CN101827603B - 用于体内生成、修复和/或维护结缔组织的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于在受治疗者中生成、修复和/或维护结缔组织的方法。在一种实施方式中，本发明涉及一种用于在受治疗者中生成、修复和/或维护软骨组织的方法。本发明还涉及一种在受治疗者中治疗和/或预防由结缔组织的退变和炎症所引起的疾病的方法。

Description

用于体内生成、修复和/或维护结缔组织的方法

技术领域

本发明涉及一种用于在受治疗者中生成、修复和/或维护结缔组织的方法。本发明还涉及一种在受治疗者中治疗和/或预防由结缔组织的退变(变性)和炎症引起的疾病的方法。

背景技术

存在于体内并产生多能细胞的非造血祖细胞(progenitor cells)，当被分离时，称作间充质前体细胞(Mesenchymal Precursor Cells)(MPC)。更具体地说，纯化的MPC能够形成大量的多能细胞集落。

Simmons等人(1994)描述了通过选择表达STRO-1细胞表面标志的细胞而从新收获的骨髓细胞来富集MPC。如作者在第272-273页所解释的，已知骨髓细胞包含一定比例的能够产生CFU-F的MPC。这些CFU-F又能够在适当的条件下产生各种完全分化的结缔组织，包括软骨、骨、脂肪组织、纤维组织以及骨髓支持基质(myelosupportive stroma)。

MPC和CFU-F通常以非常低的发生率存在于骨髓细胞中(通常在0.05％到0.001％之间)并且这种稀有已是过去对它们的研究的主要限制。由Simmons等人(1994)讨论的一个重要发现是确定了，在某种程度上，通过选择STRO-1阳性细胞这些MPC可以富集自新鲜分离的骨髓细胞。尤其是，STRO-1阳性细胞的选择使得可以分离没有污染造血祖细胞的MPC(以及所得的CFU-F)。

WO 01/04268提供了在富集MPC方面的另一重要进展，其中通过在包含MPC的STRO-1阳性细胞的该部分中鉴定亚群。尤其是，WO 01/04268描述了将STRO-1阳性细胞群体分为三个子集(亚型)：STRO-1^不明亮的、STRO-1^中间以及STRO-1^明亮的。在不同种类的亚群中，CFU-F的克隆测定说明了大多数的MPC包含在STRO-1^明亮的部分中。

WO 2004/085630首次披露了，MPC存在于血管周组织(perivascular tissue)中。该发现的好处之一在于，它大大地扩大了源组织的范围，从该源组织可以分离或富集MPC并且不再将MPC的来源有效的限制于骨髓。根据在WO 2004/085630中描述的方法从其可以分离MPC的组织包括人骨髓、牙髓、脂肪组织、皮肤、脾、胰、脑、肾、肝以及心脏。分离自血管周组织的MPC对于细胞表面标志3G5是阳性的。因而它们可以通过富集携带3G5标记的细胞，或通过富集存在于血管周细胞上的早期发育表面标志如CD146(MUC18)、VCAM-1，或通过富集细胞表面标志STRO-1的高水平表达来分离。

无血管结缔组织通常位于肌骨骼系统(其需要明显的运动)内的解剖部位。这些可自由移动的关节负责哺乳动物中的大多数铰接(关节联接，articulations)。在滑膜关节中，两个相反骨(相对骨)的接触面被透明软骨覆盖，该透明软骨毫不费力地彼此滑动，这是由于在由细胞产生的滑液中存在低摩擦润滑剂，其中上述细胞对覆盖和连接长骨的关节囊进行加衬。在脊柱中，铰接是借助于包封水合凝胶物质(髓核)的柔性纤维软骨环(flexible fibrocartilagenousring)(纤维环)通过刚性椎骨的连接来实现的，通过软骨细胞样细胞(类似于在透明软骨中存在的那些细胞)加以迁移。与这些无血管结缔组织的类型和位置无关，它们都包含合成细胞外基质的细胞，其中细胞外基质富含高度带负电荷的蛋白聚糖(蛋白多糖)，其吸入水分子以及纤维蛋白、II型胶原，这赋予高拉伸强度。

无血管结缔组织如透明软骨，半月板(关节盘，meniscus)和椎间盘的内部三分之二具有有限的修复能力，并且当受伤时可以通过产生功能较差的纤维软骨疤痕组织加以反应。通过多种受老化、遗传学、激素状态以及身体伤害支配的因素，这些无血管结缔组织经常导致盘退变(disc degeneration)、背部疼痛以及骨关节炎的广泛的临床问题。

目前通常用来治疗由这些结缔组织的衰竭引起的症状的疗法，通过向下调节居民细胞(resident cell)合成组织细胞外基质的结构成分的能力，大部分几乎没有纠正负责产生症状的病理基础(潜在病理，underlying pathology)，并且在许多情况下甚至可以加剧问题。理想地，治疗处理(therapeutic treatments)应至少是软骨保护的，甚至提供这样的条件，其可以增强基质生物合成并实施受伤结缔组织的修复和恢复。

发明内容

本发明的发明人现在已经获得了令人惊讶的发现，关节内给予MPC可以在预先存在的骨关节炎的关节中提供软骨保护效应，并导致在滑膜关节中和在椎间盘的髓核中软骨组织的生成和生长。该发现表明，MPC或它们的后代、或来自这些MPC的上清液或可溶性因子，可以用来保护或修复受损的结缔组织以及在变性或损伤部位生成新的功能性组织。

因此，本发明提供了一种治疗和/或预防在受治疗者中由结缔组织的退变和/或炎症引起的疾病的方法，该方法包括给予受治疗者MPC和/或其后代细胞和/或从其衍生的可溶性因子。

在本发明的一种实施方式中，结缔组织富含蛋白聚糖。结缔组织可以是软骨，例如，透明软骨。在另一种实施方式中，疾病导致软骨缺陷。

在另一种实施方式中，上述方法包括给予受治疗者MPC和/或其后代细胞和/或从其衍生的可溶性因子，其中MPC和/或后代细胞和/或可溶性因子并不直接给予到缺陷中。

例如，可以给予到关节间隙(joint space)中以便治疗或预防在形成关节的骨的关节表面上软骨中的缺陷。类似地，可以给予到椎间盘间隙中以便治疗或预防周围盘(surrounding discs)中的缺陷。在另一个实施例中，在软骨缺陷附近的部位进行静脉内给予。

可以通过关节内注射来给予MPC和/或后代细胞和/或可溶性因子。可以关节内注射到身体的在软骨缺陷或潜在软骨缺陷部位的附近的任何关节中。例如，可以在膝关节、髋关节、踝关节、肩关节、肘关节、腕关节、手或手指关节或足关节、或椎间盘关节中进行关节内注射。

在本发明的另一种实施方式中，MPC和/或后代细胞和/或可溶性因子的给予导致软骨的保持或生成，其中软骨富含蛋白聚糖和II型胶原。富含蛋白聚糖和II型胶原的软骨的一个实例是透明软骨。优选地，通过本发明的方法保持或生成的软骨不是纤维软骨，其富含I型胶原，但II型胶原非常低，并且比透明软骨包含更少的蛋白聚糖。

“由结缔组织的退变和/或炎症所引起的”疾病的实例包括但不限于腱炎、背部疼痛、肩部回旋肌腱退变(rotary cuff tendondegradation)、腕管综合症、DeQuervain综合症、退变性颈椎间盘(degenerative cervical)和/或腰椎间盘(lumber discs)、交叉综合症、反射性交感营养不良综合症(reflex sympathetic dystrophy syndrome)(RSDS)、狭窄性腱鞘炎(stenosing tenosynovitis)、上髁炎、腱鞘炎、胸出口综合症、尺神经压迫性损害(ulnar nerve entrapment)、桡管综合症(radial tunnel syndrome)、重复性压迫损伤(重复性劳损，repetitive strain injury)(RSI)。与透明软骨的退变和/或炎症相关的疾病的实例包括但不限于关节炎如骨关节炎，类风湿性关节炎，银屑病关节炎，以及血清反应阴性关节炎，与炎性肠病相关的关节炎，或强直性脊柱炎和变性椎间盘疾病(degenerate invertebral discdisorders)。

在另一种优选的实施方式中，该方法进一步包括给予透明质酸(HA)。可以在与细胞、上清液和/或因子相同或不同的组合物中给予HA。

本发明还提供了一种组合物，该组合物包括MPC和/或其后代细胞以及透明质酸。

本文提供的结果首次表明，植入培养的MPC释放的可溶性因子支持结缔组织的保护、生成和生长。

因此，本发明还提供了一种组合物，包括：

i)上清液、或一种或多种可溶性因子，其来自间充质前体细胞(MPC)和/或其后代细胞，以及

ii)透明质酸。

在另一个方面，本发明提供了来自间充质前体细胞(MPC)和/或其后代细胞的上清液、或一种或多种可溶性因子在用于治疗和/或预防在受治疗者中由结缔组织的退变和/或炎症所引起的疾病中的应用。

本发明可应用于各种动物。例如，受治疗者可以是哺乳动物如人、狗、猫、马、牛、或羊。在一种实施方式中，受治疗者是人。

在该整个说明书中，词语“包括”、或变型如“包含”将理解成意味着包括所述的要素(element)、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组，但不排除任何其它要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组。

在下文中将通过以下非限制性实施例并参照附图来描述本发明。

附图说明

图1.半月板切除术后12周，注射有透明质酸(HA)或HA加上不同剂量的间充质前体细胞(MPC)的关节的股骨和胫骨软骨形态学评分的平均值±SD。

图2.半月板切除术后12周，注射有透明质酸(HA)或HA加上不同剂量的间充质前体细胞(MPC)的关节的股骨和胫骨骨赘评分的平均值±SD。

图3.注射有不同剂量的间充质前体细胞(MPC)的动物的软骨形态学关节评分的比率[HA/(MPC+HA)]。当比率＝1时，两种治疗同样有效。比率＞1表明MPC+HA优于HA。

图4.相对于单独HA，注射有不同剂量的MPC+HA的动物的骨赘评分的比率[HA/(MPC+HA)]。当比率＝1时，两种治疗同样有效。比率＞1表明MPC+HA优于HA。

图5.半月板切除术后12周，注射有透明质酸(HA)或100兆MPC+HA的关节软骨的组织形态测量确定的区域厚度评分的平均值±SE。结合所有胫骨软骨区，HA+100兆MPC＞HA(p＜0.05)。

图6.注射有不同剂量的间充质前体细胞(MPC)的动物的总Mankin改进关节组织病理学评分的平均值±SE的比率[HA/(MPC+HA)]。当比率＝1时，两种治疗同样有效。比率＞1表明MPC+HA优于HA。

图7.半月板切除术后12、24以及52周，HA和HA+100兆MPC注射关节的股骨和胫骨软骨形态学评分的平均值±SD。

图8.半月板切除术后12、24以及52周，HA和HA+100兆MPC注射关节的股骨和胫骨骨赘评分的平均值±SD。

图9.半月板切除术后12、24以及52周，注射有间充质前体细胞(MPC)的动物的软骨形态学关节评分(cartilage morphologyjoint scores)的比率[HA/(MPC+HA)]。当比率＝1时，两种治疗同样有效。比率＞1表明MPC+HA优于HA。

图10.半月板切除术后12、24以及52周，注射有间充质前体细胞(MPC)的动物的骨赘关节评分的比率[HA/(MPC+HA)]。当比率＝1时，两种治疗同样有效。比率＞1表明MPC+HA优于HA。

图11.半月板切除术后12、24以及52周，注射有间充质前体细胞(MPC)的动物的改进Mankins关节软骨组织病理学评分的平均值±SE的比率[HA/(MPC+HA)]。当比率＝1时，两种治疗同样有效。比率＞1表明MPC+HA优于HA。

图12.来自注射有透明质酸(HA)或HA+不同剂量的间充质前体细胞(MPC)的关节的髌骨软骨刚度的平均值+/-SE。*＝p＜0.05、**＝p＜0.01、***＝p＜0.001、****＝p＜0.0001。

图13.来自注射有透明质酸(HA)或100兆间充质前体细胞(MPC)+HA并在半月板切除术后12、24和52周处死的关节的髌骨软骨刚度的平均值+/-SE。*＝p＜0.05、**＝p＜0.01、***＝p＜0.001、****＝p＜0.0001。

图14.来自注射有透明质酸(HA)或HA+不同剂量的间充质前体细胞(MPC)的关节的髌骨软骨相位滞后(patella cartilage phaselag)的平均值+/-SE。*＝p＜0.05、**＝p＜0.01、***＝p＜0.001、****＝p＜0.0001。

图15.来自注射有透明质酸(HA)或HA+100兆间充质前体细胞(MPC)并在半月板切除术后12、24和52周处死的关节的髌骨软骨相位滞后的平均值+/-SE。*＝p＜0.05、**＝p＜0.01、***＝p＜0.001、****＝p＜0.0001。

