ES2834329T3 - Vacuna de ADN tolerogénica - Google Patents

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Abstract

Un plásmido que codifica: i. un antígeno de insulina; ii. TGF-β; iii. IL-10; y en donde dicho plásmido conduce además la expresión de Interleucina-2 (IL-2).

Description

DESCRIPCIÓN
Vacuna de ADN tolerogénica
Campo técnico
La presente invención se refiere a vacunas de ADN inmunoterapéuticas tolerogénicas para reducir la reactividad de células T con especificidad antigénica.
Antecedentes de la invención
De acuerdo con los enfoques tradicionales de vacunas, una proteína/antígeno purificado se inyecta en una persona/paciente/animal para estimular respuestas inmunitarias específicamente para esa proteína/antígeno. Este enfoque vacunal tiende a tener un impacto principalmente sobre la producción de anticuerpos, mientras que las células T tienden a no afectarse significativamente, más que para generar una memoria de células T del antígeno. Por lo tanto, los enfoques vacunales tradicionales no se consideran adecuados en conexión con el tratamiento y/o la prevención de enfermedades dirigidas por células T como por ejemplo la diabetes tipo 1 (T1D), ya que la activación de las células T, especialmente las células T CD8+, se consideran el agente causante de esta enfermedad. Los enfoques experimentales con vacunas basadas en proteínas, tolerogénicas, se han dirigido principalmente a células B productoras de anticuerpos en lugar de células T relevantes para la enfermedad.
Las vacunas basadas en ADN, a diferencia de las vacunas basadas en proteínas, usualmente son plásmidos que codifican antígenos particulares; estos plásmidos son captados por las células en el cuerpo del huésped (“transfectados”). Después estas células huésped transfectadas producen el antígeno y procesan el antígeno en fragmentos pequeños (epítopos de células T) para la presentación al sistema inmunitario, en particular a las células T circulantes. Dado que las células T solo pueden detectar estos pequeños fragmentos antigénicos y no proteínas completas, este enfoque conduce preferentemente a una modificación de las respuestas de células T, especialmente para células T CD8+ (o células T citotóxicas), los conductores principales, por ejemplo, de la patología de T1D. Por lo tanto, las vacunas de ADN, en lugar de las vacunas con proteínas, son adecuadas para inducir respuestas de células T. Aunque actualmente no hay disponibilidad de vacunas de ADN para su uso en humanos, existen tres vacunas de ADN plasmídico, estimuladoras, autorizadas para su uso veterinario, que inducen inmunidad contra el virus de la anemia infecciosa equina, el virus del Nilo Occidental y determinados cánceres caninos.
A diferencia de las vacunas de ADN estimuladoras, las vacunas de ADN inmunoterapéuticas tolerogénicas están destinadas a suprimir la reactividad inmunitaria hacia un antígeno, en lugar de activar respuestas inmunitarias contra él. Estas vacunas no estimulan la inmunidad contra el antígeno codificado, o cambian el tipo de estimulación (como por ejemplo enfoques de vacunación de desensibilización antigénica para las alergias), pero en cambio provocan agotamiento, y/o ausencia de función y/o muerte de las células T autorreactivas. Para esto, el antígeno debe presentarse al sistema inmunitario sin coestimulación o efectos inflamatorios, que de otra manera prepararían para respuestas inmunitarias estimuladoras. Este enfoque de presentar un antígeno para que sea ignorado por el sistema inmunitario, o tolerado, puede tener valor en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, ya que así se enfocaría al mecanismo específico de la enfermedad en lugar de suprimir sistémicamente toda la respuesta inmunitaria. Una vacuna de ADN inmunoterapéutica tolerogénica es, por lo tanto, un método leve para modular las respuestas inmunitarias no deseadas.
El objetivo final de una vacuna de ADN inmunoterapéutica tolerogénica, específica para T1D, es conservar la función de las células beta y la producción de insulina endógena. Esto puede ocurrir mediante la prevención o el retraso de la enfermedad (especialmente valioso en cohortes pediátricas y de adultos jóvenes donde el seguimiento es difícil y la “normalidad” de la vida es un impulsor principal del paciente) o la extensión de la “fase de luna de miel” de seguimiento y uso de insulina mínimos que frecuentemente ocurre durante los primeros seis meses después del diagnóstico de T1D.
Gottleib y otros, (Clin Immunol 2013; 149: 297-306) describe una vacuna de ADN tolerizante para prevenir o tratar la T1D mediante el uso de plásmidos que comprenden un antígeno de insulina y una citocina (IL-10). Se sugiere además que se pueden añadir plásmidos adicionales que codifican citocinas supresoras, por ejemplo, IL-4 o IL-10. Solvason y otros, (J Immunol 2008; 181: 8298-8307) describe que una vacuna de ADN plasmídico que codifica la proinsulina II de ratón redujo la incidencia de diabetes en un modelo de ratón de T1D. El documento WO2012/062697 describe una combinación de una molécula inhibidora de IL1beta y una vacuna de ADN tolerizante contra un autoantígeno de T1D. Cailin y otros, (J Diabetes Res 2016; 1-12) describe que los ratones que recibieron combinaciones de plásmidos estaban protegidos en mayor medida que cualquier plásmido individual, incluida la proinsulina sola. Torres-Aguilar y otros, (J Clin Immunol 2010; 30; 659-688) muestra la viabilidad de las células dendríticas IL-10/TGF derivadas de monocitos para inducir tolerancia específica de antígeno en células T efectoras/de memoria generadas durante una enfermedad autoinmunitaria, pero no está relacionada con plásmidos o vacunas de ADN. Ninguna de estas referencias ha descrito un solo plásmido que codifique todo de i) un antígeno de insulina, ii) TGF-beta, iii) IL-10 e iv) IL-2 ni que se logre una eficacia mejorada de la supresión de la enfermedad T1D sin comprometer la seguridad.
Aunque se conoce que las vacunas basadas en ADN son seguras, ninguna de las vacunas de ADN (estimuladoras o tolerogénicas) que se han probado en estudios clínicos tienen suficiente potencia como enfoque independiente para el tratamiento, por ejemplo, de T1D.
Las vacunas de ADN tolerogénicas conocidas en la técnica mostraron poca eficacia y típicamente necesitaron sistemas altamente artificiales para inducir los efectos deseados. Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de vacunas de ADN inmunoterapéuticas tolerogénicas con una potencia significativamente aumentada, sin comprometer el perfil de seguridad y preferentemente, además, sin necesitar un régimen de administración inconveniente.
Breve descripción de la invención
La presente invención se refiere a un vector/plásmido multicistrónico que coexpresa/codifica un antígeno retenido celularmente, como la insulina, así como modificadores inmunitarios secretados como TGF-p, IL-10 y IL-2. La presente invención se refiere, además, a vacunas de ADN inmunoterapéuticas que comprenden tales plásmidos; así como tales formulaciones farmacéuticas y kits de estas. La presente invención finalmente se refiere al uso medicinal de tales productos; así como a métodos para producir tales plásmidos.
Los plásmidos/vacunas de ADN inmunoterapéuticas en la presente tienen un potencial terapéutico en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias que principalmente están dirigidas por células T, como por ejemplo la diabetes tipo 1 (T1D).
En un aspecto la presente invención proporciona un plásmido que codifica:
i. un antígeno de insulina;
ii. TGF-P;
iii. IL-10, y
iv. en donde dicho plásmido dirige además la expresión de Interleucina-2 (IL-2).
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Mapa de un plásmido circular.
Figura 2. Mapa del ARNm y la proteína traducida para los productos del vector del plásmido de la Figura 1.
Figura 3. Estabilidad del plásmido al cizallamiento en tres pases de inyecciones por medio de una aguja G30.
Figura 4. Confirmación del fenotipo de retención del plásmido mediante cultivo a 30°C (pases 1-50 con 17 horas de incubación y pases 51-100 con 22 horas de incubación).
Descripción
El inventor de la presente invención proporciona en la presente un vector único que dirige la expresión de múltiples citocinas secretadas, así como un antígeno retenido celularmente, a partir de un único promotor/ARNm multicistrónico.
La vacunación inmunoterapéutica con ADN con un vector único que codifica todos los componentes de la terapia en una sola célula tiene una alta preferencia con respecto a la vacunación inmunoterapéutica con una mezcla de vectores/plásmidos separados donde cada uno dirige la expresión de los componentes individuales, ya que la transfección de células al azar con diferentes vectores no garantiza la expresión de todos los componentes, o incluso ninguna relación específica de componentes, a partir de una célula transfectada, específica, determinada.
La transfección de un único plásmido/vector multicistrónico da como resultado un ambiente local/microambiente modificado genéticamente de manera específica alrededor de la célula transfectada. De esta manera, pueden añadirse combinaciones de inmunomoduladores al antígeno de manera que potencien el efecto inmunológico deseado de células T individuales sin el requisito de altas dosis sistémicas de un inmunomodulador que de otra manera pudieran provocar eventos adversos y una extensa inmunosupresión.
Esta restricción local de la producción de inmunomoduladores de las células huésped transfectadas con la vacuna de ADN inmunoterapéutica permite el uso seguro de hormonas citocinas muy potentes, que tienen un efecto sinérgico para la modificación de respuestas de células T, pero no pueden dosificarse lo suficientemente frecuente para su efecto, y/o titularse para producir la respuesta deseada, sin eventos adversos inaceptables.
Por ejemplo, tanto la interleucina 10 (IL-10) como el factor de crecimiento transformante beta1 (TGF-P1) ambos se conocen por su capacidad de inducir células T reguladoras (Treg) a partir de células T CD4+ vírgenes. Sin embargo, la combinación IL-10/TGF-P1 produce un efecto sinérgico (15 a 20 veces más eficaz) en la inducción de Treg que cualquiera de las dos citocinas solas (documento US6083919 A) y esta combinación además da como resultado una tolerancia inmunitaria en una población más amplia de células objetivo que cualquier citocina sola (Zeller JC, Panoskaltsis-Mortari A, Murphy WJ, y otros 1999 J Immunol. 163(7):3684-91).
Adicionalmente, se conoce que la interleucina 2 (IL-2) expande y estabiliza las Treg pero por otra parte también puede contribuir a respuestas inflamatorias. Sin embargo, la combinación de IL-2 e IL-10 da como resultado Treg supresoras en lugar de estimulación inflamatoria. A medida que las células T circulantes se encuentren con células transfectadas con la vacuna de ADN inmunoterapéutica de la presente, se exponen temporalmente a concentraciones subóptimas de IL-10 e IL-2. Las células T circulantes están desviadas ligeramente hacia la tolerancia, y si también son reactivas hacia el antígeno coexpresado (por ejemplo, la insulina) se unirán a la célula transfectada y por lo tanto recibirán un mayor tiempo de exposición al inmunomodulador y además recibirán también otra señal que las programa/reeduca hacia los efectos supresores. De esta manera, esas células T que son sensibles al antígeno codificado se reeducan selectivamente a un fenotipo supresor cuando se encuentran con la célula transfectada.
Por lo tanto, los plásmidos/vectores/vacunas de ADN inmunoterapéuticas en la presente se diseñan para la inducción de Treg específicas de antígenos que se acumulan en sitios de autoinmunidad para disminuir la enfermedad (por ejemplo, el páncreas en la T1D) en lugar de tener un impacto directo sobre la enfermedad a través de las hormonas citocinas expresadas.
Además de un antígeno (insulina en el ejemplo de la T1D), el vector/operón/plásmido en la presente codifica al menos dos citocinas (por ejemplo, TGF-p1 e IL-10) que juntas suprimen sinérgicamente las células presentadoras de antígenos, así como la función de las células T, y conducen a la inducción de Treg. Este efecto es potenciado si además ocurre en combinación con una exposición eficaz al antígeno.
En una modalidad, el TGF-p1 está en una forma activa constitutivamente que no requiere procesamiento o un ambiente inflamatorio para funcionar. Mientras las Treg pueden producirse a partir de células T vírgenes por medio de la exposición a un antígeno y TGF-p1, sin embargo, las Treg son “plásticas” lo que significa que pueden desdiferenciarse y convertirse en células efectoras Th17 y después provocar más, no menos, destrucción autoinmunitaria. La combinación de IL-10 con TGF-p1, además de ser un inmunomodulador más potente, suprime el ambiente que produciría células Th17 patogénicas en lugar de Treg.
En una modalidad, el vector multicistrónico en la presente también codifica IL-2 además del antígeno, TGF-pi, IL-10. La IL-2 expande la cantidad de Treg y estabiliza su fenotipo (evita que las células Treg se desdiferencien en células T efectoras) y por lo tanto aumenta su vida útil funcional en tejidos objetivo inflamados.
Por lo tanto, estas tres citocinas (TGF-p1, IL-10, e IL-2), en combinación con el antígeno, tienen efectos sinérgicos bien conocidos por inducir tolerancia mediante los siguientes mecanismos: (i) aumento significativo de la generación de Treg supresoras con especificidad antigénica, (ii) mayor vida útil de las Treg, y (iii) mayor eficacia por célula Treg individual en la supresión de inflamación/autorreactividad. Sin embargo, las concentraciones requeridas de una citocina purificada, infundida por vía sistémica, tendría una serie de efectos secundarios graves, o quizá incluso letales, como: (i) fibrosis letal debido al exceso de TGF-P1, (ii) síntomas similares a la gripe, (iii) síndrome de fuga capilar debido al exceso de IL-2, (iv) extensa inmunosupresión que conduce a infecciones crónicas, (v) potenciación del desarrollo de tumores así como (vi) anemia debido al exceso de IL-10.
Al coexpresar estas citocinas a partir del mismo vector/plásmido, y por lo tanto por la misma célula que presenta el antígeno al sistema inmunitario, el vector logra el ambiente local deseado para la inducción de la tolerancia sin acción sistémica ni los efectos secundarios correspondientes que de cualquier otra manera se producirían por la administración de dosis altas de citocinas purificadas.
La inyección de un plásmido/vector de ADN “desnudo”/ “descubierto” (vector y tampón solamente) tiene una captación y tasa de transfección muy bajas; menos de una en aproximadamente 100,000 moléculas del plásmido transfecta una célula, mientras que el resto se degrada y por lo tanto no tiene ningún efecto biológico. Esta ineficacia de transfección extremadamente baja proporciona un mecanismo seguro para distribuir y limitar las células transfectadas.
La administración de cantidades activas sistémicamente de cualquiera de estas citocinas ya sea mediante administración de proteínas maduras o mediante la transducción de alta eficiencia con un vector viral, sería difícil, si no imposible, para determinar el título para una dosis segura y eficaz. Limitar la exposición total a una dosis sistémica muy pequeña distribuida en unos pocos microambientes de alta expresión conduce a un perfil de seguridad y eficacia altamente ventajoso.
