KR101748712B1 - 호흡기 질환의 치료 또는 예방 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 STRO-1⁺ 세포가 증가된(enriched) 세포 집단(population) 및/또는 그 자손 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자를 치료대상에 투여하는 단계를 포함하는, 호흡기 질환의 치료 또는 예방 및/또는 IgE-매개 알러지의 치료 및/또는 알레르겐에 대한 알러지 반응의 감소 및/또는 알레르겐에 대한 아네르기(anergy) 유도 및/또는 알러지로 고통받는 환자의 폐 기능 증진 방법을 제공한다.

Description

호흡기 질환의 치료 또는 예방 방법{Methods of treating or preventing respiratory conditions}

우선권 세부 사항

본 출원은 2012년 12월 12일에 출원된 "호흡기 질환의 치료 또는 예방방법(Methods of treating or preventing respiratory conditions)"이라는 제목의 미국 특허 출원 No. 61/736352에서 우선권을 주장하며, 그 전체 내용이 본원에 참고로 인용된다.

본 발명은 호흡기 질환, 예를 들어 IgE-매개 알러지성 호흡기 질환의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.

호흡기 질환은 상부기도, 기관, 기관지, 세기관지, 폐포, 흉막 및 흉강을 포함하는 기체 교환에 관여하는 기관과 조직 그리고 호흡 신경 및 근육에 영향을 주는 병리적 상태를 포함하는 것으로 알려져 있다. 만성 호흡기 질환은 전세계적으로 대략 7%의 사망을 야기하고 세계 질병 부담의 4%를 나타낸다. US에서만, 만성 호흡기 질환의 비용은 직접 및 간접 비용을 포함해서 매년 US 1540억 달러가 추정이 된다. 호흡기 질환은 다음을 포함하는 몇 가지 종류로 나눌 수 있다:

·환자의 폐 내에서 호중구 및/또는 염증성 사이토카인의 수준이 증가되는 것이 특징인, 천식, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 폐기종(emphysema), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary) 또는 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome)과 같은 염증성 폐질환;

·기도 부피(airway volume) 또는 자유 기체 흐름(free gas flow)의 장애의 감소가 특징인, 만성 폐쇄성 폐질환 및 천식과 같은 폐쇄성 폐질환; 및

·불완전한 폐 확장 및/또는 증가된 폐 강직(lung stiffness)을 야기하는 폐탄성(lung compliance)의 손실이 특징인, 유아 호흡 곤란 증후군(infant respiratory distress syndrome)과 같은 제한성 폐질환(또한 간질성 폐질환(interstitial lung diseases)이라고도 함).

천식은 다양한 재발성 증상, 가역적 기도 폐쇄, 기도(예를 들어 기관지) 과민반응 및 기저 염증을 특징으로 하는 일반적인 만성 호흡기 질환이다. 천식의 급성 증상은 기침, 천명(wheezing), 숨이참(shortness of breath) 및 야간 각성(nocturnal awakening)을 포함한다. 이러한 증상들은 보통 기관지경련(bronchospasm)에서 발생하고 기관지 확장 치료를 필요로 하고 반응한다. 천식의 병리생리학의 중심에는 비만 세포, 호산구, T 림프구, 대식 세포, 수지상 세포 및 호중구를 포함하는 다양한 세포의 동원(recruitment) 및 활성화에 의해 매개되는 기저 기도 염증에 있다. 기도 과민반응(airway hyperresponsiveness)에 영향을 미치는 메카니즘은 다양하고, 염증, 기능장애성 신경조절(dysfunctional neuroregulation) 및 기도 개형(airway remodeling)을 포함한다. 기도 개형은 하부 기저막(sub-basement membrane)의 비후(thickening), 상피하부 섬유증(subepithelial fibrosis), 기도 평활근 비대(hypertrophy) 및 과형성(hyperplasia), 현재의 치료법으로 완전히 가역적으로 예방되지 않는 기류 폐쇄가 증가한 기도에서 영구적인 변화의 결과로 이어지는 혈관 증식 및 팽창을 포함하는 구조적인 변화와 연관된다.

천식에 대한 현재의 표준 치료는 코르티코스테로이드(corticosteroids) 및 β2-아고니스트(agonists)(항염증제 및 기관지 확장제(bronchodilator) 약물)의 조합이다. 이 약물들은 많은 천식성 질환의 허용가능한 조절을 제공한다. 그러나, 천식 환자의 5 내지 10%가 코르티코스테로이드 및 β2-아고니스트의 복합 치료에도 불구하고 증후성 질환(symptomatic condition)을 가지는 것으로 추정된다(Chanez et al, J Allergy Clin Immunol 119:1337-1348(2007)).

만성 폐쇄성 폐질환(COPD)은 상당한 발병률 및 사망률과 관련된 가장 흔한 만성 폐질환이다. 미국에서, COPD는 사망의 네 번째 주요 원인이고, 연간 의료 비용에서 300억 달러 이상을 차지한다. 약 1600만으로 추정되는 성인이 COPD에 걸리고, 매 해 약 120,000의 미국인들이 상기 질환으로 죽는다. COPD는 기류 폐쇄를 측정하여(예측치 FEV1/FVC <70% 및 FEVi <80%), 기도(airway)/폐포(alveolar)/전신성(systemic) 염증을 특징으로 하는 만성 질환으로 정의되고, 기관지 확장제 치료로 부분적으로 개선된다. 폐 세포에 의한 염증성 매개체의 국소적 및 전신적 방출은 기도 질환(만성 폐쇄성 기관지염)을 야기하고, 소수의 환자에게서는 실질 조직(parenchymal tissue)의 파괴(폐기종)를 야기하고, 이 둘은 모두 COPD의 특징인 기류 제한을 초래할 수 있다. 상기 폐 세포에 의한 염증성 매개체의 방출은 또한 관상동맥(coronary), 뇌혈관(cerebrovascular) 및 말초 혈관 질환(peripheral vascular conditions)에서 관찰되는 것과 같이 다른 기관계에서의 염증을 악화시킬 수 있다.

COPD를 치료하는 현재의 치료법은 과확장(hyperinflation)의 감소에 어느 정도 도움이 되는 항콜린제(anticholinergic agents)와 같은 기관지 확장제를 포함하므로 이들은 흡기 용적(inspiratory capacity)을 증가시키고 호흡 곤란을 완화시킨다. 비록 코르티코스테로이드(corticosteroids)는 대부분의 천식의 경우의 효과적인 치료제이지만, COPD에서의 염증성 세포 및 매개체는 COPD에서 제한된 유용성(usefulness)의 약물을 처리하는 전신 또는 흡입용 코르티코스테로이드 치료에 민감하지 않다.

특발성 폐 섬유화증(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)은 일반적으로 40세 이상의 성인에서 발병하는 하부 기도의 만성, 진행성 섬유증 장애이다. IPF는 호중구, 림프구 및 대식 세포의 폐포로의 동원(recruitment)을 야기하는 담배 연기와 같은 환경적 요인에 의한 초기 폐 손상의 결과로 발생하는 것으로 여겨진다. 폐포 상피 세포에 의한 TGF-β와 같은 섬유조직증식성 사이토카인(fibrogenic cytokines)의 방출은 섬유아세포(fibroblast) 증식, 이동 및 섬유증을 야기한다. 상기 섬유아세포들은 호흡 공간(respiratory space)을 채울 뿐만 아니라 실질 개형(parenchymal remodeling)을 야기하는 많은 사이토카인에 대응하는 콜라겐 및 매트릭스 단백질을 분비하기도 한다(Shimizu et al., Am J Respir Crit Care Med 163:210-217(2001)). 상기 섬유아세포의 분화는 IPF의 만성 특성(chronic nature)에 핵심일 것이다. 이는 기침과 진행성 숨이참(shortness of breath)으로 이어진다. IPF 환자는 손상된 폐 기능을 가지고 제한적인 폐의 부피와 용량을 보인다. 비록 코르티코스테로이드(corticosteroids), 면역억제제(immunosupressive agents), 호중구 엘라스타제 억제제(neutrophil elastase inhibitor), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor) 및 인터페론 감마-Ib가 IPF에 대한 치료제로써 제안되었지만, 폐 이식 이외의 생존을 연장시키는 치료는 없고, IPF는 3 내지 6 년의 평균 생존 범위 내에서 치명적인 장애가 남는다. 그래서, IPF 치료의 첫 번째 라인은 아직 정립되지 않았다.

다른 호흡기 질환으로는 폐동맥 고혈압(pulmonary arterial hypertension, PAH), 폐혈관 수축(pulmonary vasoconstriction), 림프관평활근종증(lymphangioleiomyomatosis, LAM), 결절성 경화증(tuberous sclerosis complex, TSC), 급성 호흡 곤란 증후군(Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS) 및 환기 유도 폐 손상(Ventilator Induced Lung Injury, VILI)을 포함하지만 이에 국한되는 것은 아니다.

호흡기 질환이 치료에 제한된 선택이 있는 만연하고 쇠약한 등급의 질환인 것은 본 명세서에서 당업자에게 자명할 것이다. 그래서, 본 발명은 이 질환에 대한 새로운 치료법으로 바람직하다.

본 발명은 천식, 예를 들어 알러지성 천식인 천식과 같은 인간 호흡기 질환의 허용된 동물 모델에서 투여량 의존적으로 기관지 과민반응(bronchial hyperresponsiveness)뿐만 아니라 IgE-매개 알러지성 반응과 같은 T_H2 매개 알러지성 반응(예를 들어 호산구 및/또는 IL-4 수준 및/또는 IgE 수준의 감소)을 감소시킬 수 있는 STRO-1⁺ 세포 제제를 사용하는 것을 보여주고 있다. 본 발명자들은 초기 알러지성 반응이나 말기 알러지성 반응 또는 둘 다를 억제할 수 있음을 확인하였다. 이 투여량 반응성은 STRO-1⁺ 세포 제제가 치료 효과를 제공하는 것이라고 증명한다.

STRO-1⁺ 세포 제제는 추가로 기도 내강(airway lumen) 및 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage fluid)에서 호산구 세포 침윤(infiltration)을 감소시켰고 기관지 폐포 세척액에서 호중구의 숫자를 감소시켰으며, 이러한 제제가 천식같은 염증성 호흡기 질환으로 고통받는 환자의 폐의 염증을 억제하는 능력을 입증한다.

STRO-1⁺ 세포 제제는 처리된 동물에서 알레르겐(allergen)에 특이적인 IgE 수준을 추가로 감소시켰다.

본 발명자는 또한 호중구 및 호염기구의 호흡기관으로의 이동으로 야기된 말기 천식 반응이 STRO-1⁺ 세포 제제를 받은 환자에게서 개선되었다는 것을 관찰하였다. 이 관찰은 STRO-1⁺ 세포 제제가 예를 들어 호중구 및 호염기구로 야기된 염증 및/또는 개형(remodeling)인 호흡기관의 손상을 감소 또는 예방하는데 유용하다는 것을 가리킨다.

본 발명자에 의한 결과는 환자의 호흡기 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 대한 기반을 제공하고, 상기 방법은 환자에게 STRO-1⁺ 세포가 증가된(enriched) 세포 집단(population) 및/또는 그 자손(progeny) 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자(soluble factors)를 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 추가적으로 환자의 IgE-매개 알러지(또는 T_H2 매개 알러지)를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 환자에게 STRO-1⁺ 세포가 증가된 세포 집단 및/또는 그 자손 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자를 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 추가적으로 알레르겐(allergen)에 대한 알러지 반응의 감소 및/또는 알레르겐에 대한 아네르기(anergy) 유도 방법을 제공하고, 상기 방법은 환자에게 STRO-1⁺ 세포가 증가된 세포 집단 및/또는 그 자손 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자를 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 추가적으로 집 먼지 진드기 알레르겐(HDM)에 대한 알러지 반응을 치료 또는 예방 또는 HDM에 대한 알러지 반응을 감소 및/또는 HDM에 대한 아네르기를 유도하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 환자에게 STRO-1⁺ 세포가 증가된 세포 집단 및/또는 그 자손 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자를 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 추가적으로 환자의 폐기능 증진 방법을 제공하고, 상기 방법은 환자에게 STRO-1⁺ 세포가 증가된 세포 집단 및/또는 그 자손 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자를 투여하는 단계를 포함하고, 알러지로 고통받는 환자에 있어서, IgE-매개 알러지 또는 HDM에 대한 알러지 반응이다.

일 실시예에서, 호흡기 질환은 과도한 세포 증식(excessive cell proliferation), 개형(remodeling), 염증(inflammation), 혈관수축(vasoconstriction), 기관지수축(bronchoconstriction), 기도 과반응성(airway hyperreactivity) 및/또는 부종(edema)과 연관되어 있다. 예를 들어, 본 발명은 천식(asthma), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary), 폐동맥 고혈압(pulmonary arterial hypertension); 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome), 환기 유도 폐 손상(ventilator induced lung injury), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 기관지 확장증(ciliary dyskinesia), 알파-1-항트립신 결핍증(alpha-1-antitrypsin deficiency), 비염(rhinitis), 비부비동염(rhino sinusitis), 원발성 섬모 운동이상증(primary ciliary dyskinesia), 폐렴(pneumonia), 기관지염(bronchiolitis) 및 림프관평활근종증(lymphangioleiomyomatosis), 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 폐색성 세기관지염(obliterative bronchiolitis) 또는 폐쇄성 세기관지염(bronchiolitis obliterans), 비특이적 간질성 폐렴(nonspecific interstitial pneumonia), 특발성 기질화 폐렴(cryptogenic organizing pneumonia), 급성 간질성 폐렴(acute interstitial pneumonia), 호흡기 세기관지염 관련 간질성 폐질환(respiratory bronchiolitis-associated interstitial lung disease) 또는 폐유육종증(pulmonary sarcoidosis)을 포함하는 간질성 폐질환(interstitial lung disease)과 같은 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

일 실시예에서, 폐 또는 질환은 급성 폐 손상(acute lung injury)이다. 예를 들어, 급성 폐 손상은 하나 또는 그 이상의 신체적 트라우마(trauma) 및 화학적 화상, 연기 흡입, 또는 독성 물질에의 노출과 같은 화학적 손상이다. 또 다른 실시예에서, 폐질환, 장애 또는 증상은 종양(neoplastic) 또는 부종양성(paraneoplastic) 질환에 의해 야기된 손상이다.

일 실시예에서, 호흡기 질환은 만성이다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법은 초기 또는 말기 또는 둘 모두의 만성 호흡기 질환을 치료하는데 사용할 수 있다.

일 실시예에서, 호흡기 질환은 염증성 호흡기 질환(inflammatory respiratory condition), 폐색성 호흡기 질환(obstructive respiratory condition) 또는 제한성 호흡기 질환(restrictive respiratory condition)이다.

일 실시예에서, 호흡기 질환 또는 알러지는 가역적 기도 폐쇄(reversible airway obstruction)이다.

일 실시예에서, 호흡기 질환 또는 알러지는 COPD, 천식(asthma), 폐색성 세기관지염(obliterative broncholitis) 또는 낭포성 섬유증(cystic fibrosis)과 같은 폐색성 호흡기 질환(obstructive respiratory condition)이다. 일 실시예에서, 호흡기 질환은 천식이다.

일 실시예에서, 호흡기 질환은 제한성 폐질환(restrictive respiratory condition)(예를 들면, 외인성 알러지성 폐포염(extrinsic allergic alveolitis), 섬유성 폐포염(fibrosing alveolitis), 석면증(asbestosis) 또는 호산구성 폐렴(eosinophilic pneumonia)) 또는 제한성 늑막 질환(restrictive pleural condition)(예를 들면, 흄막 삼출증(pleural effusion), 기흉(pneumothorax) 또는 기관지 확장증(bronchiectasis))과 같은 제한성 호흡기 질환이다.

일 실시예에서, 호흡기 질환은 감염 또는 암 때문에 기인하지 않는다.

일 실시예에서, 호흡기 질환은 염증성 질환(inflammatory condition)이다. 예를 들어, 질환은 기도 과반응성(airway hyperreactivity) 및/또는 기관지 과반응성(bronchial hyperreactivity) 및/또는 기도 내강(airway lumen) 및 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage fluid)에서 호산구 세포 침윤(eosinophil cell infiltration)과 연관되어 있다. 이와 관련하여, 일 실시예에서 환자에게 STRO-1⁺ 세포가 증가된 세포 집단 및/또는 그 자손 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자를 투여하는 방법이 기도 과반응성 및/또는 기관지 과반응성 및/또는 기도 내강 및 기관지 폐포 세척액에서 호산구 세포 침윤을 감소시킨다.

일 실시예에서, 질환은 만성 천식(chronic asthma) 또는 급성 천식(acute asthma) 또는 알러지성 천식(allergic asthma)과 같은 천식이다. 예를 들어, 질환은 만성 천식 또는 알러지성 천식이다.

일 실시예에서, 질환은 예를 들어 천식(asthma) 또는 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis)과 같은 폐 섬유증(pulmonary fibrosis)인 폐의 개형(remodeling)과 관련이 있다.

일 실시예에서, 천식은 중증 천식(severe asthma) 및/또는 난치성 천식(refractory asthma)이다.

일 실시예에서, 질환은 스테로이드 난치성 천식(steroid refractory asthma)이다. 예를 들어, 천식으로 고통받는 환자는 예를 들면 플루니솔리드(flunisolide), 모메타손 프로에이트(mometasone furoate), 트리암시놀론(triamcinolone), 플루티카손(fluticasone), 부데소니드(budesonide), 베클로메타손 디프로피오네이트(beclomethasone dipropionate) 같은 코르티코스테로이드와 같은 스테로이드 또는 이들 중 둘 또는 그 이상의 복합 치료에 난치성이다.

또 다른 실시예에서, 질환은 지속성 베타 아고니스트(long acting beta agonist, LABA) 난치성 천식이다. 예를 들어, 천식으로 고통받는 환자는 예를 들면, 살메테롤(salmeterol), 포르모테롤(formoterol), 붐베테롤(bumbeterol) 또는 클렌부테롤(clenbuterol) 같은 지속성 베타 아고니스트로 하는 치료에 난치성이다.

또 다른 실시예에서, 질환은 LABA 및 스테로이드 난치성 천식이다.

일 실시예에서, 방법은 초기 알러지성 반응 또는 천식성 반응을 감소시키거나 예방한다.

또 다른 실시예에서, 방법은 말기 알러지성 반응 또는 천식성 반응을 감소시키거나 예방한다.

일 실시예에서, 질환은 섬유성(fibrotic) 질환이다. 폐의 섬유성 질환은 간질성 폐질환(interstitial lung disease)(분산된 조직실질 폐질환(diffuse parenchymal lung disease))일 수 있다. 또 다른 실시예에서, 간질성 폐질환은 규폐증(silicosis), 석면증(asbestosis), 베릴륨 중독(berylliosis), 경피증(systemic sclerosis), 다발성근염(polymyositis) 또는 피부근염(dermatomyositis)이다. 다른 실시예에서, 간질성 폐질환은 항생제, 화학치료제(chemotherapeutic drug), 항부정맥제(antiarrhythmic drug) 또는 감염에 의해 야기된다.

또 다른 실시예에서, 질환은 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis)이다.

일 실시예에서, 임의의 실시예에서 본원에 기재된 방법은 STRO-1^bright 세포가 증가된 세포 집단 및/또는 그 자손 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자를 투여하는 방법을 포함한다.

일 실시예에서, 임의의 실시예에서 본원에 기재된 방법은 STRO-1⁺ 세포가 증가된 세포 집단 및 조직 비특이적 알카라인 포스페이트⁺(TNAP)⁺ 세포 및/또는 그 자손 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자를 투여하는 방법을 포함한다.

일 실시예에서, 임의의 실시예에서 본원에 기재된 방법은 조직 비특이적 알카라인 포스페이트(nonspecific alkaline phosphate)⁺(TNAP)⁺ 세포가 증가된 세포 집단 및/또는 그 자손 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자를 투여하는 방법을 포함한다. 본원에 도시된 바와 같이, 이러한 세포는 STRO-1⁺, 예를 들어 STRO-1^bright이다. 일 실시예에서, 세포는 STRO-3⁺ 세포가 증가되어 있다.

일 실시예에서, STRO-1⁺ 세포가 증가된 세포 집단 및/또는 그 자손 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자는 전신적으로(systemically) 투여된다.

예를 들어, 집단 및/또는 자손 및/또는 가용 인자는 정맥내로(intravenously) 투여된다.

또 다른 실시예에서, 집단 및/또는 자손 및/또는 가용 인자는 비강내로(intranasally) 또는 흡입(inhalation)에 의해 투여된다.

일 실시예에서, 집단 및/또는 자손 및/또는 가용 인자는 여러 번 투여된다. 이와 관련하여, 본 발명자는 본원에 기재된 세포 집단이 최대 4주 또는 최소 4주동안 치료 효과를 제공할 수 있음을 보여준다. 따라서, 일 실시예에서, 집단 및/또는 자손 및/또는 가용 인자는 매 3주 또는 3주 이상에 한 번 투여된다. 예를 들어, 집단 및/또는 자손 및/또는 가용 인자는 매 4주 또는 4주 이상에 한 번 투여된다. 예를 들어, 집단 및/또는 자손 및/또는 가용 인자는 매 5주 또는 5주 이상에 한 번 투여된다. 예를 들어, 집단 및/또는 자손 및/또는 가용 인자는 매 10주 또는 10주 이상에 한 번 투여된다. 예를 들어, 집단 및/또는 자손 및/또는 가용 인자는 매 12주 또는 12주 이상에 한 번 투여된다.

