KR20130061970A

KR20130061970A - 복합파동을 이용한 줄기세포 분화 방법 및 장치

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Publication number: KR20130061970A
Application number: KR1020110128317A
Authority: KR
Inventors: 박정극; 조현진; 서영권; 윤희훈; 최윤경; 박정은; 유보영; 김수찬; 김성민
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2011-12-02
Filing date: 2011-12-02
Publication date: 2013-06-12

Abstract

본 발명은 복합파동을 이용한 줄기세포 분화 방법 및 분화장치에 관한 것으로, 보다 구체적으로 전자기장과 음파로 구성된 복합파동을 이용하여 세포획득과 대량증식이 용이한 중간엽 줄기세포로부터 신경세포나 신경줄기세포를 수득하는 방법, 장치, 이를 이용하여 제조한 신경세포 및 이 신경세포를 포함하는 신경질환 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 복합파동을 이용한 줄기세포 분화 방법 및 분화장치는 저주파수의 전자기장과 음파의 복합 파동을 이용하여 성체줄기세포를 신경세포로 분화 유도함으로써 세포획득이 어려운 신경세포나 신경줄기세포의 용이한 수득이 가능하게 되며, 성장용 배지 조건에서도 신경분화를 유도할 수 있기 때문에 알츠하이머병, 우울증, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈, 척수손상 등의 뇌신경질환치료에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

복합파동을 이용한 줄기세포 분화 방법 및 장치 {Differentiation method of Mesenchymal stem cells by composite waves and an Appratus thereof}

본 발명은 전자기장과 음파로 구성된 복합파동을 이용하여 중간엽 줄기세포로부터 신경세포나 신경줄기세포를 수득하는 방법 및 장치에 관한 것이다.

알츠하이머병, 우울증, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈, 척수손상 등의 뇌신경질환치료에 신경세포가 치료 후보물질로 등장함에 따라 신경세포 관련한 연구가 최근 활발하게 이루어지고 있으며 다수의 논문 및 특허들이 발표되고 있는 실정이다. 그러나 신경세포 또는 신경줄기세포는 세포의 수득이 어려워 비교적 획들이 용이한 중간엽줄기세포를 신경세포로 분화 유도하는 방법에 관련 연구들이 다수 수행되고 있다. Lauren의 리뷰논문(Plast . Reonstr. Surg. 116:1453, 2005)에 의하면 지방유래 중간엽줄기세포가 화학적인 방법을 이용하여 생체외에서 신경으로 분화되었다는 6건의 보고 중 기능적으로 전기생리학적 특성을 가진다는 경우는 단 한건만이 보고되었다. Arshak (Stem Cells and Development, 17: 1123-30, 2008)의 연구에 의하면 골수유래 중간엽줄기세포를 화학적인 분화방법을 통해 신경세포로 분화유도하였으며 그 특징관찰을 위해 면역조직화학법, 웨스턴 블롯법(B3T, GFAP, MAP-2, NeuN), ELISA법(신경성장인자(NGF), 뇌유래신경세포인자 (BDNF))을 통해 분화된 신경표지인자들을 확인하였으나 전기생리학적 특성을 나타내지는 않았다. 신경세포나 신경전구세포와의 혼합배양에 의해 중간엽줄기세포를 신경치료에 사용하려는 연구(Croft AP, Exp. Neurol ., 216(2): 329-41(2009))가 진행중이나 혼합배양에 사용할 충분한 양의 인체 신경세포나 신경전구세포 획득이 실제적으로 불가능하다. 또 다른 연구방향으로는 신경세포로의 분화수율을 높이기 위해 렌티바이러스를 이용하여 신경관련 유전자 과발현을 유도하는 연구(Watson, D. J.,, Journal of Neurotrauma, 21:1723-36.(2004)) (Hofstetter, C., Nature Neuroscience,8: 346-53.(2005))등이 진행중이나 바이러스에 대한 안전성이 확보되지 않아 세포치료법에 적용하기에는 어려움이 있다.

Kuh 등(Acta Neurochir 147:985-992, 2005)에 따르면 인체 제대혈 세포를 척수손상 쥐에게 이식하고 8주차에 관찰한 결과 배지만 넣어준 대조군과 Basso, Beattie, and Bresnahan score (BBB 점수; 생체내 실험에서 회복정도를 수치로 나타내는 점수)에서 비슷한 경향을 나타냈으며 뇌유래신경영양인자(brain derived neutrophic factor; BDNF)를 혼합하여 세포를 이식한 경우 이식 5주후에 유사한 결과를 나타내는 것으로 보아 단순 줄기세포의 이식은 한계가 있다. Rooney 등(Tissue Engineering Part A, Mar. 31, 2009)은 형광발현 쥐로부터 분리한 골수유래 중간엽줄기세포에 아교세포주유래 신경영양인자(GDNF) 유전자를 도입하여 각각 이식한 경우 아교세포주유래 신경영양인자 유전자를 도입한 경우는 6주차까지 생존하는 것이 관찰되었으나 단순 중간엽줄기세포만 이식한 경우 이식 2주 이후엔 이식된 세포가 관찰되지 않아 중간엽줄기세포의 이식만으로는 척수손상 치료연구로는 부족함이 언급되었다.

