JP4563782B2 - 培養装置 - Google Patents

Description

本発明は、細胞を培養する培養装置に関する。

従来の自動式の細胞培養の例が、特許文献１に記載されている。この公報に記載の細胞培養装置においては、培地を自動的に交換するために、自動培地交換装置がインキュベータと培地交換ロボットと管理コンピュータとを備えている。管理コンピュータは、細胞を培養する培養トレイをインキュベータの中から搬送ロボット等により外部へ取り出し、培養トレイ内の液体培地をニードルで排出して新たな液体培地をニードルで注入し、培養トレイをインキュベータに入庫している。

細胞培養において、培養容器の汚染を低減し、細胞の効率的な培養を簡易な構成で達成するための培養容器の例が、特許文献２に記載されている。この公報に記載の培養容器は、内部を滅菌処理され、その一部に膜を備える容器本体と、この容器本体内部に連通し、先端が閉鎖された熱溶着可能な材質からなる少なくとも１本のチューブとを備えている。

特開２００２-２６２８５６号公報

特開２００４-１２９５６８号公報

細胞を培養する際の最も重要な課題は、塵埃や細菌、ウィルス等から培養細胞が汚染されるのを防止することである。汚染を防止するためには、細胞の播種や培地交換等の一連の細胞培養における処理を無菌状態で行い、汚染物が入らないように配慮する必要がある。現在、細胞の培養や加工の際には、ＧＭＰ（ＧＯＯＤ ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ ＰＲＡＣＴＩＣＥ）等で規定された手法を用い、減菌された各施設からなる大規模な培養施設のセルプロセッシングセンター内で熟練した技術者が作業している。このような汚染管理においては、産業化を目指して生産性を向上させることやコストを低下させることが困難である。

この不具合を解消するために、自動化技術を用いて熟練した技術者と同等レベルの作業が可能で品質が保持される、特許文献１に示すような自動培養装置が提案されている。この公報に記載の装置では、細胞播種や培地交換をロボットアームのような駆動装置を用いて実施するので、アームの稼動範囲を考慮したクリーンな空間や制御系を必要とし、装置全体が非常に大規模になる。

また、培養ディッシュ等の現行の培養器具は、外空間に対して開放系であるから、播種装置周辺の空間の雑菌を減らさないと安全性が確保できず、セルプロセッシングセンターのような建屋全体を減菌した施設等でないと自動培養装置を設置できず、培養細胞から小さな組織を作成するのに大きな減菌システムが必要である。

このような不具合を解消するためには、特許文献２に記載のように、培養空間を閉鎖系にして外部とのつながりを排除すれば、汚染を防止できる。この公報に記載の培養容器を用いれば、確かに装置の小型化が可能であるが、完全な閉鎖系にすると外空間との物質の移動が困難になる。

本発明は上記従来技術の不具合に鑑みなされたものであり、その目的は、細胞培養において外部からの汚染を防止しながら、細胞の播種と培地の交換を簡単に行うことにある。

上記目的を達成する本発明の特徴は、細胞を培養する培養空間が形成された培養容器部材とこの培養容器部材の培養空間の上部に配置された第１の弾性シールとを有する培養容器と、この培養容器に培地等の溶液を供給する供給手段が設けられた継ぎ手部材とこの継ぎ手部材に接着された第２の弾性シールとを有する継ぎ手とを備え、継ぎ手に形成した吸引手段を用いて培養容器を継ぎ手に着脱可能としたものである。

そしてこの特徴において、吸引手段は、第２の弾性シールに取り付けた吸引パッドと、この吸引パッドに連通し吸引力を作動させるポンプとを有するのがよく、第１の弾性シールは複数箇所に切り込みを有し、この切込みを弁として使用するのがよい。また、第２の弾性シールでは切込みに対応した位置に孔が形成されており、この孔の周囲にリング状の所定厚さの段差部を形成し、第２の弾性シール部材を貫通して第１の弾性シールを押し込んで、培養空間に溶液を供給可能にするチューブを継ぎ手部材に取り付けるのがよい。

上記目的を達成する本発明の他の特徴は、上面に第１の弾性シールを接着し培養空間が形成された培養容器と、この培養容器に培地等の溶液を供給する供給部が形成され、下面に微細突起を有する第２の弾性シール部材を接着した継ぎ手とを備え、第１の弾性シールは溶液を供給または排出するための弁を有し、第２の弾性シールは弁に対応した位置に漏れを防止する微細突起が形成されており、培養容器と継ぎ手とを第１の弾性シールと第２の弾性シール間で吸引して一体化した播種装置を形成したものである。