일 실시예에서, 방법은 다음의 하나 또는 그 이상이 발생할 때 환자 모니터링 및 집단 및/또는 자손 및/또는 가용 인자의 추가 투여량을 투여하는 방법을 포함한다:

(i) 환자가 천명(wheeze) 및/또는 기침 및/또는 가슴 통증(chest tightness) 및/또는 호흡곤란(difficulty breathing)을 지속적으로 시작한다;

(ii) 환자를 폐활량계(spirometer)로 측정했을 때 다음의 하나 또는 그 이상이 나타난다:

a) 최소 2주동안 일주일에 적어도 3일간 20%의 차이;

b) 다음의 치료로 최대 호기량(peak flow)의 20% 이상 향상, 예를 들어:

β-아고니스트(agonist)(예, 살부타몰(salbutamol))를 10분간 흡입; 코르티코스테로이드(corticosteroid)(예, 베클로메타손(beclometasone))를 6주간 흡입; 프레드니솔론(prednisolone) 30 mg 14일 복용,

c) 트리거(trigger)(예, 운동)에 노출된 후 이어지는 최대 호기량에서 20% 이상 감소;

(iii) 비정상 세포 및/또는 외부 물질 및/또는 환자의 기도폐색을 보여주는 기관지 내시경 검사(bronchoscopy); 또는

(iv) 폐 혈관의 이상, 폐에서 혈액이나 유체의 축적, 기관지 확장증(bronchiectasis), 흉막 삼출증(pleural effusion) 또는 폐렴(pneumonia)을 보여주는 흄부 CT 스캔.

일 실시예에서, 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 방법은 다음의 하나 또는 그 이상을 달성하기에 충분한 집단 및/또는 자손 및/또는 가용 인자의 투여량을 투여하는 방법을 포함한다:

(i) 예를 들어 기관지 유발 검사(bronchial challenge test)를 사용하여 측정된, 기관지 과민반응(bronchial hyperresponsiveness)의 개선;

(ii) 기도 과민반응(bronchial hyperresponsiveness)의 개선;

(iii) 폐 또는 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage fluid)의 호산구 침윤(eosinophil infiltration) 감소;

(iv) 폐 또는 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage fluid)의 호중구 침윤(neutrophil infiltration) 감소;

(v) 예를 들어 폐활량계(spirometer)로 측정된, 말기 천식 반응의 감소;

(vi) 예를 들어 폐활량계(spirometer)로 측정된, 초기 천식 반응의 감소; 및/또는

(vii) 흉부 CT 스캔으로 측정된, 폐 개형/섬유증(lung remodeling/fibrosis)의 감소.

일 실시예에서, 투여량은 상기 전술된 적어도 2가지 또는 3가지 또는 4가지 또는 5가지 또는 이 모두를 달성하기에 충분한 투여량이다.

일 실시예에서, 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 방법은 1×10⁶ 에서 150×10⁶ 사이의 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손을 투여하는 단계를 포함한다.

일 실시예에서, 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 방법은 25×10⁶ 에서 150×10⁶ 사이의 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손을 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 방법은 25×10⁶ 또는 75×10⁶ 또는 150×10⁶의 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손을 투여하는 단계를 포함한다.

일 실시예에서, 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 방법은 킬로그램(kg) 당 2.5×10⁴ 에서 4.5×10⁶ 사이의 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손을 투여하는 단계를 포함한다.

일 실시예에서, 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 방법은 킬로그램(kg) 당 4.5×10⁵ 에서 4.5×10⁶ 사이의 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손을 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 방법은 킬로그램(kg) 당 대략 4.5×10⁵ 또는 대략 5.5×10⁶ 또는 대략 1.7×10⁶ 또는 대략 1.9×10⁶ 또는 대략 3.5×10⁶ 또는 대략 4.5×10⁶의 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손을 투여하는 단계를 포함한다.

일 실시예에서, 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 방법은 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자의 전신 투여량을 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 세포 또는 가용 인자가 여러 번 투여되는 경우에, 전신 투여량은 일정하게 남아있다.

예를 들어, 방법은 환자에게 10 mL의 150×10⁶ STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손, 즉 밀리리터(mL)당 1.5×10⁶의 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손을 투여하는 단계를 포함한다.

일 실시예에서, 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 방법은 스테로이드 난치성 천식(steroid refractory asthma) 또는 LABA 난치성 천식 또는 스테로이드 및 LABA 난치성 천식으로 고통받는 환자에게 10 mL의 150×10⁶ STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손, 즉 밀리리터(mL)당 1.5×10⁶의 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손을 투여하는 단계를 포함한다.

일 실시예에서, 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 방법은 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis)으로 고통받는 환자에게 10 mL의 150×10⁶ STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손, 즉 밀리리터(mL)당 1.5×10⁶의 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손을 투여하는 단계를 포함한다.

일 실시예에서, 집단 및/또는 자손 세포는 자가(autogeneic) 또는 타가(allogeneic) 및/또는 상기 가용 인자는 자가(autogeneic) 또는 타가(allogeneic) 세포에서 유래될 수 있다. 일 실시예에서, 집단 및/또는 자손은 타가(allogeneic) 및/또는 가용 인자는 타가(allogeneic) 세포에서 유래된다.

상기 실시예에 따르면, 방법은 추가로 집단 및/또는 자손 세포 및/또는 가용인자의 수득을 포함할 수 있거나 집단 및/또는 자손 세포 및/또는 가용 인자의 분리를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 집단 및/또는 자손 세포는 STRO-1 및/또는 TNAP의 발현을 기반으로 한다.

일 실시예에서, 집단 및/또는 자손 세포 및/또는 가용 인자는 치료되는 환자로부터 수득된다. 또 다른 실시예에서는, 집단 및/또는 자손 세포 및/또는 가용 인자는 동종의 다른 환자로부터 수득된다.

일 실시예에서, STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손 세포가 증가된 집단은 투여 전 및/또는 가용 인자를 수득하기 전에 배양된다.

상기 실시예에 따르면, 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 방법은 추가로 집단 및/또는 자손 세포의 배양을 포함할 수 있다.

일 실시예에서, STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손 세포 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자는 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손 세포 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자 및 담체(carrier) 및/또는 부형제(excipient)를 포함하는 조성물의 형태로 투여된다.

상기 실시예에 따르면, 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 방법은 추가로 집단 및/또는 자손 및/또는 가용 인자의 조성물로의 형성을 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 환자는 치료 시간에 호흡기 질환 또는 이의 악화(예, 천식 발작(asthma attack))로 고통받는다. 예를 들어, 환자는 치료를 필요로 한다.

일 실시예에서, 환자는 호흡기 질환을 가지고 있지만, 호흡기 질환 또는 이의 악화(예, 천식 발작(asthma attack))로 심하게 고통받는 것은 아니다. 즉, 방법은 질환 또는 이의 악화를 예방하는 방법이다.

본 발명은 또한 호흡기 질환의 치료 또는 예방용 STRO-1⁺ 세포가 증가된 세포 집단 및/또는 그 자손 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자를 제공한다.

본 발명은 또한 환자의 호흡기 질환의 치료 또는 예방용 약제의 제조에서 STRO-1⁺ 세포가 증가된 세포 집단 및/또는 그 자손 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 방법에서 용도에 대한 지시사항과 함께 포장된 STRO-1⁺ 세포가 증가된 세포 집단 및/또는 그 자손 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자를 포함하는 키트(kit)를 제공한다.

예를 들어, 본 발명은 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 방법에서 조합의 용도를 지시하는 제품 정보와 함께 포장된 집단 및/또는 자손 및/또는 가용 인자를 포함하는 구성을 포함하는 키트(kit)를 제공한다.

STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손 및/또는 그로부터 분비된 하나 또는 그 이상의 인자가 호흡기 질환, 예를 들어 IgE-매개 알러지성 호흡기 질환을 치료 또는 예방하는 것으로 나타났다.

도 1. 성인 골수 형핵(morphonuclear) 세포(BMMNC)에 의한 TNAP(STRO-3) 및 중간엽 전구체 세포 마커(Mesenchymal Precursor Cell Marker)인 STRO-1^bright의 공동 발현. 듀얼-컬러 면역형광법(dual-color immunofluorescence) 및 유세포분석기(flow cytometry)는 STRO-1 MACS-선택된 BMMNC의 배양 및 FITC(x 축)와 결합된 염소 항뮤린(anti-murine) IgM 항체로 간접적으로 표지하고, STRO-3 mAb(뮤린 IgG1)를 PE(y 축)에 결합된 염소 항뮤린 IgG로 간접적으로 표지함으로써, 수행된다. 점도표 히스토그램(dot plot histogram)은 리스트모드(listmode) 데이터로 수집된 5×10⁴의 이벤트를 표시한다. 수직 및 수평선은 동일한 조건으로 처리된 아이소타입(isotype)이 일치하는 대조군 항체인 1B5(IgG) 및 1A6.12(IgM)로부터 얻어진 평균 형광 1.0% 미만의 반응성 수준으로 설정되었다. 결과는 남아있는 STRO-1⁺ 세포가 STRO-3 mAb와 반응하는데 실패한 반면에 STRO-1^bright 세포의 소수의 집단은 TNAP(1사분면)와 공동 발현됨을 입증한다.
도 2. 염소 항뮤린(anti-murine) IgM 또는 FITC-결합 IgG 이차 항체를 사용하여 감지되는 아이소타입(isotype)(IgM, IgG2a 및 IgG1) 음성 대조군(점선)과 중간엽 줄기 세포 마커(mesenchymal stem cell marker), STRO-1, STRO-4 및 CD146의 양성 세포 표면 발현(실선)에 대하여 사이노몰거스(cynomolgus) MPC 유래인 골수 배양의 단일 세포 현탁액을 사용하여 제조된 대표 유세포 분석기 히스토그램(flow cytometric histograms)을 보여주는 도해적 표현. 대표 히스토그램은 또한 단핵구/대식 세포(CD14), 조혈 줄기/전구 세포(CD34) 및 성숙 백혈구(CD45)의 마커에 대한 세포 표면 발현이 부족한 사이노몰거스 MPC를 보여준다. 아이소타입(isotype) 대조군에 비해 형광 1% 이상의 수준이면 양성을 의미한다.
도 3은 양(sheep)의 천식 모델에 처리한 MPC의 안정성 및 효능을 평가하기 위한 연구의 타임라인(timeline) 개략도이다.
도 4는 식염수 및 MPC 처리군에 대한 연구 과정을 통해 초기 천식성 반응(early-phase asthmatic response, EAR)을 보여주는 도해적 표현의 시리즈이다. 요약 EAR 데이터는 (A) 대조군과 2500만, 7500만 및 1억 5천만 oMPC의 세 가지 처리군을 나타낸다. 상기 데이터는 에어로졸화된(aerosolized) 식염수 대조군 유발 후에 취해진 기준 내성 측정값에서부터 알레르겐 유발 후 처음 한 시간동안 취해진 피크(peak) 내성 측정값까지 내성 변화율을 나타낸다. EAR 측정은 시험 전반에 걸쳐 세 차례 취해졌다: 2주 전 oMPC/식염수 처리(전처리); 1주 후 oMPC/식염수 처리(1주 후 처리); 및 4주 후 oMPC/식염수 처리(4주 후 처리). (B)와 (C)의 데이터는 전처리부터 1주 및 4주, 각각의 처리 후까지의 EAR의 변화율에 대한 대조군과 처리군 사이의 비교를 보여준다. 데이터는 평균±SEM(Mean±SEM)으로 나타난다. 대조군 및 7500만 oMPC군에 대한 N=11; 2500만 및 1억 5천만 oMPC군에 대한 N=10. **p<0.01*p<0.05.
도 5는 식염수 및 MPC 처리군에 대한 연구 과정을 통해 말기 천식성 반응(late phase asthmatic response, LAR)을 보여주는 도해적 표현의 시리즈이다. 요약 LAR 데이터는 (A) 대조군과 2500만, 7500만 및 1억 5천만 oMPC의 세 가지 처리군을 나타낸다. 상기 데이터는 에어로졸화된(aerosolized) 알레르겐 유발 전에 취해진 기준 내성 측정값에서부터 알레르겐 유발 후 6시간동안 취해진 내성 측정값까지 내성 변화율을 나타낸다. LAR 측정은 시험 전반에 걸쳐 세 차례 취해졌다: 2주 전 oMPC/식염수 처리(전처리); 1주 후 oMPC/식염수 처리(1주 후 처리); 및 4주 후 oMPC/식염수 처리(4주 후 처리). (B)와 (C)의 데이터는 전처리부터 1주 및 4주, 각각의 처리 후까지의 LAR의 변화율에 대한 대조군과 처리군 사이의 비교를 나타낸다. 데이터는 평균±SEM(Mean±SEM)으로 나타낸다. 대조군 및 7500만 oMPC군에 대한 N=11; 2500만 및 1억 5천만 oMPC군에 대한 N=10. **p<0.01*p<0.05.
도 6은 식염수 및 MPC 처리군에 대한 연구 과정을 통해 기관지 과민반응(bronchial hyperresponsiveness, BHR)을 보여주는 도해적 표현의 시리즈이다. 요약 BHR 데이터는 (A) 대조군과 2500만, 7500만 및 1억5천만 oMPC의 세 가지 처리군을 보여준다. y 축에 있는 상기 BHR 데이터는 내성에서 100% 변화의 유도를 필요로하는 카르바콜(carbachol)의 호흡 단위의 평균 수를 나타낸다. BHR 측정은 시험 전반에 걸쳐 세 차례 취해졌다: 2주 전 oMPC/식염수 처리(전처리); 1주 후 oMPC/식염수 처리(1주 후 처리); 및 4주 후 oMPC/식염수 처리(4주 후 처리). (B)와 (C)의 데이터는 전처리부터 1주 및 4주, 각각의 처리 후까지의 BHR의 변화율에 대한 대조군과 처리군 사이의 비교를 나타낸다. (D)의 데이터는 대조군과 풀링된(pooled) 처리군 사이의 BHR 데이터 비교를 나타낸다. 데이터는 평균±SEM(Mean±SEM)으로 나타낸다. 대조군 및 7500만 oMPC군에 대한 N=11; 2500만 및 1억 5천만 oMPC군에 대한 N=10. *p<0.05**p<0.01.
도 7은 식염수 및 MPC 처리군에 대한 연구 과정을 통해 기관지폐포(bronchoalveolar, BAL) 액의 호산구를 보여주는 도해적 표현의 시리즈이다. 데이터는 호산구의 비율(A), 전처리부터 1주(C) 및 4주(D) 후 처리에서의 호산구 비율의 변화, 및 풀링된(pooled) 처리군과 비교한 대조군(E)의 개요를 나타낸다. 호산구/mL는 (B)로 나타낸다. 데이터는 평균±SEM(Mean±SEM)으로 나타낸다. 대조군 및 7500만 oMPC군에 대한 N=11; 2500만 및 1억 5천만 oMPC군에 대한 N=10. *p<0.05, **p<0.01.
도 8은 식염수 및 MPC 처리군에 대한 연구 과정을 통해 기관지폐포(bronchoalveolar, BAL) 액의 호중구를 보여주는 도해적 표현의 시리즈이다. 데이터는 호중구의 비율의 개요(A), 호중구/mL (B)를 나타낸다. 데이터는 평균±SEM(Mean±SEM)으로 나타낸다. 대조군 및 7500만 oMPC군에 대한 N=11; 2500만 및 1억 5천만 oMPC군에 대한 N=10. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005.
도 9는 식염수 및 MPC 처리군에 대한 연구 과정을 통해 기관지폐포(bronchoalveolar,BAL)액의 대식 세포를 보여주는 도해적 표현의 시리즈이다. 데이터는 대식 세포의 비율의 개요(A), 대식 세포/mL (B)를 나타낸다. 데이터는 평균±SEM(Mean±SEM)으로 나타낸다. 대조군 및 7500만 oMPC군에 대한 N=11; 2500만 및 1억 5천만 oMPC군에 대한 N=10.
도 10은 식염수 및 MPC 처리군에 대한 연구 과정을 통해 기관지폐포(bronchoalveolar, BAL)액의 림프구를 보여주는 도해적 표현의 시리즈이다. 데이터는 림프구의 비율의 개요(A), 림프구/mL (B)를 나타낸다. 데이터는 평균±SEM(Mean±SEM)으로 나타낸다. 대조군 및 7500만 oMPC군에 대한 N=11; 2500만 및 1억 5천만 oMPC군에 대한 N=10.
도 11은 천식 양(asthmatic sheep)의 혈청에서 IgE의 수준을 보여주는 도해적 표현의 시리즈이다. ELISA 데이터는 시험 양의 혈청 내의 HDM-특이 IgE에 대한 평균 흡광(Abs) 수준을 나타낸다. 데이터는 평균±SEM(Mean±SEM)으로 나타나고, oMPC 처리 전과 후의 HDM-IgE 수준의 비교(A), 및 전처리부터 1주(B) 및 4주(C) 후 처리에서의 IgE 수준의 변화율을 보여준다. 전처리, 1주 후 처리 및 4주 후 처리 혈청은 각각 51, 72 및 93 실험일에 모든 양으로부터 취해졌다. 대조군 및 7500만 oMPC군에 대한 N=11; 2500만 및 1억 5천만 oMPC군에 대한 N=10. *p<0.05, **p<0.01.

일반적 기술 및 선정된 정의

본 명세서 전반에 걸쳐, 특별히 달리 언급하지 않거나 문맥상 필요하지 않으면, 하나 또는 다수(하나 또는 그 이상)의 단계, 물질의 조성물, 단계군 또는 물질의 조성물군을 포함하도록 취해진 단일 단계, 물질의 조성물, 단계군 또는 물질의 조성물군을 참조한다.

본원에 기재된 각 실시예는 특별히 언급하지 않는 한 필요한 부분만 약간 수정하여 각기 모든 발명의 다른 실시예에 적용된다.

당업자는 본원에 기재된 발명이 변형(variation) 및 구체적으로 설명되지 않은 다른 변경(modification)에 대해 허용할 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명은 모든 변형 및 변경을 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명은 또한 본 명세서를 참조하거나 기재된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물 및 임의의 모든 구성요소 또는 둘 또는 그 이상의 임의의 단계 또는 특징을 개별적으로 또는 총괄적으로 포함한다.

본 발명은 단지 예시의 목적으로 의도된 본 발명의 구체적인 예에 의해 범위가 한정되지 않는다. 기능적으로 동등한 생성물, 조성물 및 방법은 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명 및 본 발명의 실시예의 범위 내에서 명확하다.

본 발명은 달리 언급하지 않는 한, 분자 생물학(molecular biology), 미생물학(microbiology), 바이러스학(virology), 재조합 DNA 기술(recombinant DNA technology), 용액 내 펩타이드(peptide) 합성, 고상 펩타이드(solid phase peptide) 합성 및 면역학(immunology)의 통상적인 기법의 사용을 과도한 실험없이 수행한다. 이러한 방법은 예를 들어, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Second Edition (1989), Vols I, II, 및 III 전체; DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I 및 II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford, 본문 전체; Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed, 1984) IRL Press, Oxford, 본문 전체 및 특히 Gait, ppl-22; Atkinson et al, pp35-81; Sproat et al, pp 83-115; 및 Wu et al, pp 135-151 안의 논문; 4.Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford, 본문 전체; Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford, 본문 전체; Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.), 시리즈 전체; J.F. Ramalho Ortigao, "The Chemistry of Peptide Synthesis" In: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva, Germany); Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. Land Fenichel, R.L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73 336-342; Merrifield, R.B. (1963). J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154; Barany, G. and Merrifield, R.B. (1979) in The Peptides (Gross, E. and Meienhofer, J. eds.), vol. 2, pp. 1284, Academic Press, New York. 12. Wiinsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Miiler, E., ed.), vol. 15, 4th edn., Parts 1 and 2, Thieme, Stuttgart; Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, SpringerVerlag, Heidelberg; Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474; Handbook of Experimental Immunology, Vols. IIV(D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); 및 Animal Cell Culture: Practical Approach, Third Edition (John R. W. Masters, ed., 2000), ISBN 0199637970, 본문 전체에 설명되어 있다.

본 명세서의 전반에 걸쳐, 본문에서 달리 요구하지 않는 한, 용어 "포함한다(comprise)" 또는 "포함한다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 정해진 단계 또는 요소 또는 정수(integer) 또는 단계군 또는 요소들 또는 정수들의 포함을 명시하지만 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 정수 또는 요소군 또는 정수군의 제외는 명시하지 않는 것으로 이해될 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이 용어 "~로부터 유래된(derived from)"은 반드시 직접적이지 않을지라도 특정 근원(source)에서 얻을 수 있는 특정 정수(integer)를 나타내도록 취해져야 한다. STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손 세포로부터 유래된 가용 인자의 문맥상, 이 용어는 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손 세포의 시험관 배양을 통해 생산되는, 예를 들어 단백질, 펩타이드, 탄수화물 등과 같은 하나 또는 그 이상의 인자를 의미하도록 취해져야 한다.