图16.半月板切除术后12周，未治疗去势的雄性羊和切除卵巢的母羊的关节软骨形态学评分的比较，其在雌性组中显示出显著更严重的OA病变。

图17.半月板切除术后12周，未治疗去势的雄性羊和切除卵巢的母羊的关节骨赘评分的比较，其在雌性组中显示出显著更高的评分。

图18.半月板切除术后36周，来自注射有透明质酸(HA)或HA+100兆间充质前体细胞(MPC)(半月板切除术后12周)的切除卵巢的母羊的关节的软骨改进Mankin组织病理学评分的平均值±SD。P值＝HA与MPC+HA。这些结果表明，与胫骨软骨相比，单次MPC注射可以在更大程度上减小股骨透明软骨的异常组织病理学评分超过6个月。

图19.半月板切除术后36周，半月板切除术后12周给予关节内注射的切除卵巢的母羊的关节的软骨总改进Mankin组织病理学评分的比率(HA/HA+MPC)。当比率＝1时，MPC+HA相当于HA。比率＞1，表明MPC+HA比单独的HA更具保护作用。数据＝平均值±SEM。这些结果表明，与胫骨软骨相比，单次MPC注射可以在更大程度上减小股骨透明软骨的异常组织病理学评分超过6个月。

图20.半月板切除术(MX)后24和36周，与在MX后12周没有注射的关节相比，来自MX后12周注射有透明质酸(HA)或100兆间充质前体细胞(MPC)+HA的切除卵巢的母羊的关节的股骨软骨改进Mankin组织病理学评分的平均值±SD。P值是关于12周NIL与治疗。这些结果表明，单次MPC注射减小了异常组织病理学评分超过6个月。

图21.半月板切除术后36周，来自半月板切除术后12周注射有透明质酸(HA)或100兆间充质前体细胞(MPC)+HA的切除卵巢的母羊的关节的股骨软骨组织形态测定数据。示出的数据＝平均值±SEM。P值＝HA与MPC+HA。这些结果表明，与透明质酸相比，单次MPC注射可以产生更大的透明软骨超过6个月。

图22.来自未经治疗的母羊的关节的组织形态测量确定的股骨软骨厚度的平均值±SEM，其中上述未经治疗的母羊在半月板切除术(Mx)后12周被处死或在Mx以后12周被注射透明质酸(HA)或间充质前体细胞(MPC)+HA，然后在12或24周以后被处死。数据表示为平均值±SEM。P值是相对于12周NIL治疗。这些结果表明，单次MPC注射会增加透明软骨厚度超过6个月。

图23.来自未经治疗的母羊的关节的组织形态测量确定的股骨软骨区，其中上述未经治疗的母羊在半月板切除术(Mx)后12周被处死或在Mx以后12周被注射透明质酸(HA)或间充质前体细胞(MPC)+HA，然后在12或24周以后被处死。数据表示为平均值±SEM。P值是相对于12周NIL治疗。这些结果表明，单次MPC注射可以增加透明软骨区超过6个月。

图24.组织形态测量确定的综合灰度密度(IntegratedGrey-scale Density)(IGD)作为来自未经治疗的母羊的关节的股骨软骨的总蛋白聚糖(PG)含量的度量，其中上述未经治疗的母羊在半月板切除术(Mx)后12周被处死或在Mx以后12周被注射透明质酸(HA)或间充质前体细胞(MPC)+HA，然后在12或24周以后被处死。数据表示为平均值±SEM。P值是相对于12周NIL治疗。这些结果表明，与透明质酸注射相比，单次MPC注射产生显著更多的包含蛋白聚糖的软骨超过6个月。

图25.在所有羊组中，用间充质前体细胞(MPC)治疗的腰椎水平(lumber spinal levels)的示意图。

图26.在MPC和HA注射到变性羊盘(degenerate sheep discs)的髓核中以后3和6个月盘高度的平均恢复。

具体实施方式

通用技术和选择的定义

除非另有明确规定，否则本文中所使用的所有技术和科学术语将具有如本领域(例如，在细胞培养、干细胞生物学、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学、以及生物化学)普通技术人员通常所理解的相同含义。

除非另有说明，否则在本发明中采用的重组蛋白、细胞培养(细胞培养物，cell culture)、以及免疫学技术是本领域技术人员熟知的标准程序。这样的技术描述和说明在在诸如，J.Perbal，A PracticalGuide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons(1984)，J.Sambrooket al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarbourLaboratory Press(1989)，T.A.Brown(editor)，Essential MolecularBiology：A Practical Approach，Volumes 1 and 2，IRL Press(1991)，D.M.Glover and B.D.Hames(editors)，DNA Cloning：A PracticalApproach，Volumes 1-4，IRL Press(1995 and 1996)，and F.M.Ausubelet al.(editors)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括直到目前的所有更新)，Ed Harlow and David Lane(editors)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，(1988)，and J.E.Coligan et al.(editors)Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons(包括直到目前的所有更新)的来源的文献中。

如在本文中所使用的，术语“治疗”、“处理”包括给予治疗有效量的如本文所定义的上清液、可溶性因子和/或细胞，其足以减少或消除指定病症中的至少一种症状。

如在本文中所使用的，术语“预防”包括给予治疗有效量的如本文所定义的上清液、可溶性因子和/或细胞，其足以停止或阻止指定病症中的至少一种症状的发展。

如在本文中所使用的，术语“来自间充质前体细胞”是指由间充质前体细胞和/或其后代细胞的体外培养而产生的上清液、和/或一种或多种可溶性因子。

如在本文中所使用的，术语“上清液”是指在适宜的培养基，优选液体培养基中体外培养间充质前体细胞和/或其后代细胞以后所产生的非细胞物质。通常，通过在适当的条件和时间下在培养基中培养细胞，接着通过诸如离心的工艺(方法)除去细胞物质来产生上清液。在给予以前，上清液可以或可以不进一步经受纯化步骤。在优选的实施方式中，上清液包括少于10⁵个，更优选少于10⁴个，更优选少于10³个以及甚至更优选没有活细胞。

如在本文中所使用的，术语“一种或多种可溶性”因子是指在培养期间由MPC和/或其后代细胞所分泌的分子，通常为蛋白质。

间充质前体细胞(MPC)或后代细胞、以及来自其的上清液或一种 或多种可溶性因子

如在本文中所使用的，“MPC”是能够形成大量的多能细胞集落的非造血STRO-1⁺祖细胞。

间充质前体细胞(MPC)是这样的细胞，其存在于骨髓、血液、牙髓细胞、脂肪组织、皮肤、脾、胰、脑、肾、肝、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、骨、韧带、腱、骨骼肌、真皮、以及骨膜中；并且能够分化成不同的种系如中胚层、内胚层以及外胚层。因此，MPC能够分化成大量的细胞类型，其包括但不限于脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、弹性细胞、肌细胞、以及纤维结缔组织细胞。这些细胞进入的具体谱系定型(lineage-commitment)和分化途径取决于来自以下的各种影响：机械影响和/或内源性生物活性因子，如生长因子、细胞因子、和/或由宿主组织建立的局部微环境条件。间充质前体细胞因而非造血祖细胞，其分化以产生子细胞，这些子细胞是干细胞或是前体细胞(precursor cell)，其将适时地不可逆地分化以产生表型细胞。

在一种优选的实施方式中，MPC富集自由受治疗者获得的样品。术语‘富集的’、‘富集’或其变体在本文中用来描述细胞的群体，其中当与未处理群体相比时，一种特定细胞类型的比例或许多细胞类型的比例会增加。

在一种优选的实施方式中，在本发明中使用的细胞还是TNAP⁺、VCAM-1⁺、THY-1⁺、STRO-2⁺、CD45⁺、CD146⁺、3G5⁺或它们的任何组合。优选地，STRO-1⁺细胞是STRO-1^明亮的。优选地，STRO-1^明亮的细胞另外是VCAM-1⁺、THY-1⁺、STRO-2⁺和/或CD146⁺中的一种或多种。

在一种实施方式中，间充质前体细胞是如在WO 2004/85630中所定义的血管周围间充质前体细胞。

当我们称细胞对于给定的标记为“阳性的”时，它可以是所述标记的低(lo或暗淡的(dim))或高(明亮的(bright)，bri)表达子，其取决于标记存在于细胞表面上的程度，其中该术语涉及在细胞的颜色分类过程(方法)中所使用的荧光或其它颜色的强度。Lo(或暗淡的或不明亮的)和bri的区别将在用于待分选的特定细胞群体上的标记的范围内加以理解。当我们在本文中称细胞对于给定标记为“阴性的”时，它并不是指，上述细胞根本不表达所述标记。它是指，所述细胞以相对较低水平表达所述标记，以及当可检测地加以标记时它产生非常低的信号。

当在本文中使用时，术语“明亮的”是指在细胞表面上的标记，当可检测地加以标记时，其产生相对高信号。虽然不希望受理论限制，但提出“明亮的”细胞比在样品中的其它细胞表达更多的目标标记蛋白(例如由STRO-1识别的抗原)。例如，与非明亮的细胞(STRO-1^{不明亮的/暗淡的})相比，当标记有FITC共轭STRO-1抗体时，STRO-1^bri细胞产生更大的荧光信号，如通过FACS分析确定的。优选地，“明亮的”细胞构成包含在起始样品中的至少约0.1％的最明亮的标记的骨髓单核细胞。在其它实施方式中，“明亮的”细胞构成包含在起始样品中的至少约0.1％、至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％、或至少约2％的最明亮标记的骨髓单核细胞。在一种优选的实施方式中，STRO-1^明亮的细胞具有STRO-1表面表达的2对数(2log)大小更高的表达。这是相对于“背景”加以计算的，即为STRO-1^-的细胞。相比之下，STRO-1^暗淡的和/或STRO-1^中间细胞具有STRO-1表面表达的小于2对数大小更高的表达，通常约1对数或小于“背景”。

当在本文中使用时，术语“TNAP”用来包括组织非特异性碱性磷酸酶的所有变异体。例如，该术语包括肝变异体(LAP)、骨变异体(BAP)以及肾变异体(KAP)。在一种优选的实施方式中，TNAP是BAP。在一种特别优选的实施方式中，如在本文中所使用的，TNAP是指一种分子，其可以结合由杂交瘤细胞系(在布达佩斯条约(Budapest Treaty)的规定下，在2005年12月19日保藏在ATCC，保藏登录号为PTA-7282)产生的STRO-3抗体。

另外，在一种优选的实施方式中，MPC能够产生克隆原性CFU-F。

优选的是，大部分的多能细胞能够分化成至少两种不同的种系。多能细胞可以被定向的谱系的非限制性实例包括骨前体细胞；肝细胞祖细胞，其对于胆管上皮细胞和肝细胞是多能的；神经限制性细胞(neural restricted cells)，这些细胞可以产生神经胶质细胞前体，其演变成少突胶质细胞和星形细胞；神经元前体，其演变成神经元；用于心肌和心肌细胞的前体，葡萄糖反应胰岛分泌胰腺β细胞系。其它谱系包括但不限于成牙本质细胞，产生牙本质的细胞和软骨细胞，以及下述的前体细胞：视网膜色素上皮细胞，成纤维细胞，皮肤细胞如角质细胞，树突状细胞，毛囊细胞，输尿管上皮细胞，平滑和骨骼肌细胞，睾丸祖细胞，血管内皮细胞，腱细胞，韧带细胞，软骨细胞，脂肪细胞，成纤维细胞，骨髓基质(marrowstroma)细胞，心肌细胞，平滑肌细胞，骨骼肌细胞，周细胞，血管细胞，上皮细胞，神经胶质细胞，神经元细胞，星形细胞以及少突胶质细胞。

在另一种实施方式中，在培养以后，MPC不能产生造血细胞。

本发明还涉及由MPC和/或其后代细胞(后者还被称作扩大细胞(扩增细胞，expanded cells))获得的上清液或可溶性因子的应用，其产生自体外培养。本发明的扩大细胞可以具有各种各样的表型，其取决于培养条件(包括在培养基中刺激因子的数目和/或类型)、传代培养的数目等。在某些实施方式中，在约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、或约10次传代培养以后，后代细胞获自亲代种群(parental population)。然而，后代细胞可以在任何数目的传代培养以后获自亲代种群。

可以通过在任何适宜的培养基中进行培养来获得后代细胞。如相对于细胞培养所使用的，术语“培养基”包括细胞周边环境的成分。培养基可以是固相、液相、气相或相和物质的混合物。培养基包括液体生长培养基以及并不维持细胞生长的液体培养基。培养基还包括胶质培养基如琼脂、琼脂糖、明胶以及胶原基质。示例性的气体培养基包括气相，生长在平皿或其它固体或半固体载体上的细胞暴露于上述气相。术语“培养基”还指用于细胞培养的物质，即使它还没有与细胞接触。换句话说，制备用于细菌培养的富含营养物的液体是一种培养基。类似地，当与水或其它液体混合时变得适用于细胞培养的粉末混合物可以称作“粉状培养基”。

