KR20110134252A - 전자기장을 이용한 성체 줄기세포의 신경세포 분화유도 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포 또는 치수줄기세포의 분화 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 저주파의 전자기장을 중간엽 줄기세포 또는 치수줄기세포에 처리하여, 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 분화방법은 성장인자 추가에 따른 고비용의 신경분화유도 배지가 아닌 저가의 배지에서도 분화를 유도할 수 있으며, 본 발명에 의해 분화된 신경세포는 뇌신경질환 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

전자기장을 이용한 성체 줄기세포의 신경세포 분화유도 방법{Differentiation method of Mesenchymal stem cells using electromagnetic field}

본 발명은 중간엽 줄기세포 또는 성체줄기세포의 분화 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 특정 주파수의 전자기파를 중간엽 줄기세포 또는 성체줄기세포 에 처리하여, 해당 세포를 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

알츠하이머병, 우울증, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈, 척수손상 등의 뇌신경질환치료에 신경세포가 치료 후보물질로 등장함에 따라 신경세포 관련한 연구가 최근 활발하게 이루어지고 있으며 다수의 논문 및 특허들이 발표되고 있는 실정이다. 그러나 신경세포 또는 신경줄기세포는 세포의 수득이 어려워 비교적 획득이 용이한 중간엽 줄기세포를 신경세포로 분화 유도하는 방법에 관한 연구들이 다수 수행되고 있다. Lauren의 리뷰논문 (Plast . Reonstr . Surg. 116:1453, 2005)에 의하면 지방유래 중간엽 줄기세포가 화학적인 방법으로 생체외에서 신경으로 분화되었다는 6건의 보고 중 기능적으로 전기 생리학적 특성을 가진다는 경우는 단 한건만이 보고되었다. Arshak (Stem Cells and Development, 17: 1123-30, 2008)의 연구에 의하면 골수유래 중간엽줄기세포를 화학적인 분화방법을 통해 신경세포로 분화 유도하였으며 그 특징관찰을 위해 면역조직화학법, 웨스턴 블롯법 (B3T, GFAP, MAP-2, NeuN), ELISA법 (신경성장인자 (NGF), 뇌유래신경세포인자 (BDNF))을 통해 분화된 신경표지인자들을 확인하였으나, 전기생리학적 특성을 나타내지는 않았다. 신경세포나 신경 전구세포와의 혼합배양에 의해 중간엽 줄기세포를 신경치료에 사용하려는 연구(Croft AP, Exp . Neurol ., 216(2): 329-41(2009))가 진행 중이나 혼합배양에 사용할 충분한 양의 인체 신경세포나 신경전구세포 획득이 실제적으로 불가능하다. 또 다른 연구방향으로는 신경세포로의 분화수율을 높이기 위해 렌티바이러스를 이용하여 신경관련 유전자 과발현을 유도하는 연구 (Watson, D. J.,, Journal of Neurotrauma, 21:1723-36.(2004)) (Hofstetter, C., Nature Neuroscience,8: 346-53.(2005)) 등이 진행중이나 바이러스에 대한 안전성이 확보되지 않아 세포치료법에 적용하기에는 어려움이 있다.

Kuh 등 (Acta Neurochir 147:985-992, 2005)에 따르면 인체 제대혈 세포를 척수손상 쥐에게 이식하고 8주차에 관찰한 결과, 배지만 넣어준 대조군과 Basso, Beattie, and Bresnahan score (BBB 점수; 생체내 실험에서 회복정도를 수치로 나타내는 점수)에서 비슷한 경향을 나타냈으며 뇌유래 신경영양인자 (brain derived neutrophic factor; BDNF)를 혼합하여 세포를 이식한 경우 이식 5주후에 유사한 결과를 나타내는 것으로 보아 단순 줄기세포의 이식은 한계가 있음을 알 수 있다. Rooney 등 (Tissue Engineering Part A, Mar. 31, 2009)은 형광발현 쥐로부터 분리한 골수유래 중간엽 줄기세포에 아교세포주유래 신경영양인자 (GDNF) 유전자를 도입하여 각각 이식한 경우 아교세포주유래 신경영양인자 유전자를 도입한 경우는 6주차까지 생존하는 것이 관찰되었으나 단순 중간엽 줄기세포만 이식한 경우 이식 2주 이후엔 이식된 세포가 관찰되지 않아 중간엽 줄기세포의 이식만으로는 척수손상 치료연구로는 부족함이 언급되었다.

