KR20170045382A - 생체 내에서 결합 조직을 생성, 복구 및/또는 유지하는 방법 - Google Patents

생체 내에서 결합 조직을 생성, 복구 및/또는 유지하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대상의 결합 조직을 생성, 복구 및/또는 유지하는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 대상의 연골 조직을 생성, 치료 및/또는 유지하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 대상에서, 결합 조직의 분해 또는 염증에 의하여 발생되는 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

Description

생체 내에서 결합 조직을 생성, 복구 및/또는 유지하는 방법{METHODS OF GENERATING, REPAIRING AND/OR MAINTAINING CONNECTIVE TISSUE IN VIVO}
본 발명은 대상의 결합 조직을 생성, 복구 및/또는 유지하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 대상에서 결합 조직의 분해 또는 염증에 의해 발생되는 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
비-조혈 전구세포(Non-hematopoietic progenitor cell)는 체내에 정주하며, 분리시 간엽 전구세포(MPC)라고 하는 다능성 세포가 된다. 보다 구체적으로는, 정제된 MPC는 매우 다양한 다능성 세포 콜로니를 형성할 수 있다.
Simmons 등(1994)은 STRO-1 세포 표면 마커를 발현하는 세포를 선별함으로써, 새롭게 수확한 골수로부터 MPC를 농화(enrichment)하는 방법을 기술하고 있다. 272-273 페이지에서 저자가 언급한 바와 같이, 골수 세포에는 CFU-F를 생성할 수 있는 상당량의 MPC가 포함되어 있는 것으로 알려져 있다. 이 CFU-F는 이후 적절한 조건하에서 연골, 골, 지방 조직, 섬유 조직 및 골수지지 기질(myelosupportive stroma) 등의 완전히 분화된 매우 다양한 결합조직을 발생시킬 수 있다.
MPC 및 CFU-F는 전형적으로 골수 세포에 매우 낮은 농도로 존재하여(전형적으로 0.05%-0.001%), 이러한 희귀성은 과거 이에 대한 연구에 주된 한계점이되어 왔다. Simmons 등(1994)의 논의에서, STRO-1 양성 세포를 선별함으로써 새롭게 분리한 골수 세포로부터 이들 MPC를 어느 정도로 농화시킬 수 있다는 중요한 사실을 확인하였다. 특히, STRO-1 양성 세포의 선별로 조혈 전구 세포가 혼입되어 있지 않은 MPC(및 생성된 CFU-F)를 분리할 수 있었다.
WO 01/04268에서는, MPC를 포함하는 STRO-1 양성 세포 분획내에서 소집단을 동정함으로써, MPC 농화에 보다 중요한 진전을 이루었다. 특히, WO 01/04268에서는 STRO-1 양성 세포 집단을 3가지 하위집단: STRO-1dull, STRO-1intermediate 및 STRO-1bright로 분류하였다. 여러가지로 분류된 소집단에 대한 CFU-F의 집락형성 분석법(Clonogenic assay)을 통해, 대부분의 MPC가 STRO-1bright 분획에 포함되어 있다는 것이 입증되었다.
WO 2004/085630(Gronthos et al)에는 최초로 MPC가 혈관주위 조직(perivascular tissue)에 존재하고 있다는 것이 기술되어 있다. 이러한 발견으로 인한 이점 중 하나는, MPC를 분리 또는 농화할 수 있는 공급 조직의 범위를 크게 확장시킬 수 있으며, MPC 공급원을 더 이상 골수로만 제한하지 않을 수 있다는 것이다. WO 2004/085630의 방법에 따라, MPC를 분리할 수 있는 조직은, 인간 골수, 치수(dental pulp), 지방 조직, 피부, 비장, 췌장, 뇌, 신장, 간 및 심장이다. 혈관주위 조직으로부터 분리된 MPC는 세포 표면 마커인 3G5에 양성을 나타낸다. 따라서, 이는, 3G5 마커를 보유하고 있는 세포의 농화를 통해, CD146(MUC18), VCAM-I과 같은 혈관주위 세포에 존재하는 초기 발생 표면 마커의 농화를 통해, 또는 세포 표면 마커인 STRO-1의 고발현 농화를 통해, 분리할 수 있다.
무혈관성 결합 조직(avascular connective tissues)은 일반적으로 상당한 움직임이 필요한 근골격계 내 해부학적 부위에 위치하고 있다. 자유롭게 움직이는 관절은 대부분의 포유류의 마디를 구성하고 있다. 윤활 관절(synovial joints)에서 두 개의 마주하는 뼈의 접촉면은, 긴 뼈를 연결하고 덮고 있는 관절낭(joint capsule) 내부에 라이닝 된 세포에 의해 생성되는 관절 활액에 저마찰 윤활제가 존재하기 때문에, 서로 효과적으로 미끄러지는 유리질 연골(hyaline cartilage)로 덮여있다. 척주 마디에서, 관절은, 유리질 연골에 존재하는 연골 세포와 유사한 연골성 세포가 조밀하게 분포하는 수화된 젤라틴 물질(수핵)을 내포하는 유연한 섬유연골고리(섬유륜)로 단단한 척주 뼈를 연결함으로써 이루어진다. 상기 무혈관성 결합 조직의 유형 및 위치와 상관없이, 이들 모두 섬유성 단백질, 2형 콜라겐과 함께 물을 흡수하여 높은 장력 세기를 부여하는 높은 음전하를 띠는 프로테오글리칸이 다량 함유된 세포외 기질을 합성하는 세포를 포함하고 있다.
유리질 연골, 내부 반월(meniscus) 2/3 및 추간 디스크(intervertebral disc)와 같은 무혈관성 결합 조직은 제한된 회복력을 가지고 있으며, 손상되었을 때 기능적으로 하위의 섬유 연골 반흔 조직을 생성하는 것으로 반응한다. 노화, 유전, 호르몬 상태 및 신체 상처가 지배적인 복수의 인자에 의해, 이러한 무혈관성 결합이 이루어지지 못하고, 디스크 퇴화, 허리 통증 및 골관절염 등의 다양한 임상학적 문제로 이어진다.
이러한 결합 조직의 실패로 인해 야기되는 증상을 치료하기 위해 통상적으로 사용되는 현행 의학적 치료법은, 증상을 발생에 원인이 되는 근원 병태를 거의 해결하지 못하며, 많은 경우, 조직의 세포외 기질의 구조적 성분을 합성하는 정주 세포(resident cell)의 성능을 떨어뜨림으로써 문제를 더욱 악화시킨다. 이상적으로는, 치료학적 치료법은 적어도 연골을 보호하면서, 기질의 생합성을 향상시키고 손상된 결합 조직의 회복 및 복구에 효과가 있는 환경을 제공하여야 한다.
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본 발명의 요약
본 발명자들은, MPC의 관절내 투여가 골관절염이 기존재하는 관절에 연골보호 효과를 제공하며, 추간판의 윤활 관절 및 수핵에서의 연골 조직의 생성과 생장을 유도한다는 놀라운 사실을 확인하였다. 이러한 사실은, MPC 또는 이의 자손, 또는 이들 MPC로부터 유래된 상층물 또는 가용성 인자를 사용하여 손상된 결합 조직을 보호 또는 복구시킬 수 있을 뿐만 아니라 퇴화 또는 병변 부위에 새로운 기능성 조직을 생성시킬 수 있음을 의미한다.
따라서, 본 발명은 대상에서, 결합 조직의 분해 또는 염증에 의하여 발생되는 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 MPC 및/또는 그의 자손 세포 및/또는 그로부터 유도된 가용성 인자를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 결합 조직은 프로테오글리칸이 풍부하다. 결합 조직은 연골, 예컨대 유리질 연골일 수 있다. 다른 구현예에서, 질환은 연골 결함이 원인이다.
다른 구현예에서, 상기 방법은, MPC 및/또는 그의 자손 세포 및/또는 그로부터 유도된 가용성 인자를 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 MPC 및/또는 자손 세포 및/또는 가용성 인자는 결함 부위에 직접 투여되지 않는다.
예컨대, 투여는 관절을 형성하는 뼈의 관절 표면 상에서 연골의 결함을 치료 또는 예방하기 위해, 관절 공간에서 이루어질 수 있다. 유사하게, 투여는 주변 디스크의 결함을 치료 또는 예방하기 위해 추간판 공간에서 이루어질 수 있다. 다른 구현예에서, 투여는 연결 결함부의 인접 부위에 정맥 내로 이루어진다.
MPC 및/또는 자손 세포 및/또는 가용성 인자는 관절내 주사에 의해 투여될 수 있다. 관절내 주사는 연골 결함 부위 또는 연골 결함 가능성있는 부위에 인접한 체내 임의의 관절에 행해질 수 있다. 예컨대, 관절내 주사는 무릎 관절, 고관절, 발목 관절, 어깨 관절, 팔꿈치 관절, 손목 관절, 손 또는 손가락 관절, 발 관절 또는 추간판 관절에 행해질 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, MPC 및/또는 자손 세포 및/또는 가용성 인자의 투여로, 프로테오글리칸과 2형 콜라겐이 풍부한 연골의 유지 또는 생성을 초래한다. 프로테오글리칸과 2형 콜라겐이 풍부한 연골의 예는 유리질 연골이다. 바람직하게는 본 발명에 의해 유지 또는 생성되는 연골은, 1형 콜라겐이 풍부하고, 2형 콜라겐의 함량은 매우 적으며, 유리질 연골 보다 프로테오글리칸 함량이 낮은, 섬유연골(fibrocartilage)은 아니다.
"결합 조직의 분해 및/또는 염증에 의해 발생하는" 질환의 구현예에서는, 건염, 등 통증, 회전근개 건 분해(rotary cuff tendon degradation), 수근관 증후군(Carpal tunnel syndrome), 드퀘르뱅 건초염(DeQuervain's syndrome), 경추골원판 및/또는 요추 간판 퇴화(degenerative cervical and/or lumber discs), 교차 증후군(intersection syndrome), 반사성 교감신경 위축증(reflex sympathetic dystrophy syndrome: RSDS), 협착성 건초염(stenosing tenosynovitis), 상과염(epicondylitis), 건초염(tenosynovitis), 흉곽출구 증후군(thoracic outlet syndrome), 척골 신경 포착(ulnar nerve entrapment), 요골 터널 증후군(radial tunnel syndrome), 반복성 긴장성 손상(repetitive strain injury: RSI)이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 유리질 연골의 분해 및/또는 염증과 관련있는 질병의 예로는, 골관절염, 류마티스 관절염, 건선 관절염 및 혈청음성 관절염등의 관절염, 염증 장 질환 또는 강직성 척추염 관련 관절염, 및 추간판 퇴화 장애가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
다른 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 히알루론산(HA)을 투여하는 단계를 더 포함한다. HA는 세포, 상층물 및/또는 인자(들)과 동일한 또는 상이한 조성물로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 MPC 및/또는 그것의 자손세포 및/또는 히알루론산을 포함하는 조성물을 제공한다.
본원에 제시된 결과들은, 이식한 배양 MPC에서 분비되는 가용성 인자가 결합 조직의 보호, 생성 및 생장을 지지한다는 것을 최초로 나타낸다.
즉, 본 발명은 하기 성분을 포함하는 조성물을 제공한다:
i) 간엽 전구 세포(MPC) 및/또는 그것의 자손 세포로부터 유래된, 상층물, 또는 하나 이상의 가용성 인자, 및
ii) 히알루론산.
다른 측면에서, 본 발명은 결합 조직의 분해 및/또는 염증으로 인해 발생되는 질환을 대상에서 치료 및/또는 예방하기 위한, 간엽 전구 세포(MPC) 및/또는 그것의 자손 세포로부터 유래된, 상층물, 또는 하나 이상의 가용성 인자의 용도를 제공한다.
본 발명은 다양한 범주의 동물에게 적용가능한다. 예컨대, 대상은 인간, 개, 고양이, 말, 소 또는 양과 같은 포유류일 수 있다. 일 예에서, 대상은 인간이다.
본 명세서 전반에서, 용어 "포함한다" 또는 "포함한" 또는 포함하는" 등의 변형 형태는 언급된 요소, 정수 또는 단계, 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹을 포함하는 것을 내포하며, 다른 요소, 정수, 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹을 배제하는 것이 아닌 것으로 이해될 것이다.
이하 본 발명은 하기 비-제한적인 실시예와 첨부된 도면을 참고하여 설명된다.
일반적인 기술 및 선택적 정의
구체적으로 언급된 경우를 제외하고는, 본원에 사용된 모든 기술적 용어와 과학적 용어들은 당해 기술 분야(예, 세포 배양, 줄기 세포 생물학, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학, 및 생화학)의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 가지는 것으로 이해되어야 한다.
달리 언급되어 있지 않은 한, 본 발명에서 사용되는 재조합 단백질, 세포 배양 및 면역학적 기술들은 당업자들에게 잘 알려져 있는 표준적인 과정이다. 이러한 기술들은 J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), and J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (현재까지 갱신된 사항 모두 포함) 등의 문헌에 개시 및 예시되어 있다.
본원에서, 용어 "치료하는", "치료한다" 또는 "치료"는 특정 상태의 한가지 이상의 증상을 감퇴 또는 제거하는데 충분한 치료학적 유효량의 본 발명에 따른 상층물, 가용성 인자 및/또는 세포의 투여를 포함한다.
본원에서, 용어 "예방하는", "예방한다" 또는 "예방"은 특정 상태의 한가지 이상의 증상의 진행을 중지 또는 방해하는데 충분한 치료학적 유효량의 본 발명에 따른 상층물, 가용성 인자 및/또는 세포의 투여를 포함한다.
본원에서, 용어 "간엽 전구 세포 유래"는 간엽 전구 세포 및/또는 그것의 자손 세포를 시험관내 배양하여 생산한 상층물, 및/또는 하나 이상의 가용성 인자를 의미한다.
본원에서, 용어 "상층물"은 적정 배지, 바람직하게는 액체 배지에서 간엽 전구 세포, 및 또는 그것의 자손 세포를 시험관내 배양하여 생산되는 비-세포성 물질을 의미한다. 전형적으로, 상층물은 적정 조건과 시간 동안 세포를 배지에서 배양한 다음, 원심 분리와 같은 과정에 의해 세포성 물질을 제거하여 제조한다. 상층물은 투여하기 전에 추가적인 정제 단계를 거치거나 거치지 않은 것일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상층물은 살아있는 세포를 105 미만으로, 더욱 바람직하게는 104미만으로, 더더욱 바람직하게는 103 미만으로 포함하거나, 더욱 바람직하게는 포함하지 않는다.
본원에서, 용어 "하나 이상의 가용성" 인자는 배양하는 동안에 MPC 및/또는 그것의 자손 세포로부터 분비되는 분자, 전형적으로 단백질을 의미한다.
간엽 전구 세포( MPC ) 또는 자손 세포, 및 이들로부터 유래된 상층물 또는 하나 이상의 가용성 인자
본원에서, "MPC"는 다수의 다능성 세포 콜로니를 형성할 수 있는 비-조혈성 STRO-1+ 선조 세포이다.
간엽 전구 세포(MPC)는 골수, 혈액, 치수 세포(dental pulp cell), 지방 조직, 피부, 비장, 췌장, 뇌, 신장(kidney), 간, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 장, 폐, 림프절, 흉선, 뼈, 인대, 힘줄, 골격근, 진피 및 골막에서 발견되는 세포로서, 이는 중배엽, 내배엽 및 외배엽 등의 여러가지 생식세포(germ line)로 분화할 수 있다. 따라서, MPC는 비제한적으로 지방 조직, 골 조직, 연골 조직, 탄성 조직, 근육 조직 및 섬유성 결합 조직 등의 수많은 세포 타입으로 분화가능하다. 이들 세포가 들어서게 되는 특정 계통-예정(lineage-commitment) 및 분화 경로는, 기계적 영향 및/또는 성장 인자, 사이토카인 및/또는 숙주 조직에 의해 확립된 국소 미세환경 조건 등의 내인성 생활성 인자로부터의 다양한 영향에 따라 결정된다. 간엽 전구 세포는, 따라서 분열되어, 곧 비가역적으로 분화되어 표현형 세포가 될 전구 세포이거나 줄기 세포인, 딸 세포가 되는 비조혈성 선조 세포이다.
바람직한 예에서, 대상으로부터 채취한 샘플에는 간엽 전구 세포(MPC)가 농화된다. 용어 '농화된다', '농화' 또는 이의 변형어는 본원에서 무처리한 집단과 비교하여 한가지 특정 세포 타입의 비율이나 다수의 특정 세포 타입들의 비율이 증가된, 세포 집단을 지칭한다.
바람직한 예에서, 본 발명에 사용되는 세포는 TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, CD45+, CD146+, 3G5+ 또는 이의 조합이다. 바람직하게는, STRO-1+ 세포는 STRO-1bright이다. 바람직하기로는, STRO-1bright 세포는 부가적으로 VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+ 및/또는 CD146+ 중 한가지 이상이다.
일 구현예에서, 간엽 전구 세포는 WO 2004/85630에 기재된 바와 같이 혈관주위 간엽 전구 세포(perivascular mesenchymal precursor cell)이다.
세포를 해당 마커에 대해 "양성"이라고 할 때, 이는 세포 표면에 존재하는 마커의 정도에 따라 마커의 낮은(lo 또는 dim) 또는 높은(bright, bri) 발현체 중 어느 하나일 수 있으며, 상기 용어는 세포의 색 분류 과정에 사용되는 형광이나 그외 색상의 세기와 관련있다. lo(또는 dim 또는 dull) 및 bri의 구별은 특정 세포 집단을 분류할 때 사용되는 마커 측면에서 이해될 것이다. 해당 마커에 대해 세포를 "음성"이라고 언급할 때는, 상기 마커가 상기 세포에서 전혀 발현되지 않는다는 것을 의미하는 것은 아니다. 이는 상기 마커가 세포에서 비교적 매우 낮은 수준으로 발현되며, 마커를 검출가능하게 표지하였을 때 매우 낮은 시그널을 형성한다는 것을 의미한다.