在一种实施方式中，可用于本发明的方法的后代细胞通过利用标记有STRO-3抗体的磁珠从骨髓分离TNAP+MPC，然后培养扩大分离的细胞来获得(参见Gronthos et al.(1995)，适宜培养条件的一个实例)。

在一种实施方式中，这样的扩大细胞(后代)(至少5次传代培养以后)可以是TNAP-、CC9⁺、HLA类I⁺、HLA类II^-、CD14^-、CD19^-、CD3^-、CD11a-c^-、CD31^-、CD86^-CD34^-和/或CD80^-。然而，在与本文描述的培养条件不同的培养条件下，可以变化不同标记的表达。此外，虽然这些表型的细胞在消耗的细胞群体中可能占优势，但它并不意味着存在较小群体的细胞，其并不具有这种表型(例如，小百分比的扩大细胞可以是CC9-)。在一种优选的实施方式中，扩大细胞仍具有分化成不同细胞类型的能力。

在一种实施方式中，用来获得上清液或可溶性因子、或细胞本身的消耗的细胞群体(expended cell population)包括这样的细胞，其中至少25％、更优选至少50％的上述细胞是CC9+。

在另一种实施方式中，用来获得上清液或可溶性因子、或细胞本身的消耗的细胞群体包括这样的细胞，其中至少40％、更优选至少45％的上述细胞是STRO-1+。

在另一种实施方式中，扩大细胞可以表达这样的标记，其选自由LFA-3、THY-1、VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、P-选择蛋白、L-选择蛋白、3G5、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD90、CD29、CD18、CD61、整联蛋白β、6-19、血栓调节蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦素(致轻素)-R、(STRO-2＝瘦素-R)、RANKL、STRO-1^明亮的以及CD146或这些标记的任何组合组成的组。

在一种实施方式中，后代细胞是多能的扩大(expanded)的MPC后代(MEMP)，如在WO 2006/032092中所定义的。用于制备MPC(从其可以衍生后代)的富集群体的方法描述在WO01/04268和WO 2004/085630中。在体外范围内，MPC将很少作为绝对纯的制剂(preparation)存在并且将通常与其它细胞一起存在，其中上述其它细胞是组织特异性定向细胞(定型细胞)(TSCC)。WO 01/04268涉及以约0.1％至90％的纯度水平从骨髓收获这样的细胞。包括MPC(从其衍生后代)的群体可以直接收获自组织来源，或可替换地它可以是已体外扩大的群体。

例如，后代可以获自收获的、未扩大的、基本上纯化的MPC的群体，其包括至少约0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80或95％的群体(它们存在于其中)的总细胞。这种水平例如可以通过选择这样的细胞来实现，所述细胞对于选自由TNAP、STRO-1^明亮的、3G5⁺、VCAM-1、THY-1、CD146以及STRO-2组成的组中的至少一种标记是阳性的。

MEMPS可以区别于刚收获的MPC，因为它们对于标记STRO-1^bri是阳性的并且对于标记碱性磷酸酶(ALP)是阴性的。相反，新鲜分离的MPC对于STRO-1^bri和ALP均是阳性的。在本发明的优选实施方式中，至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的给予的细胞具有表型STRO-1^bri、ALP-。在另外的优选的实施方式中，MEMPS对于标记Ki67、CD44和/或CD49c/CD29、VLA-3、α3β1中的一种或多种是阳性的。在又一种优选的实施方式中，MEMP并不呈现TERT活性和/或对于标记CD18是阴性的。

MPC起始群体可以来自在WO 01/04268或WO 2004/085630中阐述的任何一种或多种组织类型，即骨髓、牙髓细胞、脂肪组织和皮肤，或也许更广泛地来自脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰、骨、韧带、骨髓、腱以及骨骼肌。

应当明了，在实施本发明中，携带任何给定细胞表面标志的细胞的分离可以通过许多不同的方法来实现，然而，优选的方法依赖于将结合剂结合于关注的标记，接着分离那些呈现结合的标记，不管是高水平结合、或低水平结合或没有结合。最方便的结合剂是抗体或基于抗体的分子，优选为单克隆抗体或基于单克隆抗体，这是由于这些后者药剂的特异性。抗体可以用于两个步骤，然而，也可以使用其它药剂，因而用于这些标记的配体也可以用来富集携带它们或缺少它们的细胞。

可以将抗体或配体连接于载体(固相支持体，solid support)以便于粗分离。分离技术优选最大化保持待收集部分的生存能力。不同功效的各种技术可以用来获得相对粗分离。采用的特定技术将取决于分离效率、伴随的细胞毒性、进行的容易程度和速度、以及对复杂设备和/或技术技能的需要。用于分离的程序可以包括但不限于磁力分离、利用涂布有抗体的磁珠、亲和层析以及“淘选”(借助于连接于固体基质的抗体)。提供准确分离的技术包括但不限于FACS。

优选的是，用于分离MPC的方法，例如，包括第一步骤，为固相分选步骤，其利用例如识别STRO-1的高水平表达的MACS。如果需要的话，可以接着是第二分选步骤，应当期望导致更高水平的前体细胞表达，如在专利说明书WO 01/14268中所描述的。这种第二分选步骤可以涉及使用两种或更多种标记。

获得MPC的方法还可以包括在第一富集步骤以前利用已知技术来收获细胞来源。因此将手术切除组织。然后将包括源组织的细胞分离成所谓的单细胞悬浮液。可以通过物理和/或酶促方式来实现这种分离。

在获得适宜的MPC群体以后，可以通过任何适宜的方式来对其进行培养或扩大，以获得MEMP。

在一种实施方式中，细胞获自待治疗的受治疗者，利用标准技术体外培养并用来获得上清液或可溶性因子或扩大细胞，用于作为自体或同种异体组合物给予受治疗者。在一种可替换的实施方式中，一种或多种已建立的人细胞系的细胞用来获得上清液或可溶性因子。在本发明的另一种有利的实施方式中，非人动物(或如果患者不是人，来自另一物种)的细胞用来获得上清液或可溶性因子。

本发明可以利用来自任何非人动物物种的细胞来实施，所述细胞包括但不限于非人灵长类动物细胞、有蹄类动物细胞、犬细胞、猫科动物细胞、兔形目动物细胞、啮齿动物细胞、鸟类细胞、以及鱼类细胞。利用其可以实施本发明的灵长类动物细胞包括但不限于黑猩猩、狒狒、食蟹猴、以及任何其它新或旧世界猴的细胞。利用其可以实施本发明的有蹄类动物细胞包括但不限于牛、猪、绵羊、山羊、马、水牛以及野牛的细胞。利用其可以实施本发明的啮齿动物细胞包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠以及沙鼠的细胞。利用其可以实施本发明的兔形目动物物种的实例包括家养兔、长腿大野兔、野兔、棉尾兔、雪靴兔、以及鼠兔。鸡(红原鸡(Gallus gallus))是利用其可以实施本发明的鸟物种的实例。

可用于本发明的方法的细胞可以在使用前、或在获得上清液或可溶性因子以前加以存储。用于保存和存储真核细胞、尤其是哺乳动物细胞的方法和方案在本领域中是众所周知的(参照，例如，Pollard，J.W.and Walker，J.M.(1997)Basic Cell Culture Protocols，Second Edition，Humana Press，Totowa，N.J.；Freshney，R.I.(2000)Culture of Animal Cells，Fourth Edition，Wiley-Liss，Hoboken，N.J.)。本发明可以采用任何方法来维持分离的干细胞如间充质干/祖细胞、或其后代的生物活性。在一种优选的实施方式中，通过利用冷冻保存来保存(维持)和存储细胞。

给予(给药)和组合物

上清液或可溶性因子

本发明的方法可以涉及局部、全身、或局部性地如在植入物或装置内，给予来自MPC的上清液或可溶性因子。

在一种具体实施方式中，本发明涉及系统地将来自MPC的上清液或可溶性因子给予受治疗者。例如，可以通过皮下或肌内注射来给予上清液或可溶性因子。

本发明的该实施方式可以用于治疗系统性变性疾病(systemicdegenerative diseases)，其中期望产生或修复特定组织。可以以这种方式治疗的系统性变性疾病的实例包括骨质疏松症或骨折、或软骨的变性疾病。

来自MPC的上清液或可溶性因子还可以用来治疗这样的患者，所述患者需要修复或替换软骨组织(由组织的疾病或创伤或衰竭引起)以正常发展，或用来提供化妆功能，如用来增加身体的面部或其它特点。治疗可以需要使用上清液或可溶性因子以产生新的软骨组织和/或维持现有的软骨组织。例如，来自MPC的上清液或可溶性因子可以用来治疗软骨病症，例如，类风湿性关节炎或骨关节炎或对软骨的创伤或手术损伤。

包括来自MPC的上清液或可溶性因子的悬浮液可以被制备成适当的用于注射的油性悬浮液。适宜的亲油性溶剂或载体包括脂肪油如麻油；或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。用于注射的悬浮液还可以包含增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇、或葡聚糖。可选地，悬浮液还可以包含适宜的稳定剂或用来增加化合物的溶解度的药剂，以便于制备高浓缩溶液。

根据需要，可以通过将所需量的上清液或可溶性因子加入到包含以上所列举组分中的一种或组分的组合的适当溶剂中，接着过滤灭菌，来制备无菌注射液。通常，通过将上清液或可溶性因子加入到无菌载体中来制备分散体，其中无菌载体包含基本分散介质以及所需要的来自上面列举的其它组分。在无菌粉末用于制备无菌注射液的情况下，制备的优选方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性组分加上任何另外的所期望的组分(来自其先前无菌过滤溶液)的粉末。根据本发明的另一个可替换方面，可以用一种或更多种另外的化合物(其增强它的溶解度)来配制上清液或可溶性因子。

细胞组合物

在一种实施方式中，作为未分化细胞，即，作为在生长培养基中培养的未分化细胞，给予本发明的细胞组合物。可替换地，可以在培养以后给予细胞组合物。

可用于本发明的细胞组合物可以单独给予或作为与其它细胞的混合物给予。可以连同本发明的组合物一起给予的细胞包括但不限于其他多能细胞或软骨细胞、成软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨衬细胞、干细胞、或骨髓细胞。可以立即或在给予以前不久，将不同类型的细胞与本发明的组合物混合，或可以在给予以前一起共培养它们一段时间。

在本发明的某些实施方式中，在开始治疗以前，可以无必要或不期望用细胞组合物对患者进行免疫抑制。因此，在某些情况下，可以耐受用同种异体、或甚至异种MPC或其后代进行的移植。

然而，在其它情况下，在开始细胞疗法以前，对患者进行药理免疫抑制可以是期望的或适当的。这可以通过使用全身或局部免疫抑制剂来完成，或可以通过递送在包封装置中的细胞来完成。细胞可以被包封在胶囊中，该胶囊对于细胞和治疗因子所需要的营养物和氧是可渗透的，而细胞对于免疫体液因子和细胞则是不可渗透的。优选地，胶囊密封材料(密封剂，encapsulant)是低变应原的、容易且稳定位于靶组织中，并且为植入结构提供另外的保护。用于减少或消除对移植细胞的免疫反应的这些和其它方式在本领域中是已知的。作为一种备选方案，可以对细胞进行基因修饰以降低它们的免疫原性。

概况

“治疗有效量”是指在所必要的剂量和时间下有效的达到期望效果的量。

“预防有效量”是指在所必要的剂量和时间下有效的达到期望的预防性结果(如预防或抑制细胞凋亡或组织损伤)的量。

待给予的上清液或可溶性因子、或MPC或其后代的量可以根据各种因素而变化，如个体的疾病状态、年龄、性别、以及体重。可以对剂量方案(dosage regimens)进行调节以提供最佳治疗反应。例如，可以给予单丸(单次，single bolus)，可以随时间给予多个分剂量，或按比例地减少或增加剂量，如治疗情况的紧急状态所表明的。可以有利的是，以单位剂型配制胃肠道外组合物，以便于给予和获得剂量的均匀性。如在本文中所使用的，“单位剂型”是指物理上分散的单位，其适合作为用于待治疗受治疗者的单位剂量；每个单位包含预定量的计算用来产生希望的治疗效应的活性化合物以及所需要的药物载体。

应当明了，可以以包括药用载体或赋形剂的组合物的形式来给予上清液或可溶性因子或MPC或其后代。

如在本文中所使用的，“药用载体”或“赋形剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗菌药以及抗真菌药、等渗剂以及吸收延迟剂等，其是生理上相容的。在一种实施方式中，载体适用于胃肠道外给予。可替换地，载体可以适合于静脉内给予、腹腔内给予、肌内给予、舌下给予或口服给予。药用载体包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。这样的介质和药剂用于药物活性物质在本领域中是众所周知的。除非任何常规的介质或药剂与活性化合物不相容，否则可以期待其用于本发明的药物组合物。辅助的活性化合物也可以加入到组合物中。