기존에 알려진 파동을 이용한 신경치료 기술로는 뇌조직에 약 10 Hz 이하의 저주파 에너지를 적용시키기 위한 장치로 환자의 뇌안에 전극을 이식후 직접 전기자극을 부여하여 전기흐름에 의한 자기장을 야기하는 장치 (공개특허: US20060205993)가 있다. Zheng은 중추신경계에 자기자극을 주는 방법으로 고주파 또는 복수의 주파수 성분을 조합하여 뇌기능 개선에 사용하려는 기술 (JP 2008-543388)을 개발하였으며 Riken은 배아줄기세포에 전기펄스 처리하여 신경세포를 제조하는 기술 (US200740065941)을 개발하였다. Gliner 등은 세포에 전기펄스를 처리하여 신경세포를 제조하는 기술을 개발하였다 (US20050075679). 위의 기술들은 전극을 직접 이식하는 방식으로 전극을 이식하는 수술이 추가되어 환자에게 고통이 수반되며 배아줄기세포의 경우 종양형성의 가능성이 문제가 되어 임상에 적용하는데 한계가 있다.

본 연구는 이러한 다양한 신경관련 질병을 치료하기 위한 세포치료제의 일환으로 중간엽 줄기세포 및 성체줄기세포를 이용하는 연구이며, 화학적 방법이 아닌 비침습적인 방법으로 중간엽 줄기세포 및 성체줄기세포를 신경세포로 분화시키는 새로운 기술 개발이 요구되고 있는 실정이다.

본 발명자들은 상기의 문제점 및 필요성을 인식하고, 수득이 어려운 신경세포 또는 신경줄기세포를 얻기 위해 비교적 획득이 용이한 중간엽 줄기세포 및 성체줄기세포를 신경세포로 분화 유도하는 방법에 대해 예의 노력한 결과, 특정 주파수의 전자기장이 줄기세포를 분화할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명의 목적은 중간엽 줄기세포 또는 성체줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 신경질환 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명자는 전자기장을 중간엽 줄기세포 또는성체 줄기세포에 처리하여, 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

상기 신경세포는 성상세포, 희소돌기아교세포가 포함된다.

상기 전자기장은 1 내지 1000Hz의 주파수로 처리되는 것이 바람직하다.

상기 전자기장은 1 내지 5mT 강도로 처리되는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 중간엽 줄기세포는 골수유래, 지방유래, 제대 유래 일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 방법으로 분화된 신경세포를 포함하는 신경질환 치료용 조성물을 제공한다.

상기 신경질환은 알츠하이머병, 우울증, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈 또는 척수손상을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 전자기장을 이용한 줄기세포 분화 방법 및 분화장치는 저주파수의 파동을 이용하여 성체줄기세포를 신경세포로 분화 유도함으로써, 세포획득이 어려운 신경세포나 신경줄기세포의 용이한 수득이 가능하게 되며, 신경분화유도용 배지에서도 가능하지만 성장인자 추가에 따른 고비용의 신경분화유도 배지가 아닌 저가의 일반배지 조건에서도 신경분화를 유도할 수 있기 때문에 알츠하이머병, 우울증, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈, 척수손상 등의 뇌신경질환치료에 유용하게 활용 될 수 있다.