본원에서, "bright"는 검출가능하게 표지하였을 때 비교적 강한 신호를 형성하는 세포 표면상의 마커를 의미한다. 이론에 한정되지 않으며, "bright" 세포는 샘플에서 다른 세포 보다 표적 마커 단백질(예, STRO-1에 의해 인식된 항원)을 더 많이 발현하는 것으로 제시된다. 예컨대, STRO-1bri 세포는 FACS 분석으로 결정된 바에 따라, FITC-접합된 STRO-1 항체로 표지하였을 때, 비-bright 세포(STRO-ldull/dim) 보다 형광 신호를 더 강하게 형성한다. 바람직하게는, "bright" 세포는 출발 샘플에 함유된 가장 밝게 표지된 골수 단핵구 세포를 약 0.1% 이상으로 포함한다. 다른 예에서, "bright" 세포는 출발 샘플에 함유된 가장 밝게 표지된 골수 단핵구 세포를 약 0.1%, 약 0.5% 이상, 약 1% 이상, 약 1.5% 이상 또는 약 2% 이상으로 포함한다. 바람직한 예에서, STRO-1bright 세포는 2 log 높은 STRO-1 표면 발현을 나타낸다. 이는 "백그라운드", 즉 STRO-1-인 세포에 대해 상대적으로 계산된다. 비교하면, STRO-1dim 및/또는 STRO-1intermediate 세포는 2 log 이하, 전형적으로 "백그라운드" 보다 약 1 log 이하의 STRO-1 표면 발현을 보인다.
본원에서 용어 "TNAP"는 조직 비-특이적 알칼리 포스파타제의 모든 이소형(isoform)을 망라하는 것으로 의도된다. 예컨대, 상기 용어는 간 이소형(LAP), 골 이소형(BAP) 및 신장 이소형(KAP)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, TNAP는 BAP이다. 특히 바람직하기로는, 본원에 사용되는 TNAP는 부다페스트 조약 규정하에 2005년 12월 19일자로 ATCC에 기탁번호 PTA-7282로 기탁된 하이브리도마 세포주에서 생산되는 STRO-3 항체에 결합할 수 있는 분자를 일컫는다.
아울러 바람직한 구현에에서, MPC는 클론원성(clonogenic) CFU-F로 생장할 수 있다.
바람직하기로는, 다능성 세포의 상당 비율은 적어도 2종 이상의 상이한 생식세포로 분화할 수 있다. 다능성 세포가 예정될 수 있는 계통에 대한 비제한적인 구현예에서는, 골 전구세포; 담관 상피 세포 및 간 세포로 될 수 있는 다능성 간 세포 선조체; 희소돌기아교 세포(oligodendrocyte) 및 성상 세포(astrocyte)로 진행되는 아교 세포 전구 세포를 만들 수 있는 신경 한정 세포; 신경으로 진행되는 신경 전구세포; 심장 근육 및 심근 세포에 대한 전구세포, 글루코스-반응성 인슐린 분비성 췌장 β 세포주가 있다. 그외 계통으로는, 상아질모세포(odontoblast), 상아질-생산 세포 및 연골세포, 및 하기 세포의 전구 세포를 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다: 망막색소 상피 세포, 섬유모세포, 각질 세포와 같은 피부 세포, 수지상 세포(dendritic cell), 모낭 세포, 신관(renal duct) 상피 세포, 평활근 및 골격근 세포, 고환 선조체, 혈관내피 세포, 힘줄, 인대, 연골, 지방 세포, 섬유모세포, 골수 기질(marrow stroma), 심장 근육, 평활근, 골격근, 혈관주위 세포(pericyte), 혈관, 상피, 아교, 신경, 성상 세포 및 희소돌기아교 세포.
다른 구현예에서, MPC는 배양시 조혈 세포가 될 수 없다.
또한, 본 발명은 MPC 및/또는 시험관내 배양을 통해 생성되는 이들의 자손 세포(후자는 또한 증폭된 세포(expanded cell)라고도 함)로부터 얻어지는 상층물 또는 가용성 인자의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 증폭된 세포는 배양 조건(배양 배지내 자극성 인자의 수 및/또는 타입을 포함함), 계대 횟수 등에 따라 매우 다양한 표현형을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 자손 세포는 모 개체군으로부터 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10번 계대 배양한 후 수득된다. 그러나, 자손 세포는 모 개체군으로부터 임의 횟수의 계배 배양한 후 수득할 수도 있다.
자손 세포는 임의의 적정 배지에서 배양함으로써 수득할 수 있다. 본원에서 세포 배양에 대해 사용되는 용어 "배지"는 세포를 둘러싼 환경 구성 성분들을 포함한다. 배지는 고체, 액체, 가스 또는 상의 혼합 및 물질일 수 있다. 배지는 액체 생장 배지 뿐 아니라 세포 생장을 지지하지 않는 액체 배지도 포함한다. 또한, 배지는 아가, 아가로스, 젤라틴 및 콜라겐 기질 등의 젤라틴성 배지를 포함한다. 기체 배지의 구현예에서는 페트리 접시(petri dish) 또는 다른 고체 또는 반고체 지지(support) 상에서 생장하는 세포가 노출되는 기체 상을 포함된다. 또한 용어 "배지"는 세포와 접촉되지 않더라도, 세포 배양에 사용되도록 의도된 물질도 지칭한다. 즉, 박테리아 배양용으로 제조된 영양분이 풍부한 액체(nutrient rich liquid)도 배지이다. 이와 유사하게, 물이나 다른 액체와 혼합하였을 때 세포 배양에 적합하게 되는 가루 혼합물도 "분말 배지"로 지칭할 수 있다.
구현예에서, 본 발명의 방법에 이용가능한 자손 세포는 STRO-3 항체로 표지된 자기(magnetic) 비드를 이용하여 골수에서 TNAP+ MPC를 분리한 뒤, 분리된 세포를 배양하여 증폭시켰다(적절한 배양 조건의 구현예에서는 Gronthos et al. (1995) 참조).
일 구현예에서, 그러한 증폭된 (자손) 세포(최소 5회 계대 배양한)는 TNAP-, CC9+, HLA 클래스 I+, HLA 클래스 II-, CD14-, CD19-, CD3-, CD11a-c-, CD31-, CD86- 및/또는 CD80-일 수 있다. 그러나, 전술한 조건과 다른 배양 조건에서는 여러가지 마커의 발현은 바뀔 수 있다. 또한, 이러한 표현형의 세포는 증폭된 세포 집단에서 우위를 점할 수 있지만, 이러한 것이 이러한 표현형(들)을 가지지 않는 세포의 비율이 소수라는 것을 의미하진 않는다(예로, 증폭된 세포에서 적은 비율은 CC9-일 수 있음). 바람직한 일 구현예에서, 증폭된 세포는 여전히 여러가지 세포 타입으로 분화할 수 있는 능력을 가진다.
일 구현예에서, 상층물 또는 가용성 인자, 또는 세포 자체를 수득하기 위하여 사용되는 증폭된 세포 집단은, 세포의 25% 이상이, 더 바람직하기로는 50% 이상이 CC9+인 세포를 포함한다.
다른 구현예에서, 상층물 또는 가용성 인자 또는 세포 자체를 수득하기 위하여 사용되는 증폭된 세포 집단은, 세포의 40% 이상이, 더 바람직하기로는 45% 이상이 STRO-1+인 세포를 포함한다.
다른 구현예에서, 자손 세포는 LFA-3, THY-1, VCAM-1, ICAM-1, PECAM-1, P-셀렉틴, L-셀렉틴, 3G5, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD90, CD29, CD18, CD61, 인테그린 β, 6-19, 트롬보모듈린(thrombomodulin), CD10, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGF1-R, NGF-R, FGF-R, 렙틴-R, (STRO-2 = Leptin-R), RANKL, STRO-1bright 및 CD146으로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커 또는 이들 마커의 조합을 발현할 수 있다.
일 구현예에서, 자손 세포는 WO 2006/032092에서 정의된 다능성 증폭된 MPC 자손(MEMP)이다. 자손이 유래될 수 있는 MPC의 농화된 집단을 제조하는 방법은 WO 01/04268 및 WO 2004/085630에 기재되어 있다. 시험관 내에서, MPC는 절대적으로 순수한 조제물로서 존재하기는 어려우며, 일반적으로 조직 특이적으로 예정된 세포(tissue specific committed cell, TSCC)인 다른 세포와 같이 존재할 것이다. WO 01/04268에는, 골수 유래 세포를 약 0.1% 내지 90%의 순도로 수득하는 방법이 기재되어 있다. 자손이 유래되는 MPC를 포함하는 집단은 직접 조직 소스로부터 수확되거나, 또는 생체 외(ex vivo)에서 이미 증폭된 집단일 수도 있다.
예컨대, 자손은 이들이 존재하는 집단의 총 세포 중 약 0.1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 95% 이상을 차지하는, 수확된, 미증폭의 실질적으로 정제된 MPC 집단으로부터 수득할 수 있다. 이러한 수준은 예컨대 TNAP, STRO-1bright, 3G5+, VCAM-1, THY-1, CD146 및 STRO-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 한가지 이상의 마커에 양성인 세포를 선별함으로써, 달성할 수 있다.
MEMP는 마커 STRO-1bri에 대해 양성이고 마커 알카리 포스파타제(ALP)에 대해 음성이라는 점에서 막 회수한 MPC과 구별할 수 있다. 반면, 막 분리한 MPC는 STRO-1bri와 ALP에 모두 양성이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 투여되는 세포 중 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상은 표현형 STRO-1bri, ALP-를 가진다. 더 바람직한 구현예에서, MEMP는 마커 Ki67, CD44 및/또는 CD49c/CD29, VLA-3, α3β1 중 1종 이상에 대해 양성이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, MEMP는 TERT 활성을 나타내지 않으며/않거나, 마커 CD18에 음성이다.
MPC 출발 집단은 WO 01/04268 또는 WO 2004/085630에 기재된 임의의 하나 이상의 조직 타입, 즉 골수, 치수세포(dental pulp), 지방 조직 및 피부, 또는 보다 광의적으로는 지방 조직, 치아, 치수, 피부, 간, 신장, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 장, 폐, 비장, 림프절, 흉선, 췌장, 뼈, 인대, 골수, 힘줄 및 골격근으로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 실시에 있어서, 임의의 소정의 세포 표면 마커를 보유하고 있는 세포는 여러가지 많은 방법으로 분리할 수 있지만, 바람직한 방법은 관심 마커에 대한 결합제의 결합에 의존적이며, 높은 수준의 결합, 낮은 수준의 결합을 보이거나 또는 결합성이 없는 것을 분리된다. 가장 일반적인 결합제는 항체 또는 항체 기반의 분자이며, 바람직하게는 이러한 후자 물질의 특이성 때문에 단일클론 항체이거나 또는 단일클론 항체를 기본으로 한다. 항체는 두가지 단계에 이용할 수 있지만, 다른 물질 또한 사용할 수 있으므로, 이러한 마커에 대한 리간드 역시 채택하여 이들을 보유하거나 보유하지 않는 세포를 농화시킬 수 있다.
항체 또는 리간드를 조 분리(crude separation)가 가능하도록 고형 지지체에 부착시킬 수 있다. 분리 기법은, 바람직하기로는, 수집된 분획의 생장성 유지를 최대화하는 방법이다. 여러가지 효능의 다양한 기법을 채택하여 적절하게 조 분리물을 수득할 수 있다. 적용되는 특정 기법은 분리 효율, 관련된 세포독성, 수행 용이성 및 속도, 및 정교한 장치 및/또는 기술 능력의 필요성에 따라 결정될 것이다. 분리 과정은, 항체-코팅된 자기 비드를 이용하는 자기 분리, 친화성 크로마토그래피 및 고상 매트릭스에 부착된 항체를 이용한 "패닝(panning)"을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 정확한 분리를 제공하는 기법은 FACS가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
MPC 분리 방법은, 예컨대 STRO-1의 고수준 발현을 인식하는 MACS를 활용하는 제1 단계의 고상 분류 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 이후 제2 단계가 수반될 수 있으며, 특허 WO 01/14268에 개시된 바와 같이, 전구세포의 발현 수준을 더 높이는 것이 바람직하다. 이러한 제2의 분류 단계는 2종 이상의 마커를 사용하는 단계를 포함할 수 있다.
MPC 수득 방법은 제1 농화 단계 전에 공지된 기법으로 세포의 공급원을 수확하는 단계를 포함할 수도 있다. 따라서, 조직은 수술로 적출될 것이다. 공급원 조직을 포함하는 세포는, 이후 이른바 단일 세포 현탁물로 분리될 것이다. 이러한 분리는 물리적 및/또는 효소적인 방식으로 달성될 수 있다.
적합한 MPC 집단이 수득되고 나면, MEMP를 수득하기 위한 임의의 적합한 방식으로 배양 또는 증폭시킬 수 있다.
일 구현예에서, 세포는 치료받을 대상으로부터 채취되고, 표준 기법으로 시험관 내에서 배양한 후, 이를 이용하여 상기 대상에게 자기(autologous) 또는 동종 조성물(allogeneic composition)으로서 투여하기 위한 상층물 또는 가용성 인자 또는 증폭된 세포를 수득한다. 다른 구현예에서, 상층물 또는 가용성 인자를 얻기 위하여 1종 이상의 확립된 인간 세포주의 세포들이 이용된다. 본 발명의 다른 유용한 구현예에서, 상층물 또는 가용성 인자를 얻기 위하여, 인간을 제외한 동물(또는 환자가 인간이 아니고 다른 종인 경우)의 세포가 이용된다.
본 발명은 인간을 제외한 영장류의 세포, 유제류(ungulate), 개과 동물(canine), 고양이과 동물(feline), 토끼목(lagomorph), 설치류, 조류 및 어류의 세포 등의, 인간을 제외한 모든 동물 종 유래의 세포를 이용하여 실시할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 영장류 세포로는, 침팬지, 비비, 시노몰구스 원숭이 및 임의의 그외 신세계 또는 구세계 원숭이의 세포가 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용할 수 있는 유제류 세포로는 소, 돼지, 양, 염소, 말, 버팔로 및 비손(bison)의 세포가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용할 수 있는 설치류 세포로는 마우스, 랫, 기니아 피그, 햄스터 및 저빌쥐(gerbil)가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용할 수 있는 토끼목 동물의 구현예로는 토끼, 잭 토끼(jack rabbit), 산토끼(hare), 흰꼬리 토끼(cottontails), 눈신 토끼(snowshoe rabbit) 및 새앙토끼(pika)가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 닭(Gallus gallus)은 본 발명에서 사용할 수 있는 조류의 일 예이다.
본 발명의 방법에 사용가능한 세포는 사용 전에 또는 상층물 또는 가용성 인자를 얻기 전에 보관될 수 있다. 진핵 세포, 특히 포유류 세포의 보존 및 저장 방법과 프로토콜은 당업계에 잘 알려져 있다(비교, 예, Pollard, J. W. and Walker, J. M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Second Edition, Humana Press, Totowa, N.J.; Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, Fourth Edition, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.). 간엽 줄기/선조 세포 등의 분리된 줄기 세포 또는 이의 자손의 생물학적 활성을 유지시키는 임의 방법들을 본 발명에 적용할 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 세포는 동결-보존을 이용하여 유지 및 저장된다.
투여 및 조성물
상층물 또는 가용성 인자
본 발명의 방법은 MPC-유래 상층물 또는 가용성 인자들을 국소, 전신 또는 임플란트 또는 디바이스 내부 등의 국지적으로 적용하는 단계를 포함할 수 있다.
일 특정 구현예에서, 본 발명은 MPC-유래 상층물 또는 가용성 인자를 대상에게 전신 투여하는 단계를 포함한다. 예로, 상층물 또는 가용성 인자는 피하 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 이러한 구현예는 특정 조직의 생성 또는 복구이 바람직한 전신 퇴행성 질환의 치료에 유용할 수 있다. 이러한 방식으로 치료가능한 전신 퇴행성 질환의 예로는 골다공증 또는 골절, 또는 연골의 퇴행성 질환을 포함한다.
또한 MPC-유래 상층물 또는 가용성 인자를 사용하여, 신체의 표면 또는 그외 부분을 늘이는 등의, 미용적 기능을 제공하거나, 또는 질병 또는 외상이 발생한 연골 조직, 또는 정상적으로 발생되지 못한 조직의 복구 또는 치환이 필요한 환자를 치료할 수 있다. 치료는 새로운 연골 조직의 생성 및/또는 기존 연골 조직의 유지하기 위한 상층물 또는 가용성 인자들의 사용을 수반할 수 있다. 예컨대, MPc-유래 상층물 또는 가용성 인자를 사용하여 연골 병태, 예컨대 류마티스 관절염 또는 골관절염, 또는 연골의 외상 또는 수술 상처를 치료할 수 있다.
MPC-유래 상층물 또는 가용성 인자를 포함하는 현탁물은 주사용으로 적합한 오일성 현탁물로서 조제될 수 있다. 적합한 친지질성 용매 또는 비히클로는 참기름과 같은 지방 오일; 에틸 올레이트 또는 트리글리세라이드와 같은 합성 지방산 에스테르; 또는 리포좀을 포함한다. 또한, 주사용으로 사용되는 현탁물에는 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁물의 점성을 증가시키는 물질이 포함될 수 있다. 선택적으로, 현탁물은 또한 고도로 농축화된 용액의 제조가 가능하도록 화합물의 용해성을 증가시키는 물질이나 적합한 안정화제를 포함할 수 있다.