La combinación de un antígeno y estas tres citocinas en la presente produce una protección eficiente de desarrollar T1D e incluso parece ser capaz de revertir establemente la progresión de la enfermedad. Debido a la baja eficiencia de transfección de la inyección de un plásmido/vector de ADN desnudo, muy pocas células producen estas proteínas recombinantes y por lo tanto no hay un cambio detectable en los niveles séricos de citocinas que se derivan de las citocinas codificadas por el plásmido/vector, y por lo tanto no hay una estimulación inmunitaria o inmunosupresión detectables hacia ningún otro antígeno diferente del antígeno codificado por el plásmido/vector (pre-proinsulina). Esto produce un perfil de seguridad conveniente.
Normalmente, las vacunas de ADN se desempeñan pobremente con una inyección subcutánea (s.c.) y por lo tanto típicamente se administran mediante el uso de inyección intramuscular (frecuentemente con electroporación) o alternativamente mediante el uso de inyección intradérmica por chorro que requiere un dispositivo incómodo; así como un mantenimiento y calibración importantes. Dado que la mayoría de los problemas de efectos secundarios con una inyección intramuscular están relacionados con el adyuvante (irritación en el sitio de inyección), por tanto, éstos no son una preocupación para el formato de vacuna inmunoterapéutica de ADN desnudo en la presente. Adicionalmente, los volúmenes inyectados usualmente son relativamente pequeños y por lo tanto no provocan distensión muscular ni dolor importantes. En una modalidad, los volúmenes inyectados son 1 ml o menos. En otra modalidad, los volúmenes inyectados son aproximadamente 0,6 o 0,5 ml. Independientemente, el plásmido/vector de múltiples citocinas proporcionado en la presente inesperadamente parece proporcionar protección contra la T1D incluso cuando se administra a través de la vía s.c., lo que permite así múltiples formatos de dosificación posibles para los pacientes.
Además de proporcionar sinergia local, mediante la codificación de los tres o cuatro de los productos traducidos mediante un único plásmido/vector y un único promotor, los criterios de carga regulatoria y de liberación de la sustancia farmacológica también se simplifican con la provisión del plásmido multicistrónico en la presente.
Por el contrario, si cada uno de los productos proteicos se produce a partir de un plásmido separado, entonces el valor sinérgico de la coexpresión a partir de la misma célula transfectada entonces se perdería o reduciría posiblemente ya que cada transfección del plásmido/vector sería un evento independiente, probablemente dirigido a diferentes células. Si las tres a cuatro proteínas recombinantes se producen a partir de dos, tres, o cuatro plásmidos/vectores individuales, cualquier efecto sinérgico en el ambiente local de la célula transfectada se perdería posiblemente; además, entonces se necesitaría numerosos ensayos clínicos individuales (uno para cada plásmido y cada combinación). La producción de todas las proteínas a partir de un único plásmido/vector y un único ARNm disminuye los requerimientos para probar las múltiples moléculas individuales y determinar las relaciones de coempaquetamiento ideales inherentes para un formato de plásmido/vector múltiple.
Cualquiera de los formatos de vectores adecuados para la presente invención puede usarse en la presente, tales como plásmidos (replicativos o pasivos), minicírculos, vectores lineales (MiLV), vectores virales (tanto integrativos [por ejemplo lentivirales] como no integrativos [por ejemplo adenovirales]), cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC), cromosomas artificiales humanos (HAC), etcétera.
Además, cualquier método permisible de potenciación de la transfección puede usarse en la presente: por ejemplo electroporación, sonoporación (potenciación por ultrasonidos, con o sin potenciación de contraste con microburbujas), agregados de lípidos/polímeros, hidrodinámica (presión por medio de alto volumen de inyección), biobalística/pistola de genes (deposición a través de la piel por medio de gas comprimido), etcétera.
En una modalidad, el ADN plasmídico episomal no replicativo se usa en la presente debido a: i) múltiples copias de ARNm derivadas de una única transfección del plásmido, y ii) estabilidad y función prolongadas de los ácidos nucleicos plasmídicos con respecto al ARNm y otros formatos de vectores de ADN. Por lo tanto, aunque los sistemas de expresión basados en ARNm y ADN pueden proporcionar administración y colocalización intracelular, los sistemas basados en plásmidos proporcionan mayor control y persistencia de la dosificación.
En una modalidad, los plásmidos/vectores codifican cuatro proteínas:
i) un antígeno,
ii) TGF beta 1 (TGF-pi),
iii) Interleucina-10, y
iv) Interleucina-2.
En una modalidad, el antígeno es un antígeno relevante para T1D dirigido al endosoma, como la insulina o GAD65. El direccionamiento endosómico puede realizarse, por ejemplo, por medio de una fusión Ii/CD74, una fusión LIMPII/SCARB, o una fusión al receptor de la transferrina.
En una modalidad, TGF-p1 está en una forma activada.
La expresión de cuatro proteínas a partir de un plásmido/vector es posible por ejemplo si las secuencias deseadas se separan con A) promotores separados, B) unas secuencias IRES (sitio interno de entrada al ribosoma) que reclutan un nuevo ribosoma para traducir cada segmento, o C) secuencias 2A virales (por ejemplo secuencias 2A de FMDV o 2A de TaV) que se traducen e inducen una pausa/salto ribosómico que da como resultado la producción de polipéptidos separados a partir de un único marco abierto de lectura. Sin embargo, en la práctica, cada una de estas estrategias es compleja y difícil de llevar a cabo.
La expresión de cuatro proteínas independientes a partir de un único plásmido/vector se logra más fácilmente teniendo un promotor separado para cada gen. Sin embargo, este formato tiene desventajas importantes en el hecho de que A) produce un plásmido muy grande, inestable y difícil de producir, debido a la longitud excesiva de múltiples promotores, B) da como resultado un comportamiento impredecible de las proteínas traducidas entre sí (ya no se producen en proporciones fijas entre sí), C) cada promotor puede silenciarse independientemente, lo que conduce a la expresión selectiva de algunos genes pero no de otros necesarios para la eficacia total, y D) falta de simplicidad regulatoria. Por el contrario, los elementos IRES y las secuencias 2A operan a nivel del ARNm y de la traducción y coexpresan de manera reproducible proporciones fijas de cada proteína a partir de un único promotor.
Cada una de las cuatro clases de elementos IRES tiene diferentes requerimientos de cofactores para funcionar, así como diferentes requerimientos de secuencias para el gen corriente abajo que se va a traducir. Por ejemplo, el IRES del EMCV (virus de endomiocarditis) es un IRES tipo 1 de 630 pares de bases que utiliza todos los factores de iniciación de la traducción en eucariotas mientras que el IRES de CrPv (virus de la parálisis en grillos) es un IRES tipo 4 de 200 pares de bases que no requiere de cofactores, pero utiliza un codón de iniciación no estándar.
Cuando se utilizan elementos IRES de diferentes clases, interfieren entre sí de manera que cada tipo de elemento IRES solo puede usarse una vez en cada plásmido, y cuando se usan juntos, diferentes tipos de elementos IRES se atenúan entre sí (disminución en la eficacia) en maneras difíciles de predecir.
Además, el barajado de las combinaciones de genes / IRES produce relaciones impredecibles de los productos traducidos ya que las interacciones de los genes con los elementos IRES no son estáticas; sino que dependen del contexto en las secuencias de nucleótidos flanqueantes. Además, los elementos IRES imponen restricciones en las primeras pocas posiciones de aminoácidos en el inicio o inmediatamente después de este. Por ejemplo, el IRES de CrPv requiere que el primer aminoácido sea una alanina en lugar de la metionina estándar y el IRES de EMCV no puede tolerar los aminoácidos P, W, C, R, o K dentro de los primeros tres codones. En una modalidad, para acomodar las restricciones de aminoácidos en el N-terminal impuestas por el IRES de EMCV, la vacuna de ADN contiene una extensión de tres alaninas en el extremo N-terminal del gen de IL-10.
Además, cada elemento IRES comprende una cantidad sustancial de pares de bases, que varía de 230 pb a más de 700 pb; por lo tanto, la inclusión de múltiples elementos IRES aumenta el tamaño y la complejidad de los plásmidos/vectores a un grado en que muchos se vuelven inestables y difíciles de producir industrialmente debido a deleciones y recombinaciones espontáneas. Además, debido al alto grado de estructura secundaria que los elementos IRES imparten a los ARNm transcritos que los contienen, aumentan la probabilidad de activar receptores de reconocimiento de patógenos (Dabo S, Meurs EF. 2012 Viruses 4(11):2598-635) en la célula transfectada y producir efectos estimuladores contrario a la inducción de la tolerancia que se desea.
Las secuencias 2A, a diferencia de los elementos IRES, no interactúan entre sí y por lo tanto proporcionan un rendimiento estable y consistente. Sin embargo, ellas mismas son traducidas y por lo tanto afectan el plegamiento, la función y la estabilidad de los productos proteicos traducidos finales. Todas las secuencias 2A dan como resultado una fusión significativa del C-terminal (19-22 aa) sobre el extremo 5' de las secuencias que se van a separar y además comienza la secuencia 3' con una prolina. Algunas proteínas permiten estas modificaciones y algunas no, lo que conduce a restricciones prácticas para el uso de secuencias 2A. Por ejemplo, el producto de Interleucina 10 permite la cola de 2A sin embargo tanto la interleucina 2 como el TGF-p1 se pliegan de manera incorrecta y pierden su función si se expresan corriente arriba de una etiqueta 2A. Por lo tanto, aunque es posible expresar numerosas proteínas independientes separadas mediante secuencias 2A, dos de las cuatro proteínas en la presente no pueden terminar en etiquetas 2A y por lo tanto deben utilizarse otras estrategias.
Dado que cada tipo de secuencia de aminoácidos 2A modifica la función ribosómica durante la traducción de proteínas, tendrán diferentes eficacias en las dos propiedades fundamentales de la familia 2A específicamente (i) separación de los productos génicos yuxtapuestos y (ii) capacidad de procesamiento (reiniciación) en el segundo producto génico. Diferentes secuencias 2A tienen diferentes eficacias en la generación de la pausa ribosómica que rompe la cadena principal del péptido (que resulta en las dos proteínas separadas) así como diferentes eficacias en la reiniciación de la síntesis peptídica del segundo producto génico.
La capacidad de las secuencias 2A para separar productos proteicos y reiniciar la traducción de proteínas depende de la secuencia de aminoácidos 2A (Donnelly ML, Hughes LE, Luke G, y otros 2001 J Gen Virol. 82(Pt 5):1027-41). Pequeñas variaciones en las secuencias de aminoácidos 2A producen mezclas significativamente diferentes de productos génicos flanqueantes separados y fusionados, que varían desde menos del 5 % (>95 % fusionados) a completamente separados (0 % fusionados o 100 % separados).
Además, el inventor ha descubierto en la presente que secuencias de aminoácidos adyacentes que codifican los dos productos proteicos flanqueantes también afectan la eficiencia de la reiniciación y la separación de las secuencias 2A, lo que conduce a desviaciones importantes de los resultados informados. Por lo tanto, la eficiencia de reiniciación varía en dependencia del tipo de secuencia de aminoácidos 2A usada; así como del ambiente proporcionado por las secuencias de aminoácidos adyacentes, y por lo tanto la relación del producto génico pre-2A y la separación de las proteínas se determinará tanto por la secuencia de aminoácidos 2A utilizada como por su contexto.
En una modalidad, “2A de FMDV” se inserta entre la secuencia que codifica al antígeno y la secuencia que codifica al TGF-p1 en la presente; lo que resulta en 100 % de separación, así como una relación de 1:1, de los productos proteicos.
En otra modalidad, “2A de TaV” puede insertarse entre la secuencia que codifica la IL-10 y la secuencia que codifica la IL-2 en la presente, lo que resulta en aproximadamente el 50 % de los productos separados; así como una relación de 10 a 6 de los productos proteicos. Por lo tanto, cada célula transfectada suministra una dosis relativamente baja de interleucina 2, que es incapaz de estimular las células T efectoras, y una dosis mayor de interleucina 10 para desviar las células T hacia el fenotipo Treg. Dado que la producción de IL-10/IL-2 fusionadas es desventajosa, se realizaron intentos para modificar la eficiencia de escisión incrementada del segmento 2A de TaV. Un intento para preceder el segmento 2A con un “segmento aislante”, que es un elemento que extiende la región traducida corriente arriba del 2A de TaV para reducir el impacto de la secuencia corriente arriba sobre el elemento 2A, no mejoró la separación. En un intento diferente para resolver el problema de fusión, se añadió un segmento desacoplador corriente arriba con una secuencia proteica traducida de GSG; sin embargo, este enfoque produjo solo una mejora creciente de la eficiencia de escisión.
En un intento diferente para resolver el problema de fusión, se añadió un segmento desacoplador corriente arriba con una secuencia proteica traducida de GSG; sin embargo, este enfoque produjo solo una mejora creciente de la eficiencia de escisión.
En otra modalidad, el vector/plásmido en la presente tiene un segmento “2A de P”. La separación de los genes que codifican IL-10 e IL-2 mediante un P2A produce una separación completa o casi completa de los productos proteicos; así como una proporción de al menos dos veces como máximo (o quizá incluso hasta cuatro o cinco veces como máximo) de IL-10 en comparación con IL-2.
Para abordar las limitaciones de los sistemas de IRES solamente y 2A solamente descritos anteriormente, las cuatro secuencias de ADNc en la presente (antígeno, TGF-p1, IL-10, IL-2) se disponen en pares antes y después de un único IRES. Cada par se separa adicionalmente mediante una secuencia 2A, que induce saltos ribosómicos y la producción de proteínas independientes a partir de cada secuencia en el par poliproteico. Dado que el TGF-p1 y la IL-2 pueden no estar en el lado N-terminal de la fusión, uno de ellos debe terminar en el sitio IRES central y el otro debe terminar la porción traducida de la secuencia de ARNm.
Por lo tanto, la cronología/secuencia de proteínas expresadas y elementos IRES/2A en la presente puede ser de la siguiente manera: (i) Antígeno, (ii) 2A de FMDV, (iii) Tg F beta 1, (iv) IRES, (v) IL-10, (vi) 2A de P, y (vii) IL-2. Como consecuencia, las cuatro proteínas pueden expresarse independientemente a partir de un único operón/segmento génico de una manera estable y predecible. Como cada una de estas proteínas se expresa a partir de un único ARNm, las relaciones de cada producto son fijas, no es posible generar un exceso de IL-2 por encima de IL-10 por ejemplo.
Además, mediante el uso de una combinación de elementos IRES y 2A para la separación de los genes codificados, una solución alternativa en la presente puede ser el uso de un promotor bidireccional para generar 2 ARNm - cada uno de estos ARNm codificaría un par de proteínas en lugar de las cuatro en una molécula de ARNm. Por lo tanto, pueden construirse disposiciones equivalentes con la utilización de pares de casetes de expresión dispuestos adecuadamente alrededor de un promotor bidireccional de mamífero y con la utilización de secuencias 2A y/o elementos IRES separados. Este enfoque, sin embargo, se asocia con desventajas, principalmente debido al gran tamaño de los promotores bidireccionales, pero además un aumento potencial de la carga regulatoria que tienen los elementos de ARNm separados incluidos en un producto medicinal. Por lo tanto, las modalidades preferidas en la presente utilizan un único promotor y una combinación de elementos IRES y 2A en lugar de un promotor bidireccional.