용어 "호흡기 질환(respiratory condition)"은 환자의 폐 기능을 감소시키는 임의의 병 또는 질환을 포함하고, 예를 들어 천식(asthma), 만성 기관지염(chronic bronnchitis), 기종(emphysema), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 호흡 부전(respiratory failure), 폐 부종(pulmonary oedema), 폐 색전증(pulmonary embolism), 폐 고혈압(pulmonary hypertension), 폐렴(pneumonia) 및 결핵(tuberculosis, TB), 폐암(lung cancer), 폐의 경화(sriffening) 및 (예, 약물, 독소, 감염 또는 방사선에 의해 야기된)상처(scarring), (예, 인공 호흡기에 의해 야기된)비정상적인 대기압으로부터의 폐질환을 포함하도록 취해져야 한다. 일 실시예에서, 호흡기 질환은 만성 폐질환(chronic lung condition) 및/또는 폐 내의 염증과 연관된 폐질환이고, 예를 들어, 폐질환은 천식 COPD 또는 낭포성 섬유증 또는 폐 섬유증(pulmonary fibrosis) 또는 세기관지염(bronchiolitis) 또는 폐포염(alveolitis) 또는 맥관염(vasculitis) 또는 유육종증(sarcoidosis)이다. 또 다른 실시예에서, 질환은 환자의 폐의 개형(remodeling) 또는 섬유증에 연관되어 있고, 예를 들어, 질환은 폐 섬유증(예, 특발성 폐 섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis)) 또는 천식이다.

본원에서 사용된 바와 같이 용어 "천식(asthma)"은 가변적인 기류 제한과 내인성(endogenous) 또는 외인성(exogenous) 자극에 대한 기도 과민반응(airway hyperresponsiveness)(Canadian Asthma Consensus Guidelines)에 관련된 호흡 곤란(dyspnea)의 범혈구감소증(paroxysmal) 또는 지속적인 증상, 흉부 압박감(chest tightness), 천명(wheezing), 가래 생성(sputum production) 및 기침 및/또는 자발적이거나 치료(천식에 대한 전세계적인 계획)로 종종 가역적인 가변적 기류 폐쇄에 따라 특히 밤이나 이른 아침에 천명, 숨이참(breathlessness), 흉부 압박감, 및 기침의 재발성 에피소드를 일으키는 기도 과민반응을 특징으로 하는 질환을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "중증 천식(severe asthma)"은 구강 코르티코스테로이드(oral corticosteroids)의 사용과 함께 또는 사용없이 흡입 코르티코스테로이드(inhaled corticosteroids)의 높은 투여량에서부터 매우 높은 투여량에 대해 잘 조절되는 천식 증상을 의미하는 것으로 이해될 것이고; "심한 중증 천식(very severe asthma)"은 추가적인 치료를 요구하거나 요구하지않고 흡입 및 섭취 코르티코스테로이드의 매우 높은 투여량에도 불구하고 잘 조절되거나 그렇지않은 천식 증상을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 이러한 정의에서, 흡입 코르티코스테로이드의 높은 일일 투여량 및 매우 높은 일일 투여량(대략적으로 등가 투여량(equivalent dose))은 다음과 같이 정의된다: 높은 투여량은 베클로메타손 디프로프리오네이트(beclomethasone diproprionate), 1000에서 2000 ㎍; 플루티카손(fluticasone), 500에서 1000 ㎍; 및 부데소니드(budesonide), 800에서 1600 ㎍ 및 매우 높은 투여량은 플루티카손, 1000에서 2000 ㎍ 및 부데소니드, 1600-3200 ㎍이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "난치성 천식(refractory asthma)"은 이전에 기재된 "중증 천식(severe asthma)" 및 "스테로이드-의존 및/또는 내성 천식(steroid-dependent and/or resistant asthma)", "조절하기 어려운 천식(difficult to control asthma)", "형편없이 조절되는 천식(poorly controlled asthma)", "취약성 천식(brittle asthma)" 또는 "돌이킬 수 없는 천식(irreversible asthma)"과 같은 천식 하위군뿐만 아니라 "치명적(fatal)"이거나 "거의 치명적인(near fatal)" 천식의 환자를 포함한다. 난치성 천식은 미국 흉부 협회 지침(American Thoracic Society guideline)에 따라 이후에 기재된 하나 또는 두 개의 주요 기준과 두 개의 보조 기준이 충족되는 경우에 정의될 수 있다: 주요 기준은: 경증의 적당한 지속성 천식 수준으로 조절을 달성하기 위한: (1)연속적 또는 거의 연속적(한 해의 50% 이상)인 구강 코르티코스테로이드(oral corticosteroids)의 치료 (2)높은 투여량의 흡입 코르티코스테로이드(inhaled corticosteroids)의 치료에 대한 필요조건이다. 보조 기준은: 예를 들어, LABA, 테오필린(theophylline) 또는 류코트리엔 안타고니스트(leukotriene antagonist)와 같은 흡입 코르티코스테로이드에 추가한 조절 약물로의 일상 치료에 대한 필요조건 (2)일상 또는 거의 일상에서 기초로 사용한 단발성 β-아고니스트(short-acting β-agonist)를 필요로 하는 천식 증상 (3)지속적인 기도 폐쇄(airway obstruction)(FEV₁이 80미만으로 예상되는; 일주 최대 호기 유량(peak expiratory flow, PEF) 변화가 20% 초과) (4)연(year) 당 천식에 대해 한 번 또는 그 이상의 긴급한 진료 방문 (5)연 당 세 번 또는 그 이상의 구강 스테로이드(oral steroid) "파열(bursts)" (6)구강 또는 흡입 코르티코스테로이드 투여량에서 25% 이하의 감소로 즉각적인 악화 (7)과거에 거의 치명적인 천식 사건이다. 난치성 천식의 정의의 목적에 대해, 약물(㎍/d) 및 투여량(퍼프(puffs)/d)은 다음과 같다: (a)베클로메타손 디프로피오네이트(beclomethasone dipropionate) > 1,260 > 40 퍼프(42 ㎍/흡입) > 20 퍼프(84 ㎍/흡입); (b)부데소니드(budesonide) > 1,200 > 6 퍼프; (c)플루니솔리드(flunisolide) > 2,000 > 8 퍼프; (d)플루티카손 프로피오네이트(fluticasone propionate) > 880 > 8 퍼프(110 ㎍), > 4 퍼프(220 ㎍); (e)트리암시놀론 아세토니드(triamcinolone acetonide) > 2,000 > 20 퍼프.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "급성 천식(acute asthma)" 또는 "알러지성 천식(allergic asthma)"은 기도의 하부기도 점막 밑에 위치한 비만 세포를 활성화시키는 알레르겐(allergen)(예, 먼지 진드기 배설물 또는 화분)에 의해 유발된 천식에 관한 것이다. 비만 세포의 활성화는 비강 상피가 점액을 생성하도록 자극하는 과립의 방출을 유발하고 기도 내의 평활근의 연속적인 수축을 유발한다. 이러한 평활근의 수축은 기도를 수축하여, 특유의 천식성 천명(asthmatic wheezing)의 원인이 된다.

"만성 천식(chronic asthma)"은 알레르겐(allergen)에 의해 유발되지 않고, 급성 천식으로부터 획득된 염증의 결과로 유발된다. 급성 천식의 전반적인 효과는 만성 염증을 유발하고, 이는 점막 상피가 환경 반응에 과민감하도록(hypersensitive) 유발시킨다. 그래서 연기(smoke)와 같은, 단순한 환경 제제(environment agents)는 과민감성 상피가 많은 양의 점액과 수축을 생성하도록 자극시킬 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis)"은 폐의 뼈대(framework)(간질(interstitium))를 지지하는 섬유증(fibrosis)을 특징으로 하는 원인 불명의 폐질환의 만성, 진행성 형태를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 일반적인 증상은 진행성 호흡 곤란(progressive dyspnea)(호흡의 어려움)일뿐만 아니라, 마른 기침(dry cough), 클러빙(clubbing)(손가락의 손상), 및 수포음(rales)(흡기동안 청진기로 들리는 폐에서의 딱딱거리는 소리)이다. 2002 ATS/ERS Multidisciplinary Consensus Statement on the Idiopathic Interstitial Pneumonias에서는 폐 조직검사(lung biopsy) 없이 IPF의 진단을 정립하기 위한 다음의 기준을 제안하였다:

·주요 기준(4개 모두 필요):

간질성 폐질환(interstitial lung disease)의 다른 알려진 원인의 배제(약물, 노출, 결합 조직(connective tissue) 질환);

제한(감소된 폐활량) 및 손상된 기체 교환(pO2, p(A-a)O2, DLCO)의 증거와 비정상적인 폐기능 검사;

고해상도 CT 스캔에서 소형 그라운드 글라스(ground glass)로 양측기저의 망상 이상(bibasilar reticular abnormalities) 및;

대체 진단을 지지하는 특성을 보이지않는 기관지 폐생검(transbronchial lung biopsy) 또는 기관지폐포 세척액(bronchoalveolar lavage, BAL).

·보조 기준(4개 중 3개 필요):

50세 초과 연령;

운동성 호흡곤란(exertional dyspnea)으로 설명되지 않는 서서히 퍼지는 발병;

3달 초과의 질병 기간; 및

양측기저 흡기성 딱딱거림(bibasilar inspiratory crackle).

용어 "악화(exacerbation)"는 예를 들어 천식 발작과 같은 호흡기 질환의 호흡기 증상의 악화를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

"초기 알러지성 반응(early phase allergic response)"(또는 천식성 반응)은 일반적으로 알레르겐(allergen) 노출 이후 2시간 이내, 또는 한 시간 또는 30분 또는 10분 또는 1분 이내에 발생하고 또한 일반적으로 즉각적인 알러지성 반응 또는 Ⅰ형 알러지성 반응(type Ⅰ allergic reaction)에 관한 것이다. 반응은 비만 세포 FcεRⅠ 수용체에 결합한 알레르겐 특이 IgE 분자의 교차 결합에 이은 비만 세포에 의한 류코트리엔(leukotrienes), 프로스타글란딘(prostaglandins) 및 사이토카인(cytokines)의 생성뿐만 아니라, 탈과립(degranulation)이라 불리는 과정에 의한 히스타민(histamine) 및 비만 세포 과립 단백질의 방출에 의해 유발된다. 이러한 매개체는 신경 세포에 영향을 줘서 가려움(itching), 수축(알러지성 천식에서 협소하게 보여지는 기도를 유발)을 유발하는 평활근, 점액 생산을 유발하는 배상 세포(goblet cell), 및 혈관확장 및 부종을 유발하는 내피 세포를 유발한다.

"말기 알러지성 반응(late phase allergic response)"(또는 천식성 반응)은 일반적으로 알레르겐(allergen) 노출 후 대략 6-12 시간 또는 8-12 시간 내에 생기고 예를 들어 비만 세포에 의해 매개된다. 초기 반응의 생성물은 케모카인(chemokines) 및 내피 세포에 작용하여 내피 세포가 (혈관 세포 접합 분자 및 셀렉틴(selectins)과 같은)세포간 접합분자(Intercellular adhesion molecule)를 발현하도록 유발하는 분자를 포함하고, 이는 함께 알러지성 반응이 일어나는 장소에 있는 혈액에서 류코사이트(leukocytes)의 동원(recruitment) 및 활성화를 유발한다. 일반적으로, 알러지성 반응에서 관찰되는 침윤세포(infiltrating cells)는 림프구(lymphocytes), 특히, 호산구(eosinophils)의 높은 비율을 포함한다. 동원된 호산구는 IL-5와 같은 많은 사이토카인(cytokines)을 생산할 뿐만 아니라 많은 세포독성 분자(주요염기성 단백질 및 호산구 퍼옥시다제(peroxidase)를 포함하는)의 방출을 탈과립(degranulate)할 것이다. 모집된 T 세포는 일반적으로 Th2 변형 및 비만 세포와 호산구의 추가적인 동원을 유발하도록 생산하는 사이토카인이고, IgE로 전환하는 혈장 세포 아이소타입(plasma cell isotype)은 비만 세포 FcεRⅠ 수용체에 결합하고 추가적인 알러지성 반응에 대해 개별적으로 준비할 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유효량(effective amount)"은 본원에 기재된 하나 또는 그 이상의 호흡기 질환 증상을 감소시키는 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손 세포 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자의 충분한 양을 의미하는 것으로 취해져야 한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"은 호흡기 질환을 치료하는 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손 세포 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자의 충분한 양을 의미하는 것으로 취해져야 하고, 즉, 환자는 더 이상 호흡기 질환 또는 이의 악화에 대한 임상적 기준을 만족하지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "예방적 유효량(prophylactically effective amount)"은 호흡기 질환 또는 이의 악화 또는 이의 재발의 발병을 예방하거나 억제하거나 지연하는 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손 세포 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자의 충분한 양을 의미하는 것으로 취해져야 한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "전신 투여량(whole body dose)"은 환자의 체중 또는 체표면적에 관계없이 세포 및/또는 가용 인자의 특정 투여량이 투여된 환자를 의미하는 것으로 이해될 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다(treat)" 또는 "치료(처리)(treatment)" 또는 "치료(처리)하는(treating)"은 가용 인자 및/또는 세포 및 호흡기 질환의 증상을 감소 및 억제시키는 치료적 유효량(therapeutically effective amount)을 투여하는 것을 의미하고, 환자는 더 이상 질환 또는 이의 악화가 임상적으로 진단되지 않는 것으로 이해해야 할 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "예방하다(prevent)" 또는 "예방하는(preventing)" 또는 "예방(prevention)"은 가용 인자 및/또는 세포의 예방적 유효량(prophylactically effective amount)을 투여하는 것을 의미하고, 호흡기 질환 또는 이의 악화의 발달 또는 진행을 멈추거나 방해하거나 지연시키는 것을 의미하는 것으로 취해져야 한다. 호흡기 질환의 예방은 또한 가용 인자 및/또는 세포의 예방적 유효량을 투여하는 것과 질환의 악화의 빈도를 예방 또는 감소시키는 것을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "가용 인자(soluble factors)"는 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손 세포에 의해 생성되는 임의의 분자, 예를 들어 단백질(protein), 펩타이드(peptide), 당단백질(glycoprotein), 당펩타이드(glycopeptide), 지단백질(lipoprotein), 지방펩타이드(lipopeptide), 탄수화물(carbohydrate) 등이 물에 용해가능(soluble)하다는 것을 의미하는 것으로 취해져야 한다. 이러한 가용 인자는 세포 내로 및/또는 세포에 의해 분비될 수 있다. 이러한 가용 인자는 복합 혼합물(예, 상청액(supernatant)) 및/또는 그의 분획물(fraction) 및/또는 정제 인자(purified factor)일 수 있다. 일 실시예에서, 가용 인자는 상청액이거나 상청액 내에 포함된다. 따라서, 하나 또는 그 이상의 가용 인자의 투여에 대해 본원의 임의의 실시예에서 필요한 부분만 약간 수정하여 상청액의 투여의 적용이 취해져야 한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "상청액(supernatant)"은 적합한 배지, 예를 들어, 액체 배지에서의 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손 세포의 시험관 배양 이후에 생성되는 비세포성 물질에 관한 것이다. 일반적으로, 상청액은 원심분리(centrifugation)와 같은 방법에 의한 세포성 물질의 제거 이후에, 적합한 조건 및 시간 하에 배지에서 세포를 배양함으로써 생성된다. 상청액은 투여 전에 추가적인 정제 단계가 실시되거나 그렇지 않을 수도 있다. 일 실시예에서, 상청액은 10⁵ 미만, 더 자세하게는, 10⁴ 미만, 예를 들어, 10³ 미만의 살아있지 않은 세포를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "정상적인 또는 건강한 개인(normal or healthy individual)"은 당 업계의 공지 및/또는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 평가된 호흡기 질환으로부터 고통받지 않는 환자를 의미하는 것으로 취해져야 한다. 일 실시예에서, "정상적인 또는 건강한 개인"은 호흡기 질환의 임의의 증상으로부터 고통받지 않는다.

알레르겐(Allergen)

일 실시예에서, 본 발명은 알레르겐에 대한 반응(예, 알러지성 반응)을 감소 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "알레르겐(allergen)"은 특이 IgE 형성(즉, 알러지성 반응)을 유도할 수 있는 하나 또는 그 이상의 항원을 포함하는 물질을 의미하는 것으로 취해져야 한다. IgE 생성 이후에, IgE는 비만 세포 또는 호염기구의 표면에 있는 Fc 수용체에 결합한다. 알레르겐에 이어지는 노출 이후, 알레르겐에 있는 최소 두 개의 에피토프(epitopes)에 결합한 최소 두 개의 IgE 항체는 알러지성 증상을 유도하는 이러한, 예를 들어, 히스타민(histamine)과 같은 다양한 혈관활성 아민(vasoactive amine)을 방출하는 비만 세포 또는 호염기구를 유발하는 IgE 분자의 Fab' 영역에 교차 결합을 유발한다. 용어 알레르겐은 모든 형태의 알레르겐, 예를 들어 폴리펩타이드 알레르겐(polypeptide allergen), 인지질 알레르겐(phospholipid allergen), 지방산(fatty acid) 또는 탄수화물(carbohydrate)을 포함한다. 일반적인 알레르겐의 예는 표 1에 나타난다.

유기체(organisms)에서 분리된 일반적인 알레르겐

	알레르겐 근원(Allergen source)		MW
	계통명 (Systematic name)	이전이름(Former name)
국화목( Asterales )	암브로시아 아르테미시폴리아 ( Ambrosia artemisiifolia , short ragweed)
	Amb a 1	항원 E	38
	Amb a 2	항원 K	38
	Amb a 3	Ra3	11
	Amb a 4	Ra5	5
	Amb a 5	Ra6	10
	Amb a 6	Ra7	12
	Amb a 7		11
	Amb a ?
	암브로시아 트리피다 ( Ambrosia trifida , giant ragweed)
	Amb t 5	Ra5G	4.4
	아르테미시아 불가리스( Artemisia vulgaris , mugwort)
	Art v 2		35
벼목( Poales )	사이노돈 닥티론 ( Cynodon dactylon , Bermuda grass)
	Cyn d 1		32
	닥티리스 글로메라타 ( Dactylis glomerata , orchard grass)
	Dac g 1	AgDg1	32
	Dac g 2		11
	Dac g 5		31
	롤리움 페렌네 ( Lolium perenne , rye grass)
	Lol p 1	그룹 Ⅰ	27
	Lol p 2	그룹 Ⅱ	11
	Lol p 3	그룹 Ⅲ	11
	Lol p 5		31
	Lol p 9	Lol p Ib	31/35
	플륨 프라텐스 ( Phleum pratense , timothy grass)
	Phl p 1		27
	Phl p 5	Ag25	32
	포아 프라텐시스 ( Poa pratensis , Kentucky blue grass)
	Poa p 1	그룹 Ⅰ	33
	Poa p 5		31
	Poa p 9		32/34
	소르굼 하레펜스 ( Sorghum lagepense , Johnson grass)
	Sor h 1
참나무목( Fagales )	알너스 글루티노사 ( Alnus glutinosa , alder)
	Aln g 1		17
	베투라 베루코사 ( Betula verrucosa , birch)
	Bet v 1		17
	Bet v 2	profilin	15
	카르피너스 베투루스( Carpinus betulus , hornbeam)
	Car b 1		17
	코리루스 아벨라나( Corylus avellana , hazel)
	Cor a 1		17
	케르커스 알바 ( Quercus alba , white oak)
	Que a 1		17
구과목( Pinales )	크립토메리아 자포니카( Cryptomeria japonica , sugi)
	Cry j 1		41-45
	Cry j 2
	주니퍼 사비노이드 ( Juniper sabinoides , mountain cedar)
	Jun s 1		50
	주니퍼 비르기니아나 ( Juniper virginiana , eastern red cedar)
	Jun v 1		45-50
물푸레나무목( Oleales )	오레아 유로피아 ( Olea europia , olive)
	Ole e 1		16
	더마토파고이드 프테로니시누스( Dermatophagoides pteronyssinus , mite)
	Der p 1	항원 P1	25
	Der p 2		14
	Der p 3	트립신(trypsin)	28/30
	Der p 4	아밀라제(amylase)	60
	Der p 5		14
	Der p 6	키모트립신(chymotrypsin)	25
	Der p 7		22-28
	더마토파고이드 미크로세라스 ( Dermatophagoides microceras , mite)
	Der m 1		25
	더마토파고이드 파리네( Dermatophagoides farinae , mite)
	Der f 1		25
	Der f 2		14
	Der f 3		30
	레피도글리퍼스 데스트럭터 ( Lepidoglyphus destructor , storage mite)
	Lep d ?		15
	캐니스 패밀리아리스 ( Canis familiaris , dog)
	Can f 1		25
	Can f 2		27
	펠리스 도메스티쿠스 ( Felis domesticus , cat saliva)
	Fel d 1	cat-1	38
	무스 무스쿨러스( Mus musculus )
	Mus m 1	MUP	19
	래튜스 노르베기우스( Rattus norvegius )
	Rat n 1		17
	아스페르길루스 푸미가투스( Aspergillus fumigatus )
	Asp f 1		18
	Asp f ?		90
	Asp f ?		55
	캔디다 알비칸스( Candida albicans )
	Cand a		40
	알터나리아 알터나타( Alternaria alternata )
	Alt a 1		28
	트리코파이톤 톤수란스( Trichophyton tonsurans )
	Tri t 1		30
	블라타리아 게르마니카 ( Blattaria germanica , cockroach)
	Bla g 2		20

일 실시예에서, 알레르겐은 동물, 예를 들어 포유류, 예를 들어 개 또는 고양이 또는 래트(rat) 또는 마우스(mouse)로부터 온다.

일 실시예에서, 알레르겐은 식물, 예를 들어 식물 화분으로부터 온다.

일 실시예에서, 알레르겐은 곤충, 예를 들어 진드기로부터 온다.

일 실시예에서, 알레르겐은 HDM이다.