도 1은 성체줄기세포의 신경분화유도에 대한 조건의 실험으로서, 생체 외에서 파동부여 후 세포의 형태학적 변화 관찰 및 신경세포 관련 인자들 (MAP-2, tau, syntax-1)의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 성체줄기세포의 신경분화 유도 후 신경관련 mRNA발현 비교결과를 나타낸 것이다.
도 3은 50Hz, 100Hz, 200Hz 의 전자기장에 노출시킨 후, 중간엽 줄기세포의 증식이 억제되는 것을 BrdU assay 및 세포수 측정법을 이용하여 나타낸 것이다.
도 4는 형태적 변화를 광학 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다. (A,C는 대조군, B, D는 50Hz, E는 100Hz, F는 200Hz를 골수유래 중간엽 줄기세포에 노출시킨 것이며, A, B 는 EGM 배지, C, D, E, F 는 LDMEM 배지로 배양한 경우를 나타낸 것임.)
도 5는 50Hz 전자기장에 의해 중간엽 줄기세포의 마커인 Nestin의 발현이 감소되는 것을 나타낸 것이다.
도 6은 50Hz 전자기장에 의해 신경세포 마커인 Nestin, MAP2,tau, NeuroD1, DCX, NF-L의 발현 여부를 나타낸 것이다.
도 7은 100, 200Hz 전자기장에 의해 신경세포 마커인 MAP2와 NeuroD1의 발현 여부를 나타낸 것이다.
도 8은 50Hz 전자기장에 의해 중간엽 줄기세포가 전자기장에 의해 신경세포 뿐만 아니라 성상세포, 희소돌기아교세포로 분화되는 것을 면역염색법을 이용하여 나타낸 것이다.
도 9는 제대유래(A), 지방유래(B) 줄기세포에 50Hz, 1mT 전자기장에 의해 신경세포 마커인 MAP2와 DCX의 발현 여부를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 성체줄기세포 분화용 전자기장 발생장치의 구현을 보여주는 것이다.
도 11은 50Hz (1 mT), 100Hz (1 mT)의 전자기파를 계대배양 4번째 치수줄기세포에 조사한 뒤 신경세포마커의 발현을 mRNA로 분석한 결과이다.
도 12는 50Hz (1 mT), 100Hz (4 mT)의 전자기파를 계대배양 7번째의 치수줄기세포에 조사한 뒤 신경세포마커의 발현을 mRNA로 분석한 결과이다.
도 13은 50Hz (1 mT), 100Hz (4 mT)의 전자기파를 계대배양 7번째의 치수줄기세포에 조사한 뒤 세포의 형태학적인 변화를 관찰한 결과이다.

본 발명은 전자기장을 중간엽 줄기세포 또는 성체줄기세포에 처리하여, 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 전자기파는 주기적으로 세기가 변화하는 전자기장이 공간 속으로 전파해 나가는 현상으로 전자파와 같은 의미이며, 저주파수 전자파는 주파수가 낮은 파를 말하는데, 보통 10kHz 이하를 의미한다.

본 명세서에서 중간엽 줄기세포 (Messenchymal stem cell)"는 배아 유래 또는 성체조직 유래일 수 있으며, 골수유래, 지방유래, 제대유래일 수 있다. 본 발명의 줄기세포는 성체 줄기세포도 포함하며, 바람직하게 상기 성체 줄기세포는 치수줄기세포일 수 있다.

줄기세포란 미분화 세포로서, 오랜기간 동안 분열을 하고 자기 갱신(self-renewal)을 할 수 있으며, 어떤 조건이 주어지면 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 줄기세포는 기원되는 조직에 따라 배아줄기세포와 성체줄기세포로 나뉘어지게 되는데, 잠재 능력은 배아줄기세포보다 한정적인 단점이 있으나 윤리적 문제가 없고 부작용이 없는 성체 줄기세포를 대상으로 많은 치료제가 연구되고 있다.

구체적으로, 본 발명에서는 성체 줄기세포를 이용하고, 이는 시판되는 줄기세포나 생체조직으로부터 분리한 줄기세포를 이용할 수 있다.

신경세포라 함은 성상세포 (Astrocytes), 희소돌기아교세포 (Oligodendrocytes), 신경(Neuron)을 모두 포함한다.

본 발명의 상기 전자기장은 특정 주파수로 중간엽 줄기세포 또는 성체줄기세포에 처리하였을 때만 신경세포로 분화될 수 있다.

본 발명을 통해 체외에서 전자기장을 이용한 성체줄기세포의 신경분화유도기술을 확보하였으며 전자기장은 바람직하게는 1 내지 10mT, 보다 바람직하게는 1 내지 5mT의 강도로 1 내지 1000Hz의 주파수, 보다 바람직하게는 1 내지 200Hz의 주파수를 갖는 저주파수 전자파가 될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 도 1에 나타난 바와 같이 전자기파를 7일간 조사한 뒤 면역염색한 결과, 50Hz의 1mT에서 MAP-2, tau, syntaxin-1의 발현이 현저히 증가함을 확인하였으며, 동일한 주파수에서도 10 mT에서는 발현이 안되는 것을 관찰하였다. 이것은 특정 주파수와 자기장 밀도 내에서만 세포가 분화되는 것을 의미한다.

