TWI603736B - 活體內產生、修補及／或維持結締組織的方法 - Google Patents

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Description

活體內產生、修補及/或維持結締組織的方法
本發明係關於一種在個體中產生、修補及/或維持結締組織之方法。本發明亦係關於一種治療及/或預防個體中由結締組織退化及發炎而引起之疾病的方法。
發明背景
存在於身體中且在分離時產生多潛能細胞之非造血祖細胞稱為間葉前驅細胞(Mesenchymal Precursor Cell，MPC)。更特定言之，經純化之MPC能夠形成極大量之多潛能細胞群落。
Simmons等人(1994)描述藉由選擇表現STRO－1細胞表面標記物之細胞自新鮮收集之骨髓細胞富集MPC。如作者在第272－273頁所說明，已知骨髓細胞含有一部分能夠產生CFU－F之MPC。此等CFU－F轉而能夠在適當條件下產生廣泛範圍之完全分化之結締組織，包括軟骨、骨、脂肪組織、纖維組織及骨髓支援性基質。
MPC及CFU－F通常以極低發生率存在於骨髓細胞中(通常在0.05%－0.001%之間)且此稀少性已成為過去研究其之主要限制。Simmons等人(1994)所討論之重要發現為證實在某種程度上藉由選擇STRO－1陽性細胞可自新鮮分離之骨髓細胞富集此等MPC。詳言之，選擇STRO－1陽性細胞使得能夠分離MPC(及所得CFU－F)而不污染造血祖細 胞。
藉由鑑別此部份STRO－1陽性細胞內含有MPC之亞群，WO 01/04268提供在MPC富集方面之另一重要發展。詳言之，WO 01/04268描述將STRO－1陽性細胞群體分成三個子集：STRO－1暗淡(dull) 、STRO－1中間(intermediate) 及STRO－1明亮(bright) 。對不同類別亞群中CFU－F之純系發生檢定證明STRO－1明亮 部份內含有絕大部分MPC。
WO 2004/085630首次揭示MPC存在於血管周圍組織中。此發現之益處中之一者在於其極大地擴大MPC可分離或富集之源組織的範圍且MPC之來源不再有效限於骨髓。根據WO 2004/085630中所述之方法可分離出MPC的組織包括人類骨髓、牙髓、脂肪組織、皮膚、脾、胰腺、腦、腎臟、肝臟及心臟。自血管周圍組織分離之MPC對細胞表面標記物3G5呈陽性。因此，可藉由富集攜帶3G5標記物之細胞或藉由富集存在於血管周圍細胞(諸如，CD146(MUC18)、VCAM－1)上之早期發育表面標記物或藉由富集高含量表現之細胞表面標記物STRO－1，來分離MPC。
無血管結締組織一般位於肌肉骨胳系統內需要明顯運動之解剖部位。此等可自由移動之關節負責哺乳動物中之大部分關節聯接。在滑膜關節中，兩個相對骨頭之接觸表面由透明軟骨覆蓋，因為藉由內襯於覆蓋及連接長骨之關節囊中之細胞產生的滑液中存在低摩擦潤滑劑，所以該等骨頭輕鬆地相對於彼此滑動。在脊柱中，藉由藉助於密封由軟骨細胞(如類似於存在於透明軟骨中之彼等軟骨細胞 的細胞)所聚居之水合凝膠物質(髓核)的可撓性纖維軟骨性環(纖維環)連接剛性脊椎骨實現關節聯接。不管此等無血管結締組織之類型及位置，其均含有合成富含高度帶負電之蛋白聚糖之胞外基質的細胞，該等蛋白聚糖吸收水分子以及纖維蛋白、II型膠原蛋白(其給予高拉伸強度)。
無血管結締組織(諸如，透明軟骨，半月板與椎間盤之內部2/3)具有有限修補能力且在受傷時可藉由產生功能差之纖維軟骨性瘢痕組織而作為回應。經由大量受衰老、遺傳、激素狀況及身體傷害影響之因素，此等無血管結締組織通常失能，導致椎間盤退化、背痛及骨關節炎之廣泛臨床問題。
目前通常用以治療由此等結締組織失能引起之症狀的醫學療法在很大程度上對負責產生症狀之潛在病理學很少醫治，且在許多情況下藉由下調定居細胞合成組織胞外基質之結構組份之能力，甚至可能使該問題惡化。理想地，治療應至少具有軟骨保護性，且甚至提供增加基質生物合成且實現受傷結締組織修補及恢復之條件。
發明概要
本發明之發明者已意外地發現在具有預先存在之骨關節炎之關節中關節內投予MPC提供軟骨保護性作用，且引起滑膜關節中及椎間盤之髓核中軟骨組織之產生及生長。此發現表明MPC或其後代或來源於此等MPC之上清液或可 溶性因子可用於在退化或損傷部位保護或修補受損結締組織以及產生新的功能性組織。
因此，本發明提供一種治療及/或預防個體中由結締組織退化及/或發炎引起之疾病的方法，該方法包含向個體投予MPC及/或其後代細胞及/或來源於其之可溶性因子。
在本發明之一具體實例中，結締組織富含蛋白聚糖。結締組織可為軟骨，例如透明軟骨。在另一具體實例中，疾病引起軟骨缺陷。
在另一具體實例中，該方法包含向個體投予MPC及/或其後代細胞及/或來源於其之可溶性因子，其中MPC及/或後代細胞及/或可溶性因子不直接投至缺陷處。
舉例而言，可投至關節間隙中以治療或預防形成該關節之骨頭之關節表面上軟骨之缺陷。類似地，可投至椎間盤間隙中以治療或預防周圍椎間盤之缺陷。在另一實例中，在靠近軟骨缺陷之部位處靜脈內投予。
MPC及/或後代細胞及/或可溶性因子可藉由關節內注射來投予。可關節內注射至接近軟骨缺陷或潛在軟骨缺陷之部位的任何身體關節中。舉例而言，可關節內注射至膝關節、髖關節、踝關節、肩關節、肘關節、腕關節、手或手指關節或足關節或椎間盤關節中。
在本發明之另一具體實例中，投予MPC及/或後代細胞及/或可溶性因子使得富含蛋白聚糖及II型膠原蛋白之軟骨得以保存或產生。富含蛋白聚糖及II型膠原蛋白之軟骨之一實例為透明軟骨。藉由本發明之方法保存或產生之軟骨 較佳不為富含I型膠原蛋白、含極低II型膠原蛋白且含比透明軟骨少之蛋白聚糖的纖維軟骨。
「由結締組織退化及/或發炎引起」之疾病之實例包括(但不限於)肌腱炎、背痛、迴旋套肌腱退化、腕隧道症候群、德奎緬氏症候群(DeQuervain's syndrome)、退化性頸及/或腰椎間盤、交叉點症候群(intersection syndrome)、反射性交感神經營養不良症候群(reflex sympathetic dystrophy syndrome，RSDS)、狹窄性腱鞘炎、上髁炎、腱鞘炎、胸廓出口症候群、尺神經卡壓、橈隧道症候群、重複性壓迫損傷(repetitive strain injury，RSI)。與透明軟骨退化及/或發炎有關之疾病之實例包括(但不限於)關節炎(諸如，骨關節炎、類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎及血清反應陰性關節炎、與發炎性腸病有關之關節炎或強直性脊椎炎)及退化性椎間盤病症。
在另一較佳具體實例中，該方法進一步包含投予玻糖醛酸(hyaluronic acid，HA)。HA可在與細胞、上清液及/或因子相同或不同之組合物中投予。
本發明亦提供一種包含MPC及/或其後代細胞及玻糖醛酸之組合物。
本文所呈示之結果首次表明由植入之所培養MPC釋放的可溶性因子支援結締組織之保護、產生及生長。
因此，本發明亦提供一種組合物，該組合物包含：i)來源於間葉前驅細胞(MPC)及/或其後代細胞之上清液或一或多種可溶性因子，及 ii)玻糖醛酸。
在另一方面中，本發明提供來源於間葉前驅細胞(MPC)及/或其後代細胞之上清液或一或多種可溶性因子用於治療及/或預防個體中由結締組織退化及/或發炎引起之疾病的用途。
本發明可應用於廣泛動物。舉例而言，個體可為哺乳動物，諸如人類、犬、貓、馬、牛或綿羊。在一具體實例中，個體為人類。
在整個本說明書中，應瞭解詞語「包含」或其變化形式表示包括所述要素、整數或步驟或要素、整數或步驟之群，但不排除任何其他要素、整數或步驟或要素、整數或步驟之群。
下文中藉助於以下非限制性實施例且參考附圖來描述本發明。
 本發明之較佳具體實例之詳述 通用技術及所選定義
除非另外特別定義，否則認為本文所用之所有技術及科學術語應具有與一般熟習此項技術者(例如，細胞培養、幹細胞生物學、分子遺傳學、免疫學、免疫組織化學、蛋白質化學及生物化學)通常瞭解之含義相同的含義。
除非另外指示，否則本發明中所利用之重組蛋白質、細胞培養及免疫技術為熟習此項技術者熟知之標準程序。 該等技術描述及說明於諸如以下來源之整個文獻中：J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984)，J.Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(編)，Essential Molecular Biology：A Practical Approach，第1及第2卷，IRL Press(1991)，D.M.Glover及B.D.Hames(編)，DNA Cloning：A Practical Approach，第1-4卷，IRL Press(1995及1996)及F.M.Ausubel等人(編)，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括所有修訂直至現在)，Ed Harlow及David Lane(編)Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988)，及J.E.Coligan等人(編)Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons(包括所有修訂直至現在)。
如本文所用之術語「治療」包括投予足以減少或消除所指定病狀之至少一種症狀的治療有效量之如本文所定義之上清液、可溶性因子及/或細胞。
如本文所用之術語「預防」包括投予足以停止或阻礙所指定病狀之至少一種症狀發展的治療有效量之如本文所定義之上清液、可溶性因子及/或細胞。
如本文所用之術語「來源於間葉前驅細胞」係指由試管內培養間葉前驅細胞及/或其後代細胞產生之上清液及/或一或多種可溶性因子。
如本文所用之術語「上清液」係指在合適培養基(較佳液體培養基)中試管內培養間葉前驅細胞及/或其後代細胞後產生之非細胞物質。通常，藉由在培養基中在合適條件及時間下培養細胞，接著藉由諸如離心之方法移除細胞物質來產生上清液。上清液可在投予之前經受或不經受進一步純化步驟。在較佳具體實例中，上清液包含少於105、更佳少於104、更佳少於103個活細胞且甚至更佳無活細胞。
如本文所用之術語「一或多種可溶性」因子係指在培養期間由MPC及/或其後代細胞分泌之分子，通常為蛋白質。
間葉前驅細胞(MPC)或後代細胞及來源於其之上清液或一或多種可溶性因子
如本文所用之「MPC」為能夠形成大量多潛能細胞群落之非造血STRO-1+祖細胞。
間葉前驅細胞(MPC)為在骨髓、血液、牙髓細胞、脂肪組織、皮膚、脾、胰腺、腦、腎臟、肝臟、心臟、視網膜、腦、毛囊、腸、肺、淋巴結、胸腺、骨、韌帶、肌腱、骨骼肌、真皮及骨外膜中存在且能夠分化成不同生殖系(諸如，中胚層、內胚層及外胚層)的細胞。因此，MPC能夠分化成大量細胞類型，包括(但不限於)脂肪組織、骨組織、軟骨組織、彈性組織、肌肉組織及纖維結締組織。此等細胞進入之特定譜系定型及分化路徑視來自機械影響及/或內源生理活性因子(諸如，生長因子、細胞因子及/或由宿主組織建立之局部微環境條件)之各種影響而定。 因此，間葉前驅細胞為分裂產生子代細胞之非造血祖細胞，該等子代細胞為幹細胞或為將按期不可逆地分化產生表型細胞之前驅細胞。
在一較佳具體實例中，自獲自個體之樣品富集MPC。術語「富集」或其變體在本文用以描述與未經處理之群體相比一特定細胞類型之比例或大量特定細胞類型之比例得以增加的細胞群體。
在一較佳具體實例中，本發明中所用之細胞亦為TNAP＋ 、VCAM－1＋ 、THY－1＋ 、STRO－2＋ 、CD45＋ 、CD146＋ 、3G5＋ 或其任何組合。STRO－1＋ 細胞較佳為STRO－1明亮 。此外STRO－1明亮 細胞較佳為VCAM－1＋ 、THY－1＋ 、STRO－2＋ 及/或CD146＋ 中之一或多者。
