WO2020044923A1 - 細胞培養方法及び細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

培養面に細胞を接着させて培養する接着培養を行い、接着培養において培養面に形成される細胞塊を培養面から剥離する。その後、培養面から剥離した細胞塊を形成する複数の細胞を培地中に浮遊させた状態で培養する浮遊培養を行う。培養面から剥離した細胞塊の状態に基づいて、浮遊培養において形成される細胞の凝集体をメッシュに通すことにより分割する分割処理の処理条件を決定し、決定した処理条件によって分割処理を行う。

Description

細胞培養方法及び細胞培養装置

　開示の技術は、細胞培養方法及び細胞培養装置に関する。

　浮遊培養により複数の細胞が凝集した球状の凝集体（スフェア）を形成する幹細胞を培養する細胞培養装置に関する技術として、例えば以下のものが知られている。例えば、国際公開第２０１４／１３６５８１号（特許文献１）には、多能性幹細胞の凝集体を分割可能なメッシュを有する継代用フィルタ部を備えた培養システムが開示されている。

　ｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cells）、間葉系胚細胞（ＭＳＣ：Mesenchymal stem cell）、ＥＳ細胞（embryonic stem cells）等の増殖性を有する幹細胞を大量に培養する方法として、幹細胞を培地中に浮遊させた状態で培養する浮遊培養が知られている。培地中に浮遊する幹細胞は、複数の単一細胞が凝集した球状の凝集体（スフェア）を形成することで、安定して増殖する。しかしながら、細胞の増殖が進み、凝集体のサイズが過大となると凝集体の中心部への酸素、二酸化炭素及び栄養分の供給が不十分となり、中心部の細胞が壊死するといった問題が生じ得る。従って、凝集体のサイズが過大となることを防止するために、培養期間中の適切な時期に、凝集体をより小さいサイズの凝集体に分割する分割処理が行われている。

　細胞の凝集体を分割する手法として、凝集体を含む細胞懸濁液を、複数の開口部（網目）を有するメッシュに通過させることで凝集体を機械的に分割する手法が提案されている。メッシュを用いた凝集体の分割処理は、凝集体を形成する複数の細胞同士の接着性に応じた適切な条件で処理を行うことが好ましい。不適切な条件で分割処理が行われた場合、細胞へのダメージが大きくなり、細胞の生存率が低下するおそれがある。

　開示の技術は、一つの側面として、凝集体を形成する細胞同士の接着性に応じた適切な条件で分割処理を行うことを目的とする。

　開示の技術に係る細胞培養方法は、培養面に細胞を接着させて培養する接着培養を行い、接着培養において培養面に形成される細胞塊を培養面から剥離し、培養面から剥離した細胞塊を形成する複数の細胞を培地中に浮遊させた状態で培養する浮遊培養を行い、培養面から剥離した細胞塊の状態に基づいて、浮遊培養において形成される細胞の凝集体をメッシュに通すことにより分割する分割処理の処理条件を決定し、決定した処理条件によって分割処理を行うことを含む。これにより、凝集体を形成する細胞同士の接着性に応じた適切な条件で分割処理を行うことが可能となる。

　開示の技術に係る培養方法において、培養面からの剥離前後における細胞塊の空間的パラメータの変化に基づいて、分割処理の処理条件を決定してもよい。

　開示の技術に係る培養方法において、培養面からの剥離前における細胞塊の個数Ｃ１と、培養面からの剥離後における細胞塊の個数Ｃ２との比である個数比Ｃ２／Ｃ１に基づいて、凝集体の分割方法を決定してもよい。個数比Ｃ２／Ｃ１を細胞の凝集体の接着性を示す指標値として用いることで、細胞の凝集体の接着性を適切に判定することができる。

　個数比Ｃ２／Ｃ１が所定値よりも小さい場合には、凝集体を、孔径が相対的に大きい第１のメッシュに通した後、孔径が相対的に小さい第２のメッシュに通すことが好ましい。また、個数比Ｃ２／Ｃ１が所定値よりも大きい場合には、凝集体が通過するメッシュの段数を、個数比Ｃ２／Ｃ１が所定値よりも小さい場合と比較して少なくしてもよい。これにより、細胞へのダメージを抑制することができる。

　細胞塊を撮像した画像に基づいて、個数比Ｃ２／Ｃ１を導出してもよい。これにより、個数比Ｃ２／Ｃ１の導出を自動化することができる。

　開示の技術に係る細胞培養方法において、凝集体の分割は、凝集体をメッシュに通すことにより行われてもよい。この場合、個数比Ｃ２／Ｃ１が所定値よりも小さい場合には、凝集体がメッシュを通過する速度を相対的に低くし、個数比Ｃ２／Ｃ１が所定値よりも大きい場合には、凝集体がメッシュを通過する速度を相対的に高くしてもよい。これにより、細胞へのダメージを抑制することができる。