在制备和储存条件下，治疗组合物通常应当是无菌和稳定的。组合物可以被配制成溶液、微乳、脂质体、或其它有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，其包含，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇以及液体聚乙二醇等)、以及它们的适宜混合物。例如，可以通过使用涂层如卵磷脂，在分散体的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。在许多情况下，优选的是，在组合物中包括等渗剂，例如，糖，多元醇如甘露醇、山梨醇，或氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的药剂，例如，单硬脂酸盐和明胶，可以产生可注射组合物的长期吸收。此外，在时间释放剂型(配方，formulation)中，例如在包括缓释聚合物的组合物中可以给予刺激因子。可以连同载体一起来制备活性化合物，其中载体将保护化合物免受快速释放，如控释剂型，其包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解、生物相容聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸以及聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(PLG)。用于制备这样的剂型的许多方法是专利性的或通常对于本领域技术人员来说是已知的。

可以连同适当的基质一起给予上清液或可溶性因子或细胞组合物，例如，以提供可溶性因子的缓释。

基质材料的选择是基于生物相容性、生物降解性、力学性能、美容外观(cosmetic appearance)以及界面性能。用于组合物的潜在基质可以是可生物降解的和化学定义的硫酸钙、磷酸三钙、羟基磷灰石、聚乳酸以及聚酸酐。其它潜在物质(基质)是可生物降解的和生物上明确定义的，如骨或真皮胶原。另外的基质由纯蛋白或细胞外基质成分构成。其它潜在基质是不可生物降解的和化学定义的，如烧结羟基磷灰石、生物玻璃、铝酸盐、或其它陶瓷。基质可以由任何上述类型的材料的组合，如聚乳酸和羟基磷灰石或胶原和磷酸三钙构成。可以改变生物陶瓷的组成，如在铝酸钙磷酸盐(calcium-aluminate-phosphate)中并加以处理以改变孔径、颗粒大小、颗粒形状、以及生物降解性。

来自MPC的上清液或可溶性因子、MPC或其后代可以被手术移植、注射、递送(例如，通过导管或注射器)，或以其它方式直接或间接地给予需要修复或增强的部位。来自MPC的上清液或可溶性因子的给予途径包括肌内给予、眼给予、胃肠道外给予(包括静脉内给予)、动脉内给予、皮下给予、口服给予以及鼻给予。胃肠道外给予的具体途径包括但不限于肌内给予途径、皮下给予途径、腹腔内给予途径、大脑内给予途径、心室内给予途径、脑室内给予途径(intracerebroventricular)、鞘内给予途径(intrathecal)、脑池内给予途径(intracisternal)、脊柱内和/或脊柱周围给予途径。

在本发明的某些实施方式中，剂型包括原位可聚合凝胶，如例如在US 2002/0022676；Anseth et al.(2002)和Wang et al.(2003)中所描述的。

在一些实施方式中，聚合物至少部分可溶于水溶液，如水、缓冲盐溶液、或含水醇溶液，其具有带电荷的侧基团、或其单价离子盐。具有可以与阳离子反应的酸性侧基团的聚合物的实例是聚(磷腈)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(乙酸乙烯酯)、以及磺化聚合物，如磺化聚苯乙烯。还可以使用这样的共聚物，其具有通过丙烯酸或甲基丙烯酸和乙烯基醚单体或聚合物的反应所形成的酸性侧基团。酸性基团的实例是羧酸基团、磺酸基团、卤化(优选氟化)醇基团、酚OH基团、以及酸性OH基团。

具有可以与阴离子反应的碱性侧基团的聚合物的实例是聚(乙烯胺)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基咪唑)、以及一些亚氨基取代的聚磷腈。聚合物的铵盐或季盐还可以由主链氮或侧亚氨基基团来形成。碱性侧基团的实例是氨基和亚氨基基团。

在室温下，在水中，藻酸盐可以与二价阳离子离子键交联，以形成水凝胶基质。由于这些温和条件，藻酸盐已是最通常用于杂交瘤细胞胶囊化的聚合物，如例如在US 4,352,883中所描述的。在US 4,352,883中所描述的方法中，包含待包封的生物材料的水溶液被悬浮在水溶性聚合物的溶液中，使悬浮液形成为液滴，通过与多价阳离子接触，其被配置到分离的微胶囊中，然后微胶囊的表面与聚氨基酸交联以在包胶材料周围形成半透膜。

聚磷腈是具有主链的聚合物，其中主链由被交替的单键和双键隔开的氮和磷组成。每个磷原子共价结合于两个侧链。

适用于交联的聚磷腈具有大部分侧链基团，其是酸性的并且能够与二价或三价阳离子形成盐桥。优选的酸性侧基团的实例是羧酸基团和磺酸基团。水解稳定的聚磷腈由具有羧酸侧基团的单体形成，其中羧酸侧基团通过二价或三价阳离子如Ca²⁺或Al³⁺加以交联。可以合成聚合物，其通过水解降解，其中通过加入具有咪唑、氨基酸酯或甘油侧基团的单体。例如，可以合成聚阴离子聚[二(乙氧羰苯氧基(羰基苯氧基，carboxylatophenoxy))]磷腈(PCPP)，其在水介质中在室温以下与溶解的多价阳离子交联以形成水凝胶基质。

可生物降解的聚磷腈具有至少两种不同类型的侧链，能够与多价阳离子形成盐桥的酸性侧基团，以及在体内条件下水解的侧基团，例如，咪唑基团、氨基酸酯、甘油以及葡糖基。

侧链的水解导致聚合物的侵蚀。水解侧链的实例是未取代和取代的咪唑和氨基酸酯，其中通过氨基键，基团结合于磷原子(其中两个R基团均以这种方式加以连接的聚磷腈聚合物被称作聚氨基磷腈)。对于聚咪唑磷腈，在聚磷腈主链上的一些“R”基团是咪唑环，其通过环氮原子连接于主链上的磷。其它“R”基团可以是有机残基，其并不参与水解，如甲基苯氧基基团或在Allcock等人(1977)的科学论文中所描述的其它基团。水凝胶材料的合成方法、以及用于制备这样的水凝胶的方法在本领域中是已知的。

可以与其它有益药物或生物分子(生长因子、营养因子)一起给予来自MPC的上清液或可溶性因子、MPC或其后代。当与其它药剂一起给予时，它们可以以单一药物组合物一起给予，或以分开的药物组合物，与其它药剂同时或顺序地(在给予其它药剂以前或以后)给予。可以共同给予的生物活性因子包括抗凋亡剂(例如，EPO、EPO模拟体(mimetibody)、TPO、IGF-I和IGF-II、HGF、半胱天冬酶抑制剂)；抗炎剂(例如，p38 MAPK抑制剂、TGF-β抑制剂、斯达汀(抑制素)、IL-6和IL-1抑制剂、PEMIROLAST、TRANILAST、REMICADE、SIROLIMUS、以及NSAID(非甾体抗炎药；例如，TEPOXALIN、TOLMETIN、SUPROFEN)；免疫抑制/免疫调节剂(例如，钙调磷酸酶(钙神经素)抑制剂，如环孢菌素、他克莫司(tacrolimus)；mTOR抑制剂(例如，SIROLIMUS、EVEROLIMUS)；抗增殖剂(例如，硫唑嘌呤(咪唑硫嘌呤，azathioprine)、麦考酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil))；皮质类固醇(例如，泼尼松龙、氢化可的松)；抗体如单克隆抗IL-2Rα受体抗体(例如，巴利昔单抗、达克珠单抗)、多克隆抗T细胞抗体(例如，抗胸腺细胞球蛋白(ATG)；抗淋巴细胞球蛋白(ALG)；单克隆抗T细胞抗体OKT3))；抗血栓发生剂(例如，肝素、肝素衍生物、尿激酶、PPack(右旋苯丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮(dextrophenylalanine proline arginine chloromethylketone))、抗凝血酶化合物、血小板受体拮抗剂、抗凝血酶抗体、抗血小板受体抗体、阿司匹林、潘生丁、鱼精蛋白、水蛭素、前列腺素抑制剂、以及血小板抑制剂)；和抗氧化剂(例如，普罗布考、维生素A、抗坏血酸、维生素E、辅酶Q-10、谷胱甘肽、L-半胱氨酸、N-乙酰基半胱氨酸)以及局部麻醉药。作为另一个实例，如在US 5,827,735中所描述的，可以连同瘢痕抑制因子一起共同给予来自MPC的上清液或可溶性因子、MPC或其后代。

当治疗和/或预防由结缔组织的退变和/或炎症所引起的疾病时，优选的是，与软骨保护剂一起给予上清液、可溶性因子或细胞。实例包括但不限于戊聚糖聚硫酸酯(或盐)(SP54和Cartrophen)、糖胺聚糖聚硫酸酯(Arteparon)、糖氨基-聚糖-肽复合物(Rumalon)以及透明质酸(Hyalgan)。Verbruggen(2005)以及Richette和Bardin(2004)描述了另外的实例。在一种优选的实施方式中，软骨保护剂是透明质酸。

纤维蛋白胶

纤维蛋白胶是一类外科密封剂，其已用于各种临床环境(clinical settings)。当技术人员将明了的，许多密封剂可用于本文定义的方法。然而，本发明的一种优选实施方式涉及纤维蛋白胶的应用。

当本文中使用时，术语“纤维蛋白胶”是指在有钙离子存在的情况下通过交联纤维蛋白聚合物而形成的不溶性基质。纤维蛋白胶可以形成自纤维蛋白原、或其衍生物或代谢物，纤维蛋白(可溶性单体或聚合物)和/或其来自生物组织或液体(其形成纤维蛋白基质)的复合物。可替换地，纤维蛋白胶可以由纤维蛋白原、或其衍生物或代谢物、或纤维蛋白(通过重组DNA技术产生)形成。

还可以通过纤维蛋白原和纤维蛋白胶形成的催化剂(如凝血酶和/或因子XIII)的相互作用来形成纤维蛋白胶。如本领域技术人员将明了的，纤维蛋白原在有催化剂(如凝血酶)存在的情况下被蛋白水解切割并被转化成纤维蛋白单体。然后纤维蛋白单体可以形成聚合物，其可以交联以形成纤维蛋白胶基质。可以通过催化剂如因子XIII的存在来增强纤维蛋白聚合物的交联。纤维蛋白胶形成的催化剂可以来自血浆、冷冻沉淀物或其它血浆部分，其包含纤维蛋白原或凝血酶。可替换地，可以通过重组DNA技术来生产催化剂。

血块形成的速度取决于与纤维蛋白原混合的凝血酶的浓度。作为酶依赖性反应，温度越高(高达37℃)，血块形成速度越快。血块的拉伸强度取决于所使用的纤维蛋白原的浓度。

Hirsh等人在美国专利第5,643,192号中描述了纤维蛋白胶的应用以及其制备和应用方法。Hirsh披露了纤维蛋白原和凝血酶成分从单一供体的提取，以及仅这些成分的组合用作纤维蛋白胶。Marx，美国专利第5,651,982号描述了纤维蛋白胶的另一种制备和应用方法。Marx提供了一种纤维蛋白胶，其中脂质体用作哺乳动物中的局部密封剂。用于伤口愈合的局部纤维蛋白原复合物(TFC)的制备和应用在本领域是已知的。美国红十字会的国际专利公开第WO96/17633号讨论了TFC制剂，其包含纤维蛋白原、凝血酶、以及氯化钙。

多个出版物描述了纤维蛋白胶在用于递送治疗剂中的应用。例如，美国专利4,983,393披露了一种用作阴道内插入物的组合物，其包含琼脂糖、琼脂、糖胺聚糖盐溶液(saline solutionglycosaminoglycans)、胶原、纤维蛋白以及酶。另外，美国专利3,089,815披露了一种可注射药物制剂，其由纤维蛋白原和凝血酶组成，而美国专利6,468,527披露了一种纤维蛋白胶，其可以促进各种生物和非生物剂递送到身体内的特定部位。

基因修饰细胞的生产

在一种实施方式中，在本发明的方法中所使用的细胞(包括用于上清液或可溶性因子的生产)被基因修饰。优选地，细胞被基因修饰以产生异源蛋白质。通常，细胞将被基因修饰使得异源蛋白质分泌自细胞。然而，在一种实施方式中，细胞可以被修饰以表达功能性非蛋白，其编码多核苷酸如dsRNA(通常用于RNA沉默)，反义寡核苷酸或催化核酸(如核酶或脱氧核酶)。

可以在存在至少一种细胞因子(其量足以支持修饰细胞的生长)的情况下对基因修饰的细胞进行培养。由此获得的基因修饰细胞可以立即使用(例如，在移植物中)，体外培养和扩大，或存储供以后使用。可以通过本领域众所周知的方法，例如，冷冻在液氮中，来存储修饰细胞。