En teoría, algunas secuencias 2A pueden reemplazarse con secuencias sensibles a proteasas intracelulares endógenas. Sin embargo, el inventor ha descubierto en la presente que tales proteasas se asocian con desventajas importantes (por ejemplo, carencia de una función reportada lo que resulta en la secreción de productos proteicos fusionados).
Para que el antígeno sea procesado y presentado al sistema inmunitario dentro del ambiente local de las hormonas citocinas codificadas por el plásmido, el antígeno debe ser retenido dentro de la célula transfectada. En el caso de la diabetes tipo 1, la producción de insulina activa conduciría potencialmente a una disminución indeseable de la glucosa en sangre si fuera a secretarse o liberarse de cualquier otra manera de la célula transfectada.
Para evitar la secreción del antígeno, cualquiera de las señales de secreción puede eliminarse de la secuencia que codifica al antígeno, por ejemplo, eliminación de la secuencia codificante de la señal de secreción de la secuencia de ácido nucleico que codifica la pre-proinsulina, por lo tanto, se generaría proinsulina en lugar de pre-proinsulina, lo que permite así que el antígeno se acumule dentro de la célula transfectada. Aunque este producto antigénico traducido (por ejemplo, insulina) no se secretaría activamente, puede liberarse durante la lisis debido a la necrosis resultante del ataque por células T CD8+. Adicionalmente, la secuencia señal de insulina es una región conocida por contener epítopos relevantes a la enfermedad (que potencialmente inducen autoinmunidad) y por lo tanto la inclusión de la secuencia señal asegura una más amplia inducción de tolerancia y una mayor probabilidad de reducir la enfermedad.
Adicionalmente, la retención citoplásmica del antígeno solo permite el procesamiento por medio del proteasoma y la presentación mediante la vía MHC clase I, que detecta patógenos intracelulares por medio de células T CD8+. Dado que las células T CD4+ son contribuyentes importantes para las citocinas proinflamatorias y la mayoría, si no todas, las Treg supresoras de autoinmunidad son CD4+, puede ser ventajoso ampliar la presentación de antígeno para incluir MHC clase II, que es reconocido por las células T CD4+.
El procesamiento para MHC clase II y la estimulación de células T CD4+ normalmente no incluyen un antígeno intracelular, ya que el acceso a esta vía es por medio de endocitosis del antígeno extracelular. Normalmente, los productos proteicos producidos dentro de una célula transfectada solo son presentados por medio de la vía de procesamiento intracelular/proteasómica predeterminada y MHC clase I, lo que resulta en efectos de células T CD8+ pero no efectos de células T CD4+. Para dirigirse tanto a células T CD4+ como CD8+ para la inmunomodulación la modalidad preferida incluye, además, factores que conducen a la presentación por MHC clase II.
En principio, para inducir la presentación por MHC clase II, el antígeno puede fusionarse a cualquier pareja que dirija la fusión a un compartimento endosómico, pero existen diferencias funcionales en cuanto a actividad y exposición. El receptor de la transferrina, conocido además como receptor de la proteína transportadora de hierro, fusiona el ciclo de la membrana plasmática/espacio extracelular al endosoma y por lo tanto también puede exponer otras células inmunitarias al antígeno completo, como células B, macrófagos, etcétera. Las fusiones LimpII/SCARB se dirigen directamente al endosoma, pero preferentemente al endosoma temprano y a veces dan como resultado un sobreprocesamiento y destrucción total del antígeno. Las fusiones de Ii (CD74), que utilizan la misma señal de chaperonas que usa el MHC clase II para la localización en endosomas tardíos, suministra el antígeno y el MHC clase II a las mismas vesículas en la misma etapa del desarrollo y maximiza la posibilidad de presentar eficazmente el antígeno en el contexto de MHC clase II. Adicionalmente, incluso con clasificación endosómica a partir de las fusiones de Ii, la secuencia de secreción de preproinsulina debe volverse inactiva o el antígeno también se secretaría y perdería antes del procesamiento.
El bloqueo de la secreción del antígeno de insulina alternativamente se ha logrado en la presente mediante la mutación de dos aminoácidos necesarios para la eliminación de la etiqueta de secreción por la SRP (partícula de reconocimiento de señales) en el retículo endoplásmico rugoso. Las mutaciones de Ala (A) a Glu (E) suprime completamente la maduración y secreción de pre-proinsulina, a la vez que se mantiene la estructura requerida del epítopo del antígeno para una mejor inducción de la tolerancia.
En una modalidad, la vacuna de ADN plasmídico se usa en la presente. El plásmido se cultiva/replica por ejemplo en E. coli, y se aísla/purifica a partir del medio, y posteriormente se formula en formulaciones líquidas por ejemplo agua, solución salina, formulaciones líquidas en PBS, o como un polvo liofilizado para una inyección intradérmica por chorro, administración intranasal o inhalación. En una modalidad, el plásmido en la presente se formula en una formulación farmacéutica acuosa que comprende opcionalmente estabilizadores. Cualquier sistema microbiano adecuado puede utilizarse para la producción de plásmidos.
Los estabilizadores en la formulación incluyen, agentes quelantes, como EDTA, EGTA, o DPTA para limpiar Mg++ y Fe+++ que de cualquier otra manera pueden estar implicados en la degradación de ADN, y/o citrato, que protege el plásmido de los efectos de degradación no específicos. En una modalidad, el plásmido en la presente puede formularse en PBS isotónico o alternativamente TRIS citrato EDTA. Tales plásmidos tienen las ventajas de ser estables, fáciles de producir y seguros y convenientes durante el uso.
En otra modalidad, pueden añadirse agentes de suministro, como virus, lípidos, liposomas, coempaquetamiento etcétera, junto con la presente invención. Sin embargo, el uso de agentes de suministro en la presente puede tener posibles problemas con la inmunidad, la integración viral, etcétera.
Definiciones
Antígeno: la vacuna de ADN inmunoterapéutica en la presente codifica un antígeno. El antígeno en la presente puede ser cualquier tipo de proteína inmunogénica asociada con una enfermedad o fragmento de esta que pueda ser reconocida por el componente de células T del sistema inmunitario. Por ejemplo, en el caso del tratamiento o prevención de la diabetes tipo 1, puede usarse un antígeno de insulina. En un ejemplo, el antígeno de insulina es el péptido inmunodominante InsB 9-23. Para las vacunas de ADN inmunoterapéuticas para la esclerosis múltiple en la presente, puede usarse como antígeno una proteína básica de la mielina (MBP), proteína de la mielina de oligodendrocitos (MOG), y/o antígeno de la proteína de proteolípidos (PLP). Las secuencias que codifican antígenos proteicos similares para antígenos representativos de alopecia, polimiositis/dermatomiositis, celiaquía, y alergenos proteicos (por ejemplo, proteína de maní ara h 2) también son ejemplos de antígenos adecuados para usar en las vacunas de ADN inmunoterapéuticas en la presente.
Direccionamiento de antígenos: En una modalidad, el antígeno en la presente se direcciona de manera endosómica. Los antígenos en la presente incluyen proteínas completas, pre-proteínas de secreción deficiente, o un fragmento peptídico funcional o inmunodominante de estas.
Por ejemplo, el antígeno de insulina en la presente es un antígeno para usar en una terapia inmunomoduladora y no un agente de disminución de glucosa. Por lo tanto, no debe procesarse/madurarse o secretarse para asegurar que se presenta en moléculas MHC a las células T circulatorias. Por lo tanto, la vacuna de ADN inmunoterapéutica en la presente no resulta en un aumento de los niveles de insulina en la sangre; sino que más bien resulta en un aumento de la presentación de antígenos al sistema inmunitario, en particular las células T.
Por lo tanto, el antígeno de insulina en la presente puede ser fragmentos que codifican péptidos inmunodominantes pequeños (por ejemplo péptido B 9-23 de la cadena de insulina, que incluye péptidos de registro desplazado que muestran epítopos equivalentes de células T), proinsulina completa, que carece de la secuencia de secreción requerida pero de otra manera intacta, o muteínas de pre-proinsulina que contienen la secuencia de secreción pero están modificadas para prevenir la función secretora.
Los ejemplos de antígenos de insulina en la presente incluyen:
Proinsulina de ratón (SEQ ID NO 1):
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICS LYQLENYCN
Proinsulina humana (SEQ ID NO 2):
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICS LYQLENYCN
La pre-proinsulina de ratón modificada que no se secreta (sustituciones con relación a la pre-proinsulina wt mostrada en letras negritas y subrayadas (SEQ ID NO 3)):
MALWMRLLPLLALLALWGPDPEQEFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGS LQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
La pre-proinsulina humana modificada que no se secreta (sustituciones con relación a la pre-proinsulina wt mostrada en letras negritas y subrayadas (SEQ ID NO 4)):
MALWMRLLPLLALLALWGPDPEQEFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGS LQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
Pre-proinsulina wt de ratón (SEQ ID NO 5):
ALWMRLLPLLALLALWGPDPAQAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSL QPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
Pre-proinsulina wt humana (SEQ ID NO 6):
MALWMRLLPLLALLALWGPDPAQAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGS LQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
Péptido de insulina “InsB 9-23” idéntico entre ratón y humano:
SHLVEALYLVCGERG (SEQ ID NO 7)
InsB 9-23 modificado (sustituciones con relación a InsB 9-23 wt mostrada en letras negritas y subrayadas (SEQ ID NO 8) y (SEQ ID NO 27)):
SHLVEALYLVCGEEG y SHLVEALYLVCGGEG
Por lo tanto, los antígenos de insulina en la presente pueden acumularse en el citosol de la célula huésped transfectada y por lo tanto pueden presentarse por medio de MHC clase I, o liberarse tras la citolisis.
El direccionamiento endosómico que resulta en presentación por MHC clase II puede lograrse en la presente por medio de la fusión de la secuencia del antígeno con secuencias líder que forman segmentos transmembrana con secuencias “YXX0” citoplásmicas, en donde Y es tirosina, X es cualquier aminoácido, y 0 es un aminoácido hidrofóbico voluminoso como triptófano o isoleucina, “[DE]XXXL[LI]” donde D y E son ácido aspártico o glutámico respectivamente, mientras que L e I son leucina e isoleucina respectivamente, o señales de clasificación endosómica/lisosómica “DXXLL”, que están subrayadas en las siguientes secuencias ilustrativas. Por lo tanto los dominios proteicos que incluyen estas señales dirigen o ciclan al endosoma/lisosoma incluyen: receptor de la transferrina, LimpII, o CD74, conocido además como cadena invariante, chaperona MHC II, o Ii, o cualquier dominio similar.
Los ejemplos de dominios de direccionamiento endosómico en la presente descripción incluyen:
Dominio de direccionamiento endosómico de CD74 de ratón / cadena invariante (Ii) (SEQ ID NO 9):
MDDQRDLISNHEQLPILGNRPREPERCSRGALYTGVSVLVALLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTITSQNLQLESLRM KLP
Dominio de direccionamiento endosómico de CD74 humano / cadena invariante (Ii) (SEQ ID NO 10):
MHRRRSRSCREDQKPVMDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFLYQQQG RLDKLTITSQNLQLESLRMKLP
Diabetes tipo 1: La diabetes tipo 1 (T1D) es considerada una enfermedad autoinmunitaria crónica, donde las células T autoagresivas infiltran los islotes de Langerhans en el páncreas y juegan un papel importante al destruir específicamente la población de células beta productoras de insulina. Una vez que se ha destruido una cantidad importante de células de los islotes, las cantidades reducidas de insulina, o la ausencia total de insulina, dará como resultado una deficiencia de insulina e hiperglucemia en el paciente. Por tanto, los pacientes con T1D son incapaces de producir suficiente insulina y necesitan inyecciones regulares de la hormona a lo largo de la vida. Algunos pacientes con diabetes tipo 1 son diagnosticados con “diabetes tipo 1,5”, “diabetes autoinmunitaria latente”/LADA, “diabetes doble” etcétera, que son enfermedades de diabetes que muestran síntomas de diabetes tipo 1 y diabetes tipo 2; por tanto todas las enfermedades de diabetes que muestran trenes de ambas diabetes tipo 1 y tipo 2 también están contenidas en el término “diabetes tipo 1” en la presente.
Vacuna de ADN tolerogénica: Las vacunas/vectores/plásmidos inmunoterapéuticos basados en ADN en la presente se diseñan para desactivar o regular negativamente la parte del sistema inmunitario responsable por destruir las células “propias” normales saludables y por lo tanto prevenir o disminuir la autoinmunidad basada en células T. El término “vacuna de ADN inmunoterapéutica” como se usa en la presente está destinado a referirse a un compuesto o composición que comprende una molécula de ADN y que se administra a un sujeto para reducir el riesgo de dicho sujeto a desarrollar una o más enfermedades.
En algunas modalidades, las vacunas inmunoterapéuticas basadas en ADN en la presente son plásmidos/vectores que codifican antígenos particulares. Después de la vacunación, estos plásmidos son captados por, en otras palabras, transfectados a células presentadoras de antígenos en el cuerpo del huésped. Las células huésped “transfectadas” producen después el antígeno y presentan fragmentos pequeños del antígeno al sistema inmunitario, en particular a las células T. Este enfoque conduce a una modificación de las respuestas de células T específicas para el antígeno codificado; así como una modificación mínima a las respuestas inmunitarias a otros antígenos (no codificados o “irrelevantes”). Solo muy pocas células huésped se transforman típicamente con el plásmido/vector vacunal de ADN en la presente, lo que significa que probablemente menos de una de cien mil, una de quinientos mil, o incluso menos de una de un millón de moléculas del plásmido/vector finalmente entran en una célula huésped. Por tanto, las vacunas de ADN en la presente representan un enfoque muy leve y específico para modular respuestas inmunitarias contra antígenos como la insulina en pacientes con T1D o pacientes en riesgo de desarrollar T1D. Plásmido: Un plásmido es una molécula pequeña de ADN que se encuentra más comúnmente en bacterias como moléculas de ADN pequeñas, circulares y bicatenarias. Los plásmidos artificiales se usan ampliamente como vectores en la clonación molecular, sirviendo de conductores de la replicación de secuencias de ADN recombinantes dentro de los organismos huésped. Los plásmidos pueden modificarse genéticamente para ser adecuados para usar como vacunas de ADN inmunoterapéuticas. Los plásmidos se consideran replicones, una unidad de ADN capaz de replicarse de forma autónoma dentro de un huésped adecuado. Los plásmidos pueden transmitirse de una bacteria a otra bacteria, que puede ser de la misma especie bacteriana o de especies diferentes mediante tres mecanismos principales: transformación, transducción y conjugación. Los plásmidos para vacunas de ADN pueden ser captados por una célula huésped mediante transformación pasiva, usualmente a una tasa relativamente baja. Los plásmidos en la presente se replican eficazmente, pero no conducen a la expresión de proteínas, en bacterias. Los plásmidos en la presente también conducen a la expresión de proteínas, pero no a la replicación del plásmido, en seres humanos y otros mamíferos, por ejemplo, ratones. En una modalidad, un vector pVAX1 (Invitrogen/LifeTechnologies) se usa como soporte en la presente para insertar los elementos que son parte de la presente invención. Otros soportes de vectores adecuados en la presente incluyen cualquier cadena principal de vector que contenga un elemento promotor eucariota, un origen de replicación de procariota con alto número de copias, y un sistema de selección para el mantenimiento del plásmido.