　開示の技術に係る培養方法において、培養面からの剥離前における細胞塊の各々の面積の合算値Ｓ１と、培養面からの剥離後における細胞塊のうち、最外周に位置する細胞塊の外縁に接する輪郭線に囲まれた領域の面積Ｓ２との比である面積比Ｓ２／Ｓ１に基づいて、細胞塊を分割する分割方法を決定してもよい。面積比Ｓ２／Ｓ１を細胞の凝集体の接着性を示す指標値として用いることで、細胞の凝集体の接着性を適切に判定することができる。

　開示の技術に係る培養方法において、細胞塊及び前記凝集体を形成する細胞は幹細胞であってもよい。

　開示の技術に係る細胞培養装置は、細胞の凝集体を分割するメッシュと、培養面に細胞を接着した状態で培養する接着培養において、培養面から剥離した細胞塊の状態に基づいて、凝集体をメッシュに通すことにより分割する分割処理の処理条件を決定する制御部と、を含む。これにより、凝集体を形成する細胞同士の接着性に応じた適切な条件で分割処理を行うことが可能となる。

　開示の技術によれば、凝集体を形成する細胞同士の接着性に応じた適切な条件で分割処理を行うことが可能となる。

開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の一例を示す工程フロー図である。 開示の技術の実施形態に係る接着培養の様子の一例を示す斜視図である。 培養面を上方から眺めた平面図である。 培養面から剥離された細胞塊の状態を示す斜視図である。 培養面を上方から眺めた平面図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養装置の構成の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る分割処理部の構成の一例を示す断面図である。 開示の技術の実施形態に係るメッシュの平面図である。 図５Ｂにおいて破線で囲んだ部分の拡大図である。 開示の技術の実施形態に係る制御部が分割処理の処理条件を決定する処理の流れの一例を示すフローチャートである。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養装置において行われる分割処理の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養装置において行われる分割処理の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る制御部が分割処理の処理条件を決定する処理の流れの一例を示すフローチャートである。 培養面を上方から眺めた平面図である。 開示の技術の実施形態に係る細胞培養装置の構成の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る制御部が分割処理の処理条件を決定する処理の流れの一例を示すフローチャートである。

　以下、開示の技術の実施形態の一例を、図面を参照しつつ説明する。なお、各図面において同一または等価な構成要素および部分には同一の参照符号を付与している。

[第１の実施形態]
　図１は、開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の一例を示す工程フロー図である。開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法においては、ｉＰＳ細胞、間葉系胚細胞、ＥＳ細胞等の増殖性を有する幹細胞を培養の対象とする。

　開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の工程Ａ１は、初期培養工程であり、細胞は接着培養によって培養される。図２Ａは、接着培養の様子の一例を示す斜視図である。図２Ａに示すように、細胞は、培地１１が添加された培養容器１０の底面に接着した状態で培養される。培養容器１０は、例えばシャーレの形態を有するものであってもよい。培養容器１０の上方には撮像装置２０が設けられている。撮像装置２０は、培養容器１０の底面に接着培養される細胞を撮像する。撮像装置２０によって取得された画像は、撮像装置２０に接続された記憶部２１に格納される。記憶部２１は、フラッシュメモリ等の不揮発性の記憶媒体である。なお、記憶部２１は撮像装置２０に内蔵されていてもよい。図２Ｂは、細胞の培養面１２となる培養容器１０の底面を上方から眺めた平面図である。接着培養により細胞の増殖が進行すると、培養面１２上には、複数の細胞が集合した細胞塊（コロニー）１００が形成される。

　開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の工程Ａ２において、細胞塊１００を培養面１２から剥離する剥離処理が行われる。本実施形態に係る細胞培養方法においては、剥離処理に先立って、培養面１２から剥離される前の細胞塊１００の状態を撮像した画像が、撮像装置２０によって取得され、記憶部２１に格納される。細胞塊の剥離処理は、例えばトリプシン等のタンパク分解酵素を含む剥離剤を添加することにより行われる。細胞塊１００の培養面１２からの剥離を促進させるために、培養容器１０に外部から衝撃を加えて振動を生じさせるタッピング処理を実施してもよい。

　図３Ａは、剥離剤を添加してから所定時間が経過した後の細胞塊１００の状態を示す斜視図であり、図３Ｂは、培養面１２を上方から眺めた平面図である。細胞塊１００に剥離剤を添加することにより、細胞塊１００と培養面１２との間の接着力が低下して培養面１２から細胞塊１００が剥離する。また、剥離剤の添加により細胞塊１００を形成する細胞同士の接着力も低下するので、細胞塊１００は、複数の小片に分解される。本実施形態に係る細胞培養方法においては、剥離剤を添加してから所定時間が経過した後の細胞塊１００の状態を撮像した画像が、撮像装置２０によって取得され、記憶部２１に格納される。

　開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の工程Ａ３において、培養面１２から剥離された細胞は、浮遊培養により培養される。

　図４は、開示の技術の実施形態に係る細胞培養装置１の構成の一例を示す図である。細胞培養装置１は、浮遊培養方式による細胞培養を実現するための構成を有する。細胞培養装置１は、培養容器３０、回収容器３３、分割処理部３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃ及び制御部３２を有する。制御部３２は、記憶部２１と通信可能に接続される。