도 2에 의하면 7일간의 저주파 전자기파에 의한 분화유도 후 신경관련 mRNA인 NeuroD와 NF-L가 발현되었다. 중간엽 줄기세포에 50, 100, 200Hz의 전자기장을 준 경우 모두 세포의 증식이 억제되어 (도 3) 중간엽 줄기세포의 분화가 유도되는 것을 확인 할 수 있었다. 뿐만 아니라 성장인자를 따로 넣지 않은 배지에서 전자기장의 효과만으로 Nestin의 발현이 감소되었으며 (도 5), 전자기장 노출 후 중간엽 줄기세포의 형태가 변화 (도 4)되고, 신경줄기세포의 마커인 nestin 과 MAP2의 발현을 확인할 수 있었다 (도 5,6,7). 이러한 결과는 골수유래 줄기세포 이외에 제대유래(도 9A), 지방유래(도 9B)에서도 유사한 경향성의 결과를 얻을 수 있었다. 또한 본 발명의 실시예에서는 전자기장 노출 후 중간엽 줄기세포가 다양한 종류의 신경세포 (MAP2), 성상세포 (GFAP), 희소돌기아교세포 (O4)의 마커가 발현되는 것은 확인할 수 있었다(도 8).

아울러, 본 발명의 일 실시예에서는 치수 줄기세포에 전자기장을 처리하여 신경세포로 분화시킬 수 있음을 확인하였다. 50 Hz (1mT)와 100Hz (4mT)를 처리한 세포에서 신경세포 분화마커의 발현과 신경돌기 형성을 확인하였다.

본 발명의 방법은 전자기장을 사용하여 성체줄기세포 및 성체줄기세포를 신경세포로 분화 유도하는 방법에 관한 것으로 성장용 배지 조건에서도 신경분화를 유도하는 장점이 있다.

성장용 배지로는 Nonhematopoitic stem cell media (Milteny사)를 사용하여 10일간 배양하였다. 실험에 사용한 중간엽 줄기세포들은 모두 37℃, 5% 이산화탄소 환경에서 배양될 수 있다.

본 발명의 중간엽 줄기세포 분화 장치는 바람직하게는 도 10에 예시된 형태일 수 있다. 또한, 도 10에 도시되지 않은 부분이더라도, 본 발명의 기술분야에 종사하는 자들에게 널리 공지된 기술을 추가로 포함할 수 있으며, 이는 본 발명의 기술적 사상의 범주에 포함된다.

또한 본 발명은 상기 방법으로 분화된 신경세포를 포함하는 신경질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 중간엽 줄기세포에서 분화된 신경세포를 원료로 하므로, 독성이 없고 안전하다.

상기 신경질환 치료용 조성물은 본 발명의 신경세포 외에 발명의 기술분야에 종사하는 자들에게 널리 공지된 약학적 조성물을 포함할 수 있으며, 다양한 제형의 형태로 변경될 수 있고, 이는 본 발명의 기술적 사상의 범주에 포함됨이 자명하다.

상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 폐포를 발달시킬 수 있는 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다.

상기 약학적 제제에는 상기 유효성분 외에 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

이렇게 제조된 본 발명의 조성물 또는 약학적 제제는 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 기타 용도에 사용되는 다른 줄기세포와 함께 또는 그러한 줄기세포와의 혼합물의 형태로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 환자의 폐질환 부위에 직접 생착 또는 이식하거나 기도에 직접 이식 또는 주입하는 것이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 흉부 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하나 카테터를 이용한 비외과적 투여방법이 보다 바람직하다.

본 발명의 신경질환은 알츠하이머병, 우울증, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈, 척수손상 등을 포함하는 신경질환을 모두 의미하며, 본 발명에 따란 분화된 신경세포 또는 신경줄기세포는 신경질환에서 신경세포의 기능을 회복함으로써 신경질환 치료제로서 기능할 수 있다.

이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 참조예 1> 제대 유래 중간엽 줄기세포의 분리

분만시 배출된 인간의 탯줄 (제대)을 인산완충용액으로 3회 세척하고 혈관주변 평활근 부위와 상피층을 제거한 후 남은 왓튼 젤리 (Wharton jelly) 층을 약 3 mm× 3 mm로 작게 자른 다음, 배양 용기에 놓고 4시간 정도 37℃의 인큐베이터에 방치하여 조직을 용기 바닥에 잘 부착시켰다. 상기 배양용기에 우태아 혈청 (FBS)이 10% 포함된 DMEM (Dulbecco's Modificaion of Eagle's Medium) 배지를 넣어 1주간 배양하면 탯줄의 왓튼 젤리로부터 세포가 흘러나오기 시작하며, 세포가 배양용기 바닥에 80%이상 증식하면 계대배양을 실시하여 세포원으로 사용하였다.