Gen de selección y sistema de selección: En un aspecto, las vacunas de ADN inmunoterapéuticas en la presente comprenden un gen de selección/marcador de selección para propósitos de producción. El marcador de selección en la presente es, por ejemplo, un gen que confiere resistencia a una toxina celular, por ejemplo, un antibiótico como ampicilina, kanamicina, cloranfenicol, estreptomicina, etcétera.
Otros tipos de sistemas de selección adecuados en la presente incluyen, por ejemplo, sistemas de silenciamiento letales condicionales (por ejemplo, sistemas del tipo CcdA/CcdB o ParD/ParE Hok/Sok), o secuencias que complementan un defecto genómico en la cepa celular de producción y por lo tanto permite el cultivo de un huésped que de otra manera sería inviable (por ejemplo, complementación auxotrófica dapD- o pyrF-, complementación del inicio de la traducción infA-, etcétera)
Las células de producción que albergan el plásmido/vacuna de ADN, que incluye el marcador de selección, sobrevivirán cuando se expongan a la toxina/antibiótico/condición, mientras que las que no captaron las secuencias plasmídicas morirán. Como tal, en una modalidad, las vacunas de ADN en la presente comprenden la secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de selección para proporcionar un mayor rendimiento/pureza y una producción/replicación más eficiente en las células de producción, como E.coli.
Si bien la selección con antibióticos es una estrategia común en el laboratorio pueden existir ventajas asociadas con sistemas de selección sin antibióticos, por ejemplo, con relación a procesos regulatorios más eficientes. Aunque en la presente también pueden usarse vectores que no contienen un mecanismo de selección como minicírculos, vectores lineales sintéticos, etcétera, estas implementaciones se asocian con ciertas desventajas en la producción, en particular debido a un aumento de los costos de producción y de control de la calidad.
Los ejemplos de estrategias de complementación (“rescate”) se conocen en la materia anterior, sin embargo, estas estrategias tienen varias desventajas.
Los sistemas de complementación metabólica como los sistemas dapD [biosíntesis de lisina] o pyrF [biosíntesis de uridina], frecuentemente dan como resultado una “alimentación cruzada” durante la producción de alta densidad en E.coli, donde una bacteria que contiene un plásmido producirá y secretará un exceso del compuesto requerido y así se “relaja” la presión de selección para las bacterias vecinas sin el plásmido.
Otro ejemplo de un sistema de selección adecuado en la presente son los plásmidos que codifican proteínas esenciales, como infA, que codifica el IF1 / factor de iniciación 1, necesario para la síntesis de proteínas. En este sistema de selección, la alimentación cruzada no ocurre porque la proteína infA no es secretada. Sin embargo, no es posible modificar adicionalmente el plásmido o expandir las células deficientes del plásmido ya que no hay manera de complementar exógenamente la proteína/infA requerida (J Bacteriol. Ene de 1994;176(1):198-205 y J Biotechnol.
1 de jul de 2004;111(1):17-30).
Para evitar las desventajas asociadas con el sistema de selección de infA, un sistema de selección alternativo se ha proporcionado en la presente con un interruptor de la traducción sensible a la temperatura (o “termosensor”) del gen de la proteína de invasión prfA de L. monocytogenes (Cell. 6 de sep de 2002;110(5):551-61). Mediante la colocación de la porción formadora de la horquilla de una secuencia “termosensora” de ARN corriente arriba de las copias genómicas de E.coli de infA mediante una tecnología de recombinación estándar, su expresión se puede regular mediante el control de la temperatura de fermentación, que permite un cultivo lento de las células sin plásmido a 37°C, y una muerte celular rápida a temperaturas <30°C. La transformación de la cepa de producción de E.coli termosensible modificada genéticamente con plásmidos que expresan infA wt permite así velocidades de cultivo totalmente normales a todas las temperaturas, lo que permite la expansión sin plásmido a 37°C así como la selección rigurosa para el plásmido a 30°C. Adicionalmente, este sistema no genera presión selectiva para que E.coli wt retenga el plásmido y por lo tanto se pierde en 8 horas en cultivo, lo que asegura la no persistencia ambiental del plásmido terapéutico.
Secuencia de nucleótidos de infA de E.coli wt (SEQ ID NO 11):
ATGGCCAAAGAAGACAATATTGAAATGCAAGGTACCGTTCTTGAAACGTTGCCTAATACCATGTTCCGCGTAGAG TTAGAAAACGGTCACGTGGTTACTGCACACATCTCCGGTAAAATGCGCAAAAACTACATCCGCATCCTGACGGG CGACAAAGTGACTGTTGAACTGACCCCGTACGACCTGAGCAAAGGCCGCATTGTCTTCCGTAGTCGCTGA
Secuencia de la proteína IF1 de E.coli wt resultante de la traducción del gen de infA (metionina inicial/M no incluida en la fusión de prfA -(SEQ ID NO 12)):
MAKEDNIEMQGTVLETLPNTMFRVELENGHVVTAHISGKMRKNYIRILTGDKVTVELTPYDLSKGRIVFRSR
Por tanto, las líneas celulares de producción de E. coli usadas en la presente para la producción de plásmidos vacunales de ADN inmunoterapéuticos pueden albergar la siguiente secuencia de nucleótidos de prfA termosensible: Secuencia de nucleótidos de prfA (“horquilla termosensora”) de L.monocytogenes wt (Shine Dalgarno subrayada, ATG inicial en letras negritas -(SEQ ID NO 13)):
TGTAAAAAACATCATTTAGCGTGACTTT CTTTCAACAGCTAACAATTGTT GTTACTGCCT AAT GTTTTT AGGGTATT TTAAAAAAGGGCGATAAAAAACGATTGGGGGAT GAGAAAT GAACGCTCAA
Secuencia de la proteína de prfA de L.monocytogenes wt (fusionada corriente arriba de IF1 de E.coli, que resulta de la traducción de la SEQ ID NO 13):
MNAQ
Origen de replicación (“Ori”): El origen de replicación, denominado además origen replicativo, es una secuencia en particular en un genoma en el cual se inicia la replicación de la cadena de ADN. En una modalidad, los sitios de origen de replicación en la presente incluyen “pUC Ori” que permite la replicación en la línea celular de producción de E. coli bacteriana, pero no en las células huésped de mamíferos, es decir, células del cuerpo del sujeto/persona/paciente vacunado. Otros orígenes de replicación bacteriana adecuados en la presente incluyen: R6K, pBR322, ColE1, pMB1, 15A, pSC101, etcétera. En un aspecto, el origen de replicación en la presente es una versión de gran número de copias que produce una alta proporción de plásmido/biomasa para una producción más eficiente. En la presente también pueden usarse vectores que no contienen un origen de replicación, como minicírculos, vectores lineales sintéticos, etcétera.
Promotor: Un promotor es una región de ADN que inicia la transcripción de un gen en particular. Los promotores se ubican cerca de los sitios de inicio de la transcripción de los genes, en la misma cadena y corriente arriba en el ADN, que es hacia la región 5' de la cadena sentido. Para que la transcripción tenga lugar, la ARN polimerasa debe unirse al ADN cerca de un gen. Los promotores contienen secuencias de ADN específicas, tales como elementos de respuesta, que proporcionan un sitio de unión inicial seguro para la ARN polimerasa y para los factores de transcripción que reclutan la ARN polimerasa. Los factores de transcripción tienen secuencias activadoras o represoras específicas que se unen a promotores específicos y regulan la expresión génica. Por lo tanto los promotores representan elementos críticos que pueden funcionar junto con otras regiones reguladoras, como potenciadores, silenciadores, elementos de límite/aisladores, para dirigir el nivel de transcripción de un gen determinado. Un promotor clásico conduce a la producción de un único ARN mensajero (ARNm), mientras que los promotores bidireccionales en la presente conducen a la producción de dos ARNm inmediatamente adyacentes al promotor, ambos corriente arriba y corriente abajo del promotor.
En una modalidad, se usan promotores eucarióticos en la presente. Los promotores eucarióticos no necesariamente obedecen a la regla de un gen/un promotor, como los numerosos promotores virales; así como los promotores que muestran una expresión amplia (es decir no tienen especificidades restringidas al tipo celular como la expresión solo en neuronas). Los ejemplos de promotores en la presente que son capaces de conducir a una amplia transcripción de grandes moléculas de ARNm con múltiples genes incluyen: los promotores virales inmediato temprano (IE) del CMV y de SV40; promotores endógenos de EF1a, PGK1, Ubc, y beta actina; y promotores sintéticos como el promotor híbrido de CAG. Existen muchos otros promotores de mamíferos adecuados y otros se diseñan actualmente por esfuerzos de biología sintética. Cualquier promotor que produzca las características de expresión deseadas en las células humanas puede usarse en los plásmidos vacunales de ADN inmunoterapéuticos en la presente.
Potenciadores: Los potenciadores son elementos de ADN que aumentan la eficiencia de los promotores en la producción de transcritos de ARNm. Los potenciadores en la presente pueden coincidir (por ejemplo, potenciador de SV40/promotor de CMV) o no. Cualquier combinación de potenciador/promotor adecuada para la función eucariótica puede usarse en la presente.
Inicio de la traducción en eucariotas: La secuencia de inicio de la traducción en eucariotas es referida usualmente como la secuencia consenso “Kozak”. La secuencia Kozak en una molécula de ARNm es reconocida por el ribosoma como el sitio de inicio de la traducción, a partir del cual es codificada una proteína. El ribosoma eucariótico necesita esta secuencia, o una variación de esta, para iniciar la traducción de proteínas. Las secuencias Kozak son degeneradas o variables y raramente coinciden con secuencias consenso. De hecho, las secuencias Kozak consenso son típicamente menos eficientes que las variantes de tipo silvestre aisladas de ARNm de mamíferos. Aunque las secuencias Kozak débiles se aíslan regularmente de ARNm nativos y probablemente juegan un papel en el control traduccional de proteínas de poca abundancia, las vacunas de ADN inmunoterapéuticas en la presente preferentemente codifican una secuencia Kozak de eficiencia media o alta. Los ejemplos de secuencias Kozak útiles en la presente comprenden la siguiente secuencia de nucleótidos: gccRccATGG (SEQ ID NO 14), donde las bases en minúsculas son los nucleótidos más comunes, pero pueden variar mientras que los nucleótidos en mayúsculas son fijos (R es el código de ambigüedad de la IUPAC para las bases A o G), y el ATG indica el sitio de inicio traduccional del codón de metionina en la posición 1.
Señal de clasificación al endosoma: Un endosoma es un compartimento unido a la membrana dentro de las células eucariotas. Algunas proteínas pueden transportarse a los endosomas y en ellos se degradan a fragmentos peptídicos. Los fragmentos peptídicos pueden unirse a las moléculas MHC presentes en el endosoma para formar complejos de MHC/péptido, que posteriormente pueden transportarse a la superficie celular para ser presentados a las células T circulantes, particularmente las células T CD4+. La clasificación de las proteínas a los endosomas está mediada por señales presentes dentro de los dominios citosólicos de las proteínas. Las señales endosómicas son usualmente secuencias de aminoácidos lineales cortas. Los antígenos en la presente son direccionados preferentemente a los endosomas mediante el uso de una señal de clasificación al endosoma, como por ejemplo las señales de clasificación endosómicas/lisosómicas YXX0, [DE]XXXL[LI], o DXXLL. Las señales de clasificación al endosoma incluyen diversas señales de clasificación al endosoma de origen natural o sintético. Los ejemplos en la presente incluyen las señales de clasificación al endosoma presentes en Cd74/cadena invariante/Ii, LimpII/SCARB, o receptor de la transferrina. Puede utilizarse cualquier dominio de direccionamiento endosómico que sea farmacéuticamente aceptable y proporcione la función deseada. La fusión de tales dominios de direccionamiento endosómico a los antígenos los dirige al compartimento endosómico después de la traducción para un aumento de la eficacia. La clasificación endosómica de los antígenos confiere un procesamiento y una presentación al sistema inmunitario en complejos con el MHC clase II, además de una presentación constitutiva en complejos con el MHC clase I, para una inducción más completa y robusta de la tolerancia y posible expansión de las Treg (que no puede lograrse por medio de los complejos de MHC clase I / antígeno). En una modalidad, las vacunas de ADN tolerogénicas en la presente codifican una fusión del antígeno con CD74/cadena invariante/Ii para conducir a un direccionamiento endosómico y presentación del antígeno mediante el MHC clase II.
Intrones: Los intrones son secuencias no codificantes dentro de un ARNm. Se conoce que algunos intrones aumentan significativamente la traducción y función del ARNm. En consecuencia, la inclusión de secuencias intrónicas también puede usarse en la presente. Pueden utilizarse intrones estándar, como beta-globina, o cualquier intrón que obedezca a las convenciones de corte y empalme en mamífero, tal como MCM7. En una modalidad, los vectores vacunales inmunoterapéuticos de ADN en la presente comprenden secuencias que codifican uno o más intrones. En otra modalidad, los vectores vacunales inmunoterapéuticos de ADN en la presente no poseen secuencias que codifiquen intrones.
Etiqueta de pausa ribosómica: En conjunto con la presente invención, puede ser una ventaja la inclusión de una o más secuencia(-s) de etiquetas de pausa ribosómica entre las secuencias codificantes de proteínas en el vector/plásmido vacunal de ADN inmunoterapéutico en la presente para separar los productos proteicos.
Un ejemplo es la “etiqueta 2A de FMDV” viral (etiqueta 2A del virus de la enfermedad de pies y boca). La secuencia de aminoácidos traducida de 2A de FMDV es APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP -(SEQ ID NO 15). La etiqueta 2A del FMDV es capaz de detener y reiniciar el ribosoma. La relación del producto traducido antes y después de la etiqueta 2A del FMDV está cerca de 1:1 y los productos proteicos resultantes normalmente están completamente separados. Estos tipos de etiquetas de ribosomas se han usado previamente junto con la coexpresión de dos dominios diferentes, por ejemplo, la cadena pesada y la cadena ligera en la producción de anticuerpos recombinantes. Sin embargo, el inventor de la presente invención ha realizado el sorprendente descubrimiento de que son útiles junto con vacunas de ADN multicistrónicas tanto para la separación de productos flanqueantes como para el control de las relaciones de las proteínas expresadas debido a eficiencias inherentes de la reiniciación ribosómica. Las etiquetas de secuencias que favorecen una relación 1:1 de los productos traducidos, preferentemente en la presente se insertan entre dos secuencias codificantes de proteínas que deben producirse preferentemente en (o cerca de) una relación de 1:1 como por ejemplo un antígeno de insulina y una citocina potente como por ejemplo TGF-p.