在一具體實例中，間葉前驅細胞為如WO 2004/85630中所定義之血管周圍間葉前驅細胞。
當提及細胞對給定標記物呈「陽性」時，其可為該標記物之低(lo或昏暗)或高(明亮，bri)表現者，此視標記物在細胞表面上存在之程度而定，其中該等術語係關於用於細胞之色分選過程中之螢光或其他顏色的強度。lo(或昏暗或暗淡)與bri之差別將在用於所分選之特定細胞群體上之標記物的情形下得以瞭解。本文中當提及細胞對給定標記物呈「陰性」時，其並不意謂該細胞一點都不表現該標記物。其意謂標記物由該細胞以相對極低之程度表現且其在可偵測標記時產生極低信號。
當用於本文時，術語「明亮」係指當可偵測標記時產 生相對較高信號之細胞表面上的標記物。雖然不希望受理論限制，但提出與樣品中之其他細胞相比，「明亮」細胞表現更多標靶標記蛋白質(例如，由STRO－1所識別之抗原)。例如，如藉由FACS分析所測定，當以FITC接合STRO－1抗體標記時，與非明亮細胞(STRO－1暗淡/昏暗(dim) )相比，STRO－1bri 細胞產生更強螢光信號。較佳地，「明亮」細胞佔起始樣品中所含之最明亮標記骨髓單核細胞的至少約0.1%。在其他具體實例中，「明亮」細胞佔起始樣品中所含之最明亮標記骨髓單核細胞的至少約0.1%、至少約0.5%、至少約1%、至少約1.5%或至少約2%。在一較佳具體實例中，STRO－1明亮 細胞具有STRO－1表面表現之2對數量級更高表現。此係相對於「背景」(亦即，為STRO－1－ 之細胞)計算。藉由比較，STRO－1昏暗 及/或STRO－1中間 細胞具有STRO－1表面表現之小於2對數量級的更高表現，通常為約1對數或小於「背景」。
當用於本文中時，術語「TNAP」意欲包涵組織非特異性鹼性磷酸酶之所有同工異型物。舉例而言，該術語包涵肝同工異型物(LAP)、骨同工異型物(BAP)及腎同工異型物(KAP)。在一較佳具體實例中，TNAP為BAP。在一尤其較佳具體實例中，如本文所用之TNAP係指可結合由依據布達佩斯條約之條款在2005年12月19日以寄存編號PTA－7282寄存於ATCC的融合瘤細胞系產生之STRO－3抗體的分子。
此外，在一較佳具體實例中，MPC能夠產生純系生成 性CFU－F。
較佳地，一顯著部分之多潛能細胞能夠分化成至少兩個不同生殖系。多潛能細胞可定型之譜系之非限制性實例包括：骨前驅細胞；肝細胞祖細胞，其具有膽管上皮細胞及肝細胞之多潛能；神經限制細胞，其可產生發展成寡樹突神經膠質細胞及星形膠質細胞之膠質細胞前驅細胞；神經元前驅細胞，其發展成神經元；心肌及心肌細胞之前驅細胞；葡萄糖應答性分泌胰島素之胰腺β細胞系。其他譜系包括(但不限於)齒質母細胞、產生齒質之細胞及軟骨細胞及以下細胞之前驅細胞：視網膜色素上皮細胞、纖維母細胞、皮膚細胞(諸如，角質細胞)、樹突狀細胞、毛囊細胞、輸尿管上皮細胞、平滑肌及骨骼肌細胞、睾丸祖細胞、血管內皮細胞、肌腱細胞、韌帶細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、纖維母細胞、骨髓基質細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、骨骼肌細胞、外被細胞、血管細胞、上皮細胞、神經膠質細胞、神經元細胞、星形膠質細胞及寡樹突神經膠質細胞。
在另一具體實例中，MPC在培養後不能夠產生造血細胞。
本發明亦係關於自由試管內培養產生之MPC及/或其後代細胞(後者亦稱為擴增細胞)獲得之上清液或可溶性因子的用途。本發明之擴增細胞可具有多種表型，此視培養條件(包括培養基中刺激因子的數目及/或類型)、繼代數目及其類似因素而定。在某些具體實例中，自親本群體 約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10次繼代後獲得後代細胞。然而，可自親本群體任何數目繼代後獲得後代細胞。
後代細胞可藉由在任何合適之培養基中培養來獲得。當提及細胞培養時所用之術語「培養基」包括在細胞周圍之環境組份。培養基可為固體、液體、氣體或相及物質之混合物。培養基包括液體生長培養基以及不維持細胞生長之液體培養基。培養基亦包括凝膠狀培養基，諸如瓊脂、瓊脂糖、明膠及膠原蛋白基質。例示性氣體培養基包括在皮氏培養皿(petri dish)或其他固體或半固體支撐體上生長之細胞所曝露之氣相。術語「培養基」亦指意欲用於細胞培養之物質，即使其尚未與細胞接觸。換言之，製備用於細菌培養之富含營養物的液體為培養基。類似地，與水或其他液體混合時變得適於細胞培養之粉末混合物可稱為「粉末狀培養基」。
在一具體實例中，藉由使用經STRO－3抗體標記之磁珠將TNAP＋MPC自骨髓分離，且接著培養擴增所分離之細胞(參見Gronthos等人(1995)關於合適培養條件之實例)，來獲得適用於本發明之方法之後代細胞。
在一具體實例中，該等擴增細胞(後代)(至少5次繼代後)可為TNAP－、CC9＋ 、I類HLA＋ 、II類HLA－ 、CD14－ 、CD19－ 、CD3－ 、CD11a－c－ 、CD31－ 、CD86－ 、CD34－ 及/或CD80－ 。然而，有可能在不同於本文所述之彼等條件的培養條件下，不同標記物之表現可變化。同時，雖然此等表型之細 胞可在擴增細胞群體中佔優勢，但其並不意謂存在較少比例之不具有此表型之細胞(例如，小百分比之擴增細胞可為CC9－)。在一較佳具體實例中，擴增細胞仍具有分化成不同細胞類型之能力。
在一具體實例中，用以獲得上清液或可溶性因子或細胞自身之擴增細胞群體包含至少25%、更佳至少50%之細胞為CC9＋之細胞。
在另一具體實例中，用以獲得上清液或可溶性因子或細胞自身之擴增細胞群體包含至少40%、更佳至少45%之細胞為STRO－1＋之細胞。
在另一具體實例中，擴增細胞可表現選自由以下各物組成之群之標記物：LFA－3、THY－1、VCAM－1、ICAM－1、PECAM－1、P－選擇素、L－選擇素、3G5、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD 90、CD29、CD 18、CD61、整合素β、6－19、血栓調節蛋白、CD 10、CD 13、SCF、PDGF－R、EGF－R、IGF1－R、NGF－R、FGF－R、瘦素－R(STRO－2＝瘦素－R)、RANKL、STRO－1明亮 及CD 146或此等標記物之任何組合。
在一具體實例中，後代細胞為如WO 2006/032092中定義之多潛能擴增MPC後代細胞(MEMP)。用於製備可獲得後代細胞之MPC富集群體的方法描述於WO 01/04268及WO 2004/085630中。在試管內情形下，MPC將很少以絕對純製劑形式存在且一般將與作為組織特異性定型細胞(TSCC)之其他細胞一起存在。WO 01/04268提及以約0.1% 至90%之純度水平自骨髓採收該等細胞。包含可獲得後代細胞之MPC之群體可直接自組織來源採收，或者其可為已在活體外擴增之群體。
舉例而言，後代可自所採收的未經擴增之實質上經純化MPC之群體獲得，該MPC群體佔其存在之群體總細胞之至少約0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80或95%。此含量可(例如)藉由選擇對選自由以下各物組成之群之至少一種標記物呈陽性的細胞來實現：TNAP、STRO-1明亮、3G5+、VCAM-1、THY-1、CD146及STRO-2。
MEMP與新鮮採收之MPC的不同之處可在於MEMP對標記物STRO-1bri呈陽性且對標記物鹼性磷酸酶(ALP)呈陰性。相比之下，新鮮分離之MPC對STRO-1bri及ALP均呈陽性。在本發明之一較佳具體實例中，至少15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%之所投予之細胞具有表型STRO-1bri、ALP-。在另一較佳具體實例中，MEMP對標記物Ki67、CD44及/或CD49c/CD29、VLA-3、α3β1中之一或多者呈陽性。在另一較佳具體實例中，MEMP不展現TERT活性及/或對標記物CD 18呈陰性。
MPC起始群體可來源於WO 01/04268或WO 2004/085630中所述之任一或多種組織類型，亦即骨髓、牙髓細胞、脂肪組織及皮膚，或可能更廣泛地來源於脂肪組織、牙齒、牙髓、皮膚、肝臟、腎臟、心臟、視網膜、腦、毛囊、腸、肺、脾、淋巴結、胸線、胰腺、骨、韌帶、骨髓、肌腱及骨骼肌。
應瞭解在執行本發明時，攜帶任何給定細胞表面標記物之細胞的分離可藉由許多不同方法實現，然而較佳方法依賴於結合劑與相關標記物之結合，接著分離展現結合之彼等細胞(高程度結合或低程度結合或不結合)。最便利之結合劑為抗體或基於抗體之分子，較佳為單株抗體或基於單株抗體，此係因為此等後者試劑具有特異性。抗體可用於兩個步驟，然而亦可使用其他試劑，因此此等標記物之配位體亦可用以富集攜帶標記物或缺乏標記物之細胞。
可使抗體或配位體附著於固體支撐物以允許粗分離。分離技術較佳使待收集部分之生存力最大保留。可使用具有不同功效之各種技術來獲得相對粗之分離。所用特定技術將視分離效率、相關細胞毒性、執行之容易性及速度及對先進設備及/或專門技能之需要而定。用於分離之程序可包括(但不限於)磁性分離、使用經抗體塗佈之磁性珠粒、親和力層析及使用附著於固體基質之抗體進行「淘選」。提供精確分離之技術包括(但不限於)FACS。
較佳地，用於分離MPC之方法(例如)包含第一步驟，其為利用(例如)識別STRO－1高含量表現之MACS的固相分選步驟。接著可繼之以第二分選步驟，希望該步驟產生如專利說明書WO 01/14268中所述之高含量前驅細胞表現。此第二分選步驟可涉及兩種或兩種以上標記物之使用。
獲得MPC之方法亦可包括在第一富集步驟之前使用已知之技術採收細胞來源。因此，將藉由外科手術移出組織。接著將包含來源組織之細胞分離至所謂單細胞懸浮液中。 此分離可藉由物理及/或酶促方式實現。
一旦獲得合適之MPC群體，即可藉由任何合適之方式培養或擴增該群體以獲得MEMP。
在一具體實例中，細胞係取自待治療之個體，使用標準技術試管內培養，且用以獲得上清液或可溶性因子或擴增細胞，以供以自體同源或同種異體組合物形式投予個體。在一替代性具體實例中，使用一或多種確定人類細胞系之細胞來獲得上清液或可溶性因子。在本發明之另一適用具體實例中，使用非人類動物之細胞(或若患者並非人類，來自另一物種)來獲得上清液或可溶性因子。
本發明可使用來自任何非人類動物物種之細胞加以實施，包括(但不限於)非人類靈長類動物細胞、有蹄類動物、犬科動物、貓科動物、兔類動物、齧齒動物、鳥類及魚類細胞。執行本發明可使用之靈長類動物細胞包括(但不限於)黑猩猩、狒狒、食蟹猴及任何其他新或舊世界猴之細胞。執行本發明可使用之有蹄類動物細胞包括(但不限於)牛、豬、綿羊、山羊、馬、水牛及野牛之細胞。執行本發明可使用之齧齒動物細胞包括(但不限於)小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠及沙鼠細胞。執行本發明可使用之兔類動物物種之實例包括家兔、長耳野兔、野兔、棉尾兔、雪地兔及鼠兔。雞(紅原雞(Gallus gallus))為執行本發明可使用之鳥類物種之一實例。
適用於本發明之方法的細胞在使用之前或在獲得上清液或可溶性因子之前可加以儲存。用於保存及儲存真核細 胞及尤其哺乳動物細胞之方法及方案在此項技術中熟知(參見例如Pollard,J.W.及Walker,J.M.(1997)Basic Cell Culture Protocols，第2版，Humana Press,Totowa,N.J.；Freshney,R.I.(2000)Culture of Animal Cells，第4版，Wiley-Liss,Hoboken,N.J.)。維持所分離幹細胞(諸如，間葉幹/祖細胞或其後代)之生物活性之任何方法可與本發明結合使用。在一較佳實施例中，藉由使用低溫保存來維持及儲存細胞。