如在本文中所使用的基因修饰包括任何基因修饰方法，其涉及将外源性或外源多核苷酸引入本文描述的细胞或涉及修饰细胞内的内源性基因。基因修饰包括但不限于转导(病毒介导的宿主DNA从宿主或供体转移到受体，体外或体内)、转染(用分离的病毒DNA基因组转化细胞)、脂质体介导的转移、电穿孔、磷酸钙转染或共沉淀以及其它方式。转导的方法包括用生产细胞(producer cells)直接共培养细胞(Bregni et al.，1992)或在有或没有适当生长因子和聚阳离子的情况下单独用病毒上清液加以培养。

优选在载体中将外源性多核苷酸引入细胞。载体优选包括用于插入的编码序列的转录和翻译的必要元件。用来构造这样的载体的方法在本领域是熟知的。例如，用于构造适宜的表达载体的技术详细地描述在Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.(3rd Ed.，2000)；以及Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，NewYork(1999)中。

载体可以包括但不限于病毒载体，如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒，以及单纯疱疹病毒；粘粒；质粒载体；合成载体；以及本领域中通常使用的重组载体。包含启动子和克隆位点(多核苷酸可以操作性地与其连接)的载体在本领域中是众所周知的。这样的载体能够体外或体内转录RNA，并且商业上可获自多种来源如Stratagene(La Jolla，Calif.)和Promega Biotech(Madison，Wis.)。具体实施包括来自Stratagene的pSG、pSV2CAT、pXtl；以及来自Pharmacia的pMSG、pSVL、pBPV以及pSVK3。

优选的载体包括逆转录病毒载体(参见，Coffin et al.，“Retroviruses”，Chapter 9 pp；437-473，Cold Springs HarborLaboratory Press，1997)。可用于本发明的载体可以由本领域众所周知的生产商重组生产。例如，WO94/29438、WO97/21824以及WO97/21825描述了逆转录病毒包装质粒和包装细胞系的构建。示例性的载体包括pCMV哺乳动物表达载体，如pCMV6b和pCMV6c(Chiron Corp.)、pSFFV-Neo、以及pBluescript-Sk+。有用的逆转录病毒载体的非限制性实例是那些来自鼠、鸟或灵长类逆转录病毒的载体。常用逆转录病毒载体包括那些基于莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine sarcoma virus)的载体(MoMLV载体)。其它来自MoMLV的载体包括Lmily、LINGFER、MINGFR以及MINT。另外的载体包括那些基于Gibbon猿白血病病毒(GALV)和莫洛尼鼠肉瘤病毒(MOMSV)以及脾脏病灶形成病毒(spleen focus formingvirus)(SFFV)的载体。来自鼠干细胞病毒(MESV)的载体包括MESV-MiLy。逆转录病毒载体还包括基于慢病毒的载体，并且非限制性实例包括基于人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)的载体。

在产生逆转录病毒载体构建物(constructs)中，可以从病毒除去病毒gag、pol以及env序列，从而为外源DNA序列的插入创造空间。由外源DNA编码的基因通常在长末端重复(LTR)中的强病毒启动子的控制下加以表达。适当控制调节序列的选择取决于所使用的宿主细胞并且选择是本领域技术人员明了的。除了LTR的启动子以外，还已知许多启动子。非限制性实例包括噬菌体拉姆达(λ)PL启动子、人巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子；莫洛尼鼠肉瘤病毒(MMSV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、或脾脏病灶形成病毒(SFFV)的U3区启动子；颗粒酶A启动子；以及颗粒酶B启动子。另外可以使用可诱导的或多重控制元件。适宜启动子的选择对于本领域技术人员来说将是显而易见的。

如果通过包装细胞系反式(in trans)提供gag、pol以及env功能，则这样的构建物可以有效地被包装到病毒颗粒中。因此，当载体构建物被引入到包装细胞中时，由细胞产生的gag-pol和env蛋白，与载体RNA进行组装以产生传染性病毒，其被分泌到培养基中。由此产生的病毒可以感染并整合到靶细胞的DNA中，但并不产生感染性病毒颗粒，因为它缺乏必要的包装序列。目前使用的大多数包装细胞系已用分开的质粒加以转染，所述质粒各自包含必要的编码序列之一，使得在可以产生有复制能力的病毒以前，多重重组事件是必要的。可替换地，包装细胞系包括前病毒。前病毒已被损害，使得虽然它可以产生为组装传染性病毒所需的所有蛋白质，但它本身的RNA不能被包装到病毒中。相反包装由重组病毒产生的RNA。因此，释放自包装细胞的病毒原液(virus stock)仅包含重组病毒。逆转录病毒包装系的非限制性实例包括PA12、PA317、PE501、PG13、PSI.CRIP，RDI 14、GP7C-tTA-G10、ProPak-A(PPA-6)、以及PT67。

其它适宜的载体包括腺病毒载体(参见，WO 95/27071)和腺相关病毒载体。这些载体在本领域都是熟知的，例如，如在Stem CellBiology and Gene Therapy，eds.Quesenberry et al.，John Wiley & Sons，1998；以及美国专利第5,693,531和5,691,176号中所描述的。在某些情况下，使用来自腺病毒的载体可以是有利的，因为它们不能感染非分裂细胞。不同于逆转录病毒DNA，腺病毒DNA不会被整合到靶细胞的基因组中。另外，腺病毒载体携带外源DNA的能力要比逆转录病毒载体大得多。腺相关病毒载体是另一种有用的递送系统。这种病毒的DNA可以被整合到非分裂细胞中，并且利用腺相关病毒载体，许多多核苷酸已成功地引入到不同的细胞类型中。

在一些实施方式中，构建物或载体将包括两种或更多种异源多核苷酸序列。优选地，另外的核酸序列是编码选择性标记、结构基因、治疗基因、或细胞因子/趋化因子基因的多核苷酸。

选择性标记可以包括在构建物或载体中，用于监测成功的基因修饰以及用于选择DNA已被整合到其中的细胞。非限制性实例包括抗药性标记，如G148或潮霉素。另外，可以使用负选择，例如，其中标记是HSV-tk基因。该基因将使细胞对药剂如阿昔洛韦和更昔洛韦变得敏感。通常使用NeoR(新霉素/G148抗性)基因，但可以使用任何方便的标记基因，其基因序列并不已经存在于靶细胞中。另外的非限制性实例包括低亲和力神经生长因子(NGFR)、增强型绿色荧光蛋白(EFGP)、二氢叶酸还原酶基因(DHFR)、细菌hisD基因、鼠CD24(HSA)、鼠CD8a(lyt)、细菌基因，其赋予对嘌呤霉素或腐草霉素、以及β-半乳糖苷酶的抗性。

另外的多核苷酸序列可以被引入到在相同载体上的细胞中或可以被引入到在第二载体上的宿主细胞中。在一种优选的实施方式中，选择性标记将包括在与多核苷酸相同的载体上。

本发明还包括基因修饰内源性基因的启动子区，使得内源性基因的表达被正调节，从而，与野生型细胞相比，导致编码蛋白的生产增加。

实施例

实施例1：免疫选择MPC的扩大和上清液的收集

骨髓(BM)收获自小于两岁的羊。简单地说，从髂嵴前部将40ml的BM抽吸到包含锂-肝素抗凝剂的管中。利用Lymphoprep^TM(Nycomed Pharma，Oslo，Norway)通过密度梯度分离来制备BMMNC，如先前描述的(Zannettino et al.，1998)。在4℃和400xg下离心30分钟以后，用移液吸管移走血沉棕黄层并在“HHF”中洗涤三次，其中“HHF”由Hanks平衡盐溶液(HBSS；Life Technologies，Gaithersburg，MD)构成，并且包含5％胎牛血清(FCS，CSL Limited，Victoria，澳大利亚)。

随后通过磁性活化细胞分选来分离TNAP+，如先前描述的(Gronthos et al.，2003；Gronthos et al.，1995)。简单地说，在冰上在封阻缓冲液中温育大约1-3×10⁸BMMNC 20分钟，其中封阻缓冲液由HHF中的10％(v/v)正常兔血清组成。在冰上，在封阻缓冲液中，用200μl的STRO-3mAb的10μg/ml溶液温育细胞1小时。随后，通过在400xg下离心，在HHF中洗涤细胞两次。添加在HHF缓冲液中的1/50稀度的山羊抗小鼠γ-生物素(SouthernBiotechnology Associates，Birmingham，UK)，并在冰上温育细胞1小时。如上述在MACS缓冲液(没有Ca²⁺和Mn²⁺的PBS，补充有1％BSA、5mM EDTA以及0.01％叠氮化钠)中洗涤细胞两次，然后再悬浮在最终容积为0.9ml的MACS缓冲液中。

将100μl链霉亲合素微珠(Miltenyi Biotec；Bergisch Gladbach，德国)加入到细胞悬浮液中并在冰上温育15分钟。洗涤细胞悬浮液两次，并再悬浮在0.5ml的MACS缓冲液中，随后加载到微型MACS柱(MS Columns，Miltenyi Biotec)上，接着用0.5ml的MACS缓冲液洗涤三次，以回收细胞，其并没有结合STRO-3 mAb(在2005年12月19日保藏在American Type Culture Collection(ATCC)，登录号为PTA-7282，参见WO/2006/108229)。在添加另外的1ml的MACS缓冲液以后，将柱从磁体移开并通过正压力来分离TNAP阳性细胞。可以用链霉亲合素-FITC对来自每个部分的等分部分的细胞进行染色，并通过流式细胞术评估纯度。

通过平板接种在α-MEM中，从MACS分离的TNAP+细胞建立原代培养，其中α-MEM补充有20％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺以及100μm L-抗坏血酸-2-磷酸盐，如先前描述的(Gronthos et al.，1995)。

对细胞进行培养，达到传代培养5次，其时可以收集经调节的培养基(上清液)。

实施例2：在成年去势的雄性羊(阉羊)中，在由双侧全内侧半月板 切除术(bilateral total medial meniscectomy)诱导的早期OA的模 型中，同种异体免疫选择的间充质前体细胞(MPC)对软骨完整性的 剂量依赖性关节内影响的研究

膝关节半月板(关节盘)或半月软骨是重要的承重结构，其还用来在关节铰接期间改善关节软骨润滑和提供横向稳定。撕裂或变性半月板(meniscus，关节盘)的手术切除，即，半月板切除术，是常见的矫形手术，但已知伴随在晚年的骨关节炎(OA)的增加的风险(Englund，2004)。在先前由手术切除半月板(关节盘)占据的空间中的关节滑膜的机械压迫性损害已知会导致半月板仿制品(meniscus replica)的部分再生(Moon et al.，1984)。然而，在狗中实验性半月板切除术研究的结果表明，这些更换结构主要由纤维组织构成，其生物力学性能远不如原来的半月板(menisci)(Ghosh etal.，1983)。此外，在半月板切除术6个月后，在这些实验动物的关节中OA发展的程度是相对严重的，这证实了由再生结构提供的对关节软骨的有限的功能保护(Ghosh et al.1983a)。OA的较大和较小动物模型已允许在关节组织中空间和时间变化的纵向评价，其发生在该疾病的发展过程中，而这难以利用人类患者来获得(Smithand Ghosh，2001)。在美利奴绵羊中，外侧或内侧半月板切除术已表明可以可靠地重现OA的典型的生化、生物力学以及组织病理学改变(Smith and Ghosh，2001)。绵羊OA模型也已广泛用来研究手术后治疗的各种模式的结果(Ghosh，1991；Smith and Ghosh，2001)，但迄今为止还未用来评估半月板再生长和OA的进展以及这些事件如何可以受到关节内间充质前体细胞(MPC)治疗的影响。

我们先前的研究已表明，在美利奴绵羊中双侧全内侧半月板切除术(BTM)导致关节软骨(AC)、软骨下骨以及滑膜组织中的病理变化，其是发展的并模拟早期人骨关节炎(OA)的发展。我们先前使用了这种动物模型来评估潜在的改善疾病的OA药物。

方法

用36只成年美利奴阉羊进行BTM。BTM两周后，对关节随机注射2mL高MW透明质酸(HA)或悬浮在2mL HA中的2mL同种异体Stro-3+MPC。研究了四种剂量的MPC：A组＝10兆(mil)MPC[n＝6]；B组＝25 mil MPC[n＝6]；C组＝100 mil MPC[n＝18]；以及D组＝150 mil MPC[n＝6]。BTM以后12周处死A、B以及D组，并在BTM以后12周[n＝6]、24周[n＝6]以及52周[n＝6]处死C组。

在尸体检剖时，由两倍盲观察员使用0-4等级对BTM关节的两个内侧室的AC病变和骨赘(OP)进行评分。从股骨和胫骨的中线除去滑膜组织和5mm宽的冠状骨软骨片并加以处理，然后利用引用的方法对组织病理变化(Little et al.，1997)和组织形态测量分析(Cake et al.，2003)进行评分。

对来自所有关节的完整的髌骨进行拓扑生物力学压印研究，以确定关节软骨的刚度和相位滞后(Appleyard et al.，2003)。

利用Kruskal-Wallis非参数分析对治疗效果进行统计分析并利用Mann Whitney U非参数分析对具体的组间比较进行统计分析，其中p＜0.05被认为是显著的。