Otro ejemplo de una secuencia de etiqueta de pausa ribosómica en la presente es la etiqueta de secuencia viral “2A de TaV” (2A del virus de Thosea asigna - secuencia de aminoácidos traducida de 2A de TaV: RAEGRGs LlTCGDVEENPGP (SEQ ID NO 16). La relación del producto traducido antes/corriente arriba y después /corriente abajo de esta etiqueta se reporta que es 50:1 (o cerca de este valor). El inventor de la presente invención ha realizado el sorprendente descubrimiento que mientras este tipo de etiqueta puede usarse para controlar los niveles de expresión en casos donde es vital que un producto traducido domine absolutamente sobre otro, la separación de los productos de citocinas flanqueantes es menos del 50 % respecto a las secuencias descritas en la literatura y la relación de expresión es por lo tanto aproximadamente 10:6. En conjunto con la presente invención, un tipo 2A de la secuencia de etiqueta de pausa ribosómica debe producir preferentemente diferentes niveles de expresión de dos proteínas codificadas por el mismo vector/plásmido. La expresión de pequeñas cantidades de una citocina pleiotrópica (como IL-2) con respecto a una citocina antiinflamatoria, como IL-10, es conveniente en la presente, y los productos fusionados no son convenientes.
Un ejemplo adicional de una secuencia de aminoácidos de una etiqueta de pausa ribosómica en la presente es la secuencia viral “2A de P” (2A del teschovirus-1 porcino, ATNFs LlKQAg Dv EENPGP -(SEQ ID NO 17)). Las secuencias 2A de P funcionan adecuadamente cuando se insertan entre IL-10 e IL-2 en la presente, lo que da como resultado una separación casi completa con una relación de la expresión de > 5:1 entre IL-10 e IL-2.
Alternativamente, en la presente pueden usarse secuencias sensibles a proteinasas, que permiten una escisión endógena entre las poliproteínas expresadas por el plásmido. Una secuencia sensible a furina (que reconoce porciones RAKR) o una secuencia sensible a carboxipeptidasas (que reconoce porciones RRRR, RKRR o RRKR) pueden usarse en la presente para separar los productos proteicos. Sin embargo, el inventor de la presente invención ha realizado el sorprendente descubrimiento de que ni las secuencias de escisión por furina ni por carboxipeptidasas dan como resultado productos separados en la presente, lo que conduce así a una secreción de proteínas de fusión de IL-10/IL-2 no deseadas.
TGF-b/P/P1 (Factor de crecimiento transformante beta/p1): El TGF-p es una proteína secretada que controla la proliferación, la diferenciación celular y otras funciones en la mayoría de las células. El TGF-p es una citocina muy potente con efectos importantes sobre el destino celular y el fenotipo de una manera dependiente del contexto, por ejemplo, en dependencia de las otras señales de citocinas recibidas concurrentemente. El TGF-p endógeno se produce en una forma latente asociada con la superficie externa de la membrana de la célula productora y requiere activación (por ejemplo, por macrófagos inflamatorios que expresan CD36 y plasmina proteinasa) para la maduración y liberación de la forma activa. En una modalidad, el TGF-p en la presente es una forma modificada que es activa constitutivamente. Esto se logra mediante el reemplazo de las cisteínas en las posiciones 223 y 225 con aminoácidos incapaces de formar puentes disulfuro. Por ejemplo, la serina o la valina se usan para reemplazar las cisteínas en las posiciones 223 y 225. Esto da como resultado una estructura de pro-proteína activa que se libera al microambiente local.
Secuencia de TGF-p1 endógena humana - SEQ ID NO 18:
MPPSGLRLLLLLLPLLWLLVLTPGRPAAGLSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLAL YNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLL RLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQV DINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWI HEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCK CS.
Secuencia de TGF-p1 humana modificada que es activa y secretada constitutivamente (sustituciones con relación al TGF-p1 wt mostrado en letras negritas y subrayadas) - s Eq ID NO 19:
MPPSGLRLLLLLLPLLWLLVLTPGRPAAGLSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLAL YNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLL RLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHVSVDSRDNTLQV DINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWI HEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCK CS.
Otra secuencia de TGF-p1 humana modificada que puede usarse es la SEQ ID NO 25:
MPPSGLRLLLLLLPLLWLLVLTPGRPAAGLSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLAL YNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLL RLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHSSSDSRDNTLQV DINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWI HEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCK CS.
Secuencia de terminación: un terminador de la transcripción es una sección de una secuencia de ácido nucleico que marca el final de un gen durante la transcripción. La liberación del complejo transcripcional libera la ARN polimerasa y la maquinaria transcripcional relacionada para comenzar la transcripción de nuevos ARNm. Adicionalmente, los mismos factores celulares añaden una “cola de poli-A” sin molde que aumenta significativamente el tiempo de vida y la funcionalidad del ARNm. Un ejemplo de un terminador de la transcripción adecuado en la presente incluye el terminador “bGH_PA”, CGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCC ACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGG GGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGG CTCTATGG (SEQ ID NO 20).
Cualquier secuencia terminadora aceptable puede utilizarse en la presente. Las variaciones incluyen el uso de dos secuencias terminadoras flanqueantes diferentes en el caso de promotores bidireccionales que producen dos ARNm orientados de manera opuesta.
En una modalidad el plásmido de la invención tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO 24.
En una segunda modalidad el plásmido de la invención tiene la secuencia SEQ ID NO 26: secuencia del plásmido completo (no anotada) GACTCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG GGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACC GCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTG ACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCC CCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTAC TTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGG ATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAA TCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGG GAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACT CACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTG TGGTGGAATTCTGCACTGCAGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACG CCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAA AGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCT TTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTAGGTAAGTTAATGAGACAGATAGAAACTGGTCTTGTAGAAACAGAGTAG TCGCCTGCTTTTCTGCCAGGTGCTGACTTCTCTCCCCTGGGCTTTTTTCTTTTTCTCAGGTTGAAAAGAAGAAGA CGAAGAAGACGAAGAAGACAAACCGTCGTCGACTGCCATGCGCCGCTGATTAACGCCGCCACCATGGCCCACC GACGCAGATCCAGAAGCTGCCGTGAGGACCAGAAGCCCGTGATGGATGATCAGAGGGACCTTATCTCTAACAAT GAACAACTGCCAATGCTCGGCAGACGGCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCAGAGGAGCCTTGTACACG GGGTTCTCCATTTTAGTGACTCTCCTTCTCGCCGGCCAAGCTACCACCGCCTACTTTCTGTACCAACAGCAAGGC AGACTAGACAAACTGACAATCACAAGCCAGAACCTTCAGCTGGAGTCTCTGCGGATGAAGCTGCCCGCTTTGTG GATGAGATTGCTTCCTCTACTTGCTCTCCTGGCGCTCTGGGGACCTGACCCCGAGCAAGAGTTTGTTAATCAGC ACCTGTGTGGGAGTCATCTGGTGGAGGCACTCTATTTAGTGTGCGGAGAGAGGGGCTTCTTCTACACTCCAAAG ACCAGACGGGAGGCCGAAGACCTTCAAGTGGGGCAAGTAGAACTGGGTGGCGGACCCGGTGCCGGGAGCCTT CAGCCGCTCGCCCTGGAGGGCTCTCTTCAGAAACGCGGCATCGTGGAGCAGTGTTGCACATCCATTTGCTCACT CTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACGGAAGCGGAGTGAAGCAGACGTTGAATTTTGATTTGTTGAAGTTGGCGG GGGATGTGGAGAGCAATCCGGGGCCGATGCCCCCTAGTGGCCTCAGACTTTTGTTATTGTTATTACCGCTTTTAT GGCTCTTGGTGCTGACACCGGGCCGTCCGGCTGCTGGCTTGTCGACTTGTAAGACAATTGATATGGAATTGGTG AAACGAAAACGGATTGAGGCCATCCGAGGACAGATTTTGAGCAAGCTGCGGCTTGCCTCGCCACCCTCGCAAG GGGAAGTCCCACCCGGACCTCTACCAGAAGCAGTCCTAGCGCTGTACAACAGTACAAGAGATAGAGTGGCCGG GGAATCCGCAGAACCAGAGCCTGAGCCTGAAGCCGATTATTATGCAAAGGAAGTGACTAGGGTCCTGATGGTC GAGACCCATAACGAAATCTACGACAAATTCAAACAAAGTACCCACTCTATCTACATGTTCTTCAACACCAGTGAG CTAAGAGAAGCCGTGCCCGAACCTGTGCTTCTTTCCCGCGCAGAACTCCGCCTCTTGAGACTCAAATTGAAAGT TGAACAACACGTAGAGCTTTACCAGAAATACTCTAATAATTCATGGCGATATCTTTCTAATCGTCTCCTCGCCCCA TCTGACAGCCCTGAATGGCTCTCCTTCGACGTTACGGGAGTTGTGCGCCAGTGGCTCAGCAGAGGCGGAGAGA TAGAGGGCTTTCGGCTGAGCGCACATAGCTCTAGCGACTCAAGGGACAACACATTGCAAGTGGATATTAACGGT TTTACAACTGGACGGAGAGGGGACCTGGCGACCATCCACGGCATGAATAGACCTTTCCTGCTGCTGATGGCTAC TCCCCTGGAGAGGGCACAGCACTTACAGTCTTCCAGACACCGGCGCGCCCTGGATACAAACTACTGCTTCAGCT CCACCGAAAAGAACTGTTGCGTGCGGCAGCTGTACATTGACTTCAGAAAGGATCTGGGCTGGAAGTGGATTCAT GAGCCCAAGGGGTATCATGCCAACTTCTGTCTTGGGCCATGCCCATACATCTGGTCACTGGATACCCAGTACTC CAAAGTTCTGGCCTTGTACAATCAACACAACCCTGGAGCTTCCGCCGCTCCTTGCTGTGTGCCCCAAGCCCTAG AGCCCCTGCCCATCGTTTATTATGTCGGACGCAAGCCCAAAGTAGAACAGCTATCAAATATGATCGTGAGAAGCT GCAAGTGTAGCTGATAAACGCGTCGAGCATGCATCTAGGGCGGCCAATTCCGCCCCTCTCCCCCCCACCCCTC TCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTAT TTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTA GGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCT TCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGTAGACAGCGGAACCCCCCACCTGGCGATAGATGCCTCTG CGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATA GTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCA TTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGC CCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGATGCACAGCTCAGCACTGCTCT GTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCC ACTTCCCAGGCAACCTGCCTAACATGCTTCGAGATCTCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGACTTTCTTTCAAA TGAAGGATCAGCTGGACAACTTGTTGTTAAAGGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAA GCCTTGTCTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAA GGCGCATGTGAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAGGCTGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTT CCCTGTGAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTA CAAAGCCATGAGTGAGTTTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGATACGAAACGGGAG CGGCGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGTACAGAATG CAGCTGCTGAGCTGCATCGCCCTGAGCCTGGCCCTGGTGACCAACAGCGCACCCACGTCCTCTAGCACCAAGA AGACCCAGTTACAGTTGGAGCATCTACTTTTAGACCTGCAAATGATTTTGAACGGCATCAACAACTACAAGAATC CTAAACTTACTCGCATGCTTACCTTCAAATTTTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAACTGAAGCACTTGCAATGTC TGGAGGAAGAACTCAAGCCGCTGGAGGAAGTTCTCAACCTCGCGCAGTCCAAGAATTTCCACCTCCGGCCAAG AGACCTGATCAGTAACATTAATGTGATAGTGCTGGAGCTGAAGGGAAGCGAGACTACATTTATGTGCGAGTACG CCGATGAAACCGCTACAATCGTCGAGTTCCTGAATAGATGGATCACATTTTGCCAGTCAATTATCTCTACTCTGA CATGATAACTCGAGGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCC ATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAA TGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAG GGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGGTTTT ATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAAC TGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGAT CGTTTCGCAT GGCCAAAGAAGACAATATTGAAAT GCAAGGTACCGTT CTTGAAACGTTGCCTAAT ACCATGTTCC GCGTAGAGTTAGAAAACGGTCACGTGGTTACTGCACACATCTCCGGTAAAATGCGCAAAAACTACATCCGCATC CTGACGGGCGACAAAGTGACTGTTGAACTGACCCCGTACGACCTGAGCAAAGGCCGCATTGTCTTCCGTAGTC GCTGATAAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCG CATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGT ATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAG GATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCA GACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAA AACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCA GCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCAC CGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGG TTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCA GCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGA AGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAG GGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCT CGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCC TTTTGCTCACATGTTCTT.
