KR20170048111A - 전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용한 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 전자기장으로부터 자기화된 금속 나노입자를 이용한 신경세포로의 직접교차분화방법 및 상기 방법에 의해 분화된 신경세포를 포함하는, 뇌신경 질환 치료용 세포치료제에 관한 것이다. 본 발명에서, 상기 방법을 통하여 신경세포로의 직접교차분화 효율을 현저하게 향상시킬 수 있으며, 뇌졸중 등 뇌신경 질환의 증상을 효과적으로 완화시킬 수 있음을 구체적으로 확인하였는바, 퇴행성 뇌신경 질환 치료에 있어서, 보다 근본적으로 접근하여 타겟 치료를 할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용한 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 방법{Method of direct lineage reprogramming for generating neurons using electromagnetic-induced metalilic nanoparticle}

본 발명은 전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용한 다양한 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 방법 및 상기 방법에 의해 분화된 다양한 신경세포를 포함하는, 뇌신경 질환 치료용 세포치료제에 관한 것이다.

알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈, 척수손상 등의 뇌신경 질환 치료에 있어서, 신경세포의 재생을 통한 새로운 치료 후보물질이 다양하게 등장되어 왔으며, 이러한 해결책으로는 배아줄기세포 및 만능성 줄기세포 등을 이용하여 환자 특이적 치료용 세포를 만들어 투여함으로써 뇌신경 질환을 치료하는 여러가지 방법이 대두되어 왔다. 그러나 이러한 미분화된 만능성 줄기세포가 이식될 경우, 암을 유발할 위험성이 존재하므로 치료제로 활용함에는 한계가 존재한다.

상기의 문제점을 해소하기 위한 방안 중 하나로서, 만능성 줄기세포 단계를 거치지 않고 바로 목적하는 세포로의 전환을 유도하는 직접교차분화 리프로래밍 기술이 주목받고 있다. 본 기술을 적용한다면, 생체 내외에서, 직접 세포의 운명을 바꾸어 신경세포를 제작함으로써, 뇌신경 질환 치료에 효과적으로 이용될 것이 예상되나, 이 역시, 신경세포로의 직접교차분화 효율이 높지 않아 실질적인 임상에 적용함은 무리가 있는 실정이다. 이에 신경세포로의 직접교차분화 효율을 높이기 위한 시도가 이루어지고 있으나 (한국 특허공개번호 10-2015-0015294), 실제 세포 치료용으로 생체 내에서도 효율적으로 이용될 수 있는 직접교차분화리프로그래밍을 유도할 수 있는 기술은 아직은 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 전자기장으로 전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용하여 생체 내외에서 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 효율을 현저히 증진시킬 수 있을뿐만 아니라, 신경세포로의 자연 분화 및 이를 통한 특이적 신경세포 보호효과를 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은 전사인자가 도입된 성체세포와 접촉시킨 금속 나노입자에 전자기장을 인가하는 단계를 포함하는, 성체세포에서 신경세포로의 직접교차분화방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 신경줄기세포 또는 신경 전구세포와 접촉시킨 금속 나노입자에 전자기장을 인가하는 단계를 포함하는, 신경세포로의 자연분화방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 분화된 신경세포를 포함하는, 뇌신경 질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 분화된 신경세포를 포함하는, 뇌신경 질환 치료용 세포치료제를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전사인자가 도입된 성체세포와 접촉시킨 금속 나노입자에 전자기장을 인가하는 단계를 포함하는, 성체세포에서 신경세포로의 직접교차분화방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 전사인자는 Ascl1, Nurr1, Pitx3, 및 Lmx1로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 금속 나노입자는 금 나노입자, 은 나노입자, 및 자성 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 성체세포는 섬유아세포 및 기타 신경세포를 제외한 모든 체세포일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 전자기장은 5 Gauss 내지 100 Gauss의 강도로 인가될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 전자기장은 10Hz 내지 500Hz의 주파수로 인가될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 방법으로 분화된 세포는 도파민 신경 및 가바 신경, 글루탐 신경 등 모든 종류의 신경세포일 수 있다.

