KR20030032921A - 영장류의 배아 줄기 세포로부터 배상체를 제조하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명에 의한 영장류 배상체들은 영장류 ES 세포들로부터 생성된다. 본 발명의 ES 세포들은 군생체를 형성한다. 이후 상기 군생체들을 군생체로서 분리한후, 비부착 조건하에서 항온 처리시킨다. 개체화된 세포들은 급속히 사멸할 것인바, 영장류 ES 세포들로부터 유래한 배상체들의 발생은 세포들의 응집을 유지시키는 것에 의존적이다.
Description
미분화 영장류 배아 줄기("ES") 세포들은 무제한으로 항온 처리될 수 있으나, 개체의 분화된 세포들을 형성하는 잠재력은 유지하지 못한다. 예를 들어 미국 특허 제5,843,780호 ; J.Thomson 외 다수, 282 Science 1145-1147 (1998) ; 및 J.Thomson외 다수, 38 Biology 133-165 (1998)을 참조하시오. 본원에 참조된 문헌들 및 기타 모든 문헌들의 공지 사항들은 본원에 전체적으로 제시되어 참고 문헌으로서 첨부되어 있다.
관련 출원의 상호 참조 문헌들
없음
연방 정부 지원 연구에 관한 진술
이하 기술된 인간이 아닌 영장류 세포들을 이용한 연구는 다음의 기관, 즉 NIHRR11571에 의하여 수여된 미합중국 정부의 지원을 받아 승인에 의하여 지지되었다. 미합중국 정부는 본 발명에 대하여 임의의 권리를 보유한다. 본원에 기술된 인간 세포를 이용한 연구를 위하여 미합중국 정부 기금이 사용되지는 않았다.
영장류 ES 세포들은 인간 조직의 분화 및 기능을 이해하기 위한 흥미로운 신규의 모델을 제공하며, 약물 발견 및 시험에 관한 신규의 기술들을 제공한다. 이들은 또한 ES 세포 유래 조직들의 이식에 기초하는 신규의 치료법들을 제공한다. 예를 들어, 면역 타협된 마우스로 주사된 인간 및 레서스 원숭이 ES 세포들은 3가지의 모든 배아 배엽을 발현하는 상당히 분화된 유도체를 보유하는 양성 기형종을 생성한다. 인간 ES 세포 기형종에서 용이하게 동정되는 분화 세포들로서는 평활근, 줄무늬근, 뼈, 연골, 원장관 및 호흡기 상피, 케라틴화된 편평 상피, 머리카락, 신경 상피 및 신경절을 포함한다.
인간 및 인간이 아닌 영장류 ES 세포주들은 정상적인 인간의 발생을 이해하기 위한 신규의 특히 유력한 모델을 제공하므로 또한 비정상적인 인간의 발생을 이해하기 위한 모델도 제공한다. 형성된 태아에 대한 잠재적 위험성으로 인하여, 이식 이후의 인간 배아의 실험적 조작은 윤리적으로 허용되지 않고 있으며 그 결과 인간 배아에 관한 기능적 연구들은 거의 행하여 지지 않고 있다. 결과적으로, 이식 이후 기간의 초기에 인간의 발생에 관하여 공지된 사실은 거의 전적으로 소수의 인간 배에 있어서의 정상적인 해부학적 절편들과 마우스의 배에 관한 실험적 연구에 있어서의 유추를 기초로 한다.
그러나, 마우스와 영장류의 초기 발생 단계는 상당히 상이하다. 예를 들어, 인간 및 마우스 배들은 배의 유전자 발현 시기, 태막 및 태반의 형성, 구조 및 기능 그리고 난원통 대신에 배막이 형성된다는 점에서 상이하다. 인간 발생의 초기 단계는 인간의 불임, 임신능의 상실 및 출생의 결함과 상당히 관련되어 있다. 영장류 ES 세포들은 이러한 인간 발생의 초기 단계를 이해하고 발생 실패의 병상을 이해하기 위한 신규의 해결책을 제공한다.
