ES2598055T3 - Dispositivo para la expansión aséptica de células - Google Patents

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ES2598055T3 ES12780267.6T ES12780267T ES2598055T3 ES 2598055 T3 ES2598055 T3 ES 2598055T3 ES 12780267 T ES12780267 T ES 12780267T ES 2598055 T3 ES2598055 T3 ES 2598055T3
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Gavin HOLMS
Katy Rebecca NEWTON
Tina Lesley CROMBIE
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Abstract

Un sistema cerrado adecuado para cultivar asépticamente células terapéuticas, que comprende: i) un recipiente que comprende: una porción permeable a los gases adecuada para soportar el crecimiento celular y permitir el suministro de gases a las células durante el cultivo, y al menos una pared adyacente a una base, en donde dicho recipiente define un volumen interno para contener un volumen de medio requerido para soportar un cultivo celular, ii) un respiradero que comprende una conducción que define un orificio interior y un orificio exterior, distantes entre sí, en comunicación fluida uno con otro, que permite equilibrar la presión durante el llenado del recipiente, permitiendo que salgan los gases y durante el proceso de vaciado de las células permitiendo que los gases entren en el volumen interior, en donde la conducción se extiende desde el exterior del sistema cerrado por un elemento estructural del recipiente y se extiende en el volumen interno del recipiente y termina en él con el orificio interior, y en donde el orificio interior está dispuesto para no estar en contacto con el medio en el recipiente o en donde el orificio interior está cubierto con una membrana impermeable a los líquidos o una válvula antirretorno de líquidos, de manera que se minimice la exposición del orificio interno al líquido y, por tanto, el orificio interior no sea susceptible de ser obstruido por el líquido durante el llenado y vaciado del medio líquido, y en donde el orificio exterior puede estar unido a un filtro estéril, iii) un conducto o conductos para la introducción aséptica de fluidos y células en el recipiente, un conducto o conductos para que salgan los fluidos del sistema sin exponer el sistema al medio ambiente externo lo que permite que las células que han crecido en él salgan del sistema por gravedad cuando el sistema se orienta de forma que las células se encuentren en comunicación fluida con el conducto de salida.

Description

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DESCRIPCION
Dispositivo para la expansion aseptica de celulas
La presente descripcion se refiere a un sistema optimizado para cultivar asepticamente celulas para aplicaciones terapeuticas a una escala comercialmente viable, a metodos para fabricar dichos sistemas y a metodos para utilizar los sistemas para la preparacion de celulas terapeuticas.
El documento WO 2005/035728 describe un sistema con una porcion permeable a los gases para cultivar celulas. Este dispositivo esta disponible en Wilson Wolf con la marca G-Rex Technology (por favor consulte el sitio web
www.wilsonwolf.com/page/show/67596). La principal ventaja del sistema es que permite que sean proporcionados nutrientes y gases para que crezcan las celulas de modo que las celulas puedan crecer continuamente durante penodos de hasta 14 dfas sin ninguna intervencion adicional, en particular: la membrana permeable a los gases permite el intercambio de CO2 y O2 y la disposicion permite que sean empleados grandes volumenes de medio, que proporcionan todos los nutrientes necesarios para el crecimiento. La disposicion se muestra en la Figura 1.
La principal limitacion de la tecnologfa G-Rex es que es un sistema de fabricacion abierto que no permite la inoculacion y recoleccion de celulas ni la adicion de nutrientes sin exposicion al medio ambiente externo. Puesto que las celulas terapeuticas no se pueden esterilizar despues de su produccion, su fabricacion tiene que realizarse en condiciones asepticas. De este modo las etapas de procesamiento "abierto" durante las cuales el producto esta expuesto al medio ambiente externo se tienen que realizar bajo una campana de flujo laminar de aire que se haga funcionar en una sala blanca clasificada clase B de acuerdo con la clasificacion de UE-GMP (US Fed. Std. 209e class 100,000, ISO 14644-1 class ISO7) para evitar la contaminacion del producto con microbios y partfculas. Las instalaciones con este tipo de tecnologfa de sala blanca, para un procesamiento abierto, son caras de construir, operar, mantener y controlar.
Igualmente importante es el hecho de que las etapas de la operacion abierta requieren que sea manipulado un solo producto a la vez en el mismo espacio de la sala blanca para minimizar el riesgo de contaminacion cruzada, por tanto, el rendimiento del producto es limitado y este sistema de fabricacion requiere que trabajen en paralelo multiples salas blancas y equipos de produccion para alcanzar altos volumenes de salida de la produccion. Para las empresas pequenas y medianas, asf como para los hospitales, la inversion de capital y los costes laborales son muy importantes sobre la base de unidad de produccion.
Para resolver este problema los autores de la presente invencion han proporcionado un sistema modificado para el cultivo de celulas que permite la preparacion aseptica de celulas para uso en terapia, sin necesidad de un medio ambiente de sala blanca porque no se requieren etapas de procesamiento abierto.