利用等方差双尾学生T检验对每组注射有MPC+HA和注射有HA的关节进行了组间平均值比较的统计分析，其中p＜0.05被认为是显著的。

利用独立的T检验，对来自每组注射有MPC+HA(经治疗的)和注射有HA的关节的髌骨软骨之间的比较进行了统计分析，其中p＜0.05被认为是显著的。

结果

BTM后12周，总的形态评分表明MPC对AC完整性和OP形成的剂量依赖效应；100 mil MPC显示为最有效的软骨保护剂量，其是相对于单独的HA(图1和图2)。总AC评分比率(HA+MPC)/(HA)表明100＞150＞25＝10，而OP比率为100＝25＞10＞150 mil MPC(图3和图4)。对于总股骨和胫骨AC，观测到统计显著的(SS)更低的评分(p＝0.02)，而对于C组MPC股骨软骨，与单独的HA(图1)相比，观测到p＝0.052。

C组MPC+HA胫骨平台的组织形态测量分析揭示了，在中区(p＝0.057)和外区(p＝0.028)、以及所有区(p＝0.01)，AC比相应的HA-AC更厚(图5)。来自C组MPC+HA关节的AC切片的平均改进Mankin评分小于相应的HA切片，但不是SS。此外，当对来自每组的注射有HA和对侧注射有HA+MPC的关节的总Mankin评分的比率进行计算和作图时，显而易见的是，100兆剂量的MPC是最有效的(图6)。

100兆MPC剂量在保护关节软骨的完整性方面的可持续性问题是通过研究在注射后22和50周，即半月板切除术后24和52周，组织的形态、组织学以及生物力学性能来解决的。如从图7和图8可以明显看到的，对于HA和HA+100兆MPC的形态评分的平均值之间的差异随时间减小，虽然在24周时仍然存在治疗效果的某些证据。这种观点得到HA/MPC+HA数据的支持，其表明细胞在抑制骨赘评分方面的强效应长达52周(图10和图11)。另一方面，Mankin组织病理学评分的类似作图表明，到52周，MPC的保护作用会丧失(图11)。

对来自所有动物组的关节的髌骨软骨的生物力学压印研究通常与形态和组织学数据一致。然而，软骨的刚度受到软骨厚度的影响，其在损伤的初期阶段可以是肥大的但随着时间会正常化。这种情况可以发生在目前的模型中，因为针对25和100兆MPC组确定的髌骨软骨刚度显著小于10和150兆MPC组，根据其它研究，其呈现最多的损害组织(图12和图13)。这种解释得到相位滞后数据的支持，对于来自100兆MPC组的髌骨，其显著更低，这是相对于对应的注射有HA的关节和150兆MPC剂量(图14)。此外，发现，在12周时观测到的平均相位滞后值在半月板切除术后24和52周会显著增加，这证实了在超过6-12个月会丧失注射的MPC的有用的治疗效果(图15)。相位滞后反映了软骨细胞外基质的分子组装并且角度(相位)越低，弹性以及从变形恢复的能力越大(Cakeet al.，2005)。

针对注射有100mil MPC的关节所观测到的软骨保护效应会随时间而减小；在12和24周BTM观测到的积极影响到52周时会丧失。

不存在滑膜组织病理学调节的证据。对这些动物进行的临床和肉眼可见器官病理学还没有显示MPC的全身不良影响的任何证据。

结论

据我们所知，这是首次报道在早期OA的模型中同种异体MPC对软骨完整性的有益治疗效果。已知MPC会释放生长因子和细胞因子并且还抑制其它细胞的TNF-α的生产，同时上调节抗炎细胞因子(例如，IL-4、IL-10)。MPC的这些旁分泌活性可以刺激新标记的软骨细胞生物合成，而且还减弱分解代谢介质的局部生产和活性。在该研究中，100兆MPC是软骨保护的发现与这样的作用机制一致。在这些羊研究中产生的数据表明，由单次关节内注射100兆MPC所介导的软骨保护效应的持续时间是在治疗后的6-12个月之间，这表明，对于OA患者的长期管理来说，可能需要多次注射。

虽然HA的关节内注射广泛用于治疗膝骨关节炎，但存在有限的证据：这种治疗是软骨保护的(Ghosh et al.，2002)。然而，关节内HA治疗报道可以提供OA的症状缓解，其缓慢发作，但比用关节内皮质类固醇更持久(Bellamy et al.，2006)。

实施例3：在由去势母羊的后膝关节中的双侧全内侧半月板切除术 所诱导的严重骨关节炎的模型中，关节内注射透明质酸(HA)或100 兆间充质前体细胞(MPC)+HA对软骨完整性的相对治疗效果

膝关节半月板(关节盘)在正常关节铰接期间在保护关节软骨(AC)以避免损伤方面具有重要作用(Arnoczky et al.，1988)。在人类中在损伤以后，全部或部分切除半月板(关节盘)通常会导致AC的过早变性以及发展成骨关节炎(OA)(Jorgensen et al.，1987；Roos et al.，1998and McNicholas et al.，2000)。实验研究已表明，在羊中单侧或双侧总半月板切除术还导致AC的过早破裂和OA的早发(Ghosh et al，1990；Appleyard et al.，1999and Ghosh et al.，1993c)。

因为在半月板切除术的关节中AC的衰竭是对软骨施加高集中和剪应力的结果，所以发现双侧半月板切除术会诱导比单侧半月板切除术更加快速的软骨变性的进展，其中通过使用对侧非操作后肢可以完成支持的无疼痛负重(Ghosh et al.，1993a and 1993b；Appleyard et al.，2003；Little et al.，1997以及Oakley et al.，2004)。另外，进行双侧半月板切除术的切除卵巢的母羊还已经显示会经受比成年阉割雄性(阉羊)更快发展的OA，这主要是由于从它们的循环中消耗了软骨保护激素，雌激素(Parker et al.，2003)。由于这些原因，切除卵巢和双侧半月板切除术的母羊有利于作为OA的较大动物模型来研究抗OA剂的疾病改善活性(Ghosh et al.，1993；Smithet al.，1997；Burkhardt et al.，2001；Hwa et al.，2001以及Cake et al.，2000)。因此OA的切除卵巢/双侧半月板切除术的羊模型被选择用于本研究，其目的是用来评价关节内(IA)给予的同种异体间充质前体细胞(MPC)对富含蛋白聚糖的软骨的生长或再生的诱导的影响以及对软骨保护的影响，其是相对于目前使用的抗OA治疗，IA透明质酸(HA)。

方法

对3个月以前已利用发表的方法(Cake et al.，1004)经受卵巢切除术的18只成年美利奴母羊进行双侧全内侧半月板切除术(BTM)其中。用于BTM的外科手术和术后方案相同于在实施例2中描述的去势雄性羊BTM研究中所用的外科手术和术后方案。

BTM后12周，6只母羊被处死，而剩余12只半月板切除术的母羊的后膝(膝)关节被随机注射有2mL高MW HA或悬浮在2mL

加2mL HA中的100兆MPC。在实施例2中，MPC+HA的这种剂量表明，在BTM雄性绵羊模型中可以提供最有利的软骨保护效应。半月板切除术和经注射的母羊被分成两组(每组6只)，其在BTM后24和36周，即HA或MPC+HA关节内注射后12和24周被处死。为了确定性别对AC关节不稳定的反应的影响，还使6只未治疗的去势雄性羊经受BTM并在半月板切除术后12周处死。

在尸体检剖中，打开关节，除去半月板(关节盘)并对内侧股骨和胫骨平台进行拍照。由两倍盲观察员使用0-4等级针对软骨的总的形态变化对记录的图像进行评分。从每个关节的股骨和胫骨的中线除去来自髌上襞(suprapatellar fold)和5mm宽冠状骨软骨片的滑膜，然后加以处理用于制备组织学切片。由两位盲观察员使用如先前所描述的改进的Mankin评分系统(Little et al.，1997)来评估软骨组织病理学，。利用最近由Cake et al.，2008描述的标准，对滑膜组织病理学进行评分。

如用于Mankin评分的来自相同软骨块的组织学系列切片还用于组织形态测量分析，如先前描述的(Caket et al.，2000；Cake et al.，2004)。这种技术采用计算机辅助图像分析(ImagePro Plus v.3.0，Media Cybernetics)来产生关于甲苯胺蓝染色AC的尺寸和蛋白聚糖含量的指数的定量数据。总之，染色切片图像借助于MicrotekSlidescanner 35t plus(Microtek Model No.PTS-1950)以1300dpi的分辨率来获取，然后在个人计算机上利用Image软件(http://rsb.info.nih.gov/ij/)加以分析。股骨和胫骨切片的数字图像细分为内区、中区以及外区，每个区表示软骨切片的总面积的大约三分之一。通过扫描10×10mm高精度标线片来实现系统的空间校准。然后该等级(标度)用来量化输入图像的每个区的长度(mm)和面积(mm²)。切片的平均厚度通过用面积除以长度来确定。获得TB染色的软骨切片的光密度(OD)作为平均灰度值(MGV)(灰度值总和/像素的数目)并作为蛋白聚糖(PG)含量的指数。整合的灰阶密度(IGD)被计算为MGV×切片的区域面积。虽然所使用的灰阶系统并不是相对于已知PG含量的TB染色切片独立地加以校准，但在相同切片机上切割的所有组织学切片具有相同厚度并作为一组加以处理，其中使用相同的染色方案。因而在软骨染色方面的差异是相对的而非绝对的。在处死的1小时内除去来自所有关节的完整的髌骨并在拓扑生物力学压印研究以前立即冷冻和存储以确定关节软骨的刚度和相位滞后(Appleyard et al.，2003)。

用来确定BTM对照12周后在治疗结果(HA与HA+MPC)或治疗与未治疗方面的差异的统计分析，如通过形态和组织学评分系统所评估的，是利用Kruskal-Wallis非参数分析来进行的，并且对于组比较之间的差异则是利用Mann Whitney U非参数分析来进行，其中p＜0.05被认为是显著的。

通过数字化组织学切片的组织形态测量分析产生的数据利用等方差双尾学生T检验进行评估，其中p＜0.05被认为是显著的。利用独立的T检验来计算相对于不同治疗和BTM后时间之间的髌骨软骨生物力学参数的统计分析，其中p＜0.05被认为是显著的。

结果

在来自BTM后12周的未治疗的母羊的关节中软骨侵蚀和骨赘形成的总的形态评估证实了，与进行相同外科手术的半月板切除术的阉割雄性相比，OA的这种模型表示这种疾病的更加侵袭性和严重的形式。对于这种未治疗的雌性对照组，相对于用来评估该参数的最高评分，股骨的平均软骨形态评分为87％而对于胫骨则为75％。来自经受相同外科手术的半月板切除术后未治疗12周的阉割雄性的关节的总的形态学评分显著小于切除卵巢的母羊(图16和图17)，此发现与利用双侧侧向半月板切除术的先前的观测结果一致(Parker et al.，2003；Cake et al.，2004)。

虽然与半月板切除术后未治疗12周的母羊基线(数据未示出)相比，在24和36周，两种治疗均导致更低的平均股骨形态软骨评分，但在MPC和HA治疗关节之间并没有检测到显著差异。我们认为，这意味着在严重OA的这种模型中，总的形态病变(侵蚀和骨赘评分)的严重性使这些参数太不敏感以致不能检测治疗性差异。

发现来自BTM后未治疗12周组的软骨的改进Mankin组织病理学评分与软骨损伤的程度(如形态评估的)一致(图16和图17)。与形态参数相反，在36周，在切除卵巢的母羊(其接受MPC+HA)中股骨软骨的总平均改进的Mankin评分低于仅接受HA的关节的相应评分并且与仅单独HA相比，对于蛋白聚糖的更强区间甲苯胺蓝(IT TB)染色显示显著更低的细胞数(p＝0.01)和趋势(p＝0.06)(图18)。对于胫骨软骨来说，这些效应不太明显(图18)。

当确定两种关节内治疗的平均总改进的Mankin评分的比率时，相对于注射HA的关节，在半月板切除术后36周，针对MPC+HA注射所观测到的更低改进的Mankin组织病理学软骨评分是突出的(图19)。因为每个比率获自相同动物的两种治疗的关节，所以比率＝1将表明两种治疗是同样有效的。然而，对于比率＞1，可以说MPC+HA治疗更有利。如从图19可以明显看到的，在BTM后36周，针对股骨软骨获得的比率的平均值比整体(unity)显著更高(1.71)，虽然两种治疗的胫骨软骨比率(1.12)仅稍微有利于MPC+HA注射组(图19)。

接着我们检查了随时间治疗对Mankin评分的影响。发现，在半月板切除术后24和36周，即注射后12和24周，在MPC+HA与仅HA治疗方式(arms)之间，在随时间对股骨软骨的影响方面存在显著差异(图20)。在接受MPC+HA的组中，在24和36周的平均评分逐渐低于在12周的基线。这是由于降低的评分和在24周细胞克隆的改善(P＝0.01)，以及在36周细胞数(P＝0.04)和蛋白聚糖(PG)的区间甲苯胺蓝染色(P＝0.04)的改善，其是相对于12周未治疗组(图20)。在仅HA组，没有观测到这样的改善。对于任何组或关节内治疗，在滑膜病理评分之间没有观测到显著差异。