En una tercera modalidad el plásmido de la invención tiene la secuencia SEQ ID NO 28: secuencia del plásmido completo (no anotada)
GACTCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG GGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACC GCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTG ACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCC CCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTAC TTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGG ATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAA TCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGG GAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACT CACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTG TGGTGGAATTCTGCAGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGT TGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTC AGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCC TGACCCTGCTTGCTCAACTCTAGGTAAGTTAATGAGACAGATAGAAACTGGTCTTGTAGAAACAGAGTAGTCGCC TGCTTTTCTGCCAGGTGCTGACTTCTCTCCCCTGGGCTTTTTTCTTTTTCTCAGGTTGAAAAGAAGAAGACGAAG AAGACGAAGAAGACAAACCGTCGTCGACTGCCATGCGCCGCTGATTAACGCCGCCACCATGGCCCACCGACGC AGATCCAGAAGCTGCCGTGAGGACCAGAAGCCCGTGATGGATGATCAGAGGGACCTTATCTCTAACAATGAACA ACTGCCAATGCTCGGCAGACGGCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCAGAGGAGCCTTGTACACGGGGTT CTCCATTTTAGTGACTCTCCTTCTCGCCGGCCAAGCTACCACCGCCTACTTTCTGTACCAACAGCAAGGCAGACT AGACAAACTGACAATCACAAGCCAGAACCTTCAGCTGGAGTCTCTGCGGATGAAGCTGCCCGCTTTGTGGATGA GATTGCTTCCTCTACTTGCTCTCCTGGCGCTCTGGGGACCTGACCCCGAGCAAGAGTTTGTTAATCAGCACCTG TGTGGGAGTCATCTGGTGGAGGCACTCTATTTAGTGTGCGGAGAGAGGGGCTTCTTCTACACTCCAAAGACCAG ACGGGAGGCCGAAGACCTTCAAGTGGGGCAAGTAGAACTGGGTGGCGGACCCGGTGCCGGGAGCCTTCAGCC GCTCGCCCTGGAGGGCTCTCTTCAGAAACGCGGCATCGTGGAGCAGTGTTGCACATCCATTTGCTCACTCTACC AGCTGGAGAACTACTGCAACGGAAGCGGAGTGAAGCAGACGTTGAATTTTGATTTGTTGAAGTTGGCGGGGGAT GTGGAGAGCAATCCGGGGCCGATGCCCCCTAGTGGCCTCAGACTTTTGTTATTGTTATTACCGCTTTTATGGCTC TTGGTGCTGACACCGGGCCGTCCGGCTGCTGGCTTGTCGACTTGTAAGACAATTGATATGGAATTGGTGAAACG AAAACGGATTGAGGCCATCCGAGGACAGATTTTGAGCAAGCTGCGGCTTGCCTCGCCACCCTCGCAAGGGGAA GTCCCACCCGGACCTCTACCAGAAGCAGTCCTAGCGCTGTACAACAGTACAAGAGATAGAGTGGCCGGGGAAT CCGCAGAACCAGAGCCTGAGCCTGAAGCCGATTATTATGCAAAGGAAGTGACTAGGGTCCTGATGGTCGAGAC CCATAACGAAATCTACGACAAATTCAAACAAAGTACCCACTCTATCTACATGTTCTTCAACACCAGTGAGCTAAGA GAAGCCGTGCCCGAACCTGTGCTTCTTTCCCGCGCAGAACTCCGCCTCTTGAGACTCAAATTGAAAGTTGAACA ACACGTAGAGCTTTACCAGAAATACTCTAATAATTCATGGCGATATCTTTCTAATCGTCTCCTCGCCCCATCTGAC AGCCCTGAATGGCTCTCCTTCGACGTTACGGGAGTTGTGCGCCAGTGGCTCAGCAGAGGCGGAGAGATAGAGG GCTTTCGGCTGAGCGCACATAGCTCTAGCGACTCAAGGGACAACACATTGCAAGTGGATATTAACGGTTTTACAA CTGGACGGAGAGGGGACCTGGCGACCATCCACGGCATGAATAGACCTTTCCTGCTGCTGATGGCTACTCCCCT GGAGAGGGCACAGCACTTACAGTCTTCCAGACACCGGCGCGCCCTGGATACAAACTACTGCTTCAGCTCCACC GAAAAGAACTGTTGCGTGCGGCAGCTGTACATTGACTTCAGAAAGGATCTGGGCTGGAAGTGGATTCATGAGCC CAAGGGGTATCATGCCAACTTCTGTCTTGGGCCATGCCCATACATCTGGTCACTGGATACCCAGTACTCCAAAGT 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TCAGCTGGACAACTTGTTGTTAAAGGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAGCCTTGT CTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCGCAT GTGAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAGGCTGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTTCCCTGTG AAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCC ATGAGTGAGTTTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGATACGAAACGGGAGCGGCGCT ACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGTACAGAATGCAGCTGC TGAGCTGCATCGCCCTGAGCCTGGCCCTGGTGACCAACAGCGCACCCACGTCCTCTAGCACCAAGAAGACCCA GTTACAGTTGGAGCATCTACTTTTAGACCTGCAAATGATTTTGAACGGCATCAACAACTACAAGAATCCTAAACTT ACTCGCATGCTTACCTTCAAATTTTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAACTGAAGCACTTGCAATGTCTGGAGGAA GAACTCAAGCCGCTGGAGGAAGTTCTCAACCTCGCGCAGTCCAAGAATTTCCACCTCCGGCCAAGAGACCTGAT CAGTAACATTAATGTGATAGTGCTGGAGCTGAAGGGAAGCGAGACTACATTTATGTGCGAGTACGCCGATGAAA CCGCTACAATCGTCGAGTTCCTGAATAGATGGATCACATTTTGCCAGTCAATTATCTCTACTCTGACATGATAACT CGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTT GCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATT GCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATT GGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACAGCA AGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTT TCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCAT GGCCAAAGAAGACAATATTGAAATGCAAGGTACCGTTCTTGAAACGTTGCCTAATACCATGTTCCGCGTAGAGTT AGAAAACGGTCACGTGGTTACTGCACACATCTCCGGTAAAATGCGCAAAAACTACATCCGCATCCTGACGGGCG ACAAAGTGACTGTTGAACTGACCCCGTACGACCTGAGCAAAGGCCGCATTGTCTTCCGTAGTCGCTGATAAATTA TTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGG CACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATG AGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAA GATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAA AAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTAC CAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAG ATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATAC CTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAG ACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCG AACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAG GCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGC CTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGG GCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACA TGTTCTT.
En una cuarta modalidad el plásmido de la invención tiene la secuencia SEQ ID NO 29: secuencia del plásmido completo (no anotada)
GACTCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG GGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACC GCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTG ACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCC CCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTAC TTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGG ATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAA TCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGG GAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACT CACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTG TGGTGGAATTCTGCAGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGT TGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTC AGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCC TGACCCTGCTTGCTCAACTCTAGGTAAGTTAATGAGACAGATAGAAACTGGTCTTGTAGAAACAGAGTAGTCGCC TGCTTTTCTGCCAGGTGCTGACTTCTCTCCCCTGGGCTTTTTTCTTTTTCTCAGGTTGAAAAGAAGAAGACGAAG AAGACGAAGAAGACAAACCGTCGTCGACTGCCATGCGCCGCTGATTAACGCCGCCACCATGGCCCACCGACGC AGATCCAGAAGCTGCCGTGAGGACCAGAAGCCCGTGATGGATGATCAGAGGGACCTTATCTCTAACAATGAACA ACTGCCAATGCTCGGCAGACGGCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCAGAGGAGCCTTGTACACGGGGTT CTCCATTTTAGTGACTCTCCTTCTCGCCGGCCAAGCTACCACCGCCTACTTTCTGTACCAACAGCAAGGCAGACT AGACAAACTGACAATCACAAGCCAGAACCTTCAGCTGGAGTCTCTGCGGATGAAGCTGCCCGCTTTGTGGATGA GATTGCTTCCTCTACTTGCTCTCCTGGCGCTCTGGGGACCTGACCCCGAGCAAGAGTTTGTTAATCAGCACCTG TGTGGGAGTCATCTGGTGGAGGCACTCTATTTAGTGTGCGGAGAGAGGGGCTTCTTCTACACTCCAAAGACCAG ACGGGAGGCCGAAGACCTTCAAGTGGGGCAAGTAGAACTGGGTGGCGGACCCGGTGCCGGGAGCCTTCAGCC GCTCGCCCTGGAGGGCTCTCTTCAGAAACGCGGCATCGTGGAGCAGTGTTGCACATCCATTTGCTCACTCTACC AGCTGGAGAACTACTGCAACGGAAGCGGAGTGAAGCAGACGTTGAATTTTGATTTGTTGAAGTTGGCGGGGGAT GTGGAGAGCAATCCGGGGCCGATGCCCCCTAGTGGCCTCAGACTTTTGTTATTGTTATTACCGCTTTTATGGCTC TTGGTGCTGACACCGGGCCGTCCGGCTGCTGGCTTGTCGACTTGTAAGACAATTGATATGGAATTGGTGAAACG AAAACGGATTGAGGCCATCCGAGGACAGATTTTGAGCAAGCTGCGGCTTGCCTCGCCACCCTCGCAAGGGGAA GTCCCACCCGGACCTCTACCAGAAGCAGTCCTAGCGCTGTACAACAGTACAAGAGATAGAGTGGCCGGGGAAT CCGCAGAACCAGAGCCTGAGCCTGAAGCCGATTATTATGCAAAGGAAGTGACTAGGGTCCTGATGGTCGAGAC CCATAACGAAATCTACGACAAATTCAAACAAAGTACCCACTCTATCTACATGTTCTTCAACACCAGTGAGCTAAGA GAAGCCGTGCCCGAACCTGTGCTTCTTTCCCGCGCAGAACTCCGCCTCTTGAGACTCAAATTGAAAGTTGAACA ACACGTAGAGCTTTACCAGAAATACTCTAATAATTCATGGCGATATCTTTCTAATCGTCTCCTCGCCCCATCTGAC AGCCCTGAATGGCTCTCCTTCGACGTTACGGGAGTTGTGCGCCAGTGGCTCAGCAGAGGCGGAGAGATAGAGG GCTTTCGGCTGAGCGCACATAGCTCTAGCGACTCAAGGGACAACACATTGCAAGTGGATATTAACGGTTTTACAA CTGGACGGAGAGGGGACCTGGCGACCATCCACGGCATGAATAGACCTTTCCTGCTGCTGATGGCTACTCCCCT GGAGAGGGCACAGCACTTACAGTCTTCCAGACACCGGCGCGCCCTGGATACAAACTACTGCTTCAGCTCCACC GAAAAGAACTGTTGCGTGCGGCAGCTGTACATTGACTTCAGAAAGGATCTGGGCTGGAAGTGGATTCATGAGCC CAAGGGGTATCATGCCAACTTCTGTCTTGGGCCATGCCCATACATCTGGTCACTGGATACCCAGTACTCCAAAGT TCTGGCCTTGTACAATCAACACAACCCTGGAGCTTCCGCCGCTCCTTGCTGTGTGCCCCAAGCCCTAGAGCCCC TGCCCATCGTTTATTATGTCGGACGCAAGCCCAAAGTAGAACAGCTATCAAATATGATCGTGAGAAGCTGCAAGT GTAGCTGATAAACGCGTCGAGCATGCATCTAGGGCGGCCAATTCCGCCCCTCTCCCCCCCACCCCTCTCCCTC CCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCAC CATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTC TTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAA GACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGTAGACAGCGGAACCCCCCACCTGGCGATAGATGCCTCTGCGGCCA AAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGG AAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATG GGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCG AACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCT GGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCC AGGCAACCTGCCTAACATGCTTCGAGATCTCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGACTTTCTTTCAAATGAAGGA TCAGCTGGACAACTTGTTGTTAAAGGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAGCCTTGT CTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCGCAT GTGAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAGGCTGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTTCCCTGTG AAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCC ATGAGTGAGTTTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGATACGAAACGGGAGCGGCGCT ACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGTACAGAATGCAGCTGC TGAGCTGCATCGCCCTGAGCCTGGCCCTGGTGACCAACAGCGCACCCACGTCCTCTAGCACCAAGAAGACCCA GTTACAGTTGGAGCATCTACTTTTAGACCTGCAAATGATTTTGAACGGCATCAACAACTACAAGAATCCTAAACTT ACTCGCATGCTTACCTTCAAATTTTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAACTGAAGCACTTGCAATGTCTGGAGGAA GAACTCAAGCCGCTGGAGGAAGTTCTCAACCTCGCGCAGTCCAAGAATTTCCACCTCCGGCCAAGAGACCTGAT CAGTAACATTAATGTGATAGTGCTGGAGCTGAAGGGAAGCGAGACTACATTTATGTGCGAGTACGCCGATGAAA CCGCTACAATCGTCGAGTTCCTGAATAGATGGATCACATTTTGCCAGTCAATTATCTCTACTCTGACATGATAACT CGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTT GCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATT GCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATT GGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACAGCA AGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTT TCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCAT GGCCAAAGAAGACAATATTGAAATGCAAGGTACCGTTCTTGAAACGTTGCCTAATACCATGTTCCGCGTAGAGTT AGAAAACGGTCACGTGGTTACTGCACACATCTCCGGTAAAATGCGCAAAAACTACATCCGCATCCTGACGGGCG ACAAAGTGACTGTTGAACTGACCCCGTACGACCTGAGCAAAGGCCGCATTGTCTTCCGTAGTCGCTGATAAATTA TTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGG CACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATG AGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAA GATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAA AAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTAC CAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAG ATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATAC CTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAG ACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCG AACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAG GCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGC CTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGG GCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACA TGTTCTT
Los términos “GLP-1/péptido GLP-1/ péptido agonista del GLP-1R” como se usan en la presente se refieren a moléculas/péptidos/proteínas/variantes/agonistas de GLP-1 en la presente y son moléculas que tienen una función de agonista del GLP-1R, lo que significa que son agonistas del receptor de GLP-1. Esta clase de fármacos se usa normalmente para el tratamiento de la diabetes, en particular diabetes tipo 2. La secuencia de aminoácidos del “GLP-1 humano” maduro es: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (SEQ ID NO: 21).
El término “análogo de GLP-1” como se usa en la presente se refiere a un péptido o un compuesto, que es una variante de GLP-1 (SEQ ID NO: 15). Los términos “análogo de GLP-1” y “análogo” pueden usarse indistintamente en la presente.
Los análogos de GLP-1 pueden describirse con referencia a i) el número del residuo de aminoácido en GLP-1 humano (SEQ ID NO: 15) que corresponde al residuo de aminoácido que se modifica (es decir la posición correspondiente en GLP-1 (SEQ ID NO: 15)), y a ii) la modificación real.
El término Derivados de GLP-1 se refiere a derivados de análogos de GLP-1. El término “derivado” como se usa en la presente descripción en el contexto de un análogo de GLP-1 significa un análogo de GLP-1 modificado químicamente en el cual uno o más sustituyentes se han unido covalentemente al análogo de GLP-1. El término “sustituyente” como se usa en la presente, se refiere a una porción química o grupo/grupo lateral conjugado a la proteína/agonista/análogo de GLP-1. El derivado puede comprender una o más modificaciones seleccionadas de amidas, carbohidratos, grupos alquilo, grupos acilo, ésteres y similares.
En algunas modalidades el sustituyente se une covalentemente por medio de un residuo de aminoácido en dicho polipéptido por ejemplo en una de las posiciones de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la posición 22, 23, 27, 34, 35 y 36.
En algunas modalidades el derivado de GLP-1 comprende un sustituyente que comprende una porción lipofílica. El término “resto lipófilo”, como se usa en la presente descripción, significa un resto de hidrocarburos alifáticos o cíclicos con más de 6 y menos de 30 átomos de carbono, en donde dicho resto de hidrocarburos puede comprender sustituyentes adicionales.
Los ejemplos de agonistas de GLP-1 incluyen exenatida, liraglutida, lixisenatida, albiglutida, dulaglutida, taspoglutida y semaglutida. Las vacunas de ADN inmunoterapéuticas que usan los plásmidos en la presente pueden combinarse inicialmente con un tratamiento paralelo con un agonista del GLP-1R para el tratamiento, por ejemplo, de pacientes con T1D de inicio reciente. La coadministración de GLP-1 puede ser crónica o temporal e incluye vías orales además de vías parenterales.
Liraglutida: (SEQ ID NO 22):
Figure imgf000019_0001
Semaglutida (SEQ ID NO 23):
Figure imgf000020_0001
Las composiciones farmacéuticas en la presente son formulaciones preferentemente acuosas que comprenden al menos 50 % de agua, con mayor preferencia al menos 60 % de agua, con mayor preferencia al menos 75 % de agua, con mayor preferencia al menos 90 % de agua, con mayor preferencia al menos 95 % de agua, y con la máxima preferencia al menos 99 % de agua. Las composiciones farmacéuticas en la presente, alternativamente, pueden ser formulaciones secas, tales como formulaciones liofilizadas, destinadas a su reconstitución, inhalación, instilación intranasal, administración intradérmica, etcétera.