投藥及組合物
上清液或可溶性因子
本發明之方法可包含局部性、全身性或區域性(諸如，在植入物或裝置內)投予來源於MPC之上清液或可溶性因子。
在一特定具體實例中，本發明包含向個體全身性投予來源於MPC之上清液或可溶性因子。舉例而言，上清液或可溶性因子可藉由皮下或肌肉內注射來投予。
本發明之此具體實例可適用於治療希望產生或修補特定組織之全身性退化性疾病。可以此方式治療之全身性退化性疾病之實例包括骨質疏鬆症或骨折或軟骨之退化性疾病。
來源於MPC之上清液或可溶性因子亦可用以治療因疾病或外傷或組織無法正常發育導致需要修補或替換軟骨組織的患者或提供美容功能，諸如使面部或身體之其他容貌更加美觀。治療可需要使用上清液或可溶性因子以產生新 的軟骨組織及/或維持存在之軟骨組織。舉例而言，可使用來源於MPC之上清液或可溶性因子來治療軟骨病狀，例如類風濕性關節炎或骨關節炎或軟骨之外傷性或外科手術損傷。
包含來源於MPC之上清液或可溶性因子的懸浮液可製備為合適之注射用油性懸浮液。合適親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油(諸如，芝麻油)或合成脂肪酸酯(諸如，油酸乙酯或三酸甘油酯)或脂質體。用於注射之懸浮液亦可含有增加懸浮液黏度之物質，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。懸浮液視情況亦可含有合適穩定劑或增加化合物溶解性之試劑以允許製備高度濃縮溶液。
可藉由將上清液或可溶性因子以所需量與上文所列舉成份中之一種或其組合一起併入合適溶劑中，接著過濾殺菌來製備無菌可注射溶液。一般而言，藉由將上清液或可溶性因子併入含有鹼性分散介質及來自上文所列舉成份的所需其他成份之無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌散劑的狀況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其自其先前無菌過濾溶液產生活性成份加上任何其他所要成份的粉末。根據本發明之一可選擇方面，上清液或可溶性因子可與一或多種增加其溶解性之其他化合物一起調配。
細胞組合物
在一具體實例中，本發明之細胞組合物以未分化細胞形式(亦即，在生長培養基中培養時)投予。或者，細胞 組合物可在培養之後投予。
適用於本發明之細胞組合物可單獨投予或以與其他細胞之混合物形式投予。可連同本發明之組合物一起投予之細胞包括(但不限於)其他多潛能或多能細胞或軟骨細胞、軟骨母細胞、骨細胞、骨母細胞、破骨細胞、骨內膜細胞、幹細胞或骨髓細胞。不同類型之細胞可與本發明之組合物在投藥前即刻或不久混合，或其可在投藥之前一起共培養一段時間。
在本發明之一些具體實例中，可能不需要或不欲在開始使用細胞組合物進行治療之前對患者進行免疫抑制。因此，在某些情況下可容許移植同種異體或甚至異種MPC或其後代細胞。
然而，在其他情況下可能希望或適宜在開始細胞治療之前以藥理學方式對患者進行免疫抑制。此可經由使用全身性或區域性免疫抑制劑來實現，或其可藉由在封裝裝置中傳遞細胞來實現。細胞可封裝在膠囊中，該膠囊可透過細胞及治療因子所需之營養物及氧，而細胞不透過免疫體液因子及細胞。密封劑較佳具有低過敏性且容易及穩定地定位於標靶組織中，且向植入結構提供增加之保護作用。用於減少或消除對移植細胞之免疫反應之此等及其他方式在此項技術中已知。作為替代方法，細胞可經遺傳修飾以減小其免疫原性。
總則
「治療有效量」係指在必要劑量且歷時必要時段之情 況下有效實現所要效果之量。
「預防有效量」係指在必要劑量且歷時必要時段之情況下有效實現所要預防結果(諸如，預防或抑制細胞凋亡或組織損傷)之量。
待投予之上清液或可溶性因子或MPC或其後代細胞之量可根據諸如個體之疾病病況、年齡、性別及體重之因素而變。可調節給藥方案以提供最佳治療反應。舉例而言，可投予單次劑量(single bolus)，可隨時間投予若干分次劑量，或可如治療情形之緊急狀態所指示按比例減少或增加劑量。將非經腸組合物調配為單位劑型可為有利的，以易於投藥及達成劑量均一性。如本文所用之「單位劑型」係指適合作為待治療之個體之單一劑量的物理離散單位；各單位含有經計算產生與所需醫藥載劑相關之所要治療效果之預定量之活性化合物。
應瞭解上清液或可溶性因子或MPC或其後代細胞可以包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑之組合物形式投予。
如本文所用之「醫藥學上可接受之載劑」或「賦形劑」包括任何及所有生理上相容之溶劑、分散介質、塗層、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。在一具體實例中，載劑適於非經腸投藥。或者，載劑可適於靜脈內、腹膜內、肌肉內、舌下或經口投藥。醫藥學上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌散劑。該等用於醫藥活性物質之介質及試劑之用途在此項技術中熟知。除非任何習知介 質或試劑與活性化合物不相容，否則涵蓋其在本發明之醫藥組合物中之用途。補充性活性化合物亦可併入組合物中。
治療組合物通常在製備及儲存條件下應為無菌且穩定的。可將組合物調配為溶液、微乳液、脂質體或其他有序結構。載劑可為含有例如以下物質之溶劑或分散介質：水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其合適混合物。適當流動性可(例如)藉由使用諸如卵磷脂之塗層來維持，在分散液之狀況下藉由維持所需粒徑來維持及藉由使用界面活性劑來維持。在多種狀況下，組合物中較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如，甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括延遲吸收之試劑(例如，單硬脂酸鹽及明膠)來達成。此外，可在延時釋放調配物(例如，包括緩釋聚合物之組合物)中投予刺激因子。可用防止化合物快速釋放之載劑(諸如受控釋放調配物，包括植入物及微囊封傳遞系統)來製備活性化合物。可使用生物可降解之生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸及聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(PLG)。用於製備該等調配物之多種方法已被授予專利或一般為熟習此項技術者所已知。
上清液或可溶性因子或細胞組合物可與合適基質組合投予(例如)以提供可溶性因子之緩釋。
基質物質之選擇係基於生物相容性、生物可降解性、機械性質、美觀及界面性質。用於組合物之潛在基質可為 生物可降解及經化學定義之硫酸鈣、磷酸三鈣、羥磷灰石、聚乳酸及聚酸酐。其他潛在物質可生物可降解且在生物學上明確定義，諸如骨或皮膠原蛋白。其他基質包含純蛋白質或胞外基質組份。其他潛在基質為非生物可降解且經化學定義，諸如燒結羥磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽或其他陶瓷。基質可包含任何以上提及類型物質之組合，諸如聚乳酸與羥磷灰石或膠原蛋白與磷酸三鈣。生物陶瓷可在組成(諸如，鈣－鋁酸鹽－磷酸鹽)及加工上有所改變以改變孔徑、粒徑、顆粒形狀及生物可降解性。
來源於MPC之上清液或可溶性因子、MPC或其後代細胞可藉由外科手術植入、注射、傳遞(例如，經由導管或注射器)或以其他方式直接或間接投至需要修補或增強之部位。來源於MPC之上清液或可溶性因子之投藥途徑包括肌肉內、眼、非經腸(包括靜脈內)、動脈內、皮下、經口及經鼻投藥。非經腸投藥之特定途徑包括(但不限於)肌肉內、皮下、腹膜內、腦內、心室內、腦室內、鞘內、腦池內、脊柱內及/或髓周投藥途徑。
在本發明之一些具體實例中，調配物包含原位可聚合凝膠，如(例如)US 2002/0022676；Anseth等人(2002)及Wang等人(2003)中所述。
在一些具體實例中，聚合物至少部分可溶於具有帶電側基之水溶液(諸如，水、緩衝鹽溶液或乙醇水溶液)或其單價離子鹽中。具有可與陽離子反應之酸性側基之聚合物的實例為聚(磷氮烯)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙 烯酸與甲基丙烯酸之共聚物、聚(乙酸乙烯酯)及磺化聚合物，諸如磺化聚苯乙烯。亦可使用藉由使丙烯酸或甲基丙烯酸與乙烯基醚單體或聚合物反應而形成之具有酸性側基之共聚物。酸性基團之實例為羧酸基、磺酸基、鹵化(較佳氟化)醇基、酚系OH基團及酸性OH基團。
具有可與陰離子反應之鹼性側基之聚合物的實例為聚(乙烯胺)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基咪唑)及一些亞胺基取代之聚磷氮烯。聚合物之銨鹽或季銨鹽亦可由主鏈氮或側接亞胺基形成。鹼性側基之實例為胺基及亞胺基。
海藻酸鹽可與二價陽離子在室溫下在水中離子交聯以形成水凝膠基質。由於此等溫和條件，所以如(例如)US 4,352,883中所述，海藻酸鹽已成為最常用於融合瘤細胞封裝之聚合物。在US 4,352,883中所述之過程中，將含有待封裝之生物物質之水溶液懸浮於水溶性聚合物之溶液中，使該懸浮液形成液滴，該等液滴藉由與多價陽離子接觸而組態形成離散微囊，接著使微囊表面與聚胺基酸交聯以形成圍繞經封裝物質之半透膜。
聚磷氮烯為主鏈由交替單鍵及雙鍵隔開之氮及磷組成的聚合物。各磷原子與兩個側鏈共價鍵結。
適於交聯之聚磷氮烯具有為酸性且能夠與二價或三價陽離子形成鹽橋之大部分側鏈基團。較佳酸性側基之實例為羧酸基及磺酸基。水解穩定之聚磷氮烯係由具有藉由二價或三價陽離子(諸如，Ca2＋ 或Al3＋ )交聯之羧酸側基之單體形成。可合成藉由併入具有咪唑、胺基酸酯或甘油側基 之單體而水解降解之聚合物。例如，可合成在室溫或低於室溫下在水性介質中與溶解之多價陽離子交聯以形成水凝膠基質的聚陰離子聚[雙(羧酸酯基苯氧基)]磷氮烯(PCPP)。
生物可降解聚磷氮烯具有至少兩種不同類型之側鏈：能夠與多價陽離子形成鹽橋之酸性側基及在活體內條件下水解之側基，例如咪唑基、胺基酸酯、甘油及葡糖基。
側鏈水解導致聚合物腐蝕。水解側鏈之實例為未經取代及經取代之咪唑及基團經由胺基鍵聯與磷原子鍵結之胺基酸酯(兩個R基團均以此方式連接之聚磷氮烯聚合物稱為聚胺基磷氮烯)。對於聚咪唑磷氮烯而言，聚磷氮烯主鏈上之一些「R」基團為咪唑環，其經由環氮原子與主鏈中之磷連接。其他「R」基團可為不參與水解之有機殘基，諸如甲基苯氧基或Allcock等人(1977)之科學論文中所示之其他基團。合成水凝膠物質之方法以及用於製備該等水凝膠之方法在此項技術中已知。