そしてこの特徴において、第２の弾性シールに吸着手段を設け、この吸着手段に吸引ポンプをチューブを介して接続し、吸引ポンプの動作により第１の弾性シールと第２の弾性シール間で培養容器と継ぎ手とを着脱させるのがよく、弁と微細突起の表面に、撥水処理を施こすことが好ましい。また、播種装置を載置するベースを有し、このベースには培養容器の幅に対応した位置に突起が形成されており、培養容器の側部にこの突起が係止する溝を設け、培養時にこの溝に突起を係止して播種装置を保持可能にすることが望ましい。

上記特徴においてまた、継ぎ手の側面にアームを設け、このアームの先端部を回転軸に接続し、培養空間に培地等の溶液を注入または培養空間から溶液を排出するときには、吸着手段により一体化された播種装置を水平方向から傾けるように回転軸が動作するのがよく、弁を培養空間の外方に対応する位置に複数設け、溶液交換時には下方に位置する弁部から溶液を供給し、上方に位置する弁部から溶液を排出することを可能とすることが好ましい。

本発明によれば、播種装置に着脱自在な継ぎ手を設け、この継ぎ手を樹脂によりシールしたので、外部からの汚染を防止しながら容易に培地交換や細胞の播種が可能になる。さらに、装着した継ぎ手と播種装置を垂直方向に傾けた状態で、下から培養溶液に注液するので培養空間に確実に注液できる。その際、培養空間に混入した気泡が抜けるという効果もある。

以下、発明に係る培養装置の一実施例を、図面を用いて説明する。図６に、培養装置１１０を上面図で示す。培養装置１１０は、滅菌された培養装置１１０内に培養容器６０を投入するための培養容器投入口部１１２と、培養容器６０内で細胞培養するための培養室１１３とを有している。培養装置１１０内部にほぼ平行に配置された１対の継ぎ手保持位置決め部１１１の一方を前後方向１１１ａ、１１ｂに移動させて、培養容器投入口部１１２から培養装置１１０内に投入された培養容器６０を培養室１１３に運ぶ。

培養室１１３には裏面に駆動系を有するターンテーブル９６が配置されており、ターンテーブル９６上には複数個のベース９５が周方向に間隔をおいて配置されている。培養の開始時に細胞を培養容器６０に投入するときは、他方の継ぎ手保持位置決め部１１１が前後方向１１１ａ、１１１ｂに移動し、培養装置１１０が有する細胞投入部１１４から投入された細胞懸濁液を培養容器６０に注液する。注液された培養容器６０は、培養室１１３に戻され、培養が進行する。培地交換の際には、培地供給部１１５から供給され培地を、継ぎ手保持位置決め部１１１に保持された培養容器に６０に注液する。培地供給部１１５は、滅菌されたドラフト１１６外に置かれている。培養が終了したら、培養容器投入口部１１２または別に設けた培養容器取り出し部に、継ぎ手保持位置決め部１１１が培養容器を戻す。

細胞の播種や培地の交換の様子を、図１ないし図５を用いて説明する。図１は、培養容器６０と継ぎ手５０を一体化した播種装置７０をターンテーブル９６上に取り付ける様子を示した斜視図である。図２は、図１に示した播種装置７０の分解斜視図である。図３は、播種装置７０の部分詳細断面図である。播種装置７０は、中央部に培養空間４２ｂが形成された容器部材４０を有する培養容器６０と、培養容器６０の上部に配置され、培養液を培養空間４２ｂに導入および培養空間４２ｂから排出するための継ぎ手５０とを備えている。

容器部材４０は厚みの薄い直方体状をしており、中央部に円形の中空部である培養空間４１ｂが形成されている。容器部材４０の底面には、膜４２ａが接着等で取り付けられている。容器部材４０の円形空間部の周りには、４個の止まり穴４１が形成されている。止まり穴４１の底部近傍には、培養空間４２ｂとこの止まり穴４１を連通する流路４３が形成されている。

容器部材４０に形成した止まり穴４１に対応する位置に弁３１が形成された矩形状の第１の弾性シール３０を、容器部材４０の上面に接着等により保持する。第１の弾性シールは、シリコーン樹脂のような粘弾性部材で作られており、弁３１はこの粘弾性部材に形成した十字型の切り込みである。容器部材４０と第１の弾性シール３０は、培養容器６０を形成する。