　培養容器３０には、接着培養工程を経た細胞及び培地を含む細胞懸濁液が収容される。培養容器３０は、例えばガス透過性を有するフィルムを含んで構成されるバッグの形態を有していてもよい。培養容器３０に収容される培地には、細胞を継続的に浮遊させる目的、及び細胞同士の過度の密着を防ぐ目的で、細胞毒性を有しない高分子化合物が添加されていてもよい。上記目的で培地に添加される高分子化合物は、例えば、培地の比重を調整する高分子化合物、培地の粘度を調整する高分子化合物、培地中で三次元ネットワーク構造を形成する高分子化合物である。このような高分子化合物としては、メチルセルロース及びジェランガムなどが挙げられる。

　幹細胞の浮遊培養においては、複数の細胞が凝集した球状の凝集体（スフェア）が形成される。細胞の増殖が進み、凝集体（スフェア）のサイズが過大となると凝集体（スフェア）の中心部への酸素、二酸化炭素及び栄養分の供給が不十分となり、中心部の細胞が壊死するといった問題が生じ得る。従って、凝集体（スフェア）のサイズが過大となることを防止するために、培養期間中の適切な時期に、凝集体（スフェア）をより小さいサイズの凝集体（スフェア）に分割する分割処理が行われる。

　分割処理部３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃは、それぞれ、所定のサイズにまで成長した凝集体（スフェア）に対して分割処理を施す。細胞培養装置１は、培養容器３０と回収容器３３との間に並列に配置された第１の流路Ｆ１及び第２の流路Ｆ２を有する。すなわち、培養容器３０及び回収容器３３は、第１の流路Ｆ１及び第２の流路Ｆ２を介して互いに接続されている。第１の流路Ｆ１の途中には２つの分割処理部３１Ａ、３１Ｂが設けられ、第２の流路Ｆ２の途中には、１つの分割処理部３１Ｃが設けられている。また、第１の流路Ｆ１の一端及び他端にはバルブＱ１及びＱ２が設けられ、第２の流路Ｆ２の一端及び他端にはバルブＱ３及びＱ４が設けられている。回収容器３３と、第１の流路Ｆ１及び第２の流路Ｆ２とを接続する流路の途中にはポンプＰ１が設けられている。

　制御部３２は、バルブＱ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４の開閉制御及びポンプＰ１の駆動制御を行う。すなわち、バルブＱ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４は、制御部３２から供給される制御信号に応じて開閉し、ポンプＰ１は、制御部３２から供給される制御信号に応じて駆動する。例えば、バルブＱ１、Ｑ２が開状態に制御され、バルブＱ３、Ｑ４が閉状態に制御され、ポンプＰ１が駆動されることで、培養容器３０に収容されている細胞懸濁液は、第１の流路Ｆ１を経由して回収容器３３に回収される。この場合、細胞懸濁液に含まれる凝集体（スフェア）は、第１の流路Ｆ１の途中に設けられた分割処理部３１Ａ及び３１Ｂの各々によって分割される。一方、バルブＱ３、Ｑ４が開状態に制御され、バルブＱ１、Ｑ２が閉状態に制御され、ポンプＰ１が駆動されることで、培養容器３０に収容されている細胞懸濁液は、第２の流路Ｆ２を経由して回収容器３３に回収される。この場合、細胞懸濁液に含まれる凝集体（スフェア）は、第２の流路Ｆ２の途中に設けられた分割処理部３１Ｃによって分割される。

　図５Ａは、分割処理部３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃの構成の一例を示す断面図である。分割処理部３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃの基本的な構成は、互いに同じである。分割処理部３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃは、それぞれ、流入口２０２及び流出口２０３を有するケース２０１と、ケース２０１の内部の、流入口２０２と流出口２０３との間に設けられたメッシュ２１０とを含んで構成されている。

　図５Ｂは、メッシュ２１０の平面図、図５Ｃは、図５Ｂにおいて破線で囲んだ部分Ｙの拡大図である。メッシュ２１０は、複数の繊維状部材２１２を例えば平織りすることによって形成された複数の開口部（網目）２１１を有する。なお、繊維状部材２１２の織り方は、平織りに限定されない。繊維状部材２１２の材質は、特に限定されるものではないが、耐食性の高い材料で構成されていることが好ましく、例えばナイロンまたはステンレスを好適に用いることができる。メッシュ２１０は、複数の開口部２１１を有する主面が、細胞懸濁液の流れ方向ＦＬと交差する方向に延在するようにケース２０１内に設置されている。細胞懸濁液が、メッシュ２１０を通過することで、細胞懸濁液に含まれる凝集体（スフェア）が機械的に分割される。