來源於MPC之上清液或可溶性因子、MPC或其後代細胞可與其他有益藥物或生物分子(生長因子、營養因子)一起投予。當與其他藥劑一起投予時，其可在單一醫藥組合物中一起投予或在獨立醫藥組合物中與其他藥劑同時或相繼投予(在投予其他藥劑之前或之後)。可共投予之生物活性因子包括：抗細胞凋亡劑(例如，EPO、EPO模擬體、TPO、IGF-I及IGF-II、HGF、卡斯蛋白酶(caspase)抑制劑)；消炎劑(例如，p38 MAPK抑制劑、TGF-β抑制劑、斯達汀(statin)、IL-6及IL-1抑制劑、吡嘧司特 (PEMIROLAST)、曲尼司特(TRANILAST)、雷米卡德(REMICADE)、西羅莫司(SIROLIMUS)及NSAID(非類固醇消炎藥；例如，替泊沙林(TEPOXALIN)、托美丁(TOLMETIN)、舒洛芬(SUPROFEN)))；免疫抑制/免疫調節劑(例如鈣調神經磷酸酶(calcineurin)抑制劑，諸如環孢素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)；mTOR抑制劑(例如，西羅莫司(SIROLIMUS)、埃羅莫司(EVEROLIMUS)))；抗增殖劑(例如，硫唑嘌呤(azathioprine)、黴酚酸酯(mycophenolate mofetil))；皮質類固醇(例如，潑尼龍(prednisolone)、氫皮質酮(hydrocortisone))；抗體，諸如單株抗IL－2Rα受體抗體(例如，巴利昔單抗(basiliximab)、達利珠單抗(daclizumab))、多株抗T細胞抗體(例如，抗胸腺細胞球蛋白(ATG)；抗淋巴細胞球蛋白(ALG)；單株抗T細胞抗體OKT3)；抗血栓形成劑(例如，肝素、肝素衍生物、尿激酶、PPack(右旋苯基丙胺酸脯胺酸精胺酸氯甲基酮)、抗凝血酶化合物、血小板受體拮抗劑、抗凝血酶抗體、抗血小板受體抗體、阿司匹林(aspirin)、雙嘧達莫(dipyridamole)、魚精蛋白(protamine)、水蛭素(hirudin)、前列腺素抑制劑及血小板抑制劑)；及抗氧化劑(例如，普羅布可(probucol)、維生素A、抗壞血酸、生育酚、輔酶Q－10、麩胱甘肽、L－半胱胺酸、N－乙醯半胱胺酸)以及局部麻醉劑。作為另一實例，來源於MPC之上清液或可溶性因子、MPC或其後代細胞可與如US 5,827,735中所述之 疤痕抑制因子共投予。
當治療及/或預防由結締組織退化及/或發炎引起之疾病時，上清液、可溶性因子或細胞較佳與軟骨保護劑一起投予。實例包括(但不限於)戊聚糖多硫酸酯(SP54及卡托酚(cartrophen))、葡糖胺聚糖多硫酸酯(阿特帕隆(Arteparon))、糖基胺基-聚醣-肽複合物(乳瑪隆(Rumalon))及玻糖醛酸(海蘭(Hyalgan))。其他實例由Verbruggen(2005)及Richette及Bardin(2004)描述。在一較佳具體實例中，軟骨保護劑為玻糖醛酸。
纖維蛋白膠
纖維蛋白膠為已用於各種臨床環境之一類外科手術密封劑。如熟習者所瞭解，大量密封劑適用於本文所定義之方法。然而，本發明之一較佳具體實例係關於纖維蛋白膠之用途。
當用於本文中時，術語「纖維蛋白膠」係指由纖維蛋白聚合物在鈣離子存在下交聯而形成之不可溶基質。纖維蛋白膠可由來源於形成纖維蛋白基質之生物組織或體液之纖維蛋白原或其衍生物或代謝物、纖維蛋白(可溶性單體或聚合物)及/或其複合物形成。或者，纖維蛋白膠可由藉由重組DNA技術產生之纖維蛋白原或其衍生物或代謝物或纖維蛋白形成。
纖維蛋白膠亦可藉由纖維蛋白原與纖維蛋白膠形成催化劑(諸如，凝血酶及/或因子XIII)之相互作用形成。如熟習此項技術者所應瞭解，纖維蛋白原在催化劑(諸如， 凝血酶)存在下蛋白水解裂解且轉變為纖維蛋白單體。接著纖維蛋白單體可形成可交聯以形成纖維蛋白膠基質之聚合物。纖維蛋白聚合物之交聯可藉由催化劑(諸如，因子XIII)之存在而增強。纖維蛋白膠形成催化劑可來源於血漿、低溫沈澱物或含有纖維蛋白原或凝血酶之其他血漿部份。或者，催化劑可藉由重組DNA技術產生。
凝塊形成之速率視與纖維蛋白原混合之凝血酶的濃度而定。作為酶依賴性反應，溫度愈高(至多37℃)，凝塊形成速率愈快。凝塊之拉伸強度視所用纖維蛋白原之濃度而定。
纖維蛋白膠之用途及其製備及使用之方法由Hirsh等人描述於美國專利第5,643,192號中。Hirsh揭示自單一供體萃取纖維蛋白原及凝血酶組份且僅此等組份之組合用作纖維蛋白膠。Marx之美國專利第5,651,982號描述纖維蛋白膠之另一種製備及使用方法。Marx提供具有脂質體之纖維蛋白膠用作哺乳動物中之局部密封劑。用於創傷癒合之局部纖維蛋白原複合物(TFC)之製備及用途在此領域中已知。美國紅十字會(American Red Cross)之國際專利公開案第W096/17633號討論含有纖維蛋白原、凝血酶及氯化鈣之TFC製劑。
若干公開案描述纖維蛋白膠用於傳遞治療劑之用途。舉例而言，美國專利4,983,393揭示一種用作陰道內插入物之組合物，其包含瓊脂糖、瓊脂、鹽水溶液、葡糖胺聚糖、膠原蛋白、纖維蛋白及酶。此外，美國專利3,089,815揭示 一種由纖維蛋白原及凝血酶組成之可注射醫藥製劑，且美國專利6,468,527揭示一種促進傳遞各種生物及非生物藥劑至身體內特定部位之纖維蛋白膠。
遺傳修飾細胞之產生
在一具體實例中，本發明之方法中所用的細胞(包括用於產生上清液或可溶性因子)係經遺傳修飾。較佳地，細胞經遺傳修飾以產生異源蛋白質。通常，細胞經遺傳修飾以使得自該等細胞分泌異源蛋白質。然而，在一具體實例中，細胞可經修飾以表現功能性非蛋白質編碼聚核苷酸(諸如dsRNA(通常用於RNA沉默))、反義寡核苷酸或催化性核酸(諸如，核糖酶或DNAzyme)。
經遺傳修飾之細胞可在足以支持經修飾之細胞生長之量的至少一種細胞因子存在下培養。因此獲得之經遺傳修飾之細胞可即刻使用(例如，移植中)，試管內培養及擴增，或儲存以備以後使用。經修飾之細胞可藉由此項技術中熟知之方法儲存，例如在液氮中冷凍。
如本文所用之遺傳修飾包涵包括將外源或外來聚核苷酸引入本文所述之細胞中或修飾細胞內的內源基因的任何遺傳修飾方法。遺傳修飾包括(但不限於)轉導(試管內或活體內，病毒介導之宿主DNA自宿主或供體轉移至接受者)、轉染(以分離之病毒DNA基因組使細胞轉型)、脂質體介導之轉移、電穿孔、磷酸鈣轉染或共沈澱及其他方法。轉導方法包括將細胞與生產細胞直接共培養(Bregni等人,1992)或在合適生長因子及聚陽離子下或無合適生長 因子及聚陽離子之情況下僅用病毒上清液培養。
較佳以載體將外源聚核苷酸引入細胞中。載體較佳包括轉錄及轉譯所插入編碼序列之必要元件。用以構築該等載體之方法在此項技術中熟知。舉例而言，用於構築合適表現載體之技術詳細描述於Sambrook等人,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.(第3版,2000)；及Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York(1999)中。
載體可包括(但不限於)：病毒載體，諸如逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒及單純疱疹病毒；黏接質體；質體載體；合成載體；及此項技術中通常所用之其他重組媒介。含有啟動子及聚核苷酸可操作性連接於其中之選殖位點兩者的載體在此項技術中熟知。該等載體能夠試管內或活體內轉錄RNA且可購自諸如Stratagene(La Jolla,Calif)及Promega Biotech(Madison,Wis)之來源。特定實例包括來自Stratagene之pSG、pSV2CAT、pXtl及來自Pharmacia之pMSG、pSVL、pBPV及pSVK3。
較佳載體包括逆轉錄病毒載體(參見Coffin等人,「Retroviruses」,第9章第437－473頁,Cold Springs Harbor Laboratory Press,1997)。適用於本發明之載體可藉由此項技術中熟知之程序重組產生。舉例而言，WO94/29438、WO97/21824及WO97/21825描述逆轉錄病毒包裝質體及包裝細胞系之構築。例示性載體包括pCMV哺乳動物表現載 體，諸如pCMV6b及pCMV6c(Chiron Corp.)、pSFFV－Neo及pBluescript－Sk＋。適用逆轉錄病毒載體之非限制性實例為來源於鼠類、鳥類或靈長類動物逆轉錄病毒之彼等載體。常見逆轉錄病毒載體包括基於莫洛尼氏鼠白血病毒(Moloney murine leukemia virus)之彼等載體(MoMLV－載體)。其他來源於MoMLV之載體包括Lmily、LINGFER、MINGFR及MINT。其他載體包括基於長臂猿白血病毒(GALV)及莫洛尼氏鼠肉瘤病毒(MOMSV)及脾灶形成病毒(SFFV)之彼等載體。來源於鼠類幹細胞病毒(MESV)之載體包括MESV－MiLy。逆轉錄病毒載體亦包括基於慢病毒之載體，且非限制性實例包括基於人類免疫缺陷病毒(HIV－1及HIV－2)之載體。
在產生逆轉錄病毒載體構築體時，可自病毒中移除病毒gag、pol及env序列，產生用於插入外來DNA序列之空間。由外來DNA編碼之基因通常在長末端重複序列(LTR)中之強病毒啟動子控制下表現。合適控制調節序列之選擇視所用宿主細胞而定且選擇在熟習此項技術者技能內。除LTR之啟動子外，亦已知大量啟動子。非限制性實例包括：噬菌體λPL啟動子、人類細胞巨大病毒(CMV)極早期啟動子；莫洛尼氏鼠肉瘤病毒(MMSV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)或脾灶形成病毒(SFFV)之U3區啟動子；顆粒酶A(Granzyme A)啟動子；及顆粒酶B啟動子。此外可使用誘導性或多重控制元件。合適啟動子之選擇對熟習此項技術者而言顯而易見。
若gag、pol及env功能藉由包裝細胞系以反式提供，則此類構築體可有效包裝至病毒粒子中。因此，當將載體構築體引入包裝細胞中時，由細胞產生之gag－pol及env蛋白質與載體RNA一起組裝以產生分泌至培養基中之感染性病毒。由此產生之病毒可感染且整合至靶細胞之DNA中，但因為其缺乏基本包裝序列，所以不產生感染性病毒粒子。已用獨立質體轉染目前使用之大部分包裝細胞系，各質體含有必要編碼序列中之一者，以便使得在可產生重複感受態病毒之前多次重組事件為必需的。或者，包裝細胞系具有原病毒。已將原病毒損壞，以便使得雖然其可產生組裝感染性病毒所需之所有蛋白質，但其自身RNA不可包裝至病毒中。實情為，由重組病毒產生之RNA得以包裝。因此，自包裝細胞釋放之病毒族群僅含有重組病毒。逆轉錄病毒包裝細胞系之非限制性實例包括PA12、PA317、PE501、PG13、PSI.CRIP、RDI 14、GP7C－tTA－G10、ProPak－A(PPA－6)及PT67。
其他合適載體包括腺病毒載體(參見WO 95/27071)及腺相關病毒載體。此等載體均在此項技術中熟知，(例如)如Stem Cell Biology and Gene Therapy,Quesenberry等人編,John Wiley & Sons,1998；及美國專利第5,693,531號及第5,691,176號中所述。在某些情況下使用來源於腺病毒之載體可為有利的，此係因為其不能夠感染非分裂細胞。不同於逆轉錄病毒DNA，腺病毒DNA不整合至靶細胞之基因組中。此外，與逆轉錄病毒載體相比，腺病毒載體中攜帶 外來DNA之能力大得多。腺相關病毒載體為另一種適用傳遞系統。此病毒之DNA可整合至非分裂細胞中，且已使用腺相關病毒載體將許多聚核苷酸成功地引入不同細胞類型中。
在一些具體實例中，構築體或載體將包括兩種或兩種以上異源聚核苷酸序列。較佳地，其他核酸序列為編碼選擇性標記物、結構基因、治療基因或細胞因子/趨化因子基因之聚核苷酸。
選擇性標記物可包括在構築體或載體中以達成監測成功遺傳修飾及選擇整合有DNA之細胞的目的。非限制性實例包括抗藥性標記物，諸如G148或潮黴素(hygromycin)。此外，可使用負選擇，例如其中標記物為HSV－tk基因。此基因將產生對諸如阿昔洛韋(acyclovir)及更昔洛韋(gancyclovir)之藥劑敏感的細胞。通常使用NeoR(新黴素(neomycin)/G148抗性)基因，但可使用基因序列先前不存在於靶細胞中之任何適宜標記基因。此外，非限制性實例包括低親和力神經生長因子(NGFR)、增強型綠色螢光蛋白(EFGP)、二氫葉酸還原酶基因(DFIFR)、細菌hisD基因、鼠類CD24(HSA)、鼠類CD8a(lyt)、賦予對嘌呤黴素(puromycin)或腐草黴素(phleomycin)之抗性之細菌基因及β－半乳糖苷酶。