継ぎ手５０は、培養容器６０の上面に配置される矩形状の第２の弾性シール２０と、この第２の弾性シール２０が接着等で固定され厚みの薄い直方体状に形成された継ぎ手部材１０とを有している。第２の弾性シール２０は、シリコーン樹脂のような粘弾性部材で作られている。第２の弾性シール２０は、容器部材４０に形成した止まり穴４１に対応する位置であって第１の弾性シール３０に対向する位置に、リング状の微細突起２１が形成されている。第２の弾性シール２０の角部には、詳細を後述する吸引パッド用の孔２２が形成されている。

継ぎ手部材１０は、厚みの薄い直方体状に形成されており、４角部であって底面には、第２の弾性シール２０に形成した吸引パッド用の孔２２に対応する位置に、ラッパ形状の吸着パッド１５が取り付けられている。継ぎ手部材１０の底面には、容器部材４０の止まり穴４１に嵌合するチューブ１３を取り付ける貫通孔が形成されている。図３に示すように、この孔は段付き孔であり、上部の孔は、嵌合するコネクタ１１を取り付けるために、ねじ孔になっている。

コネクタ１１には、細胞懸濁液や培地、薬品を供給可能なチューブ１２が着脱自在に接続される。継ぎ手部材１０には、吸着パッド１５の背面側に連通する孔も形成されており、この孔には吸引用チューブ１４が嵌合されている。さらに、継ぎ手部材１０の一方の側面には、アーム８０が取り付けられている。

継ぎ手５０と培養容器６０とは、吸引用チューブ１４から吸引して一体化され、播種装置７０を構成する。一体化された播種装置７０は、ベース９５に形成した突起９１と培養容器６０の下部の周囲部に形成した溝９０とを係合することにより、ベース９５に固定される。

このように構成した播種装置７０を用いた培養方法を、以下に説明する。初めに図３を用いて、培養容器６０を継ぎ手５０に吸着させるときの様子を説明する。培養容器部材４０にはチューブ１３用の孔４１が形成されているから、培養容器部材４０を開放したままハンドリングすると、外からの菌等により汚染されるおそれがある。また、孔４１からの液漏れにより、環境を汚染するおそれもある。また、新しいチューブ１３を培地交換の度に容器部材４０に形成した孔４１に挿入して汚染を防いでいるが、その結果、チューブ１３の交換頻度が高くなる。したがって、交換頻度が高くなっても、チューブ１３と孔４１間が確実にシールされるとともに、チューブ１３を取り外しても孔４１からの漏れが生じないように、孔４１を自動的に閉じる必要がある。そこで、培養容器６０内が汚染されるのを防止するために、次のようなシールを用いている。

すなわち、培養容器６０と継ぎ手５０の着脱時における密着性と液漏れ防止性を向上させるために、第２の弾性シール２０を継ぎ手部材１０の底面側に、第１の弾性シール３０を培養容器部材４０の上面側にそれぞれ接着する。そして、第２の弾性シール２０に第１の弾性シール３０を吸引ポンプを用いて密着させた。第２の弾性シール２０と第１の弾性シール３０の密着性を向上させるために、これらの弾性シール２０、３０に、粘弾性部材を使用した。

孔４１からの菌等の混入や液漏れを防止するとともに、チューブ１３が孔４１に挿入されていないときには、孔４１を自動的に閉じるフタの代わりに、第１の弾性シール３０にスリット３１ａからなる弁３１を形成している。チューブ１３挿入時にスリット３１ａ部から下方に押し出されていたシール片３１ｂが、チューブ１３が孔４１に挿入されていないときは弾性力により復元して、弁３１は閉じた状態を維持する。その結果、液漏れが防止される。

培養のために、チューブ１３をスリットに挿入すると、シール片３１ｂが下方に押し広げられ、弁３１は開かれる。弁３１を構成するシール片３１ｂは弾性力により、チューブ１３に密着するので、液の漏れや逆流が防止される。なお、弁３１には液漏れと汚染防止のために、撥水処理を施している。

一方、第２の弾性シール２０のチューブ１３用の孔の周辺に、環状の微細突起２１を設けて、第１の弾性シール３０と第２の弾性シール２０との吸着に用いる。継ぎ手５０と培養容器６０とを吸着させるときには、図４に詳細を示す吸着パッド１５を用いて、真空吸引する。吸着パッド１５は、吸引チューブ１４を介して図示しない吸引ポンプに接続されている。吸引の際には、微細突起２１を培養容器６０に押し付けて、孔４１周辺に形成したシール部の密着性を高めている。