영장류 ES 세포들은 또한 특이적인 분화 영장류 세포들의 정상적인 기능 및 병상에 관심이 있는 관찰자에게 분화된, 정배수성의, 비형질전환 세포의 잠정적으로 무제한적인 근원을 제공한다. 특이적 ES 세포 유래성 세포들의 이러한 정제된 군집들은 또한 약물 발견, 독성 스크린에 유용하며, 조직 이식용 세포의 근원을 제공할 것이다.
영장류 ES 세포들은 조직 특이성 줄기 세포가 완전히 결여되어 있는 심장과 같은 조직에 더욱 유용한 것으로 입증될 것이다. 영장류 ES 세포들은 또한 신규의 이식 치료법의 가능성을 제공한다. 예를 들어, 파킨슨씨 병(도파민 생성 뉴런), 또는 소년기 당뇨병(이자 β섬 세포들)과 같은 경우에 있어서, 제한된 수의 세포 유형의 파괴 또는 기능 장애로 질병이 발생할 경우, 이들 특이 세포 유형들을 ES 세포 유도체들과 대체함으로써 잠재적인 생명 연장 치료법을 제공할 수 있다.
이러한 목적을 달성하기 위하여, ES 세포들을 특이적 계통으로 더욱 효율적으로 분화시키는 것이 바람직하다. 신경 조직, 조혈 조직 및 심장 조직으로 비영장류 ES 세포를 분화시키는 것은 상당히 발전되었다. 예를 들어, T.Doetschman외 다수, 87 J.Embry.And Exper.Morph. 27-45 (1985) ; G.Keller, 7 Current Op.In Cell Biol. 862-869 (1995) ; 미국 특허 제5,914,268호를 참조하시오. 상기 각각의 예들에서, ES 세포들은 처음에 "배상체"들, 즉 후속 분화 단계를 촉진하는 3차원적 ES 세포 응집체로 형성된다.
그러나, 영장류 ES 세포들에 대해서도 유사한 실험이 행하여졌으나, 통상적인 쥐과 동물을 이용한 방법에 의해서는 배상체가 형성되지 않았음을 알 수 있었다. 이와 같은 종래의 방법에서 ES 세포들은 단일 세포들로 분산되어, 기판에 세포가 부착되는 것을 방지하는 조건하에서 배상체들로 응집되었거나, 또는 메틸셀룰로즈중에 현탁되어 있는 단일 세포들 또는 클러스터들로부터 ES 세포들이 배상체들로 생장되었다. 이로써 본 발명자들은 부착이 방지되면 단일 세포들로 분산될때 영장류 ES 세포들은 급속하게 사멸하여, 이들은 성공적으로 응집되지 않아서, 메틸셀룰로즈중 클론들로부터 생장되어 나오지 않는다는 사실을 알 수 있었다.
따라서 영장류 배상체들을 생성하는 개선된 방법, 및 이들 세포로부터 유래된 분화 세포들이 존재할 필요가 있는 것으로 보여진다.
본 발명의 개요
본 발명은 기판에 부착되는 영장류 배아 줄기 세포의 콜로니들로부터 영장류 배상체를 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 기판으로부터 군생체 상태인 배아 줄기 세포들의 부착성 콜로니들을 제거한다. 이후, 상기 군생체들을 군생체들이 용기에 부착되는 것이 방지되어 배상체로 유착되도록 만드는 것이 필수적이다. 이러한 목적으로, 군생체를 2 이상의 줄기 세포들로 분류시키는데, 이때 군생체는 육안으로 관찰 가능할 정도로 충분히 큰 것이 바람직하다.