　第１の流路Ｆ１上において細胞懸濁液の流れ方向の下流側に配置される分割処理部３１Ｂが有するメッシュ２１０の開口部２１１の径（以下、孔径Ｌと称する）は、細胞懸濁液の流れ方向ＦＬの上流側に配置される分割処理部３１Ａが有するメッシュ２１０の孔径Ｌよりも小さい。すなわち、第１の流路Ｆ１を通過する細胞懸濁液に含まれる凝集体（スフェア）は、分割処理部３１Ａにおいて孔径Ｌが相対的に大きいメッシュ２１０による分割処理が施された後、分割処理部３１Ｂにおいて孔径Ｌが相対的に小さいメッシュ２１０による分割処理が施される。

　第２の流路Ｆ２上に配置される分割処理部３１Ｃが有するメッシュ２１０の開口部２１１の孔径Ｌは、分割処理部３１Ｂが有するメッシュ２１０の開口部２１１の孔径Ｌと同じである。すなわち、第２の流路Ｆ２を通過する細胞懸濁液に含まれる細胞の凝集体は、分割処理部３１Ａが有するメッシュ２１０の孔径Ｌよりも小さい孔径Ｌを有するメッシュ２１０による分割処理が施される。

　分割処理部３１Ａが有するメッシュ２１０の孔径Ｌは、例えば、分割処理前の凝集体（スフェア）の平均径よりも小さい大きさとされる。凝集体（スフェア）の平均径として、凝集体（スフェア）の各々を球形近似したときの、当該球形の直径の算術平均を適用することが可能である。分割処理部３１Ｂ及び３１Ｃが有するメッシュ２１０の孔径Ｌは、分割処理後の凝集体（スフェア）の目標サイズに応じて定められる。

　開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の工程Ａ４において、工程Ａ２において培養面１２から剥離した細胞塊（コロニー）の状態に基づいて、分割処理の処理条件が決定される。開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の工程Ａ５において、工程Ａ４において決定した処理条件によって分割処理が行われる。本実施形態においては、制御部３２が、撮像装置２０によって取得された画像に基づいて、分割処理の処理条件を決定し、決定した処理条件によって分割処理を行うべく、バルブＱ１～Ｑ４及びポンプＰ１を制御する。

　図６は、制御部３２が分割処理の処理条件を決定する処理の流れの一例を示すフローチャートである。

　ステップＢ１において、制御部３２は、記憶部２１に格納されている、培養面１２から剥離される前の細胞塊の状態（図２Ｂ参照）を撮像した画像を記憶部２１から読み出す。

　ステップＢ２において、制御部３２は、ステップＢ１において読み出した画像から、培養面１２から剥離される前の細胞塊（コロニー）の個数Ｃ１を導出する。なお、個数Ｃ１の導出は、公知の画像解析技術を用いて行うことが可能である。図２Ｂに示す例では、培養面１２から剥離される前の細胞塊（コロニー）の個数が１つである場合が例示されているが、接着培養においては、２つ以上の細胞塊（コロニー）が培養面１２に形成される場合もある。

　ステップＢ３において、制御部３２は、記憶部２１に格納されている、培養面１２から剥離された後の細胞塊の状態（図３Ｂ参照）を撮像した画像を記憶部２１から読み出す。

　ステップＢ４において、制御部３２は、ステップＢ３において読み出した画像から、培養面１２から剥離された後の細胞塊（コロニー）の個数Ｃ２を導出する。上記したように、剥離剤を用いて細胞塊（コロニー）を培養面１２から剥離することで、細胞塊（コロニー）を形成する細胞同士の接着力が低下する。その結果、細胞塊（コロニー）は、複数の小片または単一細胞に分解されることから、通常Ｃ２＞Ｃ１が成立する。なお、個数Ｃ２の導出は、公知の画像解析技術を用いて行うことが可能である。

　ステップＢ５において、制御部３２は、培養面からの剥離前における細胞塊（コロニー）の個数Ｃ１と、培養面からの剥離後における細胞塊の個数Ｃ２との比である個数比Ｃ２／Ｃ１を、細胞同士の接着性を示す指標値Ｘとして導出する。ここで、細胞塊（コロニー）を形成する細胞同士の接着力が強い程、剥離剤による細胞塊（コロニー）の分解は生じにくくなり、培養面１２から剥離された後の細胞塊（コロニー）の個数Ｃ２は、小さくなる。従って、個数比Ｃ２／Ｃ１を、細胞塊（コロニー）を形成する細胞同士の接着性を示す指標値Ｘとして用いることが可能である。また、細胞塊（コロニー）を形成する細胞同士の接着性は、浮遊培養において培地中を浮遊する凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着性と相関性を有する。従って、指標値Ｘ（＝Ｃ２／Ｃ１）は、浮遊培養において培地中を浮遊する凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着性をも示す。例えば、指標値Ｘが小さい程、凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着力は強いものと判定することができる。

　ステップＢ６において、制御部３２は、ステップＢ５において導出した指標値Ｘが、所定の閾値Ｘ１以下であるか否かを判定する。制御部３２は、指標値Ｘが閾値Ｘ１以下であると判定した場合（すなわち、凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着力が比較的強い場合）、処理をステップＢ７に移行し、指標値Ｘが閾値Ｘ１よりも大きいと判定した場合（すなわち、凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着力が比較的弱い場合）、処理をステップＢ８に移行する。