멸균 주사용 용액은, 적정 용매중에 필수량의 상층물 또는 가용성 인자를 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 조합과 혼합한 다음, 필요에 따라, 여과 멸균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산물은, 기본 분산 매질과 상기 열거된 성분들 이외의 다른 필수 성분이 포함된 멸균 비히클에 상층물 또는 가용성 인자를 병합함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이미 멸균-여과한 용액으로부터 활성 성분과 원하는 부가적인 성분의 분말을 만드는, 진공 건조 및 동결 건조이다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 상층물 또는 가용성 인자는 이의 용해도를 증가시키는 하나 이상의 부가적인 화합물과 함께 제형화될 수 있다.
세포성 조성물
일 구현예에서, 본 발명의 세포성 조성물은 예컨대 배양 배지에서 배양한 바와 같은, 미분화 세포로서 투여된다. 다른 예로, 세포성 조성물은 배양한 후 투여될 수 있다.
본 발명에 유용한 세포성 조성물은 단독으로 또는 다른 세포와 혼합하여 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 투여할 수 있는 세포로는, 다른 다능성(multipotent) 또는 전능성(pluripotent) 세포, 또는 연골세포, 연골모세포, 골세포, 골모세포, 파골세포, 골 라이닝 세포, 줄기 세포 또는 골수 세포를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 여러가지 타입의 세포를 본 발명의 조성물과 투여하기 바로 전 또는 직전에 혼합하거나, 또는 투여하기 전 일정 시간 동안 함께 공-배양할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 세포 조성물을 이용한 치료를 개시하기 전에, 환자의 면역을 억제하는 것이 필수가 아니거나 또는 바람직하지 않을 수 있다. 따라서, 동종이형 또는 이종의 MEMP 또는 그것의 자손의 이식은 일부 경우에서는 허용될 수 있다.
그러나, 다른 경우에, 세포 치료를 개시하기 전에 환자의 면역을 약물학적으로 억제하는 것이 바람직하거나 적절할 수도 있다. 이는 전신성 또는 국소 면역억제제를 이용하여 달성할 수 있으며, 또는 캡슐화된 장치를 통해 세포를 전달함으로써 수행할 수 있다. 세포는, 세포가 필요로 하는 영양분과 산소, 그리고 치료학적 인자는 투과가능하지만, 면역 체액성 인자와 세포는 비투과성인, 캡슐에 캡슐화될 수 있다. 바람직하게는, 캡슐화제는 저자극성이며, 표적 조직에 용이하고 안정적으로 위치시킬 수 있으며, 이식된 구조물에 추가적인 보호를 제공한다. 이식된 세포에 대한 면역반응을 감소 또는 없애기 위한 이러한 및 다른 방법들은 당업계에 공지되어 있다. 다른 예로, 세포를 유전자 변형하여 이의 면역원성을 낮출 수 있다.
일반적인 사항
"치료학적 유효량"은 투약(dosage) 및 필수 시간적 기간 동안에 원하는 효과를 달성하는데 효과적인 양을 의미한다.
"예방학적 유효량"은 투약(dosage) 및 필수 시간적 기간 동안에, 세포 자살 또는 조직 손상을 예방하거나 저해하는 것과 같은, 원하는 예방학적 결과를 달성하는데 효과적인 양을 의미한다.
투여되는 상층물, 가용성 인자의 양 또는 MPC 또는 그것의 자손은 개체의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자들에 따라 변경할 수 있다. 투약 요법은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예로, 1회 볼루스(bolus) 투여하거나, 일정 시간 동안 여러번 분할하여 투여하거나, 또는 투여량을 치료 상태의 위급성에 따라 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수 있다. 투여 용이성 및 투약 균일성을 위해 투약 단위 형태로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 이로울 수 있다. "투약 단위 형태"는 본원에서 처리할 개체에게 단일 투약으로서 조절된 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 필요한 약학 담체와 조합하여 원하는 치료 효과를 형성하도록 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 양을 포함한다.
상층물, 가용성 인자의 양 또는 MPC 또는 그것의 자손은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물의 형태로 투여할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
본원에서, "약학적으로 허용가능한 담체" 또는 "부형제"는 생리적으로 사용가능한, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항세균제, 항진균제, 등장제, 흡수 지연제 등을 포함한다. 일 구현예에서, 비경구 투여에 적합하다. 다른 예로, 담체는 정맥내, 복막내, 근육내, 설하 또는 경구 투여에 적합할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 멸균 수용액이나 분산물, 및 멸균 주사용액 또는 분산물을 즉석에서 제조하기 위한 멸균 분말을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질에 대한 이러한 매질 및 물질의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 종래 매질 또는 제제가 활성 화합물과 혼용가능하지 않은 경우를 제외하고는, 본 발명의 약학 조성물내에 이들의 사용이 포함된다. 또한, 보충적인 활성 화합물도 상기 조성물에 병합시킬 수 있다.
치료 조성물은, 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균 상태이고 안정적이어야 한다. 상기 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀 또는 그외 고도화된 구조로서 제형화될 수 있다. 담체는, 예컨대 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적정 혼합물을 포함하고 있는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예컨대, 렉시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산물의 경우에 필수 입자 크기 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해, 적절한 유동성을 유지시킬 수 있다. 많은 경우들에서, 등장성 물질, 예컨대, 당, 만니톨과 같은 폴리알코올, 소르비톨 또는 소듐 클로라이드를 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 장기 흡수(prolonged absorption)는, 흡수를 지연시키는 물질, 예컨대 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 이룰 수 있다. 또한, 자극 인자를, 시간 방출 제형, 예컨대 서방형 폴리머를 포함하는 조성물로 투여할 수 있다. 활성 화합물은, 임플란트 및 미세캡슐화된 전달 시스템 등의, 조절성 방출 제형과 같이 화합물이 신속하게 방출되지 않도록 보호하는 담체와 함께 조제할 수 있다. 생분해성의 생체적합한 폴리머, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 폴리락트산 및 폴리락틱, 폴리글리콜릭 공중합체(PLG)를 사용할 수 있다. 이러한 제형의 제조하기 위한 다수의 방법들이 특허되어 있으며, 당업자들에게 일반적으로 공지되어 있다.
상층물, 가용성 인자 또는 세포 조성물은, 예컨대 가용성 인자의 느린 방출을 제공하기 위해, 적합한 매트릭스와 조합하여 투여할 수 있다.
매트릭스 재료의 선택은 생체적합성, 생분해성, 기계적 특성, 미용적 외양(cosmetic appearance) 및 인터페이스 특징을 기초로 한다. 조성물에 대해 사용가능한 매트릭스는 생분해성이며, 화학적으로 정해진 칼슘 설페이트, 트리칼슘 포스페이트, 하이드록시아파티트, 폴리락트산 및 폴리안하이드라이드일 수 있다. 그외 가능성 있는 물질은 생분해성이며, 골 또는 진피 콜라겐과 같이 생물학적으로 잘 규정되어 있는 것이다. 추가적인 매트릭스는 순수한 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분으로 구성된다. 그외 가능성 있는 매트릭스는 비-생분해성이며, 소결된 하이드록시아파티트, 바이오글라스, 알루미네이트 또는 다른 세라믹류와 같이 화학적으로 규정된다. 매트릭스는 폴리락트산 및 하이드록시아파티트 또는 콜라겐 및 트리칼슘 포스페이트와 같이, 전술한 타입의 물질의 임의 조합으로 구성될 수 있다. 바이오세라믹류는 칼슘-알루미네이트-포스페이트와 같은 조성물 중에서 변형될 수 있으며, 이를 가공하여 기공 크기, 입자 크기, 입자 형태 및 생분해성을 변경시킬 수 있다.
MPC-유래 상층물 또는 가용성 인자, MPC 또는 그것의 자손은, 복구 또는 확대가 필요한 부위에, 수술을 통해 이식하거나, 주사하거나, 전달(예, 카테터나 또는 주사 바늘을 이용하여)하거나, 그렇지 않다면 직접 또는 간접적으로 투여할 수 있다. MPC-유래 상층물 또는 가용성 인자의 투여 경로는 근육내, 눈, 비경구(정맥내 포함), 동맥내, 피하, 경구 및 코 투여를 포함한다. 비경구 투여의 특정 경로로는 근육내, 피하, 복막내, 뇌내, 뇌실내(intraventricular), 대뇌뇌실내(intracerebroventricular), 경막내, 수조내(intracisternal), 척추내 및/또는 말초-척추 투여 경로가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일부 구현예에 있어서, 제형은 미국 특허 공개번호 2002/0022676; Anseth et al. (2002) 및 Wang et al.(2003)에 기술된 바와 같이, 인 시츄(in situ) 중합성 겔(polymerizable gel)을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리머는 하전된 측기 또는 그것의 1가 이온성 염을 가지는, 물, 완충화된 염 용액 또는 알코올 수용액과 같은 수용액 중에 일정 부분 이상 용해된다. 양이온과 반응할 수 있는 산성 측기를 가진 폴리머의 예는, 폴리(포스파젠), 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 아크릴산과 메타크릴산의 공중합체, 폴리(비닐 아세테이트) 및 설폰화된 폴리스티렌과 같은 설폰화된 폴리머가 있다. 아크릴 또는 메타크릴산과 비닐 에테르 모노머 또는 폴리머의 반응에 의해 형성되는 산성 측기를 가지고 있는 공중합체도 사용할 수 있다. 산성기의 예로는 카르복시산기, 설폰산기, 할로겐화된(바람직하기로는 플루오르화된) 알코올기, 페놀의 OH기, 및 산성 OH기가 있다.
음이온과 반응할 수 있는 염기성 측기를 가지고 있는 폴리머의 예로는, 폴리(비닐 아민), 폴리(비닐 피리딘), 폴리(비닐 이미다졸) 및 일부 이미노 치환된 폴리포스파젠이 있다. 폴리머의 암모늄 또는 4급 염은 벡본 니트로겐 또는 부속 이미노기로부터 형성될 수 있다. 염기성 측기의 예는 아미노 및 이미노기이다.
알기네이트는 이가 양이온과, 수중에서, 실온에서, 이온 가교에 의해, 하이드로겔 매트릭스를 형성할 수 있다. 이러한 온화한 조건으로 인해, 알기네이트는 예컨대 미국 특허 제 4,352,883호에 개시된 바와 같이, 하이브리도마 세포의 캡슐화에 가장 일반적으로 사용되는 폴리머이다. 미국 특허 제 4,352,883호에 개시된 방법에서, 캡슐화할 생물 물질을 포함하는 수용액을 수용성 폴리머 용액에 현탁하고, 현탁물을 소적(droplet)으로 만든 다음, 다가 양이온과의 접촉에 의해 개별적인 미세캡슐로 변환시키고, 미세캡슐 표면을 폴리아미노산과 가교시켜 캡슐화된 물질 주위에 반투과성 막을 형성시킨다.
폴리포스파젠은 교차성 단일 결합 및 이중 결합에 의해 분리되어 있는 니트로겐 및 포스포로스로 구성된 백본을 가진 폴리머이다. 각 포스포러스 원자는 2개의 측쇄와 공유 결합되어 있다.
가교에 적합한 폴리포스파젠은, 대부분이 2가 또는 3가 양이온과 염 브릿지를 형성할 수 있으며 산성인 측쇄기를 가지고 있다. 바람직한 산성 측기의 예는 카르복시산기 및 설폰산기이다. 가수분해에 안정적인 폴리포스파젠은 Ca2 + 또는 Al3+과 같은 2가 또는 3가 양이온에 의해 가교된 카르복시산 측기를 가지고 있는 모노머들로 형성된다. 이미다졸, 아미노산 에스테르 또는 글리세롤 측기를 가진 모노머들을 병합함으로써 가수분해에 의해 분해되는 폴리머를 합성할 수 있다. 예컨대, 폴리양이온성 폴리[비스(카르복실아토페녹시)]포스파젠(PCPP)을 합성할 수 있으며, 이는 실온 또는 실온 보다 낮은 온도에서 수계 매질중에 용해된 다가 양이온과 가교하여, 하이드로겔 매트릭스를 형성한다.
생분해성 폴리포스파젠은 2종 이상의 상이한 타입의 측쇄, 다가 양이온과 염 브릿지를 형성할 수 있는 산성기, 및 생체내 조건에서 예컨대 이미다졸 기, 아미노산 에스테르, 글리세롤 및 글루코실을 가수 분해하는 측기를 가지고 있다
측쇄의 가수 분해로 폴리머는 마멸(erosion)된다. 가수 분해성 측쇄의 예는 비치환 및 치환된 이미디졸, 및 아미노 연결을 통해 포스포러스 원자에 기가 결합되어 있는 아미노산 에스테르이다(R 기 둘다 이러한 방식으로 부착된 폴리포스파젠 폴리머는 폴리아미노포스파젠임). 폴리이미다졸포스파젠의 경우, 폴리포스파젠 벡본 상의 "R" 기 중 일부는 고리의 질소 원자를 통해 벡터의 포스포러스에 부착되어 있는 이미다졸 고리이다. 그외 "R"기는 메틸 페녹시기 또는 Allcock et al. (1977)의 과학 논문에 기재된 다른 기와 같이, 가수 분해에 관여하지 않는 유기 잔기일 수 있다. 하이드로겔 물질의 합성 방법과 이러한 하이드로겔의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다.
MPC-유래 상층물 또는 가용성 인자, MPC 또는 그것의 자손은 다른 유익한 약물이나 생물 분자(성장 인자, 영양 인자)와 함께 투여할 수 있다. 다른 물질과 함께 투여하였을 때, 이들은 단일 약학 조성물로 함께, 또는 개별적인 약학 조성물로 다른 물질과 동시에 또는 연속적으로(다른 물질의 투여 전 또는 후) 투여할 수 있다. 함께 투여할 수 있는 생활성 인자로는, 항-세포자살제(예, EPO, EPO 항체모방체(mimetibody), TPO, IGF-I 및 IGF-II, HGF, 카스파제 저해제); 항-염증제(예, p38 MAPK 저해제, TGF-beta 저해제, 스타틴, IL-6 및 IL-1 저해제, PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE, SIROLIMUS, 및 NSAID(비스테로이드계 항-염증제; 예, TEPOXALIN, TOLMETIN, SUPROFEN); 면역억제제/면역조절제(예, 사이클로스포린, 타크롤리무스와 같은 칼시뉴린(calcineurin) 저해제; mTOR 저해제(예, SIROLIMUS, EVEROLIMUS); 항-증식제(예, 아자티오프린(azathioprine), 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil)); 코르티코스테로이드(예, 프레드니솔론(prednisolone), 하이드로코르티손(hydrocortisone)); 단일클론 항-IL-2Rα 리셉터 항체와 같은 항체(예, 바실릭시맵(basiliximab), 다클리주맵(daclizumab)), 다클론성 항-T-세포 항체(예, 항-흉선 세포 글로불린(ATG); 항-림프구 글로불린(ALG); 단일클론 항-T 세포 항체 OKT3)); 항-혈전제(anti-thrombogenic agents)(예, 헤파린, 헤파린 유도체, 유로키나제, PPack(덱스트로페닐알라닌 프롤린 아르기닌 클로로메틸케톤), 항트롬빈 화합물, 혈소판 리셉터 길항제, 항-트롬빈 항체, 항-혈소판 리셉터 항체, 아스피린, 디피리다몰, 프로타민, 히루딘, 프로스타글란딘 저해제 및 혈소판 저해제); 및 항-산화제(예, 프로부콜(probucol), 비타민(vitamin) A, 아스코르브산, 토코페롤, 코엔자임 Q-1O, 글루타티온, L-시스테인, N-아세틸시스테인) 뿐만 아니라 국소 마취제를 포함한다. 다른 예에서, MPC-유래 상층물 또는 가용성 인자, MPC 또는 그것의 자손은 미국 특허 제 5,827,735호에 언급된 바와 같이, 흉터 저해 인자와 함께 병행-투여할 수 있다.
결합 조직의 분해 및/또는 염증으로 인한 질환을 치료 및/또는 예방하는 경우에, 상층물, 가용성 인자 또는 세포는 연골보호제와 함께 투여하는 것이 바람직하다. 그 예로는, 펜토산 폴리설페이트(SP54 및 Cartrophen), 글리코스아미노글리칸 폴리설페이트 에스테르(Arteparon), 글리시아미노-글리칸-펩탕드 복합체(Rumalon) 및 히알루론산(Hyalgan)이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 추가적인 예는 Verbruggen (2005) 및 Richette and Bardin (2004)에 언급되어 있다. 바람직한 예에서, 연골보호제는 히알루론산이다.
피브린 글루
피브린 글루는 다양한 임상적인 상황에서 사용되는 외과 봉합제의 한 유형이다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 많은 밀봉제들이 본원에 정의된 방법에 있어 유용하다. 그러나, 본 발명의 바람직한 예는 피브린 글루의 용도에 관한 것이다.
본원에서, 용어 "피브린 글루"는 칼륨 이온의 존재 하에서, 피브린 폴리머의 가교에 의해 형성된 불용성의 매트릭스를 지칭한다. 피브린 글루는, 피브린 매트릭스를 형성하는 유체나 생물 조직으로부터 유래된, 피브리노겐이나 이의 유도체 또는 대사산물, 피브린(수용성 단량체 또는 폴리머) 및/또는 이의 복합체로부터 만들 수 있다. 또한, 피브린 글루는, 재조합 DNA 기술에 의해 생산된, 피브리노겐, 이의 유도체 또는 이의 대사 산물, 또는 피브린으로부터 형성될 수 있다.