在BTM后36周，利用分析的组织形态测量方法，作为来自注射关节的股骨髁的3个区(内、中以及外)的PG含量的指数，TB染色的软骨厚度、面积以及强度的分析示在图21中。到BTM后36周时，治疗组之间的显著差异是明显的。与HA注射关节的相应软骨相比，来自MPC+HA注射关节的股骨软骨显著更厚(图21A)并占据显著更大的面积(图21B)。来自MPC+HA注射关节的股骨软骨的更大体积伴随更高含量的蛋白聚糖，如由TB染色切片的整合的灰度密度所确定的(图21C)。

用基于时间的分析再次比较这些参数，发现，在半月板切除术后24和36周，即注射后12和24周，在MPC+HA与仅HA治疗方式之间，在随时间对股骨软骨的影响方面的显著差异。利用相同的组织形态测量方法，我们能够证明，与仅HA相比，半月板切除术后12周给予的MPC+HA注射导致12和24周以后(即，在BTM后24和36周)逐步更大的富蛋白聚糖的股骨软骨生长或再生(图22至图24)。因此，与在半月板切除术后12周未治疗关节的基线值相比，在BTM后24和36周，来自在12周注射有MPC+HA的半月板切除术母羊的关节的股骨软骨显著更厚(图22)，并且通常具有更大的面积(图23)。从来自HA注射关节的股骨软骨的切片扫描的相应区未能证明相对于12周未治疗对照的统计显著的变化(图22和图23)。相对于来自BTM后未治疗12周组的关节的相同软骨区，对于HA和MPC+HA注射关节来说，作为股骨软骨切片的PG含量的度量的整合灰阶密度显著更高，但MPC+HA诱导变化的大小显著大于单独的HA(图24)。而与基线相比，在36周，MPC+HA组发展几乎60％更大的富蛋白聚糖股骨组织(P＜0.001)，并且软骨生长的这种速率还没有达到稳定期(plateau phase)，仅HA组已达到稳定期并且发展仅约30％更大的组织。这表明，相对于单独HA治疗的基线和任何时间效应，在随后的24周期间(即，软骨的生长和/或再生)，用MPC+HA进行的治疗会刺激富蛋白聚糖的软骨的显著更大的增加。

对来自注射关节的髌骨软骨的压印研究的结果未能说明对于两种治疗的软骨生物力学性能的任何差异，但相对于半月板切除术后流逝的时间和BTM后未治疗12周组确定了变化。在半月板切除术后24周，来自MPC+HA的髌骨软骨的刚度显著高于12周(P＝0.05)和36周(P＜0.01)(数据未示出)。然而，与还低于未治疗12周对照(P＝0.01)的24周(P＝0.001)相比，在36周两种治疗均产生更厚的髌骨软骨。在24和36周，对于两个治疗组来说，髌骨软骨相位滞后均高于未治疗12周对照(P＝0.001)(数据未示出)。

讨论

本研究已表明，在切除卵巢的母羊中双侧内侧半月板切除术会在3个月以后诱导关节关节软骨的病理变化，其与发展的和严重的OA是一致的。因此，对于股骨和胫骨软骨的总的形态学评分是最高评分的87-70％。有趣的是，与针对切除卵巢的雌性所观测到的相比，经受相同外科手术并在相同时间(12周)被处死的阉割雄性显示更小严重的软骨病变。软骨病理特征的程度还反映在针对该组所观测到的较高的总计的改进Mankin组织病理学评分中，其与早期OA的赋值(分配)是一致的(Little et al.，1997)。虽然先前的研究已确定了在绝经后雌性中OA的强关联，其是通过雌激素从循环的消耗加以解释(Roos et al.，2001；Pelletier et al.，2007以及Nevitt etal.，1996)并得到对切除卵巢的母羊的研究的支持(Parker et al.，2003以及Cake et al.，2004)，但其它更为最近的研究表明，脂肪衍生激素、瘦素在介导软骨破裂和OA中可以起更重要的作用(Dumond etal，2003以及Teichtahl et al.，2005)。因此BTM后3个月期间被作为起点来评价在给予这些药剂以后12和24周，关节内注射HA或MPC+HA对软骨病理特征的进展速率的相对效应。

该研究的结果表明，将分散在2mL HA和2mL

(一种商用冷冻保护剂)中的100兆MPC单次关节内注射到具有确立的严重的OA的关节中，可以在24周的干预期间减慢关节病理特征的进展以及增强富蛋白聚糖的软骨的生长和/或再生到比2mLHA的单次注射更大的程度。令人惊讶地，观测到由MPC介导的生长/再生和软骨保护效应，在大多数检查的参数中，在给予后的24周比给予后的12周更显著，这表明发展的效应，其还没有达到稳定期。该发现的原因目前是不清楚的，然而，可能的是，生长因子如TGF-β超家族的成员，例如由MPC释放的BMP(Ahrens et al.，1993；Aggarwal et al.，2005)支持软骨的合成代谢(补偿)相，以致改变了通过内侧半月板切除术并通过关节施加的机械应力。这种观点得到组织形态测量数据的支持，其证明了，与在BTM后12周开始治疗时相比，在MPC注射组中存在蛋白聚糖的更大容积和更强烈染色。这些基质变化与增加的软骨细胞生物合成一致。显著地，通常发现合成代谢参数的大小在接受MPC+HA的动物的软骨中比在仅接受HA的动物的软骨中更大。MPC保护并且甚至增强这种软骨对机械超载的反应的能力与对由OA的许多传统治疗(包括许多类固醇和非甾体抗炎药(NSAID))所介导的对软骨细胞代谢的已知的抑制效应形成对比(McKenzie et al.，1976；Ghosh，1988；Brandt，1993 and 1993a；Huskisson et al.，1995)。

多次关节内HA注射已用作一种用于管理膝OA多于30年的疗法。虽然共识是这种形式的治疗能提供临床症状缓解，但最近的综述和发表的HA临床试验的元分析已质疑该结论的有效性，其是基于与关节内注射相关的更强的安慰剂效应、盲研究者的困难以及出版偏见(Brandt et al.，2000；Lo et al.，2003)。关节内HA是否呈现任何软骨保护或软骨再生活性还是有争议的。然而，广泛的动物研究已表明，在由单侧和双侧半月板切除术以及在狗中前交叉韧带横切诱导的OA的兔和绵羊模型中HA确实呈现镇痛、抗炎以及疾病改善效应。已综述了这些数据以及基于用不同分子量的HA进行的临床前和实验室临床研究(Ghosh et al.，2002)。

在本研究中，仅评估了HA的单次关节内注射(单独或连同MPC一起)。基于我们自己的数据，我们的结论是，由MPC+HA组合提供的长期生长和再生、以及软骨保护效应是由MPC介导的。在这方面，重要的是应当注意，本研究的设计便于每只动物作为它本身的对照，因为一个关节接受HA而对侧关节接受相同量在冷冻保护剂，

中的HA加MPC。因为两个膝关节在本研究中均被手术去稳定并且在相同时间被注射，所以我们确信：作用于关节软骨的负重机械应力的大小和特性对于两个关节是相同的。

根据本研究，我们的结论是，将MPC+HA单次关节内给予患有预先存在的严重OA的绵羊关节会导致富蛋白聚糖的软骨的生长或再生，如相对于治疗前基线和相对于HA注射对照，在治疗后24周增加的软骨细胞外基质所表明的。

实施例4：利用免疫选择的MPC进行的绵羊盘再生研究

方法

36只年龄匹配的美利奴阉羊(大约18至24月龄)用于本研究。在所有36只羊中，三个邻近的腰椎盘(L3-L4、L4-L5、L5-L6)注射有在大约0.1ml无菌生理盐水中的1.0 IU软骨素酶(chondroitinase)ABC(Seikagaku Corporation，日本)，以分解和除去NP的PG。剩余的腰椎盘(L1-L2和L2-L3)并不注射有软骨素酶ABC并用作对照。在给予软骨素酶ABC以后15周(±3周)，将与相等容积的透明质酸(

(Ferring Pharmaceuticals))混合的在ProFreezeTM Freezing Medium(NAO)或仅ProFreezeTMNAO(Lonza Walkersville Ltd.)中的注射液MPC(0.5×10⁶个细胞直接给予到椎间盘的软骨素酶ABC治疗的髓核中，其示意性地确定在图25中。在3个和6个月以后处死各实验组，如在表1中总结的。

表1.研究设计总结

组

编号

盘

15±3周前基线

第0天基线

处死

在处死时的分析

1

n＝6

L1-L2

没有注射

没有注射

3个月

成分/组织学

L2-L3

没有注射

没有注射

3个月

成分/组织学

L3-L4

软骨素酶

MPC 0.5×106

3个月

成分/组织学

L4-L5

软骨素酶

没有注射

3个月

成分/组织学

L5-L6

软骨素酶

HA和NAO

3个月

成分/组织学

2

n＝6

L1-L2

没有注射

没有注射

6个月

成分/组织学

L2-L3

没有注射

没有注射

6个月

成分/组织学

L3-L4

软骨素酶

MPC 0.5×106

6个月

成分/组织学

L4-L5

软骨素酶

没有注射

6个月

成分/组织学

L5-L6

软骨素酶

HA和NAO

6个月

成分/组织学

动物具有侧平(清晰)X光照片(射线照片)，其是在诱导麻醉下并在以下时间点获自腰脊柱：第0天(注射软骨素酶ABC(Seikagaku Corporation，日本))，测试制品(test article)给予日(在诱导腰椎盘变性以后15±3周)，以及在注入测试制品以后3个月和6个月。利用椎间高度指数(DHI)来评价X光照片，其中椎间高度指数通过如下来计算：平均来自IVD的前、中以及后部分的测量结果，然后除以邻近椎间体高度的平均值，如由(Masuda et al.，2004)所描述的。

MRI是在诱导麻醉下并在以下时间点获自腰脊柱：第0天(注射软骨素酶ABC[Seikagu Corp Japan])，测试制品给予日(在诱导腰椎盘变性以后15+3周)，在注入测试制品以后3个月和6个月。根据MRI扫描并利用Pfirrmann分类系统(Pfirrmann et al.，2001)对腰椎盘进行分级。

用于组织化学和生化分析的脊柱运动节段(区段)(Spinalmotion segments)通过利用骨锯切割靠近软骨终板的颅和尾椎体加以分离。将这些脊柱切片全部固定在中56小时并在5％中性缓冲福尔马林中的10％甲酸的一些变化中脱钙两周并不断搅拌直到利用Faxitron HP43855A X射线小室(Hewlett Packard，McMinnville，USA)证实了完全脱钙。

通过标准组织学方法并借助于梯度乙醇溶液(graded ethanolsolutions)使脱钙样品的多个矢状片(sagittal slices)(大约5mm厚)脱水并包埋在石蜡中。将4μm厚的石蜡切片封固在Superfrost Plus显微镜盖玻片(Menzel-Glaser)上，在85℃下干燥30分钟，然后在55℃下过夜。然后在二甲苯(4次变化×2分钟)中对切片进行去石蜡化并通过梯度乙醇洗涤(100-70％v/v)至自来水加以再水化。用苏木精和伊红对来自由矢状片制备的所有块的一个切片进行染色。由独立的组织病理学家检查编码的切片，其中组织病理学家比较仅经受酶注射那些水平与被酶注射并随后接受MPC的那些水平的组织学特性。四点半定量分级系统用来评估整个盘的微观特征，如表2所示。还制备了包括阿辛蓝(用于一般的糖胺聚糖物质)和番红O(专用于硫酸软骨素物质)的另外的染色剂，以说明盘基质合成的程度。

还利用Sequenza盒和一次性Coverplate免疫染色系统来进行免疫组织化学程序，如先前描述的(Melrose et al.，2003；Melrose et al.，2002；Melrose et al.，2000；Melrose et al.，2002a；Melrose et al.，1998；Panjabi et al.，1985；Race et al.，2000；Smit，2002)。通过用3％H₂O₂温育组织切片来最初阻断内源性过氧化物酶活性。然后用在20mMTris-乙酸盐缓冲液pH 8.0中的软骨素酶ABC(0.25U/ml)在37℃下1小时、在磷酸盐缓冲液pH 5.0中的牛睾丸透明质酸酶1000U/ml在37℃下1小时的组合来对它们进行预消化，接着在室温下在20mM Tris-HCl pH 7.2 0.5M NaCl(TBS)或蛋白酶K(DAKO S3020)中三次洗涤6分钟，以暴露抗原表位。然后在20％正常猪血清中封闭组织1小时，并用大量一抗探测较大和较小的蛋白聚糖和胶原(表3)。还处理阴性对照切片，其中省去一抗或用不相关的同型匹配的一抗代替感兴趣的真实的一抗。商用(DAKO)同型匹配的小鼠IgG(DAKO Code X931)或IgM(DAKO Code X942)对照抗体(适当时)用于该步骤。DAKO产物X931和X942是小鼠单克隆IgG₁(克隆DAK-GO1)和单克隆IgM(克隆DAK-GO8)抗体，其指向(靶向)黑曲霉葡糖氧化酶，一种在哺乳动物组织中既不存在或也不是可诱导的酶。辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶轭合二抗用于检测，其中使用0.05％的3，3′-二氨基联苯胺二盐酸盐和0.03％的H₂O₂(在TBS中)、Nova RED、氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/碘硝基四唑紫(NBT/BCIP/INT)或新品红作为底物。借助于明视场显微镜来检查染色的载玻片并利用Leica MPS 60照相显微镜数码相机系统加以拍照。