STRO -1 ⁺ 세포 또는 자손 세포, 및 그로부터 유래된 상청액 또는 하나 또는 그 이상의 가용 인자

STRO-1⁺ 세포는 골수(bone marrow), 혈액, 유치(deciduous teeth)(예, 박리된 유치), 치수 세포(dental pulp cell), 지방 조직, 피부(skin), 비장, 이자, 뇌, 신장, 간, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 장, 폐, 림프절, 흉선, 뼈, 인대, 힘줄, 골격근, 피부(dermis), 및 골막(periosteum)에서 발견되는 세포다.

일 실시예에서, STRO-1⁺ 세포는 중배엽 및/또는 내배엽 및/또는 외배엽과 같은 하나 또는 그 이상 또는 둘 또는 그 이상 및/또는 세 개의 생식 계열(germ line)으로 분화가 가능하다.

일 실시예에서, STRO-1⁺ 세포는 지방 조직, 골 조직, 연골 조직, 탄성 조직, 근육 조직, 및 섬유성 결합 조직을 포함하지만 이에 국한되지 않는 많은 세포 형태로 분화가 가능한 다능성 세포(multipotential cells)이다. 특정 계통-예정(lineage-commitment) 및 분화 경로의 세포들은 기계적 영향 및/또는 숙주 조직에 의해 정립된 성장 인자, 사이토카인(cytokines), 및/또는 국부적인 미소서식환경 상태(local microenvironmental conditions)와 같은 내생적 생리활성 인자(endogenous bioactive factors)로부터 다양한 영향에 따라 들어온다. STRO-1⁺ 다능성 세포는 그러므로 줄기 세포이거나 제때 표현형 세포를 얻기 위해 비가역적으로 분화하는 전구체 세포인 딸 세포를 얻기 위해 분할하는 비-조혈전구 세포(non-hematopoietic progenitor cells)이다.

일 실시예에서, STRO-1⁺ 세포는 대상(subject), 예를 들어 치료받을 대상 또는 관련된 대상 또는 관련되지 않은 대상(같은 종이거나 다른 종이거나)으로부터 얻은 샘플에서 증가된다. 용어 "증가된(enriched)", "증가(enrichment)" 또는 그의 변형은 본원에서 하나의 특정 세포 형태의 비율 또는 많은 특정 세포 형태의 비율인 세포의 집단(population)이 비처리된 세포의 집단(예, 기존 환경(native environment)에 있는 세포)에 비교해서 증가한 것을 기재하기 위해 사용된다. 일 실시예에서, STRO-1⁺ 세포가 증가된 집단은 최소 0.1% 또는 0.5% 또는 1% 또는 2% 또는 5% 또는 10% 또는 15% 또는 20% 또는 25% 또는 30% 또는 50% 또는 75%의 STRO-1⁺ 세포를 포함한다. 이와 관련하여, 용어 "STRO-1⁺ 세포가 증가된 세포 집단"은 용어 "X%의 STRO1⁺ 세포를 포함하는 세포 집단"을 명백히 지지하는 것을 제공하며, 여기서 X%는 본원에 인용된 백분율이다.

STRO-1⁺ 세포는 일부 실시예에서, 클론형성 콜로니(clonogenic colonies)를 형성할 수 있고, 예를 들어, CFU-F(섬유아세포(fibroblasts)) 또는 그의 하위집합(예, 50% 또는 60% 또는 70% 또는 70% 또는 90% 또는 95%)은 이러한 활성을 가질 수 있다.

일 실시예에서, 세포 집단은 선택가능한 형태로 STRO-1⁺ 세포를 포함하는 세포 제제(cell preparation)에서 증가된다. 이와 관련하여, 용어 "선택가능한 형태(selectable form)"는 STRO-1⁺ 세포의 선택을 허용하는 마커(marker)(예, 세포 표면 마커)를 발현하는 세포를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 마커가 STRO-1일 수 있지만, STRO-1일 필요는 없다. 예를 들어, 본원에 기재되고 또는 예시된, STRO-2 및/또는 STRO-3(TNAP) 및/또는 STRO-4 및/또는 VCAM-1 및/또는 CD146 및/또는 3G5를 발현하는 세포는 또한 STRO-1을 발현한다(그리고 STRO-1^bright가 될 수 있다). 따라서, 세포가 STRO-1⁺을 표시한다고 해서 상기 세포가 STRO-1의 발현에 의해 선택되는 것을 의미하지 않는다. 일 실시예에서, 세포들은 최소 STRO-3 발현을 기반으로 선택되고, 예를 들어 세포들은 STRO-3⁺(TNAP⁺)이다.

세포 또는 그의 집단의 선택을 참조하면 특정 조직 근원(source)에서의 선택을 필요로 하지 않는다. 본원에 기재된 바와 같이 STRO-1⁺ 세포는 매우 다양한 근원에서 선택되거나 분리되거나 증가될 수 있다. 그렇긴 하지만, 일부 실시예에서는, 이러한 용어들이 STRO-1⁺ 세포(예, MPCs) 또는 혈관 조직 또는 주피세포(pericytes)(예, STRO-1⁺ 주피세포)를 포함하는 조직 또는 본원에서 인용된 하나 또는 그 이상의 임의의 조직을 포함하는 임의의 조직에서의 선택을 지지하는 것을 제공한다.

일 실시예에서, 세포는 TNAP⁺, VCAM-1⁺, THY-1⁺, STRO-2⁺, STRO-4⁺(HSP-90β), CD45⁺, CD146⁺, 3G5⁺ 또는 이들의 임의의 조합을 구성하는 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 마커를 개별적으로 또는 총괄적으로 발현하는 본 발명의 방법으로 사용된다.

"개별적으로(individually)"는 본 명세서에서 인용된 마커 또는 마커군 각각을 포함하는 것으로 의미하며, 개별 마커 또는 마커군이 청구범위를 동반하는 본원에 따로 나열되지 않음에도 불구하고 이러한 마커 또는 마커군을 별도로 나눠서 정의할 수 있다.

"총괄적으로(collectively)"는 본 명세서에서 인용된 마커 또는 펩타이드군의 임의의 수 또는 조합을 포함하는 것으로 의미하며, 마커 또는 마커군의 이러한 수 또는 조합이 청구범위를 동반하는 본원에 구체적으로 나열되지 않음에도 불구하고 마커 또는 마커군의 임의의 다른 조합에서 이러한 조합 또는 하위조합을 별도로 나눠서 정의할 수 있다.

예를 들어, STRO-1⁺ 세포는 STRO-1^bright(동의어. STRO-1^bri)이다. 일 실시예에서, STRO-1^bri 세포는 STRO-1^dim 또는 STRO-1^intermediate 세포에 대하여 우선적으로 증가된다.

일 실시예에서, STRO-1^bright 세포는 추가적으로 하나 또는 그 이상(또는 모두)의 TNAP⁺, VCAM-1⁺, THY-1⁺, STRO-2⁺, STRO-4⁺(HSP-90β) 및/또는 CD146⁺이다. 예를 들어, 세포는 앞서 언급된 하나 또는 그 이상의 마커로 선택되고/또는 앞서 언급된 하나 또는 그 이상의 마커를 발현하는 것으로 보여진다. 이와 관련하여, 마커를 발현하는 것으로 보여지는 세포는 구체적으로 시험될 필요는 없고, 오히려 이미 증가된 또는 분리된 세포는 시험될 수 있고 이후에 사용되고, 분리되거나 증가된 세포는 또한 동일한 마커를 발현하는지 합리적으로 추정될 수 있다.

일 실시예에서, 중간엽 전구체 세포(mesenchymal precursor cells)는 WO 2004/85630에 정의된 것과 같이 혈관주위의 중간엽 전구체 세포(perivascular mesenchymal precursor cells)이다.

주어진 마커에 대해 "양성(positive)"으로 나타난 세포는 세포 표면에 있는 마커의 정도에 따라 마커의 낮거나(lo 또는 dim) 높은(bright, bri) 수준을 발현할 수 있고, 용어는 세포의 분류 단계에서 사용되는 형광의 강도(intensity)나 다른 마커에 관한 것이다. lo(또는 dim 또는 dull) 및 bri의 차이는 분류되는 특정 세포 집단에서 사용되는 마커의 맥락으로 이해될 것이다. 주어진 마커에 대해 "음성(negative)"으로 나타난 세포는 세포에서 반드시 완전히 없는 것이 아니다. 이 용어는 마커가 세포에서 비교적 매우 낮은 수준으로 발현되는 것을 의미하고, 감지가능하게 표지되어 있는 경우에 마커는 매우 낮은 신호를 발생시키거나 예를 들어 아이소타입(isotype) 대조군 항체를 사용하여 검출된 수준의 배경 수준(background levels) 이상으로 감지할 수 없다.

본원에서 사용될 때, 용어 "밝은(bright)"은 신호가 감지가능하게 표지되어 있는 경우에 비교적 높은 신호를 발생시키는 세포 표면의 마커에 관한 것이다. 이론에 의해 제한되지 않기를 바라는 동안, "밝은" 세포는 샘플에서 다른 세포보다 타겟 마커 단백질(target marker protein)(예를 들어 STRO-1에 의해 인식되는 항원)을 더 많이 발현하는 것을 제안한다. 예를 들어, STRO-1^bri 세포는, 형광 활성화된 세포 분류(fluorescence activated cell sorting ,FACS) 분석법에 의해 결정된 것과 같은 FITC-결합 STRO-1 항체로 표지된 경우에, 비-밝은 세포(non-bright cells)(STRO-1^dull/dim)보다 더 큰 형광 신호를 생성한다. 일 실시예에서, "밝은" 세포는 초기 샘플에 포함된 최대한 밝게 표지된 세포(예, 골수 단핵 세포(bone marrow mononuclear cells))의 최소 대략 0.1%를 구성한다. 다른 실시예에서, "밝은" 세포는 초기 샘플에 포함된 최대한 밝게 표지된 세포, 예를 들어, 골수 단핵 세포에 최소 대략 0.1%, 최소 대략 0.5%, 최소 대략 1%, 최소 대략 1.5%, 최소 대략 2%를 구성한다. 일 실시예에서, STRO-1^bright 세포는 "배경(background)", 즉 STRO-1^-인 세포에 비해 STRO-1 표면 발현의 2 로그 규모(log magnitude)만큼 더 높은 발현을 가진다. 이에 비해, STRO-1^dim 및/또는 STRO-1^intermediate 세포는 STRO-1 표면 발현의 2 로그 규모에 못 미치는 높은 발현을 가지고, 일반적으로 1 로그 또는 "배경"보다 더 낮다.

본원에서 사용된 바와 같이 용어 "TNAP"는 조직 비특이적 알카라인 포스파타(tissue non-specific alkaline phosphatase)제의 모든 동형을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 용어는 간 동형(liver isoform, LAP), 골 동형(bone isoform, BAP) 및 신장 동형(kidney isoform, KAP)를 포함한다. 일 실시예에서, TNAP는 BAP이다. 일 실시예에서, 본원에서 사용되는 TNAP는 기탁 번호 PTA-7282의 부다페스트 조약의 규정에 의해 2005년 12월 19일에 ATCC에 기탁된 하이브리도마 세포주(hybridoma cell line)에 의해 생성된 STRO-3 항체에 결합할 수 있는 분자에 관한 것이다.

더불어, 바람직한 실시예에서, STRO-1⁺ 세포는 클론형성(clonogenic) CFU-F을 생기게 할 수 있다.

일 실시예에서, STRO-1⁺ 다능성 세포(multipotential cells)의 유의한 비율은 최소 두 가지의 다른 생식세포 계열(germ lines)로의 분화를 가능하게 한다. 다능성 세포의 계열의 비제한적인 예는 골 전구체 세포(bone precursor cells); 간세포 전구체(hepatocyte progenitors)는 쓸개관 상피 세포(bile duct epithelial cells) 및 간세포(hepatocytes)에 대해 다능하고; 신경 제한 세포(neural restricted cells)는 희소돌기아교세포(oligodendrocytes) 및 성상세포(astrocytes)로 진행하는 신경교세포 전구체(glial cell precursors)를 발생시킬 수 있고; 뉴런으로 진행하는 뉴런 전구체(neuronal precursors); 심장근(cardiac muscle) 및 심장근육세포(cardiomyocytes), 당-반응성 인슐린 분비 이자 베타 세포계(glucose-responsive insulin secreting pancreatic beta cell lines)에 대한 전구체를 포함하여 수임(committed)될 수 있다. 다른 계열은 치아모세포(odontoblasts), 상아질-생성 세포(dentin-producing cells) 및 연골세포(chondrocytes), 및 다음에 오는 전구체 세포: 망막 색소 상피 세포(retinal pigment epithelial cells), 섬유아세포(fibroblasts), 케라틴세포(keratinocytes)와 같은 피부 세포, 수지상세포(dendritic cells), 모낭 세포(hair follicle cells), 신장관 상피 세포(renal duct epithelial cells), 평활근 및 골격근 세포, 고환 전구체(testicular progenitors), 혈관 내피 세포(vascular endothelial cells), 힘줄, 인대, 연골, 지방세포, 섬유아세포, 골수 간질(marrow stroma), 심장근, 평활근, 골격근, 주피세포(pericyte), 혈관, 내피, 아교(glial), 신경, 성상세포 및 희소돌기아교세포를 포함하지만 이에 국한되는 것은 아니다.

또 다른 실시예에서, STRO-1⁺ 세포는 배양시에 조혈모세포(hematopoietic cells)를 생기게 할 수 있다.

일 실시예에서, 세포는 치료받는 환자에게서 취해지고, 표준 기술을 사용하여 시험관에서 배양되고, 자가(autologous) 또는 타가(allogeneic) 조성물로써 환자에게 투여하기 위한 상청액(supernatant) 또는 가용 인자 또는 배양된 세포를 얻기 위해 사용된다. 대안적인 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 정립된 인간 세포주(human cell lines)의 세포가 사용된다. 본 발명의 또 다른 유용한 실시예에서, 비-인간 동물(non-human animal)(또는 환자가 인간이 아니면, 다른 종으로부터)의 세포가 사용된다.

본 발명은 또한 시험관 배양에서 생성된 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손 세포(후자는 또한 배양된 세포라고 언급된다)로부터 얻은 또는 유래된 상청액(supernatant) 또는 가용 인자의 사용을 고려한다. 본 발명의 배양된 세포는 (배양 배지에서 자극 인자(stimulatory factors)의 수 및/또는 유형을 포함하는)배양 조건, 계대수(the number of passages) 등에 따른 매우 다양한 표현형을 가질 수 있다. 특정 실시예에서, 자손 세포는 부모 집단에서 대략 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 계대 후에 획득된다. 그러나, 자손 세포는 부모 집단에서 임의의 계대수 후에 획득될 수 있다.

자손 세포는 임의의 적합한 배지에서 배양함으로써 획득될 수 있다. 세포 배양에 참조하여 사용되는 용어 "배지(medium)"는, 세포를 둘러싸는 환경의 조성들을 포함한다. 배지는 고체, 액제, 기체 또는 상(phase) 및 물질들의 혼합물일 수 있다. 배지는 세포 성장을 지속시키지 않는 액체 배지뿐만 아니라 액체 성장 배지를 포함한다. 배지는 또한 아가(agar), 아가로오스(agarose), 젤라틴(gelatine) 및 콜라겐 매트리스(collagen matrices)와 같은 젤라틴성 배지를 포함한다. 대표적인 기체 배지는 페트리 접시(petri dish) 또는 다른 고체 또는 반고체(semisolid) 지지체에서 성장하는 세포에 노출된 기체 상을 포함한다. 용어 "배지"는 비록 아직 세포에 접촉하지 않았더라도, 또한 세포 배양용으로 만들어진 물질에 관한 것이다. 즉, 세균 배양을 위해 준비된 영양이 풍부한 액체는 배지이다. 물 또는 다른 액체로 혼합되면서 세포 배양에 적합해진 분말 혼합물은 "분말 배지(powdered medium)"라고 할 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명의 방법에 유용한 자손 세포는 STRO-3 항체로 표지된 자성 비드(magnetic beads)를 사용하여 골수(bone marrow)에서 TNAP⁺ STRO-1⁺를 분리함으로써 얻을 수 있고, 이후에 분리된 세포를 배양한다(적합한 배양 조건의 실시예에 대한 Gronthos et al. Blood 85: 929-940, 1995 참조하라).

일 실시예에서, 이러한 배양된 세포(자손(progeny))(예를 들어, 최소 5 계대 후)는 TNAP^-, CC9⁺, HLA Ⅰ⁺ 클래스, HLA Ⅱ^- 클래스, CD14^-, CD19^-, CD3^-, CD11a^-c^-, CD31^-, CD86^-, CD34^- 및/또는 CD80^-일 수 있다. 그러나, 본원에 기재된 다른 배양 조건하에서 다른 마커가 다양할 수 있는 가능성이 있다. 또한, 이러한 표현형의 세포는 배양된 세포 집단에서 우세할 수 있는 반면에 이 표현형(예를 들어, 배양된 세포의 작은 백분율이 CC9^-일 수 있다)을 가지지 않는 세포의 소수 비율이 존재한다는 것을 의미하지 않는다. 일 실시예에서, 배양된 세포는 여전히 다른 세포 형태로 분화할 수 있는 능력을 가진다.

일 실시예에서, 상청액(supernatant) 또는 가용 인자, 또는 세포 그 자체를 얻기 위해 사용되는 배양된 세포 집단은 최소 25%의 세포에 있어서, 예를 들어 최소 50%의 세포가 CC9⁺인 세포를 포함한다.

또 다른 실시예에서, 상청액(supernatant) 또는 가용 인자, 또는 세포 그 자체를 얻기 위해 사용되는 배양된 세포 집단은 최소 40%의 세포에 있어서, 예를 들어 최소 45%의 세포가 STRO-1⁺인 세포를 포함한다.

또 다른 실시예에서, 배양된 세포는 LFA-3, THY-1, VCAM-1, ICAM-1, PECAM-1, P-selectin, L-selectin, 3G5, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD 90, CD29, CD 18, CD61, 인테그린 베타(integrin beta) 6-19, 트롬보모듈린(thrombomodulin), CD 10, CD 13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGF1-R, NGF-R, FGF-R, Leptin-R (STRO-2 = Leptin-R), RANKL, STRO-4 (HSP-90β), STRO-1^bright 및 CD 146 또는 이 마커들의 임의의 조합을 포함하는 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 마커를 총괄적으로 또는 개별적으로 발현할 수 있다.

일 실시예에서, 자손 세포(progeny cells)는 WO 2006/032092에 정의 및/또는 기재된 바와 같이 다능의 배양된 STRO-1⁺ 다능 세포 자손(Multipotential Expanded STRO-1⁺ Multipotential cells Progeny, MEMPs)이다. STRO-1⁺ 다능 세포에서 유래될 수 있는 자손의 증가된 집단을 제조하는 방법은 WO 01/04268 및 WO 2004/085630에 기재되어 있다. 시험관 사정(context) 상, STRO-1⁺ 다능 세포는 전적으로 순수한 제제로써 드물게 존재할 것이고 조직 특이적 수임 세포(tissue specific committed cells, TSCCs)인 다른 세포로 일반적으로 존재할 것이다. WO 01/04268은 대략 0.1% 내지 90%의 정제 수준에 있는 골수에서 이러한 세포를 채취하는 것을 언급한다. 자손이 유래된 MPC를 포함하는 집단은 조직 근원(source)에서 직접 채취될 수 있고, 또는 대안적으로 이미 체외에서 배양된 집단일 수 있다.

예를 들어, 자손은 이들이 존재하는 집단의 전체 세포의 최소 대략 0.1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 95%를 포함하는, 채취되고, 배양되지 않은 상당히 정제된 STRO-1⁺ 다능 세포(multipotential cells)의 집단에서 얻을 수 있다. 이 수준은, 예를 들어, TNAP, STRO-4(HSP-90β), STRO-1^bright, 3G5⁺, VCAM-1, THY-1, CD146 및 STRO-2를 구성하는 군에서 개별적으로 또는 총괄적으로 선택된 최소 하나의 마커에 대해 양성인(positive) 세포를 선택함으로써 달성될 수 있다.

MEMPS는 STRO-1⁺ 다능 세포(multipotential cells)가 마커 STRO-1^bri에 대해 양성(positive)이고 마커 알카라인 포스파타제(Alkaline phosphatase, ALP)에 대해 음성(negative)이라는 점에서 갓 채취한 STRO-1⁺ 다능 세포와 구별할 수 있다. 대조적으로, 갓 분리된 STRO-1⁺ 다능 세포는 STRO-1^bri 및 ALP에 대해 모두 양성이다. 본 발명의 일 실시예에서, 최소 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 투여되는 세포는 표현형 STRO-1^bri 및 ALP^-를 가진다. 또 다른 실시예에서 MEMPS는 하나 또는 그 이상의 마커 Ki67, CD44 및/또는 CD49c/CD29, VLA-3, α3β1에 대해 양성이다. 그러나 또 다른 실시예에서 MEMPs는 TERT 활성을 보이지 않고/또는 마커 CD18에 대해 음성이다.

STRO-1⁺ 세포 시작 집단(starting population)은 WO 01/04268 또는 WO 2004/085630에서 시작한 임의의 하나 또는 그 이상의 조직 형태, 즉 골수(bone marrow), 치수 세포(dental pulp cells), 지방 조직 및 피부, 또는 아마도 더 대략적으로 지방 조직, 치아, 치수(dental pulp), 피부, 간, 신장, 심장, 망막, 뇌, 모낭(hair follicles), 장, 폐, 비장, 림프절, 흉선, 이자, 뼈, 인대, 골수, 힘줄 및 골격근에서 유래될 수 있다.