Sumario de la invencion
Por tanto, la presente invencion proporciona un sistema cerrado adecuado para cultivar asepticamente celulas terapeuticas que comprende:
i) un recipiente que comprende:
una porcion permeable a los gases adecuada para mantener el crecimiento celular y permitir el suministro de gases a las celulas durante el cultivo, y
al menos una pared adyacente a una base, en donde dicho recipiente define un volumen interno y estando adaptado dicho recipiente para contener un volumen de medio requerido para mantener las celulas durante el cultivo,
ii) un respiradero que comprende una conduccion que define un orificio interior y un orificio exterior, distantes entre sf, en comunicacion fluida uno con el otro, que permite equilibrar la presion durante el llenado del recipiente permitiendo que salgan los gases y durante el proceso de vaciado de las celulas permitiendo que entren los gases en el volumen interior, en donde la conduccion se extiende desde el exterior del sistema cerrado a traves de un elemento estructural del sistema, y se extiende en el volumen interno del recipiente y termina dentro con el orificio interior, y en donde el orificio interior esta dispuesto para evitar el contacto con el medio del recipiente o en donde el orificio interior esta cubierto con una membrana impermeable a los lfquidos o una valvula antirretorno de lfquidos, de manera que se minimice la exposicion del orificio interior al lfquido y, por tanto, el orificio interior no sea susceptible de ser obstruido por el lfquido durante el llenado y vaciado del medio lfquido, y en donde el orificio exterior puede estar unido a un filtro esteril,
iii) un conducto o conductos para la introduccion aseptica de fluido y celulas en el recipiente,
un conducto o conductos para que salga el fluido del sistema sin exponer el sistema al medio ambiente externo, lo que permite que las celulas que han crecido en el salgan del sistema por gravedad cuando el sistema se orienta de forma que las celulas se pongan en comunicacion fluida con el conducto de salida.
El sistema de acuerdo con la presente invencion tiene ventajas significativas para la preparacion comercial de
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celulas para uso en terapia. En particular, es flexible y adaptable, requiere baja inversion de capital en el espacio de preparacion y es robusto y de facil fabricacion. Tambien elimina las etapas de procesamiento abierto y por tanto reduce aun mas el riesgo de contaminacion del producto con agentes patogenos y partfculas. Ademas, se cree que el presente sistema satisface una necesidad no satisfecha actualmente y representa un verdadero avance en la reduccion de la necesidad de instalaciones de salas blancas costosas para la preparacion de celulas terapeuticas.
Ventajosamente, la presente invencion permite la transformacion de tecnolog^a de sistemas abiertos existentes, tal como el sistema G-Rex, para proporcionar un sistema cerrado que permita la inoculacion y recoleccion de celulas y el suministro de nutrientes sin exposicion al medio ambiente externo.
Alternativamente, un sistema disenado a la medida de acuerdo con la presente descripcion puede ser fabricado espedficamente para cultivar celulas terapeuticas, por ejemplo, un sistema mostrado en la Figura 7 u 8.
La presente descripcion se extiende tambien a metodos para fabricar los sistemas descritos en la presente memoria y tambien al uso de los sistemas para cultivar celulas.
Breve descripcion de las figuras
Figura 1 Figura 2 Figura 3
Figure 4 Figura 5 Figura 6
Figura 7 Figura 8
Figura 9
Figura 10 Figura 11 Figura 12
muestra una representacion esquematica del sistema G-Rex disponible comercialmente para el cultivo de celulas comercializado por Wilson Wolf.
es una representacion esquematica de un recipiente que comprende una tapa con un respiradero y un conducto situado junto a el.
es una representacion esquematica de un recipiente de una sola pieza de acuerdo con la presente descripcion que comprende un respiradero y un conducto situado junto a el en una pared de la unidad.
es una representacion esquematica de un recipiente de una sola pieza de acuerdo con la presente descripcion que comprende un respiradero y un conducto situados opuestos entre sf.
es una representacion esquematica de un recipiente de una sola pieza de la presente descripcion en donde el respiradero y el conducto estan dispuestos perpendiculares uno respecto al otro.
es una representacion esquematica de un recipiente que comprende una tapa con un respiradero y un conducto situado junto a el, en donde el respiradero se extiende hacia abajo en el medio hacia la capa permeable a los gases. El orificio interior esta cubierto por una membrana impermeable a los lfquidos, tal como una membrana permeable a los gases que evita que el medio entre por el respiradero.
es una representacion esquematica de un recipiente de una sola pieza en forma de campana de acuerdo con la presente descripcion que comprende un respiradero y un conducto situado junto a el en una pared de la unidad.
es una representacion esquematica de un recipiente de una sola pieza en forma de campana de acuerdo con la presente descripcion que comprende un respiradero y un conducto situado junto a el en una pared de la unidad y orientado para permitir el acceso del medio y las celulas al conducto de salida.
es una representacion esquematica de como un sistema de acuerdo con la descripcion se puede llenar y recolectar.
es una representacion esquematica de un sistema de acuerdo con la presente descripcion. son dibujos detallados de un sistema como el mostrado en la Figura 10.
es una representacion esquematica de como se orienta el sistema para recolectar las celulas cultivadas en el.
Descripcion detallada de la invencion
Un sistema cerrado como se emplea en la presente memoria permite la entrada y salida de materiales, incluyendo lfquidos, celulas y gases, sin exposicion al medio ambiente externo.
Un sistema cerrado de acuerdo con la presente descripcion se puede emplear sin embargo como un sistema abierto si el usuario final decide no seguir los protocolos apropiados cuando introduce o extrae material del sistema. Sin embargo, los sistemas descritos en la presente memoria estan dispuestos y adaptados para ser adecuados para uso como un sistema cerrado.
El cultivo de celulas como se emplea en la presente memoria se pretende que se refiera al crecimiento y/o
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diferenciacion de celulas in vitro.
El crecimiento de celulas como se emplea en la presente memoria se refiere a aumentar el numero de celulas diana en una poblacion de celulas.
El documento WO 2005/035728, incorporado en la presente memoria como referencia, describe como preparar un recipiente permeable a los gases. En una realizacion se emplea material de silicona permeable a los gases.
En una realizacion la base soporta el material permeable a los gases.
En una realizacion, la base consiste sustancialmente en material permeable a los gases, es decir, la capa de material permeable a los gases y la base son de hecho la misma entidad.
En una realizacion, la capa permeable a los gases esta situada en una pared u otro elemento de la estructura del recipiente.
En una realizacion, sustancialmente todo el recipiente esta fabricado de un material permeable a los gases, por ejemplo, con una resistencia estructural suficiente para retener el contenido durante el cultivo.