< 참조예 2> 치수세포의 일차배양

외과적 수술로 제거된 인체의 치아를 항생제/항진균제(Antibiotic/Antimycotic) 200 ㎕ 및 젠타마이신(Gentamycin) 10 ㎕이 함유된 α-MEM ((주)웰진) 20 ml 배지에 담고, 얼음이 담긴 아이스 박스에 보관한 상태로 빠른 시간 내에 실험실로 운반했다.

치아조직을 절개한 뒤 그 안의 치수조직을 채취하여 1% (v/v)혈청이 함유된 1500U의 콜라게나아제(collagenase) 용액 3 ml에 넣었다. 37℃로 유지되는 CO₂ 인큐베이터에서 90분간 교반하여 세포-조직 간을 느슨하게 하고 조직과 효소를 모두 취하여 10% FBS 함유 α-MEM 배지 20ml에 넣어 30회 정도 피펫팅 한 뒤 800 rpm으로 5분간 원심 분리하였다. 상등액은 버리고 남은 세포를 10%(v/v) FBS 함유 α-MEM 배지 10 ㎖가 들어있는 100 mm 디쉬에 접종하여 3일마다 배지를 교환해 주면서 37℃로 유지되는 CO₂ 인큐베이터에서 10일간 배양하였다.

< 실시예 1> 50~200 Hz 1 mT 세기의 전자기파를 이용 중간엽줄기세포로부터 신경세포로의 분화 유도능

전자기장을 이용하여 중간엽줄기세포를 신경세포로 분화 유도하는 방법에 관한 것으로 본 방법은 성장용 배지 조건에서도 신경분화를 유도하는 장점이 있다. nonhematopoietic stem cell media를 이용하여 중간엽 줄기세포의 분화능을 유지하였다. 실험에 사용한 골수 유래 중간엽 줄기세포는 Lonza사의 세포를 사용하였으며, 지방유래 중간엽 줄기세포는 Invitrogen사의 세포, 제대 유래 중간엽 줄기세포는 상기 참조예1의 방법에 따라 분리하여 사용하였다. 모두 37℃, 5% 이산화탄소 환경에서 배양되었다.

상기 중간엽 줄기세포에 50Hz의 1mT의 전자기파를 7일간 노출시키고, 공지된 방법으로 면역 염색하여 그 결과를 관찰하였다. 도 1에서 확인되는 바와 같이, 면역염색결과 50Hz의 1mT에서 MAP-2, tau, syntaxin-1의 발현이 현저히 증가함을 확인하였다. 그러나 동일한 주파수에서도 10 mT에서는 발현이 안 되는 것을 관찰하였다. 이것은 특정 주파수와 자기장 밀도 내에서만 세포가 분화되는 것으로 판단되었다.

또한 도 2에 나타난 바와 같이, 7일간의 저주파 전자기파에 의한 분화유도 후 신경관련 mRNA인 NeuroD와 NF-L가 발현되었음을 확인할 수 있었다.

아울러, 골수 유래 줄기세포 분화에 전자기장이 미치는 영향을 확인하기 위해 골수 유래 중간엽 줄기세포 (BM-MSC)를 NH media로 배양한 후 전자기장에 노출시킬 때 배지의 조성을 10% (v/v) 우태아 혈청 (fetal bovine serum), 25mM 아스코르브산 (ascorbic acid)이 보충된 낮은 글루코즈 DMEM (LDMEM) 교체한 후, 상기 중간엽 줄기세포에 전자기장을 노출시켰다. 골수 유래 중간엽 줄기세포 (BM-MSC)에 50Hz, 1mT 의 전자기장을 12일 동안 노출시켰으며, 노출 동안 1회 계대 배양시켰다. 성장인자가 포함된 EBM 배지를 양성 대조군으로 사용하였으며, 유전자 발현 확인을 위해 RT-PCR과 면역조직화학 (immunohistochemistry) 검사를 당업계에 공지된 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 4,5에 나타난 바와 같이, 중간엽 줄기세포 표식인자인 nestin의 발현이 감소되었으며, 세포의 형태도 변화됨을 관찰할 수 있었다. 이는 BM-MSC가 신경 유사 세포로 분화되었음을 의미한다.