본 발명에 기재된 수행 방법에서, 임의의 주어진 세포 표면 마커를 운반하는 세포의 분리는 많은 다른 방법에 의해 영향을 받을 수 있지만, 예시적인 방법은 상기 해당되는 결합제(binding agents)(예, 결합제의 항체 또는 항원 결합 조각)의 결합에 의존한 다음, 높은 수준의 결합 또는 낮은 수준의 결합 또는 무결합에 따른 결합 여부로 분리되는 것으로 이해될 것이다. 가장 편리한 결합제는 항체 또는 항체-기반 분자들이고, 예를 들어 단일클론 항체(monoclonal antibodies) 또는 후자의 결합제의 특이성 때문에 단일클론 항체를 기반으로 한(예, 단일클론 항체의 항원 결합 조각을 포함하는 단백질) 것이다. 항체는 양 단계에서 사용될 수 있지만, 다른 결합제가 또한 사용될 수 있고, 그래서 이 마커들의 리간드는 또한 이들을 운반하거나 결핍된 세포를 증가시키기 위해 사용될 수 있다.

항체 또는 리간드는 조분리(crude separation)를 위해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 예를 들어, 분리 기술은 수집되는 분획의 생존력(viability)의 유지를 최대화시킨다. 다른 효능의 다양한 기술은 상대적으로 조분리를 얻기 위해 사용될 수 있다. 사용되는 특정 기술은 분리 효율, 관련된 세포독성, 성능의 편의성 및 속도, 및 정교한 장비 및/또는 기술적 기능에 대한 필요성에 의존할 것이다. 분리에 대한 방법은 항체-코팅된 자성 비드(antibody-coated magnetic beads)를 사용한 자성 분리(magnetic separation), 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 및 고체 매트릭스에 부착한 항체로 "패닝(panning)"하는 방법을 포함할 수 있지만 이에 국한되는 것은 아니다. 정확한 분리를 제공하는 기술은 FACS를 포함하지만 이에 국한되는 것은 아니다. FACS를 수행하는 방법은 당업자에게 자명할 것이다.

본원에 기재된 마커 각각에 대한 항체는 상업적으로 구할 수 있고(예, STRO-1에 대한 단일클론 항체(monoclonal antibodies)는 미국, R&D 시스템에서 상업적으로 구할 수 있다), ATCC 또는 다른 기탁 협회에서 구할 수 있고/또는 당 업계에서 인정받은 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

일 실시예에서, STRO-1⁺ 세포를 분리하는 방법은 예를 들어 STRO-1의 높은 수준의 발현을 인식하는 자성 활성화된 세포 분류방법(magnetic activated cell sorting, MACS)인 고체상 분류 단계(solid phase sorting step) 이용방법인 첫 번째 단계를 포함한다. 두 번째 분류 단계는 특허 명세서 WO 01/14268에 기재된 바와 같이 전구체 세포(precursor cell) 발현의 높은 수준이 유발되어야 따를 수 있다. 이 두 번째 분류 단계는 두 개 또는 그 이상의 마커의 사용을 포함할 수 있다.

STRO-1⁺ 세포를 얻는 방법은 또한 공지된 기술을 사용한 첫 번째 증가(enrichment) 단계 전에 세포의 근원의 채취를 포함할 수 있다. 그래서 조직은 수술로 제거될 수 있다. 근원 조직을 포함하는 세포는 소위 단일 세포 현탁액(single cells suspension)으로 분리될 것이다. 이 분리는 물리적 및 또는 효소적 수단에 의해 달성될 수 있다.

일단 적합한 STRO-1⁺ 세포 집단이 얻어지면, MEMPs를 얻기 위해 임의의 수단으로 배양되거나 증가될 수 있다.

일 실시예에서, 세포는 치료받는 환자에게서 취해지고, 표준 기술을 사용하여 시험관에서 배양되고, 자가(autologous) 또는 타가(allogeneic) 조성물로써 환자에게 투여하기 위한 상청액(supernatant) 또는 가용 인자 또는 배양된 세포를 얻기 위해 사용된다. 대안적인 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 정립된 인간 세포주(human cell lines)의 세포는 상청액 또는 가용 인자를 얻기 위해 사용된다. 본 발명의 또 다른 유용한 실시예에서, 비-인간 동물(non-human animal)(또는 환자가 인간이 아니면, 다른 종으로부터)의 세포가 상청액 또는 가용 인자를 얻기 위해 사용된다.

본 발명의 방법 및 사용법은 비-인간 영장류 세포(non-human primate cells), 유제류(ungylate), 개(canine), 고양이(feline), 토끼(lagomorph), 설치류(rodent), 조류(avian) 및 어류(fish) 세포를 포함하지만 이에 국한되지 않는 임의의 비-인간 동물 종으로부터의 세포를 사용하여 실행될 수 있다. 본 발명의 방법으로 수행할 수 있는 영장류 세포는 침팬지(chimpanzees), 개코원숭이(baboons), 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이, 및 임의의 다른 신세계 또는 구세계 원숭이(New or Old World monkeys)의 세포를 포함하지만 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 방법으로 수행할 수 있는 유제류 세포는 소(bovines), 돼지(porcines), 양(ovines), 염소(caprines), 말(equines), 버팔로(buffalo) 및 바이손(bison)을 포함하지만 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 방법으로 수행할 수 있는 설치류 세포는 마우스(mouse), 랫(rat), 기니피그(guinea pig), 햄스터(hamster) 및 거빌 쥐(gerbil)의 세포를 포함하지만 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 방법으로 수행할 수 있는 토끼종의 실시예는 집토끼(domesticated rabbits), 산토끼(jack rabbits), 토끼(hare), 솜꼬리토끼(cottontails), 눈신토끼(snowshoe rabbit), 및 새앙토끼(pikas)를 포함한다. 닭(Gallus gallus)은 본 발명의 방법으로 수행할 수 있는 조류종의 예이다.

일 실시예에서, 세포는 인간 세포이다.

본 발명의 방법으로 유용한 세포는 사용하기 전에, 또는 상청액(supernatant) 또는 가용 인자를 얻기 전에 보관될 수 있다. 진핵 세포, 그리고 특히 포유류 세포(mammalian cells)의 보존 및 보관을 위한 방법 및 프로토콜(protocols)은 당업자에게 공지되어 있다(예, Pollard, J. W. and Walker, J. M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Second Edition, Humana Press, Totowa, N.J.; Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, Fourth Edition, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.). 중간엽 줄기(mesenchymal stem)/전구체(progenitor) 세포, 또는 그 자손(progeny)과 같은 분리된 줄기 세포의 생물학적 활성을 유지하는 임의의 방법은 본 발명에 관련하여 이용될 수 있다. 일 실시예에서, 세포는 냉동보존(cryopreservation)을 이용하여 유지되고 보관된다.

유전자 변형 세포(Genetically-Modified Cells)

일 실시예에서, STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손 세포는, 예를 들어 목적 단백질을 발현 및/또는 분비하기 위해 유전자 변형된다. 예를 들어, 세포는 프로테아제(protease), DNAse 또는 계면활성 단백질(surfactant protein), 예를 들면, 계면활성 단백질 C와 같은, 호흡기 질환의 치료에 유용한 단백질을 발현하기 위해 조작(engineered)된다.

유전적으로 세포를 변형하는 방법은 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들어, 세포에서 발현되는 핵산(nucleic acid)은 세포에서의 발현을 유도하는 프로모터(promoter)에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 핵산은, 예를 들어, 바이러스 프로모터(viral promoter), 예를 들어, CMV 프로모터(예, CMV-IE 프로모터) 또는 SV-40 프로모터와 같은 환자의 다양한 세포 내의 작동가능한 프로모터에 연결된다. 추가의 적합한 프로모터는 당업계에 공지되어 있고 본 발명의 실시예에 맞게 적용하기 위해 필요한 부분만 약간 수정하여 취해질 것이다.

일 실시예에서, 핵산(nucleic acid)은 발현 구성물의 형태로 제공된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현 구성물(expression construct)"은 세포에서 작동가능하게 연결되는 핵산(예, 리포터 유전자(reporter gene) 및/또는 역-선택가능한 리포터 유전자(counter-selectable reporter gene))에서의 발현을 부여하는 능력을 가지는 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 문맥상, 발현 구성물은 플라스미드(plasmid), 박테리오파지(bacteriophage), 파지미드(phagemid), 코스미드(cosmid), 바이러스 하위-유전적 또는 유전적 단편(virus sub-genomic or genomic fragment), 또는 발현가능한 포맷에서 이형(heterologous) DNA를 유지 및/또는 복제할 수 있는 다른 핵산을 포함하거나 될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

본 발명의 수행을 위한 적합한 발현 구성물(expression construct)의 구성 방법은 당업자에게 자명할 것이고 예를 들어, Ausubel et al(In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987) 또는 Sambrook et al(In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001)에 기재되어 있다. 예를 들어, 발현 구성물의 구성요소 각각은 예를 들어, PCR과 예를 들어, 플라스미드(plasmid) 또는 파지미드(phagemid)와 같은, 이어지는 적합한 발현 구성물로의 복제를 사용하여 적합한 주형 핵산에서 증폭된다.

이러한 발현 구성물에 적합한 벡터(vector)는 당업계에 공지 및/또는 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, 포유류 세포에서 본 발명의 방법에 적합한 발현 벡터는, 예를 들어, Invitrogen에 의해 공급된 pcDNA 벡터 모음의 벡터, pCI 벡터 모음의 벡터(Promega), pCMV 벡터 모음의 벡터(Clontech), pM 벡터(Clontech), pSI 벡터(Promega), VP 16 벡터(Clontech) 또는 pcDNA 벡터 모음의 벡터(Invitrogen)이다.

당업자는 추가적인 벡터(vector)와, 예를 들어, Life Technologies Corporation, Clontech 또는 Promega와 같은, 이러한 벡터의 출처를 알고 있을 것이다.

발현을 위해 분리된 핵산 분자 또는 분리된 핵산 분자를 포함하는 유전자 구성물을 세포로 도입하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 주어진 유기체에 사용된 기술은 공지의 성공한 기술에 의해 결정된다.

재조합 DNA를 세포로 도입하는 방법은 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(dextran)에 의해 매개된 형질주입(transfection), 리포펙타민(lipofectamine)(Gibco, MD, USA) 및/또는 셀펙틴(cellfectin)(Gibco, MD, USA)을 사용하는 것과 같은 리포솜(liposomes)에 의해 매개된 형질주입, PEG-매개 DNA 흡수, 전기천공법(electroporation) 및 다른 무엇보다도 DNA-코팅된 텅스텐(tungsten) 또는 금 입자(Agracetus Inc., WI, USA)를 사용한 것과 같은 미립자 충격(microparticle bombardment)을 포함한다.

대안으로, 본 발명의 발현 구성물은 바이러스 벡터(viral vector)이다. 적합한 바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있고 상업적으로 구할 수 있다. 숙주 세포 유전체로의 핵산의 전달 및 핵산의 통합에 대한 종래의 바이러스-기반 시스템(viral-based systems)은, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터(retroviral vector), 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector) 또는 아데노-관련 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector)를 포함한다. 대안으로, 아데노바이러스 벡터는 숙주 세포에서 에피솜(episomal)으로 남아있는 핵산 도입에 유용하다. 바이러스 벡터는 표적 세포 또는 조직으로 유전자 전달 방법에 효율적이고 다목적이다. 추가로, 높은 형질도입 효율은 많은 다른 세포 형태 및 표적 조직에서 관찰된다.

예를 들어, 레트로바이러스 벡터(retroviral vector)는 일반적으로 외부 서열의 6-10 kb까지 포장하는 능력과 함께 시스(cis)-작용 긴 말단 반복(long terminal repeats, LTR)을 포함한다. 최소의 시스-작용 긴 말단 반복은 벡터의 복제 및 포장에 충분하고, 이는 발현 구성물을 긴 말단 발현을 제공하기 위한 표적 세포로 통합하기 위해 사용된다. 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스(murine leukemia virus)(MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus)(GaLV), 유인원 면역결핍 바이러스(simian immunodeficiency virus)(SrV), 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus)(HIV)를 기반으로 하는 레트로바이러스 벡터, 및 그의 조합을 포함한다(예를 들어, Buchscher et al, J Virol . 56:2731-2739 (1992); Johann et al, J. Virol 65:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al, Virol 76:58-59 (1990); Wilson et al, J. Virol 63:274-2318 (1989); Miller et al., J. Virol 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700; Miller and Rosman BioTechniques 7:980-990, 1989; Miller, A. D. Human Gene Therapy 7:5-14, 1990; Scarpa et al Virology 75:849-852, 1991; Burns et al Proc . Natl Acad . Sci USA 90:8033-8037, 1993 참조하라).

다양한 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus)(AAV) 벡터 시스템은 또한 핵산 전달을 위해 개발되어 왔다. AAV 벡터는 당업계에 알려진 기술을 사용하여 손쉽게 제작될 수 있다. 예를 들어, U.S. Pat. Nos. 5,173,414 및 5,139,941; International Publication Nos. WO 92/01070 및 WO 93/03769; Lebkowski et al. Molec . Cell. Biol. 5:3988-3996, 1988; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter Current Opinion in Biotechnology 5:533-539, 1992; Muzyczka. Current Topics in Microbiol , and Immunol . 158:97-129, 1992; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801, 1994; Shelling and Smith Gene Therapy 7: 165-169, 1994; 및 Zhou et al. J Exp . Med . 179: 1867-1875,1994를 참조하라.

본 발명의 발현 구성물을 전달하는데 유용한 추가적인 바이러스 벡터는, 예를 들어, 우두 바이러스(vaccinia virus) 및 조류 수두바이러스(avian poxvirus) 또는 알파바이러스(alphavirus) 또는 결합 바이러스 벡터(conjugate virus vector)와 같은, 폭스 패밀리 바이러스로(pox family of viruses)부터 유래된 벡터를 포함한다(예를 들어, Fisher-Hoch et al, Proc . Natl Acad . Sci . USA 56:317-321,1989에 기재되어 있다).

세포 및 가용 인자의 치료/예방 가능성 분석법(Assaying Therapeutic/Prophylactic Potential of Cells and Soluble Factors)

호흡기 질환의 진행 또는 발병을 치료하거나 예방 또는 지연하기 위한 세포나 가용 인자의 능력을 측정하는 방법은 당업자에게 자명할 것이다.

예를 들어, 세포 또는 가용 인자(예, 인자 또는 단일 인자 또는 혼합물 또는 인자의 분획물(fraction)(예, 친화성 정제법(affinity purification) 또는 크로마토그래피(chromatography)로 유래된))는 호흡기 질환의 모델에게 투여되고 하나 또는 그 이상의 증상에 나타나는 효과가 평가된다.

호흡기 질환의 예시적인 모델은 알러지의 동물 모델, 예를 들면, WO2002/098216에 기재된 모델과 같은, 알러지성 천식과, 예를 들면, 집 먼지 진드기 단백질(house dust mite protein)에 의해 유도된 알러지성 천식의 마우스 모델(Fattouh et al., Am J Respir Crit Care Med 172: 314-321, 2005), IL-5 및 에오탁신(eotaxin)이 과발현된 중증 천식(severe asthma)의 마우스 모델, 에어로졸(aerosol)로 전달될 때 메타콜린(methacholine)에 과민감성인 폴리-1-리신(poly-1-lysine)의 기관내 점적(intracheal instillation)을 받는 마우스(Homma et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 289: L413-L418, 2005), 폐 섬유증(pulmonary fibrosis)의 블레오마이신(bleomycin) 또는 FITC 또는 실리카(silica) 유도 모델(Muggia et al., Cancer Treat Rev 10: 221-243, 1983; Roberts et al., J Pathol 176: 309-318, 1995; Oberdorster Inhal Toxicol 8: 73-89, 1996)을 포함한다.

본 발명에서 또한 호흡기 질환의 치료, 예방 또는 지연에 대한 세포 또는 가용 인자를 확인 또는 분리하는 방법을 제공하는 것은 전술된 바와 같이 당업자에게 자명할 것이고, 방법은:

(i) 호흡기 질환으로 고통받는 시험 환자에게 세포 또는 가용 인자를 투여하고 호흡기 질환의 증상을 평가하는 방법;

(ii) 대조군 환자에 비해 시험 환자에서의 증상의 개선이 세포 또는 가용 인자가 호흡기 질환을 치료하는 것을 나타냄에 있어서, (i)에서 환자의 호흡기 질환 수준의 증상을 세포 또는 가용 인자가 투여되지 않은 호흡기 질환으로 고통받는 대조군 환자의 호흡기 질환의 증상에 비교하는 방법을 포함한다.

세포는 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 임의의 세포일 수 있다.

예시적인 증상은 본원에 기재되어 있다.

세포 조성물(Cellular Compositions)

본 발명의 일 실시예에서 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손 세포는 조성물의 형태로 투여된다. 일 실시예에서, 이러한 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체(carrier) 및/또는 부형제(excipient)를 포함한다.

용어 "담체(carrier)" 및 "부형제(excipient)"는 보관, 투여, 및/또는 활성 화합물의 생물학적 활성을 촉진하기 위해 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질의 조성물을 나타낸다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mac Publishing Company (1980))을 참조하라). 담체는 또한 활성 화합물의 임의의 바람직하지 않은 부작용을 감소시킬 수 있다. 적합한 담체는, 예를 들어, 안정하고, 담체에서 다른 성분과 반응할 수 없다. 일 실시예에서, 담체는 치료에 사용되는 복용량(dosages) 및 농도에서 수용자(recipients)에게 중요한 국부적 또는 전신적인 부작용을 생성하지 않는다.

본 발명에서 적합한 담체는 통상적으로 사용되는 담체이고, 예를 들어 물, 식염수(saline), 수용성 덱스트로스(aqueous dextrose), 락토오스(lactose), 링거액(Ringer's solution), 완충 용액(buffered solution), 히알루로난(hyaluronan) 및 글라이콜(glycols)은 특히 (등장성(isotonic)인 경우) 용액에 대한 예시적인 액체 담체이다. 적합한 약제학적 담체 및 부형제는 전분(starch), 셀룰로오스(cellulose), 글루코스(glucose), 락토오스(lactose), 수크로오스(sucrose), 젤라틴(gelatin), 맥아(malt), 쌀(rice), 밀가루(flour), 초크(chalk), 실리카겔(silica gel), 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate), 스테아린산 소듐(sodium stearate), 모노스테아린산 글리세롤(glycerol monostearate), 염화나트륨(sodium chloride), 글리세롤(glycerol), 프로필렌 글라이콜(propylene glycol), 물, 에탄올(ethanol) 등을 포함한다.

또 다른 실시예에서, 담체는, 예를 들어 세포가 성장하고 지지되는 배지 조성물이다. 예를 들어, 이러한 배지 조성물은 투여받을 환자에게 임의의 부작용을 유도하지 않는다.

예시적인 담체 및 부형제는 호흡기 질환을 감소, 예방 또는 지연시키는 세포의 생존력 및/또는 세포의 능력에 악영향을 주지 않는다.

일 실시예에서, 담체 또는 부형제는 적합한 pH에서 세포 및/또는 가용 인자를 유지하기 위해 완충 활성(buffering activity)을 제공함으로써 생물학적 활성을 가하는데, 예를 들어, 담체 또는 부형제는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)이다. PBS는 매력적인 담체 또는 부형제를 나타내며 이는 세포 및 인자와 최소한으로 상호작용하고 세포 및 인자의 급속한 방출을 허용하기 때문에, 이러한 경우에, 본 발명의 조성물은 혈류 또는 조직내로 또는 조직을 둘러싸거나 근접한 지역에 예를 들어, 주사로 직접 적용하기 위해 액체로 제조될 수 있다.

STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손 세포는 또한 수용자-호환가능하고(recipient-compatible) 수용자에게 해롭지않은 생성물로 분해되는 스캐폴드(scaffolds)로 통합되거나 삽입될 수 있다. 이 스캐폴드는 수용자 환자에게 이식될 세포의 지지와 보호를 제공한다. 천연 및/또는 합성 생분해성 스캐폴드는 이러한 스캐폴드의 예이다.

다양한 다른 스캐폴드는 본 발명의 방법의 실시에서 성공적으로 사용될 수 있다. 예시적인 스캐폴드는 생물학적인, 분해가능한 스캐폴드를 포함하지만 이에 국한되는 것은 아니다. 천연 생분해성 스캐폴드는 콜라겐(collagen), 피브로넥틴(fibronectin), 및 라미닌(laminin) 스캐폴드를 포함한다. 세포 이식 스캐폴드에 대해 적합한 합성 재질은 대규모의 세포 성장 및 세포 기능을 지지할 수 있어야 한다. 이러한 스캐폴드는 또한 재흡수가능(resorbable)할 수 있다. 적합한 스캐폴드는, 예를 들어, Vacanti, et al. J. Ped . Surg . 23:3-9 1988; Cima, et al. Biotechnol . Bioeng . 38:145 1991; Vacanti, et al. Plast . Reconstr. Surg . 88:753-9 1991에 의해 기재된 바와 같이 폴리글라이콜릭산(polyglycolic acid) 스캐폴드를 포함하거나; 폴리산무수물(polyanghydrides), 폴리오르쏘에스터(polyorthoesters), 및 폴리락트산(polylactic acid)과 같은 합성 폴리머를 포함한다.

또 다른 실시예에서, 세포는 (Upjohn Company의 Gelfoam과 같은)겔 스캐폴드(gel scaffold)로 투여될 수 있다.