En una realizacion, la membrana permeable a los gases tiene un area superficial de, por ejemplo 5 a 200 cm2, tal como 5 a 100 cm2, en particular 10, 30 o 50 cm2, tal como 10 cm2.
Una base como se emplea en la presente memoria es un elemento estructural del recipiente.
Cuando las celulas estan en el proceso de ser cultivadas, generalmente los sistemas se orientaran (o se colocaran en posicion vertical) sobre la base, por ejemplo, si la base es plana o sustancialmente plana. Incluso si el sistema no esta en posicion vertical sobre la base, para permitir que circule el aire, entonces durante el cultivo la base puede representar la parte inferior del sistema.
En general, durante el proceso de cultivo las celulas tienden a sedimentarse y ser soportadas por la superficie interna de la capa permeable a los gases, por ejemplo en un plano que es paralelo al plano de la base.
La base en el contexto de la presente descripcion, se puede entender por ejemplo por referencia a los dispositivos mostrados en las Figuras 5 a 8, que muestra la base (1). Evidentemente, la capa permeable a los gases en la base debe tener acceso a los gases del medio ambiente para que funcione el sistema. Por tanto, la base puede estar elevada por encima de la superficie sobre la que esta dispuesto verticalmente o colocado el sistema, para garantizar el acceso al medio ambiente gaseoso externo.
El termino “adyacente a el” como se emplea en la presente memoria se pretende que se refiera al hecho de que un elemento esta unido a otro.
El recipiente empleado sera generalmente ngido o sustancialmente ngido o elasticamente deformable pero no permanentemente deformable. Sin embargo, el recipiente puede comprender porciones de materiales flexibles o deformables. Estos materiales flexibles pueden incluir el tipo de materiales empleados en la fabricacion de bolsas para infusion.
En una realizacion, el recipiente y sustancialmente todos sus elementos estructurales son ngidos.
Los recipientes y sistemas de la presente invencion se pueden proporcionar en una amplia gama de formas y tamanos, por ejemplo en forma de cubo, caja, cilindro, cono o piramide. Sin embargo, generalmente al menos una zona o lado de la forma estara adaptada para acomodar los respiraderos, conducto o conductos y/u otros elementos del sistema. Se pueden utilizar formas puras, pero generalmente no se emplearan debido a que la forma se adaptara generalmente para proporcionar un recipiente hecho a la medida para el fin deseado. Por ejemplo, una forma de cono se puede adaptar para proporcionar una forma troncoconica que comprenda una base y una pared curvada y una pared superior o tapa. La pared superior o tapa se puede acomodar al conducto o conductos y/o respiraderos.
En una realizacion, el recipiente esta asociado o comprende una tapa resellable, donde el recipiente y la tapa forman juntos el sistema cerrado. Una tapa resellable se puede ilustrar con referencia a la Figura 1, que muestra un dispositivo que comprende una tapa de rosca, que es un tipo de tapa resellable.
En una realizacion, la union de la tapa al recipiente es enroscando la tapa en la rosca grabada en el recipiente permitiendo asf que se cree un cierre hermetico que protege el contenido del interior de la contaminacion de microbios y partfculas del medio ambiente externo.
En una realizacion, se puede proporcionar un sistema de acuerdo con la presente descripcion modificando un sistema existente, por ejemplo se puede modificar la unidad G-Rex incorporando un respiradero y uno o dos conductos, a los cuales se pueden conectar asepticamente otros componentes del sistema de fabricacion. En una realizacion, el respiradero y el conducto o conductos estan incorporados en la tapa de un sistema G-Rex. Esto proporciona una forma rentable de producir un sistema cerrado para cultivar celulas terapeuticas, que puede trabajar
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fuera de una cabina de flujo laminar de aire en una sala blanca clasificada de acuerdo con la clase D de la EU-GMP (US Fed. Std. 209e class 100,000, ISO 14644-1 class ISO8) ya que el producto nunca esta expuesto al medio ambiente externo. Esto facilita mucho la preparacion aseptica de celulas terapeuticas de conformidad con los requisitos reglamentarios.
En una realizacion, se proporciona una tapa de acuerdo con la presente invencion para un sistema o recipiente de fabricacion de acuerdo con la descripcion, tal como un sistema G-Rex, comprendiendo dicha tapa en particular un respiradero y/o un conducto como se describe en la presente memoria o fijandola para acomodarla.
En una realizacion, la tapa, el respiradero y/o los conductos son unitarios, por ejemplo moldeados.
En una realizacion, la tapa, el respiradero y/o los conductos son del mismo material.
En una realizacion, la tapa, el respiradero y/o los conductos son de materiales distintos.
En una realizacion, la tapa, el respiradero y/o los conductos son de un material y el recipiente sobre el que se adapta
la tapa para su ajuste es del mismo material.
En una realizacion, la tapa, el respiradero y/o los conductos son de un material y el recipiente sobre el que se adapta la tapa para su ajuste es de un material distinto.
En una realizacion, la tapa, el respiradero y/o los conductos son de materiales distintos y el recipiente sobre el que se adapta la tapa para su ajuste es de un material empleado en la tapa o el respiradero/ conducto.
En una realizacion, la tapa, el respiradero y/o los conductos son de materiales distintos y el recipiente sobre el que se adapta la tapa para su ajuste es de otro material distinto.
En una realizacion, el material sintetico duro adecuado para uso en la fabricacion aseptica como se describe en la presente memoria, tal como policarbonato, se emplea para fabricar uno o mas de los componentes anteriores.
Puede ser ventajoso para las buenas practicas de laboratorio (GLP) y la perspectiva reguladora que el recipiente, la tapa, los respiraderos y los conductos sean del mismo material.
