KR101948396B1 - 특정 전자기파 처리를 통한 효율적 3d 중뇌 유사 오가노이드 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 특정 전자기파를 이용한 3D 도파민성 중뇌 오가노이드 (organoid)로의 분화 방법에 관한 것으로, 상기 방법을 통하여 도파민 신경세포 3D 분화 유사장기 제작 효율을 현저하게 향상시킬 수 있으며, 이를 통하여 파킨슨병 증상을 효과적으로 완화시킬 수 있음을 구체적으로 확인하였는바, 퇴행성 뇌신경 질환 치료에 있어서, 보다 근본적으로 접근하여 타겟 치료를 할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

특정 전자기파 처리를 통한 효율적 3D 중뇌 유사 오가노이드 제조 방법 {Method for efficient generation of 3D midbrain organoid using specific electromagnetic field}
본 발명은 특정 전자기파 처리를 통한 도파민 신경을 포함하는 3D 중뇌 (midbrain) 유사 오가노이드 (Organoid)로의 효율적 분화 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 상기 방법에 의해 제작된 중뇌 유사 오가노이드 (Organoid) 및 이를 활용한 뇌신경 질환 치료용 신약 스크리닝 방법 및 세포치료제에 관한 것이다.
알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈, 척수손상 등의 뇌신경 질환 치료에 있어서, 신경세포의 재생을 통한 새로운 치료 후보물질이 다양하게 등장되어 왔으며, 이러한 해결책으로는 배아줄기세포 및 만능성 줄기세포 등을 이용하여 환자 특이적 치료용 세포를 만들어 투여함으로써 뇌신경 질환을 치료하는 여러가지 방법이 대두되어 왔다. 그러나 이러한 미분화된 만능성 줄기세포가 이식될 경우, 암을 유발할 위험성이 존재하므로 치료제로 활용함에는 한계가 존재한다.
최근 개발되고 있는 최신 줄기세포 기술 중, 줄기세포를 특정 세포로 분화시킬뿐 아니라, 특정 세포로 분화하는 과정에서 3D 상태로 분화를 유도하였을 때, 신체 장기와 유사한 모양의 구조를 갖는 3D 상태의 유사장기 (Organoid) 구조체를 만들 수 있다고 밝혀지고 있으며, 이러한 발견들을 바탕으로, 현재까지 뇌 유사장기 (brain organoid), 심장 유사장기 (heart organoid), 간 유사장기 (liver organoid), 폐 유사장기 (lung organoid), 소장 유사장기 (small intestine organoid) 등 다양한 미니 유사 장기가 제작될 수 있다는 결과들이 보고되었다.
이러한 유사장기, 즉 오가노이드의 개발은 생체 내와 가까운 3D 환경의 조성을 보임으로서, 기존에 보여질수 없던 ‘몸 밖’의 실험 상황에서도 약물이 마치 ‘몸 안’에서 작용하듯이 실험할 수 있을 뿐더러 실제 사람의 장기에서 나타나는 효과를 그대로 재연할 수 있다는 장점 있다. 또한, 최근에는 도파민 신경을 포함하는 중뇌 유사장기 (midbrain organoid) 까지 제작될 수 있음이 보고 되었으며, 이러한 중뇌 유사장기는, 파킨슨병을 모델하는 시스템을 대체할 수 있는 아주 유효한 방법이라고 볼수 있어, 향후 파킨슨병 치료를 위한 신약 개발 검증 및 발암 위험성이 낮은 새로운 세포 이식체 개발에 많은 가능성을 제공하고 있다.
그러나, 현재 대두되고 있는 가장 큰 문제는 이러한 3D 중뇌 및 모든 유사장기 개발에는 많은 시간과 복잡한 단계의 다양한 화합물을 처리 등을 통해서만 유사장기가 유도될 수 있다고 보고되어지고 있으며, 이러한 번거로움은 미래의 3D 유사장기의 활용에 큰 어려움이 된다. 이에, 생체 내외에서 복잡한 단계와 다양한 기술적인 처리 과정 없이, 보다 효율적으로 유사장기를 제작할 수 있는 방법이 요구되고 있는 실정이다 (한국공개특허 제10-2012-0003855 참조).