낮은 주파수의 전자기장이 중간엽줄기세포의 신경분화를 유도하는 것에 관하여 Piacentini 등(J. Cell . Physiol. 215:129-39, 2008)이 갓 태어난 쥐의 뇌 피질에서 일차배양한 신경줄기세포(Neural Stem Cells)을 도파민을 분신경세포로 분화시키는 연구에 대해 보고하였다. 신경줄기세포는 최종적으로 신경으로 분화되도록 분화방향이 결정된 세포로 성장인자 처리 등 화학적인 처리법을 통해서 신경세포로 분화된다는 연구는 Wright, Anderson, Kelly 등에 의해 여러 차례 보고되었다(Wright LS, Exp . Cell . Res 3112:2 107-20, 2006; Anderson, Exp . Neurol, 204: 512-24, 2007; Kelly, Brain Res Bull, 68: 83-94, 2005). 그러나 신경줄기세포는 뇌 회백질 또는 말초신경절(ganglion) 등에서 수득되나 임상에 적용하기 위한 자가세포를 획득이 불가능하며 신경줄기세포는 조직내에서 분리수율이 낮고 증식능력이 중간엽줄기세포에 비해 낮은 것으로 알려져 있다.

기존에 알려진 파동을 이용한 신경치료 기술로는 뇌조직에 약 10 Hz 이하의 저주파 에너지를 적용시키기 위한 장치로 환자의 뇌안에 전극을 이식후 직접 전기자극을 부여하여 전기흐름에 의한 자기장을 야기하는 장치(공개특허: US20060205993)가 있다. Zheng은 중추신경계에 자기자극을 주는 방법으로 고주파 또는 복수의 주파수 성분을 조합하여 뇌기능 개선에 사용하려는 기술(JP 2008-543388)을 개발하였으며 Riken은 배아줄기세포에 전기펄스 처리하여 신경세포를 제조하는 기술(US200740065941)을 개발하였다. Gliner 등은 세포에 전기펄스를 처리하여 신경세포를 제조하는 기술을 개발하였다(US20050075679). 위의 기술들은 전극을 직접 이식하는 방식으로 전극을 이식하는 수술이 추가되어 환자에게 고통이 수반되며 배아줄기세포의 경우 종양형성의 가능성이 문제가 되어 임상에 적용하는데 한계가 있다.

본 발명자에 의한 한국 선행특허 제10-2008-0096982호, 제10-2008-0048140호에서는 음파를 이용할 경우 지방전구세포와 인대세포에서 다양한 주파수와 강도(intensity)중 특정 영역에서만 세포의 성장과 활성도가 증가함을 확인함으로써, 다양한 주파수가 섞여있는 음파를 사용할 경우 효과가 없음을 입증하였다.

그러나 이와 같은 생체적합물질 분야의 발전 및 인대성장을 촉진시킬 수 있는 신규물질의 개발에도 불구하고 in vitro에서 사람의 동종 또는 이종 인대세포를 효과적으로 증식시키고 활성 시킬 수 있는 적절한 조건, 이식에 사용하였을 때 안전상의 문제없이 생착 가능하고 지속적으로 유지될 수 있는 적절한 형태의 활성이 향상된 인대세포를 수득하는 방법과 이식부위에 음파진동을 처리하여 생착기능을 증가시키는 방법은 개발되지 않았다. 따라서 인대조직의 결손 또는 결함 등을 효과적으로 치료하기 위해서는 세포 생산기술과 적절한 생체적합물질의 조화가 필요하고, 안전상에 문제를 야기하지 않으면서 인대세포의 성장을 촉진할 수 있는 새로운 기술 개발이 요구되고 있는 실정이다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자들은 신경질환치료제로서 그 활용도가 증가하고 있는 신경세포나 신경줄기세포를 세포획득과 대량증식이 용이한 중간엽 줄기세포로부터 간편하게 수득하는 방법 및 장치를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 전자기장과 음파로 구성된 복합파동이 성체줄기세포를 신경세포로 분화 유도할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 중간엽 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 중간엽 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 장치를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 분화된 신경세포 및 이 신경세포를 포함하는 신경 질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전자기장 및 음파를 처리하여 중간엽 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

상기의 전자기장 및 음파는 동시에 또는 순차적으로 처리될 수 있다.