其他聚核苷酸序列可在同一載體上引入細胞中，或可在第二載體上引入宿主細胞中。在一較佳具體實例中，將在與聚核苷酸相同之載體上包括選擇性標記物。
本發明亦包涵遺傳修飾內源基因之啟動子區以使得內源基因之表現受到上調，使得與野生型細胞相比，所編碼蛋白質之產生增加。
實施例 實施例1：經免疫選擇MPC之擴增及上清液之收集
自不足2歲之綿羊採收骨髓(BM)。簡言之，自前髂骨脊吸出40 ml BM至含鋰－肝素抗凝血劑之管中。如先前所述(Zannettino等人,1998)，藉由使用Lymphoprep TM (Nycomed Pharma,Oslo,Norway)進行密度梯度分離來製備BMMNC。在4℃下以400×g離心30分鐘後，用移液管將淡黃色層移出且在由含有5%胎牛血清(FCS,CSL Limited,Victoria,Australia)之漢克斯平衡鹽溶液(Hank's balanced salt solution)(HBSS；Life Technologies,Gaithersburg,MD)組成的「HHF」中洗滌3次。
接著如先前所述(Gronthos等人,2003；Gronthos等人,1995)，藉由磁性活化細胞分選術分離TNAP＋。簡言之，將約1－3×108 個BMMNC在由HHF中之10%(v/v)正常兔血清組成之阻斷緩衝液中在冰上培育20分鐘。將細胞用200 μl於阻斷緩衝液中之10 μg/ml STRO－3 mAb溶液在冰上培育1小時。接著藉由以400×g離心，將細胞在HHF中洗滌兩次。添加山羊抗小鼠γ－生物素(Southern Biotechnology Associates,Birmingham,UK)於HHF緩衝液中之1/50稀釋液且將細胞在冰上培育1小時。將細胞在如上MACS緩衝液(補充有1% BSA、5 mM EDTA及0.01%疊氮化鈉之無 Ca2＋ －及Mn2＋ －之PBS)中洗滌兩次且再懸浮於最終體積為0.9 ml之MACS緩衝液中。
將100 μl抗生蛋白鏈菌素微珠(Miltenyi Biotec；Bergisch Gladbach,Germany)添加至細胞懸浮液中且在冰上培育15分鐘。將細胞懸浮液洗滌2次且再懸浮於0.5 ml MACS緩衝液中，且接著加樣至微型MACS管柱(MS Columns,Miltenyi Biotec)上，且用0.5 ml MACS緩衝液洗滌3次，以回收未結合STRO－3 mAb(於2005年12月19日以寄存編號PTA－7282寄存於美國典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)－參見WO/2006/108229)之細胞。在添加另外1 ml MACS緩衝液後，自磁體移出管柱且藉由正壓分離TNAP－陽性細胞。可用抗生蛋白鏈菌素－FITC將來自各溶離份之細胞之等分試樣染色且藉由流式細胞儀評估純度。
如先前所述(Gronthos等人,1995)，藉由塗鋪於補充有20%胎牛血清、2 mM L－麩胺醯胺及100 μm L－抗壞血酸－2－磷酸鹽之α－MEM中，自MACS分離TNAP＋細胞建立初級培養物。
將細胞培養至繼代5，此時可收集條件培養基(上清液)。
實施例2：關於同種異體免疫選擇之間葉前驅細胞(MPC)對成年閹割雄綿羊(閹羊)中藉由兩側全部內側半月板切除術誘發之早期OA之模型中軟骨完整性的劑量依賴性關節內作用之研究。
膝關節半月板或半月軟骨為重要負重結構，其亦用以改良關節軟骨潤滑且在關節接合期間提供側面穩定。外科手術移出撕裂或退化之半月板(亦即，半月板切除術)為常見矯形程序，但已知其與以後多年中骨關節炎(OA)危險增加有關(Englund,2004)。已知在先前由外科手術切除之半月板佔據之空間中關節滑膜之機械夾帶引起半月板複製品部分再生(Moon等人,1984)。然而，犬中實驗性半月板切除術研究之結果表明此等替換結構基本上由生物力學性質遠差於原始半月板之纖維組織組成(Ghosh等人,1983)。此外，在半月板切除術後6個月此等實驗動物之關節中OA發展程度相對嚴重，證實關節軟骨上重新長出之結構所提供之功能性保護有限(Ghosh等人,1983a)。OA之大型及小型動物模型已允許縱向評估使用人類患者難以獲得的此疾病發展期間出現之關節組織空間及時間變化(Smith及Ghosh,2001)。在美利奴綿羊(merino sheep)中，已展示外側或內側半月板切除術可靠地再現代表OA之生物化學、生物力學及組織病理學改變(Smith及Ghosh,2001)。羊OA模型亦已廣泛用以研究各種模式之手術後處理之結果(Ghosh,1991；Smith及Ghosh,2001)，但迄今為止，尚未用以評估半月板再生長及OA發展及此等事件可如何受關節內間葉前驅細胞(MPC)療法影響。
先前研究已顯示美利奴綿羊中兩側全部內側半月板切除術(BTM)導致關節軟骨(AC)、軟骨下骨及滑膜組織的病理學改變，該等改變為漸進的且模擬早期人類骨關節 炎(OA)之發展。預先使用此動物模型來評估潛在的改良疾病之OA藥物。
方法
在36隻成年美利奴閹羊中進行BTM。BTM後兩週，將關節用2 mL高MW玻尿酸(HA)或懸浮於2 mL HA中之2 mL同種異體Stro－3＋MPC隨機注射。研究四種MPC劑量：組A＝10×106 (mil)個MPC[n＝6]；組B＝25 mil個MPC[n＝6]；組C＝100 mil個MPC[n＝18]且組D＝150 mil個MPC[n＝6]。將組A、B及D在BTM後12週犧牲，而組C在BTM後12週[n＝6]、24週[n＝6]及52週[n＝6]犧牲。
屍檢時，藉由2個不知情觀測者針對AC病變及骨贅(OP)使用0－4級別對兩個BTM關節之內側隔室評分。將滑膜組織及5 mm寬冠狀骨軟骨片自股骨及脛骨之中線移出，且進行處理且使用所列舉之方法針對組織病理學變化(Little等人,1997)及組織形態計量學分析(Cake等人,2003)評分。
使來自所有關節之完整膝蓋骨經受局部解剖學生物力學壓痕研究以測定關節軟骨之硬度及相位滯後(Appleyard等人,2003)。
使用Kruskal－Wallis非參數分析進行處理效果之統計分析，且使用Mann Whitney U非參數分析進行特定組間比較之統計分析，其中認為p<0.05具顯著性。
使用同等差異雙尾學生T檢驗(equal variance two tailed Student's T－Test)進行用於各組注射MPC＋HA及注 射HA關節之組平均值之間的比較之統計分析，其中認為p<0.05具顯著性。
使用獨立T檢驗進行用於各組注射MPC＋HA(經處理)及注射HA關節之膝蓋骨軟骨之間的比較之統計分析，其中認為p<0.05具顯著性。
結果
BTM後12週總體形態學評分展示MPC對AC完整性及OP形成具有劑量依賴性作用；相對於單獨HA，100 mil個MPC呈現為最有效之軟骨保護性劑量(圖1及2)。總AC評分比率(HA＋MPC)/(HA)展示100>150>25＝10，而OP比率為100＝25>10>150 mil個MPC(圖3及4)。對於總股骨及脛骨AC，觀測到統計上顯著(SS)較低之評分(p＝0.02)，而對於組C MPC股骨軟骨，與單獨HA相比，觀測到p＝0.052(圖1)。
組C MPC＋HA脛骨坪之組織形態計量學分析揭示AC比中間(p＝0.057)及外部區域(p＝0.028)中之相應HA－AC厚；所有區域(p＝0.01)(圖5)。來自組C MPC＋HA關節之AC區之平均改良Mankin評分小於相應HA區，但並非SS。此外，當計算來自各組之注射HA及對側注射HA＋MPC之關節的總Mankin評分之比率且將其繪圖時，顯而易見100×106 劑量之MPC最為有效(圖6)。
藉由研究注射後22週及50週(亦即，半月板切除術後24週及52週)組織之形態學、組織學及生物力學性質來解決100×106 個MPC劑量在保持關節軟骨完整性方面之 持續性的問題。如自圖7及8顯而易見，HA及HA＋100×106 個MPC之形態學評分的平均值之間的差異隨時間減小，儘管在24週時一些證據證明治療效果。此觀點由表明細胞在抑制骨贅評分方面具有更強效果歷時至多52週的HA/MPC＋HA資料支持(圖10及11)。另一方面，Mankin組織病理學評分之類似圖展示截至52週，MPC之保護作用喪失(圖11)。
一般而言，關於來自所有動物組之關節之膝蓋骨軟骨的生物力學壓痕研究與形態學及組織學資料一致。然而，軟骨硬度受軟骨厚度影響，軟骨厚度在受傷早期可肥厚但隨時間正常化。此情況可能發生在本發明之模型中，此係因為針對25×106 及100×106 個MPC組所測定之膝蓋骨軟骨硬度顯著小於10×106 及150×106 個MPC組，10×106 及150×106 MPC組自其他研究展示最受損組織(圖12及13)。此解釋藉由相位滯後資料支持，相對於注射HA之相應關節及150×106 個MPC劑量兩者，對於來自100×106 個MPC組之膝蓋骨而言相位滯後資料顯著較低(圖14)。此外，發現在12週觀測到之平均相位滯後值在半月板切除術後24週及52週顯著增加，證實超過6－12月注射之MPC之適用治療效果喪失(圖15)。相位滯後反映軟骨胞外基質之分子組裝，且角度(相位)愈低，彈性及因此自變形恢復之能力愈大(Cake等人,2005)。
觀測到注射100 mil個MPC之關節的軟骨保護性效果隨時間減小；在12週及24週指示正面效果，截至52週BTM 喪失。
無證據證明滑膜組織病理學調節。對此等動物進行之臨床及總體器官病理學尚未展示任何證明MPC之全身性不利影響的證據。
結論
就所瞭解而言，此為第一次報導同種異體MPC對早期OA之模型中軟骨完整性具有有益治療效果。已知MPC釋放生長因子及細胞因子且亦抑制其他細胞產生TNF－α，同時上調消炎細胞因子(例如，IL－4、IL－10)。MPC之此等旁分泌活性可刺激新基質之軟骨細胞生物合成，且亦減少分解代謝介體之局部產生及活性。在此研究中100×106 個MPC具有軟骨保護性之發現與此類作用機制一致。在此等綿羊研究中產生之資料表明藉由單次關節內注射100×106 個MPC所介導之軟骨保護性效果之持續時間在治療後6－12個月之間，表明對於長期控制OA患者而言可能需要多次注射。
雖然關節內注射HA廣泛用於治療膝蓋骨關節炎，但證明此療法具有軟骨保護性之證據有限(Ghosh等人,2002)。然而，據報導關節內HA療法提供OA之症狀減輕，其開始緩慢，但比關節內皮質類固醇持續得久(Bellamy等人,2006)。
實施例3：關節內注射玻尿酸(HA)或100×10 6 個間葉前驅細胞(MPC)＋HA對切除卵巢之母羊之膝關節中由兩側全部內側半月板切除術誘發的嚴重骨關節炎之模型中 軟骨完整性的相對治療效果。
膝關節半月板在保護關節軟骨(AC)以防正常關節接合期間損傷中起重要作用(Arnoczky等人,1988)。在人類中在半月板受傷後將其全部或部分切除一般導致AC過早退化且發展成骨關節炎(OA)(Jorgensen等人,1987；Roos等人,1998及McNicholas等人,2000)。實驗研究已展示綿羊中單側或兩側全部半月板切除術亦引起AC過早損壞及OA早期發作(Ghosh等人,1990；Appleyard等人,1999及Ghosh等人,1993c)。