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 줄기세포에 3D 중뇌 구조를 유도할 수 있는 특이적인 특정 주파수의 전자기파장을 처리하였을 때, 3D 중뇌 유사 오가노이드 (Organoid)를 보다 효율적으로 제작할 수 있음을 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 줄기세포에 전자기장을 인가하는 단계를 포함하는, 3D 중뇌 유사 오가노이드 (Organoid)로의 분화방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 분화된 신경세포를 포함하는, 뇌신경 질환 치료용 세포치료제를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포에 전자기장을 인가하는 단계를 포함하는, 3D 중뇌 유사 오가노이드 (Organoid)로의 분화방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 방법은 줄기세포에 금속 나노입자를 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 전자기장은 5 Gauss 내지 100 Gauss의 강도로 인가될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 전자기장은 10Hz 내지 500Hz의 주파수로 인가될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 금속 나노입자는 금 나노입자, 은 나노입자, 및 자성 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 역분화 줄기세포, 전분화능 줄기세포 또는 신경 줄기세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 분화된 3D 중뇌 유사 오가노이드 (Organoid)를 포함하는, 뇌신경 질환 치료용 세포치료제를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 뇌신경 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈 및 뇌졸중으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 세포치료제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌신경 질환의 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 분화된 신경세포의 뇌신경 질환 치료제 제조용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 분화된 3D 중뇌 유사 오가노이드 (Organoid)를 개체에 이식하는 단계를 포함하는 뇌신경 질환의 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 분화된 3D 중뇌 유사 오가노이드 (Organoid)를 이용한 뇌신경 질환 치료제의 스크리닝방법을 제공한다.
본 발명은 특정 전자기파를 이용한 3D 도파민성 중뇌 오가노이드 (organoid)로의 분화 방법에 관한 것으로, 상기 방법을 통하여 도파민 신경세포 3D 분화 유사장기 제작 효율을 현저하게 향상시킬 수 있으며, 기존의 줄기세포 보다 효과적으로 기존의 뇌조직과 유사한 구조를 만들 수 있는 3D 환경을 제공함으로써, 기존 모델에서는 구현이 어려웠던 파킨슨병 3D 발달 모델을 효율적으로 구현할 수 있다. 또한, 3D 중뇌 구조체를 통한 세포 재생 효과를 극대화하여 파킨슨병 질환의 증상을 효과적으로 완화시킬 수 있음을 구체적으로 확인하였는바, 뇌신경 질환 치료를 위한 기술로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
이러한 전자기장 처리 3D 기반 유사장기 제작 기술은 물리적인 전자기장을 이용하여 비침습적이므로, 간편하고 효율적인 장기유사체 제작을 유도할 수 있다. 아울러, 장기유사체 제작이 완료되었을 때도 단순히 전자기장 처리를 제거하여 발달 정도에 따라 이식용 3D 신경 제작 효과를 조절할 수 있다는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 특정 전자기파 (10 Gauss, 100 Hz)를 처리하여 3D 중뇌 유사 오가노이드를 제작하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 특정 전자기파 (10 Gauss, 100 Hz) 하에서 3D 중뇌 유사 오가노이드 (Organoid)의 크기 변화를 여러 강도 (3, 5, 10, 또는 30 Gauss)의 전자기파와 비교한 결과이다.
도 3은 여러 주파수 (10, 50, 100, 150, 200, 또는 300 Hz)의 전자기파를 7 일간 처리하여 제작된 3D 중뇌 유사 오가노이드 (Organoid) 내에서, TH 및 Tuj1을 공통으로 나타내는 양성 (positive) 도파민 신경의 수를 나타낸 도이다.
도 4는 여러 강도 (10, 30, 60, 100, 150, 200, 또는 500 Gauss)의 전자기파를 7 일간 처리하여 제작된 3D 중뇌 유사 오가노이드 (Organoid) 내에서, TH 및 Tuj1을 공통으로 나타내는 양성 (positive) 도파민 신경의 수를 나타낸 도이다.
도 5는 2D 및 3D에서 각각 real time qPCR을 수행하였을 때, 10 Gauss/100 Hz 조건에서 도파민 신경 유전자인 Th 및 Synapsin의 발현을 나타낸 도이다.