表2：在下腰椎间盘(BEP骨终板、CEP软骨终板)中组织学变化的分级系统

等级	环形纤维化	髓核	软骨终板	边缘/软骨下骨
					1	完整的薄片窄层间基质完整的附着环(annulusattachment)管，仅在外侧1/3	均匀性缺乏沟裂(裂缝)	均匀厚度完整附着于骨均匀钙化＜深度的1/5均匀细胞分布	BEP的均匀厚度仅板层骨(lamellar bone)与CEP的不同的接合处很少血管入侵到CEP
2	小型层分裂和组织破坏。基质的轻微扩大。附件的轻微组织破坏。Rim病变而没有修复反应	小型沟裂次要的细胞坏死环轻微后位移轻微软骨形成	轻微软骨变薄小横向裂缝钙化区的不规则增厚很少入侵血管通道小软骨	稍微不均匀的BEP施莫尔结BEP的最小重塑小边缘骨赘
					3	基质的中等扩大，附件的中等开裂，扩散撕裂未涉及外侧1/3最小软骨样化生，囊性变性管在外测和中间1/3rim病变具有轻微修复反应	中等沟裂中等细胞坏死囊性变性环内后移胶原的向心延伸中等软骨形成	显著的软骨变薄钙化区的显著增厚许多横向裂缝许多血管通道许多软骨	中等不均匀的BEP血管化的施莫尔结中等小梁增厚骨片层中的缺陷在骨髓空间中最少的纤维化组织中型骨赘
4	广泛的层状组织破坏扩散撕裂延伸到外侧1/3广泛的软骨样化生在所有区中的管Rim病变并具有显著的修复反应	核的完全丧失松散体(浮软骨)形成显著的软骨形成	软骨的完全丧失剩余软骨的钙化广泛的开裂	显著不均匀的BEP骨化的施莫尔结较大的骨赘显著的小梁增厚骨髓空间的显著纤维化软骨形成

表3.对于蛋白聚糖和胶原核心蛋白质表位的一抗

纤维环和髓核的样品解剖自经处理的精细切成的块并且将已知湿重的组织区的代表性部分冷冻干燥至恒重。在110℃下，将一式三份(1-2mg)的干燥组织在6M HCl中水解16小时，然后测定等分部分的中和消化物的羟脯氨酸，作为组织胶原含量的度量(Sakai et al.，2005)。还用木瓜蛋白酶消化一式三份的干燥组织(约2mg)，然后利用异染性染料1，9-二甲基亚甲蓝来测定等分部分的可溶性组织的硫酸化糖胺聚糖，作为PG的度量(Sakai et al.，2005)。

运动节段被包裹在盐水浸泡纱布中，用双厚度聚乙烯袋密封，并在-30℃下冷冻直到进行生物力学测试。这种治疗未显示出改变了组织的生物力学特性(Panjabi et al.，1985)。进行生物力学测试，以在接近生理负荷的规定的计算机控制的条件下测量每个盘在轴向压缩、挠曲、延伸、侧向弯曲以及轴向扭转时的刚度(Panjabi etal.，985；Race et al.，2000；Smit，2002；Wilke et al.，1999)。测试方案的全部细节在别处证明(Panjabi et al.，1985；Race et al.，2000；Smit，2002；Wilke et al.，1999)。用于测试的试样(功能脊柱单位，FSU)包括两个邻近的椎骨、中介盘(介入盘，intervening disc)以及伴随的韧带。测试了三个FSU/脊椎：仅单独用C-ABC降解的水平，其中盘用C-ABC降解并且其随后仅用透明质酸治疗的水平，以及中心水平，其用C-ABC降解并且其随后用透明质酸和用MPC加以治疗。每个FSU被封固在两个铝合金杯中并用三个螺栓和冷固化聚甲基丙烯酸甲酯牙粘固粉加以固定(Vertex SC Self Curing，Dentimex BV，Zeist，荷兰)。要小心以确保水平定位椎间盘的中线。通过使销子(壳板钉)通过椎管而进入杯之一的孔中，而使运动节段位于杯的中心。所有测试在保持在37℃的盐水浴中进行。在开始测试以前，每个FSU将被预加载至0.5MPa的应力，直至达到水化的重现状态。这被用作在每个测试以前的基线。0.5MPa的预加载应力模拟放松站立并且是基于椎间盘内压力的体内测量结果。

利用Model 8511动态伺服液压材料试验机(INSTRON Pty Ltd，High Wycombe，UK)进行机械试验，上述试验机装备有‘6个自由度’的测力传感器(测压仪)以便于同时监测和控制在所有三个平面中的力。该试验机通过个人计算机和定制设计的软件加以控制，其中上述软件还记录和分析数据。在轴向负荷或扭转控制的最后5个正弦0.1Hz加载循环的稳定滞后中获得测试数据。进行的测试是纯轴向压缩、左和右侧向弯曲、组合挠曲/延伸以及纯轴向扭转。

在FSU中借助于很少或没有弯曲或挠曲(伴随载荷)产生纯轴向压缩至200N。利用在颅杯表面上的点接触进行所有压缩试验。弯曲的中性轴(NAB)通过铝合金杯(其保持试样以实现微不足道的弯曲)上的点将循环荷载施加至关节来确定。这种试错(尝试错误)方法使得可以尽可能接近纯轴向压缩，其中使用刚性点负载接触。尽管在试样之间存在轻微可变性，但发现该点是在矢状面上，大约在椎管以前10mm，但稍微在盘心的后面。将标记置于NAB前后10mm并且置于NAB左右，以定位用于弯曲测试的偏移负载(偏置负荷)。将200N的最大压缩负荷施加于每点以产生2Nm的弯曲和200N的轴向压缩。

选择保守的弯曲和压缩载荷以确保盘、后元件(posteriorelements)、终板以及其它韧带结构不会受到损伤。利用这种加载方法不会产生纯弯曲。相反，弯曲和轴向压缩的组合用于组合挠曲/延伸和侧向弯曲测试。我们认为，这被证明是正确的，因为体内加载将很少产生纯弯曲而是压缩和弯曲的组合。在任何一种载荷(加载)情况下，所有载荷被一致地施加于每个试样，从而便于直接比较力学响应。

对于扭转试验，将施加5Nm的纯轴向扭转。这是在其它研究中施加的和估计的扭矩的生理范围内。一种新的专门设计的扭转测试系统将用来对每个FSU施加纯扭转。该系统使用滚珠丝杆/止推板机构以将Instron致动器的轴向位移转换成纯旋转。X-Y定向表(bearing table)确保在测试期间FSU并不具有对它施加的旋转的固定中心。这是重要的，因为在轴向旋转期间旋转中心并不是恒定的。下杯被固定至扭矩传感器，而上杯则被固定至X-Y定向表和滚珠丝杆/止推板机构。

最初用完整的FSU进行所有测试。在完成以后，通过切割通过后元件(利用较小的弓锯条，其通过神经孔)和向后切割来分离盘。该切割通过关节突间关节以及棘突间和棘突上韧带，留下完整的椎间盘、后和前纵韧带。这种切割以向后增加的楔形方式进行，以确保在关节突关节之间没有接触。然后用分离的盘进行所有测试。

数据分析包括参数如在第五个加载周期期间线性区中的刚度、滞后和应变能以及中性区的范围。来自对照水平的数据与变性/MPC注射的水平相比较，并且对每个生物力学参数进行方差的重复度量分析。

结果

在MPC注射组中的所有动物保持正常体重并且在实验期间没有显示不良副作用的证据。

在软骨素酶ABC注射盘中，这种酶对PG的消耗导致在3个月以后在所有注射盘中盘高度指数(DHI)38％的减小。盘高度的这种丧失证实了在治疗以前髓核的变性状态并且迄今为止被称作MPC前DHI。相对于MPC前DHI，HA或MPC+HA注射到变性盘中以后三个月没有产生DHI的任何显著的增加(图26)。然而，到治疗后6个月时，相对于相应的3个月评分，注射有MPC+HA的盘显示DHI的52％的平均增加(第1组)(图26和表4)。相反，仅注射有HA的盘在相同时期仅显示23.1％的DHI评分的平均改善(图26和表4)。显著地，较低MPC+HA注射盘的平均DHI在治疗后6个月类似于非软骨素酶ABC注射(即，非变性)对照盘的DHA评分(图26)。

HA或MPC+HA注射后6个月与3个月的DHI的统计分析示在表4中。

在本实验中，将绵羊MPC连同适宜的载体，如高分子量透明质酸(HA)给予到实验产生的变性IVD的髓核中已显示可以加速盘细胞外基质的再生，如通过盘高度的恢复放射影像上评估的。这种解释是基于以下假设：在加载脊柱中，盘高度通过在NP和内环内存在高浓度的基质蛋白聚糖来保持，基质蛋白聚糖连同它们结合的水分子一起为这种结构赋予高膨胀压力。确实，在这些实验开始时，软骨素酶ABC用来诱导盘变性是依赖于这种酶从NP细胞外基质降解和除去大多数蛋白聚糖的能力。

迄今为止获得的数据表明，由MPC介导的治疗效果是相对缓慢的过程。在本研究中，0.5×10⁶MPC的剂量是特别有效的。

虽然本实验在MPC被注入到盘中以后6个月被终止，但发现针对低剂量MPC注射获得的盘高度恢复的水平接近于针对非软骨素酶ABC注射的内部对照所观察到的值，这表明在该期间达到了最大程度的NP重建。

本领域技术人员将明了，在不偏离如广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对本发明进行许多变化和/或改进，如在具体实施方式中所示。因此，本发明的实施方式是说明性的而不是限制性的。

本文讨论和/或提及的所有出版物均全部结合于本文。

包括在本说明书中的文献、法令、材料、装置、制品等的任何讨论仅用于提供本发明的范围。不应视为承认，任何或所有这些内容构成现有技术基础的一部分或是与本发明有关的领域中的常见的一般知识，因为它存在于本申请的每项权利要求的优先权日期以前。

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Zannettino et al.(1998)Blood 92：2613-2628.

Claims (14)

1.STRO-1⁺MPC和/或其后代细胞和/或来自其的可溶性因子在制备用于在受治疗者中治疗和/或预防由结缔组织的退变和/或炎症所引起的疾病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述结缔组织富含蛋白聚糖。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的应用，其中，所述结缔组织是软骨。

4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述疾病在所述软骨中导致一种或多种缺陷。

5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述MPC和/或后代细胞和/或可溶性因子并不直接被给予到软骨缺陷内。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的应用，其中，所述MPC和/或后代细胞和/或可溶性因子被给予关节间隙。

7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述关节间隙在膝关节、髋关节、踝关节、肩关节、肘关节、腕关节、手或手指关节或足关节、或椎间盘关节中。

8.根据权利要求6或权利要求7所述的应用，其中，所述MPC和/或后代细胞和/或可溶性因子被通过关节内注射给予。

9.根据权利要求3所述的应用，其中，所述软骨是透明软骨。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的应用，其中，所述疾病是腱炎、背部疼痛、肩部回旋肌腱退变、腕管综合症、DeQuervain综合症、退变性颈椎间盘和/或腰椎间盘、交叉综合症、反射性交感营养不良综合症(RSDS)、狭窄性腱鞘炎、上髁炎、腱鞘炎、胸廓出口综合症、尺神经压迫性损害、桡管综合症、重复性压迫损伤(RSI)、骨关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、血清反应阴性关节炎、与炎性肠病或强直性脊柱炎相关的关节炎以及变性椎间盘疾病。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的应用，所述药物进一步包括透明质酸(HA)。

12.一种组合物，包括：

i)上清液、或一种或多种可溶性因子，来自STRO-1⁺间充质前体细胞(MPC)和/或其后代细胞，以及

ii)透明质酸。

13.一种组合物，包括：

i)STRO-1⁺间充质前体细胞(MPC)和/或其后代细胞，以及

ii)透明质酸。

14.来自STRO-1⁺间充质前体细胞(MPC)和/或其后代细胞的上清液、或一种或多种可溶性因子在制备用于在受治疗者中生成、修复和/或维护结缔组织的药物中的应用。

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