KR101423225B1

KR101423225B1 - 전자기장을 이용하여 성체줄기세포를 슈반세포로 분화시키는 방법

Info

Publication number: KR101423225B1
Application number: KR1020120021285A
Authority: KR
Inventors: 서영권; 박정극; 한미정; 이종호; 윤희훈; 김수찬; 김성민
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2012-02-29
Filing date: 2012-02-29
Publication date: 2014-07-24
Also published as: KR20130099633A

Abstract

본 발명은 전자기장을 이용하여 성체줄기세포를 슈반세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 성체줄기세포를 슈반세포로 분화시키는 방법은, 특정 주파수와 강도의 전자기장을 이용하여 성체줄기세포를 배양함으로써 고비용의 슈반세포 분화 배지를 사용하지 않고도 기존에 슈반세포로의 분화가 용이하지 않았던 성체줄기세포를 효과적으로 슈반세포로 분화시킬 수 있다.

Description

전자기장을 이용하여 성체줄기세포를 슈반세포로 분화시키는 방법{Method for differentiation of adult stem cell into schwann cell using electromagnetic field}

본 발명은 전자기장을 이용하여 성체줄기세포를 슈반세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

손상되거나 잘린 신경의 재생에 있어서 수초는 중요한 역할을 한다. 슈반세포는 말초신경을 싸고 있는 수초를 구성하는 세포로 신경의 재생에 중요한 역할을 하며, 신경재생의 효율을 향상시킨다는 것이 많은 연구자에 의해 밝혀졌다 (Ide, Neurosci. 25:101, 1996, Mosahebi et al., Exp Neurol , 2002 173:213, Rutkowski et al., J Neural Eng, 2004, 1:151). 슈반세포는 공급이 원활하지 않고 생체 외 배양이 쉽지 않아 이를 극복하기 위한 여러 방법들이 연구되어지고 있다. 대표적으로 슈반세포 분화용 배지를 이용하여 성체줄기세포를 슈반세포로 분화되도록 유도하는 다양한 연구들이 진행되고 있다. Kingham 등은 지방 유래 줄기세포를 1일간 1 mM β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)이 함유된 α-MEM 배지로 배양하고, 3일간 35 ng/ml 트랜스 레티놀산(all-trans-retinoic acid)이 함유된 배지로 배양한 뒤, 2주간 5 ng/ml 혈소판 유래성장인자(PDGF), 10 ng/ml 섬유모세포 성장인자(bFGF), 14 μM 포스콜린(forskolin), 그리고 252 ng/ml 신경교세포 성장인자(GGF-2)가 함유된 분화용 배지로 배양하여 S100, p75, GFAP등이 발현되는 것을 확인하여 지방 유래 줄기세포가 슈반세포로 분화가 진행됨을 보고하였으며 (Kingham et al., Exp Neurol , 2007, 207:267), Brohlin 등은 골수유래 중간엽 줄기세포를 이용하여 상기와 동일한 방법과 분화용 배지조성으로 슈반세포 분화를 유도하였다 (Brohlin et al., Neroscience Res, 2009, 64:41). 또한 Zhang 등은 재대혈 유래 줄기세포를 5% 혈청, 35 ng/ml 트랜스 레티놀산(all-trans-retinoic acid), 10 ng/ml 혈소판 유래성장인자(PDGF), 10 ng/ml 섬유모세포 성장인자(bFGF), 5 μM 포스콜린, 그리고 200 ng/ml 해레글린(heregulin)이 함유된 분화용 배지로 배양하여, S100과 GFAP가 발현됨을 보여줌으로써 제대혈 유래 줄기세포가 슈반세포로 분화됨을 확인하였다 (Zhang et al., Developmental neroscience, 2009, 20:354). 그러나 이러한 연구결과는 고가의 분화용 배지를 필요로 하는 한계점이 있었으며, 이러한 분화용 배지를 대신할 수 있는 분화기술은 아직까지 보고된 바 없다.