세포는 비강내(intranasal) 투여를 위해 특별히 만들어진 약제학적 조성물의 구성요소로써 투여될 수 있다. 특정 실시예에서, 세포는 효소 억제제 또는 흡수 촉진제와 함께 투여된다. 다른 실시예에서, 비강내 투여를 위해 만들어진 약제학적 조성물은 효소 억제제 및/또는 흡수 촉진제를 포함한다. 그러나 다른 실시예에서, 약제학적 조성물은 합성 계면활성제(surfactants), 담즙염(bile salts), 인지질(phospholipids), 및 싸이로덱스트린(cylodextrins)을 포함한다. 세포는 또한 에멀젼(emulsion) 또는 리포솜(liposome)을 통해 비강내로 투여될 수 있다. 특정 실시예에서, 비강내 투여는 폴리머릭 미소구체(polymeric microspheres)의 사용에 의해 달성된다. 세포는 소듐 글라이코콜린산(sodium glycohcholate)(NaGC) 및 리놀레산(linoleic acid)의 존재하에 투여될 수 있다.

비강내 투여를 위한 약제학적 조성물은 스프레이(spray), 에어로졸(aerosol), 겔(gel), 용액(solution), 에멀젼(emulsion), 또는 현탁액(suspension)으로써 투여될 수 있다. 대안으로, 약제학적 조성물은 예를 들어, 부비강(paranasal sinuses)같은 상부 기도에 직접 투여된다. 일 실시예에서, 세포 또는 약제학적 조성물은 미소카테터(microcatheter)를 통해 투여된다.

본원에 기재된 방법에 유용한 세포 조성물은 홀로 투여되거나 다른 세포와의 혼합물로써 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 세포는 다른 다능성(multipotent) 또는 전능성(pluripotent) 세포 또는 줄기 세포, 또는 골수 세포를 포함하지만 이에 국한되는 것은 아니다. 다른 형태의 세포는 투여 전에 즉시 또는 곧바로 본 발명의 조성물과 혼합될 수 있고, 또는 투여 전에 일정 기간동안 함께 배양될 수 있다.

일 실시예에서, 조성물은 세포의 유효량 또는 치료적 또는 예방적 유효량을 포함한다. 투여되는 세포의 정확한 양은 연령, 체중, 및 환자의 성별, 그리고 호흡기 질환의 정도 및 심각성을 포함하는 다양한 인자에 달려있다.

일부 실시예에서, 세포는 환자의 순환계로 배출되는 세포를 허용하지 않는 챔버(chamber) 내에 함유되지만, 순환계에 들어오는 세포에 의해 분비되는 인자는 허용한다. 이와 같이 가용 인자는 환자의 순환계로 인자를 분비하는 세포를 허용함으로써 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 챔버는 가용 인자의 국소적 수준(local levels)을 증가시키기 위해 환자의 부위에 동등하게 주입될 수 있고, 예를 들면 이자내 또는 이자 근처에 주입될 수 있다.

본 발명의 일부 실시예에서, 세포 조성물로 치료를 시작하기 전에 환자를 면역억제(immunosuppress)하는 것이 필수적이거나 바람직하지 않을 수 있다. 타가(allogeneic) 또는 심지어 이종(xenogeneic)의 이식에 따라서, STRO-1⁺ 세포 또는 그 자손은 일부 경우에 허용될 수 있다.

그러나, 다른 경우에 세포 치료 개시 및/또는 세포 조성물에 대한 환자의 면역 반응을 감소시키기 전에 환자의 약학적 면역억제가 바람직하거나 적절할 수 있다. 이는 전신성(systemic) 또는 국부적 면역억제제(local immunosuppressive agents)의 사용을 통해 달성될 수 있고, 또는 캡슐에 넣어진 장치에 세포를 전달함으로써 달성될 수 있다. 세포는 캡슐에 넣어질 수 있고 세포와 치료 인자에 의해 요구되는 영양소와 산소가 침투할 수 있지만 면역 체액성 인자(immune humoral factors) 및 세포는 침투할 수 없다. 예를 들어, 봉합제(encapsulant)는 저자극성이고 쉽고 안정적으로 표적 조직에 위치하게 되고 주입된 구조에 추가되는 보호를 제공한다. 이식된 세포에 면역 반응을 감소 또는 제거하는 이러한 방법 및 다른 방법은 당업계에 공지되어 있다. 대안으로써, 세포는 그들의 면역원성(immunogenicity)을 감소시키기 위해 유전적으로 변형될 수 있다.

가용 인자의 조성물(Compositions of Solunle Factors)

일 실시예에서, STRO-1⁺ 세포-유래 및/또는 자손 세포-유래 상청액(supernatant) 또는 가용 인자는 예를 들어, 적합한 담체(carrier) 및/또는 부형제(excipient)를 포함하는 조성물의 형태로 투여된다. 일 실시예에서, 담체 또는 부형제는 가용 인자 또는 상청액의 생물학적 효과에 악영향을 주지 않는다.

일 실시예에서, 조성물은 가용 인자 또는 상청액의 구성요소, 예를 들어, 프로테아제 억제제(protease inhibitor)를 안정시키는 물질의 조성물을 포함한다. 일 실시예에서, 프로테아제 억제제는 환자에게 부작용을 주기에 충분한 양으로 포함되지 않는다.

STRO-1⁺ 세포-유래 및/또는 자손 세포-유래 상청액 또는 가용 인자를 포함하는 조성물은 적절한 액체 현탁액(liquid suspensions), 예를 들어, 배양 배지 내에서 또는 안정한 담체 또는 예를 들어, 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline)인 완충 용액으로 제조될 수 있다. 적합한 담체는 상기 본원에 기재되어 있다. 또 다른 실시예에서, STRO-1⁺ 세포-유래 및/또는 자손 세포-유래 상청액 또는 가용 인자를 포함하는 현탁액은 주사용 유성 현탁액(oily suspensions)이다. 적합한 친유성(lipophilic) 용매 또는 비히클(vehicle)은 참기름같은 지방유(fatty oils); 또는 에틸 올레산(ethyl oleate) 또는 트리글리세리드(triglycerides)같은, 합성 지방산 에스테르(synthetic fatty acid esters); 또는 리포솜(liposome)을 포함한다. 주사에 사용되는 현탁액은 또한 소듐 카복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose), 소르비톨(sorbitol), 또는 덱스트란(dextran)같은 현탁액의 점성(viscosity)을 증가시키는 물질을 포함한다. 선택적으로, 현탁액은 또한 매우 농축된 용액의 제조를 허용하는 화합물의 용해도(solubility)를 증가시키는 적합한 안정제(stabilizers)) 또는 제제(agents)를 포함한다.

멸균 주사 용액(sterile injectable solutions)은 여과 멸균 이후에 상기에 기재된 성분 하나 또는 성분의 조합인 적절한 용매에서 요구되는 양으로 상청액 또는 가용 인자를 통합함으로써 제조될 수 있다.

일반적으로, 분산액(dispersions)은 기본 분산액 배지 및 상기에 열거된 필요한 다른 구성요소를 포함하는 멸균 비히클(sterile vehicle)로 상청액 또는 가용 인자를 통합함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말(sterile powders)의 경우, 예시적인 제조 방법은 진공 건조(vacuum drying) 및 이전에 멸균-여과 용액에서 임의의 추가적인 바람직한 성분이 추가된 활성 성분의 분말을 수득하는 동결 건조(freeze-drying)이다. 본 발명의 대안의 실시예에 따르면, 상청액 또는 가용 인자는 이들의 용해도(solubility)를 증가시키는 하나 또는 그 이상의 추가적인 화합물로 만들어질 수 있다.

다른 예시적인 담체(carrier) 또는 부형제(excipient)는, 예를 들어, Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N. Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N. Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y.에 기재되어 있다.

치료 조성물은 일반적으로 제조 및 보관 조건 하에 멸균되고 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼(microemulsion), 리포솜(liposome), 또는 다른 주문된 구조로 만들어질 수 있다. 담체는 용매 또는 예를 들어, 물, 에탄올(ethanol), 폴리올(polyol)(예를 들어, 글리세롤(glycerol), 프로필렌 글라이콜(propylene glycol), 및 액체 폴리에틸렌 글라이콜(liquid polyethylene glycol), 등), 및 그의 적합한 혼합물을 포함하는 분산매(dispersion medium)가 될 수 있다. 적절한 유동성(fludity)은, 예를 들어, 레시틴(lecithin)같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제(surfactants)의 사용에 의해 유지될 수 있다. 일부 경우에, 등장성 제제(isotonic agents), 예를 들어, 설탕(sugars)과, 만니톨(mannitol), 소르비톨(sorbitol), 또는 염화나트륨(sodium chloride)같은 폴리알코올(polyalcohols)은 조성물에 포함된다. 주사 조성물의 연장되는 흡수는 예를 들어, 모노스테아린산 염(monostearate salts) 및 젤라틴(gelatin)같은 흡수를 지연시키는 조성물 제제를 포함함으로써 유발할 수 있다. 게다가, 가용 인자는, 예를 들어 느리게 방출되는 폴리머를 포함하는 조성물에서 경시적 방출 제형물(time release formulation)에 투여될 수 있다. 활성 화합물은 주입 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 방출 조절제(controlled release formulation)와 같은, 급속한 방출에 대한 화합물을 보호할 담체(carrier)로 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 폴리머는 에틸렌 비닐 아세테이트(ethylene vinyl acetate), 폴리산무수물(polyanhydrides), 폴리글라이콜릭산(polyglycolic acid), 콜라겐(collagen), 폴리오르쏘에스터(polyorthoesters), 폴리락트산(polylactic acid) 및 폴리락틱(polylactic), 폴리글라이콜릭 코폴리머(polyglycolic copolymers, PLG)로써 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조에 대한 많은 방법은 특허받았고 또는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다.

상청액(supernatant) 또는 가용 인자는, 예를 들어, 가용 인자의 느린 방출을 제공하는 적절한 매트릭스(matrix)와 함께 투여될 수 있다.

조성물의 추가적인 구성 요소(Additional Components of Compositions)

STRO-1⁺ 세포 유래-상청액(supernatant) 또는 가용 인자, STRO-1⁺ 세포 또는 그 자손은 다른 유익한 약물 또는 생물학적 분자(성장 인자, 영양 인자)와 함께 투여될 수 있다. 다른 제제와 투여될 때, 이들은 단일 약제학적 조성물, 또는 다른 제제(다른 제제의 투여 전이나 후)와 동시에 또는 순차적으로 별도의 약학 조성물과 함께 투여될 수 있다. 생리활성 인자(bioactive factors)는 국소 마취제(local anesthetics) 뿐만 아니라 항-세포사멸제(anti-apoptotic agents)(예, EPO, EPO 미메티바디(mimetibody), TPO, IGF-Ⅰ 및 IGF-Ⅱ, HGF, 카스파제(caspase) 억제제); 항-염증제(anti-inflammatory agents)(예, p38 MAPK 억제제, TGF-베타 억제제, 스타틴(statins), IL-6 및 IL-1 억제제, PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE, SIROLINUS, 및 NSAIDs(비-스테로이드성 항-염증제(non-steroidal anti-inflammatory drugs); 예, TEPOXALIN, TOLMETIN, SUPROFEN)); 면역억제제(immunosupressive)/면역조절제(immunomodulatory)(예, 사이클로스포린(cyclosporine), 타크로리무스(tacrolimus)같은 칼시뉴린(calcineurin) 억제제; mTOR 억제제(예, SIROLIMUS, EVEROLIMUS)); 항-증식제(anti-proliferatives)(예, 아자치오프린(azathioprine), 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil)); 코르티코스테로이드(corticosteroids)(예, 프레드니솔론(prednisolone), 하이드로코르티손(hydrocortisone)); 단일클론(monoclonal) 항-IL-2R알파 수용체 항체와 같은 항체(예, 바실릭시맙(basiliximab), 다클리주맙(daclizumab)), 폴리클론(polyclonal) 항-T-세포 항체(예, 항-흉선세포 글로불린(anti-thymocyte globulin, ATG); 항-림프구 글로불린(anti-lymphocyte globulin, ALG); 단일클론 항-T 세포 항체 OKT3)); 항-혈전제(anti-thrombogenic agents)(예, 헤파린(heparin), 헤파린 유사체(heparine derivatives), 우로키나아제(urokinase), PPack(덱스트로페닐알라닌 프롤린 아르기닌 클로로메틸케톤(dextrophenylalanine proline arginine chloromethylketone)), 항트롬빈 화합물(antithrombin compounds), 혈소판 수용체 안타고니스트(platelet receptor antagonists), 항-트롬빈 항체(anti-thrombin antibodies), 항-혈소판 수용체 항체(anti-platelet receptor antibodies), 아스피린(aspirin), 디피리다몰(dipyridamole), 프로타민(protamine), 히루딘(hirudin), 프로스타글란딘 억제제(prostaglandin inhibitors), 및 혈소판 억제제(platelet inhibitors)); 및 항-산화제(anti-oxidants)(예, 프로부콜(probucol), 비타민 A, 아스코르브산(ascorbic acid), 토코페롤(tocopherol), 코엔자임(coenzyme) Q-10, 글루타티온(glutathione), L-시스테인(cysteine), N-아세틸시스테인(acetylcysteine))를 포함하여 공동 투여될 수 있다.

일 실시예에서, 임의의 실시예에 따른 본원에 기재된 조성물은 항-염증제(anti-inflammatory agent), 면역조절제(immunomodulatory), 면역억제제(immunosuppressive agent), 진통제(pain medication), 또는 항생제(antibiotic)를 포함한다. 일 실시예에서, 두 번째 치료제는 면역조절제이다. 또 다른 실시예에서, 두 번째 제제는 항-CD3 항체(예, OKT3, 뮤로노맙(muronomab)), 항-IL-2 수용체 항체(예, 바실릭시맙(basiliximab) 및 다클리주맙(daclizumab)), 항 T 세포 수용체 항체(예, 뮤로모맙(Muromomab)-CD3), 아자치오프린(azathioprine), 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor), 코르티코스테로이드(corticosteroid), 사이클로스포린(cyclosporine), 메토트렉세이트(methotrexate), 멀캅토퓨린(mercaptopurine), 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 타크로리무스(tacrolimus), 또는 시로리무스(sirolimus)이다.

대안으로, 또는 추가로, 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 세포, 분비된 인자 및/또는 조성물은 공지된 호흡기 질환의 치료, 예를 들어, 스테로이드(steroid) 또는 LABA와 결합된다.

일 실시예에서, 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 약제학적 조성물은 호흡기 질환을 치료하기 위해 사용되는 화합물을 포함한다. 대안으로, 본 발명의 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 치료/예방 방법은 추가로 호흡기 질환 치료에 사용되는 화합물의 투여를 포함한다. 예시적인 화합물은 본원에 기재되어 있고 본 발명의 이러한 실시예를 적용하기 위해 필요한 부분만 약간 수정하여 취해진다.

또 다른 실시예에서, 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 조성물은 추가로 전구체 세포(progenitor cell)에서 혈관 세포(vascular cell)로의 분화를 유도 또는 촉진하는 인자를 포함한다. 예시적인 인자는 혈관 내피세포 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 혈소판 유래 성장인자(platelet derived growth factor, PDGF; 예, PDGF-BB), 및 FGF를 포함한다.

또 다른 실시예에서, 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 조성물은 추가로 조직 특이 수임 세포(tissue specific committed cell, TSCC)를 포함한다. 이와 관련하여, 국제 특허 출원 No. PCT/AU2005/001445는 TSCC 및 TSCC의 향상된 증식을 유발할 수 있는 STRO-1⁺ 세포의 투여를 증명한다. 일 실시예에서, TSCC는 혈관 세포이다. 환자에게 이러한 조성물의 투여는 맥관 구조(vasculature)의 증가된 생성을 유발할 수 있고, 예를 들어, 영향받는 조직으로 전달되는 증가된 영양분을 유발할 수 있다.

의료 장비(Medical Devices)

본 발명은 또한 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 방법에 사용되거나 사용을 위한 의료 장비를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 주사기(syringe) 또는 카테터(catheter) 또는 흡입기(inhaler) 또는 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손 세포 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자를 포함하는 다른 적합한 전달 장비 및/또는 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 제공한다. 선택적으로, 주사기 또는 카테터 또는 흡입기는 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 지시사항(instructions)과 함께 포장된다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손 세포 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자를 포함하는 임플란트(implant) 및/또는 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 제공한다. 선택적으로, 임플란트는 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 지시사항(instructions)과 함께 포장된다. 적합한 임플란트는 예를 들어, 상기 본원에 기재되고 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손 세포 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자인 스캐폴드(scaffold)로 형성될 수 있다.

투여 방식(Modes of Administraton )

STRO-1⁺ 세포-유래 상청액(supernatant) 또는 가용 인자, STRO-1⁺ 세포 또는 그 자손 세포는 보수(repair) 또는 확대(augmentation)가 필요한 곳, 예를 들어 폐 내에 외과적으로 주입(implanted), 주사(injected), 흡입(inhaled), 전달(delivered)(예, 카테터(catheter) 또는 주사(syringe)에 의해)될 수 있고, 또는 그렇지않으면 직접 또는 간접적으로 투여될 수 있다.

일 실시예에서, STRO-1⁺ 세포-유래 상청액(supernatant) 또는 가용 인자, STRO-1⁺ 세포 또는 그 자손 세포는 치료 대상의 혈류(blood stream)로 전달된다. 예를 들어, STRO-1⁺ 세포-유래 상청액 또는 가용 인자, STRO-1⁺ 세포 또는 그 자손 세포는 비경구적으로(parenterally) 전달된다. 비경구적 투여의 예시적인 경로는 복강내(intraperitoneal), 심실내(intraventricular), 뇌실내(intracerebroventricular), 척추강내(intrathecal), 또는 정맥내(intravenous) 투여를 포함하지만 이에 국한되는 것은 아니다. 일 실시예에서, STRO-1⁺ 세포-유래 상청액 또는 가용 인자, STRO-1⁺ 세포 또는 그 자손 세포는 동맥내(intra-arterially) 투여방법으로, 대동맥(aorta), 심장의 심방(atrium) 또는 심실(ventricle)로 또는, 예를 들어 정맥내(intravenously) 투여방법으로, 혈관으로 전달된다. 이와 관련하여, STRO-1⁺ 세포는 손상된 부분 및/또는 폐로 이동하는 것으로 나타난다.

심장의 심방(atrium) 또는 심실(ventricle)로 세포를 전달하는 경우, 세포는 폐로의 급속한 세포의 전달이 일어날 수 있는 합병증을 피하기 위해 좌심방 또는 좌심실로 투여될 수 있다.

일 실시예에서, STRO-1⁺ 세포-유래 상청액(supernatant) 또는 가용 인자, STRO-1⁺ 세포 또는 그 자손은 정맥내로(intravenously) 전달된다.

일 실시예에서, STRO-1⁺ 세포-유래 상청액(supernatant) 또는 가용 인자, STRO-1⁺ 세포 또는 그 자손은 예를 들어, 주사(syringe) 또는 카테터(catheter)를 통해 또는 중심관(central line)을 사용하여 전달하는 부위로 주사된다.

일 실시예에서, 일 실시예에서, STRO-1⁺ 세포-유래 상청액(supernatant) 또는 가용 인자, STRO-1⁺ 세포 또는 그 자손은 비강내(intranasally) 또는 흡입(inhalation)에 의해 전달된다.

치료적 제형을 위한 투여 방식의 선택은 개체(entity)의 혈청(serum) 또는 조직 회전율(tissue turnover rate), 증상의 수준, 및 개체의 면역원성(immunogenicity)을 포함하는 여러 인자에 달려있다. 일 실시예에서, 투여 방식은 부작용의 허용가능한 수준과 일치하는 환자에게 전달되는 세포 및/또는 인자의 수를 최대화시킨다. 따라서, 전달된 세포 및/또는 인자의 수는 특정 개체 및 치료되는 질환의 중증도(severity)에 부분적으로 의존한다.

일 실시예에서, STRO-1⁺ 세포-유래 상청액(supernatant) 또는 가용 인자, STRO-1⁺ 세포 또는 그 자손은 단일 볼루스 투여량(single bolus dose)으로 전달된다. 대안으로, STRO-1⁺ 세포-유래 상청액 또는 가용 인자, STRO-1⁺ 세포 또는 그 자손은 연속적 투입, 또는 예를 들어, 하루, 일 주, 또는 일주일에 1-7번의 시간간격의 투여량으로 투여된다. 예시적인 투여량 프로토콜(dose protocol)은 최대 투여량 또는 상당한 바람직하지 않은 부작용을 피하는 투여량 빈도를 포함한다. 총 주간 투여량은 사용되는 화합물/세포의 형태 및 활성에 달려있다. 적절한 투여량의 결정은 예를 들어, 당업계에서 치료에 영향을 주기 위해 지지되거나 치료에 영향을 주기 위해 예측되는 파라미터(parameters) 또는 공지된 인자를 사용하는 임상의(clinician)에 의해 만들어진다. 일반적으로, 투여량은 최적의 투여량보다 어느 정도 적은 양으로 시작하고 바람직한 또는 최적의 효과가 임의의 부작용에 대하여 달성되고나서 그 후에 작은 증분(increment)에 의해 증가된다.

본 발명의 발명자는 STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자에 의해 제공되는 치료적 이익이 환자에서 최소 4주간 관찰되는 것으로 나타난다. 따라서, 일부 실시예에서 세포는 일주일에 한번, 2주일에 한번, 매 3주일에 한번 또는 매 4주일에 한번 투여된다.

호흡기 질환의 진행의 치료 또는 지연에 관한 본 발명의 실시예에 따르면, STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손 세포 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자는 예를 들어, 당업계에 공지 및/또는 본원에 기재된 표준 방법을 사용하여, 다음의 장애의 진단에 투여된다.