En una realizacion, el recipiente es de una sola pieza porque define una unidad completa sin un elemento extrafble ni resellable, tal como una tapa. Los recipientes de una sola pieza pueden, por ejemplo, ser moldeados en una sola pieza pero tal como se emplea en la presente invencion no es una referencia a como se hace el recipiente, sino mas bien es una descripcion de la funcion del recipiente y, en particular, que no se requieren elementos estructurales adicionales, tales como una tapa, para cerrar hermeticamente el recipiente.
En una realizacion, se proporciona una disposicion de campana (Figuras 7 y 8) en donde un elemento estructural opuesto a la base proporciona una superficie concava en el volumen interior. Formas tales como campanas son ventajosas debido a que se minimiza el numero de esquinas internas en el volumen interno lo que puede maximizar la posible recuperacion de celulas. La presente descripcion tambien abarca formas alternativas que sean adecuadas para realizar esta funcion, en particular cuando se minimizan los lugares capaces de atrapar celulas usando "superficies redondeadas".
Por tanto, en una realizacion, el recipiente esta dispuesto para canalizar las celulas al conducto de salida cuando el sistema esta situado en la orientacion apropiada. En una realizacion, la forma interna esta adaptada para facilitar el drenaje desde un conducto de salida cuando esta orientado adecuadamente.
Los sistemas de acuerdo con la presente descripcion estan dispuestos de forma que permitan la retirada del lfquido y las celulas por gravedad, cuando estan dispuestos en la orientacion requerida. La retirada de las celulas por gravedad es ventajosa debido a que es sencilla, eficaz y rentable. Sin embargo, este proceso se puede aumentar empleando vado, aumentando la presion interna del sistema (denominado en la presente memoria sobrepresion) o bombeando (tal como con una bomba peristaltica). Estas tecnologfas son bien conocidas y se pueden emplear en combinacion con el sistema por union de la entrada de la bomba, el vado o los gases para crear una sobrepresion en un conducto o respiradero correspondiente, segun proceda.
Si se desea, el lfquido y las celulas se pueden retirar por bombeo, vado o sobrepresion sin la ayuda de la gravedad, incluso aunque el sistema este disenado para ser adecuado para la retirada del lfquido o las celulas por gravedad.
Un elemento estructural, tal como se emplea en la presente memoria se pretende que se refiera a una base, pared, tapa u otro elemento estructural del recipiente que realice una funcion como soporte, forma y volumen de retencion, mantenimiento o similares. Un elemento estructural no se refiere a los apendices del recipiente, tales como accesorios, en particular, conductos, respiraderos, juntas y similares.
A menos que el contexto indique otra cosa, en la presente memoria los terminos interior e interno se emplean indistintamente.
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A menos que el contexto indique otra cosa, en la presente memoria los terminos exterior y externo se emplean indistintamente.
En la presente memoria los terminos volumen interior y espacio interior se emplean indistintamente.
En una realizacion, el volumen requerido de medio para el que esta adaptado el recipiente es una cantidad que no obstruya el respiradero durante el cultivo de las celulas y la retirada del Kquido y las celulas. En una realizacion, el volumen del medio es el 50% o menos del volumen interno, tal como el 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% o menos. Cuando el recipiente esta lleno hasta este nivel, entonces puede ser apropiado retirar el contenido por gravedad.
En una realizacion, el volumen maximo requerido del medio es de 15 a 30 mL, tal como aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26 mL.
La expresion "no susceptible de obstruccion por el medio y las celulas" como se emplea en la presente memoria pretende referirse al hecho de que los elementos esten dispuestos para minimizar el acceso de las celulas y/o el medio al elemento, de manera que tenga una propension reducida a ser obstruido de modo que no pueda realizar su funcion.
En una realizacion, el volumen del medio es el 50% o mas del volumen interno, tal como el 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%. En esta realizacion, el volumen maximo requerido del medio en un sistema, tal como el G-Rex 10, es de 30 a 40 mL, tal como aproximadamente 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 o 39 mL. Cuando el recipiente esta lleno hasta este nivel, entonces puede ser apropiado emplear una "bomba" u otro sistema descrito anteriormente para ayudar a retirar el contenido. El respiradero puede ser liberado de cualquier medio o celulas situados en el por el "bombeo"/proceso de extraccion forzada y por lo tanto el respiradero puede llegar a "obstruirse" si este sistema se vacfa solo por la fuerzas de la gravedad.
En una realizacion, la relacion entre los valores numericos de la zona permeable a los gases y el volumen del medio empleado en los sistemas esta en el intervalo de 1:1 a 1:5, respectivamente, por ejemplo 1:2, 1:3 o 1:4, tal como una zona permeable a los gases de 10 cm2 para un volumen de 20 mL, que da una relacion de 1:2.
El respiradero que comprende un conducto que define un orificio interior y otro orificio exterior es esencialmente un tubo que conecta el interior del sistema con el exterior. Este respiradero permite equilibrar la presion durante el llenado del recipiente, dejando que salgan los gases. Durante el proceso de vaciado de las celulas, el respiradero permite que los gases entren en el volumen interno para llenar el vacfo que se creana por la retirada del lfquido y las celulas, permitiendo asf la comunicacion fluida libre del lfquido y las celulas con el conducto externo usando sistemas de gravedad o presurizados.
La expresion “el respiradero termina en el volumen interno” pretende referirse al hecho de que el respiradero tiene acceso al volumen interno y el orificio interior puede estar situado en un elemento estructural del recipiente, tal como una pared, siempre que el respiradero este en comunicacion fluida con el volumen interno y que el respiradero este dispuesto de tal manera que generalmente no sea susceptible de obstruccion durante la recoleccion de las celulas, cuando el medio y las celulas sean menos del 50% del volumen del recipiente.