최근 물리적 자극을 이용한 연구에서, 장력배양(tension culture)은 마우스의 중간엽 줄기세포의 지방, 골, 연골 세포로의 분화는 촉진하나 신경분화는 이루어지지 않는다는 연구 결과가 보고되었고(Sarraf et al., Cell Prolif , 2011 44:99), 장력배양은 치주인대세포(perodontal ligament cell)의 시멘텀세포(cementoblast)와 골세포로의 분화를 촉진시킬 수 있음이 보고되었다(Matsuda et al., Arch Oral Biol . 1998, 43:987). 이러한 장력을 이용한 배양시스템 외에 전자기장(electromagnetic field)을 이용하여 줄기세포의 분화를 촉진시키는 연구들이 보고되고 있다. Sun 등은 15 Hz, 1.8 mT의 전자기장에서 골수유래 중간엽 줄기세포를 배양하여, 알카라이니포스파테이즈(ALP)와 골형성단백질(BMP-2) 등의 발현이 촉진되어 골세포로의 분화가 촉진됨을 보고하였고, Schwartz등은 15Hz, 1.6 mT의 전자기장으로 중간엽 줄기세포의 골분화를 촉진시켰다. 이러한 전자기장을 이용한 골분화 촉진 연구는 7.5∼15 Hz, 0.1∼1.8mT의 전자기장을 이용하였다. 또한 Piacentini등은 50Hz, 1 mT의 전자기장에 신경줄기세포를 배양하여 칼슘채널의 활성화로 신경세포의 분화가 촉진됨을 확인하였다. 그러나 아직까지 전자기장을 이용한 슈반세포로의 분화에 관련된 연구는 전무한 상태이다.

따라서, 고가의 슈반세포 분화용 배지를 이용하지 않으면서 줄기세포로부터 슈반세포를 효과적으로 얻을 수 있는 방법에 대한 연구의 필요성이 절실히 요구되고 있다.

한국특허출원 제10-2002-0011191호

본 발명자들은 성체줄기세포를 슈반세포로 효과적으로 분화시키기 위한 방법에 대해 연구하던 중, 특정 주파수와 강도의 전자기장을 이용하여 성체줄기세포를 배양하는 경우 슈반세포로의 분화를 효과적으로 유도할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 전자기장을 이용하여 성체줄기세포를 슈반세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 전자기장을 이용하여 성체줄기세포를 슈반세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 성체줄기세포를 슈반세포로 분화시키는 방법은, 특정 주파수와 강도의 전자기장을 이용하여 성체줄기세포를 배양함으로써 고비용의 슈반세포 분화 배지를 사용하지 않고도 기존에 슈반세포로의 분화가 용이하지 않았던 성체줄기세포를 효과적으로 슈반세포로 분화시킬 수 있다.

도 1은 치수줄기세포의 줄기세포특성을 FACS 를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 50Hz, 100Hz, 150Hz 의 전자기장을 이용하여 배양한 치수줄기세포에서 슈반세포 분화마커인 GFAP, MBP, p75, P0, KORX20, S100, CAD19의 mRNA 발현양을 비교한 결과(A) 및 이의 mRNA 발현 결과를 그래프(B)로 나타낸 도이다.
도 3은 50Hz, 100Hz, 150Hz 전자기장을 이용하여 배양한 치수줄기세포에서 슈반세포 발현마커 p75(왼쪽)와 S100(오른쪽)의 발현량 변화를 면역화학염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다(A: 배양 전 치수줄기세포, B: 전자기장 비처리군, C: 50Hz, D: 100Hz, E: 150Hz).
도 4는 50Hz, 100Hz, 150Hz 전자기장을 이용하여 배양한 치수줄기세포에서 슈반세포 발현마커 GFAP(왼쪽), MBP(오른쪽)의 발현량 변화를 면역화학염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다(A: 배양 전 치수줄기세포, B: 전자기장 비처리군, C: 50Hz, D: 100Hz, E: 150Hz).
도 5는 50Hz, 100Hz, 150Hz 전자기장의 독성을 치수줄기세포의 형태학적 변화를 통하여 관찰한 결과를 나타낸 도이다(A: 배양 전 치수줄기세포, B: 전자기장 비처리군, C: 50Hz, D: 100Hz, E: 150Hz)
도 6은 치주인대세포의 줄기세포 특성을 FACS를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도7은 50Hz, 150Hz 의 전자기장을 이용하여 배양한 치주인대세포에서 슈반세포 관련 mRNA의 발현양을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 50Hz, 150Hz 의 전자기장을 이용하여 배양한 치주인대세포에서 형태학적인 변화(A) 및, 슈반세포 마커 S100(B) 와 GFAP(C) 발현량의 변화를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 슈반세포로의 분화방법은 전극을 직접 세포에 삽입하거나, 배양접시에 접촉시켜 세포에 직접 전기자극을 주는 방법과 달리, 세포에 직접적인 접촉없이 자기장을 형성하고 형성된 자기장 내에 세포를 위치시켜 배양하는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명은 전자기장 내에 성체줄기세포를 위치시켜 배양함으로써, 성체줄기세포를 슈반세포로 분화시킬 수 있으며, 본 발명의 전자기장은 1 내지 200Hz의 주파수와 0.5 내지 2 mT의 강도를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 “전자기장”은 주기적으로 세기가 변화하는 전자기장이 공간 속으로 전파해 나가는 현상으로 전자파와 같은 의미이며, 본 발명에서 사용된 전자기장은 펄스파 형태와 연속파(사인파) 형태를 모두 포함할 수 있다.