또한, 피브린 글루는 피브리노겐과 피브린 글루 형성 촉매(예, 트롬빈 및/또는 팩터 XIII)와의 상호작용에 의해 만들어질 수 있다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 피브리노겐은 촉매(예, 트롬빈)의 존재시 단백질이 절단됨으로써 피브린 단량체로 변환된다. 피브린 단량체는 이후 가교되어 피브린 글루 매트릭스를 형성할 수 있는 폴리머를 형성할 수 있다. 피브린 폴리머의 가교는 팩터 XIII과 같은 촉매의 존재에 의해 증진될 수 있다. 피브린 글루 형성의 촉매는 혈장, 동결침전물(cryoprecipitate) 또는 피브리노겐이나 트롬빈을 포함하고 있는 그외 혈장 분획으로부터 유래될 수 있다. 또는, 촉매는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다.
응괴 형성율은 피브리노겐과 혼합된 트롬빈의 농도에 의존한다. 효소 의존적인 반응으로, 온도가 높을수록(최대 37 ℃), 응괴 형성율은 빨라진다. 응괴의 장력 강도는 사용되는 피브리노겐의 농도에 의존적이다.
피브리노겐 글루의 용도 및 이의 제조 및 사용 방법은 미국 특허 제5,643,192호에 기재되어 있다. Hirsh는 단일 공여체로부터 피브리노겐과 트롬빈 성분의 추출 방법과 피브린 글루로서 사용하기 위한 이들 성분들만의 조합을 기재하고 있다. Marx 미국 특허 5,651,982에는 피브린 글루의 다른 조제물과 이용 방법이 기술되어 있다. Marx는 포유류에 국조 봉합제로서 사용하기 위한 피부린 글루와 리포좀을 제공하고 있다. 손상 치유를 위한 국소 피브리노겐 복합체(TFC)으 제조 및 사용은 당해 분야에 공지되어 있다. The American Red Cross의 국제 특허 공개 번호 WO96/17633에서는, 피브리노겐, 트롬빈 및 칼슘 클로라이드를 포함하는 TFC 조제물이 논의되어 있다.
몇 가지 공개문헌들에 치료제의 전달을 위한 피브린 글루의 사용이 개시되어 있다. 구현예에서, 미국 특허 4,983,393에는 아가로스, 아가, 염수 용액, 글리코사미노글리칸, 콜라겐, 피브린 및 효소를 포함하는 질내 삽입물로서 이용하기 위한 조성물이 개시되어 있다. 또한, 미국 특허 3,089,815에는 피브리노겐 및 트롬빈으로 구성된 주사용 약리학적 조제물이 개시되어 있으며, 미국 특허 6,468,527에는 체내 특정 부위에 다양한 생물학제 및 비-생물학제의 전달을 용이하게 하는 피브린 글루가 개시되어 있다.
유전적으로 변형된 세포의 제조
일 구현예에서, 상층물 또는 가용성 인자의 제조 등의 본 발명의 방법에 사용되는 세포는 유전적으로 변형된다. 바람직하게는, 세포는 이종의 단백질을 생산하도록 유전적으로 변형된다. 전형적으로, 세포는 이종 단백질이 세포로부터 방출되도록 유전적으로 변형될 것이다. 그러나, 일 구현예에서, 세포는 dsRNA(전형적으로 RNA 침묵), 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 촉매성 핵산(예, 리보자임 또는 DNAzyme)과 같은 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 기능적인 비-단백질을 발현하도록 변형될 수 있다.
유전적으로 변형된 세포는 상기 변형된 세포의 생장을 뒷받침하기에 충분한 양의 한가지 이상의 사이토카인의 존재하에 배양할 수 있다. 이렇게 수득되는 유전적으로 변형된 세포는 바로 이용(예, 이식에)하여 배양 및 시험관내에서 증폭시키거나, 또는 나중에 이용하기 위해 보관할 수 있다. 변형된 세포는, 예컨대 액체 질소에서의 동결과 같이, 당업계에 잘 알려져 있는 방법으로 저장할 수 있다.
본원에서 유전적 변형은 외인성 또는 외래 폴리뉴클레오티드의 본원에 기술된 세포로의 도입, 또는 세포내 내인성 유전자의 변형을 포함하는, 임의의 유전적 변형 방법을 포함한다. 유전적 변형은, 형질전이(바이러스 매개의 숙주 또는 공여체로부터 숙주 DNA를 수용체로 시험관내 또는 생체내 전달), 형질감염(분리된 바이러스 DNA 게놈으로 세포를 형질전환시킴), 리포좀 매개의 전이, 전기천공(electroporation), 칼슘 포스페이트 형질감염 또는 공-침전 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 형질전이 방법으로는, 세포와 생산자 세포의 직접적인 공배양(Bregni et al., 1992) 또는 바이러스 상층물과 단독으로 또는 적절한 성장 인자 및 폴리양이온과 배양하는 방법이 있다.
외인성 폴리뉴클레오티드는, 바람직하기로는 벡터 형태로 숙주 세포에 도입된다. 벡터는 바람직하기로는 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역에 필수적인 요소를 포함한다. 이러한 벡터 구축에 사용되는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예컨대, 적절한 발현 벡터를 구축하는 기법은 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. (3rd Ed., 2000); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1999)에 구체적으로 기재되어 있다.
벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스(adeno-associated virus) 및 헤르페스 심플렉스 바이러스와 같은 바이러스 벡터; 코스미드; 플라스미드 벡터; 합성 벡터; 및 당업계에서 전형적으로 사용되는 그외 재조합 비히클이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 프로모터 및 폴리뉴클레오티드를 작동가능하게 연결시킬 수 있는 클로닝 사이트 둘다를 포함하고 있는 벡터는, 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 벡터는 시험관내 또는 생체내에서 RNA를 전사할 수 있으며, Stratagene (La Jolla, Calif.) 및 Promega Biotech (Madison, Wis.)과 같은 업체로부터 구입가능하다. 구체적인 예로는, Stratagene 사의 pSG, pSV2CAT, pXtl; 및 Pharmacia 사의 pMSG, pSVL, pBPV 및 pSVK3가 있다.
바람직한 벡터로는 레트로바이러스 벡터가 있다(참조, Coffin et al., "Retroviruses", Chapter 9 pp; 437-473, Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1997). 본 발명에 사용가능한 벡터는 당업계에 잘 알려져 있는 방법으로 재조합으로 제조할 수 있다. 예로, WO94/29438, WO97/21824 및 WO97/21825에는, 레트로 패키징 플라스미드 및 패킹 세포주의 구축이 언급되어 있다. 예시적인 벡터로는 pCMV6b 및 pCMV6c(Chiron Corp.)와 같은 pCMV 포유류 발현 벡터, pSFFV-Neo 및 pBluescript-Sk+가 있다. 이용가능한 레트로바이러스 벡터의 비제한적인 예로는, 설치류, 조류 또는 영장류 레트로바이러스로부터 유래된 것이다. 일반적인 레트로바이러스 벡터로는, 몰루니 설치류 백혈병 바이러스를 근간으로 한 벡터(MoMLV-vector)가 있다. 그외 MoMLV 유래 벡터로는 Lmily, LINGFER, MINGFR 및 MINT가 있다. 추가적인 벡터로는 GALV(Gibbon ape leukemia virus), MOMSV(Moloney murine sarcoma virus) 및 SFFV(spleen focus forming virus) 유래 벡터가 있다. MESV(murine stem cell virus)로부터 유래된 벡터로는 MESV-MiLy가 있다. 또한, 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스를 근간으로 한 벡터를 포함하며, 비제한적인 예로 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1 및 HIV-2)를 근간으로 한 벡터가 있다.
레트로바이러스 벡터 구조체의 제조에 있어, 바이러스의 gag, pol 및 env 서열을 바이러스에서 제거하여 외래 DNA 서열을 삽입하기 위한 공간을 만들 수 있다. 외래 DNA에 의해 코딩되는 유전자는 일반적으로 LTR(long terminal repeat)에서 강력한 바이러스 프로모터의 통제하에 발현된다. 적절한 조절 서열의 선택은 사용되는 숙주 세포에 따라 의존적이며, 선택은 당업자의 능력내에서 이루어진다. LTR의 프로모터 외에도 다수의 프로모터들이 알려져 있다. 비제한적인 예로는, 파지 람다 PL 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 조기 프로모터(immediate early promoter); 몰로니 설치류 사코마 바이러스(MMSV), 루이스 사코마 바이러스(RSV) 또는 비장 집중 형성 바이러스(SFFV)의 U3 영역 프로모터; Granzyme A 프로모터; 및 Granzyme B 프로모터가 있다. 부가적으로, 유도성 및 다수개의 조절 요소가 사용될 수 있다. 적합한 프로모터의 선택은 당업자들에게 명백할 것이다.
이러한 구조체는 gag, pol 및 env 기능이 팩킹(packing) 세포주에 의해 트랜스로 제공된다면 효율적으로 바이러스 입자에 팩킹될 수 있다. 따라서, 벡터 구조체가 팩킹 세포에 도입되었을 때, 세포에서 생산된 gag-pol 및 env 단백질이 벡터 RNA와 조합하여 배양 배지로 분비되는 감염성 바이런(viron)을 생산한다. 이렇게 제조된 바이러스는 표적 세포에 감염하여 표적 세포의 DNA에 삽입할 수 있지만, 필수적인 팩킹 서열이 없어 감염성 바이러스 입자를 형성하진 못한다. 현재 사용되는 대부분의 팩킹 세포주는, 각각 필수 코딩 서열들 중 하나를 포함하고 있는 개별 플라스미드에 의해 형질감염되므로, 복제 가능한(replication competent) 바이러스가 제조될 수 있기 전에 여러 번의 재조합이 필수적으로 이루어진다. 다른 예로, 팩킹 세포주는 프로바이러스를 가진다. 프로바이러스는 결함이 있어, 감염성 바이러스 조합에 필요한 단백질을 모두 생산할 수 있지만 자신의 RNA를 바이러스로 팩킹할 수 없다. 대신 재조합 바이러스에서 생산된 RNA가 팩킹된다. 그러므로, 팩킹된 세포로부터 방출되는 바이러스 스톡(stock)은 오직 재조합 바이러스만 포함한다. 레트로바이러스 팩킹 주에 대한 비제한적인 예로는, PA12, PA317, PE501, PG13, PSI.CRIP, RDI 14, GP7C-tTA-G10, ProPak-A (PPA-6), 및 PT67가 있다.
그외 적합한 벡터로는 아데노바이러스 벡터(참조, WO 95/27071)와 아데노-부속 바이러스 벡터가 있다. 이들 벡터는, 당업계, 예컨대 Stem Cell Biology and Gene Therapy, eds. Quesenberry et al., John Wiley & Sons, 1998; 및 미국 특허 제 5,693,531호 및 제 5,691,176호에, 잘 알려져 있다. 아데노바이러스 유래 벡터의 사용은, 상기 벡터가 비분열성 세포에는 감염할 수 없기 때문에, 특정 조건에서는 유용할 수 있다. 레트로바이러스 DNA와는 다르게, 아데노바이러스 DNA는 표적 세포의 게놈에 삽입되지 않는다. 게다가, 외래 DNA를 수송하는 능력도 레트로바이러스 벡터 보다 아데노바이러스 벡터가 더 우수하다. 아데노-부속 바이러스 벡터는 다른 유용한 전달 시스템이 된다. 이러한 바이러스의 DNA는 비분열성 세포에 삽입할 수 있으며, 다수의 폴리뉴클레오티드를 아데노-부속 바이러스 벡터를 이용하여 다양한 세포 타입에 성공적으로 도입시킨다.
일부 예들에 있어서, 구조체 또는 벡터는 2종 이상의 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다. 바람직하기로는, 추가적인 핵산 서열은 선별 마커, 구조 유전자, 치료 유전자 또는 사이토카인/케모카인 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
선별 마커는 성공적인 유전적 변형을 모니터링하기 위해, 그리고 DNA가 삽입된 세포 선별을 위해, 구조체 또는 벡터에 포함시킬 수 있다. 이의 비제한적인 예로는 G148 또는 히그로마이신과 같은 약물 내성 마커가 있다. 부가적으로, 예컨대 마커가 HSV-tk 유전자인 경우에는 음성 선별을 이용할 수 있다. 이 유전자는 세포가 아시클로버 및 간시클로버와 같은 제제에 민감해지게 할 것이다. NeoR(네오마이신/G148 내성) 유전자가 통상적으로 이용되고 있지만, 유전자 서열이 사용가능한 표적 세포에 기존재하지 않는 모든 기존의 마커 유전자들을 사용할 수 있다. 다른 비제한적인 예로는, 저-친화성 신경 성장 인자(NGFR), 보강된 형광 그린 단백질(EFGP), 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자(DHFR), 박테리아 hisD 유전자, 설치류 CD24(HSA), 설치류 CD8a(lyt), 푸로마이신 또는 플레오마이신에 대해 내성을 부여하는 박테리아 유전자 및 베타-갈락토시다제가 있다.
상기 추가적인 폴리뉴클레오티드 서열(들)은은 동일한 벡터 상에서 숙주 세포에 도입되거나, 또는 제2의 벡터 상에서 숙주 세포로 도입될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 선별 마커는 동일한 벡터 상에 폴리뉴클레오티드로서 포함될 것이다.
또한, 본 발명은, 내인성 유전자의 발현이 천연형 세포에 비해 코딩된 단백질의 생산 증가를 초래하는 상향-조절되도록, 내인성 유전자의 프로모터 영역의 유전적 변형을 포함한다.
본 발명은 대상의 결합 조직을 생성, 복구 및/또는 유지하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 대상에서 결합 조직의 분해 또는 염증에 의해 발생되는 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
도 1. 히알루로난(HA) 또는 HA + 다양한 농도의 간엽 전구 세포(MPC)를 주사한 관절에 대한, 반월 연골 절제술 후 12주의 대퇴골 및 경골 연골의 형태 스코어, 평균 + SD.
도 2. 히알루로난(HA) 또는 HA + 다양한 농도의 간엽 전구 세포(MPC)를 주사한 관절에 대한, 반월 연골 절제술 후 12주의 대퇴 및 경골 골증식체(osteophyte) 스코어, 평균 + SD.
도 3. 간엽 전구 세포(MPC)를 다양한 농도로 주사한 동물에서의, 연골 형태 관절 스코어의 [HA/(MPC+HA)] 비. 비 = 1은 2가지 처치가 동일하게 효과적인 것을 의미하고, 비 > 1은 HA 보다 MPC+HA가 효과적임을 의미한다.
도 4. HA 단독 대비 여러가지 농도의 MPC + HA를 주사한 동물에서의, 골증식체의 [HA/(MPC+HA)] 비. 비 = 1은 2가지 처치가 동일하게 효과적인 것을 의미하고, 비 > 1은 HA 보다 MPC+HA가 효과적임을 의미한다.
도 5. 히알루로난(HA) 또는 108 MPC + HA를 주사한 관절의 연골에 대한, 반월 연골 절제술 후 12주째의 조직 형태계측학적으로 측정한 영역의 두께 스코어, 평균 + SE. 모든 대퇴 연골 영역은 HA + 108 MPC > HA임(p<0.05).
도 6. 다양한 농도의 간엽 전구 세포(MPC)를 주사한 동물의, 맨킨 변형 관절에 대한 조직병리학적 총 스코어의 평균 + SE의 [HA/(MPC+HA)] 비. 비 = 1은 2가지 처리가 동일하게 효과적인 것을 의미하고, 비 > 1은 HA 보다 MPC+HA가 효과적임을 의미한다.
도 7. 반월 연골 절제술 후 12주, 24주 및 52주의, HA 또는 108 MPC + HA를 주사한 관절에 대한, 대퇴 및 경골 연골의 형태 스코어 평균 + SD.
도 8. 반월 연골 절제술 후 12주, 24주 및 52주의, HA 또는 108 MPC + HA를 주사한 관절에 대한, 대퇴 및 경골 골증식체 스코어 평균 + SD.
도 9. 반월 연골 절제술 후 12주, 24주 및 52주의, 간엽 전구 세포(MPC)를 주사한 동물에 대한, 연골 형태 관절 스코어의 [HA/(MPC+HA)] 비. 비 = 1은 2가지 처치가 동일하게 효과적인 것을 의미하고, 비 > 1은 HA 보다 MPC+HA가 효과적임을 의미한다.
도 10. 반월 연골 절제술 후 12주, 24주 및 52주의, 간엽 전구 세포(MPC)를 주사한 동물에 대한, 골증식체 관절 스코어의 [HA/(MPC+HA)] 비. 비 = 1은 2가지 처치가 동일하게 효과적인 것을 의미하고, 비 > 1은 HA 보다 MPC+HA가 효과적임을 의미한다.
도 11. 반월 연골 절제술 후 12주, 24주 및 52주의, 간엽 전구 세포(MPC)를 주사한 동물의 맨킨 변형 관절에 대한 연골의 조직병리학적 스코어 평균 + SE의 [HA/(MPC+HA)] 비. 비 = 1은 2가지 처치가 동일하게 효과적인 것을 의미하고, 비 > 1은 HA 보다 MPC+HA가 효과적임을 의미한다.
도 12. 히알루로난(HA) 또는 다양한 농도의 MPC + HA를 주사한 관절의, 슬개골 연골의 강도(stiffness) 평균 + SE. *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001, ****=p<0.0001.
도 13. 히알루로난(HA) 또는 108 MPC + HA를 주사하고, 반월 연골 절제술 후 12주, 24주 및 52주에 희생시킨, 관절의 슬개골 연골 강도 평균 + SE. *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001, ****=p<0.0001.
도 14. 히알루로난(HA) 또는 다양한 농도의 MPC + HA를 주사한 관절의, 슬개골 연골의 상 지연(phase lag), 평균 + SE. *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001, ****=p<0.0001.