　ステップＢ７において、制御部３２は、分割処理の処理条件として、孔径Ｌが段階的に小さくなるように構成された２段のメッシュ２１０によって凝集体（スフェア）を分割することを決定する。制御部３２は、決定した処理条件によって分割処理を行うべく、バルブＱ１、Ｑ２を開状態、バルブＱ３、Ｑ４を閉状態に制御し、ポンプＰ１を駆動させる。これにより、図７Ａに示すように、培養容器３０から流出した細胞懸濁液は、第１の流路Ｆ１を通過する。第１の流路Ｆ１を通過する細胞懸濁液に含まれる凝集体（スフェア）は、分割処理部３１Ａにおいて、孔径Ｌが相対的に大きいメッシュ２１０によって分割され、その後、分割処理部３１Ｂにおいて、孔径Ｌが相対的に小さいメッシュ２１０によって分割される。分割処理済みの凝集体（スフェア）を含む細胞懸濁液は、回収容器３３に回収される。

　ステップＢ８において、制御部３２は、分割処理の処理条件として、１段のメッシュによって凝集体（スフェア）を分割することを決定する。制御部３２は、決定した処理条件によって分割処理を行うべく、バルブＱ３、Ｑ４を開状態、バルブＱ１、Ｑ２を閉状態に制御し、ポンプＰ１を駆動させる。これにより、図７Ｂに示すように、培養容器３０から流出した細胞懸濁液は、第２の流路Ｆ２を通過する。第２の流路Ｆ２を通過する細胞懸濁液に含まれる凝集体（スフェア）は、分割処理部３１Ｃにおいて、分割処理部３１Ｂのメッシュ２１０と同じ孔径Ｌを有するメッシュ２１０によって分割される。分割処理済みの凝集体（スフェア）を含む細胞懸濁液は、回収容器３３に回収される。

　以上のように、本実施形態に係る細胞培養方法及び細胞培養装置１によれば、接着培養において培養面１２に形成される細胞塊（コロニー）が培養面１２から剥離され、培養面１２から剥離した細胞塊（コロニー）の状態に基づいて分割処理の処理条件が決定され、決定された処理条件によって分割処理が行われる。培養面１２から剥離した細胞塊（コロニー）の状態は、浮遊培養において培地中を浮遊する凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着性を反映する。従って、培養面１２から剥離した細胞塊（コロニー）の状態に基づいて、分割処理の処理条件を決定することで、凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着力に応じた適切な分割処理の処理条件を定めることができる。

　本実施形態に係る細胞培養方法及び細胞培養装置１によれば、培養面からの剥離前後における細胞塊の空間的パラメータの変化に基づいて、分割処理の処理条件が決定される。ここで細胞塊の空間的パラメータとは、細胞塊の個数、面積、周長、相互間距離、広がり具合等の空間的要素を含むパラメータである。

　本実施形態に係る細胞培養方法及び細胞培養装置１によれば、培養面１２から剥離される前の細胞塊（コロニー）の個数Ｃ１と、培養面１２から剥離された後の細胞塊（コロニー）の個数Ｃ２との比である個数比Ｃ２／Ｃ１が、凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着性を示す指標値Ｘとして適用される。これにより、凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着性を適切に評価することが可能となる。

　本実施形態に係る細胞培養方法及び細胞培養装置１によれば、指標値Ｘが、閾値Ｘ１以下である場合（すなわち、凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着力が比較的強い場合）、凝集体（スフェア）は、分割処理部３１Ａにおいて、孔径Ｌが相対的に大きいメッシュ２１０によって分割され、その後、分割処理部３１Ｂにおいて、孔径Ｌが相対的に小さいメッシュ２１０によって分割される。このように、細胞同士の接着力が比較的強い凝集体（スフェア）に対して、孔径Ｌが段階的に小さくなるように構成された２段のメッシュを用いて段階的に分割処理を行うことで、細胞へのダメージを抑制することができる。仮に、細胞同士の接着力が比較的強い凝集体（スフェア）に対して、孔径Ｌが相対的に小さいメッシュ２１０を備えた分割処理部３１Ｂのみによる分割処理を行った場合には、細胞に加わるせん断力が過大となり、細胞へのダメージが大きくなる。

　一方、指標値Ｘが、閾値Ｘ１よりも大きい場合（すなわち、凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着力が比較的弱い場合）、凝集体（スフェア）は、分割処理部３１Ｃにおいて、分割処理部３１Ｂのメッシュ２１０と同じ孔径Ｌを有するメッシュ２１０によって分割される。細胞同士の接着力が比較的弱い凝集体（スフェア）に対しては、孔径Ｌが相対的に小さいメッシュ２１０のみによる分割処理を行った場合でも、細胞に加わるせん断力は過大とならず、細胞へのダメージは小さい。細胞同士の接着力が比較的弱い凝集体（スフェア）に対しては、より少ない段数のメッシュによって分割処理を行うことで細胞へのダメージを抑制することができる。