상기 “줄기세포”란 미분화 세포로서 오랜 기간 동안 분열을 하고 자기 갱신(self-renewal)을 할 수 있으며, 어떤 조건이 주어지면 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 줄기세포는 기원되는 조직에 따라 배아줄기세포와 성체줄기세포로 나뉜다. 신경줄기세포(neural stem cell)는 배아줄기세포와 성체줄기세포의 중간단계로 분류될 수 있으며, 비교적 쉽게 슈반세포 등 원하는 세포로의 분화 유도가 가능한 것으로 알려져 있다. 이에 비하여, 성체줄기세포는 배아줄기세포보다 부작용이 없는 것으로 알려져 있으나, 원하는 세포로의 분화 유도가 어려운 것으로 알려진 줄기세포이다.

상기 “성체줄기세포”는 중간엽 줄기세포도 포함하며, 성체줄기세포는 치주인대세포, 치수줄기세포, 골수유래 중간엽 줄기세포, 제대유래 중간엽줄기세포, 지방유래 중간엽 줄기세포를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 성체줄기세포 중 치주인대세포 또는 치수줄기세포를 특정 주파수와 강도의 전자기장을 이용하여 배양함으로써 슈반세포로 분화시킬 수 있다. 상기 성체줄기세포는 시판되는 줄기세포나 생체조직으로부터 분리한 줄기세포를 제한없이 이용할 수 있다.

본 발명에서 성체줄기세포를 전자기장 내에 위치시켜 배양함에 있어서, 상기 배양은 (a) 베타 머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)이 첨가된 α-MEM 배지에서 12시간 내지 36시간 동안 배양하는 단계; (b) 트랜스 레티놀산(trans-retinoicacid)이 첨가된 α-MEM 배지에서 60시간 내지 82시간 동안 배양하는 단계; 및 (c) 포스콜린(forskolin)이 첨가된 α-MEM 배지에서 7일 내지 14일간 배양하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 베타 머켑토에탄올은 1 내지 5 μM, 트랜스 레티놀산은 30 내지 40 ng/ml, 포스콜린은 1 내지 10 μM 농도로 첨가될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 전자기장의 이용한 치수줄기세포의 배양

1.1 치수줄기세포의 일차 배양

외과적 수술로 제거된 인체의 치아를 항생제/항진균제(Antibiotic/ Antimycotic) 200 μl 및 젠타마이신(Gentaycine) 10μl이 함유된 α-MEM ((주)웰진) 20 ml 배지에 담고, 얼음이 담긴 아이스 박스에 보관한 상태로 빠른 시간 내에 실험실로 운반하였다. 치아조직을 절개한 뒤, 치수조직을 채취하여 1%(v/v) 혈청이 함유된 1500U 콜라게나아제(Collagenase) 용액 3ml에 넣었다. 37°C로 유지되는 CO₂ 배양기에서 90분간 교반하여 세포-조직 결합을 느슨하게 한 후, 조직과 효소를 모두 취하여 10% FBS를 함유한 α-MEM 배지 20ml에 넣어 30회 피펫팅하고 800rpm으로 5분간 원심분리하였다. 원심분리로 얻어진 상등액은 버리고, 남은 세포를 다시 10%(v/v) FBS를 함유한 α-MEM 배지 10ml가 들어있는 100mm 배양 접시에 접종한 후 3일마다 배지를 교환해 주면서 37℃로 유지되는 CO₂ 배양기에서 10일간 배양하였다. 얻어진 치수줄기세포의 줄기세포 특성을 FACs로 분석하였다.

결과는 도1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, CD73, CD90, CD105를 분석한 결과 치수줄기세포의 줄기세포 특성을 확인할 수 있었다.

1.2 전자기장을 이용하여 배양된 치수줄기세포의 슈반세포로의 분화 확인

상기 1.1에서와 같이 일차 배양 후, 배지를 제거하고 PBS (Phosphate Buffered Saline) 10ml을 사용하여 1회 이상 세척하였다. 세척된 세포에 0.05%(w/v) 트립신 및 0.01%(w/v) EDTA함유 용액 1ml을 첨가하고 37℃에서 5분간 처리하여, 세포를 배양접시 바닥에 떨어뜨려 용액 중에 부유시켰다. 세포 용액을 10%(v/v) FBS 함유 α-MEM 배지 15ml에 혼합한 후, 800rpm에서 5분간 원심분리 하여 상등액은 버리고 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 CO₂배양기에서 계대수 5까지 배양하였다.