La expresion “se extiende en el volumen interno” pretende referirse a una parte del conducto del respiradero que penetra en el espacio interno.
En una realizacion preferida, al menos parte del respiradero se extiende ffsicamente y penetra en el volumen interno como un apendice anclado en el elemento estructural.
En una realizacion, la porcion del respiradero que termina en el orificio interno no termina en el mismo plano que el elemento estructural a traves del cual esta soportado, es decir, el conducto pasara generalmente a traves de un elemento estructural en el que esta soportado y se extiende en el espacio definido por el volumen interno, por ejemplo terminando en el centro del volumen, como se muestra en una cualquiera de las Figuras 2, 3, 5, 6, 7 y 10 a 12.
La expresion “situado en el centro” como se emplea en la presente memoria pretende referirse al hecho de que parte del respiradero se extiende en el elemento estructural del recipiente en el que se aloja y en el espacio del volumen interno y no se pretende que sea una referencia absoluta al centro del espacio per se. Esto tiene la ventaja de que durante el llenado del recipiente con el medio o durante la recoleccion de las celulas (en particular si el respiradero esta situado junto con el conducto de entrada/salida) se minimice con ello la exposicion del orificio interno al lfquido.
En una realizacion, el respiradero esta dispuesto para terminar en el centro volumetrico del volumen interno del recipiente.
La expresion “centro volumetrico” como se emplea en la presente memoria pretende referirse a aproximadamente el centro del espacio tridimensional definido por el volumen interno.
En una realizacion, el conducto del respiradero se extiende entre 5 y 35 mm, tal como aproximadamente 30 mm,
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desde la parte inferior de la tapa u otro elemento estructural del recipiente o, alternativamente, desde la base.
En una realizacion, el orificio interior del respiradero esta dispuesto para que no este en contacto con el medio contenido en el recipiente durante el uso, en particular cuando el medio y las celulas ocupan menos del 50% del volumen del recipiente, de manera que el orificio y el respiradero no sean susceptibles de ser obstruidos por el lfquido o las celulas.
Sin embargo, el respiradero puede estar dispuesto de manera que se extienda en el medio contenido en el recipiente durante el uso. La funcion del respiradero puede ser facilitada empleando una membrana impermeable a los lfquidos, tal como una membrana permeable a los gases, sobre el orificio interno y/o empleando una valvula antirretorno de lfquidos en el respiradero.
En una realizacion, el respiradero puede comprender una valvula antirretorno de lfquidos.
En una realizacion, el orificio interno puede estar protegido por una membrana impermeable a los lfquidos, tal como una membrana permeable a los gases.
Opcionalmente, el respiradero puede comprender una valvula para controlar el seguimiento de los gases, si se desea.
El respiradero esta dispuesto para que sea capaz de ser conectado con un filtro esteril, tal como un filtro de 0,2 micrometros, que impida que los microbios y las partfculas transportados por el aire entren en el volumen interno del recipiente y contaminen el sistema. Generalmente, el dispositivo o elemento filtrante puede estar conectado al orificio externo del conducto que forma el respiradero, como se muestra en las Figuras 2 a 6 y 9.
La conexion puede ser directa o por un medio de acoplamiento, tal como un tramo de tubo.
En una realizacion, el filtro esteril esta fijado al respiradero por un medio de fijacion, tal como un dispositivo de cierre.
El respiradero se puede preparar a partir de cualquier material adecuado y puede estar moldeado en el elemento estructural que lo soporta, es decir, integrado en el.
En una realizacion, el respiradero puede comprender simplemente un tubo flexible que se extiende a traves del elemento estructural que lo soporta.
En una realizacion, el respiradero comprende una porcion exterior que se extiende fuera del sistema cerrado que es adecuada para la conexion a un tubo flexible. Un tubo flexible adecuado esta disponible en muchas formas diferentes, por ejemplo:
• un tubo translucido que no contiene plastificantes, latex ni acetato de vinilo y tambien esta exento de productos de origen animal, o
• un tubo de transfusion, por ejemplo, tubos de PVC de calidad de transfusion, tales como tubos de PVC de calidad de transfusion de 4 mm de diametro externo.
En una realizacion, el tubo es de silicona.
El tubo empleado es tal que se pueda conectar asepticamente a los componentes que contienen tambien un tubo que utiliza un soldador de tubos esteril, por ejemplo comercializado por Terumo Medical Corporation.
El respiradero puede estar situado en cualquier lugar adecuado del recipiente incluyendo, por ejemplo, un elemento estructural tal como una pared, la base, una tapa, por ejemplo, en una realizacion el respiradero se extiende a traves de la capa permeable a los gases, como se ha descrito antes con detalle y puede estar situado en la base del recipiente.
En una realizacion, el respiradero esta situado en el centro en un elemento estructural del recipiente, es decir, no proximo a un borde de una pared, base o tapa.
En una realizacion, el respiradero esta situado aproximadamente a lo largo de un eje central del recipiente, por ejemplo, a traves del centro de una tapa o pared y se puede extender hacia el centro del volumen interno. “Centro” como se emplea en la presente memoria pretende referirse a aproximadamente el punto medio del espacio o elemento.
El material adecuado para el conducto o los conductos cuando se moldean incluyen, por ejemplo, los mismos materiales que el recipiente (tales como termoplasticos, en particular, policarbonato). En una realizacion, un conducto o conductos moldeados es/estan disenados de tal manera que el conducto o conductos sean adecuados para ser conectados a un tubo, por ejemplo como se muestra en la Figura 6, donde el tubo se desliza sobre la porcion del respiradero o conducto que esta moldeada.
En una realizacion, el conducto o conductos se proporcionan como tubos, tal como un tubo flexible, que se extienden
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a traves de un elemento estructural del recipiente y/o sistema. En esta realizacion puede ser necesario que el tubo flexible este sellado al elemento estructural por una junta.