　なお、本実施形態においては、第１の流路Ｆ１の途中に２つの分割処理部３１Ａ及び３１Ｂを設け、第２の流路Ｆ２に、１つの分割処理部３１Ｃを設ける場合を例示したが、この態様に限定されない。第１の流路Ｆ１の途中に３つ以上の分割処理部を設け、第１の流路Ｆ１を通過する凝集体（スフェア）に対して、孔径Ｌが段階的に小さくなるように構成された３段以上のメッシュによって分割処理を行ってもよい。また、第１の流路Ｆ１の途中に設けられた分割処理部の個数よりも少ない２個以上の分割処理部を第２の流路に設け、第２の流路Ｆ２を通過する凝集体（スフェア）に対して、孔径Ｌが段階的に小さくなるように構成された２段以上のメッシュによって分割処理を行ってもよい。例えば、第１の流路Ｆ１の途中に設けられるメッシュを３段構成とし、第２の流路Ｆ２の途中に設けられるメッシュを２段構成としてもよい。

［第２の実施形態］
　図８は、開示の技術の第２の実施形態に係る、制御部３２が分割処理の処理条件を決定する処理の流れの一例を示すフローチャートである。

　ステップＢ１１において、制御部３２は、記憶部２１に格納されている、培養面１２から剥離される前の細胞塊の状態（図２Ｂ参照）を撮像した画像を記憶部２１から読み出す。

　ステップＢ１２において、制御部３２は、ステップＢ１１において読み出した画像から、培養面１２から剥離される前の細胞塊（コロニー）の面積の合算値Ｓ１を導出する。培養面１２から剥離される前の細胞塊（コロニー）が１である場合、当該細胞塊（コロニー）の面積がＳ１に相当する。培養面１２から剥離される前の細胞塊（コロニー）が２つ以上である場合、細胞塊（コロニー）の各々の面積を合計した面積がＳ１に相当する。細胞塊（コロニー）の面積の合算値Ｓ１の導出は、公知の画像解析技術を用いて行うことが可能である。

　ステップＢ１３において、制御部３２は、記憶部２１に格納されている、培養面１２から剥離された後の細胞塊の状態（図３Ｂ参照）を撮像した画像を記憶部２１から読み出す。

　ステップＢ１４において、制御部３２は、ステップＢ１３において読み出した画像から、図９に示すように、剥離剤によって分解され、拡散した細胞塊１００のうち、最外周に位置する細胞塊１００の各々に接する輪郭線３００を導出する。輪郭線３００は、例えば円形で近似してもよい。続いて、制御部３２は、輪郭線３００に囲まれた領域の面積Ｓ２を導出する。上記したように、剥離剤を用いて細胞塊（コロニー）を培養面１２から剥離することで、細胞塊（コロニー）を形成する細胞同士の接着力が低下する。その結果、細胞塊（コロニー）は、複数の小片に分解され、外側に拡散することから、通常Ｓ２＞Ｓ１が成立する。輪郭線３００の導出及び面積Ｓ２の導出は、公知の画像解析技術を用いて行うことが可能である。

　ステップＢ１５において、制御部３２は、培養面１２から剥離される前の細胞塊（コロニー）の面積の合算値Ｓ１と、輪郭線３００に囲まれた領域の面積Ｓ２との比である面積比Ｓ２／Ｓ１を細胞同士の接着性を示す指標値Ｘとして導出する。ここで、細胞塊（コロニー）を形成する細胞同士の接着力が強い程、剥離剤による細胞塊（コロニー）の分解は生じにくくなり、輪郭線３００に囲まれた領域の面積Ｓ２は小さくなる。従って、面積比Ｓ２／Ｓ１を、細胞塊（コロニー）を形成する細胞同士の接着性を示す指標値Ｘとして用いることが可能である。また、細胞塊（コロニー）を形成する細胞同士の接着性は、浮遊培養において培地中を浮遊する凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着性と相関性を有する。従って、指標値Ｘ（＝Ｓ２／Ｓ１）は、浮遊培養において培地中を浮遊する凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着性をも示す。例えば、指標値Ｘが小さい程、凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着力は強いものと判定することができる。

　ステップＢ１６において、制御部３２は、ステップＢ１５において導出した指標値Ｘが、所定の閾値Ｘ２以下であるか否かを判定する。制御部３２は、指標値Ｘが閾値Ｘ２以下であると判定した場合（すなわち、凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着力が比較的強い場合）、処理をステップＢ１７に移行し、指標値Ｘが閾値Ｘ２よりも大きいと判定した場合（すなわち、凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着力が比較的弱い場合）、処理をステップＢ１８に移行する。