또한, 본 발명은 신경줄기세포 또는 신경전구세포와 접촉시킨 금속 나노입자에 전자기장을 인가하는 단계를 포함하는, 신경세포로의 자연분화방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 분화된 신경세포를 포함하는, 뇌신경 질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 분화된 신경세포를 포함하는, 뇌신경 질환 세포치료제를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 뇌신경 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈 및 뇌졸중으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 세포치료제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌신경 질환의 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 분화된 신경세포의 뇌신경 질환 치료제 제조 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 방법은 전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용하여 신경세포로의 리프로그래밍을 유도하는 것으로서, 본 발명에서, 상기 방법을 통하여 생체 내외에서 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 효율을 현저하게 향상시킬 수 있으며, 이러한 기술을 생체 내의 뇌에 적용하였을때, 신경 재생을 통하여 알츠하이머, 파킨슨병, 뇌졸중, 뇌출혈 등 뇌신경 질환의 증상을 효과적으로 완화시킬 수 있음을 구체적으로 확인하였는바, 뇌신경 질환 치료를 위한 기술로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

또한, 분화된 신경세포를 활용하여 다양한 뇌신경 질환 치료용 세포치료 기술을 확립하였으며, 이러한 기술은 물리적인 전자기장을 이용하여, 비침습적으로 직접교차 리프로그래밍을 유도하므로, 안전하고 부작용이 적으면서도 효율적인 신경치료를 유도할 수 있다. 아울러, 신경치료가 완료되었을 때에도, 단순히 전자기장 처리를 제거하여 신경 재생 효과를 치료 정도에 따라 조절할 수 있다는 장점이 있다.

도 1은, 본 발명의 전자기가 유도된 금속 나노입자(금 나노입자, 은 나노입자, 자성 나노입자)를 활용하여 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍하는 방법을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2a는, 전자기장의 다양한 강도 (10G, 20G, 및 30G)에 따른 신경 지표 유전자인 TH, 및 Tuj1의 발현 변화를 면역 염색 및 형광 현미경을 통하여 확인한 결과이다.
도 2b는, 전자기장의 다양한 강도 (10G, 20G, 및 30G)에 따른 신경 지표 유전자인 Tuj1, MAP1, Gad67, Synnapsin의 발현 정도를 RT-PCR을 통하여 비교한 결과이다.
도 3은, 전자기장의 강도 (10G, 20G, 30G, 50G, 100G) 및 파장 (50Hz, 150Hz, 및 250Hz) 변화에 따른 TH+ 신경세포 수의 변화를 비교한 결과이다.
도 4a는, 전자기가 유도된 은 나노입자를 이용한 경우, 신경 지표 유전자 AADC의 변화를 RT-PCR을 통하여 확인한 결과이다.
도 4b는, 전자기가 유도된 마그네틱 나노입자를 이용한 경우, AADC의 변화를 RT-PCR을 통하여 확인한 결과이다.
도 5는, 생체 내 동물모델에서, 본 발명의 신경세포로의 직접교차분화리프로그래밍 방법을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 6은, 동물모델에서, 전사인자 및 금 나노 입자를 마우스의 뇌에 주입하고 전자기장을 동물에 인가한 경우, 신경 지표 유전자인 TH 및 Tuj1의 변화를 면역 염색 및 형광 현미경을 통하여 확인한 결과이다.
도 7a는, 파킨슨병 유발 약물인 6OHDA를 주입한 동물모델에서, 전사인자 및 금 나노입자를 마우스의 뇌에 주입하고 외부에서 전자기장을 인가한 경우, 마우스의 뇌신경 회복효과를 회전수 변화를 통해 확인한 결과이다.
도 7b는, 파킨슨병 유발 약물인 6OHDA를 주입한 동물모델에서, 전사인자 및 은 나노입자를 마우스의 뇌에 주입하고, 외부에서 전자기장을 인가한 경우, 마우스의 뇌신경 회복효과를 회전수 변화를 통해 확인한 결과이다.
도 8a는, 신경세포 파괴 물질인 MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)를 처리한 동물모델에서, 전사인자 및 금 나노입자를 마우스의 뇌에 처리하고 전자기장을 인가한 경우, 신경 지표 유전자인 Tuj1 및 Map2의 변화를 면역 염색법을 이용하여 염색한 후, 형광 현미경을 통하여 확인한 결과이다.
도 8b는, 신경세포 파괴 물질인 MPTP를 처리한 동물모델에서, 전사인자 및 금 나노입자를 마우스의 뇌에 처리하고 전자기장을 인가한 경우, 신경 지표 유전자인 Tuj1의 변화를 정량화하여 확인한 결과이다.
도 8c는, 신경세포 파괴 물질인 MPTP를 처리한 동물모델에서, 전사인자 및 금 나노입자를 마우스의 뇌에 처리하고 전자기장을 인가한 경우, 신경 지표 유전자인 Map2의 변화를 정량화하여 확인한 결과이다.
도 9는, MPTP에 의해 유도된 뇌신경 질환 마우스 동물모델에서, 전사인자 및 금 나노입자를 마우스의 뇌에 주입하고 외부에서 전자기장을 인가한 경우, 마우스의 뇌신경 회복효과를 구부림, 굽힘, 및 테이프 자가 떼기를 통해 확인한 결과이다.
도 10은, 뇌졸중 동물모델에서, 전사인자 및 금 나노입자를 마우스의 뇌에 주입하고 외부에서 전자기장을 인가한 경우, 마우스의 뇌신경 회복효과를 구부림, 굽힘, 및 테이프 자가 떼기를 통해 확인한 결과이다.
도 11a는, 전자기가 유도된 금 나노입자를 이용하여 배아줄기세포에서 신경세포로의 자연분화를 유도한 경우, 분화된 신경세포 수의 변화를 면역염색법을 이용하여 염색한 후, 형광현미경을 통하여 확인한 결과이다.
도 11b는, 전자기가 유도된 금 나노입자를 이용하여 배아줄기세포에서 신경세포로의 자연분화를 유도한 경우, Map2+ 신경세포 수의 변화를 정량화하여 확인한 결과이다.
도 11c는, 전자기가 유도된 금 나노입자를 이용하여 배아줄기세포에서 신경세포로의 자연분화를 유도한 경우, 신경 지표 유전자인 Map2, Tuj1, Vmat2, Nestin, TH, DAT, 및 Pitx3의 발현량 변화를 RT-PCR을 통하여 분석하여 열지도 형태로 확인한 결과이다.
도 12는, MPTP에 의해 유도된 뇌신경 질환 마우스 동물모델에서, 본 발명의 방법을 통해 배아줄기세포로부터 자연분화된 신경세포를 이식한 경우, 마우스의 뇌신경 회복효과를 원통테스트와 움직임 테스트를 통해 확인한 결과이다.