Los tubos para uso con o como un conducto incluyen tubos como los descritos anteriormente que se pueden utilizar en dispositivos de conexion esteriles para la conexion aseptica de componentes externos como, por ejemplo, bolsas esteriles para infusion.
El conducto o conductos pueden estar situados en cualquier lugar adecuado en el recipiente incluyendo, por ejemplo, los elementos estructurales, tales como una pared, la base, una tapa.
En una realizacion, se proporciona un conducto de entrada independiente y un conducto de salida independiente.
En una realizacion, se proporciona un conducto que funciona como un conducto de entrada y salida.
En una realizacion, el respiradero esta situado junto al conducto o conductos, por ejemplo, en una pared o tapa.
La ventaja de estar situados juntos el respiradero y el conducto o conductos en un elemento estructural opuesto a la base, tal como una tapa o pared, es que no se requieren modificaciones en la pared lateral del recipiente. Esto es ventajoso debido a que los recipientes sin elementos en las paredes laterales pueden ser colocados muy proximos entre sf ocupando un espacio mmimo. Esto tambien permite la fabricacion eficaz del respiradero y del conducto o conductos dentro de un solo componente del recipiente.
La ventaja de estar situados juntos el respiradero y el conducto o conductos en la tapa significa que no se requiere ninguna modificacion adicional del recipiente comercialmente disponible para convertirlo de un sistema abierto en uno cerrado.
En una realizacion, el conducto empleado para que salgan las celulas esta situado proximo a un elemento estructural, tal como la pared, el borde de una tapa o similar. Los inventores han encontrado que situando el conducto de salida en un borde, una pared o elemento estructural del recipiente se obtiene entonces una recuperacion mas eficaz de las celulas. Un ejemplo del conducto situado proximo a un elemento estructural se muestra en las Figuras 2 a 12.
Situando el conducto o conductos al lado de la tapa u otro elemento estructural se asegura que se consigue la maxima recuperacion del lfquido y las celulas. Los prototipos anteriores teman el conducto en el centro de la tapa y debido a la tension superficial del lfquido, se determino que se reteman en el recipiente 0,5 mL-0,8 mL de lfquido. Cuando el conducto se traslado a un lado, y se alineo con una junta, la retencion se redujo hasta 0,1 mL.
Ademas, situando el conducto o conductos descentrados permite que el respiradero este situado en el centro, que en al menos algunas realizaciones puede minimizar la exposicion del respiradero a la obstruccion por el lfquido.
Por tanto, en una realizacion, el conducto o conductos, en particular, el conducto de salida no es coaxial con un eje central del volumen interno del recipiente.
En las figuras de la seccion transversal mostradas en la presente memoria, una lmea doble representa una pared o barrera o similar, que esta cerrada. Sin embargo, una sola lmea no es un cierre sino que esta presente para mostrar la forma del elemento. Por tanto, cuando se muestra una sola lmea al final de un respiradero o conducto, indica que este esta abierto.
La Figura 2 muestra una capa permeable a los gases (2), que forma la base (1) del recipiente (4), que comprende una tapa (8) en la que estan situados juntos un respiradero (6) y un conducto (5), en donde dicho respiradero comprende una conduccion que define un orificio exterior capaz de soportar un filtro esteril, extendiendose dicha conduccion a traves de la tapa hasta el centro del volumen interior definido por el recipiente y terminando en el orificio interior. En uso, el recipiente contiene un medio y celulas que se depositan sobre la superficie interior de la capa permeable a los gases.
La Figura 3 muestra una disposicion similar a la de la Figura 2, pero se caracteriza porque el recipiente es de una sola pieza sin tapa resellable. El conducto (5) y el respiradero (6) estan situados juntos en una pared (un elemento estructural) del recipiente. La conduccion del respiradero se extiende como un saliente en el volumen interno del recipiente.
La Figura 4 muestra una disposicion similar a la de la Figura 3 pero en ella el conducto (5) y el respiradero (6) estan dispuestos en posiciones opuestas entre sf.
La Figura 5 muestra una disposicion similar a las de las Figuras 3 y 4, pero en ellas el conducto (5) y el respiradero (6) estan dispuestos perpendiculares entre sf.
La Figura 6 muestra una capa permeable a los gases (2), que forma la base (1) del recipiente (4), que comprende una tapa (8) en la que estan situados un respiradero (6) y un conducto (5), en donde dicho respiradero comprende una conduccion que define un orificio exterior capaz de soportar un filtro esteril, extendiendose dicha conduccion a
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traves de la tapa hasta el centro del volumen interior definido por el recipiente, hacia la base e introduciendose en el medio (3). El orificio interior esta protegido por una membrana permeable a los gases (9) que evita la obstruccion del respiradero por el lfquido.
La Figura 7 muestra un recipiente en forma de campana de una sola pieza (4) provisto del conducto (5) (que tiene una funcion doble de conducto de entrada y salida) y el respiradero (6) situado junto a el en un elemento estructural del recipiente opuesto a la base que comprende una capa permeable a los gases. En esta Figura el respiradero (6) y el conducto (5) se muestran con las porciones exteriores conectadas a un tubo flexible.
La Figura 8 muestra un sistema de la Figura 7 orientado para poner el medio lfquido y las celulas en comunicacion con el conducto de salida (5), por el que las celulas pueden salir por gravedad. Las dimensiones de la Figura en la presente invencion se dan solamente a modo de ejemplo y no pretenden ser limitantes.
Envases esteriles, tales como bolsas para infusion, que contienen materiales tales como un medio y/o celulas se pueden soldar a un conducto o tubo de entrada conectado a ellos utilizando tecnologfa conocida para introducir asepticamente el medio en el sistema. Esto se ilustra esquematicamente en la Figura 9. Tecnicas y tecnologfa de soldadura esteril son bien conocidas en la industria y no se explicaran mas en la presente memoria.