도 6a는 10 Gauss/100 Hz의 전자기파 조건에서 2D 및 3D에서의 면역 염색을 수행한 결과이며, 도 6b는 상기 면역 염색을 수량화한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 특정 전자기파 (10 Gauss, 100 Hz)를 처리하여 3D 중뇌 유사 오가노이드 (Organoid)로 분화된 세포를 나타낸 도이다.
도 8은 10 Gauss/100 Hz의 전자기파 인가/비인가 조건에서, 금속 나노입자 (goldnanoparticles)를 함께 처리하였을 때, 대조군에 비하여 보다 더 많은 3D 도파민 신경이 생성됨을 확인하는 도이다.
도 9는 MPTP-파킨슨 질환 동물 모델에서, 특정 전자기파 (10 Gauss, 100 Hz)를 인가하여 제작된 중뇌 오가노이드를 이식한 후, 행동실험을 통하여 파킨슨 치료 효과를 확인한 도이다.
본 발명자들은, 특정 전자기파를 처리하여 3D 중뇌 유사 오가노이드 (Organoid)로의 제작 효율을 현저하게 증진시킬 수 있으며, 이 과정에서 인가되는 전자기장을 조건을 조절함으로써 3D 분화능을 자유롭게 조절할 수 있음을 확인하였다. 또한, 이러한 방법을 생체 내에 적용하여, 파킨슨 질환 동물 모델을 이용한 실험에서도 3D 중뇌 신경세포로의 분화 효율 증진 및 증상의 완화 효과를 구체적으로 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 줄기세포에 전자기장을 인가하는 단계를 포함하는, 3D 중뇌 유사 오가노이드 (Organoid)로의 분화방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "줄기세포"는 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 '미분화' 세포로서, 배아줄기세포, 또는 성체줄기세포를 포함하는 모든 종류의 줄기세포를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "오가노이드 (organoid)"는 줄기세포를 이용해 최소 기능을 할 수 있도록 만든 ‘미니 유사 장기’로서, 3차원 구조로 만들어져 실험실에서도 실제 신체 기관과 비슷한 환경을 만들 수 있는 것이 특징이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "3D 중뇌 유사 오가노이드 (Organoid)"는 뇌의 일부분인 '중뇌'를 소규모로 만든 미니 유사 장기로서, 신경세포들이 연결돼 네트워크를 구성하고 있고, 서로 신호를 전달하며 신경전달물질을 만들어내는 등 사람 뇌에서 일어나는 작용을 그대로 가지는 것이 특징이다.
본 발명의 일구체예로, 상기 3D 중뇌 유사 오가노이드 (Organoid)로의 분화 효율을 증진시키고자 줄기세포에 금속 나노입자를 접촉시킨 후, 전자기장을 인가하여 상기 금속 나노 입자에 전자기를 유도하였으며, 동물의 체내인 뇌에 금속 나노입자와 관련 전사인자를 함께 주입한 후, 동물에 직접 전자기장을 인가하였다.
본 발명에서, 상기 전자기가 유도된 금속 나노입자는, 줄기세포에서 오가노이드로의 분화를 촉진시키며, 바람직하게 금, 은, 또는 자성 나노입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 전자기장은 5 Gauss 내지 50 Gauss의 강도 및/또는 10Hz 내지 500Hz의 주파수로 인가될 수 있으며, 바람직하게는 10 Gauss/100 Hz의 전자기장일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이에, 본 발명은 상기 방법으로 분화된 3D 중뇌 유사 오가노이드 (Organoid)를 포함하는, 뇌신경 질환 치료용 세포치료제를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 약학적 조성물 또는 세포 치료제의 투여에 의해 뇌신경 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 치료 대상이 되는 질병인 "뇌신경 질환"은 신경 특히 뇌신경과 관련된 여러 가지 질병을 총칭하는 것으로서, 바람직하게는 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈, 뇌졸중, 또는 척수손상 질환일 수 있고, 보다 바람직하게는 파킨슨병일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 있어서, "세포치료제"는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다.