본 발명자들은, 전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용하여 다양한 신경세포로의 직접교차분화 리프로그래밍 (Direct lineage reprogramming) 효율을 현저하게 증진시킬 수 있으며, 이 과정에서 인가되는 전자기장을 조절함으로써 직접교차분화 효율을 자유롭게 조절할 수 있음을 확인하였다. 또한, 이러한 방법을 생체 내에 적용하여, 퇴행성 뇌질환 동물 모델을 이용한 실험에서도 신경세포로의 직접교차분화의 현저한 효율 증진 및 증상의 완화 효과를 구체적으로 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 전사인자가 도입된 성체세포와 접촉시킨 금속 나노입자에 전자기장을 인가하는 단계를 포함하는, 성체세포에서 신경세포로의 직접교차분화방법을 제공할 뿐만 아니라, 신경 줄기세포 또는 신경전구세포와 접촉시킨 금속 나노입자에 전자기장을 인가하는 단계를 포함하는, 신경세포로의 자연분화방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "성체세포"는 분화가 일어난 세포로서, 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 능력을 말하는 다분화능을 완전히 소실하거나 대부분 소실한 상태의 세포를 의미하며, 섬유아세포 및 기타 신경세포를 제외한 모든 체세포일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "신경줄기세포"는 뉴런(Neuron), 별 아교세포(Astrocyte), 희소돌기신경세포 (oligodendrocyte) 등의 신경세포로 분화될 수 있는 다분화능을 가지는 줄기세포 (multipotent stem cell)로서, 바람직하게는 배아줄기세포 또는 역분화 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 성체세포의 전처리 과정은, 기존에 알려진 신경 유도 전자인자의 도입 및 신경유도 물질을 처리하는 것을 의미한다. 또한, 전사인자의 도입은 바이러스를 이용한 방법 등 당업계에 널리 알려진 방법을 통해서 이루어질 수 있으며, 바람직하게 Ascl1, Nurr1, Pitx3, 및 Lmx1로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 도입할 수 있으나, 신경세포로의 직접교차분화를 위한 전사인자라면, 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "신경세포"는 도파민 신경세포, 가바 신경세포, 글루탐 신경세포, 척수신경 세포, 및 모든 종류의 신경세포를 의미하며, 이러한 신경세포들은 뇌와 척추에 위치하여 중추신경계를 구성한다. 이러한 신경세포는 생체 내에서 기억, 사고, 자세 반사, 운동, 및 보상 관련 거동 등 모든 종류의 뇌 기능을 조절하는 역할을 하는바, 뇌신경 질환 치료에 중요한 역할을 한다.