바람직한 하나의 구체예에서, 상기 제거 단계는 군생체를 기판으로부터 군생체로서 분리시키는 것을 촉진하는 제제의 존재하에서 수행된다. 베르센(등록 상표명 ; Versene) 칼슘 이나트륨 EDTA 킬레이팅제와 같은 순수한 화학적 제제가 사용될 수 있다. 그러나, 디스파제, 콜라게나제, 카탈라제, 뉴라미니다제, 판크레아틴, 췌장 엘라스타제 또는 트립신과 같은, 세포외 매트릭스에서 우선적으로 작용하는 단백질 분해효소가 더욱 바람직하다. 트립신을 사용하는 경우, 상기 트립신이 상기 군생체들을 파괴하는 것을 방지하기 위하여 제거 단계는 신속하게 그리고 비교적 낮은 농도에서 수행되어야 한다. 효소 EDTA 혼합물을 사용하는 것도 또한 유리하다.
다른 구체예에서, 제거 단계는 기판으로부터 상기 군생체들을 군생체로서 기계적으로 긁어내는 것을 포함한다.
다른 관점에서, 상기 항온 처리 단계는 상기 용기를 교반(예를 들어, 부드러운 록킹(gently rocking), 쉐이킹(shaking), 또는 바이브레이팅(vibrating)함으로써 수행할 수 있으며, 항온 처리 단계용 용기는 비부착성 세균용의 항온 처리 플라스틱일 수 있으며/있거나 상기 항온 처리 단계는 부착 인자들이 존재하지 않는 무혈청 배지의 존재하에서 수행될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 방법들을 사용하여 유래된(직접적으로 또는 간접적으로) 영장류 배상체들을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 배상체들로부터 유래된(직접적으로 또는 간접적으로) 분화 세포들을 제공한다.
본 발명에 의하면, 표준 조건하에서 항온 처리된 영장류 ES 세포들은 과생장시켜, 쌓이게 하고/하거나, 그렇지 않으면 기판(예를 들어, 표준적인 공급물 층을 보유하는 플라스틱 조직 항온 처리 평판)상에서 군생체로 밀착 회합시키도록 만든다. 이후 이들을 기판으로부터 군생체로서 제거한다(예를 들어, ES 세포와 ES 세포의 부착 보다는 기판과 ES 세포 콜로니의 부착을 더욱 강력하게 공격하는 효소와 함께 ES 세포 콜로니들을 항온 처리함에 의함). 이러한 경우에서, 효소는 약 10㎎/㎖의 농도의 디스파제일 수 있다.
또는, 상기 군생체들은 마이크로피펫, 즉 세포 스크레이퍼(cell scraper)등을 사용하여 기계적으로 긁어내어 군생체로서 분리할 수 있다.
이후 본질적으로 원형 그대로의 콜로니들을 비부착성 조건하에서 항온 처리한다(바람직하게는 항온 처리 접시를 계속적으로 록킹시키고, 비부착성 세균용의 항온 처리 플라스틱상에서 배양시키며/또는 배양시키거나, 혈청 부착 인자가 존재하지 않는 무혈청 배지의 존재하에서 연속적으로 항온 처리시킴). 이후 콜로니들은 밀착된 배상체로 급속히 유착될 수 있는데, 이후 연속 현탁액내, 또는 기판에 재부착되어 분화될 수 있다. 이러한 배상체들은 다른 목적 계통들을 얻기 위하여 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 분화 유도체들을 유도하는데에 사용될 수 있다.
영장류 배아 줄기 세포주로부터 영장류 배상체들을 생성시키는 효과적인 방법을 제공하는 것이 본 발명의 이점이다. 본 발명의 다른 이점은 다른 영장류 세포 유형들로 분화시키기에 적합한 영장류 배상체들을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 양상들 및 이점들은 이하 첨부된 명세서 및 청구항들을 검토하여 명백히 밝혀질 것이다.