배양한 세포를 10%(v/v) FBS를 포함하는 α-MEM 배지 60mm 배양 접시에 1×10⁵ 세포/배양접시 농도로 접종하고 3일마다 배지를 교환해 주면서 37℃의 CO₂ 배양기에서 2주간 배양하였다.

전자기파 장치를 배양기 내에 장착하고 전자기장 안에 상기 60mm 배양접시를 위치시킨 후, 각각 0 Hz(비조사군), 100 Hz (1mT), 150 Hz (1mT) 주파수의 전자기장에서 세포를 2주간 배양하였다. 배양은 1 μM 베타 머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)이 첨가된 α-MEM 배지에서 24시간, 35 ng/ml 트랜스 레티놀산(trans-retinoicacid)이 첨가된 α-MEM 배지에서 72시간, 그리고 5μM 포스콜린(forskolin)이 첨가된 α-MEM 배지에서 10일간 수행하였다. 배양 후, 세포를 각각 회수하여 슈반세포 분화마커인 GFAP, MBP, p75, P0, KORX20, S100, CAD19의 mRNA 발현양을 분석하였다.

결과를 도 2 에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 전자기장을 이용하여 배양한 치수줄기세포에서 슈반세포 분화마커의 mRNA 양이 증가하였으며, 특히 150Hz (1mT) 주파수의 전자기장에서 배양한 치수줄기세포에서 슈반세포 분화마커의 발현이 가장 높게 증가하였다. 따라서, 치수줄기세포가 슈반세포로 분화됨을 알 수 있다.

또한, 전자기장 주파수에 따른 치수줄기세포의 슈반세포로의 분화유도 효과를 비교하기 위하여, 전자기장의 주파수를 50Hz, 100Hz, 150Hz 로 달리하여 슈반세포 분화마커인 p75, S100, GFAP, MBP의 발현 정도를 면역화학염색을 통해 확인하였다.

결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.

도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, p75, S100, GFAP, MBP 단백질의 발현은 전자기장 비처리군에 비하여 전자기장 처리군에서 모두 증가하였으며, 특히 150Hz 주파수의 전자기장에서 배양한 치수줄기세포에서 상기 단백질이 가장 강하게 발현됨에 따라, 150Hz 주파수의 전자기장이 치수줄기세포의 슈반세포로의 분화를 가장 활발하게 유도함을 알 수 있다.

또한, 광학현미경을 이용하여 50Hz, 100Hz, 150Hz 전자기장의 독성을 치수줄기세포의 형태학적 변화를 통하여 관찰한 결과를 관찰하였다.

결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 전자기장을 이용하여 배양한 치수줄기세포는 액포형성 또는 세포막 붕괴와 같은 세포사 관련 형태가 관찰되지 않아 본 연구의 주파수 및 강도가 세포에 독성을 유발하지 않음을 확인할 수 있다.

실시예 2. 전자기장의 이용한 치주인대세포의 배양

2.1 치주인대세포의 일차 배양

외과적 수술로 제거된 인체의 치아를 항생제/항진균제(Antibiotic/ Antimycotic) 200 μl 및 젠타마이신(Gentaycine) 10μl이 함유된 α-MEM ((주)웰진) 20 ml 배지에 담고, 얼음이 담긴 아이스 박스에 보관한 상태로 빠른 시간 내에 실험실로 운반하였다. 치아뿌리 부근의 치주인대조직을 채취하여 1%(v/v) 혈청이 함유된 1500U 콜라게나아제(Collagenase) 용액 3ml에 넣었다. 37℃로 유지되는 CO₂ 배양기에서 90분간 교반하여 세포-조직 결합을 느슨하게 한 후, 조직과 효소를 모두 취하여 10% FBS를 함유한 α-MEM 배지 20ml에 넣어 30회 피펫팅하고 800rpm으로 5분간 원심분리하였다. 원심분리로 얻어진 상등액은 버리고, 남은 세포를 다시 10%(v/v) FBS를 함유한 α-MEM 배지 10ml가 들어있는 100mm배양접시에 접종한 후, 3일마다 배지를 교환해 주면서 37℃로 유지되는 CO₂ 배양기에서 10일간 배양하였다. 얻어진 치주인대세포의 줄기세포 특성을 FACs로 분석하였다.