본 발명에서 사용하는 용어, "직접교차분화 (Direct lineage reprogramming, Direct conversion, Trans differentiation)"는 전혀 다른 세포타입을 가지는 성체 세포간 전환을 유도하는 기술로서, 유도만능줄기세포를 제조하는 단계 없이 바로 목적하는 세포로의 전환을 유도한다는 점에서 종래의 기술과 차이가 있다. 현재 직접 교차분화 기술은 질병 모델링, 신약 발굴, 유전자 치료, 및 재생 의학 분야 등에서 이용 가능성을 인정받고 있으며, 이를 이용한 뇌신경 질환 치료에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있으나, 분화 효율이 높지 않아 실질적인 임상에 적용함에 어려움을 겪고 있다. 또한, 직접교차분화 리프로그래밍을 통한 생체 내 교차분화 적용은 임상적으로 상당한 의미를 가짐에도, 적절한 유도방법의 부재로 인해 상용화에 문제가 있었다. 이에, 본 발명은 전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용함으로써, 생체 내외에서, 성체세포로부터 신경세포로의 직접교차분화 및 신경세포로의 자연분화 효율을 증진시키고자 하였다.

보다 구체적으로, 신경세포로의 직접교차분화 효율을 증진시키고자 금속 나노입자상에 전사인자가 도입된 성체세포를 위치시킨 후, 전자기장을 인가하여 상기 금속 나노 입자에 전자기를 유도하였으며, 동물의 체내인 뇌에 금속 나노입자와 관련 전사인자를 함께 주입한 후, 동물에 직접 전자기장을 인가하였다.

본 발명에서, 상기 전자기가 유도된 금속 나노입자는, 성체세포에서 신경세포로의 직접교차분화를 촉진시키며, 바람직하게 금, 은, 또는 자성 나노입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 전자기장은 바람직하게 5 Gauss 내지 50 Gauss의 강도 및/또는 10Hz 내지 500Hz의 주파수로 인가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 금속 나노 입자에 인가되는 전자기장의 강도 및 파장을 조절함으로써, 신경세포로의 직접교차분화 효율을 증진시킬 수 있으며, 금 나노입자뿐만 아니라 은, 또는 자성 나노입자를 이용한 경우에도 우수한 효과를 얻을 수 있음을 확인하였다 (실시예 1 내지 2 참조). 또한, 동물모델을 이용한 in vivo 실험에서도, 상기와 마찬가지로 신경세포로의 직접교차분화 효율이 증진되었으며, 뇌신경 질환 관련 증상이 확연히 완화됨을 확인하였으며 (실시예 3 내지 4 참조), 본 발명의 방법을 통해 신경세포로의 자연분화 효율 역시 증진되며, 상기 신경세포를 뇌신경 질환 치료에 유용하게 이용할 수 있음을 실험적으로 확인하였다 (실시예 5 내지 6 참조).

이에, 본 발명은 상기 방법으로 분화된 신경세포를 포함하는, 뇌신경 질환 치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 세포치료제의 투여에 의해 뇌신경 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 치료 대상이 되는 질병인 "뇌신경 질환"은 신경 특히 뇌신경과 관련된 여러 가지 질병을 총칭하는 것으로서, 바람직하게 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈 또는 뇌졸중, 척수손상 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 있어서, "세포치료제"는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다.

한편, 본 발명의 다른 양태로서, 상기 세포치료제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌신경 질환의 치료방법을 제공한다.

본 발명에서, "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 전자기장으로 자기화된 금속 나노입자를 이용한 신경세포로의 직접교차분화 유도 효과 확인

본 발명은 전자기장으로 전자기가 유도된 금속 나노입자를 이용하여 성체세포에서 신경세포로의 직접교차분화리프로그래밍 (Direct lineage reprogramming)을 유도하는 기술로서, 그 일례로, 도 1에 나타낸 바와 같이, 전자기장에 의해 전자기가 유도되는, 금 나노 입자로 코팅된 플레이트를 사용하여 전사인자가 전처리된 섬유아세포 (Fibroblast)를 신경세포로 직접교차분화시켰다. 보다 구체적으로, 본 실시예에서는, 외부 전자기장의 강도 및 파장에 따른 신경세포로의 직접교차분화 활성 변화를 확인하고자 하였다.