因為半月板切除之關節中AC破壞為高集中性及剪切應力強加於軟骨之結果，所以發現與單側半月板切除術(其中藉由使用對側未進行手術之後肢可容納支撐性無疼痛負重)相比，兩側半月板切除術誘發更快速之軟骨退化發展(Ghosh等人,1993a及1993b；Appleyard等人,2003；Little等人,1997及Oakley等人,2004)。此外，亦已展示與成年閹割雄性(閹羊)相比，經受兩側半月板切除術之切除卵巢之母羊經歷更快發展之OA，在很大程度上係因為其缺乏軟骨保護性激素雌激素之循環(Parker等人,2003)。針對此等原因，切除卵巢及雙側半月板切除之母羊有利地作為研究抗OA藥劑之改善疾病活性的OA之大型動物模型(Ghosh等人,1993；Smith等人,1997；Burkhardt等人,2001；Hwa等人,2001及Cake等人,2000)。因此，選擇具有OA之切除卵巢/雙側半月板切除之綿羊模型用於本發明之研究－達成評估相對於目前使用之抗OA療法關節內 (IA)玻尿酸(HA)，IA投予同種異體間葉前驅細胞(MPC)對誘發富含蛋白聚糖之軟骨生長或再生及軟骨保護作用的效果之目的。
方法
使用公開之方法(Cake等人，1004)，在18隻預先3個月經受卵巢切除術之成年美利奴母羊中進行兩側全部內側半月板切除術(BTM)。用於BTM之外科手術程序及手術後方案與針對實施例2中所述之閹割雄羊BTM研究所述的程序及方案相同。
BTM後12週，犧牲6隻母羊，同時將剩餘12隻半月板切除之母羊之後膝(膝蓋)關節隨機注射2mL高MW HA或懸浮於2mL Profreeze®加上2mL HA中之100×106個MPC。在實施例2中MPC+HA之此劑量展示在BTM雄綿羊模型中提供最有益之軟骨保護性作用。將經半月板切除及注射之母羊分成兩組(6隻一組)，在BTM後24週及36週(亦即HA或MPC+HA關節內注射後12週及24週)犧牲。為測定性別對AC關節不穩定之反應的影響，亦使6隻未經處理之閹割雄綿羊經受BTM且在半月板切除術後12週犧牲。
屍檢時，打開關節，移出半月板且拍攝內側股骨及脛骨坪之照片。藉由2個不知情觀測者針對軟骨之總體形態變化使用0-4級別，對所記錄之影像評分。將來自髕上襞之滑膜及5mm寬冠狀骨軟骨片自各關節之股骨及脛骨之中線移出，且進行處理以製備組織切片。藉由2個不知情觀 測者使用如前所述之經改良Mankin評分系統(Little等人,1997)評估軟骨組織病理學。使用近來Cake等人,2008所述之標準對滑膜組織病理學評分。
來自與用於Mankin評分之軟骨塊相同之軟骨塊的組織連續切片亦用於如前所述之組織形態計量學分析(Caket等人,2000；Cake等人,2004)。此技術採用電腦輔助之影像分析(ImagePro Plus v.3.0,Media Cybernetics)以產生關於經甲苯胺藍(Toluidine blue)染色之AC之尺寸及蛋白聚糖含量指數的定量資料。簡言之，經由Microtek Slidescanner 35t plus(Microtek型號PTS－1950)以1300 dpi之解析度獲得染色切片之影像，且接著在個人電腦上使用Image J軟體(http：//rsb.info.nih.gov/ij/ )進行分析。將股骨及脛骨切片之數位影像再分成內部、中間及外部區域，各區域表示軟骨切片總面積之約三分之一。藉由掃描10×10 mm高精確度十字線來實現系統之空間校準。接著此刻度用於測定輸入影像之各區域的長度(mm)及面積(mm2 )。切片平均厚度係藉由面積除以長度來確定。TB染色軟骨切片之光學密度(OD)以平均灰度值(MGV)形式獲得(總灰度值/像素數)且作為蛋白聚糖(PG)含量之指數。積分灰階密度(IGD)計算為MGV×切片區域面積。雖然所用灰階系統未針對具有已知PG含量之TB染色切片獨立校準，但所有組織切片均在同一切片機上切割，具有同一厚度且作為整體使用同一染色方案處理。因此，軟骨染色之差異為相對的而非絕對的。在犧牲1小時內將來自所有關節之完整膝蓋骨移出且 立刻冷凍且儲存，接著進行局部解剖學生物力學壓痕研究以測定關節軟骨之硬度及相位滯後(Appleyard等人,2003)。
如藉由形態學及組織學評分系統評估，使用Kruskal－Wallis非參數分析進行鑑別處理結果(HA對HA＋MPC)或處理與BTM後12週未處理之對照的差異之統計分析，且使用Mann Whitney U非參數分析進行組比較之間的差異之統計分析，其中認為p<0.05具顯著性。
使用同等差異雙尾學生T檢驗評估藉由組織形態計量學分析數位化組織切片而產生之資料，其中認為p<0.05具顯著性。使用獨立T檢驗計算關於不同處理及BTM後時間之間的膝蓋骨軟骨生物力學參數之統計分析，其中認為p<0.05具顯著性。
結果
來自BTM後12週未經處理之母羊之關節中軟骨侵蝕及骨贅形成的總體形態學評估證實OA之此模型代表與經受相同外科手術程序之半月板切除之閹割雄性相比更具侵襲性及嚴重形式之疾病。對於此未經處理之雌性對照組而言，股骨之平均軟骨形態學評分為用以評估此參數之最大評分之87%且脛骨之平均軟骨形態學評分為用以評估此參數之最大評分之75%。針對來源於經受相同外科手術程序之半月板切除後12週未經處理之閹割雄性的關節所獲得之總體形態評分顯著小於切除卵巢之母羊(圖16及17)，此發現與使用兩側外側半月板切除術之先前觀測一致(Parker 等人,2003；Cake等人,2004)。
雖然兩種處理均導致24週及36週時平均股骨形態學軟骨評分低於基線半月板切除後12週未經處理之母羊(資料未圖示)，但經MPC與HA處理之關節之間未偵測到顯著差別。吾人解釋此意謂在嚴重OA之此模型中，總體形態病變(侵蝕及骨贅評分)之嚴重程度使得此等參數過於不敏感而無法偵測治療差異。
發現來自BTM後12週未經處理組之軟骨之改良Mankin組織病理學評分與如形態學上評估之軟骨損傷程度一致(圖16及17)。與形態學參數形成對比，在第36週接收MPC＋HA之切除卵巢之母羊中股骨軟骨的總平均改良Mankin評分低於僅接收HA之關節之相應評分，且展示與單獨HA相比顯著更低之細胞數目(p＝0.01)及蛋白聚糖之區域間甲苯胺藍(IT TB)染色更強之趨勢(p＝0.06)(圖18)。此等影響對於脛骨軟骨而言較不明顯(圖18)。
當測定兩種關節內處理之平均總改良Mankin評分之比率時，突顯出觀測到半月板切除術後36週注射MPC＋HA之改良Mankin組織病理學軟骨評分相對於注射HA之關節低(圖19)。因為各比率自同一動物之兩個經處理之關節獲得，所以比率＝1將表明兩種處理同等有效。然而，對於比率>1而言，可說明MPC＋HA處理更有益。如自圖19顯而易見，BTM後36週針對股骨軟骨獲得之比率之平均值顯著高於(1.71)一，而兩種處理之脛骨軟骨比率(1.12)僅略微有利於注射MPC＋HA之組(圖19)。
接著，檢查處理對Mankin評分隨時間之影響。發現在半月板切除術後24週及36週(亦即，注射後12週及24週)，在MPC＋HA與單獨HA之處理組之間對股骨軟骨之影響隨時間存在顯著差別(圖20)。在接收MPC＋HA之組中，24週及36週之平均評分逐漸低於12週基線。此係因為相對於12週未經處理之組，24週細胞選殖之評分減少及改良(P＝0.01)及36週細胞數(P＝0.04)及蛋白聚糖(PG)之區域間甲苯胺藍染色之評分減少及改良(P＝0.04)(圖20)。在單獨HA組中未見該等改良。在任何組或關節內處理之滑膜病理學評分之間未觀測到顯著差別。
圖21中展示在BTM後36週使用組織形態計量學分析方法分析作為來自注射關節之股骨髁之3個區域(內側、中間及外側)的PG含量指數之軟骨厚度、面積及TB染色強度。截至BTM後36週，處理組之間的顯著差別為明顯的。與注射HA之關節之相應軟骨相比，來自注射MPC＋HA之關節之股骨軟骨顯著更厚(圖21A)且佔據顯著更大之面積(圖21B)。如自TB染色切片之積分灰階密度確定，較大體積之來自注射MPC＋HA之關節之股骨軟骨伴隨有較高含量之蛋白聚糖(圖21C)。
再次在基於時間之分析中比較此等參數，發現在半月板切除術後24週及36週(亦即，注射後12週及24週)，在MPC＋HA與單獨HA之處理組之間對股骨軟骨之影響隨時間存在顯著差別。使用相同組織形態計量學方法，能夠證明12週及24週以後(亦即，BTM後24週及36週)， 與單獨HA相比，半月板切除術後12週投予之MPC+HA注射液引起逐漸更大之富含蛋白聚糖之股骨軟骨生長或再生(圖22至24)。因此，與來自半月板切除術後12週未經處理之關節之基線值相比，來自在12週注射MPC+HA之半月板切除之母羊關節的股骨軟骨在24週及36週顯著更厚(圖22)且一般具有較大面積(圖23)。自來源於注射HA之關節之股骨軟骨切片掃描的相應區域無法證明相對於12週未經處理之對照統計上顯著之變化(圖22及23)。相對於來自BTM後12週未經處理組之關節的相同軟骨區域，對於注射HA及MPC+HA之關節兩者而言，作為股骨軟骨切片之PG含量之量度的積分灰階密度均顯著更高，但與單獨HA相比，MPC+HA誘發之變化程度顯著更大(圖24)。儘管與基線相比，在36週MPC+HA組使富含蛋白聚糖之股骨組織生長增大幾乎60%，且此軟骨生長速率尚未達到平台期，但單獨HA組已達到平台期且僅使組織生長增大約30%。此表明相對於基線及單獨HA處理之任何時間影響，在隨後24週時段(亦即，軟骨生長及/或再生)期間用MPC+HA處理刺激富含蛋白聚糖之軟骨顯著更大增加。
關於來自經注射關節之膝蓋骨軟骨之壓痕研究結果無法證明兩種處理之軟骨生物力學性質之任何差異，但相對於半月板切除術後流逝之時間及BTM後12週未處理組，確定變化。半月板切除術後24週來自MPC+HA之膝蓋骨軟骨硬度顯著高於12週(P=0.05)及36週(P<0.01)(資料未圖示)。然而，與24週相比，36週兩種處理均產生更 厚膝蓋骨軟骨(P=0.001)，24週亦低於未經處理之12週對照(P=0.01)。與未經處理之12週對照相比，在24週及36週兩處理組之膝蓋骨軟骨相位滯後更高(P=0.001)(資料未圖示)。
討論
本發明之研究已展示切除卵巢之母羊中兩側內側半月板切除術在3個月後誘發關節軟骨之病理學改變，該等理學改病變與漸進性及嚴重OA一致。因此，股骨及脛骨軟骨之總體形態學評分為最大評分之87-70%。有趣地，經受相同外科手術程序且同時(12週)犧牲之閹割雄性展示與對切除卵巢之雌性觀測到之軟骨損害相比較不嚴重之軟骨損害。軟骨病理學之程度亦反映在針對此組觀測之高的總改良Mankin組織病理學評分，該等評分與早期OA之分配一致(Little等人，1997)。雖然先前研究已確定絕經後雌性中OA之強烈關聯(此藉由耗盡來自循環之雌激素所解釋(Roos等人，2001；Pelletier等人，2007及Nevitt等人，1996)且由切除卵巢之母羊中之研究支持(Parker等人，2003及Cake等人，2004))，但其他更近之研究表明來源於脂肪之激素瘦素可能在介導軟骨破環及OA中起更重要之作用(Dumond等人，2003及Teichtahl等人，2005)。因此，BTM後3個月時段作為評估關節內注射HA或MPC+HA對投予此等藥劑後12及24週軟骨病理學發展速率之相對影響的起點。
此研究結果表明單一關節內注射分散於2mL HA及2 mL Profreeze®(商業冷凍保護劑)中之100×106個MPC至具有確定之嚴重OA之關節中可在24週干預時段期間在比單一注射2mL HA大的程度上減緩關節病理學發展且增強富含蛋白聚糖之軟骨生長及/或再生。意外地，觀測到在大部分所檢查之參數中，由MPC介導之生長/再生及軟骨保護性效應在投予24週後比12週後顯著，表明漸進性效應尚未達到平台期。此發現之原因目前尚不清楚，然而，有可能MPC釋放之生長因子(諸如TGF-β超家族之成員，例如BMP)(Ahrens等人，1993；Aggarwal等人，2005)支援軟骨之合成代謝(補償)相以應對藉由內側半月板切除術強加在整個關節上之改變的機械應力。此觀點藉由組織形態計量學資料支持，組織形態計量學資料證明與在BTM後12週開始處理相比，在注射MPC組中存在更高量及更強烈染色之蛋白聚糖。此等基質變化與軟骨細胞生物合成增加一致。顯著地，一般發現接收MPC+HA而非單獨HA之動物之軟骨中合成代謝參數量級更大。MPC保持且甚至增強對機械性過負荷之此軟骨反應的能力與藉由許多傳統OA治療(包括類固醇及非類固醇消炎藥物(NSAID)中之多者)介導之對軟骨細胞代謝之已知抑制作用形成對照(McKenzie等人，1976；Ghosh,1988；Brandt,1993及1993a；Huskisson等人，1995)。