도 15. 히알루로난(HA) 또는 108 MPC + HA를 주사하고, 반월 연골 절제술 후 12주, 24주 및 52주에 희생시킨, 관절의 슬개골 연골의 상 지연(phase lag), 평균 + SE. *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001, ****=p<0.0001.
도 16. 무처리 거세 수컷 양과 난소 절제한 암양의 관절 연골 형태 스코어의 비교로서, OA 병변의 중증도는 암컷 그룹에서 현저한 것으로 나타남.
도 17. 무처리 거세 수컷 양과 난소 절제한 암양에서의, 반월 연골 절제술 후 12주째에 관절의 골증식체 스코어를 비교한 것으로서, 암컷 그룹에서 스코어가 상당히 높음.
도 18. 반월 연골 절제술 후 12주째에 히알루로난(HA) 또는 108 MPC + HA를 주사한 난소 절제한 암양의 관절에 대한, 반월 연골 절제술 후 36주째의 변형된 맨킨 연골의 조직병리학적 스코어, 평균 + SD. P 값 = HA 대 MPC+HA. 이 결과는, MPC 단독 주사가 대퇴골 유리질 연골의 비정상적인 조직병리학적 스코어를 6개월간 경골 연골에 비해 높은 수준으로 낮춤을 나타낸다.
도 19. 반월 연골 절제술 후 12주째에 관절내 주사 투여한 난소 절제한 암양의 관절에 대한, 반월 연골 절제술 후 36주째의 변형된 맨킨 연골 조직병리학적 총 스코어의 [HA/(MPC+HA)] 비. 비 = 1은 MPC+HA와 HA가 동일하게 효과적인 것을 의미하고, 비 > 1은 HA 단독 보다 MPC+HA가 보호 효과가 높음을 의미한다. 데이타 = 평균 + SEM. 이러한 결과는, MPC 단독 주사가 대퇴골 유리질 연골의 비정상적인 조직병리학적 스코어를 6개월간 경골 연골에 비해 높은 수준으로 낮춤을 나타낸다.
도 20. 반월 연골 절제술(MX) 후 12주째에 히알루로난(HA) 또는 108 MPC + HA를 주사한 난소 절제한 암양의 관절에 대한, MX 후 12주째에 주사하지 않은 관절 대비, 반월 연골 절제술 후 36주째의 변형된 맨킨 연골의 조직병리학적 스코어 평균 + SD. P 값은 12주 NIL 대 처리. 이 결과는, MPC 단독 주사가 비정상적인 조직병리학적 스코어를 6개월간 낮춤을 시시한다.
도 21. 반월 연골 절제술 후 12주째에 히알루로난(HA) 또는 108 MPC + HA를 주사한 난소 절제한 암양의 관절에 대한, 반월 연골 절제술 후 36주째의 대퇴골 연골의 조직형태계측학적 데이타. 데이타는 평균 + SEM으로 나타낸다. P 값 = HA 대 MPC+HA. 이 결과는, MPC 단독 주사가 히알루론산에 비해 유리질 연골을 6개월간 더 많이 생성함을 시시한다.
도 22. 반월 연골 절제술 후 12주째에 희생시킨 무처리 암양, 또는 반월 연골 절제술 후 12주째에 히알루로난(HA) 또는 MPC + HA를 주사한 다음 그후 12주 또는 24주에 희생시킨 암양의 관절에 대한, 조직형태계측 방법으로 측정한 대퇴골 연골의 두께 평균 + SEM. 데이타는 평균 + SEM으로 나타낸다. P 값은 12주의 NIL 무처리 기준이다. 이 결과는, MPC 단독 주사가 6주간 유리질 연골 두께를 증가시킴을 시사한다.
도 23. 반월 연골 절제술 후 12주째에 희생시킨 무처리 암양, 또는 반월 연골 절제술 후 12주째에 히알루로난(HA) 또는 MPC + HA를 주사한 다음 그후 12주 또는 24주에 희생시킨 암양의 관절에 대한, 조직형태계측 방법으로 측정한 대퇴골 연골의 면적. 데이타는 평균 + SEM으로 나타낸다. P 값은 12주의 NIL 무처리 기준이다. 이 결과는, MPC 단독 주사가 6주간 유리질 연골 두께를 증가시킴을 시사한다.
도 24. 반월 연골 절제술 후 12주째에 희생시킨 무처리 암양, 또는 반월 연골 절제술 후 12주째에 히알루로난(HA) 또는 MPC + HA를 주사한 다음 그후 12주 또는 24주에 희생시킨 암양의 관절에 대한, 대퇴골 연골의 총 프로테오글리칸(PG)의 측정값으로서 조직형태계측 방법으로 측정한 IGD(Integrated Grey-scale Density). 데이타는 평균 + SEM으로 나타낸다. P 값은 12주의 NIL 무처리 기준이다. 이 결과는, MPC 단독 주사가 6주간 히알루론산 주사 보다 프로테오글리칸을 함유한 연골을 상당히 많이 생성시킴을 시사한다.
도 25. 모든 양 그룹들에서, 간엽 전구 세포(MPC)를 처리한 요추의 높이(level)를 개시한 도표.
도 26. MPC 및 HA를 양의 퇴화된 디스크의 수핵에 주사한 후 3개월 및 6개월째의 디스크 높이의 평균 복구
실시예
실시예 1: 면역선택된 MPC의 증가 및 상층물의 수집
2년생 미만의 양으로부터 골수(BM)를 채취하였다. 간단히, 리튬-헤파린 항응고제를 함유하는 튜브에 전장골능(anterior iliac crest)으로부터 BM 40 ml를 흡인하였다. 기존에 개시된 바(Zannettino et al., 1998)에 따라 LymphoprepTM(Nycomed Pharma, Oslo, Norway)를 사용하여 밀도 구배 분리에 의하여 BMMNC를 제조하였다. 4℃에서 30분 동안, 400 x g로 원심 분리한 뒤, 담황막층을 트랜스퍼 파이펫으로 제거하고, 5%의 소태아 혈청(FCS, CSL Limited, Victoria, Australia)이 포함된 HBBS(Hank's balanced salt solution; Life Technologies, Gaithersburg, MD)로 구성된 "HHF" 내에서 3회 세척하였다.
기존에 개시된 바와 같이, 자기 활성화된 세포 분류에 의하여 TNAP+을 후속적으로 분리하였다(Gronthos et al., 2003; Gronthos et al., 1995). 간단히, 대략 1-3 x 108 정도의 BMMNC를, 얼음 상에서, HHF 중의 정상 토끼 혈청 10% (v/v)로 이루어진 블록킹 버퍼 내에서 배양하였다. 상기 세포를 블록킹 버퍼 중의 STRO-3 mAb 10 ㎍/ mL 용액 200 ㎕으로 1시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 후속적으로, 상기 세포를 400 x g 원심분리에 의하여 HHF 내에서 2회 세척하였다. HHF 버퍼 중의 염소 항-마우스 γ-비오틴(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, UK)의 1/50 희석액을 첨가하고, 상기 세포들을 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 상기와 같이 MACS 버퍼(1% BSA, 5 mM EDTA 및 0.01% 아지드화 나트륨이 추가된 Ca2 + - 및 Mn2 + -없는 PBS) 내에서 세포들을 2회 세척하고 최종 부피 0.9 mL MACS 버퍼에 재현탁하였다.
스트렙타비딘 마이크로비드 (Miltenyi Biotec; Bergisch Gladbach, Germany) 100 ㎕를 상기 세포를 현탁액에 첨가하고, 얼음 위에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이러한 세포 현택액을 2회 세척하고, 0.5 mL MACS 버퍼에 재현탁시킨 뒤, 후속적으로 미니 MACS 컬럼(MS Columns, Miltenyi Biotec)에 로딩하고, 0.5 mL MACS 버퍼로 3회 세척하여 STRO-3 mAb(ATCC(American Type Culture Collection)에 2005년 12월 19일자로 기탁번호 PTA-7282로 기탁됨, WO 2006/108229 참조)에 결합하지 않는 세포들을 얻었다. MACS 버퍼를 1 ml를 더 첨가한 후, 컬럼에서 자석을 제거하고, TNAP-양성 세포를 양압에 의하여 분리하였다. 각 분획에서 일부 세포는 스트렙타비딘-FITC로 염색될 수 있으며, 유세포 측정으로 순도를 측정할 수 있다.
이전에 개시된 바와 같이(Gronthos et al., 1995), 일차 배양물을, 소태아 혈청 20%, L-글루타민 2mM 및 L-아스코베이트-2-포스페이트 100 μM가첨가된 α-MEM에 파종하여, MACS 분리된 TNAP+ 세포로부터 확립하였다.
조건 배지(상층물)를 수집할 수 있을 정도로 세포들을 5계대까지 배양하였다.
실시예 2: 거세된 성체 숫양의 양측 총 중앙 반월 연골 절제술에 의하여 야기되는 조기 OA의 모델의 연골 완전성(integrity)에 대한, 자가 면역선택된 간엽 전구 세포(MPC)의 용량 의존적인 연골 내 효과에 관한 연구
무릎 관절 반월판 또는 반월상 연골은, 관절 연골 윤활을 향상시키며, 관절의 연결 중 측면 안정성 또한 제공하는 중요한 체중 지지 구조이다. 파열되거나 퇴화된 반월판의 수술 제거, 즉, 반월 연골 절제술은, 일반적인 정형외과 시술이나, 몇 년 뒤, 골관절염(OA)의 발병 위험을 증가시키는 것으로 알려졌다(Englund, 2004). 수술로서 절제된 반월판이 이전에 위치하고 있었던 공간 내에서 관절 활막의 기계적 엔트랩먼트(entrapment)는 반월판 복제의 부분적 재생을 유도하는 것으로 알려져 있다(Moon et al., 1984). 그러나, 개에 대한 반월 연골 절제술 실험의연구 결과, 이러한 대체 구조물은 필수적으로 원래의 반월판에 비하여 훨씬 열등한 생체역학적 성질을 갖는 섬유 조직에 의하여 이루어지는 것으로 밝혀졌다(Ghosh et al., 1983). 더욱이, 반월 연골 절제술 한 지 6개월 후, 상기 실험 동물들의 관절내에서 골관절염(OA)의 발병 정도는 비교적으로 심각하였는데, 이는 관절 연골 상의 재성장한 구조에 의하여 제공되는 기능적 보가는 매우 제한적임을 주었다(Ghosh et al. 1983a). 골관절염(OA)의 크고 작은 동물 모델은 인간 환자를 이용하여서는 얻기 어려운, 질환의 발병 동안에 발생하는 관절 조직의 공간적 및 시간적 변화에 대한 종적 평가를 가능하도록 하였다(Smith and Ghosh, 2001). 메리노 양에 있어서, 측면 또는 중앙의 반월 연골 절제술은 전형적인 OA의 생화학, 생체역학적 및 조직병리학적 변화를 재발시키는 것으로 나타났다(Smith and Ghosh, 2001). 양의 OA 모델은 또한, 수술 후 치료법의 다양한 양식 결과를 조사하기 위하여 널리 사용되었으나(Ghosh, 1991; Smith and Ghosh, 2001), 현재까지 반월판의 재성장 및 OA의 진행 및 이러한 이밴트(event)들이 어떻게 관절내 간엽 전구 세포(MPC) 치료법에 의하여 영향을 받을 수 있는지 등을 평가하기 위해서 사용된 적은 없었다.
본 발명자들의 이전 연구에서는, 메리노 양에 대한 양측 총 중앙 반월 연골 절제술(BTM: Bilateral Total Medial Meniscectomy)은 관절 연골(AC), 연골하뼈 및 활막성 조직 내의 병리학적 변화를 야기하고 조기 인간 골관절염(OA)의 발전을 자극하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 질환-조절 OA 약물을 평가하기 위하여 상기 동물 모델을 이전에 사용하였다.
방법
메리노 거세 숫양 36마리에 대하여 BTM을 실시하였다. BTM 2주 후, 관절에 2 mL 고분자량 히알루로난(HA) 또는 2 mL HA 중에 현탁된 2 mL 자가 Stro-3+ MPC를 무작위로 주사하였다. MPC의 4 투여 그룹에 대해 조사하였다: A 그룹 = 10 밀리온 (mil) MPC [n=6]; B 그룹 = 25 mil MPC [n=6]; C 그룹 = 100 mil MPC [n=18] 및 D 그룹 = 150 mil MPC [n=6]. BTM 12주 뒤 A, B 및 D 그룹을 희생시키고, C 그룹을 BTM 12주 [n=6], 24주 [n=6] 및 52주 [n=6] 후에 희생시켰다.
부검 시, BTM 관절의 양측 중앙 구획을 관절 연골(AC) 손상 및 골증식체(OP)에 대하여 2중 맹검을 실시하여 0-4 스케일로 점수 매겼다. 활막성 조직 및 5 mm너비 관상면 골연골 슬라이스를 대퇴골 및 경골의 정준선(mid-line)으로부터 제거하고, 처리하여 언급된 방법을 사용하여 조직병리학적 변화(Little et al., 1997) 및 조직형태학적 분석(Cake et al., 2003)에 대해 점수 매겼다.
관절 연골의 강도 및 상 지연(phase lag)를 측정하기 위하여, 모든 관절의 무손상 슬개골을 외형적, 생체역학적 압입(indentation) 처리하였다(Appleyard et al., 2003).
크루스칼-윌리스의 비모수 분석법(Kruskal-Wallis nonparametric analysis)을 사용하여 치료 효과를 통계적으로 분석하고, 유의도의 수준이 p<0.05인 만-휘트니 유 분석법(Mann Whitney U nonparametric analysis)을 사용하여 특히 그룹 비교의 통계 분석을 실시하였다.
각 그룹의 MPC + HA 주사한 관절과 HA 주사한 관절의 그룹 평균을 비교하기 위하여 유의도의 수준이 p<0.05인 등분산 양쪽 꼬리 스튜던트 T-검정을 이용하여 통계 분석을 실시하였다.
각 그룹의 MPC + HA 주사한(처리된) 관절과 HA 주사한 관절 간의 슬개 연골을 비교하기 위하여 유의도의 수준이 p<0.05인 독립표본 T 검정을 이용하여 통계 분석을 실시하였다.
결과
BTM 후 12주에 총체적 형태학적 스코어(Gross morphological score)는 AC 보전 및 OP 형성에 대한 MPC 용량-의존적인 효과를 나타내었다: HA 단독 주사에 비하여 100 밀리온 MPC는 가장 효과적인 연골 보호성 투여인 것으로 나타난다(도 1 및 도 2). OP 비는 100 = 25>10>150 밀리온 MPC 이었지만, 총 AC 스코어 비 (HA+MPC)/(HA) 는 100>150>25=10인 것으로 나타났다(도 3 및 4). 총 대퇴골 및 경골 AC에 대하여 통계적으로 유의한(SS:tatistically significant) 더 낮은 스코어가 관측되었으며, HA 단독에 비하여 C 그룹 MPC 대퇴골 연골은 p = 0.052인 것으로 관측되었다(도 1).
C그룹 MPC+HA 경골 고평부의 조직형태학적 분석은 AC가 중앙(p = 0.057) 및 바깥쪽 영역(p = 0.028); 모든 영역(p = 0.01)의 대응하는 HA-AC에 비하여 더 두꺼운 것으로 나타났다(도 5). C그룹 MPC+HA 관절의 AC 섹션에 대한 평균 조절된 맨킨 스코어는 대응하는 HA 섹션보다 작았지만, 통계적으로 유의한 것은 아니었다. 또한, 각 그룹의 HA 주사한 관절 및 반대측 HA+MPC 주사한 관절에 대한 총 맨킨 스코어 비를 계산한 경우, MPC 100 밀리온 투여가 가장 효능이 있음이 명백히 나타났다(도 6).
관절 연골의 보전을 보호하기 위한, 100 밀리온 MPC 투여의 지속 가능에 대한 의문은 주사 후 22 및 50주 뒤, 즉 반월 연골 절제술 24 및 52주 후, 조직의 형태적, 조직학적 및 생체역학적 성질을 연구함으로써 해결되었다. 도 7 및 도 8에서 명백한 바와 같이, HA 및 HA+100 밀리온 MPC의 형태적 스코어의 평균 값은 시간이 지남에 따라 감소하였지만, 24주에는 치료학적 효과의 일부의 증거가 있다. 이러한 관찰은 52주 동안 골증식체를 억제하는 세포의 더 강한 효과를 나타내는, HA/MPC+HA 데이타에 의하여 지지된다(도 10 및 11) 반면, 맨킨(Mankin) 조직병리학적 스코어와 유사한 곡선은, 52주 후, MPC의 보호성 효과가 소실되었음을 나타낸다(도 11).
모든 동물 그룹에 있어서 관절의 슬개골 연골에 대한 생체역학적 압입 연구는 일반적으로 형태학적 및 조직학적 데이타와 일치한다. 그러나, 연골의 강도는 연골의 두께에 의하여 영향을 받으며, 연골 두께는 손상 조기 단계에 있어서 비대해질 수 있으나, 시간이 지남에 따라 정상화된다. 이러한 상황은 현 모델에서 발생할 수 있는데, 25 및 100 밀리온 MPC 그룹에 대하여 측정된 슬개골 연골의 강도가 다른 연구에 있어서는 조직을 가장 많이 손상된 조직을 나타내 보인, 10 및 150 밀리온 MPC 그룹보다 유의적으로 낮기 때문이다(도 12 및 13). 이러한 해석은, HA 주사한 관절 및 150 밀리온 MPC 투여에 비하여 100 밀리온 MPC 그룹의 슬개골이 유의적으로 더 낮은 거으로 나타난 상 지연 데이타에 의하여 지지된다(도 14). 더욱이, 12주에 관찰된 평균 상 지연 값은 반월 연골 절제술 뒤 24 및 52주 후에 유의적으로 증가한 것으로 밝혀졌으며, 이는 6-12개월 뒤 주사한 MPC의 유익한 치료 효과가 소실되는 것을 의미한다(도 15). 상 지연은 연골 세포외 기질의 분자적 응집과 (위상) 각이 낮을수록 더 큰 탄성을 가지며, 따라서 변형으로부터 회복되는 능력을 반영하는 것이다(Cake et al., 2005).