第２の弾性シール２０に微細突起２１を形成したので第１の弾性シール３０と第２の弾性シール２０との接触面積が低減し、接触部の面圧が増大する。これに対して、微細突起２１がないと、第１の弾性シール３０と第２の弾性シール２０との面圧が低下し、チューブ１３周辺におけるシール性が低下する。

また、微細突起２１を設けたので、培養容器６０を継ぎ手５０から外すのが容易になる。第１、第２の弾性シール３０、２０は、ともに粘弾性部材であるから密着性がよい。そこで、環状の微細突起２１であるシール部以外の部分が、不用意に培養容器６０に密着するのを微細突起２１の段差が防止する。この微細突起２１の形成により、継ぎ手５０と培養容器６０間の液漏れが防止されるとともに、継ぎ手５０を外した時に液がチューブ１３近傍に残って周囲を汚染するのが防止される。さらに、微細突起２１に撥水処理を施しているので、微細突起２１に培地が付着することはない。

次に、図４および図５、図７を用いて、培養容器６０に細胞懸濁液や培地を注液する方法を説明する。図４は、播種装置７０の正面図である。水平に置かれた培養容器６０の上方に継ぎ手５０を配置する。継ぎ手５０の側部に、アーム８０が取り付けられており、アーム８０の端部は回転軸８１に接続されている。回転軸８１は、上方向７０ａおよび下方向７０ｂに移動可能である。

継ぎ手５０を位置決めするときは、培養容器６０に形成した孔４１に継ぎ手５０に取り付けたチューブ１３を合わせる。図３に示すように、継ぎ手５０に固定したチューブ１３が、シール片３１ｂを下方に押出して、培養容器６０に形成した孔４１にチューブ１３が挿入される。培養容器６０に継ぎ手５０が載ったら、図示しない吸引ポンプを作動させ、吸引用チューブ１４が接続された吸引パッド１５が培養容器６０を吸引して継ぎ手５０に密着する。これにより第２の樹脂シール２０と第１の樹脂シール３０が密着する。

継ぎ手５０と培養容器６０が密着して一体型の播種装置７０が形成されたら、回転軸８１を用いて、一体型の播種装置７０を傾斜させる。図５に、播種装置７０の正面図を示す。回転軸８１を時計周り８１ａに９０度回転させる。密着した培養容器６０と継ぎ手５０を水平方向から垂直方向に回転７０ｃさせる。

この状態で、培養空間４２ｂに下方向に位置するチューブ１２から、培地や細胞懸濁液を注液１２ｂする。一方、上方向に位置するチューブ１２から、播種装置６０内の廃液や気体を排出１２ａする。注液する培地は、別の場所に冷蔵保管したものを用い、使用直前に適温に温めて新鮮な培地として図示しないポンプで培養空間４２ｂに供給する。播種装置６０を垂直方向に立てて、注液および排液作業するので、培養空間４２ｂに混入した気泡を抜くことができる。

所定の液を注液し終えたら、回転軸８１を反時計周り８１ｂに回転させる。一体化した播種装置７０を、垂直方向から水平方向７０ｄに戻す。上下方向に移動可能な回転軸８１を操作して、図１に示したベース９５に播種装置６０をセッテングする。播種装置６０の側面には、溝９０に係合する突起９１が形成されているので、播種装置７０を予め定められた係止前の位置に位置決めする。その後、水平方向９２ａに播種装置７０を移動させて突起９１を溝９０に係止する。

吸着パッド１５からの吸引を停止するために、吸引ポンプを止める。その後、吸着パッド１５に圧力空気を供給する。圧力空気が送風されると、培養容器６０と継ぎ手５０間の吸引力の代わりに反発力が発生し、培養容器６０と継ぎ手５０間の密着力が失われる。培養容器６０と継ぎ手５０間の密着力が失われたので、上下方向７０ａ、７０ｂに移動可能な回転軸８０を、上方向７０ａに操作して、播種装置６０と継ぎ手５０を離す。