多次關節內HA注射已用作控制膝蓋OA之療法達30年以上。雖然一致同意此形式之治療在臨床上確實提供症狀減輕，但公開HA臨床試驗之近來評論及其後分析已置疑 此結論在與關節內注射有關之更強安慰劑效應基礎上的有效性、盲法研究者之困難及發表偏好(Brandt等人，2000；Lo等人，2003)。關節內HA是否展現任何軟骨保護性或軟骨再生活性亦存在爭論。然而，廣泛動物研究已展示HA在患有由單側及兩側半月板切除術誘發之OA之兔及羊模型中以及患有前十字韌帶切斷誘發之OA之犬中展現止痛、消炎及改善疾病作用。已評述此等資料與在不同分子量HA情況下臨床前及基於實驗室之臨床研究一起的討論(Ghosh等人，2002)。
在本發明之研究中，僅評估單一關節內注射單獨或與MPC組合之HA。在吾人資料之基礎上，推斷出MPC+HA組合所提供之持久生長及再生以及軟骨保護性作用係由MPC介導。在此方面，須注意此研究之設計允許各動物充當其自身對照，此係因為一關節接收HA，同時對側關節接收相同量之HA加於冷凍保護劑Profreeze®中之MPC。因為在本發明之研究中藉由外科手術使兩個膝關節不穩定且同時注射，所以有信心兩個關節上作用於關節軟骨之負重機械應力之大小及性質相同。
由本發明之研究，推斷出如藉由相對於基線預處理及注射HA對照，處理後24週軟骨胞外基質增加所表現，單一關節內投予MPC+HA至具有預先存在之嚴重OA之羊關節中引起富含蛋白聚糖之軟骨生長或再生。
實施例4：使用免疫選擇MPC方法進行羊椎間盤再生研究
對於此研究使用36隻年齡相仿之美利奴閹羊(約18至24個月大)。在所有36隻綿羊中，將3個相鄰腰椎間盤(L3-L4、L4-L5、L5-L6)注射1.0 IU於約0.1ml無菌生理鹽水中之軟骨素酶(chondroitinase)ABC(Seikagaku Corporation,Japan)以破環及移出NP之PG。剩餘腰椎間盤(L1-L2及L2-L3)不注射軟骨素酶ABC且用作對照。在投予軟骨素酶ABC之後15週(±3週)，將MPC(0.5×106個細胞)於與等量玻糖醛酸(Euflexxa®,Ferring Pharmaceuticals)混合之ProFreezeTM冷凍介質(NAO)或單獨ProFreezeTM NAO(Lonza Walkersville Ltd.)中之注射液直接投至圖25中示意性鑑別之經軟骨素酶ABC處理之椎間盤髓核中。如表1中概述，將各別實驗組在3及6個月後犧牲。
動物具有在以下時間點在誘發麻醉下拍攝之腰脊柱側平面放射線照片：第0天(注射軟骨素酶ABC(Seikagaku Corporation,Japan))、測試物品投予之日(誘發腰椎間盤退化後15±3週)及植入測試物品後3個月及6個月。如藉由(Masuda等人，2004)所述，使用藉由求出來自IVD之前部、中部及後部之量測結果平均值且將其除以相鄰椎間體高度而計算出的椎間高度(DHI)指數進行放射線照片之評估。
在以下時間點在誘發麻醉下拍攝腰脊柱之MRI：第0天(注射軟骨素酶ABC[Seikagu Corp Japan])、測試物品投予之日(誘發腰椎間盤退化後15+3週)及植入測試物品後3個月及6個月。使用Pfirrmann分類系統(Pfirrmann等人，2001)自MRI掃描將椎間盤分級。
藉由使用骨鋸切斷接近於軟骨終板之頭部及尾部椎體來分離指定用於組織化學及生物化學分析之脊柱運動節段。將此等脊柱切片全部於Histochoice®中固定歷時56h，且在恆定攪動下在轉換數次於5%中性緩衝福馬林(Formalin)中之10%甲酸中脫鈣，歷時2週，直至使用Faxitron FIP43855A X光箱(Hewlett Packard,McMinnville,USA)證實完全脫鈣。
藉由標準組織學方法將約5mm厚之脫鈣樣品之多個矢狀切片經由分級乙醇溶液脫水且包埋於石蠟中。將4μm厚之石蠟切片安裝於Superfrost Plus玻璃顯微鏡載片 (Menzel－Glaser)上，在85℃下乾燥30 min，接著在55℃下乾燥隔夜。接著將切片在二甲苯中去除石蠟(4次轉換×2 min)且經由分級乙醇洗滌液(100－70% v/v)至自來水重新水化。將來自由矢狀切片製備之所有塊狀物之一切片用蘇木精(haematoxylin)及伊紅(eosin)染色。藉由獨立組織病理學家檢查經編號之切片，該組織病理學家比較僅經受酶注射之彼等程度與注射酶且接著接收MPC之彼等程度的組織學特徵。如表2中所示，使用四點半定量分級系統來評估整個椎間盤之微觀特徵。亦製備包括阿爾新藍(Alcian Blue)(針對一般葡糖胺聚糖物質)及番紅精O(Safranin O)(對硫酸軟骨素種類具特異性)之其他染色劑以證明椎間盤基質合成之程度。
如先前所述，亦使用Sequenza盒及拋棄式蓋板免疫染色系統執行免疫組織化學程序(Melrose等人,2003；Melrose等人,2002；Melrose等人,2000；Melrose等人,2002a；Melrose等人,1998；Panjabi等人,1985；Race等人,2000；Smit,2002)。最初藉由用3% H2 O2 培育組織切片來阻斷內源過氧化物酶活性。接著將其用以下組合預消化：37℃下20 mM Tris－乙酸鹽緩衝液(pH 8.0)中之軟骨素酶ABC(0.25 U/ml)1 h，37℃下磷酸鹽緩衝液(pH 5.0)中之牛睾丸玻尿酸酶1000 U/ml 1 h，接著在室溫下在20 mM Tris－HCl(pH 7.2)、0.5M NaCl(TBS)或蛋白酶－K(DAKO S3020)中洗滌3次，歷時6 min，以暴露抗原決定基。接著將組織在20%正常豬血清中阻斷1 h且用多種初級抗體探測大及小的 蛋白聚糖及膠原蛋白(表3)。亦處理陰性對照切片，省略初級抗體或用不相關同型匹配初級抗體替換真正相關初級抗體。對於此步驟使用商業(DAKO)同型匹配小鼠IgG(DAKO編號X931)或IgM(DAKO編號X942)對照抗體(適當時)。DAKO產品X931及X942為針對黑曲黴菌(Aspergillus niger )葡萄糖氧化酶(一種既不存在於哺乳動物組織中亦不具有誘導性之酶)之小鼠單株IgG1 (純系DAK－GO 1)及單株IgM(純系DAK－G08)抗體。使用TBS中之0.05% 3,3'－二胺聯苯胺二鹽酸鹽及0.03% H2 O2 、Nova RED、氮藍四唑/5－溴－4－氯－3－吲哚基磷酸鹽/碘基硝基四唑鎓紫(NBT/BCIP/INT)或新品紅(New Fuchsin)作為受質，對於偵測使用辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶接合之二級抗體。藉由明視場顯微術檢查經染色之載片且使用Leica MPS 60照相顯微鏡數位相機系統拍攝照片。
自精細切塊之經加工塊狀物切割纖維環及髓核樣品且將已知濕重之組織區域之代表性部分凍乾至恆重。在110℃下將三份乾燥組織部分(1－2 mg)於6M HCl中水解，歷時16 h，且檢定經中和消化產物之等分試樣的羥脯胺酸，作為組織膠原蛋白含量之量度(Sakai等人,2005)。亦用木瓜蛋白酶消化三份乾燥組織部分(約2 mg)且使用異染染料1,9－二甲基亞甲基藍檢定溶解組織之等分試樣之硫酸葡糖胺聚糖，作為PG量度(Sakai等人,2005)。
將運動節段包在鹽水浸漬之紗布中，密封於雙倍厚度之聚乙烯袋中且於－30℃下冷凍，直至生物力學測試。已展示此處理不改變組織之生物力學特徵(Panjabi等人, 1985)。進行生物力學測試以在接近生理負載之規定電腦控制之條件下量測在軸向壓縮、彎曲、延伸、側向彎曲及軸向扭轉方面各椎間盤之硬度(Panjabi等人,1985；Race等人,2000；Smit,2002；Wilke等人,1999)。在其他地方記錄測試方案之詳情(Panjabi等人,1985；Race等人,2000；Smit,2002；Wilke等人,1999)。用於測試之樣品(脊柱功能單位，FSU)包含2個相鄰椎骨、其間椎間盤及相關韌帶。每一脊柱測試3個FSU：僅在僅C－ABC下退化之程度，椎間盤在C－ABC下退化且接著僅經玻糖醛酸處理之程度，及在C－ABC下退化且接著經玻糖醛酸及MPC處理之中心程度。將各FSU安裝在2個鋁合金杯中且用3個螺釘及冷固化聚甲基丙烯酸甲酯補齒水泥(Vertex SC Self Curing,Dentimex BV,Zeist,Holland)固定。注意確保椎間盤中線水平定位。藉由將穿過椎管之定位銷置放至一杯中之洞中，將運動節段置於杯的中心。所有測試均在維持於37℃下之鹽水浴中進行。在開始測試之前，將各FSU預負載至0.5 MPa之應力，直至實現可再現之水合狀態。此用作各測試前之基線。0.5 MPa之預負載應力模擬鬆馳站立且係基於椎間盤內壓力之活體內量測結果。
使用裝備有「6自由度」測力計之8511型動態液壓伺服材料測試機(INSTRON Pty Ltd,High Wycombe,UK)執行機械測試以允許同時監測及控制所有3個平面中之力。藉由亦記錄及分析資料之個人電腦及按用戶需要設計之軟體控制機器。在來自軸向負載或扭轉對照中最終五個正弦 0.1 Hz負載循環之穩定滯後中獲得測試資料。所執行之測試為完全軸向壓縮、左及右側向彎曲、組合之彎曲/延伸及完全軸向扭轉。
在極少或無彎曲或撓曲伴隨負載之情況下在FSU中產生達200 N之完全軸向壓縮。在頭部杯表面上使用點接觸執行所有壓縮測試。藉由將循環負載經由容納樣品之鋁合金杯上之一點施加至關節以實現可忽略之彎曲來測定彎曲中性軸(NAB)。此嘗試錯誤法使得能夠使用剛性點負載接觸而儘可能接近完全軸向壓縮。儘管樣品之間存在微小可變性，但發現此點位於脊柱管前約10 mm但椎間盤質心略微後側。將標記置放於NAB前側及後側及左側及右側10 mm以定位用於彎曲測試之偏移負載。在各點施加200 N之最大壓縮負載以產生2 Nm彎曲及200 N軸向壓縮。
選擇保守彎曲及壓縮負載以確保椎間盤、後側部分、終板及其他韌帶性結構不受損傷。使用此負載方法不產生完全彎曲。作為替代，存在彎曲與軸向壓縮之組合以用於組合之撓曲/延伸及側向彎曲測試。咸信假定活體內負載很少產生完全彎曲而產生壓縮與彎曲之組合，證明此為正確的。在每一負載狀況下，所有負載一貫施加於各樣品，允許直接比較力學響應。
對於扭轉測試而言，將施加5 Nm之完全軸向扭轉。此在自其他研究所估計及所應用之扭矩生理學範圍內。新穎按用戶需要設計之扭轉測試系統將用以施加純扭力至各FSU。此系統使用滾珠絲杠/推力板機構以將英斯特致動器 (Instron actuator)之軸向位移轉化成純旋轉。X－Y承載桌確保FSU在測試期間不具有施加於其之旋轉固定中心。此為重要的，因為旋轉中心在軸向旋轉期間不恆定。將下方杯固定於扭矩傳感器，其中上方杯固定於X－Y承載桌及滾珠絲杠/推理板機構。
最初在完整FSU上進行所有測試。一旦完成，藉由使用通過神經孔之小弓鋸條切割後側部分且在後部切割來分離椎間盤。此切割關節突關節及棘間及棘上韌帶，使椎間盤、後及前縱韌帶完整。以在後部增加之楔形方式進行切割以確保關節突關節之間無接觸。接著在經分離之椎間盤上重複所有測試。
資料分析包括以下參數：諸如第五負載循環期間線性區域之硬度、中性區之滯後及應變能及程度。將來自對照程度之資料與退化/注射MPC之程度相比，且在各生物力學參數上重複量測變數分析。