100 mil MPC 주사한 관절에 대해 관측된 연골 보호 효과는 시간이 지남에 따라 감소하였으며, BTM 후 12주 및 24주에 관찰되었던 양성 효과는 52주 뒤 소멸되었다.
활막 조직병리학적 조절에 대한 증거는 없었다. 상기 동물에 대하여 실시된 임상 및 총체적 조직 병리는 MPC의 시스템 악영향에 대한 증거를 전혀 보이지 않았다.
소결
본 발명자들이 알고 있는 한, 본원은 조기 OA 모델의 연골 보전에 대한 자가 MPC의 유익한 치료 효과에 관한 첫 번째 보고서이다. MPC는 성장 인자 및 사이토킨을 방출하며, 또한 항-염증 사이토킨(예: IL-4, IL-10)을 상향 조절하는 반면, 다른 세포에 의한 TNF-α의 생성은 억제하는 것으로 알려져 있다. 이러한 MPC의 파라크린 활동은 새 기질의 연골 세포의 생합성을 촉진할 수 있지만, 이화 매개체의 활성 및 국부적 생성을 감소시킬 수도 있다. 본 연구에 있어서 100 밀리온 MCP가 연골 보호 효과가 있다는 이와 같은 발견은 작용의 메커니즘과 상응한다. 상기 양들의 연구에서 얻은 데이타는 100 밀리온 MPC의 연골 내 단일 투입에 의한 연골 보호 효과의 지속 기간이 처리 후 6-12 개월 동안임을 나타내며, 이는 OA 환자의 장기적 치료에는 복수회 주사가 필요함을 시사한다.
무릎 관절염을 치료하기 위하여 연골 내 HA 주사가 널리 사용되고 있는 반면, 상기 치료법이 연골 보호 효과를 가진다는 증거는 제한적이다(Ghosh et al., 2002). 그러나, 연골 내 HA 처리는 OA의 발병 속도를 늦추어 증상을 경감시켜주나, 연골 내 코르티코스테로이드보다 더욱 지속된다(Bellamy et al., 2006).
실시예 3: 난소 절제된 암양의 무릎 관절에 대해 실시한 양측 총 중앙 반월 연골 절제술(bilateral total medial meniscectom)에 의하여 야기된 심각한 골관절염 모델에 있어서, 히아루노난(HA) 또는 100 밀리온 간엽 전구 세포(MPC) + HA의 주사가 연골 보전에 미치는 상대적 치료 효과
무릎 관절 반월판은 정상적인 관절의 경우, 손상에 대하여 관절 연골(AC)를 보호하는 중요한 역할을 수행한다(Arnoczky et al., 1988). 반월판의 손상에 따른, 인체 내에서 반월판을 전체 또는 부분 절제하는 것은 일반적으로 AC의 조기 퇴화 및 골관절염(OA)의 진행을 야기한다(Jorgensen et al., 1987; Roos et al., 1998 and McNicholas et al., 2000). 실험 연구에 있어서, 양에 대한 일측 또는 양측의 총 중앙 반월 연골 절제술은 AC의 조기 파열 및 OA의 조기 발병을 야기하는 것으로 나타났다(Ghosh et al, 1990; Appleyard et al., 1999 and Ghosh et al., 1993c).
반월상 연골 절제된 관절내의 AC의 손상은 연골의 절단 스트레스 및 높은 병소(focal)의 부담에 의한 결과이기 때문에, 수술하지 않은 반대측 뒷다리의 사용에 의하여 통증 없이 체중을 지지할 수 있는 일측의 반월 연골 절제술의 경우보다, 양측 반월 연골 절제술의 경우, 연골 퇴화를 더욱 빨리 진행시키는 것으로 밝혀졌다(Ghosh et al., 1993a and 1993b; Appleyard et al., 2003; Little et al., 1997 and Oakley et al., 2004). 더욱이, 양측 반월판 절제술이 행해진, 난소 절제된 암양은 대게 연골 보호 호르몬인, 에스테로겐의 순환이 중지됨으로써 거세된 성체 숫컷(거세된 숫양)보다 OA가 더욱 진행되는 것으로 밝혀졌다(Parker et al., 2003). 이러한 이유로 인하여, 질환-조절 항-OA 약물을 연구하기 위한 큰 동물 모델로서, 난소 절제되고, 양측으로 반월판 연골이 제거된 암양이 선호된다(Ghosh et al., 1993; Smith et al., 1997; Burkhardt et al., 2001; Hwa et al., 2001 and Cake et al., 2000). 따라서, 본 조사를 위하여 난소 절제된/양측 반월 연골 절제된 OA의 양 모델을 선택하였으며, 본 조사의 목적은 연골 내(IA) 주사한 자가 간엽 전구 세포(MPC)가 프로테오글리칸-풍부 연골의 성장 또는 재생의 유도에 미치는 영향 및 현재 사용되는 항-OA 치료, IA 히아루노난(HA)와 비교하여 연골보호에 미치는 영향을 평가하는 것이다.
방법
공지된 방법에 의하여 3개월 전에 난소 절제술을 행한 18 마리의 성체 메리노 암양에 대하여 양측의 총 중앙 반월 연골 절제술(BTM)을 실시하였다(Cake et al., 1004). BTM에서 사용된 외과 시술 및 수술-후의 처방은 실시예 2에 기술한 거세된 숫양의 BTM 연구에 대해 기술한 것과 동일하다.
BTM 후 12주에, 6마리를 희생시키고, 반월 연골이 절제된 나머지 12 마리의 암양에 대해서는, 2 mL 고분자량 HA 또는 2 mL Profreeze® 와 2 mL HA 중에 현탁된 100 밀리온 MPC을 무작위로 주사하였다. 실시예 2에서, 상기 MPC+HA의 투여는 BTM 수컷 양 모델에 있어서 가장 유익한 연골 보호 효과를 갖는 것으로 나타났다. 상기 반월 연골 절제되고 주사한 암양들을 6 마리씩 두 그룹으로 나누고, BTM 후 24 및 36주에, 즉 HA 또는 MPC+HA 연골 내 주사한 뒤로부터 12 및 24주에 희생시켰다. AC 관절의 불안정화에 대한 성별에 따른 효과를 측정하기 위하여, 처리하지 않은 거세된 숫양 6 마리에 대한 BTM를 행하고, 반월 연골 절제술 12주 후에 희생시켰다.
부검 시, 관절을 절개하여 반월판을 제거하고, 중앙 대퇴골 및 경골 고평부를 사진 촬영하였다. 연골의 총체적 형태학적 변화를 측정하기 위하여, 0-4 스케일을 사용한 이중 맹검에 의하여 기록된 영상을 점수 매겼다. 슬개 위 폴더의 활막 및 5 mm의 너비의 관상면 골연골 슬라이스를 각 관절의 대퇴골 및 경골의 정준선으로부터 제거하고, 조직학적 섹션의 제조를 위하여 처리하였다. 이전에 기술한 바와 같이 변형된 맨킨 스코어링 시스템을 사용하여, 이중 맹검으로 연골 조직병리를 평가하였다(Little et al., 1997). 활막성 조직병리는 Cake 외(2008)에 의해 최근에 기술된 기준에 의하여 점수 매겼다.
맨킨 점수 매기기에 사용된 것과 동일한 연골 블록의 조직학적 일련의 부분들은 이전에 기술된 바와 같이 조직학적 분석에도 사용되었다(Caket et al., 2000; Cake et al., 2004). 상기 방법은, 치수에 관한 정량적 데이타 및 톨루이딘 블루로 염색된 AC의 프로테오글리칸 함량의 색인을 얻기 위하여, 컴퓨터-보조 영상 분석(ImagePro Plus v.3.0, Media Cybernetics)을 이용하였다. 간단히, 1300 dpi 해상도를 갖는 마이크로텍 슬라이드스캐너 35t 플러스(Microtek Model No. PTS-1950)에 의하여 염색된 부분의 영상을 얻은 뒤, 개인 컴퓨터에서 이미지 J® 소프트웨어(http://rsb.info.nih.gov/ij/)를 사용하여 분석하였다. 대퇴골 및 경골 섹션의 디지컬 영상을 내부, 중앙, 및 외부 영역으로 다시 나누었으며, 이들 각각의 영역은 연골부 총 영역의 대략 1/3 정도를 차지하였다. 시스템의 공간 보정은 10x10mm의 높은 정확도 레티큘을 스캐닝함으로써 달성되었다. 상기 스케일은 입수된 영상의 각 영역에 있어서 길이(mm) 및 면적(mm2)을 측량하는데 사용하였다. 상기 부분들의 평균 두께는 면적을 길이로 나눔으로써 결정하였다. TB 염색된 연골 부분의 광학 밀도(OD)는 평균 그레이 수치(MGV)(총 그레이 값/픽셀의 수)로서 얻었으며, 프로테오글리칸(PG) 함량의 인덱스로서 취하였다. 통합된 그레이-스케일 밀도(IGD)는 MGV ×섹션의 영역 면적으로 계산하였다. 사용된 그레이 스케일 시스템은 PG 함량으로 알려진 TB 염색된 부분에 대하여 독립적으로 보정하지 않았으며, 모든 조직학적 섹션은 동일한 마이크로톰 상에서 절단하였으며, 동일한 두께를 가지며, 동일한 염색 프로토콜을 사용한 그룹으로서 처리하였다. 따라서, 연골 염색시의 차이점은 절대적이라기보다 상대적이었다. 관절 연골의 강도 및 상 지연을 측정하기 위하여, 희생된 뒤 1시간 내에 모든 관절의 온전한 슬개골을 제거하여, 즉시 냉동시키고 국소 해부 생체역학적 압입 연구 전까지 보관하였다(Appleyard et al., 2003).
형태학적 및 조직학적 스코어링 시스템에 의하여 측정된 처리 결과(HA 대 HA+MPC) 또는 치료 대 BTM 후 12주에 처리되지 않은 대조군간의 차이를 확인하기 위하여 크루스칼-윌리스의 비모수 분석법(Kruskal-Wallis nonparametric analysis)을 사용하여 통계 분석을 실시하였으며, 그룹 비교간의 상이한 점을 확인하기 위하여 유의도의 수준이 p<0.05인 만-휘트니 유 분석법(Mann Whitney U nonparametric analysis)을 사용하여 통계 분석을 실시하였다.
유의도의 수준이 p<0.05인 등분산 양쪽 꼬리 스튜던트 T-검정을 이용하여 디지털화된 조직학적 부분의 조직형태학적 분석에 의하여 얻은 데이타를 평가하였다. 유의도의 수준이 p<0.05인 독립표본 T 검정을 이용하여 다양한 치료와 BTM 후의 시간에 대해 슬개골 연골의 생체역학적 파라미터의 통계 분석을 계산하였다.
결과
BTM 후 12주에 처리하지 않은 암양의 관절내의 연골 마모 및 골증식체 형성의 총체적 형태학적 평가를 통하여, 상기 OA 모델은 동일한 외과 시술에 의하여 반월 연골 절제된 거세 수컷에 비해, 더욱 공격적이고 심각한 형태의 질환을 나타냄을 확인하였다. 상기 치료되지 않은 암컷 대조군에 있어, 평균 연골 형태학적 스코어는 대퇴골이 상기 파라미터를 평가하기 위해 사용된 최대 스코어의 87%이었으며, 경골은 75%이었다. 동일한 외과 시술에 의하여 반월 연골 절제술이 시행된 후, 12주 뒤 처리하지 않은 거세된 수컷로부터 유래한 관절에 대해 얻은 총체적 형태 스코어는 난소 절제된 암양에 비하여 유의적으로 적었으며(도 16 및 14), 이러한 발견은, 양측의 반월 연골 절제술을 이용하였던 이전의 연구와 일치하였다(Parker et al., 2003; Cake et al., 2004).
반월 연골 절제술 24 및 36주 후, 두 치료 모두는 반월 연골 절제술 12주 후 처리하지 않았던 암양의 베이스라인보다 더 낮은 평균 대퇴골 형태학적 연골 스코어를 나타낸 반면(데이타가 제시되지 않음), MPC와 HA 처리된 관절 간의 차이점은 거의 관측되지 않았다. 본 발명자들은 이로부터 상기 심각한 OA 모델에서, 총체적 형태학적 손상(마모 및 골증식체 스코어)의 심각성으로 인하여, 상기 파라미터들이 너무 민감해져 치료학적 효과의 관측이 불가능하게 된 것으로 해석하였다.
BTM 12주 후 처리하지 않은 그룹의 연골에 대한 변형된 맨킨 조직병리학적 스코어는 형태학적으로 측정된 연골 손상의 정도와 일치하는 것으로 밝혀졌다(도 16 및 17). 형태학적 파라미터들과는 반대로, MPC+HA가 수여된, 난소 절제된 암양의 대퇴골 연골에 대한 총 평균 변형된 맨킨 스코어는 HA가 단독 수여된 관절에 대응하는 스코어보다 더 낮은 것으로 나타났으며, HA 단독보다 유의적으로 더 낮은 세포 수(p = 0.01) 및 프로테오글리칸에 대한 내부 구역 톨루이딘 블루(IT TB) 염색이 더 강한 경향(p = 0.06)을 보였다(도 18). 경골 연골에 대해서는 이러한 효과가 덜 나타났다(도 18).
반월 연골 절제술 뒤 36주 때, HA 주사한 관절에 비하여, 더 낮게 측정된 MPC+HA 주사 관절의 변형된 맨킨 조직형태학적 연골 스코어는 두 가지 연골-내 치료에 대한 평균 총 변형된 맨킨 스코어의 비의 측정 시, 두드러졌다(도 19). 동일한 동물에 있어서 두 가지 방법에 의하여 처리된 관절로부터 얻은 각 비율이 1인 경우, 양 방법 모두가 동일하게 효과 있음을 의미한다. 그러나, 비율이 1보다 큰 경우, MPC+HA 치료가 더욱 유익하다고 할 수 있다. 도 19로부터, 대퇴부 연골에 대하여 얻은 비율의 평균은 BTM 뒤 36주 후의 단위보다 유의적으로 높으나, 두 가지 치료에 있어서의 경골 비율(1.12)은 MPC+HA를 주사한 그룹이 좀 더 선호됨을 명백히 제시하고 있다(도 19).
그 다음, 본 발명자들은 맨킨 스코어로 시간에 따른 치료 효과를 실험하였다. 반월 연골 절제술 뒤, 24 및 36주에, 즉 주사 뒤 12 및 24주 후에 MPC + HA 및 HA 단독 치료 그룹 간에, 시간에 따른 대퇴골 연골에 대한 효과가 유의적으로 다름을 밝혔다(도 20). MPC+HA가 수여된 그룹에 있어서, 24 및 36주의 평균 스코어는 12주의 베이스 라인에 비하여 점진적으로 낮았다. 이것은 감소된 스코어 및 12주 시 처리되지 않은 그룹에 비하여 24주의 세포클로닝(P = 0.01) 및, 36주의 세포 수(P = 0.04) 및 프로테오글리칸(PG)에 대한 내부 구역의 톨루이딘 블루 염색(P = 0.04)의 증가 때문이었다(도 20). 상기와 같은 증가는 HA 단독 그룹에서는 관측되지 않았다. 임의의 그룹 또는 연골 내부 치료에 대한 활막 병리학 스코어는 거의 동일하였다.
조직형태학적 분석 방법을 사용하여, BTM 후 36 주에 주사한 관절의 대태골과의 3 영역(내부, 중앙, 및 외부)에 대하여, 연골 두께 및 PG 함량의 인덱스로서의 TB 염색의 면적 및 강도의 분석이 도 21에 제시되어 있다. BTM 후 36 주까지 치료 그룹이 서로 유의적으로 다름이 명백하였다. MPC+HA 주사한 관절의 대퇴골 연골은 HA 주사한 관절의 대응 연골에 비하여 더 두꺼우며(도 21A), 유의적으로 더 큰 면적을 차지하고 있었다(도 21B). MPC+HA 주사한 관절의 대퇴골 연골은 부피가 더 크고, TB 염색된 부분의 집적된 그레이-스케일 밀도에 의해 결정된 프로테오글리칸 함량 또한 더 컸다(도 21C).