배상체들의 생성
영장류 배아 줄기 세포들(예를 들어, 레서스 또는 인간 - 미국 특허 제5,843,780호 ; J.Thomson 외 다수, 282 Science 1145-1147(1998))을, 0.1% 젤라틴으로 밤새도록 항온 처리하여 전처리한 조직 항온 처리 플라스틱상에서 5 ×104세포/㎠ 로 유사분열 불활성화된 (3000 rads g-복사) 마우스 배아 섬유아세포들상에서 항온 처리하였다[E.Robertson, Embryo-derived Stem Cell Lines, In : Tetracarcinomas And Embryonic Stem Cells : A Practical Approach IRL Press : Washington, D.C., 71-112(1987)]. 배양 배지는 79% 둘베토의 개질된 이글 배지(DMEM ; 1 ℓ당 글루코즈 4500㎎를 함유하고 ; 피루브산나트륨은 함유하지 않음), 20% 소 태아 혈청(FBS), 0.1 mM 2-머캅토에탄올, 1mM L-글루타민 및 1% 비필수 아미노산 보존 용액(GIBCO)을 포함한다.
콜로니들은 수 시간에 걸쳐 군생체들을 생성시킬 수 있었다. 이후, ES 세포 콜로니들은 ES 세포들을 군생체 상태로 유지시키는 물리적 또는 화학적 방법을 이용하여 조직 항온 처리 평판으로부터 제거할 수 있었다.
상기 항온 처리 평판으로부터 ES 세포 콜로니들을 디스파제 또는 콜라게나제로 제거하기 위하여, 배양 배지를 ES 세포들로부터 분리하였다. 디스파제(ES 배양 배지중 10㎎/㎖) 또는 콜라게나제(DMEM 또는 다른 기저 배지중 용액 1㎎/㎖)를 항온 처리 평판에 첨가하였다. 상기 항온 처리 평판들을 10∼15분 동안 다시 항온 처리기에 넣었다.
디스파제 처리후 콜로니들은 항온 처리 접시로부터 세정하거나 또는 천천히교반하면서 조직 항온 처리 평판으로부터 유리시켰다. 콜라게나제 처리 이후 상기 세포들을 5㎖들이 유리 피펫으로 항온 처리 접시로부터 긁어낼 수 있었다. 약간의 콜로니들이 분리되었으나, 이는 세포들을 개체화시키기에는 충분하지 않았다. 조직 항온 처리 평판으로부터 세포들을 화학적으로 제거한후, 세포 현탁액을 5분 동안 천천히 원심 분리시키고, 상청액을 제거 및 폐기한후, 세포들을 세정하고 이들을 다시 혈청을 함유하거나 또는 함유하지 않는 배양 배지중에 재현탁시켰다.
세포들의 기계적 제거는 항온 처리 평판으로부터 세포들을 긁어내는 유리 피펫을 사용하여 수행하였다. 새로운 조직 배양 배지중에서 원심 분리를 행하지 않고, 세포 군생체들을 즉시 재현탁시킬 수 있었다.
일단 콜로니들이 조직 항온 처리 평판으로부터 제거되면, ES 세포들은 추가의 배상체 생성중에 현탁액내에 유지되어야 한다. 이는 예를 들어, 세포 현탁액을 천천히 계속적으로 록킹시킴으로써 수행될 수 있다. 세포 현탁액을 6 웰 조직 항온 처리 접시의 웰들에 분취시키고, 이를 록커(Red Rocker, Hoefer Scientific Instruments)상에 위치되어 있으며, 5% CO2, 5% O2및 90% N2로 충전되어 밀봉된, 가습 분리 챔버에 위치시켰다. 상기 록커를 37℃로 유지시킨 항온 처리기 내에 넣었다. 상기 항온 처리 평판들을 48 시간 이상 14일 이하의 기간 동안 계속적으로 록킹시켰다.