호흡기 질환의 발병의 예방 또는 지연에 관한 이러한 실시예에서, STRO-1⁺ 세포 및/또는 그 자손 세포 및/또는 그로부터 유래된 가용 인자는 장애의 임상적 진단 전에 투여될 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명의 치료 방법은 투여 후(예, 7일에서 30일 이후) 폐 기능의 하나 또는 그 이상의 파라미터(parameters)에서 개선을 위한 치료받은 환자의 평가를 포함하는데 있어서, 폐 기능의 파라미터는 1초동안 강제 호기량(forced expiratory volume)(FEV1); 강제폐활량(forced volume vital capacity)(FVC); FEV1/FVC; 최대호기유량(peak expiratory flow)(PEF); 강제 호기유량(forced expiratory flow) 25%-50% 또는 25% 70%(호기의 중간 지점동안 폐에서 나가는 기체의 평균 유량); 강제 호기 시간(forced expiratory time)(FET); 총 폐용량(total lung capacity)(TLC); 폐확산능(diffusing capacity), 일산화탄소(carbon monoxide)(DLCO); 최대 환기량(maximum voluntary ventilation); 하나 또는 그 이상의 가슴 엑스레이, CT 스캔, MRI, 기관지 내시경 검사(bronchoscopy) 또는 유사한 스캔에서 감지가능한 개선(예, 폐의 모양에서 눈에 보이는 개선); 또는 혈액에서 감지가능한 이산화탄소 수준의 감지가능한 개선(예, 정상 범위 내에서의 CO₂ 수준의 움직임)이다. 일 실시예에서, 투여는 (1) 80% 또는 그 이상으로 예상되는; 또는 (2) 최소 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 50%의 하나 또는 그 이상의 폐 기능의 파라미터의 개선을 유발한다. 일 실시예에서, 투여 전, 동일한 신장과 체중의 개별에 대한 예상되는 수치의 80%보다 적은 임의의 파라미터의 확인 및 치료 후 상기 파라미터의 평가를 포함하는 방법에 있어서, 치료는 (1) 80% 또는 그 이상으로 예상되는; 또는 (2) 최소 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 50%의 상기의 하나 또는 그 이상의 폐 기능의 개선을 유발한다.

본 발명은 다음의 비-제한적인 실시예를 포함한다.

실시예

실시예 1: STRO -3 ⁺ 세포의 선택에 의한 MPCs 의 면역학적선택( Immunoselection of MPCs by Selection of STRO -3 ⁺ Cells)

골수(bone marrow, BM)는 건강한 정상 성인 지원자(20-35세)로부터 채취된다. 간략하게, BM의 40 ml는 후방 장골(posterior iliac crest)에서 리튬-헤파린 항응집제-함유 튜브(lithium-heparin anticoagulant-containing tubes)가 흡인된다.

BMMNC는 앞에서 기재된 바와 같이 Lymphoprep™(Nycomed Pharma, Oslo, Norway)을 사용한 밀도 구배 분리(density gradient separaion)에 의해 제조된다(Zannettino, A.C. et al. (1998) Blood 92: 2613-2628). 이어지는 400×g에서 30분 동안 4℃에서 원심분리(centrifugation) 후, 연층(buffy layer)은 트랜스퍼 피펫(transfer pipette)으로 제거되고 Hank's balanced salt solution(HBSS; Life Technologies, Gaithersburg, MD)로 구성되고, 5% 소태아혈청(fetal calf serum)(FCS, CSL Limited, Victoria, Australia)을 포함하는 "HHF"에서 세 번 세척된다.

STRO-3⁺ (또는 TNAP⁺)세포는 이전에 기재된 바와 같이 자기 활성 세포 분류법(magnetic activated cell sorting)에 의해 순차적으로 분리되었다(Gronthos et al. (2003) Journal of Cell Science 116: 1827-1835; Gronthos, S. and Simmons, P.J. (1995) Blood 85: 929-940). 간략하게, 대략 1-3×10⁸ BMMNC는 20분간 얼음에 있는 HHF 내의 10%(v/v) 정상 토끼 혈청(normal rabbit serum)을 포함하는, 블로킹 버퍼(blocking buffer)에서 배양된다. 세포는 1시간동안 얼음에 있는 블로킹 버퍼 내에서 STRO-3 mAb 10 ㎍/ml 용액의 200 ㎕와 배양된다. 세포는 순차적으로 400×g에서 원심분리(centrifugaion)에 의해 HHF에서 두 번 세척된다. HHF 버퍼 내에 있는 염소 항-마우스 γ-비오틴(anti-mouse γ-biotin)(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, UK)의 1/50 희석액(dilution)이 첨가되고 세포는 1시간동안 얼음에서 배양된다. 세포는 상기와 같이 MACS 버퍼(buffer)(1% BSA, 5 mM EDTA 및 0.01% 소듐 아자이드(sodium azide)가 보충된 Ca^{2 +}- 및 Mn^{2 +} -자유 PBS)에서 두 번 세척되고 0.9 ml MACS 버퍼의 최종 부피에서 재현탁(resuspended)된다.

100 ㎕ 스트렙트아비딘 마이크로비드(streptavidin microbeads)(Miltenyi Biotec; Bergisch Gladbach, Germany)는 세포 현탁액(cell suspension)에 첨가되고 얼음에서 15분동안 배양된다. 세포 현탁액은 두 번 세척되고 0.5 ml MACS 버퍼에서 재현탁되고 순차적으로 미니 MACS 컬럼(mini MACS column)(MS Columns, Miltenyi Biotec)에 로딩되고, STRO-3 mAb에 결합하지 않은 세포를 회수하기 위해 0.5 ml MACS 버퍼에서 세 번 세척된다(기탁 번호 PTA-7282의 2005년 12월 19일에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁된 것으로 국제 공개공보 No.WO 2006/108229를 참조하라). 추가로 1 ml MACS 버퍼를 첨가한 후에, 컬럼은 자석으로부터 제거되고 TNAP⁺ 세포는 양압(positive pressure)에 의해 분리된다. 각 분획에서 세포의 부분 표본은 스트렙트아비딘(streptavidin)-FITC로 염색되고 순도(purity)는 유세포 분석기(flow cytometry)로 평가된다.

실시예 2: STRO -3 mAb 에 의해 선택된 세포는 STRO -1 ^bright 세포이다(Cells Selected by STRO -3 mAb are STRO -1 ^bright Cells

실험은 STRO-1^bright세포를 분리하기 위한 단일 시약(single reagent)으로써 STRO-3 mAb를 사용하는 가능성을 확인하기 위해 설계되었다.

STRO-3(IgG1)은 STRO-1(IgM)의 다른 동형(isotype)이고, STRO-3의 클론형성(clonogenic) CFU-F를 확인하는 능력은 MACS를 사용하여 분리된 STRO-1⁺ 세포와 공동 발현된 것을 기반으로 한 2색 FACS 분석법(two-color FACS analysis)에 의해 평가된다(도 1). 점도표 히스토그램(dot plot histogram)은 리스트모드(listmode) 데이터로 수집된 5×10⁴의 이벤트(event)를 나타낸다. 수직 및 수평선은 동일한 조건으로 처리된 아이소타입(isotype)이 일치하는 대조군 항체인 1B5(IgG) 및 1A6.12(IgM)로부터 얻어진 평균 형광 1.0% 미만의 반응성 수준으로 설정되었다. 결과는 남아있는 STRO-1⁺ 세포가 STRO-3 mAb와 반응하는데 실패한 반면에 STRO-1^bright세포의 소수의 집단은 TNAP(1사분면)와 공동 발현됨을 입증한다. 모든 사분면에서 FACS에 의해 분리된 세포는 CFU-F의 발생 정도에 대해 순차적으로 분석되었다(표 1).

표 1: 세포 표면 마커 STRO-1 및 TNAP의 공동 발현을 기반으로 한 듀얼-컬러 FACS 분석법(dual-color FACS analysis)에 의한 인간 골수 세포의 증가(도 1을 참조). FACS로 분류된 세포는 20% FCS가 보충된 알파 MEM에서 표준 클론형성(clonogenic) 조건하에 배양되었다. 데이터는 14일간 플레이팅된(plated) 10⁵ 세포 당 콜로니-형성 세포(colony-forming cells)(CFU-F)의 평균 수±SE를 나타낸다(n=3 서로 다른 골수 천자액(bone marrow aspirates)). 이 데이터는 인간 MPC가 STRO-1 항원을 밝게 공동 발현한 BM의 TNAP 양성 분획물(positive fraction)에 독점적으로 제한되어 있다는 것을 시사한다.

실시예 3: 양의 천식의 양 모델에서 양 MPCs 의 치료 적용방법(Therapeutic Application of Ovine MPCs in a Sheep Model of Ovine Asthma)

3.1 방법

알러지성 천식의 집 먼지 진드기(house dust mite)(HDM) 양(sheep) 모델은 천식에 대한 MPCs의 효과를 연구하기 위해 선택되었는데 이는 인간에게 임상적으로 관련되어 있는 알레르겐(allergen)을 사용하기 때문이다. 다른 천식 모델은 결핍으로 고통받는다. 예를 들어, 알레르겐을 사용하는 마우스 OVA 유도 모델은 인간에게 임상적으로 관련되어 있지 않고, 폐 염증의 패턴 및 분포는 인간에게서 관찰되는 그것과 다르고, 폐와 실질 염증/개형(panchymal inflammation/remodeling)이 관찰되고, 기도 평활근에서의 큰 증가는 인간의 만성 천식(chronic asthma)에 대해 관찰되지 않는다. 유사하게, 천식의 아스카리스(Ascaris) 양 모델은 임상적으로 연관된 항원을 이용하지 않고 인간에게 정상적으로 노출되지 않은 알레르겐(ascaris suum)에 반응하는 비교적 약한 호산구성 반응(eosinophilic response)과 함께 강한 호중구성 반응(neutrophilic response)을 가진다.

천식은 2주 간격으로 백반(alum)과 함께 집 먼지 진드기 항원(house dust mite antigen)(50 ㎍)의 세 번의 피하 주사(subcutaneous injections)의 투여에 의해 양에서 시작되었다. 양은 ELISA에 의해 검출되는 높은 IgE 반응을 보여주고, "높은 IgE 반응"을 고려한 항원 투여 후에 1.5배 증가한 IgE 수준에서 선택된다.

7, 28 및 49일째에 양은 인공 호흡기(mechanical ventilator)에 연결된 분무기(nebulizer)를 사용하여 집 먼지 진드기 항원(house dust mite antigen)(200 ㎍/mL 항원을 함유한 5 mL)을 에어로졸 유도(aerosol challenges) 받았다. 인공 호흡기는 양에게 10분동안 분 당 20 호흡을 호흡할 수 있게 보조해줘서 각각의 양은 시험 당 에어로졸된(aerosolized) 항원의 200 호흡 투여량을 받았다. 이 유도는 양에서 천식성 및 염증성 반응을 유도하기에 충분한 것으로 앞서 밝혀졌다.

7, 28 및 49일째에 기관지 과민반응(bronchial hyperresponsiveness)은 기관지수축제 카르바콜(brochoconstrictor carbachol)의 농도를 증가시키는 투여량-반응(dose-response)을 계산함으로써 평가될 수 있다. 이 검사에 대해 예상되는 투여량 범위는 저항에서 100% 증가를 주는 에어로졸된 카르바콜(aerosolized carbachol) 1 mg/ml의 5-300 호흡 사이다.

초기 천식성 반응(early phase asthmatic responses)은 또한 기준치(baseline)(사전-항원 투여(pre-antigen administraion)) 값에 비교하여 항원 투여후에 저항에서 50%에서 900% 사이로 변화되는 반응의 예상되는 범위로 측정되었다.

양은 표 2에 나타난 것과 같이 네 그룹으로 임의로 추출될 수 있고, 이러한 모든 그룹은 생리학적 반응(physiological responses)의 유사한 범위에서 양을 포함한다. ProFreeze™/DMSO/αMEM에 있는 양의 MPCs는 식염수에서 희석됐고 63일째(세 번째 항원 에어로졸 유도(aerosol challenge)의 투여 후 2 주)에 관련 그룹에 투여되었다. 처리 프로토콜(treatment protocol)의 개요도가 도 3에 도시된다.

표 2: 처리군(treatment groups)

양의 MPCs는 정맥내 주입(intravenous infusion)(100mL/30 분)에 의해 경정맥(jugular vein)으로 투여되었다. 양은 집 먼지 진드기 알레르겐(house dust mite allergen)으로 다시 1에서 4주(70일째와 91일째, 각각)에 유도되었다.

폐 기능(초기 천식성 반응(early asthmatic response)[EAR]) 기준치(baseline)의 측정은, Koumoundouros et al., Exp . Lung Res., 32: 321-330, 2006에 의해 앞서 기재된 바와 같이, 식도(esophageal)와 기관(tracheal)의 압력과 기도 저항을 계산하기 위한 폐의 기류(airflows)를 측정함으로써 수행되었다. 이 프로토콜(protocol)에서, 벌룬 카테터(balloon catheter)는 식도의 압력(즉, 외부 압력)을 측정하기 위해 하부 식도에 비강으로(nasally) 삽입되었다. 내부 기도 압력을 측정하기 위해, 기관 카테터(tracheal catheter)는 비강으로 삽입된 기관내관(endotracheal tube)으로 위치시켰다. 기류(airflow)는 기관내관의 근위말단(proximal end)에 부착된 호흡유량계(pneumotachograph)(Hans Rudolph, Kansas City, USA)를 통해 측정되었다. 식도와 기관 카테터, 그리고 호흡유량계는 기류와 함께 경폐압(transpulmonary pressure)의 측정을 허용하는 차등 변환기(differential transducers)에 연결되었다. 이 기록에서 디지털 데이터는 Labview Pty Ltd 소프트웨어 프로그램에 맞춰져서, 숨 쉴때마다(한 호흡당, breath-by-breath basis) 기도 저항을 기록하기 위해 측정되었다. 알레르겐-유도 기관지수축(allergen-induced bronchoconstriction)은 HDM으로 에어로졸 유도(aerosol challenge)를 한 후에 특정 시간에 기도 저항 변화를 분석함으로써 양에서 측정되었다. 저항값은 초기 천식성 반응(early phase asthmatic response)(EAR)을 측정하기 위해, 이 유도 후 즉시 1시간 동안 기록되었고, 6시간 천식성 반응을 측정하기 위해 유도 후 6시간을 기록하였다. EAR에 대한 결과는 에어로졸된 식염수 유도(aerosolized saline challenge)를 한 후에 기준 저항값에서부터 HDM 유도 후 첫 번째 시간동안 최대 저항값까지 기도 저항에서의 변화율로 표현된다. LAR 데이터는 기준 저항값에서부터 HDM 유도 후 6 시간 측정된 평균 저항값까지 기도 저항에서의 변화율로 표현된다.

기관지 과민반응성(bronchial hyperresponsiveness)(BHR), 또한 기도 과민반응성(airway hyperresponsiveness)(AHR)은 비특이적 자극원에 대한 기도 폐쇄의 반응성의 측정이다. 천식성 기도(asthmatic airways)는 악명높게 불안하고(notoriously twitchy), 콜린성 아고니스트 카르바콜(cholinergic agonists carbachol) 및 메타콜린(methacholine) 같은 기관지수축제(bronchoconstricting agents)의 비교적 낮은 투여량에 반응한다. 양에서, BHR은 HDM 유도 기간의 개시 전과, 그리고나서 HDM 유도 몇 주 후에 측정되었다. 이는 두 배의 에어로졸 투여량(aerosol dose)(0.25%-4% w/v 카르바콜(carbachol)) 범위에서 기관지수축제 카르바콜(bronchoconstrictor carbachol)의 투여와 카르바콜의 각각의 투여 후에 즉시 기도 저항에서의 변화를 측정함으로써 달성되었다. 결과는 카르비콜의 기준치(baseline) 또는 최대 투여량이 달성된 기도 저항이 100%까지 증가하기 위해 필요한 카르바콜 에어로졸(carbachol aerosol)의 농도로 나타났다. 카르바콜 투여량의 투여되는 농도는 호흡 단위(BUs)로 측정되었다; 1 BU는 1% w/v 카르바콜의 1 호흡이다.

대략적으로 혈액의 20-30 mL는 7일 째(연구 시작 기준점) BHR 검사(2, 51, 72, 93일 째) 후 24시간동안 채취되었고 다음의 분석법이 수행되었다:

·혈액학(hematology) 및 응고(coagulation): 적혈구 세포 계수(red blood cell count)(RBC), 백혈구 세포 계수(white blood cell count)(WBC), 헤모글로빈(hemoglobin)(Hb), 적혈구 용적률(hematocrit), 혈소판(platelet), 호중구(neutrophils), 림프구(lymphocytes), 단핵구(monocytes), 호산구(eosinophils), 호염기구(basophils), 피브리노겐(fibrinogen).

·생화학(biochemistry): 나트륨(sodium), 칼륨(potassium), 염소(chloride), 중탄산염(bicarbonate), 글루코스(glucose), 크레아티닌(creatinine), 칼슘(calcium), 마그네슘(magnesium), 인산(phosphate), 총 단백질(total protein), 알부민(albumin), 총 빌리루빈(total bilirubin), 아스파르테이트 트랜스아미나제(aspartate transaminase)(AST), 알라닌 트랜스아미나제(alanine transaminase)(ALT), 감마-글루타밀 트랜스펩티다제(gamma-glutamyl transpeptidase)(GGT).

·사이토카인 검정(cytokine testing): 사이토카인(cytokines)(TNF-α 및 IFN-γ)

49일, 63일, 및 91일 째에 채취된 혈청 샘플(serum samples)은 표준 효소 면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay)(ELISA)에 의한 IgE의 존재에 대해 분석되었다.

기관지-폐포 세척액(broncho-alveolar lavage)(BAL) 세포는 기관지파이버스코프(fiber-optic bronchoscope)를 사용하고 BAL 세포 및 액체를 회수하여 왼쪽 폐로 10 mL 식염수를 흡인함으로써 채취되었다. BAL 세포는 다양한 백혈구 존재의 백분율을 확인하기 위해 Haem Kwik(HD Scientific Pty Ltd.) 염색으로 별도로 염색되었다. BAL은 7일 째(연구 시작 기준점) BHR 검사(2, 51, 72, 93일 째) 후 24시간동안 수행되었다.

동물은 펜토바르비톤 나트륨(pentobarbitone sodium)의 과다투여(overdose)를 사용하여 안락사시켰다(최소 200mg/kg; 즉 40 kg 양 당 400 mg/mL의 20 mL).

부검(necropsy) 및 조직 채취는 죽거나 안락사한 동물에게서 수행된다.

조식 샘플은 좌측 말단 폐 부위(left caudal lung field)에서 부검(93 일째)으로 채취되었고, 면역조직화학(immunohistochemistry)을 위해 액체 질소에 떠있는 알루미늄 트레이(aluminium trays)에 몰드(mold) 내의 배지에 끼워져있는(embedding) OCT에서 동결된다. 두 개의 조직 블록은 양의 폐마다 동결되었다(frozen per sheep lung). 동결된 구획(5 ㎛)은 양 세포 표면 분자 CD4, CD8, CD45R, γδ 및 IgE에 대한 mAbs를 사용하여 염색되었다. 호산구는 내생성 퍼옥시다제(endogenous peroxidase)로 조직 염색한 후에 확인되었고 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신-y(eosin-y)로 대조염색(counterstained)되었다. 개별의 세포들은 검사되고 실질(parenchyma), 기도 점막 고유층(airway lamina propria)과 각각의 양에 대한 외부 기도 벽에서 계수(count)되었고, 검사된 조직의 mm² 당 세포의 수로 표현되었다. 고밀도 세포 유형에 대해, 최소 100개의 세포가 각각의 구역에서, 200 배 배율(magnification)로, 세포 밀도를 확인하기 위해 계수되었다. 저밀도 세포 유형에 대해, 밀도는 완전한 구획의 모든 적절한 구역에서 취해진 겹쳐지지 않은 영역(nonoverlapping fields)에서 계산되었다. 모든 세포 식별(identification), 계수(counting), 및 밀도 계산은 처리군에서 맹검된(blinded) 관찰자에 의해 수행되었다.

