaattctg cagctcgcat ctctccttca 780 cgcgcccgcc gccctacctg aggccgccat ccacgccggt tgagtcgcgt tctgccgcct 840 cccgcctgtg gtgcctcctg aactgcgtcc gccgtctagg taagtttaaa gctcaggtcg 900 agaccgggcc tttgtccggc gctcccttgg agcctaccta gactcagccg gctctccacg 960 ctttgcctga ccctgcttgc tcaactctag gtaagttaat gagacagata gaaactggtc 1020 ttgtagaaac agagtagtcg cctgcttttc tgccaggtgc tgacttctct cccctgggct 1080 tttttctttt tctcaggttg aaaagaagaa gacgaagaag acgaagaaga caaaccgtcg 1140 tcgactgcca tgcgccgctg attaacgccg ccaccatggc ccaccgacgc agatccagaa 1200 gctgccgtga ggaccagaag cccgtgatgg atgatcagag ggaccttatc tctaacaatg 1260 aacaactgcc aatgctcggc agacggcctg gggccccgga gagcaagtgc agcagaggag 1320 ccttgtacac ggggttctcc attttagtga ctctccttct cgccggccaa gctaccaccg 1380 cctactttct gtaccaacag caaggcagac tagacaaact gacaatcaca agccagaacc 1440 ttcagctgga gtctctgcgg atgaagctgc ccgctttgtg gatgagattg cttcctctac 1500 ttgctctcct ggcgctctgg ggacctgacc ccgagcaaga gtttgttaat cagcacctgt 1560 gtgggagtca tctggtggag gcactctatt tagtgtgcgg agagaggggc ttcttctaca 1620 ctccaaagac cagacgggag gccgaagacc ttcaagtggg gcaagtagaa ctgggtggcg 1680 gacccggtgc cgggagcctt cagccgctcg ccctggaggg ctctcttcag aaacgcggca 1740 tcgtggagca gtgttgcaca tccatttgct cactctacca gctggagaac tactgcaacg 1800 gaagcggagt gaagcagacg ttgaattttg atttgttgaa gttggcgggg gatgtggaga 1860 gcaatccggg gccgatgccc cctagtggcc tcagactttt gttattgtta ttaccgcttt 1920 tatggctctt ggtgctgaca ccgggccgtc cggctgctgg cttgtcgact tgtaagacaa 1980 ttgatatgga attggtgaaa cgaaaacgga ttgaggccat ccgaggacag attttgagca 2040 agctgcggct tgcctcgcca ccctcgcaag gggaagtccc acccggacct ctaccagaag 2100 cagtcctagc gctgtacaac agtacaagag atagagtggc cggggaatcc gcagaaccag 2160 agcctgagcc tgaagccgat tattatgcaa aggaagtgac tagggtcctg atggtcgaga 2220 cccataacga aatctacgac aaattcaaac aaagtaccca ctctatctac atgttcttca 2280 acaccagtga gctaagagaa gccgtgcccg aacctgtgct tctttcccgc gcagaactcc 2340 gcctcttgag actcaaattg aaagttgaac aacacgtaga gctttaccag aaatactcta 2400 ataattcatg gcgatatctt tctaatcgtc tcctcgcccc atctgacagc cctgaatggc 2460 tctccttcga cgttacggga gttgtgcgcc agtggctcag cagaggcgga gagatagagg 2520 gctttcggct gagcgcacat agctctagcg actcaaggga caacacattg caagtggata 2580 ttaacggttt tacaactgga cggagagggg acctggcgac catccacggc atgaatagac 2640 ctttcctgct gctgatggct actcccctgg agagggcaca gcacttacag tcttccagac 2700 accggcgcgc cctggataca aactactgct tcagctccac cgaaaagaac tgttgcgtgc 2760 ggcagctgta cattgacttc agaaaggatc tgggctggaa gtggattcat gagcccaagg 2820 ggtatcatgc caacttctgt cttgggccat gcccatacat ctggtcactg gatacccagt 2880 actccaaagt tctggccttg tacaatcaac acaaccctgg agcttccgcc gctccttgct 2940 gtgtgcccca agccctagag cccctgccca tcgtttatta tgtcggacgc aagcccaaag 3000 tagaacagct atcaaatatg atcgtgagaa gctgcaagtg tagctgataa acgcgtcgag 3060 catgcatcta gggcggccaa ttccgcccct ctccccccca cccctctccc tccccccccc 3120 ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg tgcgtttgtc tatatgttat 3180 tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg gaaacctggc cctgtcttct 3240 tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg aatgcaaggt ctgttgaatg 3300 tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca aacaacgtct gtagcgaccc 3360 tttgtagaca gcggaacccc ccacctggcg atagatgcct ctgcggccaa aagccacgtg 3420 tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca cgttgtgagt tggatagttg 3480 tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga 3540 aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg cacatgcttt acatgtgttt 3600 agtcgaggtt aaaaaacgtc taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa 3660 aacacgatga taatatgatg cacagctcag cactgctctg ttgcctggtc ctcctgactg 3720 gggtgagggc cagcccaggc cagggcaccc agtctgagaa cagctgcacc cacttcccag 3780 gcaacctgcc taacatgctt cgagatctcc gagatgcctt cagcagagtg aagactttct 3840 ttcaaatgaa ggatcagctg gacaacttgt tgttaaagga gtccttgctg gaggacttta 3900 agggttacct gggttgccaa gccttgtctg agatgatcca gttttacctg gaggaggtga 3960 tgccccaagc tgagaaccaa gacccagaca tcaaggcgca tgtgaactcc ctgggggaga 4020 acctgaagac cctcaggctg aggctacggc gctgtcatcg atttcttccc tgtgaaaaca 4080 agagcaaggc cgtggagcag gtgaagaatg cctttaataa gctccaagag aaaggcatct 4140 acaaagccat gagtgagttt gacatcttca tcaactacat agaagcctac atgacaatga 4200 agatacgaaa cgggagcggc gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg 4260 aggagaaccc tggacctatg tacagaatgc agctgctgag ctgcatcgcc ctgagcctgg 4320 ccctggtgac caacagcgca cccacgtcct ctagcaccaa gaagacccag ttacagttgg 4380 agcatctact tttagacctg caaatgattt tgaacggcat caacaactac aagaatccta 4440 aacttactcg catgcttacc ttcaaatttt acatgcccaa gaaggccacc gaactgaagc 4500 acttgcaatg tctggaggaa gaactcaagc cgctggagga agttctcaac ctcgcgcagt 4560 ccaagaattt