시간을 기준으로 한 분석에서, 상기 파라미터들을 다시 비교함으로써, 반월 연골 절제술 후 24 및 36주에 즉, 주사 후 12 및 24주에 MPC+HA와 HA 단독 치료 그룹은 시간에 따라 대퇴골 연골에 미치는 영향이 유의적으로 상이함이 밝혀졌다. 동일한 조직형태학적 방법론을 이용하여, 본 발명자들은 반월 연골 절제술 12주 뒤에 MPC+HA 주사 투여한 경우, HA 단독의 경우보다, 12주 및 24주 지나서(즉, BTM 후 24 및 36주에) 프로테오글리칸-풍부 대퇴골 연골의 성장 또는 재생이 점진적으로 더 증가함을 설명할 수 있었다(도 22 내지 24). 따라서, BTM 후 12 주에 반월 연골 제거된 암양 관절에 MPC+HA을 주사한 경우, 대퇴골 연골은, BTM 후 24 및 36주때에, 반월 연골 절제술 후 12 주에 처리하지 않은 관절의 베이스라인 값에 비하여 유의적으로 더 두껍고(도 22) 일반적으로 더 큰 면적을 가졌다(도 23). HA 주사한 관절의 대퇴골 연골의 부분을 스캔한 영역은 12주 때 처리되지 않은 대조군에 비하여 통계적으로 유의한 변화를 보이지 않았다(도 22 및 23). 대퇴골 연골 부분의 PG 함량을 측정한, 집적된 그레이-스케일 밀도는, BMT 후 12주에 처리하지 않은 그룹의 관절의 동일한 연골 영역에 비하여 HA 및 MPC+HA 주사한 관절 모두의 값이 유의적으로 높았으나, MPC+HA가 야기한 변화의 크기는 HA단독의 경우보다 유의하게 더 컸다(도 24). MPC+HA 그룹은 베이스라인과 비교하여 36주에, 거의 60% 더 증가된 프로테오글리칸-풍부 대퇴골 조직을 발달시키고(p<0.001), 이러한 연골 성장의 속도는 평탄기에 도달하지 않은 반면, HA만 주사한 그룹은 평탄기에 도달하였으며, 약 30% 조직만이 더 증가하였다. 이는 MPC+HA에 의한 치료가 베이스라인과 HA 단독 치료의 임의의 시간적 효과에 비하여, 24주의 기간이 지나서도 계속하여 유의적으로 더 큰 프로테오글리칸-풍부 연골의 증가(즉, 연골의 성장 및/또는 재생)를 유도하였음을 의미하였다.
주사한 관절에 있어서, 슬개골 연골에 대한 압입 연구 결과는 상기 두 치료 그룹 간의 생체역학적 성질이 다름을 보이지는 못하였지만, 반월 연골 절제술 후 시간에 따른 경과 및 BMT 후 12주에 처리하지 않은 그룹에 대해서는 변화를 확인하였다. 반월 연골 절제술 후 24 주에, MPC+HA 그룹의 슬개골 연골의 강도는 12주(P = 0.05) 및 36주(P < 0.01)에 비하여 유의적으로 높았다(데이타가 제시되지 않음). 그러나, 모든 치료 그룹은, 12주에 처리되지 않은 대조군(P = 0.01)에 비하여도 낮은 24주(P = 0.001) 때에 비해 36주에 더 두꺼운 슬개골 연골을 생성하였다. 24 및 36주 때에, 양 치료 그룹의 슬개골 연골의 상 지연은 처리되지 않은 12주 대조군에 비하여 더 높았다(P = 0.001) (데이타가 제시되어 있지 않음).
고찰
본 연구는 난소 절제된 암양에 있어서, 양측 중앙 반월 연골 절제술은 3개월 후, 점진적이고 심각한 OA와 일치하는, 관절 연골의 병리학적 변화를 야기함을 밝혔다. 따라서, 대퇴골 및 경골 연골에 대한 총체적 형태학적 스코어는 최대 스코의 87-70%이었다. 흥미롭게도, 거세된 수컷을 동일한 외과 시술로 처리하고 동일한 시기(12주)에 희생시켰을 때, 난소 절제된 암컷에서 관찰된 것보다 손상이 덜 심각한 것으로 관측되었다. 연골 병상의 정도는 이 그룹에 대헤 관측된 높은 총체적 변형된 맨킨 조직병리학 스코어를 반영하는 것으로, 이는 조기 OA의 값과 일치한다(Little et al., 1997). 이전의 연구는 암컷의 폐경과 OA의 강한 연관관계를 확인하였고, 이는 에스트로겐의 주기의 중지에 의하여 설명되고(Roos et al., 2001; Pelletier et al., 2007 and Nevitt et al., 1996), 난소 절제된 암양의 연구에 의하여 지지받았으나(Parker et al., 2003 and Cake et al., 2004), 최근 추가 연구는 지방 유도 호르몬인 렙틴(Leptin)이 파손된 연골과 OA를 중재하는데 더욱 중요한 역할을 하고 있음을 시사한다(Dumond et al, 2003 and Teichtahl et al., 2005). 따라서, BTM 후 3개월 기간은 HA 또는 MPC+HA 내부 관절 주사의 약물 투여 후 12 및 24주 때의, 연골 병상의 진전 속도에 미치는 경감 효과를 측정하기 위한 시작점으로 채택되었다.
본 연구 결과는 심각한 OA가 확립된 관절내에, 2 mL HA 및 2 mL Profreeze® (상업용 냉동보호제)에 분산된 100 밀리온 MPC을 연골 내 단일 투여함으로써, 관절의 병리의 진행을 늦추고, 2 mL HA 투여한 것보다 프로테오칸-풍부 연골의 성장 및/또는 재생 정도를 더욱 향상시킬 수 있었다. 놀랍게도 모든 파타미터 실험에 있어서 성장/재생 및 MPC에 의하여 중재되는 보호효과는 투여한 후 12주 후 보다, 24주 뒤, 더욱 유의한 것으로 관측되었으며, 이는 평탄기에 도달하지 않은 점진적 효과를 의미하는 것이다. 이러한 현상의 원인은 현재로서 명확하지 않지만, TGF-β 수퍼패밀리의 요소와 같은 성장인자, 예를 들면 MPC에 의하여 방출되는 BMP가(Ahrens et al., 1993; Aggarwal et al., 2005) 중앙 반월 연골 절제술에 의해 관절에 부과되는 변형된 기계적 스트레스에 대한 연골의 동화(보상) 단계를 지지하는 것이 가능하다. 이러한 견해는, BTM 후 12주에 치료가 시작되었을 때 보다 MPC 주사한 그룹의 프로테오글리칸의 용적과 그에 대한 염색의 정도가 더욱 큼을 보여주는 조직형태학적 데이타에 의하여 지지된다. 이러한 기질 변화는 연골 세포의 생합성 증가와 일치한다. 중요하게, 동화 파라미터들의 크기는 일반적으로, HA 단독보다 MPC+HA가 수여된 동물의 연골에 있어서 더욱 큰 것으로 나타났다. 기계적 부하에 반응하여 상기 연골을 보호하고 심지어 향상시키는 MPC의 효능은, 다수의 스테로이드 및 비-스테로이드 항염증제(NSAIDs) 등의 많은 전형적 OA 치료에 의하여 중재되는 연골 세포의 신진대사에 대해 공지된 억제효과와 대조된다(McKenzie et al., 1976; Ghosh, 1988; Brandt, 1993 and 1993a; Huskisson et al., 1995).
복수회의 관절내 HA 주사는 30년 이상 무릎 OA 관리를 위한 치료로서 이용되었다. 이러한 형태의 치료는 임상적으로 증상의 경감을 제공한다는 것이 여론이지만, 최근의 재고찰 및 공개된 HA 임상 치료의 메타-분석은, 관절내 주사, 맹검 조사의 어려움 및 출판의 편향과 관련된 더 강한 플라시보 효과에 기초하여 상기 결론의 유효성에 대하여 의문을 제기하였다(Brandt et al., 2000; Lo et al., 2003). 관절내 HA가 연골 보호 또는 연골 재생 활성을 보이는 것에 대해서도 논쟁의 여지가 있다. 하지만, 광범위한 동물 조사에 의하여, 토끼 및 양의 일측 및 양측 반월 연골 절제술과 개의 전방 십대 인대의 절단에 의해 야기된 OA의 모델들에 있어서, HA는 진통제 효과, 항-염증 효과 및 질환 조절 효과를 보임이 밝혀졌다. 이러한 데이타들의 논의는 다양한 분자량의 HA에 관한 임상 전 및 실험에 기초한 임상 연구와 함께 재검토되었다(Ghosh et al., 2002).
본 연구에서는, 단독 또는 MPC와의 조합된 관절-내 HA 단일 주사에 대하여 평가하였다. 본 연구의 데이타에 기초하여, 본 발명자들은 MPC+HA 조합에 의하여 가능한 연골 보호 효과 및 장기간 지속되는 성장 및 재상효과는 MPC에 의하여 중재되는 것으로 결론지었다. 이와 관련하여, 본 연구의 설계는, 하나의 관절에는 HA를 수여하고, 반대 측의 관절에는 Profreeze® 냉동 보호제 내의 동일한 양의 HA와 MPC를 더하여 수여함으로써, 각 동물은 스스로 조절함으로써 작용하도록 허용하였다는 것이 중요하다. 본 연구에서 양 쪽 무릎 관절을 수술로 악화시키고 동시에 주사함으로써, 본 발명자들은 관절 연골에 작용하는 체중지지 역학적 스트레스의 크기 및 본질은 양쪽 관절에 있어 동일함을 확신하였다.
본 연구로부터 본 발명자들은, 이전에 존재하는, 심각한 OA를 갖는 양의 관절내에 MPC+HA을 관절내 단일 투여한 경우, 치료 전 베이스라인 및 HA 주사한 대조군에 비해 처리 24주 후, 증가된 연골 세포외 기질에 의하여, 프로테로글리칸-풍부 연골의 성장 또는 재생이 최대화된다고 결론지었다.
실시예 4: 면역선택된 MPC를 이용한 양의 디스크 재생 연구
방법
36 마리의 매치된 메이노 거세한 숫양(대략 18 내지 24개월 생)을 본 연구에서 사용하였다. NP의 PG를 절단하고 제거하기 위하여, 모든 36마리 양에 있어서, 3개의 인접 요추 디스크(L3-L4, L4-L5, L5-L6)에 약 0.1 ml의 멸균된 생리식염수 중의 1.0 IU 콘드로이티나제 ABC(Seikagaku Corporation, Japan)를 투여하였다. 남은 요추 디스크(L1-L2 및 L2-L3)에는 콘드로이티나제 ABC를 투여하지 않고 대조군으로 보관하였다. 콘드로이티나제 ABC 투여 후 15주(±3주) 후, 동결 매개물(NAO) ProFreezeTM 중의 MPC(0.5 x106 세포) 또는 단독의 ProFreezeTM NAO(Lonza Walkersville Ltd.)와 동일한 용적의 히아루론산(Euflexxa®, Ferring Pharmaceuticals)이 혼합된 주사를 도 25에 도식적으로 나타난 콘드로이티나제 ABC 처리된 추간판(intervertebral discs)의 수핵(nuclei pulposi)에 직접 투여하였다. 표 1에 요약된 바와 같이 각 실험 그룹을 3 및 6개월 뒤에 희생시켰다.
Figure pat00001
유도 마취 하에서, 하기 시점에 있어 동물의 요추(lumbar spine)의 측면 단순 방사선 사진을 촬영하였다: 0일(콘드로이티나제 ABC(Seikagaku Corporation, Japan)의 투여), 시험 물질 투여일(요추 디스크 퇴화 유도 후 15주±3주), 및 시험 물질 이식 후 3개월 및 6개월. (Masuda et al., 2004)에 기재된 바와 같이, IVD의 전방, 중앙 및 후방부의 측정값을 평균 내고, 이를 인접한 추간부 높이의 평균으로 나눔으로써 계산한, 추간 높이(DHI)의 색인을 이용하여 방사선 사진을 평가하였다.
유도 마취 하에서, 하기 시점에 있어 요추(lumbar spine)의 MRI를 촬영하였다: 0일(콘드로이티나제 ABC[Seikagaku Corporation, Japan]의 투여), 시험 물질 투여일(요추 디스크 퇴화 유도 후 15주±3주), 및 시험 물질 이식 후 3개월 및 6개월. 퍼만(Pfirrmann) 분류 시스템을 이용하여 MRI 스캔으로부터 디스크의 등급을 매겼다(Pfirrmann et al., 2001). 조직화학적 및 생화학적 분석을 위하여 선정된 척추 운동 분절(Spinal motion segments)을 뼈 톱을 이용하여 연골 종판에 가까운 두개골의 및 미골의 척추체를 관통하여 절단함으로써 분리하였다. 상기 척추면을 Histochoice®(Hewlett Packard, McMinnville, USA)에 일괄적으로 56 시간 고정시키고, 완전히 탈회할 때까지 계속하여 교반하면서 5% 중성 완충 포르말린 중의 10% 포름산의 내에서 2주 동안 여러 번 탈회시키고, Faxitron HP43855A X-ray cabinet(Hewlett Packard, McMinnville, USA)을 이용하여 확인하였다.
표준 조직학적 방법에 의하여, 탈회된(decalcified) 표본의 시상 슬라이스(두께 5mm) 복수개를 농도 구배된(graded) 에탄올 용액에 의하여 탈수시키고 파라핀 왁스 내에 엠비드(embed)시켰다. 두께 4 ㎛인 파라핀 섹션을 슈퍼프로스트 플러스(Superfrost Plus) 글라스 현미경 슬라이드(Menzel-Glaser)에 고정시키고, 85℃에서 30분간 건조시킨 뒤 55℃에서 밤새 건조시켰다. 상기 섹션을 자일렌 내에서 탈파라핀화시킨 뒤(4 번 x 2 분), 농도 구배된 에탄올 세척(100-70% v/v)을 통해서 수돗물로 재수화시켰다. 시상 슬라이스로부터 준비된 모든 블록의 한 섹션을 헤마토실린 및 에오신으로 염색하였다. 효소만이 투여된 그룹과 효소-주사 후, 후속적으로 MPC가 투여된 그룹들 간의 조직학적 특성의 정도를 비교하는 독립적인 조직병리학자에 의하여 코드화된 섹션을 실험하였다. 표 2에 나타난 바와 같이 전체 디스크의 현미경적 특성을 측정하기 위하여 4-포인트 세미-정량적 등급 시스템(four-point semi-quantitative grading system)을 사용하였다. 디스크 기질의 합성 정도를 표시하기 위하여 알시안 블루(Alcian Blue)(일반적 글리코스아노글리칸 물질용) 및 사프라닌 O(safranin O)(특히 콘드로이틴 설페이트 물질용) 등의 추가적 착색 염색을 준비하였다.
또한 이전에 기술된 바와 같이 시퀀자 카세트(Squenza cassette) 및 1 회용 커버플레이트 면역염색 시스템 (disposable Coverplate immunostaining system)을 이용하여 면역조직화학 과정을 수행하였다(Melrose et al., 2003; Melrose et al., 2002; Melrose et al., 2000; Melrose et al., 2002a; Melrose et al., 1998; Panjabi et al., 1985; Race et al., 2000; Smit, 2002). 조직 섹션을 3% H2O2로 인큐베이션함으로써 내재성 과산화제 활성을 초기에 방지하였다. 그 후, 37℃에서 1시간 동안의 20 mM 트리스-아세테이트 버퍼 pH 8.0 중의 콘드로이티나제 ABC(0.25 U/ml) 처리 및, 37℃에서 1시간 동안의 포스페이트 버퍼 pH 5.0 중의 소 고환 히알루로니다제 1000 U/ mL 처리를 조합하여 상기 조직 섹션을 절단하고, 그 후 실온에서 6분 간 20 mM 트리스-HCl pH 7.2 중의 0.5M NaCl (TBS) 또는 프로테이나아제-K (DAKO S3020) 으로 3회 세척하여 항원 에피토프에 노출시켰다. 그 후, 조직을 1시간 동안 20% 정상 돼지 혈청에 담궈두고, 크고 작은 프로테오글리칸 및 콜라겐을 다수의 제1 항체로 탐침하였다(표 3). 또한 제1 항체를 생략하거나, 관심있는 진정한 제1차 항체 대신 관련없는 이소형 매치된 제1 항체로 대체함으로써 음성 대조군 섹션을 처리하였다. 이 단계에서 상업적 (DAKO) 이소형 매치된 마우스 IgG (DAKO 코드 X931) 또는 IgM (DAKO 코드X942) 대조 항체가 사용되었다. 상기 DAKO 프로덕트 X931 및 X942는 포유류 조직에서는 존재하지 않으며, 유도되지도 않는 효소인, Aspergillus niger 글루코스 산화제에 대하여 직접적인, 마우스 모노클론 IgG1 (클론 DAK-GO1) 및 모노클론 IgM (클론 DAK-GO8) 항체이었다. 기질로서 TBS 중의 0.05% 3, 3'-디아미노벤지덴 디하이드로클로라이드 및 0.03% H2O2, 노바 레드(Nova RED), 니트로블루 테트라졸리움/5-브로모-4-클로로3-인돌릴 포스페이트/요오드 니트로테트라졸리움 바이올렛(NBT/BCIP/INT) 또는 뉴 푹신(New Fuchsin)을 사용하는 검출에서 홀스래디쉬(Horseradish) 과산화제 또는 제2 항체 콘쥬게이트된 알칼리 포스파타아제를 사용하였다. 염색된 슬라이드를 일반광학현미경(bright-field microscope)으로 실험하고, 레이카(Leica) MPS 60 포토 현미경 디지털 카메라 시스템을 사용하여 사진 촬영하였다.