　ステップＢ１７において、制御部３２は、分割処理の処理条件として、孔径Ｌが段階的に小さくなるように構成された２段のメッシュによって凝集体（スフェア）を分割することを決定する。制御部３２は、決定した処理条件によって分割処理を行うべく、バルブＱ１、Ｑ２を開状態、バルブＱ３、Ｑ４を閉状態に制御し、ポンプＰ１を駆動させる。これにより、図７Ａに示すように、培養容器３０から流出した細胞懸濁液は、第１の流路Ｆ１を通過する。第１の流路Ｆ１を通過する細胞懸濁液に含まれる凝集体（スフェア）は、分割処理部３１Ａにおいて、孔径Ｌが相対的に大きいメッシュ２１０によって分割され、その後、分割処理部３１Ｂにおいて、孔径Ｌが相対的に小さいメッシュ２１０によって分割される。分割処理済みの凝集体（スフェア）を含む細胞懸濁液は、回収容器３３に回収される。

　ステップＢ１８において、制御部３２は、分割処理の処理条件として、凝集体（スフェア）を１段のメッシュによって分割することを決定する。制御部３２は、決定した処理条件によって分割処理を行うべく、バルブＱ３、Ｑ４を開状態、バルブＱ１、Ｑ２を閉状態に制御し、ポンプＰ１を駆動させる。これにより、図７Ｂに示すように、培養容器３０から流出した細胞懸濁液は、第２の流路Ｆ２を通過する。第２の流路Ｆ２を通過する細胞懸濁液に含まれる凝集体（スフェア）は、分割処理部３１Ｃにおいて、分割処理部３１Ｂのメッシュ２１０と同じ孔径Ｌを有するメッシュ２１０による分割処理が施される。分割処理済みの凝集体（スフェア）を含む細胞懸濁液は、回収容器３３に回収される。

　本実施形態に係る細胞培養方法及び細胞培養装置によれば、第１の実施形態と同様、凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着力に応じた適切な分割処理の処理条件を定めることができる。

　本実施形態に係る細胞培養方法及び細胞培養装置によれば、培養面１２から剥離される前の細胞塊（コロニー）の面積の合算値Ｓ１と、培養面１２から剥離された後の最外周に位置する細胞塊（コロニー）に接する輪郭線３００に囲まれた領域の面積Ｓ２との比Ｘ（＝Ｓ２／Ｓ１）が、凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着性を示す指標値として適用される。これにより、指標値Ｘとして個数比Ｃ２／Ｃ１を適用する場合と同様、凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着性を適切に評価することが可能となる。

［第３の実施形態］
　図１０は、開示の技術の第３の実施形態に係る細胞培養装置１Ａの構成の一例を示す図である。細胞培養装置１Ａは、培養容器３０と回収容器３３との間に、単一の分割処理部３１を有する。

　図１１は、制御部３２が分割処理の処理条件を決定する処理の流れの一例を示すフローチャートである。なお、ステップＢ２１からステップＢ２６までの処理は、図６に示すフローチャートのおけるステップＢ１からステップＢ６と同一であるため、説明は省略する。

　制御部３２は、ステップＢ２６において、指標値Ｘが閾値Ｘ１以下であると判定した場合（すなわち、凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着力が比較的強い場合）、ステップＢ２７において、分割処理の処理条件として、凝集体（スフェア）が、分割処理部３１のメッシュを通過する速度を相対的に低い速度Ｖ１に設定することを決定する。制御部３２は、決定した処理条件によって分割処理を行うべく、バルブＱ１、Ｑ２を開状態に制御し、ポンプＰ１を速度Ｖ１に対応した回転数で駆動させる。分割処理済みの凝集体（スフェア）を含む細胞懸濁液は、回収容器３３に回収される。

　一方、制御部３２は、ステップＢ２６において、指標値Ｘが閾値Ｘ１よりも大きいと判定した場合（すなわち、凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着力が比較的弱い場合）、ステップＢ２８において、分割処理の処理条件として、凝集体（スフェア）が、分割処理部３１のメッシュを通過する速度を相対的に高い速度Ｖ２（＞Ｖ１）に設定することを決定する。制御部３２は、決定した処理条件によって分割処理を行うべく、バルブＱ１、Ｑ２を開状態に制御し、ポンプＰ１を速度Ｖ１に対応した回転数で駆動させる。分割処理済みの凝集体（スフェア）を含む細胞懸濁液は、回収容器３３に回収される。

　本実施形態に係る細胞培養方法及び細胞培養装置によれば、第１の実施形態と同様、凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着力に応じた適切な分割処理の処理条件を定めることができる。

　本実施形態に係る細胞培養方法及び細胞培養装置１によれば、指標値Ｘが、閾値Ｘ１以下である場合（すなわち、凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着力が比較的強い場合）、凝集体（スフェア）が分割処理部３１のメッシュを通過する速度が、相対的に低い速度Ｖ１とされる。このように、細胞同士の接着力が比較的強い凝集体（スフェア）に対する分割処理を、相対的に低い速度Ｖ１で行うことで、細胞へのダメージを抑制することができる。仮に、細胞同士の接着力が比較的強い凝集体（スフェア）に対する分割処理を、速度Ｖ１よりも高い速度Ｖ２で行った場合には、細胞に加わるせん断力が過大となり、細胞へのダメージが大きくなる。