結果
注射MPC之組中所有動物在實驗持續期間維持正常體重且未展示不良副作用之證據。
在注射軟骨素酶－ABC之椎間盤中，藉由此酶耗盡PG導致3個月後所有注射之椎間盤中椎間盤高度指數(DHI)減少38%。此椎間盤高度損失證實在處理之前髓核之退化狀態且向來稱之為MPC前DHI。HA或MPC＋HA注射至退化椎間盤後3個月無法產生相對於MPC前DHI任何顯著的DHI增加(圖26)。然而，截至處理後6個月，注射MPC＋HA 之椎間盤展示相對於相應3個月評分(組1)DHI平均增加52%(圖26及表4)。相比之下，注射單獨HA之椎間盤在同一時期僅展示23.1% DHI平均改良(圖26及表4)。顯著地，注射低MPC＋HA之椎間盤之平均DHI在處理後6個月可與未注射軟骨素酶ABC(亦即，未退化)之對照椎間盤的DHA評分相比(圖26)。
HA或MPC＋HA注射後6個月與3個月之DHI的統計分析展示於表4中。
如藉由椎間盤高度之恢復在放射照相上所評估，在本發明之實驗中展示將羊MPC與合適載劑(諸如，高分子量玻糖醛酸(HA))一起投至實驗產生之退化IVD之髓核中加速椎間盤胞外基質再生。此解釋係基於假定在負載脊柱中椎間盤高度藉由高濃度基質蛋白聚糖存在於NP及內環內來維持，基質蛋白聚糖與其結合水分子一起向此結構給與高膨脹壓力。實際上，在此等實驗開始時使用軟骨素酶－ABC誘發椎間盤退化依賴於此酶降解及自NP胞外基質移出大部分蛋白聚糖之能力。
迄今為止所得資料表明由MPC介導之治療作用為相對緩慢之過程。在本發明之研究中，0.5×106 個MPC之劑量尤其有效。
雖然本發明之實驗在MPC注射至椎間盤後6個月停止，但發現低劑量MPC注射液所獲得之椎間盤高度恢復程度接近針對未注射軟骨素酶ABC之內部對照所觀測到之值，表明在此時期實現NP重建之最大程度。
熟習此項技術者應瞭解在不悖離如廣泛描述之本發明之精神或範疇的情況下，如特定具體實例中所示，可對本發明進行大量變化及/或修改。因此，認為本發明之具體實例在所有方面均為例示性而非限制性的。
本文所討論及/或參考之所有公開案均以全文引用的方式併入本文中。
對已包括在本說明書內之文獻、法令、物質、裝置、物品或其類似物的任何討論僅為達成為本發明提供上下文之目的。不認為其許可任何或所有此等物質形成先前技術基礎之部分或為與本發明有關之領域中之常用知識，此係因為其在本申請案之各申請專利範圍的優先日期之前存在。
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圖1 半月板切除術後12週注射玻尿酸(HA)或HA加上不同劑量之間葉前驅細胞(MPC)之關節的股骨及脛骨軟骨形態學評分之平均值±SD。
圖2 半月板切除術後12週注射玻尿酸(HA)或HA加上不同劑量之間葉前驅細胞(MPC)之關節的股骨及脛骨骨贅評分之平均值±SD。
圖3 注射不同劑量之間葉前驅細胞(MPC)之動物的 軟骨形態學關節評分的比率[HA/(MPC＋HA)]。當比率＝1時，兩種治療同等有效。比率>1表明MPC＋HA優於HA。
圖4 相對於單獨HA，注射不同劑量之MPC＋HA之動物的骨贅評分之比率[HA/(MPC＋HA)]。當比率＝1時，兩種治療同等有效。比率>1表明MPC＋HA優於HA。
圖5 半月板切除術後12週注射玻尿酸(HA)或100×106 個MPC＋HA之關節之軟骨的組織形態計量學測定之區域厚度評分之平均值±SE。合併所有脛骨軟骨區域HA＋100×106 個MPC>HA(p<0.05)。
圖6 注射不同劑量之間葉前驅細胞(MPC)之動物的平均值±SE總Mankin改良之關節組織病理學評分之比率[HA/(MPC＋HA)]。當比率＝1時，兩種治療同等有效。比率>1表明MPC＋HA優於HA。
圖7 半月板切除術後12週、24週及52週注射HA及HA＋100×106 個MPC之關節的股骨及脛骨軟骨形態學評分之平均值±SD。
圖8 在半月板切除術後12週、24週及52週注射HA及HA＋100×106 個MPC之關節的股骨及脛骨骨贅評分之平均值±SD。
圖9 半月板切除術後12週、24週及52週注射間葉前驅細胞(MPC)之動物的軟骨形態學關節評分之比率[HA/(MPC＋HA)]。當比率＝1時，兩種治療同等有效。比率>1表明MPC＋HA優於HA。
圖10 半月板切除術後12週、24週及52週注射間葉前 驅細胞(MPC)之動物的骨贅關節評分之比率[HA/(MPC＋HA)]。當比率＝1時，兩種治療同等有效。比率>1表明MPC＋HA優於HA。
圖11 半月板切除術後12週、24週及52週注射間葉前驅細胞(MPC)之動物的平均值±SE改良Mankins關節軟骨組織病理學評分之比率[HA/(MPC＋HA)]。當比率＝1時，兩種治療同等有效。比率>1表明MPC＋HA優於HA。
圖12 注射玻尿酸(HA)或HA＋不同劑量之間葉前驅細胞(MPC)之關節的膝蓋骨軟骨硬度之平均值＋/－ SE。＊ ＝p<0.05，＊＊ ＝p<0.01，＊＊＊ ＝p<0.001，＊＊＊＊ ＝p<0.0001。
圖13 半月板切除術後12、24及52週注射玻尿酸(HA)或100×106 個間葉前驅細胞(MPC)＋HA且犧牲的關節之膝蓋骨軟骨硬度之平均值＋/－ SE。＊ ＝p<0.05，＊＊ ＝p<0.01，＊＊＊ ＝p<0.001，＊＊＊＊ ＝p<0.0001。
圖14 注射玻尿酸(HA)或HA＋不同劑量之間葉前驅細胞(MPC)之關節的膝蓋骨軟骨相位滯後之平均值＋/－ SE。＊ ＝p<0.05，＊＊ ＝p<0.01，＊＊＊ ＝p<0.001，＊＊＊＊ ＝p<0.0001。
圖15 半月板切除術後12週、24週及52週注射玻尿酸(HA)或HA＋100×106 間葉前驅細胞(MPC)且犧牲的關節之膝蓋骨軟骨相位滯後之平均值＋/－ SE。＊ ＝p<0.05，＊＊ ＝p<0.01，＊＊＊ ＝p<0.001，＊＊＊＊ ＝p<0.0001。
圖16 半月板切除術後12週未經處理之閹割雄綿羊及切除卵巢之母羊的關節軟骨形態學評分之比較，展示雌性組中OA病變之嚴重程度顯著更大。
圖17半月板切除術後12週未經處理之閹割雄羊綿及切除卵巢之母羊的關節骨贅評分之比較，展示雌性組中評分顯著更高。
圖18半月板切除術後12週注射玻尿酸(HA)或HA+100×106個間葉前驅細胞(MPC)之切除卵巢之母羊關節在半月板切除術後36週的軟骨改良Mankin組織病理學評分之平均值±SD。P值=HA：(MPC+HA)。此等結果展示與脛骨軟骨相比，經6個月單一MPC注射在更大程度上降低股骨透明軟骨之異常組織病理學評分。
圖19半月板切除術後12週投予關節內注射液之切除卵巢之母羊關節在半月板切除術後36週的軟骨總改良Mankin組織病理學評分之比率(HA/HA+MPC)。當比率=1時，MPC+HA等於HA。比率>1展示MPC+HA比單獨HA更具保護性。資料=平均值±SEM。此等結果展示與脛骨軟骨相比，經6個月單一MPC注射在更大程度上降低股骨透明軟骨之異常組織病理學評分。
圖20與半月板切除術(MX)後12週未注射之關節相比，MX後12週注射玻尿酸(HA)或100×106個間葉前驅細胞(MPC)+HA之切除卵巢之母羊關節在MX後24週及36週股骨軟骨改良Mankin組織病理學評分之平均值±SD。P值為12週NIL：處理。此等結果展示經6個月單一MPC注射降低異常組織病理學評分。
圖21半月板切除術後12週注射玻尿酸(HA)或100×106個間葉前驅細胞(MPC)+HA之切除卵巢之母羊關節在半 月板切除術後36週的股骨軟骨組織形態計量學資料。所示資料＝平均值±SEM。P值＝HA：(MPC＋HA)。此等結果展示與玻糖醛酸相比，經6個月單一MPC注射產生更多透明軟骨。
圖22 半月板切除術(Mx)後12週犧牲或Mx後12週注射玻尿酸(HA)或間葉前驅細胞(MPC)＋HA接著12週或24週以後犧牲的未經處理之母羊之關節的平均值±SEM組織形態計量學測定之股骨軟骨厚度。資料表示為平均值±SEM。P值相對於12週NIL處理。此等結果展示經6個月單一MPC注射增加透明軟骨厚度。
圖23 半月板切除術(Mx)後12週犧牲或Mx後12週注射玻尿酸(HA)或間葉前驅細胞(MPC)＋HA接著12週或24週以後犧牲的未經處理之母羊之關節的組織形態計量學測定之股骨軟骨面積。資料表示為平均值±SEM。P值相對於12週NIL處理。此等結果展示經6個月單一MPC注射增加透明軟骨面積。
圖24 半月板切除術(Mx)後12週犧牲或Mx後12週注射玻尿酸(HA)或間葉前驅細胞(MPC)＋HA接著12週或24週以後犧牲的未經處理之母羊之關節的股骨軟骨之組織形態計量學測定之積分灰階密度(IGD)(作為總體蛋白聚糖(PG)含量之量度)。資料表示為平均值±SEM。P值相對於12週NIL處理。此等結果展示與玻糖醛酸注射相比，經6個月單一MPC注射產生顯著更多含有蛋白聚糖之軟骨。
圖25 在所有綿羊群中經間葉前驅細胞(MPC)處理之腰椎管水平之圖示。
圖26 在將MPC及HA注射至退化綿羊椎間盤之髓核後3及6個月椎間盤高度之平均恢復。

Claims (12)

  1. 一種一群已針對STRO-1明亮(bright)多潛能細胞進行富集的細胞及/或其後代細胞及/或來源於其之可溶性因子之用途，其係用於製造供治療及/或預防個體中因退化及/或發炎引起之結締組織疾病之用的醫藥品。
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該結締組織富含蛋白聚糖。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該結締組織為軟骨。
  4. 如申請專利範圍第3項之用途，其中該疾病引起該軟骨中之一或多種缺陷。
  5. 如申請專利範圍第4項之用途，其中該醫藥品不被直接投至軟骨缺陷中。
  6. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該醫藥品係投至關節間隙中。
  7. 如申請專利範圍第6項之用途，其中該關節間隙處於膝關節、髖關節、踝關節、肩關節、肘關節、腕關節、手或手指關節或足關節或椎間盤關節中。
  8. 如申請專利範圍第6項之用途，其中該醫藥品係藉由關節內注射來投予。
  9. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該醫藥品之投予使得富含蛋白聚糖之軟骨得以保存或產生。
  10. 如申請專利範圍第9項之用途，其中該富含蛋白聚糖之軟骨為透明軟骨。
  11. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該疾病為肌腱炎、背痛、迴旋套肌腱退化、腕隧道症候群、德奎緬氏症候群(DeQuervain's syndrome)、退化性頸及/或腰椎間盤、交叉點症候群(intersection syndrome)、反射性交感神經營養不良症候群(reflex sympathetic dystrophy syndrome，RSDS)、狹窄性腱鞘炎、上髁炎、腱鞘炎、胸廓出口症候群、尺神經卡壓、橈隧道症候群、重複性壓迫損傷(repetitive strain injury，RSI)、骨關節炎、類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、血清反應陰性關節炎、與發炎性腸病有關之關節炎或強直性脊椎炎及退化椎間盤病症。
  12. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該醫藥品係與玻糖醛酸(HA)組合投予。
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