2 일마다 평판들을 록킹 장치로부터 분리하여 배양 배지를 제거한후, 새로운 배양 배지를 상기 세포들에 첨가하였다. 이후 상기 항온 처리 접시들을 록킹 환경으로 복귀시켰다. 세포들은 또한 록킹시키지 않는 현탁 항온 처리 접시(Nunc)중에서 항온 처리되는 경우 현탁된 상태로 유지될 것이거나, 또는 혈청이 존재하지 않는 상태에서 항온 처리될 경우, 부착 인자들을 제공한다. 모든 세포들은 가습화된, 규정 기체 대기(공기중 5% CO2, 5% O2및 90% N2또는 5% CO2)중 37℃에서 항온 처리되어야 한다.
11일 이하의 기간 동안 배양액을 현탁시킨 이후, ES 배지중에서, 배상체들을 기계적 또는 화학적 수단으로 분산시키고 젤라틴 또는 매트릭스로 처리된 조직 항온 처리 평판에 재부착시킬 수 있었다.
교체되고 평판에 재부착된 배상체들은 평평한 단일층들을 형성할 것이며, 2일마다 배지를 교체하여 유지시킬 수 있었다.
배상체의 분석 및 분화된 세포들
신경 표현형을 나타내는 세포들의 존재를 확인하기 위하여 평판화시킨 이후 7일 이하의 기간 동안 면역형광 항체 염색을 수행하였다. 세포들을 30% 메탄올/10% 아세트산에 고정시킨 이후 상기 항체들과 항온 처리하였다. 사용된 항체들은 다음과 같았다 : 토끼 항-소 GFAP(DAKO), 항-Forse-1(Developmental Studies Hybridoma Bank), 항-소 MAP-2(Roche), 항-인간 NCAM/CD56(DAKO) 및 항-01(S.-C. Zhang, University of Wisconsin). 항-GFAP를 제외한 모든 1차 항체들은 마우스 모노클로날 항체들이다. 2차 항체들, FITC-접합된 염소 항-마우스 IgG 및 바이오틴 접합된 염소 항-토끼, 및 AMCA 접합된 스트렙타비딘을 Jackson ImmunoResearch로부터 구입하였다.
Forse-1 항체는 포스파칸, 즉 인간 및 설치류 모두의 배아 CNS에서 신경 세포 부착 분자들과 결합하는 뇌 특이적 콘드로이친 설페이트 프로테오글리칸을 인지한다[K.Allendorfer외 다수, 6 Mol. And Cell. Neuro. 381-395(1995) ; S.Tole외 다수, 15 J.Neuro. 957-969(1995)]. 상기 01 항체는 배아 마우스 뇌 배양액중 3일 경과시 제공되는 프로올리고덴드로사이트를 인지하였다[M.Schachner외 다수, 83 Dev.Biol. 328-338(1981) ; I.Sommer외 다수, 83 Dev. Biol. 311-327(1981)].
평판화 이후 3일 이내에, Forse-1 및 01에 의하여 염색된 신경 전구체들을 관찰하였다. 상기 Forse-1 항체는 다수의 둥근형 세포들을 염색시켰던 반면에, 매우 드물게 존재하는, 외부에 돌기가 형성된 평판화 세포들은 항-01 항체로 염색되었다.
신경 세포 부착 분자(NCAM)/CD56(도 3), 미세소관 결합 단백질-2(MAP-2)(도 3), βⅢ-튜불린 및 신경교 섬유상 산성 단백질(GFAP)을 양성 염색시킴으로써, 평판화 이후 3일 경과시 및 그 이후에 뉴런 및 신경교를 검출하였다. NCAM은 신경 상피 세포에서 세포-세포 상호 작용에 중요한 것으로 생각되는 세포 부착 분자이다[B.Cunningham외 다수, 236 Science 799-806(1987) ; J.Ritz외 다수, 42 Adv. Immuno. 181-211(1988)]. MAP-2는 뇌 미세소관 조립에 중요한 역할을 한다. βⅢ-튜불린은 뉴런 특이적 마커로서, 신경교 섬유상 산성 단백질(GFAP)은 성상세포 마커이다.