1-1. 전자기장의 강도에 따른 직접교차분화 효율 변화

전자기장의 강도 변화에 따른 섬유아세포의 직접교차분화 활성을 평가하기 위하여, 상기 금 나노입자로 코팅된 플레이트에 다양한 강도 (10G, 20G, 및 30G)의 전자기장을 인가한 후, 신경 지표 유전자인 TH (Tyrosine hydroxylase), 및 Tuj1 (Class III β-tubulin)의 변화를 면역 염색 및 형광 현미경을 통하여 확인하였다. 또한, Tuj1, MAP1 (Microtubule associated protein 2), Gad67 (Glutamic acid decarboxylase 67), Synnapsin의 발현 정도를 RT-PCR (Realtime PCR)을 통하여 정량적으로 비교하였다. 한편, 대조군으로는 전자기장을 인가하지 않은 군을 이용하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 전자기장을 인가한 군에서, 신경 지표 유전자인 TH 및 Tuj1이 유의적으로 증가하였으며, 이 중에서도 20G의 전자기장을 인가한 군에서 가장 우수한 효과를 확인할 수 있었다 (도 2a 참조). 또한, 상기 결과와 마찬가지로, 전자기장을 인가한 군에서, Tuj1, MAP1, Gad67, 및 Synnapsin 모두 발현량이 증가하였으며, 10G 또는 30G의 전자기장을 인가한 군과 비교하여 볼 때, 20G 전자기장을 인가한 군에서 발현량이 현저하게 증가함을 확인할 수 있었다 (도 2b 참조).

1-2. 전자기장의 파장에 따른 직접교차분화 효율 변화

전자기장의 파장 변화에 따른 섬유아세포의 직접교차분화 활성을 평가하기 위하여, 상기 금 나노입자로 코팅된 플레이트에 다양한 강도 (10G, 20G, 30G, 50G, 100G) 및 파장 (50Hz, 150Hz, 및 250Hz)의 전자기장을 인가한 후, 필드 (Field) 당 TH+ 신경세포 수의 변화를 측정하여 비교하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1-1과 마찬가지로, 전자기장을 인가하지 않은 군에 비해 전자기장을 인가한 군에서, 다수의 TH+ 신경세포가 측정되었다. 특히, 30G 이상의 전자기장을 인가한 군에서는 현격하게 세포의 수가 감소하였으며, 20G의 전자기장을 인가한 군에서, 가장 다수의 TH+ 신경세포가 관찰되었다. 또한, 20G의 전자기장을 인가한 군 중에서도 150Hz 또는 250Hz 파장의 전자기장을 인가한 군에서 다수의 TH+ 신경세포를 관찰할 수 있었다.

실시예 2. 다양한 금속 나노입자를 이용한 신경세포로의 효율적 직접교차분화 유도 효과 확인

상기 실시예 1에서는 금속 나노입자 중 금 나노입자와 전자기장을 이용하여 신경세포로의 직접교차분화를 유도했던 반면, 본 실시예에서는, 다양한 금속 나노입자를 이용한 경우에도 신경세포로의 직접교차분화 효율을 증진시킬 수 있는지를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 금속 나노입자 중에서 은 나노입자와 자성 나노입자를 이용하였으며, 전자기가 유도된 은 또는 자성 나노입자에 의한 신경세포 유전자 마커인 AADC (Aromatic amino acid decarboxylase)의 변화를 RT-PCR을 통하여 정량적으로 비교하였다.

그 결과, 4에 나타낸 바와 같이, 은 또는 자성 나노입자를 이용한 군 모두에서, 전자기가 유도되지 않은 대조군과 비교하여 AADC가 유의적으로 증가하였음을 확인하였는바, 실시예 1의 금 나노입자뿐만 아니라, 은 나노입자(도 4a 참조) 또는 자성 나노입자(도 4b 참조)를 이용한 경우에도 신경세포로의 직접교차분화 효율을 증진시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 동물모델에서의 신경세포로의 직접교차분화 유도 효과 확인

본 실시예에서는, 동물모델을 이용하여 본 발명의 신경세포로의 직접교차분화 유도 효과를 in vivo 상에서 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 도 5에 나타낸 바와 같이, 전사인자인 Ascl1, Nurr1, Pitx3, 및 Lmx1과 금 나노입자를 마우스의 뇌에 주입하고 전자기장을 인가하였으며, 이때, 신경 지표 유전자인 TH, 및 Tuj1의 변화를 면역 염색 및 형광 현미경을 통하여 확인하였다. 대조군으로는 전사인자 및 금 나노입자를 투여하고 전자기장을 인가하지 않은 군 (Auptl)을 이용하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 전자기장을 인가한 군 (EMF)에서, TH 및 Tuj1이 유의적으로 증가하였으며, 이는 본 발명의 방법을 통하여 체내에서도 신경세포로의 직접교차분화를 촉진시킬 수 있음을 의미한다.