한편, 본 발명의 다른 양태로서, 상기 세포치료제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌신경 질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명에서, "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 전자기장을 이용한 3D 도파민 신경 Organoid로의 효율적 분화 유도
줄기세포에서 3D 도파민 신경 오가노이드로의 분화를 보다 효율적으로 유도할 수 있는 방법을 확인하기 위하여, 배아줄기세포 및 역분화 줄기세포를 포함하는 줄기세포에 특정 전자기장을 처리하여 3D 신경 유사장기로 분화시키는 방법을 구상하였으며, 이를 도식화하여 도 1에 나타내었다. 보다 구체적으로는, 외부 전자기장의 다양한 강도 및 파장에 따른 3D 도파민신경 Organoid로의 분화 효율 증진을 확인하였다.
1-1. 전자기장의 강도에 따른 3D 신경 Organoid 분화 효율 변화
먼저, 전자기장 처리 변화 (강도)에 따른 3D 도파민 신경 오가노이드 분화 활성을 평가하기 위하여, 다양한 강도 (3~100 Guess)의 전자기장을 인가한 후, 줄기세포로부터 3D culture를 통해 제작된, 도파민 신경유사장기 (Organoid)의 크기를 확인하였다. 보다 구체적으로는, 전분화능 배아 및 역분화 줄기세포 각각을 3D culture을 통해서 약 12일 동안 10 Guess의 전자기장 하에서 분화를 유도하였으며, 직경 (Diameter) 측정을 통하여 도파민 신경 오가노이드로의 효율적인 제작을 확인하였다. 이때, 인간 배아줄기세포로부터 3 번의 독립적인 3D 분화 실험을 수행하였으며, 인간 역분화 줄기세포로부터 역시 3 번의 독립적인 3D 분화 유도 실험을 수행하여 나타나는 diameter를 측정한 결과의 평균값과 표준편차를 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 10 Guess의 전자기파를 12 일 동안 처리하였을 때, 10 Guess의 조건에서 도파민신경 오가노이드가 효율적으로 제작되어짐을 확인하였다.
또한, 상기 결과를 추가적으로 검증하기 위하여, 신경 지표 유전자인 Tyrosine hydroxylase (TH), 및 Class III β-tubulin (Tuj1)를 발현하는 도파민 신경 유사장기의 수를 측정하였다. 이때, 배아줄기세포로부터 3 번의 독립적인 분화 실험과, 역분화 줄기세포로부터 역시 3 번의 독립적인 실험을 수행하여 제작된 도파민 신경 오가노이드를 면역 염색 후, 형광 현미경하에서 이의 총 갯수를 측정하여 나타나는 결과의 평균값과 표준편차를 통하여 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 10 Guess의 전자기파를 7 일 동안 처리하였을 때, 10 Guess의 조건에서 도파민신경 유사체가 최대의 양으로 제작되어짐을 확인하였다.
1-2. 전자기장의 파장에 따른 3D 신경 Organoid 분화 효율 변화
다음으로, 전자기장의 파장 변화에 따른 3D 신경 오가노이드 분화 활성을 평가하기 위하여, 다양한 파장 (50, 100, 150 및 250 Hz)의 전자기장을 인가한 후, TH+/Tuj1+인 도파민 신경 유사장기의 수의 변화를 측정하여 비교하였다. 이때, 배아줄기세포로부터 3 번의 독립적인 3D 분화 실험을 수행하였으며, 역분화 줄기세포로부터 역시 3 번의 독립적인 3D 분화 유도 실험을 수행하여 제작된 도파민 신경 오가노이드를 면역 염색 후, 형광 현미경하에서 Tuj1+/TH+ 도파민 신경 오가노이드 개수를 측정하여 나타나는 결과의 평균값과 표준편차를 통하여 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 전자기장을 인가하지 않은 군에 비해 전자기장을 인가한 군에서, 다수의 TH+/Tuj1+ 도파민 오가노이드가 측정되었다. 특히, 역분화 및 배아 줄기세포를 3D 분화하였을 때 100 Hz의 전자기장을 인가한 군에서, 가장 다수의 Tuj1+/TH+ 도파민신경 오가노이드가 제작됨을 확인하였다.