　一方、指標値Ｘが、閾値Ｘ１よりも大きい場合（すなわち、凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着力が比較的弱い場合）、凝集体（スフェア）が分割処理部３１のメッシュを通過する速度が、相対的に高い速度Ｖ２とされる。細胞同士の接着力が比較的弱い凝集体（スフェア）に対しては、凝集体（スフェア）が分割処理部３１のメッシュを通過する速度を高くしても、細胞に加わるせん断力は過大とならず、細胞へのダメージは小さい。細胞同士の接着力が比較的弱い凝集体（スフェア）に対しては、凝集体（スフェア）が分割処理部３１のメッシュを通過する速度が、過度に低くならないようにすることで、細胞へのダメージを抑制することができる。

　なお、本実施形態では、単一の分割処理部３１によって分割処理を行う場合を例示したが、直列接続された複数の分割処理部３１を設け、孔径Ｌが段階的に小さくなるように構成された２段以上のメッシュによって分割処理を行ってもよい。

　また、第２の実施形態（図８参照）の例に倣って、面積比Ｓ２／Ｓ１を、凝集体（スフェア）を形成する細胞同士の接着性を示す指標値として適用してもよい。

　日本出願特願２０１８－１６３９００号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。

　本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

１、１Ａ　細胞培養装置
１０　培養容器
１１　培地
１２　培養面
２０　撮像装置
２１　記憶部
３０　培養容器
３１、３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃ　分割処理部
３２　制御部
３３　回収容器
１００　細胞塊
３００　輪郭線
２０１　ケース
２０２　流入口
２０３　流出口
２１０　メッシュ
２１１　開口部
２１２　繊維状部材
Ｆ１、Ｆ２　流路
Ｐ１ ポンプ
Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４　バルブ

Claims (10)

1. 　培養面に細胞を接着させて培養する接着培養を行い、
   　前記接着培養において前記培養面に形成される細胞塊を前記培養面から剥離し、
   　前記培養面から剥離した前記細胞塊を形成する複数の細胞を培地中に浮遊させた状態で培養する浮遊培養を行い、
   　前記培養面から剥離した前記細胞塊の状態に基づいて、前記浮遊培養において形成される細胞の凝集体をメッシュに通すことにより分割する分割処理の処理条件を決定し、
   　決定した前記処理条件によって前記分割処理を行う
   　細胞培養方法。
2. 　前記培養面からの剥離前後における前記細胞塊の空間的パラメータの変化に基づいて、前記分割処理の処理条件を決定する
   　請求項１に記載の細胞培養方法。
3. 　前記培養面からの剥離前における前記細胞塊の個数Ｃ１と、前記培養面からの剥離後における前記細胞塊の個数Ｃ２との比である個数比Ｃ２／Ｃ１に基づいて、前記凝集体の分割方法を決定する
   　請求項１または請求項２に記載の細胞培養方法。
4. 　前記個数比Ｃ２／Ｃ１が所定値よりも小さい場合には、前記凝集体を、孔径が相対的に大きい第１のメッシュに通した後、孔径が相対的に小さい第２のメッシュに通す
   　請求項３に記載の細胞培養方法。
5. 　前記個数比Ｃ２／Ｃ１が前記所定値よりも大きい場合には、前記凝集体が通過するメッシュの段数を、前記個数比Ｃ２／Ｃ１が所定値よりも小さい場合と比較して少なくする
   　請求項４に記載の細胞培養方法。
6. 　前記細胞塊を撮像した画像に基づいて、前記個数比Ｃ２／Ｃ１を導出する
   　請求項３から請求項５のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
7. 　前記凝集体の分割は、前記凝集体をメッシュに通すことにより行われ、
   　前記個数比Ｃ２／Ｃ１が所定値よりも小さい場合には、前記凝集体が前記メッシュを通過する速度を相対的に低くし、
   　前記個数比Ｃ２／Ｃ１が前記所定値よりも大きい場合には、前記凝集体が前記メッシュを通過する速度を相対的に高くする、
   　請求項３に記載の細胞培養方法。
8. 　前記培養面からの剥離前における前記細胞塊の各々の面積の合算値Ｓ１と、前記培養面からの剥離後における前記細胞塊のうち、最外周に位置する細胞塊の外縁に接する輪郭線に囲まれた領域の面積Ｓ２との比である面積比Ｓ２／Ｓ１に基づいて、前記細胞塊を分割する分割方法を決定する
   　請求項１または請求項２に記載の細胞培養方法。
9. 　前記細胞塊及び前記凝集体を形成する細胞は幹細胞である
   　請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
10. 　細胞の凝集体を分割するメッシュと、
    　培養面に細胞を接着した状態で培養する接着培養において、前記培養面から剥離した細胞塊の状態に基づいて、前記凝集体を前記メッシュに通すことにより分割する分割処理の処理条件を決定する制御部と、
    　を含む細胞培養装置。

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