De manera similar, los envases vados, tales como bolsas esteriles para infusion, se pueden soldar a un conducto de salida, o a un tubo conectado a el, para retirar asepticamente las celulas del recipiente, tambien ilustrado en la Figura 9.
Ambos metodos de introduccion y retirada de materiales del sistema asepticamente son muy convenientes, robustos y practicos.
Permitir que las celulas sean retiradas (recolectadas) por gravedad cambiando la orientacion del recipiente de 10 a 350 grados, por ejemplo 45 grados o mas, tal como 90 o 180 grados, es muy facil y eficaz, debido a que no requiere equipo especializado ni necesita espacio ni experiencia mmimos.
En una realizacion, el conducto de salida no se extiende por encima de un elemento estructural en el que se encuentra en el volumen interno mas de 0,15 mm. Esto asegura la recuperacion maxima de celulas.
El conducto o conductos pueden estar equipados con una valvula y/o membrana o similar para controlar el flujo de materiales a traves de los mismos.
Se pueden requerir juntas y cierres hermeticos adecuados dependiendo de la construccion exacta del sistema.
En general, se requerira un material adecuado para la fabricacion del recipiente y sus elementos estructurales que cumplan una o mas de las siguientes normas: Aprobacion alimentaria de la UE: Directiva de la UE 2002/72/EC; USP <88>, biological reactivity test in vivo, class VI; USP <87>, biological reactivity test in vitro; USP <661>, physicochemical test - plastics; monograffa 3.2.2 de la Farmacopea europea (EP), Envases y cierres de plastico para uso farmaceutico; ensayos biologicos de acuerdo con la norma ISO 10993 - dispositivos de comunicacion externos; para contacto indirecto con sangre durante un periodo prolongado.
En una realizacion, los elementos del recipiente y/o estructurales de los sistemas se fabrican con un termoplastico adecuado, tal como policarbonato.
Los conductos y respiraderos se pueden incorporar al sistema por soldadura termica, especialmente cuando se crea un sistema cerrado a partir de un producto comercialmente disponible, tal como G-Rex.
En una realizacion, se moldeara una tapa modificada en una sola pieza con las conexiones apropiadas para tubos y/o filtro, que se uniran despues.
En una realizacion, los elementos y la funcionalidad estructural, tales como conductos y respiraderos, se crearan cuando se moldea el recipiente.
El termino “funcionalidad estructural” como se emplea en la presente memoria pretende referirse a los elementos que realizan una funcion, por ejemplo, como un respiradero o conducto y/o que es adecuada para fijar accesorios, tales como tubos o similares.
Los sistemas de acuerdo con la descripcion pueden ser irradiados por rayos gamma para su esterilizacion.
En general, el sistema sera entregado a los usuarios finales en una bolsa hermeticamente cerrada de forma esteril, por ejemplo junto con un certificado de esterilidad. Un sistema de esta forma tendra generalmente un periodo de validez de aproximadamente 1 ano o mas.
Se proporciona tambien un procedimiento para fabricar un sistema de acuerdo con la presente descripcion que comprende la etapa de moldear el recipiente y fijarle opcionalmente los conductos y los respiraderos.
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En una realizacion, los agujeros para acomodar un respiradero y/o conductos son creados por sondas termicas en lugar de por perforacion, minimizando as^ la cantidad de contaminacion generada y garantizando que el producto final sea adecuado para uso en la preparacion de un producto terapeutico.
En una realizacion, en el proceso de fabricacion se fijan otros componentes, tales como juntas y/o valvulas y/o filtros.
En una realizacion, el proceso de fabricacion comprende la etapa adicional de esterilizacion del sistema, por ejemplo, utilizando irradiacion con rayos gamma y cerrando hermeticamente de modo aseptico la unidad en una o varias bolsas o envases.
En una realizacion, una o mas etapas del proceso de fabricacion se realizan en una habitacion blanca que cumpla las normas de EU-GMP clase D (Us Fed. Std. 209e class 100,000, ISO 14644-1 class ISO8). En una realizacion, cada sistema junto con filtros, juntas, tubos y conexiones y antes de la esterilizacion del sistema ensamblado se sometera a un ensayo de mantenimiento de la presion con aire comprimido de acuerdo con metodos conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo, el ensayo de presion de 0,5 bar ± 0,05 bar durante mas de 2 minutos. Durante este tiempo, la presion no descendera de su valor inicial registrado menos de 0,05 bar.
En una realizacion, se proporciona un metodo para modificar un sistema de cultivo celular existente para obtener un sistema cerrado de acuerdo con la invencion. La modificacion puede emplear una o mas de las etapas de fabricacion definidas anteriormente.
En una realizacion, un recipiente de acuerdo con la descripcion, tal como un recipiente G-Rex modificado y/o un recipiente con una membrana permeable a los gases de aproximadamente 10 cm2, se llenara tfpicamente hasta un volumen final de 10 a 25 mL con celulas y medio de cultivo, y se incubara a 37°C hasta que las celulas esten listas para la recoleccion. Teniendo esto en cuenta, el recipiente se puede llenar hasta 40 mL como se indico anteriormente.
Por tanto, se proporciona un metodo para introducir asepticamente celulas a un sistema cerrado de acuerdo con la descripcion, seguido por incubacion de las celulas a una temperatura apropiada y durante un penodo adecuado.
En un aspecto adicional, se proporciona un metodo para recolectar asepticamente celulas terapeuticas de un sistema cerrado de acuerdo con la descripcion uniendo asepticamente un receptaculo a un conducto de salida del sistema y recolectando las celulas en el receptaculo por gravedad.