3.2 결과

oMPC 또는 식염수의 단일 정맥내 주입 후 1에서 4주, 전처리에서 HDM- 감작된 천식성 양에서의 초기 천식성 반응(EAR)(Early phase asthmatic response(EAR) in HDM-sensitized asthmatic sheep at pre-treatment, 1 and 4 weeks after a single intravenous infusion of oMPC or saline)

1억 5천만 oMPCs를 받은 양은 4주 사후 oMPC 처리 시점에서 알레르겐 유도(allergen challenge) 후 시간동안 폐 기능이 상당히 증진되었다(도 4A, B & C). 4주 사후 oMPC 처리 시점에서 폐 기능의 증진은 사전-oMPC 처리 EAR에 비교했을 때 알레르겐 유도 후 EAR에서 57.1% 감소로써 나타났다(p<0.05(도 4A & C).

oMPC 또는 식염수의 단일 정맥내 주입 후 1에서 4주, 전처리에서 HDM- 감작된 천식성 양에서의 말기 천식성 반응( LAR )(Late phase asthmatic response( LAR ) in HDM-sensitized asthmatic sheep at pre-treatment, 1 and 4 weeks after a single intravenous infusion of oMPC or saline)

식염수 대조군은 전처리값에 비교했을 때 1주와 4주 시점에서 측정된 경우에 알레르겐 유도(allergen challenge) 후에 6 시간동안 LAR의 증가 경향을 보였다(도 5A). 2500만 oMPC 처리군은 전처리값에 비교했을 때 1주에서 6 시간동안 LAR의 유의한 감소와 관련이 있다(도 5A). 7500만 및 1억 5천만 oMPC 처리군은 전처리값에 비교했을 때 1주와 4주 시점에서 6 시간동안 LAR의 감소 경향을 모두 경험했다. 6 시간동안 LAR 처리군 사이에서 상대적인 변화를 보여주는 개요 그래프는 도 5B에 나타난다. 전처리에서부터 사후 처리까지의 변화율에 의한 LAR에서 상대적인 변화를 평가할 때, 2500만 oMPC 투여군에서 LAR의 변화율은 1주 시점에서 대조군과 비교하여 유의하게 증진되었다(p<0.05, 도 5B). 유사한 경향이 4주 사후 oMPC 처리 시점에서 6 시간동안 LAR에 대해 나타났다(도 5C).

oMPC 또는 식염수의 단일 정맥내 주입 후 1에서 4주, 전처리에서 천식성 양에서의 기관지 과민반응성( BHR )(Bronchial Hyperresponsiveness ( BHR ) in asthmatic sheep at pre-treatment, 1 and 4 weeks after a single intravenous infusion of oMPC or saline)

oMPC 대신에 식염수 비히클(vehicle) 처리를 받은 대조군은 1주와 4주 시점에서 BHR에 아무런 큰 변화를 경험하지 않았다(도 6A, B, C & D). 7500만 oMPC를 받은 양 그룹은 oMPC 처리 전에 측정된 BHR에 비교했을 때 1주와 4주 시점 사후 oMPC 처리에서 BHR 지수가 유의하게 증진되었다(도 6A). 사전 치료 1주에서 4주 시점 사이의 차이는 모든 처리군이 사후 분석법에서 함께 풀링되었을(pooled) 때 통계학적으로 유의했다(도 6D).

기관지폐포 세척액( BAL ) 유체 분석법: oMPC 또는 식염수의 단일 정맥내 주입 후 1에서 4주, 전처리에서 천식성 양에서의 BAL 유체에서 염증성 세포 프로파일( Bronchoalveolar lavage ( BAL ) fluid analysis: inflammatory cell profile in BAL fluid in asthmatic sheep at pre-treatment, 1 and 4 weeks after a single intravenous infusion of oMPC or saline)

기관지폐포 세척액(bronchoalveolar lavage)(BAL)은 oMPC나 식염수-대조 처리 후 1주와 4주에서 알레르겐 유도(allergen challenge) 후에 이틀간 샘플링되었다. 이 시도에서 사용되는 모든 양에서 알레르겐 유도 후와 줄기 세포 처리 전에 샘플링된 총 BAL 세포의 호산구의 평균 기준치 백분율은 4.5%이다. 알레르겐 유도 후와 줄기 세포 또는 식염수 처리 전에 2일 간 샘플링된 모든 양의 BAL에서의 호산구 평균 백분율(즉, BAL 호산구의 평균 사전처리 백분율)은 15.0%이다. 알레르겐 유도와 사후 oMPC 처리 후 2일 간 시험한 양에서 회수된 BAL 유체 내 호산구의 분석법은 전처리와 2500만 oMPCs가 주입된 양에 대한 1주 시점 사이에 상당한 차이가 있었다는 것을 나타냈다(도 7A & B). 7500만 및 1억 5천만 oMPC 처리군에 대해, 전처리와 1 및 4주 시점 사이에서 BAL 유체 내 호산구 수의 차이는 통계학적 유의성에 도달하지 않았다. 그러나, 1 및 4주 시점 모두에서 사전 및 사후-처리 BAL 호산구 사이에서의 차이는 모든 세 가지 처리값이 사후 분석법에서 풀링되었을(pooled) 때 통계학적으로 유의하였다(도 7E).

이 시험에서 사용된 모든 양에서 알레르겐 유도 후와, 줄기 세포 또는 식염수 처리 전에 이틀간 샘플링된 총 BAL 세포의 호중구의 평균 백분율은, 비교적 낮은 0.89%이다. BAL 유체 내 호중구의 백분율은 2500만 및 1억 5천만 oMPC 처리된 양에 대한 전처리 값에 비해, 1주 시점 사후 oMPC에서 상당히 더 낮았다(도 8A). 7500만 oMPC 군에 대해, BAL 유체 내 호중구의 백분율은 전처리 값에 비해, 4주 사후 oMPC 시점에서 상당히 더 낮았다(도 8A).

알레르겐 유도 후 2일 간 시험한 모든 양에서 회수된 BAL 유체 내 림프구와 대식세포의 사이토스팟(cytospot) 분석법은 BAL 유체 내 임의의 세포 유형에 대한 그룹 사이에 아무런 큰 변화가 없었다는 것으로 나타났다(도 9-10).

oMPC 또는 식염수의 단일 정맥내 주입 후 1에서 4주, 전처리에서 천식성 양의 혈청 내 HDM-특이 IgE(HDM-specific IgE in sera of asthmatic sheep at pre-treatment, 1 and 4 weeks after a single intravenous infusion of oMPC or saline)

알레르겐-유도 천식(allergen-induced asthma)이 알레르겐-특이 IgE와 관련이 있기 때문에, 모든 양의 혈청 내 순환하는 HDM-특이 IgE의 수준은 oMPC 투여 전에, 두 시점에서, 1주와 4주에서 oMPC 처리 후에 측정되었다(도 11A). 결과는 1억 5천만 oMPC 투여량이 HDM-특이 IgE 전처리 수준과 비교하여 oMPC 처리 1주일 후 상당히 감소한 HDM-특이 IgE에 효과가 있다는 것을 보여준다(도 11A). 2500만과 7500만 oMPC 처리는 HDM-특이 IgE 전처리 수준과 비교하여 oMPC 처리 4주일 후 HDM-특이 IgE가 상당히 감소했다. HDM-특이 IgE의 수준은 전처리 값에 비해 1주와 4주 시점에서 식염수-처리된 대조군 양에서 약간 떨어졌다; 그러나 이 차이는 유의하지 않았다(도 11A). 대조군 양과 전처리부터 1주와 4주 사후 처리까지 혈청 내 IgE 수준에서 변화율을 측정한 oMPCs의 다른 투여량이 주입된 양 사이의 비교는 도 11B & C에 나타난다.

폐 조직의 면역조직학적 분석: oMPC 또는 식염수의 단일 정맥내 주입 후 4주 천식성 양의 폐 내 염증성 세포 프로파일( Immunohistology analysis of lung tissue: inflammatory cellular profile in the lungs of asthmatic sheep 4 weeks after a single intravenous infusion of oMPC or saline)

면역화학염색(immunohistochemistry)은 시험된 양의 좌측 말단엽(left caudal lobe)에서 부검(autopsy)하여 샘플링된 폐 조직에서 수행되었다. 세포 표면 항체 마커의 패널은 CD4, CD8, 및 γδ-양성 T 세포 하위집합(γδ-positive T cell subsets), CD45R-양성 세포(positive cells), 및 (비만 세포를 확인하는)IgE-양성 세포(positive cells)를 확인하기 위해 조직 구획에서 사용되었다. 호산구는 퍼옥시다제-양성 염색 세포(peroxidase-positive staining cells)로 확인되었다. 이러한 세포 유형의 상대적인 밀도는 페포 공간 및 폐포벽과 같은 비-기도 조직에 포함된 실질(parenchyma); 내강 상피(luminal epithelium)와 기도 평활근 다발의 내부 경계 사이의 기도벽 영역에서 세포 밀도 분석이 제한된 기도벽의 점막고유층(lamina propria); 및 기도 내강 상피(airway luminal epithelium)와 폐포 경계의 외부 외막 사이의 밀도 계수(density counts)가 포함된 전체 기도벽을 포함하는 세 개로 분리한 폐 위치에서 측정되었다.

1억 5천만 oMPC로 처리된 양의 기도벽에서 호산구 밀도를 가리키는 천식성 양에서 샘플링된 폐 조직 구획에서 퍼옥시다제-양성 호산구(peroxidase-positive eosinophils)의 분석은 식염수-처리된 대조군 양(p<0.05)의 기도벽 내 호산구 밀도에 비해 상당히 낮았다. 전체적으로, 부검 4주 전에 주어진 1억 5천만 oMPC 투여량 처리를 나타내는 이러한 데이터는 알레르겐(allergen)에 노출된 기도벽 내 퍼옥시다제-양성 호산구의 낮은 밀도와 관련이 있었다.

조직병리학적 분석: oMPC 또는 식염수의 단일 정맥내 주입 후 4주 천식성 양의 폐 내로의 호산구 침윤 및 24 시간 후 이어지는 HDM 재유도( Histopathology analysis: eosinophil infiltration in the lungs of asthmatic sheep 4 weeks after a single intravenous infusion of oMPC or saline and 24 hours following re-challenge with HDM)

폐 조직은 호산구 과립(eosinophil granules)을 특유의 붉은색으로, 배경 조직은 푸른색으로 염색함으로써 호산구를 확인하는 Luna 조직학적 분석법(Luna histological method)으로 염색되었다.

세기관지 내강 파편(bronchiolar luminal debris)/호산구 및 앞쪽(cranial) 폐와 말단(caudal) 폐 내의 호산구의 폐확장부전(atelectasis)의 결과 분석은 대조군과 처리군 동물 사이에서 유의적인 차이를 드러내지 않았다. 대조군 양과 처리군 양의 앞쪽 및 말단 폐엽(lung lobes) 내 결과의 분석은 그룹 C의 동물(즉, 1억 5천만 oMPC 처리된 양) 내 Luna-양성 호산구(Luna-positive eosinophils)의 감소 경향을 나타냈다. 앞쪽 좌측 폐엽(cranial left lung lobe)에서, Luna-양성 호산구를 보이는 양의 수의 발생정도(incidence)는 대조군 내 양 5마리에서 1억 5천만 oMPC 처리군 내에서 양 3마리로 감소하였다. 앞쪽 우측 폐엽(cranial right lung lobe)에서, Luna-양성 호산구를 보이는 양의 수의 발생정도는 대조군 내 양 5마리에서 1억 5천만 oMPC 처리군 내에서 양 4마리로 감소하였다. 말단 좌측 폐엽(caudal left lung lobe)에서, Luna-양성 호산구를 보이는 양의 수의 발생정도는 대조군 내 양 5마리에서 1억 5천만 oMPC 처리군 내에서 양 3마리로 감소하였다. 말단 우측 폐엽(caudal right lung lobe)에서, Luna-양성 호산구를 보이는 양의 수의 발생정도는 대조군 내 양 4마리에서 1억 5천만 oMPC 처리군 내에서 양 2마리로 감소하였다. 2500만 및 7500만 oMPC 투여군과 대조군 사이의 Luna-양성 호산구를 보이는 양의 수의 발생정도에서는 차이가 없었다.

사후 분석은 1억 5천만 oMPC 투여가 대조군에 비해 Luna-양성 호산구의 존재의 전체적인 감소에서 더 효과가 있는지 측정하기 위해 수행되었다. 이 분석법은 각각 4개의 피검된(examined) 폐엽에 대해 염색한 눈에 띄는 Luna-양성 호산구를 보이는 양의 수를 추가함으로써 수행되었다. 이 분석법은 식염수-처리된 대조군과 비교하여 1억 5천만 oMPC 처리군에서 병리학적(pathology)으로 Luna-양성 호산구를 보이는 양의 낮은 수가 있다는 것을 보여주었다.

3.3 토의

본 연구는 천식의 양 모델(ovine model)에서 oMPC 치료의 안정성과 효능을 평가하였다. 사전-면역 수준(pre-immunization levels)에 비해, 혈청에서 HDM-특이 IgE 항체의 높은 수준을 가진 양은, HDM으로 기도를 감작시키기 위해 6주가 넘는 기간동안 HDM으로 세 번의 폐 전체 에어로졸 유도(aerosol challenges)가 주어졌다. 양은 무작위로 4 그룹으로 할당되었고 식염수(대조군), 또는 IV 주입에 의한 oMPC 처리군(2500만,7500만 또는 1억 5천만 oMPC)의 세 가지 투여량 중 하나로 주어졌다. 양은 각각의 oMPC 또는 식염수 처리 후 7일과 28일째에 HDM으로 재유도되었다(re-challenged). 폐기능과 BAL 세포 분석은 앞서 나타난 시점에서 HDM 재유도 직후에 측정되었다. 2500만, 7500만 또는 1억 5천만 oMPC에서 IV 주입은 잘 받아들여졌고(well tolerated) 이 세포들의 투여와 관련된 부작용이 없었다.

본 연구에서, oMPC 단일 투여의 i.v. 주입은 일반적으로 대조군 양에 비해 알레르겐 유도(allergen challenge)에 낮은 중증의 생리학적 반응과 관련이 있다. 예를 들어, 1억 5천만 oMPC 처리 후 4주에서 EAR 폐 기능 반응의 통계학적으로 유의한 감쇠(attenuation)가 발생했다. 흥미롭게도, EAR에서 유의한 감소는 지연되었고 1억 5천만 oMPC 처리군 내 4주 사후-MPC 처리에서 관찰되었다. 어떠한 이론이나 작용 방식에 얽매이지 않고, 이 지연된 효과는 잠재적으로 막 결합 비만 세포 알레르겐-특이 IgE(membrane bound mast cell allergen-specific IgE)의 긴 반감기(half-life) 때문이다. 이는 결국 비만 세포에서 알레르겐-특이 IgE가 흘러나온 이후에, MPC가 궁극적으로 oMPC 처리 후 4주에서 EAR에서의 감소를 유발시키는 비만 세포의 탈과립(degranulation)을 감소시킬 수 있다는 것을 나타낼 수 있다.

모든 세 개의 oPMC 처리군은 일반적으로 대조군에 비해 사후 oMPC 처리 1주에서 LAR 폐 기능 지수가 감쇠되었다(attenuated). 세 개의 다른 oMPC 투여량에서 풀링된(pooled) 데이터의 분석은 1주와 4주 사후-처리 시점에서 식염수-처리된 대조군 양에 비해 BHR 폐 기능 지수가 통계학적으로 유의하게 개선된 oMPC 처리군을 보여준다. 그래서, oMPC-처리된 양에 대한 BHR 폐 기능 지수의 개선은 oMPC 주입 후 4주에 대해 지속적으로 나타났다. 이는 oMPC 주입의 유의한 처리 효과가 4주 시점에서 명백하다는 것을 나타내는 1억 5천만 투여군에서의 EAR 데이터의 해석과 일치한다.

어떠한 이론이나 작용 방식에 얽매이지 않고, 실험적 천식의 양 내 폐 기능이 개선된 oMPC의 효과는, 최소 부분적으로, 이러한 oMPC-처리된 동물의 기도벽 내 호산구의 다소 낮은 밀도와 관련될 수 있다. 기도벽 내 호산구의 조직 밀도의 맹검된 형태계측학적 분석(blinded morphometric analyses)은 식염수-처리된 대조군 양에 비해 1억 5천만 oMPC 처리군이 유의하게 낮은 조직 호산구의 밀도를 가지는 것을 보여주었다. 게다가, 가장 높은 oMPC 투여량은, 분석에 대한 모든 형태계측학적 데이터(morphometric data)가 oMPC 단일 투여 후 4주 부검에서 수집된 것을 고려하면, 4주 연구 기간동안 기도 호산구 밀도의 감소에 효과적이었다.

결과는 oMPC 처리군이 BAL 유체 내 호중구의 낮은 수준과 관련이 있다는 것을 보여준다. 처리 전 모든 시험된 양(trial sheep)에서 알레르겐 유도(allergen challenge) 후 이틀간 총 BAL 세포의 호중구의 평균 백분율은 0.89%이다. 이러한 상대적으로 낮은 백분율에서, 2500만 및 1억 5천만 oMPC 처리는 1주 시점 사후 oMPC에서 50% 이상으로 BAL 내 호중구 퍼센트를 효과적으로 감소시켰다. oMPC 투여 후 4주 시점 후에, 7500만 oMPC 처리는 BAL 내 호중구를 유의적으로 감소시켰다. BAL 유체와 기도벽의 호중구의 존재는 천식의 특정 표현형(phenotype)의 병리(pathology)와 관련이 있다.

본 연구에서 사용된 모든 양은 HDM으로 지엽적인 면역처리(peripheral immunizations)의 완료 후 7일동안 혈청 내 HDM-특이 IgE 항체의 높은 수준을 기반으로 한 실험에서 선택되었고, 그러므로 오직 감작된(sensitized) 양만이 본 연구에서 사용되었다. oMPC 처리가 알레르겐-특이 IgE 항체를 감쇠시키고(attenuates) 2500만이나 7500만 oMPC의 단일 주입 후 4주동안 효과가 유지되는 것을 보여주는 결과는 주목할만하다. 1억 5천만 oMPC 처리군에서, IgE의 감소(dampening)는 1주 사후 oMPC에서 유의적이었고 4주 샘플링 시점에서 감소되었다. 식염수-처리된 대조군 양은 전처리값과 비교하여 1주나 4주 시점에서 혈청 HDM-특이 IgE의 수준의 유의한 감소를 보이지 않았다.

Claims (26)

1. STRO-1^bright 다능성 세포가 증가된(enriched) 세포 집단(population)또는 이의 배양 세포를 포함하는, 인간 개체에 투여하기 위한 (i) 호흡기 질환, (ii) IgE-매개 알러지 및 (iii) 알레르겐에 대한 알러지 반응으로 구성된 군에서 선택된 질환의 치료 또는 예방용 의약 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 급성 호흡기 질환 또는 만성 호흡기 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 염증성 호흡기 질환이고, 폐색성 호흡기 질환 또는 제한성 호흡기 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 호흡기 질환 또는 알러지는 폐색성 호흡기 질환 또는 알러지 또는 염증성 폐질환 또는 알러지인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 천식은 급성 천식, 만성 천식, 중증 천식 또는 난치성 천식인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 천식은 지속성 베타 아고니스트(long acting beta agonist, LABA) 난치성 천식 또는 스테로이드(steroid) 난치성 천식인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
8. 제3항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 제한성 호흡기 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 특발성 폐섬유증인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
10. 제1항에 있어서, 상기 질환은 집 먼지 진드기 알레르겐(HDM)에 대한 알러지이거나 상기 알레르겐이 HDM인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
11. 삭제
12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 전신 투여용 조성물.
    
13. 제12항에 있어서, 정맥내 투여 또는 비강내 투여용 조성물.
    
14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 복수회 투여용 조성물.
    
15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 다음의 하나 또는 그 이상이 발생할 때 상기 집단 또는 상기 배양 세포의 추가 투여량을 포함하는 조성물:
    (i) 환자가 천명(wheeze) 또는 기침 또는 가슴 통증 또는 호흡곤란을 지속적으로 시작한다;
    (ii) 환자를 폐활량계로 측정했을 때 다음의 하나 또는 그 이상이 나타난다:
    a) 최소 2주동안 일주일에 적어도 3일간 20%의 차이;
    b) 다음의 치료로 최대 호기량(peak flow)의 20% 이상 향상:
    β-작용제를 10분간 흡입; 또는 코르티코스테로이드(corticosteroid)를 6주간 흡입; 또는 프레드니솔론(prednisolone) 30 mg 14일 복용,
    c) 트리거(trigger)에 노출된 후 이어지는 최대 호기량에서 20% 이상 감소;
    (iii) 비정상 세포 또는 외부 물질 또는 환자의 기도폐색을 보여주는 기관지 내시경 검사; 또는
    (iv) 폐 혈관의 이상, 폐에서 혈액이나 유체의 축적, 기관지 확장증, 흉막 삼출증 또는 폐렴을 보여주는 흄부 CT 스캔.
    
16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 다음의 하나 또는 그 이상을 달성하기에 충분한 상기 세포 집단의 투여량을 포함하는 조성물:
    (i) 기관지 과민반응의 개선;
    (ii) 폐 또는 기관지 폐포 세척액의 호산구 침윤 감소;
    (iii) 폐 또는 기관지 폐포 세척액의 호중구 침윤 감소;
    (iv) 말기 천식 반응의 감소;
    (v) 초기 천식 반응의 감소; 또는
    (vi) 폐 개형/섬유증의 감소.
    
17. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 1×10⁶내지 150×10⁶의 STRO-1^bright 세포 또는 이의 배양 세포를 함유하는 조성물.
    
18. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 STRO-1^bright 세포 또는 이의 배양 세포의 전신 투여량을 포함하는 조성물.
    
19. 제18항에 있어서, 상기 전신투여량은 10 mL의 150×10⁶ STRO-1^bright 세포 또는 이의 배양 세포인 조성물.
    
20. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단은 타가(allogeneic)인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
21. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단은 배양 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
22. 삭제
23. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 담체(carrier) 또는 부형제(excipient)를 포함하는 조성물.
    
24. 인간 개체에서 (i) 호흡기 질환, (ii) IgE-매개 알러지 및 (iii) 알레르겐에 대한 알러지 반응으로 구성된 군에서 선택된 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, STRO-1^bright 다능성 세포가 증가된 세포 집단 또는 이의 배양 세포.
    
25. STRO-1^bright 다능성 세포가 증가된 세포 집단 또는 이의 배양 세포를 포함하는, 인간에 투여하기 위한 STRO-1^bright 다능성 세포가 증가된 세포 집단 또는 이의 배양 세포를 포함하는, 인간에 투여하기 위한 (i) 호흡기 질환, (ii) IgE-매개 알러지, 및 (iii) 알레르겐에 대한 알러지 반응으로 구성된 군에서 선택된 질환의 치료 또는 예방용 약제의 제조를 위한 조성물.
    
26. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단은 자가(autogeneic)인 것을 특징으로 하는 조성물.
    

Images