또한, 상기의 전자기장는 바람직하게는 1 내지 200Hz의 주파수로 1 내지 15mT 동안 처리될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 내지 100Hz, 가장 바람직하게는 50Hz의 주파수로 처리될 수 있다.

또한, 상기의 음파는 바람직하게는 0.1 내지 1V, 10 내지 100 Hz의 주파수로 처리된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 1V, 10 내지 40 Hz의 주파수, 가장 바람직하게는 1V, 40Hz의 주파수로 처리될 수 있다.

또한, 상기 중간엽 줄기세포는 배아 유래 또는 성체조직 유래일 수 있으며, 골수유래, 지방유래, 제대혈 유래 또는 제대유래 일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 전자기장 및 음파를 처리하여 중간엽 줄기세포를 신경세포로 분화시키기 위한 장치를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 전자기장 및 음파를 처리하여 중간엽 줄기세포로부터 분화된 신경세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 신경세포를 포함하는 신경질환 치료용 약학적 조성물을 제공하며, 상기 신경질환은 바람직하게는 알츠하이머병, 우울증, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈 또는 척수손상일 수 있다.

본 발명에 따른 복합파동을 이용한 줄기세포 분화 방법 및 분화장치는 기존의 전자기장만을 이용하여 중간엽 줄기세포를 신경세포로 분화유도 했을 때 보다 빠른 시간 내에 신경세포로 분화시킬 수 있다. 저주파수의 전자기장과 음파의 복합 파동을 이용하여 성체줄기세포를 신경세포로 빠른 시간 내에 분화 유도함으로써 세포획득이 어려운 신경세포나 신경줄기세포의 용이한 수득이 가능하게 되며, 신경분화유도용 배지에서도 가능하지만 성장인자 추가에 따른 고비용의 신경분화유도 배지가 아닌 저가의 일반배지 조건에서도 신경분화를 유도할 수 있기 때문에 알츠하이머병, 우울증, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈, 척수손상 등의 뇌신경질환치료에 유용하게 활용 될 수 있다.

도 1은 성체줄기세포의 신경분화유도에 대한 조건의 실험으로서, 생체 외에서 복합파동부여 후 세포의 형태학적 변화를 관찰한 그림이다.
도 2는 성체줄기세포의 신경분화 유도 후 신경관련 유전자들 (GFAP, NeuroD1, MAP-2, MBP, NF-L)의 mRNA발현 비교결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 성체줄기세포 분화용 복합파동 발생장치의 구현을 보여주는 것이다.

본 발명은 전자기장 및 음파를 처리하여 중간엽 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

상기의 전자기장는 바람직하게는 1 내지 200Hz의 주파수로 1 내지 15mT 동안 처리 할 수 있으며, 보다 바람직하게는 50Hz의 주파수로 처리될 수 있다.

또한, 상기의 음파는 바람직하게는 0.1 내지 1V, 10 내지 100 Hz의 주파수로 처리될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 1V, 10 내지 40 Hz의 주파수로 처리될 수 있다.

본 발명의 전자기장 및 음파는 순차적으로 또는 동시에 처리될 수 있다.

본 명세서에서 “전자기장”은 주기적으로 세기가 변화하는 전자기장이 공간 속으로 전파해 나가는 현상으로 전자파와 같은 의미이며, “저주파수 전자기장“는 주파수가 낮은 파를 말하는데, 보통 10kHz 이하를 의미한다.

본 명세서에서 “음파”는 20 kHz 미만의 주파수 영역대로 특정 음파 대역 주파수를 갖는 진동을 중간엽 줄기세포에 처리하여 신경세포로의 분화를 유도할 수 있다.

본 명세서에서 “중간엽 줄기세포 (Messenchymal stem cell)"는 배아 유래 또는 성체조직 유래일 수 있으며, 골수유래, 지방유래, 제대혈 유래, 제대유래일 수 있다.

본 발명은 1 내지 15mT, 1 내지 100Hz의 주파수, 보다 바람직하게는 50Hz의 주파수를 갖는 저주파수 전자기장과 0.1 내지 1V, 10 내지 100 Hz의 주파수, 보다 바람직하게는 0.5 내지 1V, 10 내지 40 Hz의 주파수 영역대의 음파를 이용한 복합파동을 이용하여 성체줄기세포를 신경세포로 분화 유도하는 방법에 관한 것으로 성장용 배지 조건에서도 신경분화를 유도하는 장점이 있다.