En un aspecto adicional, se proporciona un metodo para recolectar asepticamente celulas terapeuticas de un sistema cerrado de acuerdo con la descripcion uniendo asepticamente un receptaculo a un conducto de salida del sistema y recolectando las celulas en un receptaculo empleando una bomba.
En una realizacion, el receptaculo al que se transfieren las celulas recolectadas es una bolsa de 600 mL, denominada algunas veces en la tecnica un "paquete de transferencia".
En una realizacion, despues de la recoleccion las celulas se lavan, por ejemplo, con una solucion que comprende seroalbumina humana, solucion salina o similar.
En una realizacion, las celulas se lavan manualmente.
En una realizacion, las celulas se lavan empleando un sistema automatizado, por ejemplo un sistema Sepax® comercializado por Biosafe.
En una realizacion, por ejemplo, despues del lavado, se cuentan las celulas.
En una realizacion, por ejemplo despues del recuento, se selecciona una cantidad terapeutica de celulas (es decir, una o mas dosis de celulas).
En un aspecto, las celulas recolectadas se encierran en un envase adecuado, por ejemplo una bolsa para infusion, opcionalmente junto con uno o mas conservantes o excipientes farmaceuticamente aceptables, para su almacenamiento.
Excipientes adecuados incluyen DMSO, por ejemplo DMSO al 10%.
En una realizacion, el envase se transporta a la ubicacion de un paciente.
En una realizacion, el contenido del envase se administra a un paciente por via parenteral, particularmente por via intravenosa.
En el contexto de esta memoria, el termino "que comprende" debe interpretarse como "que incluye".
Se pretende tambien que los aspectos de la invencion que comprenden ciertos elementos tambien se extiendan a realizaciones alternativas "que consisten" o "que consisten esencialmente" en elementos pertinentes.

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    REIVINDICACIONES
    1. Un sistema cerrado adecuado para cultivar asepticamente celulas terapeuticas, que comprende:
    i) un recipiente que comprende:
    una porcion permeable a los gases adecuada para soportar el crecimiento celular y permitir el suministro de gases a las celulas durante el cultivo, y al menos una pared adyacente a una base,
    en donde dicho recipiente define un volumen interno para contener un volumen de medio requerido para soportar un cultivo celular,
    ii) un respiradero que comprende una conduccion que define un orificio interior y un orificio exterior, distantes entre sf, en comunicacion fluida uno con otro, que permite equilibrar la presion durante el llenado del recipiente, permitiendo que salgan los gases y durante el proceso de vaciado de las celulas permitiendo que los gases entren en el volumen interior,
    en donde la conduccion se extiende desde el exterior del sistema cerrado por un elemento estructural del recipiente y se extiende en el volumen interno del recipiente y termina en el con el orificio interior, y en donde el orificio interior esta dispuesto para no estar en contacto con el medio en el recipiente o en donde el orificio interior esta cubierto con una membrana impermeable a los lfquidos o una valvula antirretorno de lfquidos, de manera que se minimice la exposicion del orificio interno al lfquido y, por tanto, el orificio interior no sea susceptible de ser obstruido por el lfquido durante el llenado y vaciado del medio lfquido, y
    en donde el orificio exterior puede estar unido a un filtro esteril,
    iii) un conducto o conductos para la introduccion aseptica de fluidos y celulas en el recipiente,
    un conducto o conductos para que salgan los fluidos del sistema sin exponer el sistema al medio ambiente externo lo que permite que las celulas que han crecido en el salgan del sistema por gravedad cuando el sistema se orienta de forma que las celulas se encuentren en comunicacion fluida con el conducto de salida.
  2. 2. Un sistema de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el recipiente es de una sola pieza.
  3. 3. Un sistema de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que el elemento estructural del recipiente a traves del
    cual se extiende la conduccion es una pared del recipiente.
  4. 4. Un sistema de acuerdo con la reivindicacion 2 o 3, en el que parte del recipiente esta dispuesta para canalizar las celulas al conducto de salida cuando el recipiente esta en una orientacion apropiada.
  5. 5. Un sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho respiradero y dichos conductos estan situados en el mismo elemento estructural del recipiente, por ejemplo estan situados opuestos a la base.
  6. 6. Un sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el conducto de salida no es coaxial con un eje central del volumen interno del recipiente.
  7. 7. Un sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el conducto de salida
    esta situado en un elemento estructural y el conducto se extiende 0,15 mm o menos en el volumen interno.
  8. 8. Un sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el orificio exterior esta
    unido a un filtro esteril.
  9. 9. Un sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la conduccion del respiradero se extiende entre 5 y 35 mm en el volumen interno del recipiente, tal como 30 mm desde el elemento estructural del recipiente.
  10. 10. Un metodo para el cultivo aseptico de celulas terapeuticas que comprende las etapas de:
    a. anadir asepticamente a un sistema cerrado definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, una poblacion de celulas para su cultivo,
    b. anadir asepticamente a dicho sistema un nutriente o nutrientes para cultivar las celulas, en donde la etapa a se puede realizar antes, despues o simultaneamente con la etapa b,
    c. cultivar las celulas para aumentar la poblacion de linfocitos T diana, y
    d. recolectar asepticamente los linfocitos en un envase adecuado.
  11. 11. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 10, que comprende la etapa adicional de lavar la poblacion
    aumentada de celulas despues de la recoleccion.
  12. 12. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 10 u 11, que comprende una etapa adicional de contar la poblacion aumentada de celulas despues de la recoleccion.
  13. 13. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, que comprende una etapa 5 adicional de separar una dosis terapeutica de las celulas en un envase adecuado.
  14. 14. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde se anade un excipiente, tal como DMSO, a las celulas recolectadas.
  15. 15. Uso del sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para cultivar asepticamente celulas terapeuticas.
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