1-3. 특정 전자기장의 처리에 따른 3D 신경 Organoid 분화 효율 확인
상기 방법으로 제작된 전자기파 처리된 3D 오가노이드의 추가적인 검증을 위하여, 10 guess 및 100 Hz 전자기장에서 7 일간의 처리를 통해 제작된 도파민 신경 오가노이드에서, 성숙한 도파민 신경의 마커로 알려진 TH 및 Synapsin의 발현 정도를 RT-PCR 분석 (Realtime PCR analysis)을 통하여 정량적으로 비교하였다. 이때, 대조군으로는 전자기장을 인가하지 않은 군 또는 2D 상태로 플레이트에 붙여서 분화를 유도하는 군을 사용하여 비교하였으며, 배아줄기세포로부터 3 번의 독립적인 2D 및 3D 분화 실험을 수행하였고, 역분화 줄기세포로부터 3 번의 독립적인 2D 및 3D 분화 유도를 진행하여 제작된 도파민 신경 오가노이드에서 RT-PCR을 수행 후, 얻어진 발현양의 상대적 차이를 평균값과 표준편차를 통하여 확인하였다 (Diff medium: 분화유도배지를 통한 분화유도. EMF: 전자기장 처리함.).
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 10 guess의 세기 및 100 Hz의 파장의 전자기장을 3D분화 상태로 인가한 군에서만, 성숙한 도파민 신경 지표 유전자인 TH 및 Synapsin의 발현이 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었다.
또한, 추가적으로 상기 결과를 확인하기 위하여, 7 일간 전자기파를 처리하여 역분화 및 배아 줄기세포로부터 3D 분화를 통해 제작된 오가노이드를 고정후 (4% PFA fixation), 7 μm로 조직을 박리하여, 오가노이드 조직 내에 존재하는 도파민 신경의 수를 측정하였다. 도파민 신경을 확인하기 위해 MAP2 및 TH 항체를 통해서 하나의 오가노이드에 존재하는 도파민 신경을 면역염색하였다. 이때, 배아줄기세포로부터 3 번의 독립적인 3D 분화 실험을 수행하였으며, 역분화 줄기세포로부터 역시 3 번의 독립적인 3D 분화 유도를 통해, 각각 제작된 도파민 신경 오가노이드에서 각 5 개씩 조직을 준비하여 면역 염색을 수행하였고, 상기 5 개의 오가노이드에서 염색을 통해서 얻어지는 조직을 랜덤하게 선택하여, 각 field에서 count 수행 후 얻어진 Map2+/TH+ 개수의 평균값과 표준편차를 확인하였다.
그 결과, 도 6a 및 6b에 나타낸 바와 같이, 10 Guess 및 100 Hz의 전자기장을 인가한 군에서 만들어진 도파민 신경 오가노이드 조직 안에서, 가장 다수의 Map2+/TH+ 신경세포가 관찰되었다.
상기 내용을 종합한 결과, 10 guess의 강도 및 100 Hz의 파장의 전자기파를 처리하였을 때, 최적의 도파민 신경 오가노이드가 제작됨을 확인할 수 있었다. 또한, 이러한 결과를 바탕으로, 추가적으로 10 guess 및 100 Hz의 파장의 전자기파를 처리를 통한 도파민 신경으로 3D 분화를 최장 20일까지 유도하였을 때, 대조군에 비교하여 전자기장을 인가한 군에서 현저히 크기가 큰 도파민 신경 오가노이드가 형성됨을 확인할 수 있었다(도 7 참조).
실시예 2. 전자기장으로 자기화된 금속 나노입자를 활용한 3D 도파민 신경 Organoid 제작 효율 증가 확인
본 실시예에서는 상기 실시예 결과를 바탕으로, 전자기장의 처리 효과를 극대화하기 위해서 금속나노입자를 추가하여, 3D 도파민 신경 오가노이드로의 분화 유도를 보다 효율적으로 증진시킬 수 있는지를 확인하고자 하였다. 보다 구체적으로는, 줄기세포에 금 나노입자를 선처리한 후 (금 나노입자에는 RGD protein을 금 나노입자에 코팅하여, 세포에 처리하였을 때, 세포표면에 쉽게 흡착되게 하였다) 전자기장을 인가한 경우, 금속 나노입자가 세포에서 보다 더 직접적으로 자기화되어 도파민 신경 오가노이드로의 3D 분화를 보다 더 효율적으로 유도함을 확인하고자 하였다. 대조군으로는 금속 나노입자 및 전자기장을 전혀 처리하지 않은 군 (Control)을 이용하였다. 이때, 배아줄기세포로부터 3 번의 독립적인 3D 분화 실험을 수행하였으며, 역분화 줄기세포로부터 역시 3 번의 독립적인 3D 분화 유도를 통해, 각각 제작된 도파민 신경 오가노이드에서 각 임의로 4 개씩 조직을 선택하여 면역 염색을 수행하였고, 각 오가노이드에서, 염색을 통하여 얻어지는 임의의 조직에서 발견되어지는 Tuj1+/TH+ 세포 개수의 평균값과 표준편차를 통하여 확인하였다 (EMF: 전자기장 처리, AuNPs: 금나노입자).