培養容器６０を持ち上げる７０ａときは、回転軸８０を下方向７０ｂに操作し、継ぎ手５０と培養容器６０を吸着して密着させる。その後、図１に示すように突起９１と溝９０の係合を外す方向９２ｂに、播種装置７０を移動させる。溝９０と突起９１との係合が外れたら、播種装置７０を上方向７０ａに移動して、注液する。この一連の作業手順により、培養容器６０に細胞懸濁液や培地を入れるときであっても、培養空間４２ｂを限りなく閉鎖系の状況に保つことができる。これにより、培養空間４２ｂ等からの漏れや汚染が防止される。

図７に、この一連の動作で使用する継ぎ手保持位置決め部１１１を、斜視図で示す。前後方向１１１ａ、１１１ｂにスタンド１２０が移動可能なように、移動方向に沿ってレール１２１が取り付けられている。スタンド１２０は基部でレール１２１に嵌合している。スタンド１２０の上下方向に延びる軸１２２には、上下方向７０ａ、７０ｂに移動可能なギア軸１２３が取り付けられている。ギア軸１２３にはラック１２４が噛み合っており、ギア軸１２３を回転させると、ラック１２４が左右方向９２ａ、９２ｂに進退する。ラック１２４の先端には、回転軸８１が水平方向であってレールと同じ向きに取り付けられている。回転軸８１には、播種装置７０のアーム８０が取り付け可能になっている。回転軸８１を回転させると、播種装置７０は前後方向１１１ａ、１１１ｂに延びる回転軸８１周りに回転８１ａ、８１ｂする。

本発明に係る播種装置の一実施例の斜視図である。 図１に示した播種装置の分解斜視図である。 図１に示した播種装置の部分詳細断面図である。 図１に示した播種装置の正面図であり、培養容器を取り外す状態を示す図である。 図１に示した播種装置を傾けたときの正面図である。 本発明に係る培養装置の一実施例の上面図である。 図６に示した培養装置に用いる継ぎ手保持位置決め部の斜視図である。

符号の説明

１０…継ぎ手部材、１２…チューブ、１２a…排気、廃液、１２b…注液、１３…チューブ、１４…吸引用チューブ、１５…吸着パッド、２０…第２の弾性シール、２１…微細突起、２２…吸引パット用孔、３０…第１の弾性シール、３１…弁、４０…培養容器部材、４１…孔、４２ａ…ガス透過膜、４２ｂ…培養空間、４３…流路、５０…継ぎ手、６０…培養容器、７０…播種装置、７０ａ…継ぎ手移動上方向、７０ｂ…継ぎ手移動下方向、７０ｃ…右回転方向、７０ｄ…左回転方向、８０…アーム、８１…回転軸、８１ａ…右回転方向、８１ｂ…左回転方向、９０…溝、９１…突起、９２ａ…水平移動方向（非固定）、９２ｂ…水平移動方向（固定）、９５…ベース、９６…ターンテーブル、１１０…培養装置、１１１…継ぎ手保持位置決め部、１１１a…移動方向（前）、１１１b…移動方向（後）、１１２…培養容器投入口部、１１３…培養室、１１４…細胞投入部、１１５…培地供給部。

Claims (4)

1. 細胞を培養する培養空間が形成された培養容器部材とこの培養容器部材の培養空間の上
   部に配置された第１の弾性シールとを有する培養容器と、この培養容器に培地等の溶液を
   供給する供給手段が設けられた継ぎ手部材とこの継ぎ手部材に接着された第２の弾性シー
   ルとを有する継ぎ手とを備え、前記継ぎ手に形成した吸引手段を用いて前記培養容器を前
   記継ぎ手に着脱可能としたことを特徴とする培養装置。
2. 前記吸引手段は、前記第２の弾性シールに取り付けた吸引部材と、この吸引部材に連通
   し吸引力を作動させるポンプとを有することを特徴とする請求項１に記載の培養装置。
3. 上面に第１の弾性シールを接着し培養空間が形成された培養容器と、この培養容器に培
   地等の溶液を供給する供給部が形成され、下面に微細突起を有する第２の弾性シール部材
   を接着した継ぎ手とを備え、前記第１の弾性シールは溶液を供給または排出するための弁
   を有し、前記第２の弾性シールは前記弁に対応した位置に漏れを防止する微細突起が形成
   されており、前記培養容器と前記継ぎ手とを吸引して、第１の弾性シールと第２の弾性シ
   ールを密着させて一体化した播種装置を形成したことを特徴とする培養装置。
4. 前記弁と前記微細突起の表面に、撥水処理を施したことを特徴とする請求項３に記載の
   培養装置。

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