Las formulaciones farmacéuticas en la presente se administran preferentemente sin el uso de métodos para potenciar la transformación, como la electroporación. En una modalidad, las formulaciones farmacéuticas están destinadas a la administración parenteral, por ejemplo, administración subcutánea, administración intradérmica, administración intravenosa, administración intramuscular, etcétera. En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas en la presente también pueden administrarse por vía tópica, oral, rectal o mediante inhalación.
Las composiciones farmacéuticas en la presente, preferentemente, no tienen adición de ningún agente de condensación u otros excipientes que puedan inducir reacciones locales. Las formulaciones en la presente, preferentemente, contienen limpiadores de radicales libres (por ejemplo, etanol al 1 %) y/o quelantes como por ejemplo limpiadores de cationes divalentes (por ejemplo, e DtA [CAS #60-00-4], EGTA [CAS #67-42-5], o DPTA [CAS #67-43-6]) para mejorar la estabilidad del a Dn plasmídico en agua. Las composiciones farmacéuticas en la presente también pueden estar en la forma de una solución salina y/o una solución tampón o comprender una solución salina y/o comprender una solución tampón (por ejemplo, PBS - solución salina tamponada con fosfato, tampón TRIS, o tampones aceptables farmacéuticamente equivalentes). Las formulaciones farmacéuticas en la presente, preferentemente, no contienen ningún adyuvante; así como otros ingredientes típicos de vacunas como por ejemplo hidróxido de aluminio, fenol, sorbitol, silicona, etcétera.
Administración: La vacuna de ADN inmunoterapéutica en la presente puede administrarse a un paciente con T1D, o un paciente en riesgo de desarrollar T1D. La vacuna puede administrarse por ejemplo diariamente, en días alternos, dos veces a la semana, una vez a la semana, dos veces al mes, una vez al mes, cada dos meses, cuatro veces al año, o una vez al año; la frecuencia puede ajustarse de acuerdo con las necesidades generales o individuales. La inmunoterapia en la presente puede ser crónica. La duración de la terapia puede ser por ejemplo de un mes, dos meses, tres meses, 6 meses, un año, dos años, tres años, cinco años, seis años, siete años, ocho años, nueve años, o 10 años.
Ejemplos
Ratones diabéticos no obesos (modelo de ratón NOD de diabetes tipo 1): La función inmunitaria en la autoinmunidad se basa en una compleja red de interacciones celulares que no pueden evaluarse adecuadamente in vitro.
Las evaluaciones de la supresión y/o el tratamiento de la enfermedad en la presente se llevaron a cabo en el modelo de ratón NOD, este modelo es un modelo de inicio espontáneo poligénico donde la mayoría de los ratones desarrollan concentraciones elevadas de glucosa en sangre (BGV, valor de glucosa en sangre, determinado a partir de un pinchazo con aguja en la vena de la cola y un medidor de mano) entre las 12 y las 30 semanas de edad. La incidencia y progresión de la enfermedad son impredecibles, donde la incidencia total varía de 60 % a 95 % a las 30 semanas de edad (WoA) y la progresión desde el diagnóstico (dos lecturas secuenciales de BGV de >250) hasta la etapa terminal (dos lecturas secuenciales de BGV de 600 o mayor) que varían de 2 días a 4 semanas. La replicación de BGV elevados en las lecturas secuenciales es necesaria ya que los ratones reciben alimento y agua ad libitum lo que produce una variabilidad moderada de los BGV más allá de la causada por la inmunopatología.
Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos del plásmido en la presente:
SEQ ID NO 24: secuencia del plásmido completo (no anotada) (6,401 pares de bases) GACTCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG GGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACC GCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTG ACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCC CCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTAC TTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGG ATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAA TCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGG GAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACT CACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTG TGGTGGAATTCTGCACTGCAGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACG CCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAA AGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCT TTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTAGGTAAGTTAATGAGACAGATAGAAACTGGTCTTGTAGAAACAGAGTAG TCGCCTGCTTTTCTGCCAGGTGCTGACTTCTCTCCCCTGGGCTTTTTTCTTTTTCTCAGGTTGAAAAGAAGAAGA CGAAGAAGACGAAGAAGACAAACCGTCGTCGACTGCCATGCGCCGCTGATTAACGCCGCCACCATGGCCCACC GACGCAGATCCAGAAGCTGCCGTGAGGACCAGAAGCCCGTGATGGATGATCAGAGGGACCTTATCTCTAACAAT GAACAACTGCCAATGCTCGGCAGACGGCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCAGAGGAGCCTTGTACACG GGGTTCTCCATTTTAGTGACTCTCCTTCTCGCCGGCCAAGCTACCACCGCCTACTTTCTGTACCAACAGCAAGGC AGACTAGACAAACTGACAATCACAAGCCAGAACCTTCAGCTGGAGTCTCTGCGGATGAAGCTGCCCGCTTTGTG GATGAGATTGCTTCCTCTACTTGCTCTCCTGGCGCTCTGGGGACCTGACCCCGAGCAAGAGTTTGTTAATCAGC ACCTGTGTGGGAGTCATCTGGTGGAGGCACTCTATTTAGTGTGCGGAGAGAGGGGCTTCTTCTACACTCCAAAG ACCAGACGGGAGGCCGAAGACCTTCAAGTGGGGCAAGTAGAACTGGGTGGCGGACCCGGTGCCGGGAGCCTT CAGCCGCTCGCCCTGGAGGGCTCTCTTCAGAAACGCGGCATCGTGGAGCAGTGTTGCACATCCATTTGCTCACT CTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACGGAAGCGGAGTGAAGCAGACGTTGAATTTTGATTTGTTGAAGTTGGCGG GGGATGTGGAGAGCAATCCGGGGCCGATGCCCCCTAGTGGCCTCAGACTTTTGTTATTGTTATTACCGCTTTTAT GGCTCTTGGTGCTGACACCGGGCCGTCCGGCTGCTGGCTTGTCGACTTGTAAGACAATTGATATGGAATTGGTG AAACGAAAACGGATTGAGGCCATCCGAGGACAGATTTTGAGCAAGCTGCGGCTTGCCTCGCCACCCTCGCAAG GGGAAGTCCCACCCGGACCTCTACCAGAAGCAGTCCTAGCGCTGTACAACAGTACAAGAGATAGAGTGGCCGG GGAATCCGCAGAACCAGAGCCTGAGCCTGAAGCCGATTATTATGCAAAGGAAGTGACTAGGGTCCTGATGGTC GAGACCCATAACGAAATCTACGACAAATTCAAACAAAGTACCCACTCTATCTACATGTTCTTCAACACCAGTGAG CTAAGAGAAGCCGTGCCCGAACCTGTGCTTCTTTCCCGCGCAGAACTCCGCCTCTTGAGACTCAAATTGAAAGT TGAACAACACGTAGAGCTTTACCAGAAATACTCTAATAATTCATGGCGATATCTTTCTAATCGTCTCCTCGCCCCA TCTGACAGCCCTGAATGGCTCTCCTTCGACGTTACGGGAGTTGTGCGCCAGTGGCTCAGCAGAGGCGGAGAGA TAGAGGGCTTTCGGCTGAGCGCACATGTATCTGTGGACTCAAGGGACAACACATTGCAAGTGGATATTAACGGT TTTACAACTGGACGGAGAGGGGACCTGGCGACCATCCACGGCATGAATAGACCTTTCCTGCTGCTGATGGCTAC TCCCCTGGAGAGGGCACAGCACTTACAGTCTTCCAGACACCGGCGCGCCCTGGATACAAACTACTGCTTCAGCT CCACCGAAAAGAACTGTTGCGTGCGGCAGCTGTACATTGACTTCAGAAAGGATCTGGGCTGGAAGTGGATTCAT GAGCCCAAGGGGTATCATGCCAACTTCTGTCTTGGGCCATGCCCATACATCTGGTCACTGGATACCCAGTACTC CAAAGTTCTGGCCTTGTACAATCAACACAACCCTGGAGCTTCCGCCGCTCCTTGCTGTGTGCCCCAAGCCCTAG AGCCCCTGCCCATCGTTTATTATGTCGGACGCAAGCCCAAAGTAGAACAGCTATCAAATATGATCGTGAGAAGCT GCAAGTGTAGCTGATAAACGCGTCGAGCATGCATCTAGGGCGGCCAATTCCGCCCCTCTCCCCCCCACCCCTC TCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTAT TTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTA GGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCT TCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGTAGACAGCGGAACCCCCCACCTGGCGATAGATGCCTCTG CGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATA GTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCA TTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGC CCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCTGCCGCTCATTCTAGTGCCC TTCTTTGCTGCCTGGTCCTGCTCACCGGGGTGCGAGCTAGCCCTGGACAAGGGACACAATCCGAAAACTCGTG 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CTCTGACATGATAACTCGAGGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTG CCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCT AATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGAC AGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGG CGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAA AGTAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGAT GAGGATCGTTTCGCATGGCCAAAGAAGACAATATTGAAATGCAAGGTACCGTTCTTGAAACGTTGCCTAATACCA TGTTCCGCGTAGAGTTAGAAAACGGTCACGTGGTTACTGCACACATCTCCGGTAAAATGCGCAAAAACTACATCC GCATCCTGACGGGCGACAAAGTGACTGTTGAACTGACCCCGTACGACCTGAGCAAAGGCCGCATTGTCTTCCGT AGTCGCTGATAAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCAC ACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAAT ATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAA AAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCG TCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAA AAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCT TCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAG CACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACC GGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAG CCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTC CCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTC CAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGAT GCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTG GCCTTTTGCTCACATGTTCTT
Ejemplo 1 - Plásmidos codificantes del antígeno en comparación con plásmidos codificantes del antígeno IL-10:
En la materia anterior se ha sugerido que sería necesario el agotamiento de secuencias CpG inmunoestimuladoras en la cadena principal del plásmido para un tratamiento eficaz de T1D con inmunoterapia con ADN. Por tanto este experimento se diseñó después de experimentos publicados previamente (2008 J Immunol. 181(12):8298-307). Los ratones NOD se administraron con ocho dosis, una vez por semana, del plásmido comenzando en la semana 9 (edad): se administró ya sea el vector vacío (pVAX1, 50 ug), o el Ag pVAX1-proinsulina (no dirigido al endosoma, no preproinsulina), o el Ag pVAX1-proinsulina agotado de CpG, o una construcción bicistrónica pVAX1-IL10-IRES-Ag de proinsulina en relaciones equimolares.
Todas las administraciones fueron intramusculares en el cuádriceps izquierdos bajo anestesia con isoflurano y contenían solo plásmido en PBS EDTA. Los BGV se evaluaron en todos los ratones semanalmente y la incidencia de diabetes tipo 1 se calificó sobre la base de dos lecturas de BGV por encima de 250 mg/dl. Los ratones se evaluaron hasta las 30 semanas de edad o hasta que se alcanzó un BGV de 600, seguido de sacrificio.
Los resultados de este experimento (tabla 1) demuestran que A) el agotamiento de CpG no es necesario ni beneficioso para la eficacia, B) la inclusión de citocinas inmunomoduladoras aumenta significativamente la eficacia, y C) la cadena principal del plásmido (vector vacío) es equivalente a los grupos no tratados.
Tabla 1: incidencia de T1D en ratones NOD a las 30 semanas de edad.
Figure imgf000022_0001
* para la comparación
Ejemplo 2 - Productos proteicos expresados que resultan de plásmidos que codifican el antígeno, IL-10, IL-2 y TGF-p
Se crearon plásmidos multicistrónicos para coexpresar TGF-p, IL-10 y opcionalmente IL-2. Las células Freestyle293 se transfectaron transitoriamente y se cultivaron en medio libre de suero. Los sobrenadantes se recolectaron y se sometieron a cuantificación por ELISA después de 72 horas.
Los resultados en la tabla 2 más adelante muestran que: A) la expresión de múltiples citocinas independientes se logra a partir de un vector único, B) se producen cantidades significativas de cada citocina y en las relaciones esperadas, C) cambios menores en la secuencia mejoran significativamente la expresión de IL-10 a partir del plásmido de IL10/proinsulina de la primera generación, y D) ni la cadena principal del plásmido (vector vacío) ni el direccionamiento endosómico del antígeno (IIAg) induce la producción o desregulación de citocinas.
Tabla 2: Cuantificación por ELISA de los productos proteicos expresados.
Figure imgf000023_0001
* para la comparación
Ejemplo 3 - Impacto del TGF-p y la IL-2 sobre la supresión de la enfermedad
Los plásmidos multicistrónicos se evaluaron en cuanto a la prevención de la enfermedad en ratones NOD como en el ejemplo 1, con la excepción de que la dosificación fue continua una vez a la semana hasta el sacrificio (inicio de la diabetes) o la semana 30. Un ratón de cada grupo (n inicial = 24) se envió para la realización de la necropsia completa después de 10 semanas de dosificación, que incluyó patología de 10 tejidos altamente perfundidos estándar, conteo sanguíneo completo y química clínica. Excepto una ruptura muscular menor y recrecimiento debido a un trauma mecánico en el sitio de inyección, no se presentaron desviaciones con relación a los animales no dosificados.
Los resultados en la tabla 3 más adelante muestran que: A) la adición de TGFp aumenta significativamente la eficacia, B) la inclusión de interleucina 2 puede aumentar la eficacia y no induce patología, C) la dosificación crónica con plásmidos que expresan IL-10 y antígeno aumenta la eficacia en la prevención de la enfermedad, y D) la dosificación crónica con plásmidos que expresan TGFp, IL-10 e IL-2 aumenta la eficacia sin resultar en ninguna señal de seguridad.
Tabla 3: Incidencia de T1D en ratones NOD.
Figure imgf000023_0002
* para la comparación
Ejemplo 4 Evaluación de elementos IRES, intrones; así como de la administración subcutánea
Los plásmidos multicistrónicos se evaluaron en cuanto a la prevención de la enfermedad en ratones NOD como en el ejemplo 3, excepto que la dosificación comenzó más temprano (en la semana 5) para imitar mejor la administración pediátrica crónica. Además de validar los plásmidos pVAX1-IIAg/TGFp/IL10 y pVAX1-IIAg/TGFp/IL10/IL2 que contienen intrones, se examinaron otros grupos de control. Específicamente, un segmento IRES diferente (CrPV [del virus de la parálisis del grillo] contrario al de EMCV [de virus de la encefalomiocarditis]) se evaluó en cuanto a los aumentos esperados en la eficacia, al igual que una deleción del segmento del intrón para evaluar su necesidad. Debido a una obvia carencia de eficacia en comparación con el plásmido original (pVAX1-IIAg/TGFp/IL10/IL2) los grupos con CrPV y sin intrones (n.i. = sin intrón) concluyeron temprano. Además, la cohorte de ratones utilizada en este experimento mostró una progresión más rápida de la enfermedad que cohortes anteriores, con un tiempo desde el diagnóstico hasta el sacrificio que promedió 1,25 semanas en lugar de 2,75 de experimentos anteriores. Finalmente, se añadió un grupo de administración subcutánea. Este grupo se dosificó con el triple del plásmido de citocinas (pVAX1-IIAg/TGFp/IL10/IL2) con una inyección una vez a la semana en el espacio s.c. en la nuca del cuello sin anestesia.