결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이 CD73, CD90, CD105를 분석한 결과 치주인대세포의 줄기세포 특성을 확인할 수 있었다.

2.2 전자기장을 이용하여 배양된 치주인대세포의 슈반세포로의 분화 확인

상기 2.1에서와 같이 일차 배양 후, 배지를 제거하고 PBS (Phosphate Buffered Saline) 10ml을 사용하여 1회 이상 세척하였다. 세척된 세포에 0.05%(w/v) 트립신 및 0.01%(w/v) EDTA함유 용액 1ml을 첨가하고 37℃에서 5분간 처리하여, 세포를 배양접시 바닥에 떨어뜨려 용액 중에 부유시켰다. 세포 용액을 10%(v/v) FBS 함유 α-MEM 배지 15ml에 혼합한 후, 800rpm에서 5분간 원심분리 하여 상등액은 버리고 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 CO₂배양기에서 계대수 5까지 배양하였다.

배양한 세포를 10%(v/v) FBS를 포함하는 α-MEM 배지 60mm 배양 접시에 1×10⁵ 세포/배양접시 농도로 접종하고 3일마다 배지를 교환해 주면서 37℃ 의 CO₂ 배양기에서 2주간 배양하였다.

전자기파 장치를 배양기 내에 장착하고 전자기장 안에 상기 60mm 배양접시를 위치시킨 후, 각각 0 Hz(비조사군), 50Hz (1mT), 150 Hz (1.5mT) 주파수의 전자기장에서 세포를 2주간 배양하였다. 배양은 1 μM 베타 머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)이 첨가된 α-MEM 배지에서 24시간, 35 ng/ml 트랜스 레티놀산(trans-retinoicacid)이 첨가된 α-MEM 배지에서 72시간, 그리고 5μM 포스콜린(forskolin)이 첨가된 α-MEM 배지에서 10일간 수행하였다. 배양 후, 세포를 각각 회수하여 슈반세포 분화마커인 KROX20, p75, P0의 mRNA발현양을 분석하였다.

결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 전자기장을 이용하여 배양한 치주인대세포에서 슈반세포 분화마커의 mRNA 양이 증가하였으며, 특히 150Hz (1mT) 주파수의 전자기장에서 배양한 치수인대세포에서 슈반세포 분화마커의 발현이 가장 높게 증가하였다. 따라서, 치수인대세포가 슈반세포로 분화됨을 알 수 있다.

치주인대세포의 슈반세포로의 분화유도 효과를 비교하기 위하여, 전자기장의 주파수를 50Hz, 150Hz 으로 달리하여 치주인대세포의 형태를 광학현미경으로 관찰하였으며, 슈반세포 분화마커인 S100, GFAP의 발현 정도를 면역화학염색을 통해 관찰하였다.

결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 50Hz의 전자기장을 이용하여 배양된 치주인대세포보다 150Hz의 전자기장을 이용하여 배양된 치주인대세포가 슈반세포와 유사한 형태를 띄는 것을 확인하였다(A). 또한, S100, GFAP 단백질의 발현은 전자기장 비처리군에 비하여 전자기장 처리군에서 모두 증가하였으며, 특히 150Hz 주파수의 전자기장에서 배양한 치주인대세포에서 상기 단백질이 가장 강하게 발현됨에 따라, 150Hz 주파수의 전자기장이 치수인대세포의 슈반세포로의 분화를 가장 활발하게 유도함을 확인하였다(B,C).

Claims

전자기장을 이용하여 성체줄기세포를 슈반세포로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 성체줄기세포를 전자기장 내에 위치시킨 후 배양하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 전자기장은 1 내지 200Hz의 주파수를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 전자기장은 0.5 내지 2 mT의 강도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 배양은
(a)베타 머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)이 첨가된 α-MEM 배지에서 12시간 내지 36시간 동안 배양하는 단계;
(b)트랜스 레티놀산(trans-retinoicacid)이 첨가된 α-MEM 배지에서 60시간 내지 82시간 동안 배양하는 단계; 및
(c)포스콜린(forskolin)이 첨가된 α-MEM 배지에서 7일 내지 14일간 배양하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 성체줄기세포를 슈반세포로 분화시키는 방법.
제5항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 베타 머켑토에탄올은 1 내지 5 μM 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 트랜스 레티놀산은 30 내지 40 ng/ml농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 포스콜린은 1 내지 10 μM 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 성체줄기세포는 치주인대세포, 치수줄기세포, 골수유래 중간엽줄기세포, 재대유래 중간엽줄기세포, 지방유래 중간엽줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.