실시예 4. 직접교차분화 유도에 따른 뇌신경 질환 치료효과 확인

본 실시예에서는, 상기 실시예 3의 결과를 토대로, 동물모델을 이용하여 본 발명의 뇌질환 치료 효과를 확인하고자 하였다. 보다 구체적으로 6OHDA (6-hydroxydopamine) 또는 MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) 처리에 의한 뇌신경 손상과 그의 회복, 및 뇌졸중 동물 모델에서 뇌신경 증상 완화 효과를 비교하였다.

4-1. 6OHDA (6-hydroxydopamine)에 대한 보호효과

파킨슨병 유발 약물인 6OHDA (6-hydroxydopamine)를 마우스의 뇌에 주입하여 도파민 뉴런을 괴사시켰다. 이후, 금 나노입자 또는 은 나노입자와 같이 전도성을 갖는 나노물질을 마우스의 뇌에 처리하고 전자기장을 인가한 경우, 신경세포의 보호효과를 마우스의 회전수 변화를 통해 확인하였다. 대조군으로는 금속 나노입자 및 전자기장을 전혀 처리하지 않은 군을 이용하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 6OHDA 주입에 의해서 마우스의 회전수가 증가하였던 반면, 상기 마우스에 전사인자 및 금 나노입자 (도 7a 참조) 또는 은 나노입자 (도 7b 참조)를 주입하고 전자기장을 인가한 경우, 신경세포로의 직접교차분화가 유도되어 외부 약물에 의한 마우스의 회전수가 현저하게 감소되었다. 즉, 금 나노입자 또는 은 나노입자와 같은 금속 나노입자는 파킨슨병의 치료를 유도하여, 도파민 신경의 손상으로 인한 마우스의 회전성 행동을 상당히 완화시킴을 확인할 수 있었다.

4-2. MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)에 대한 보호효과

우선, 신경세포 파괴 물질인 MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)를 처리하여 인위적으로 신경세포를 파괴하였다. 이후, 전사인자, 및 금 나노입자를 마우스의 뇌에 처리하고 전자기장을 인가한 경우, 신경세포의 보호효과를 면역 염색법을 통해 확인하였다. 또한, MPTP에 의해 유도된 신경질환 마우스 동물모델을 제작하고, 전사인자, 금 나노입자 및 전자기장 처리에 따른 마우스의 행동의 변화를 원통 테스트, 매달리기 테스트, 또는 움직임 테스트를 통하여 관찰하였다. 대조군으로는 금속 나노입자 및 전자기장을 전혀 처리하지 않은 군 (Cont, No AuEMF)을 이용하였다.

그 결과, 도 8에 나타내 바와 같이, MPTP 처리에 의해 신경 지표 유전자인 Tuj1 및 Map2가 유의적으로 감소된 반면, 상기 마우스에 전사인자, 및 금 나노입자를 주입하고 전자기장을 인가한 경우, 상기 신경 지표 유전자인 Tuj1 및 Map2가 거의 감소되지 않았는바, 유의적인 신경세포 보호효과를 확인할 수 있었다.

또한, 도 9에 나타낸 바와 같이, 원통 테스트, 매달리기 테스트, 또는 움직임 테스트 결과, 금 나노입자를 주입하고 전자기장을 인가한 경우, 신경세포로의 직접교차분화가 유도되어 뇌졸중에 의한 마우스의 비정상적 행동이 상당 부분 개선됨을 확인할 수 있었다.

4-3. 뇌졸중 동물모델에서의 치료효과

뇌졸중 모델을 제조한 후, 상기 전사인자와 금속 나노입자를 뇌졸중 마우스의 뇌에 처리하고 전자기장을 인가한 경우, 뇌졸중으로부터 나타나는 쥐의 행동 변화를 구부림, 굽힘, 및 테이프 자가 떼기 테스트를 통하여 관찰하였다. 대조군으로는 금속 나노입자 및 전자기장을 전혀 처리하지 않은 군 (MPTP)을 이용하였다.