실험에 사용한 골수 유래 중간엽 줄기세포는 Lonza사의 세포를 사용하였다. 성장용 배지로는 NH 배지 (Mylteni 사)를 이용하여 5일간 배양하였다. 일차 배양된 제대유래 줄기세포를 NH배지 (Mylteni 사)를 이용하여 계대배양 3회를 실시한 뒤 100mm 디쉬에 8×10⁴ cell씩 접종하였다. 실험에 사용한 중간엽 줄기세포들은 모두 37℃, 5% 이산화탄소 환경에서 배양되었다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 도 3에 있는 음파발생장치를 이용하여 도 2에 나타난 바와 같이 복합파동을 7일간 조사한 뒤 신경분화 관련 유전자의 mRNA 분석 결과 GFAP, NeuroD1, MAP-2, MBP, NF-L의 발현이 현저히 증가함을 확인하였다. 이는 전자기장을 단독으로 준 경우보다 신경분화유도가 빠른 속도로 진행되었음을 의미한다. 이것은 특정 주파수와 자기장 밀도 내에서만 신경세포 분화가 유도되었다.

본 발명은 복합파동을 발생시킬 수 있는 중간엽 줄기세포 분화장치를 제공한다.

본 발명의 중간엽 줄기세포 분화 장치는 바람직하게는 도 3에 예시된 형태일 수 있다. 또한, 도 3에 도시되지 않은 부분이더라도, 본 발명의 기술분야에 종사하는 자들에게 널리 공지된 기술을 추가로 포함할 수 있으며, 이는 본 발명의 기술적 사상의 범주에 포함된다.

본 발명은 또한 상기 방법으로 분화된 신경세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 신경세포를 유효성분으로 포함하는 신경질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 신경질환은 알츠하이머병, 우울증, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈, 척수손상 등을 포함하는 신경질환을 모두 의미하며, 본 발명에 따란 분화된 신경세포 또는 신경줄기세포는 신경질환에서 신경세포의 기능을 회복함으로써 신경질환 치료제로서 기능할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 조성물의 일일 투여량은 약 0.01~1000㎎/㎏, 바람직하게는 약 1~100㎎/㎏이나 임상실험결과에 따라 가감될 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 전체 약학적 조성물에서 0.001 내지 50중량%, 바람직하게는 0.01 내지 20중량% 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 전체 약학적 조성물에서 상기 약학적 조성물이 투여되는 개체의 1kg당 적정량이 투여될 수 있도록 함량을 조절할 수 있다. 예를 들어, 상기 투여되는 개체가 인간인 경우 0.0001 내지 500mg/kg, 바람직하게는 0.001 내지 500mg/kg, 보다 바람직하게는 0.001 내지 300mg/kg의 함량으로 투여될 수 있도록 약학적 조성물에 포함되는 함량이 조절될 수 있다

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1> 복합파동을 이용하여 중간엽 줄기세포로부터 신경세포로의 분화 유도능

저주파수 전자기장를 이용하여 성체줄기세포를 신경세포로 분화 유도하는 방법에 관한 것으로 본 방법은 성장용 배지 조건에서도 신경분화를 유도하는 장점이 있다. 실험에 사용한 골수 유래 중간엽 줄기세포는 Lonza사의 세포를 사용하였고, 성장용 배지로는 NH 배지 (Mylteni 사)를 이용하여 5일간 배양하였다. 일차 배양된 제대유래 줄기세포를 NH배지 (Mylteni 사)를 이용하여 계대배양 3회를 실시한 뒤 100mm 디쉬에 8×10⁴ cell씩 접종하였다. 실험에 사용한 중간엽 줄기세포들은 모두 37℃, 5% 이산화탄소 환경에서 배양되었다.

본 발명을 통해 체외에서 전자기장를 이용한 성체줄기세포의 신경분화유도기술 확보하였으며 도 2에 의하면 복합파동을 7일간 조사한 뒤 신경분화 관련 유전자의 mRNA 분석 결과 GFAP, NeuroD1, MAP-2, MBP, NF-L의 발현이 현저히 증가함을 확인하였다. 이는 전자기장을 단독으로 준 경우보다 신경분화유도가 빠른 속도로 진행되었음을 의미한다.

Claims

전자기장 및 음파를 처리하여 중간엽 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 전자기장 및 음파는 동시에 또는 순차적으로 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 전자기장은 1 내지 100Hz의 주파수로 1 내지 15mT 동안 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 전자기장은 50Hz의 주파수로 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 음파는 0.1 내지 1V, 10 내지 100 Hz의 주파수로 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 음파는 0.5 내지 1V, 10 내지 40 Hz의 주파수로 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 배아 유래 또는 성체조직 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 골수유래, 지방유래, 제대혈 유래 또는 제대유래인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 전자기장 및 음파를 처리하여 중간엽 줄기세포를 신경세포로 분화시키기 위한 장치.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 전자기장 및 음파를 처리하여 중간엽 줄기세포로부터 분화된 신경세포.
제10항의 신경세포를 포함하는 신경질환 치료용 약학적 조성물.
제11항에 있어서, 상기 신경질환은 알츠하이머병, 우울증, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈 또는 척수손상인 것을 특징으로 하는 조성물.