또한 유전자 발현을 분석한 결과, 신경 줄기세포의 마커인 Nestin과 신경세포 분화과정 중 초기에 발현되는 MAP2를 확인할 수 있었다 (도 5,6,7).

이러한 결과는 골수유래 줄기세포 이외에 제대유래(도 9A), 지방유래(도 9B)에서도 유사한 경향성의 결과를 얻을 수 있었다.

< 실시예 2> 1 mT 전자기파가 치수줄기세포의 신경분화에 미치는 영향

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 성체줄기세포 분화용 전자기장 발생장치이다. 상기 참조예 1에서와 같이 일차배양한 후 배지를 제거하고, PBS (Phosphate Buffered Saline) 10㎖을 사용하여 1회 세척하였다. 세척된 세포를 0.05%(w/v) 트립신 및 0.01%(w/v) EDTA 함유용액 1 ㎖을 첨가하고 37℃에서 5분간 처리하여 세포를 디쉬 바닥에서 떨어뜨려 용액 중에 부유시켰다. 세포용액을 10%(v/v) FBS 함유 α-MEM 배지 15 ㎖에 혼합한 후 1,000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 세포만을 회수하였다. 이들 세포는 CO₂ 인큐베이터에서 계대수 5까지 배양한 뒤 실험에 이용하였다.

이 세포를 10%(v/v) FBS 함유 α-MEM 배지의 60mm 배양 디쉬에 1×10⁵ 세포/디쉬 농도로 접종하고 3일마다 배지를 교환해 주면서 37℃로 유지되는 CO₂ 인큐베이터에서 5일간 배양하였다.

이때, 전자기파 장치를 인큐베이터 내에 장착하고 전자기장 안에 상기 60mm 디쉬를 올려놓은 후 각각에 0 Hz(비조사군), 50 Hz (1 mT), 및 100 Hz (1 mT)주파수의 전자기파를 조사하여 전자기장을 형성하면서 배양하였다.

배양이 된 세포를 각각 회수하여 mRNA분석 결과 100Hz (1mT)에서 비조사군에 비하여 신경세포분화마커인 MAP2, NeuroD1, DCX의 발현이 증가 되어, 신경세포로 분화되고 있음을 확인할 수 있었다 (도 11).

< 실시예 3> 4 mT 전자기파가 치수줄기세포의 신경분화에 미치는 영향

상기의 배양된 치수세포를 계대수 7까지 계대한 뒤, 10%(v/v) FBS 함유 α-MEM 배지의 60mm 배양 디쉬에 1×10⁵ 세포/디쉬 농도로 접종하고 3일마다 배지를 교환해 주면서 37℃로 유지되는 CO₂ 인큐베이터에서 5일간 배양하였다.

이때, 전자기파 장치를 인큐베이터 내에 장착하고 전자기장 안에 상기 60mm 디쉬를 올려놓은 후 각각에 0 Hz (비조사군), 50 Hz (1mT), 및 100 Hz (4mT)주파수의 전자기파를 조사하여 전자기장을 형성하면서 배양하였다.

배양이 된 세포를 각각 회수하여 mRNA분석 결과 50 Hz (1mT)와 100Hz (4mT)에서 비조사군에 비하여 신경세포 분화마커인 MAP2, NeuroD1, DCX의 발현이 증가 되어, 신경세포로 분화되고 있음을 확인할 수 있었다 (도 12).

세포의 형태학적 변화를 관찰하기 위하여 광학현미경으로 관찰한 결과 50 Hz (1mT)와 100Hz (4mT)에서 많은 신경돌기(화살표)가 형성되고 있음을 확인하였다 (도 13).

Claims (8)

1. 전자기장을 중간엽 줄기세포에 처리하여, 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 신경세포는 성상세포, 희소돌기아교세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 전자기장은 1 내지 1000Hz의 주파수로 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 전자기장은 1 내지 5mT의 강도로 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 골수유래, 지방유래, 또는 제대 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1항에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 치수줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 분화된 신경세포를 포함하는 신경질환 치료용 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 상기 신경질환은 알츠하이머병, 우울증, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈 또는 척수손상인 것을 특징으로 하는 조성물.

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