ccacctccgg ccaagagacc tgatcagtaa cattaatgtg atagtgctgg 4620 agctgaaggg aagcgagact acatttatgt gcgagtacgc cgatgaaacc gctacaatcg 4680 tcgagttcct gaatagatgg atcacatttt gccagtcaat tatctctact ctgacatgat 4740 aactcgagtc tagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt 4800 gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc 4860 ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt 4920 ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca 4980 ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctactgg gcggttttat ggacagcaag 5040 cgaaccggaa ttgccagctg gggcgccctc tggtaaggtt gggaagccct gcaaagtaaa 5100 ctggatggct ttctcgccgc caaggatctg atggcgcagg ggatcaagct ctgatcaaga 5160 gacaggatga ggatcgtttc gcatggccaa agaagacaat attgaaatgc aaggtaccgt 5220 tcttgaaacg ttgcctaata ccatgttccg cgtagagtta gaaaacggtc acgtggttac 5280 tgcacacatc tccggtaaaa tgcgcaaaaa ctacatccgc atcctgacgg gcgacaaagt 5340 gactgttgaa ctgaccccgt acgacctgag caaaggccgc attgtcttcc gtagtcgctg 5400 ataaattatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg 5460 tatttcacac cgcatacagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt 5520 ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg 5580 cttcaataat agcacgtgct aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 5640 ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca 5700 gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc 5760 tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta 5820 ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt 5880 ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc 5940 gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg 6000 ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg 6060 tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag 6120 ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc 6180 agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat 6240 agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg 6300 gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct gggcttttgc 6360 tggccttttg ctcacatgtt ctt 6383

Claims (19)

  1. i. 인슐린 항원;
    ii. TGF-β; 및
    iii. IL-10
    을 암호화하고 발현하는 플라스미드로서,
    상기 플라스미드는 또한 인터류킨-2 (IL-2)를 동시-발현하는, 플라스미드.
  2. 제1 항에 있어서, 상기 인슐린 항원은 프로인슐린 또는 프리-프로인슐린인 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  3. 제1 항에 있어서, 상기 인슐린 항원은 엔도솜으로 표적화된 인슐린인 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  4. 제1 항에 있어서, 상기 플라스미드는 인슐린 항원 및 TGF-β을 IL-10보다 2 내지 200배 더 적은 양으로 발현하는 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  5. 제1 항에 있어서, 상기 플라스미드는 (i) 인슐린 항원 암호화 서열 및 TGF-β 암호화 서열을 분리하는 FMDV 2A 요소, (ii) TGF-β 암호화 서열 및 IL-10 암호화 서열을 분리하는 EMCV IRES 요소, 및 (iii) IL-10 암호화 서열 및 IL-2 암호화 서열을 분리하는 2A 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  6. 제1 항에 있어서, TGF-β 암호화 서열은 구성적으로 활성인 TGF-β를 암호화하는 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  7. 제1 항에 있어서, 상기 플라스미드는 (i) 엔도솜으로 표적화된 프리-프로-인슐린 암호화 서열, (ii) FMDV 2A 요소, (iii) TGF-β 암호화 서열, (iv) EMCV IRES 요소, (v) IL-10 암호화 서열, (vi) P 2A 요소, (vii) IL-2 암호화 서열, (viii) 폴리아데닐화/종결 요소, (ix) 선택 유전자, (x) 복제 기원, (xi) 진핵생물 프로모터 요소, (xii) 진핵생물 번역 시작 서열, 및 (xiii) 엔도솜 선별 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  8. 제7 항에 있어서, 상기 플라스미드는 (xiv) 인트론을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  9. 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항의 플라스미드를 포함하는 DNA 면역-요법 백신.
  10. 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항의 플라스미드를 포함하는, I형 당뇨병을 지연하거나 예방하기 위한 약학적 조성물로서, 상기 약학적 조성물은 식염수 용액, 버퍼, 킬레이터, 또는 이것들의 조합을 포함하는, 약학적 조성물.
  11. 제10 항에 있어서, 상기 버퍼는 임의의 바이러스, 지질, 공동-포장제(co-packing agent), 또는 응결제를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  12. 제10 항에 있어서, 상기 조성물은 또한 GLP-1 수용체 아고니스트를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 제10 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 피하 투여용인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 제10 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 근육내 투여용인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제9 항의 DNA 면역-요법 백신을 포함하는, I형 당뇨병을 지연하거나 예방하기 위한, 약학적 조성물로서, 상기 약학적 조성물은 식염수 용액, 버퍼, 킬레이터, 또는 이것들의 조합을 포함하는, 약학적 조성물.
  16. 제15 항에 있어서, 상기 버퍼는 임의의 바이러스, 지질, 공동-포장제(co-packing agent), 또는 응결제를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  17. 제15 항에 있어서, 상기 조성물은 또한 GLP-1 수용체 아고니스트를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  18. 제15 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 피하 투여용인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  19. 제15 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 근육내 투여용인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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