계통으로의 분화
배상체들은 다수의 바람직한 계통으로 분화될 수 있다. 예를 들어 배상체들은 M.Wiles외 다수 111 Development 259-267(1991)에서 마우스에 대하여 사용된 기술과 유사한 기술을 사용하여 조혈 세포를 유도해내는데에 사용될 수 있었다. 이러한 관점에서, 2 i.u./㎖ 에리트로포에틴 또는 IL-3의 존재하에 혈청 함유 배지중 배상체들을 평판화시킬 수 있었다.
심장 계통들이 바람직한 경우, T.Doetschman외 다수, 87 J.Embry.Exper.Morph. 27-45(1985)에 기술된 것과 유사한 기술을 사용할 수 있다. 첨가물이 함유되어 있지 않은 혈청 함유 배지중에 상기 배상체들을 평판화시킬 수 있었다.
신경 계통들을 발생시키기 위하여 섬유아세포 생장 인자 20 ng/㎖ 및 표피 생장 인자 20 ng/㎖의 존재하에서 배상체들을 평판화시킬 수 있었다. 이는 B.Reynolds외 다수, 255 Science 5052(1992)에 기술된 기술과 유사하다.
그러므로 본 발명은 영장류 ES 세포들로부터 영장류 배상체들을 제조하는 효과적인 방법을 제공한다. 상기 방법은 레서스 및 인간 배아 줄기 세포들(및 이들 배상체들로부터 유래된 신경 세포들)에 중점을 두고 있었던 반면에, 본원에 기술된 기술들은 영장류 배아 줄기 세포들 및 다른 세포 유형들에 대하여 널리 연구되었다. 뿐만 아니라, 군생체 제거용 특이적 기술들이 논의되었던 반면에, 본 발명은 이것들에 한정되지 않는다. 차라리, 기판으로부터 군생체 형태인 세포들을 제거하기 위한 다른 기술들이 수행되어야 한다.
그러므로, 본 발명은 본원에 기술된 특정 구체예들에 한정되지는 않는다. 차라리, 본 발명의 전범위를 파악하기 위해서는 청구의 범위를 주의깊게 살펴봐야 할 것이다.
본 발명은 연구, 의학적 목적 및 계통으로의 분화에 적합한 인간 및 다른 영장류 배상체들을 제공하는 것이다.
Claims (15)
- 기판에 부착되는 영장류 배아 줄기 세포들의 콜로니들로부터 영장류 배상체들을 생성시키는 방법으로서, 상기 방법은기판으로부터 군생체 상태의 배아 줄기 세포들의 부착성 콜로니들을 제거하는 단계 ; 및상기 군생체들이 본질적으로 용기에 부착되는 것이 방지되고 배상체들로 유착하는 조건하에 용기내에서 군생체들을 항온 처리하는 단계를 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제거 단계가 기판으로부터 군생체로서 상기 군생체들의 분리를 촉진하는 효소의 존재하에 수행되는 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 효소가 디스파제인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제거 단계가 킬레이팅제의 존재하에서 수행되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제거 단계가 기판으로부터 군생체들을 기계적으로 긁어내는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제거 단계가 트립신, 칼슘 및 마그네슘의 존재하에서 수행되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 항온 처리 단계가 상기 용기를 교반시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 항온 처리 단계가 플라스틱재 용기에서 수행되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 항온 처리 단계가 무혈청 배지의 존재하에서 수행되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 영장류 배아 줄기 세포가 인간 배아 줄기 세포이고 영장류 배상체들이 인간 배상체인 방법.
- 제1항의 방법으로 유도된 영장류 배상체.
- 제11항에 있어서, 상기 배상체가 인간 배상체인 영장류 배상체.
- 제11항의 배상체로부터 유도된 분화 영장류 세포.
- 제13항에 있어서, 상기 세포가 인간 세포인 분화 영장류 세포.
- 제14항에 있어서, 상기 세포가 인간 신경 세포인 분화 영장류 세포.
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