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 줄기세포에 금 나노입자를 처리한 후, 10 guess 및 100 Hz의 전자기장을 7 일간 인가한 경우, 신경 지표 유전자인 Tuj1 및 TH를 발현하는 세포의 수가 전자기화된 도파민 신경 오가노이드에서 증가됨을 확인하였다.
실시예 3. 전자기장을 이용하여 분화된 3D 신경 Organoid를 활용한 파킨슨병 치료 효과 확인
나아가, 본 실시예에서는 파킨슨병 동물 모델을 이용하여 본 발명에서 제작된 3D 신경 오가노이드로의 분화 유도된 오가노이드의 치료 효과를 in vivo 상에서 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 상기 실시예 1의 방법으로 전자기장 하에서 7 일간 분화된 3D 도파민신경 오가노이드를 6OHDA (6-hydroxydopamine)가 한 쪽 뇌에만 처리된 파킨슨병 질병 마우스의 뇌에 이식하였으며, 마우스의 행동성을 분석하였다. 이때, 대조군으로는 전자기장을 인가하지 않은 군에서 제작된 오가노이드를 이식에 이용하였으며, 배아줄기세포로부터 3 번의 독립적인 3D 분화 실험과, 역분화 줄기세포로부터 역시 3 번의 독립적인 3D 분화 유도를 통해, 각각 제작된 도파민 신경 오가노이드를 각 5 마리씩 6OHDA를 처리하여 제작된 파킨슨 마우스 모델에 이식하였고, 이식 3 주 후에 apomorpine을 활용하여 30 분간 rotation을 유도하여 행동결과를 수치화하여 평균값과 표준편차를 확인하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 일반적으로 6OHDA (6-hydroxydopamine)를 한쪽 뇌에만 처리하였을 때, 마우스의 한쪽 도파민 신경이 괴사됨으로써 ratation 행동 양식을 보이는데 반해, 전자기장 처리된 오가노이드를 이식하였을 때, 대조군보다 효율적으로 적은 rotation 행동을 보임으로써 세포 치료에 있어서도 전자기장 처리된 3D 도파민신경의 효과가 있음을 확인하였다.
상기 내용을 종합한 결과, 본 발명의 방법을 통하여 제작된 3D 도파민 신경 오가노이드가 세포 치료에 보다 더 효율적인 효과가 있음을 알 수 있는바, 퇴행성 뇌신경 질환 치료를 위한 기술로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (8)

  1. 배아줄기세포 또는 역분화줄기세포에 전자기장을 인가하는 단계를 포함하고, 금 또는 은 나노입자를 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 3D 중뇌 유사 오가노이드 (Organoid)로의 분화방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 전자기장은 30 Gauss 내지 200 Gauss의 강도로 인가되는 것을 특징으로 하는, 3D 중뇌 유사 오가노이드 (Organoid)로의 분화방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 전자기장은 50 Hz 내지 200 Hz의 주파수로 인가되는 것을 특징으로 하는, 3D 중뇌 유사 오가노이드 (Organoid)로의 분화방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 금 또는 은 나노입자는 RGD 단백질(RGD protein)을 코팅한 것을 특징으로 하는, 3D 중뇌 유사 오가노이드 (Organoid)로의 분화방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 배아줄기세포 또는 역분화줄기세포는 전분화능 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 3D 중뇌 유사 오가노이드 (Organoid)로의 분화방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
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