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 뇌졸중에 의해서 쥐의 비정상적 행동이 증가하였던 반면, 상기 마우스에 전사인자, 및 금속 나노입자를 주입하고 전자기장을 인가한 경우, 신경세포로의 직접교차분화가 유도되어 쥐의 비정상적 행동이 감소함을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 전자기장으로 자기화된 금속 나노입자를 이용한 신경세포로의 자연분화 유도효과 확인

상기 실시예 1 내지 4에서는 전자기장으로 자기화된 금속 나노입자를 이용하여 성체세포인 섬유아세포로부터 신경세포로의 직접교차분화리프로그래밍을 유도하였던 반면, 본 실시예에서는, 본 발명을 이용하여 배아줄기세포로부터 신경세포로의 자연분화 유도 효율 역시 증진시킬 수 있는지를 확인하고자 하였다. 보다 구체적으로, 배아줄기세포에 금 나노입자를 처리한 후, 전자기장을 인가한 경우, 신경세포로의 자연분화를 면역염색법을 통해 확인하였으며, 신경 지표 유전자인 Map2, Tuj1, Vmat2, Nestin, TH, DAT, 및 Pitx3의 발현량 변화를 RT-PCR을 통해 확인하였다. 대조군으로는 금속 나노입자 및 전자기장을 전혀 처리하지 않은 군 (Control)을 이용하였다.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 금 나노입자를 처리한 후, 전자기장을 인가한 경우, 신경세포로의 자연분화 효율이 현저하게 증가되었으며(도 11a 참조), 상기 결과와 마찬가지로, 신경 지표 유전자인 Map2, Tuj1, Vmat2, Nestin, TH, DAT, 및 Pitx3의 발현량도 통해 현저하게 증가됨을 확인할 수 있었다. 이는, 본 발명의 방법을 통해 신경세포로의 직접교차분화리프로그래밍뿐만 아니라, 자연분화의 효율도 증진시킬 수 있음을 의미한다.

실시예 6. 자연분화 유도에 따른 뇌신경 질환 치료효과 확인

본 실시예에서는, 상기 실시예 5의 결과를 토대로, 동물모델을 이용하여 본 발명의 뇌질환 치료 효과를 확인하고자 하였다. 보다 구체적으로 MPTP에 의해 유도된 신경질환 마우스 동물모델에 본 발명의 방법을 통해 배아줄기세포로부터 자연분화된 신경세포를 이식하였으며, 이에 따른 마우스의 행동 변화를 원통 테스트와 움직임 테스트를 통하여 관찰하였다. 대조군으로는 신경세포를 이식하지 않은 군 (Control)을 이용하였다.

그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 본 발명의 방법을 통해 배아줄기세포로부터 자연분화된 신경세포를 이식한 경우, NPT 마우스의 비정상적 행동이 상당 부분 개선됨을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 전자기가 유도된 금 나노입자를 이용하는 본 발명을 방법을 통해 자연분화된 신경세포가 뇌신경 질환 치료에 유용하게 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (10)

1. 전사인자가 도입된 성체세포와 접촉시킨 금속 나노입자에 전자기장을 인가하는 단계를 포함하는, 성체세포에서 신경세포로의 직접교차분화방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 전사인자는 Ascl1, Nurr1, Pitx3, 및 Lmx1로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 직접교차분화방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 금 나노입자, 은 나노입자, 및 자성 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 직접교차분화방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 성체세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는, 직접교차분화방법.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 전자기장은 5 Gauss 내지 50 Gauss의 강도로 인가되는 것을 특징으로 하는, 직접교차분화방법.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 전자기장은 10Hz 내지 500Hz의 주파수로 인가되는 것을 특징으로 하는, 직접교차분화방법.
   
7. 배아줄기세포 또는 역분화줄기세포와 접촉시킨 금속 나노입자에 전자기장을 인가하는 단계를 포함하는, 신경세포로의 자연분화방법.
   
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 분화된 신경세포를 포함하는, 뇌신경 질환 치료용 약학적 조성물.
   
9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 분화된 신경세포를 포함하는, 뇌신경 질환 치료용 세포치료제.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 뇌신경 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈 및 척수신경손상 질환군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 세포치료제.

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