하부 요추 디스크에 조직학적 변화에 대한 등급 체계( BEP 뼈 종판, CEP 연골 종판)
등급 섬유륜 수핵 연골 종판 변연/연골하
1 무손상 층판
좁은 층판간 기질
무손상 윤 유착
외부 1/3에만 혈관		 균일성
틈 없음		 일정한 두께
뼈에 무손상 유착
깊이 <1/5의 일정한 석회화
일정한 세포 분포		 평편한 두께의 BEP
측판 골만
CEP과 구별되는 정션
CEP에 수개의 혈관 침투
2 경미한 층판 갈라짐 및 비조직화
경미한 기질 확장
복구 반응없이 유착 외륜 병변의 비조직화		 경미한 갈라짐
경미한 세포괴사
윤의 경미한 후방 전위
경미한 콘드론(chondrone) 형성		 경미한 연골 박화
작은 횡균열
석회화된 부분의 불규칙적인 비후화
수개의 침투성 혈관 채널
작은 콘드론		 약간 평평하지 않은 BEP
쉬모를 결절
BEP의 최소의 리모델링
작은 변연성 골증식체
3 기질의 중등도의 확장
유착의 중등도의 균열
방사성으로 찢어진 부분에는 외부 1/3 최소 콘드로이드 이형성이 없음
낭포성 변성
외부 및 중간 1/3 외륜 병변에 혈관과 최소한의 복구 반응		 중등도의 균열
중등도의 세포 괴사
낭포성 변성
윤 내부의 후방 전위
콜라겐의 구심성 확장
중등도의 콘드론 형성		 현저한 연골 박화
현저한 석회화 영역의 비후화
많은 횡균열
많은 혈관 채널
많은 콘드론		 중간 정도로 평평하지 않은 BEP
혈관이 형성된 쉬모를 결절
중등도의 소주상 비후화
뼈 층판에 결함
골수 공간내 최소 섬유증 조직
중간 크기의 골증식체
4 광범위한 층판 비조직화
방사성 찢어짐이 외부 1/3까지 확장
대규모 콘드로이드 이형성
모든 영역에 혈관
현저한 복구 반응을 보이는 외륜 병변		 핵의 완전 소실
늘어진 바디 형성
현저한 콘드론 형성		 연골 전체 소실
잔류 연골의 석회화
광범위한 균열		 매우 평평하지 않은 BEP
골화된 쉬모를 결절
큰 골증식체
현저한 소주상 비후화
골 공간의 현저한 섬유증
연골 형성
프로테오글리칸 및 콜라겐 코어 단백질 에피토프에 대한 일차 항체
일차 항체 에피토프 클론(이소형) 참조문헌
큰 PG
어그레칸(Aggrecan)
버시칸(Versican)
AD 11-2A9 (IgG)
12C5 (IgG)
26,30
26, 28
콜라겐
1형
2형
I8H5 (IgG1)
II-4CII (IgG1)
23, 28
28
일차 항체 에피토프 클론(이소형) 참조문헌
IV형
VI형
IX형		 CIV-22 (IgG1)
토끼 다클론
마우스 모노클론 D1-9 (IgG1), B3-1 (IgG2b)		 28
28
35
섬유륜 및 수핵의 샘플을 미세하게 주사위꼴로 잘려진 진행된 블럭에서 절제하여, 기지의 습윤 중량의 조직 영역의 일부를 중량이 변하지 않을 때까지 동결 건조시켰다. 건조시킨 조직의 3세트(1-2mg)를 6M HCl 중에 16시간 동안 110 ℃에서 수화한 다음, 중화시킨 소화물(digest) 분액을 대상으로 조직 콜라겐 함량 측정치로서 하이드록시프롤린을 분석하였다(Sakai et al., 2005). 건조시킨 조직의 3세트(~2mg)도 파파인으로 소화시키고, 용해된 조직의 분액에서 메타크로마틱 색소, 1,9-디메틸메틸렌 블루를 이용하여 PG 측정치로서 황산화된 글리코스아미노글리칸을 분석하였다(Sakai et al., 2005).
운동 분절을 염수에 담근 거즈로 싸고, 2겹의 폴리텐 백으로 밀봉하고, 생체 역학 테스트를 실시할 때까지 -30 ℃로 동결시켰다. 이러한 처리는 조직의 생체 역학적 특징을 변이시키지 않는 것으로 확인되었다(Panjabi et al.,1985). 생체 역학적 테스트를 수행하여, 축 압축, 만곡, 확장, 측면 굽힘 및 축 비틀림에 대한 각각의 디스크의 강도를 생리적 부하에 가까운 한정된 컴퓨터-조절 조건 하에서 측정하였다(Panjabi et al.,1985; Race et al., 2000; Smit, 2002; Wilke et al., 1999). 테스트 프로토콜의 모든 상세한 사항은 도처에 기술되어 있다(Panjabi et al.,1985; Race et al., 2000; Smit, 2002; Wilke et al., 1999). 테스트를 위한 피검물(기능성 척주 단위, FSU)은 2개의 인접한 추골, 개지 디스크(intervening disc) 및 연결 인대로 구성되어 있다. 척주 당 3개의 FSU를 테스트하였다: C-ABC 단독으로만 분해된 레젤은 디스크를 C-ABC로 분해한 다음 히알루론산 단독 처리하였고, 중간 레벨은 C-ABC로 분해한 다음 히알루론산과 MPC로 처리하였다. 각각의 FSU를 2개의 알루미늄 합금 컵에 둔 다음 3개의 볼트와 차가운 폴리메틸 메타크릴레이트 덴탈 시멘트(Vertex SC Self Curing, Dentimex BV, Zeist, Holland)로 고정하였다. 추간 디스트의 중간이 수평으로 위치되도록 조처를 취하였다. 척주관을 통해 컵 하나의 홀에 못으로 고정하여 운동 분절이 컵 가운데 위치될 것이다. 모든 테스트는 37 ℃로 유지되는 염수 조에서 수행하였다. 테스트를 개시하기 전에, 각각의 FSU에 재현가능한 수화 상태가 될 때까지 0.5 MPa 스트레스를 미리 하중할 것이다. 이는 각 테스트 전에 베이스라인으로 사용하였다. 미리 하중한 0.5 MPa 스트레스 자극은 스탠딩을 완화시키고, 추간 압력의 생체내 측정값을 기초로 하였다.
기계적 테스트는 '6단계의 프리덤' 로드 셀이 장착된 Model 8511 다이나믹 서보유압 머터리얼 테스팅 장치(INSTRON Pty Ltd, High Wycombe, UK)을 이용하여 수행하여, 모두 3개의 플랜에서 모니터링과 힘 조절을 동시에 가능하게 하였다. 장치는 퍼스널 컴퓨터와 데이타를 기록 및 분석하는 커스텀형 소프트웨어로 조절하였다. 테스트 데이타는 축 하중 또는 비틀림 조절 중 어느 하나에서 최종 사인형의 0.1 Hz 하중 사이클 5가지로부터 안정적인 히스테리스로 수득하였다. 테스트는 순수 축 압축, 좌 및 우 측면 굽힘, 굴곡/신전 조합 및 순수 축 비틀림에 대해 수행하였다.
200N의 순수 축 압축을 하중에 수반되는 굽힘 또는 굴곡이 거의 없거나 없는 FSU에 가하였다. 모든 압축 테스트는 두개컵(cranial cup) 표면 상에 포인트 접촉을 이용하여 수행하였다. 중립축 굽힘(neutral axis of bending: NAB)을, 피검물이 고정된 알루미늄 합금 컵 상에 포인트를 통해 관절에 사이클형 하중을 적용하여 아주 약한 굽힘을 형성함으로써 측정하였다. 이러한 시도와 실패는 단단한 포인트 하중 접촉을 이용하여 가능한 순수 축 압축에 가까워지게 할 수 있다. 피검물 간에 약간의 가변성에도 불구하고, 이 포인트는 척주관에서 전방 약 10 mm, 디스크 중심점에서 약간 후방의 시상면에서 찾아졌다. NAB의 좌측 및 우측에서 10 mm 전방 및 후방에 마크를 표시하여, 굽힘 테스트에 대한 상쇄 하중을 나타내었다. 최대 압축 하중 200N을 각 포인트에 가하여 2Nm 굽힘 및 200N 축 압축을 형성시켰다.
디스크, 후방 요소, 종판 및 그외 인대 구조가 손상되지 않았는 지를 확인하기 위해 보존 굽힘(Conservative bending) 및 압축 하중을 선택하였다. 이러한 하중 방법을 이용하여 순수 굽힘을 만들지 않았다. 대신, 굽힘과 축 압축의 조합은 굴곡/신전 조합 및 측면 굽힘 테스트에서 제시되었다. 본 발명자들은, 이는 생체내 하중이 압축과 굽힘의 조합 보다는 순수 굽힘을 거의 형성하지 않는다는 것을 뒷받침하는 것으로 생각하였다. 각각의 하중 경우에서, 모든 하중을 각 피검물에 일정하게 적용하여, 기계적 반응을 직접 비교가능하게 하였다.
비틀림 테스트에서, 5Nm의 순수 축 비틀림이 적용될 것이다. 이는 다른 실험에서 적용하고 예상되는 생리적 토크 범위내였다. 새로운 맞춤 설계한 토크 테스트 시스템을 이용하여, 각 FSU에 순수 토크를 적용할 것이다. 이 시스템은 볼스크류/미는(ballscrew/thrust) 플레이트 메카니즘을 이용하여, 인스트론 액추어터(Instron actuator)의 축 전위를 순수 회전으로 변환시킨다. X-Y 베어링 테이블은, FSU가 테스트 동안에 이에 부가된 회전의 고정 센터를 가지지 않는다는 것을 보증한다. 이는, 회전의 센터가 축 회전 동안에 일정하지 않다는 것이므로, 중요한 사항이다. 아래 컵은 토크 트랜스듀서로 고정시키고, 위쪽 컵은 테이블과 볼스크류/미는 플레이트 메카니즘에 적합한 X-Y에 고정시켰다.
모든 테스트들은 무손상 FSU에서 먼저 수행하였다. 완료한 후, 디스크는 소형 활통납을 이용하여 신경 구멍(neural foramen)을 관통하여 후방 엘리먼트 전체를 자르고, 후방을 잘라, 분리하였다. 돌기사이관절, 극간 및 극상 인대 전체를 잘라, 추간 디스크, 후방 및 전방 세로길이의 인대가 온전히 남게된다. 이러한 절단은 돌기사이관절들 간에 접촉되지 않도록 하기 위해, 후방쪽으로 넓어지는 쐐기 양상으로 이루어졌다. 그런 후 모든 테스트는 분리한 디스크로 반복하였다.
데이타 분석에는 5번째 하중 사이클 동안에 선형 영역에서의 강직성, 히스테레시스 및 중립존의 연신 에너지와 면적 등의 파라미터가 포함되었다. 대조군 레벨 데이트를 변성/MPC-주사한 레벨과 비교하였고, 반복적인 분산 분석 측정을 생체 역학적 파라미터 각각에 대해 수행하였다.
결과
MPC 주사한 그룹의 동물 모두 정상 체중을 유지하였지만, 실험하는 기간 동안 부작용 증거는 없었다.
콘드로이티나제-ABD 주사한 디스크에서, 이 효소에 의한 PG의 고갈로, 주사한 디스크 모두에서 3개월 후에 디스크 높이 인덱스(DHI)가 38% 감소되었다. 이러한 디스크 높이 감소는, 처리하기 전에 수핵의 퇴화 상태를 나타내며, 지금까지는 pre-MPC DHI이라고 한다. HA 또는 MPC + HA를 퇴화 부위에 주사한 지 3개월 후에 pre-MPC DHI에 비해 DHI의 임의의 현저한 증가를 이루는데 실패하였다(도 26). 그러나, 처리 후 6개월까지, MPC + HA를 주사한 디스크에서는 대응되는 3개월 스코어(그룹 1)에 비해 DHI의 52%의 평균 증가가 나타났다(도 26 및 표 4). 반면, HA만 주사한 디스크에서는 동일 기간 동안 23.1%의 DHI 스코어의 평균적인 개선이 나타났다(도 26 및 표 4). 중요한 것으로, MPC + HA를 저농도로 주사한 디스크의 평균 DHI는, 처리 후 6개월이 비-콘드로티나제 ABC 주사한(즉, 무-퇴화) 대조군 디스크에 대한 DHA 스코어에 견줄만 하였다(도 26).
HA 또는 MPC + HA 주사 후 6개월 대 3개월째의 DHI의 통계 분석 결과는 표 4에 나타낸다.
양의 MPC와, 고중량 히알루론산(HA)과 같은 적정 담체를 함께 실험으로 만든 퇴화 IVD의 수핵에 투여한 결과, 본 발명에서 디스크 높이의 복구에 의해 방사선그래프로 분석한 바에 따라 디스크 세포외 기질의 재생을 촉진시키는 것으로 확인되었다. 이러한 해석은, 이에 결합된 수분자와 함께 그러한 구조에 높은 팽창압을 부여하는, 매트릭스 프로테오글리칸이 고농도로 NP와 내부-윤에 존재함으로써, 하중된 척주에서, 디스크 길이가 유지된다는 추측을 근간으로 한다. 실제, 이러한 실험의 개시시에 디스크 퇴화를 유도하는 콘드로이티나제-ABC의 이용은, 이 효소의 NP 세포외 기질로부터 대부분의 프로테오글리칸을 분해 및 제거하는 능력에 의존된다.
지금까지 수득한 데이타는, MPC에 의해 매개된 치료학적 효과가 비교적 느린 과정임을 시사한다. 현 연구에서, MPC 농도 0.5 x 106가 특히 효과적이었다.
본 실험은 MPC를 디스크에 주사한 후 6개월에 종결지었지만, MPC를 조농도로 주사한 후 수득한 디스크 높이 복구 레벨이 비-콘드로이티나제 ABC 주사한 내부 대조군에서 관찰되는 수치에 가까운 것으로 확인되었으며, 이는 최대 NP 재구성 수준은 이 기간 동안에 달성되었음을 의미한다.
당업자라면, 광의적으로 기술된 본 발명의 사상 또는 범위에서 이탈하지 않으면서, 구체적인 구현예들에 나타낸 바와 같이, 수많은 변형 및/또는 수정을 본 발명에 가할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 모든 측면들이 예시적이고 비제한적인 것으로 간주된다.
본원에 논의 및/또는 참조된 모든 공개 문헌들은 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에 포함되어 있는 문헌, 논문, 물질, 장치, 기사 등에 대한 모든 내용들은 본 발명의 내용을 제공하기 위한 목적일 뿐이다. 이러한 사항들 중 임의 또는 전체가 본 출원의 각 청구항에 대한 우선일 이전에 존재하는 것으로서, 종래 기술 분야의 일부를 형성하거나, 또는 본 발명에 해당되는 분야에 공통된 상식이라는 것을 인정하는 것으로서 받아들여지는 것은 아니다.
간엽 전구 세포( MPC ) + 히알루로난 (HA) 또는 HA 단독을 양의 퇴화된 요추 디스크에 주사한 후 3개월 및 6개월에 디스크 높이 복구 정도
　 MPC 주사 전 DHI MPC 주사 후 3 개월
DHI 		MPC 주사 후 6 개월
DHI
　 주사 안함 cABC 단독 cABC +HA cABC +HA+MPC 주사 안함 cABC 단독 cABC +HA cABC +HA+MPC 주사 안함 cABC 단독 cABC +HA cABC +HA+MPC
평균 0.054 0.04 0.04 0.04 0.055 0.0416667 0.0433333 0.0383333 0.0566667 0.0516667 0.0533333 0.05833333
표준 편차 0.015 0.01 0.01 0.01 0.01 0.014 0.008 0.014 0.015 0.017 0.008 0.007
3개월에서 6개월까지의 변화율% 　 　 0.2 23.9 23.1 52.174
통계학적 유의성(P 값) 0.83 0.31 0.059 0.0142
P < 0.05 = 유의함 DHI = 디스크 높이 인덱스 cABC = 콘드로이티나제 ABC 　

Claims (15)

  1. MPC 및/또는 그것의 자손 세포 및/또는 이들로부터 유래된 가용성 인자를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 결합 조직의 분해 및/또는 염증으로 인한 개체 내 질병을 치료 및/또는 예방하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 결합 조직에 프로테오글리칸이 풍부한 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 결합 조직이 연골인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 질환이 연골에서의 한가지 이상의 결함으로 인한 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 MPC 및/또는 그것의 자손 세포 및/또는 이들로부터 유래된 가용성 인자가 연골 결함 부위에 직접 투여되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MPC 및/또는 그것의 자손 세포 및/또는 이들로부터 유래된 가용성 인자가 관절 스페이스(joint space)에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 관절 스페이스가 무릎 관절, 고관절, 발목 관절, 어깨 관절, 팔꿈치 관절, 손목 관절, 손 또는 손가락 관절, 발 관절 또는 추간판 관절내인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 MPC 및/또는 그것의 자손 세포 및/또는 이들로부터 유래된 가용성 인자가 관절내 주사에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MPC 및/또는 그것의 자손 세포 및/또는 이들로부터 유래된 가용성 인자의 투여가 프로테오글리칸이 풍부한 연골의 유지 또는 생성을 야기하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 프로테오글리칸이 풍부한 연골이 유리질 연골인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 건염, 등 통증, 회전근개 건 분해(rotary cuff tendon degradation), 수근관 증후군(Carpal tunnel syndrome), 드퀘르뱅 건초염(DeQuervain's syndrome), 경추 디스크 및/또는 요추 디스크 퇴화(degenerative cervical and/or lumber discs), 교차 증후군( intersection syndrome), 반사성 교감신경 위축증(reflex sympathetic dystrophy syndrome: RSDS), 협착성 건초염(stenosing tenosynovitis), 상과염(epicondylitis), 건초염(tenosynovitis), 흉곽출구 증후군(thoracic outlet syndrome), 척골 신경 포착(ulnar nerve entrapment), 요골 터널 증후군(radial tunnel syndrome), 반복성 긴장성 손상(repetitive strain injury: RSI), 골관절염, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 및 혈청음성 관절염, 염증 장 질환 또는 강직성 척추염 관련 관절염, 또는 추간판 퇴화 장애인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루론산(HA)을 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. i) 간엽 전구 세포(MPC) 및/또는 그것의 자손세포로부터 유래된, 상층물 또는 하나 이상의 가용성 인자, 및
    ii) 히알루론산을 포함하는 조성물.
  14. i) 간엽 전구 세포(MPC) 및/또는 그것의 자손세포, 및
    ii) 히알루론산을 포함하는 조성물.
  15. 개체에서 결합 조직을 생성, 복구 및/또는 유지시키기 위한, 간엽 전구 세포(MPC) 및/또는 그것의 자손세포로부터 유래된, 상층물 또는 하나 이상의 가용성 인자의 용도.
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