Los resultados en la tabla 4 muestran que: A) los elementos IRES de EMCV proporcionan una eficacia significativamente mejor que el IRES de CrPV, B) la inclusión de un intrón (en este plásmido ubicado dentro de la región de direccionamiento endosómico al CD74) aumenta la eficacia significativamente, C) aunque la inclusión de IL-2 proporciona un beneficio mínimo en escenarios leves de la enfermedad su presencia aumenta significativamente la eficacia y robustez del tratamiento en escenarios agresivos de la enfermedad, y D) la dosificación subcutánea, que es ineficaz en la mayoría de las aplicaciones de vacunas de ADN, aquí muestra una eficacia modesta y un retraso significativo de la enfermedad incluso sin optimización.
Tabla 4: Incidencia de T1D en ratones NOD.
Figure imgf000024_0001
* para la comparación
Ejemplo 5 Comparación de la selección sin antibióticos comercial con sistemas de selección con antibióticos
Una cadena principal alternativa del plásmido se evaluó con el objetivo de eliminar la resistencia a la kanamicina para cumplir con las directrices de la Agencia de Medicinas europea. El mismo inserto (MAg/TGFp/IL10/IL2, que incluye el intrón) se clonó en la cadena principal de un “nanoplásmido” NTC9385R de Nature Technology. El plásmido resultante se evaluó en ratones NOD como en el ejemplo 3, excepto que el tratamiento comenzó en la semana 11 (inicio tardío) y terminó temprano debido a un fallo del plásmido basado en NTC9385R.
Los resultados en la tabla 5 a continuación muestran que: A) los cambios al sistema de selección de la cadena principal del plásmido, sorprendentemente, inducen cambios significativos en la efectividad de los plásmidos, y B) un inicio tardío al tratamiento da como resultado conversiones tempranas. Los datos de otros experimentos relacionados indican que la dosificación con estos plásmidos de vacunas de ADN tolerogénicas requiere dos a cuatro semanas para tener eficacia, de manera que un inicio tardío al tratamiento da como resultado numerosos casos tempranos de diabetes antes que el tratamiento tenga eficacia.
Tabla 5: incidencia de la enfermedad de T1D en ratones NOD.
Figure imgf000024_0002
* para la comparación
Ejemplo 6 Eficacia de supresión de la enfermedad con plásmidos con y sin antígeno
Para determinar el papel del antígeno codificado en la función del plásmido se realizaron dos experimentos (Ejemplos 6 y 7). Un plásmido alternativo se evaluó con el objetivo de eliminar la región que codifica al antígeno (preproinsulina) a la vez que retiene el dominio de direccionamiento a CD74 y las tres citocinas secretadas. El plásmido resultante se evaluó en ratones NOD como en el ejemplo 3, excepto que el tratamiento comenzó en la semana 11 (inicio tardío).
Este experimento demuestra que la porción del antígeno es necesaria para la total eficacia y que no es meramente la producción de citocinas quien conduce la función del plásmido. Este es uno de los dos criterios necesarios para demostrar especificidad antigénica del tratamiento.
Tabla 6: Incidencia de T1D en ratones NOD.
Figure imgf000025_0001
* para la comparación
Ejemplo 7 Impacto de la inmunoterapia con antígeno en la presente sobre la eficiencia de vacunas de antígenos no relacionados
Para determinar el papel del antígeno codificado en la función del plásmido se realizaron dos experimentos (Ejemplos 6 y 7). Los ratones NOD recibieron un tratamiento simulado con una inyección de PBS o se trataron con el plásmido pVAX1-IIAg/TGFp/IL10/IL2 como en el ejemplo 3. Después de cuatro dosis (es decir a las 13 semanas de edad) cada ratón se inmunizó por vía i.p. con 50 |ig de un antígeno irrelevante (Ovoalbúmina de pollo, OVA) en 100 |il de una suspensión de alumbre de 1:1. Los tratamientos simulados o con plásmido se mantuvieron una vez a la semana hasta el sacrificio tres semanas (21 días) después de la inmunización, tiempo en el cual se extrajo suero. Los anticuerpos con cambio de clases (IgG e IgG2a total) contra el antígeno de ovoalbúmina se determinaron por medio de kits de ELISA comerciales. No se observaron diferencias significativas entre los grupos tratados con plásmido y con tratamiento simulado en sus niveles de IgG anti-OVA total, y ningún grupo produjo IgG2a anti-OVA. Los resultados en la tabla 7 más adelante muestran que; aunque el plásmido suprime las respuestas inmunitarias relacionadas con la enfermedad objetivo, no suprime la reactividad inmunitaria hacia antígenos no relacionados (es decir cualquier antígeno no codificado por el plásmido). Este es el segundo de los dos criterios necesarios para demostrar la especificidad antigénica del tratamiento. Dado que el tratamiento de pacientes pediátricos implicará una administración concomitante de vacunaciones infantiles estándar esta es una ventaja significativa sobre la inmunosupresión sistémica / genérica por medio de agentes como metotrexato o ciclosporina A.
Tabla 7: Respuesta a un antígeno irrelevante en ratones NOD que han recibido vacunación inmunoterapéutica con ADN contra T1D.
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Estos valores producen un valor de p de 0,377 no significativo y un intervalo de confianza de -1,99 a 4,87. Estos resultados indican que el tratamiento con el plásmido inmunomodulador no tiene un impacto sobre la respuesta inmunitaria contra otros antígenos no codificados por el plásmido, y por lo tanto no producen una inmunosupresión amplia o sistémica.
Ejemplo 8 Productos proteicos individuales expresados a partir del plásmido
El elemento 2A de TaV produjo productos de fusión IL-10+IL-2 inesperados en la presente (datos no mostrados) y por tanto se evaluaron otras estrategias de separación. Las tecnologías de separación iniciales incluyeron extensiones corriente arriba de la secuencia 2A de TaV (que conduce a una degradación rápida y carencia de IL-10 secretada) y además un sitio de escisión de carboxipeptidasa (que indujo la muerte de las líneas celulares transfectadas). Otras estrategias de separación evaluadas fueron 2A de GSG-TaV, un sitio de escisión de furina, un sitio de furina seguido por 2A de TaV, 2A de P, y 2A de E (virus de rinitis equina A).
Las células Freestyle293 se transfectaron transitoriamente y se cultivaron en medio libre de suero. Tanto los sedimentos celulares como los sobrenadantes se recolectaron y se sometieron a transferencia Western multicolor semicuantitativa después de 72 horas.
Los resultados en la tabla 8 a continuación muestran que: A) inesperadamente, los sitios de escisión proteolítica no funcionaron entre los genes de IL-10 e IL-2, B) se prefieren etiquetas GSG (secuencias desacopladoras) entre IL-10 IL-2 a las secuencias aislantes extendidas, C) 2A de P se prefiere a 2A de TaV o 2A de E, y D) las secuencias 2A pueden tener efectos significativos e inesperados sobre la degradación y secreción de proteínas corriente arriba, expresadas, tal como IL-10.
Tabla 8: Separación de los productos proteicos IL-10 e IL-2 expresados.
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Ejemplo 9 Comparación de un sistema de selección comercial con un sistema de selección sensible al calor proporcionado en la presente; así como comparación entre plásmidos que codifican IL-2 y plásmidos que no codifican IL-2 (administración subcutánea)
Se crearon cadenas principales de plásmidos y se evaluaron con el objetivo de eliminar la resistencia a la kanamicina para cumplir con las directrices de la Agencia de Medicinas europea. El inserto corregido (IIAg/2A de GSG-FMDV/TGFp/IRES de EMCV/IL10/2A de GSG-P/IL2, que incluyó un intrón en la región no codificante corriente arriba) se clonó en un vector pVAX1 retroajustado/modificado mínimamente que contenía el marcador de selección “ARN-OUT” de Nature Technology o un vector pVAX1 equivalente modificado mínimamente que codifica infA wt (“pNN”) como cadenas principales. Adicionalmente, se produjeron plásmidos que contenían un elemento potenciador de SV40 adicional o que eran deficientes en IL-2. Los plásmidos resultantes se evaluaron en ratones nOd como en el ejemplo 3, excepto que la administración fue por vía s.c. lo mismo una vez por semana que tres veces por semana (preferida).
Los resultados mostrados en la tabla 9+10 a continuación muestran que: A) el intercambio disponible comercialmente de RNA-OUT para la resistencia al antibiótico kanamicina en la cadena principal de pVAX1, inesperadamente, todavía tiene un desempeño inferior, B) el sistema de selección sin antibióticos con complementación de infA se desempeña de manera equivalente al vector pVAX1 original, C) la interleucina 2 es necesaria para una eficacia óptima, D) la adición del elemento potenciador de SV40 no mejora la eficacia, y E) el inserto triple de citocinas corregido retiene toda la funcionalidad.
Tabla 9: Incidencia de T1D en ratones NOD.
Figure imgf000026_0001
* para la comparación
Tabla 10: Incidencia de T1D en ratones NOD.
Figure imgf000027_0001
* para la comparación
Ejemplo 10 Análisis de la duración del efecto de tolerancia después de la retirada del plásmido
En el experimento anterior (representado en la tabla 9), el grupo con pNN-IIAg/FMDV/TGFp/IL10/P2A/IL2 no se sacrificó a las 30 semanas de edad, pero se detuvo la dosificación con plásmido. Los valores de glucosa en sangre se siguieron durante unas diez (10) semanas adicionales, para un total de 40 semanas de edad, para evaluar si el plásmido había inducido un estado durable de tolerancia o si era necesario continuar con la dosificación para la eficacia.
Los resultados mostrados en la tabla 11 más adelante indican que se necesita de una dosificación continuada para la durabilidad de la tolerancia, ya que un estado estable libre de enfermedad a las 30 semanas de edad se deterioró rápidamente después del cese de la dosificación. Esto indica un perfil de seguridad beneficioso, ya que cualquier evento adverso que pudiera encontrarse con la dosificación del plásmido también podría esperarse que cese con la dosificación.
Tabla 11: Incidencia de T1D en ratones NOD después del cese de la dosificación del plásmido.
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Ejemplo 11 Análisis de la estabilidad del plásmido y la durabilidad en la inyección
Un tema fundamental con la administración de plásmidos es la degradación durante la administración. En el caso de una inyección, las fuerzas de cizallamiento que encuentran las moléculas grandes y viscosas del plásmido que pasan a través de una aguja delgada a presión conducen a la ruptura de la estructura circular covalentemente cerrada del plásmido, que lo vuelve lineal y produce una capacidad de transfección reducida y destrucción rápida. La mayoría de los plásmidos tienen un 5 a 15 % de degradación a formas lineales con la inyección a través de agujas de tamaños aceptables para uso clínico, lo que conduce a una reducción de la eficacia o una necesidad de dosis iniciales más grandes para compensar la pérdida. Numerosos tipos de estructuras de secuencias que pueden conducir al desenrollamiento del plásmido y la susceptibilidad a la degradación por cizallamiento se redujeron intencionalmente al mínimo en los plásmidos descritos, con la intención de aumentar la robustez y la confiabilidad con protocolos de inyección. Para evaluar la degradación del plásmido por cizallamiento, que puede variar con la viscosidad y por lo tanto la concentración, el plásmido dirigido a humanos se resuspendió en tampón Tris EDTA a concentraciones de 5, 7, y 9 mg/ml y se pasó tres veces a través de una aguja G30 (se expulsó, se volvió a recoger en la jeringa, después se volvió a expulsar) y las muestras de un (1) microgramo se corrieron sobre un gel de agarosa contra muestras de referencia que no pasaron por el proceso de inyección.
Los resultados mostrados en la figura 3 indican, sorprendentemente, que el plásmido no se degrada de manera notable por los tres pases de inyecciones en ninguna concentración o viscosidad analizadas. La degradación del plásmido se visualizaría como un corrimiento de las bandas más pequeñas (entre la banda superenrollada principal

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un plásmido que codifica:
i. un antígeno de insulina;
ii. TGF-p;
iii. IL-10; y
en donde dicho plásmido conduce además la expresión de Interleucina-2 (IL-2).
2. El plásmido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho antígeno de insulina se selecciona del grupo que consiste en: proinsulina, preproinsulina y un fragmento peptídico funcional o inmunodominante de estas.
3. El plásmido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho antígeno de insulina es insulina dirigida al endosoma.
4. El plásmido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho plásmido conduce la expresión de un antígeno de insulina y TGF-p en una cantidad de al menos 2 veces menor que IL-10.
5. El plásmido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho plásmido comprende: (i) un elemento 2A de FMDV que separa la secuencia que codifica el antígeno de insulina y la secuencia que codifica el TGF-p, (ii) un elemento IRES de EMCV que separa la secuencia que codifica el TGF-p y la secuencia que codifica la IL-10, y (iii) un elemento 2A que separa la secuencia que codifica la IL-10 y la secuencia que codifica la IL-2.
6. El plásmido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia que codifica el TGF-p codifica TGF-p constitutivamente activo.
7. El plásmido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho plásmido comprende: (i) una secuencia que codifica la preproinsulina dirigida al endosoma, (ii) un elemento 2A de FMDV, (iii) una secuencia que codifica el TGF-p, (iv) un elemento IRES de EMCV, (v) una secuencia que codifica la IL-10, (vi) un elemento 2A de P, (vii) una secuencia que codifica la IL-2, (viii) un elemento de poliadenilación/terminación, (ix) un gen de selección, (x) un origen de replicación, (xi) un elemento promotor eucariótico, (xii) una secuencia de inicio de la traducción en eucariotas, (xiii) una secuencia de clasificación endosómica, y (xiv) opcionalmente un intrón.
8. Una vacuna de ADN inmunoterapéutica que comprende un plásmido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
9. La vacuna de ADN inmunoterapéutica de acuerdo con la reivindicación 8, o un plásmido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para usar en el retraso o la prevención de la diabetes tipo I.
10. La vacuna de ADN inmunoterapéutica de acuerdo con la reivindicación 8, o un plásmido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para la administración subcutánea.
11. La vacuna de ADN inmunoterapéutica de acuerdo con la reivindicación 8, o un plásmido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para la administración intramuscular.
12. Una composición farmacéutica que comprende la vacuna de ADN inmunoterapéutica de acuerdo con la reivindicación 8, o un plásmido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicha composición farmacéutica comprende una solución salina y/o un tampón y/o un quelante.
13. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho tampón no comprende ningún virus, agente de coempaquetamiento de lípidos o agente de condensación.
14. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12-13, en donde dicha composición comprende, además, un agonista del GLP-1R.
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