CN103841983B - 治疗或预防神经性疾病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于治疗炎症性神经性疾病的方法，其包括施用富含STRO‑¹⁺细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。

Description

治疗或预防神经性疾病的方法

相关申请

本申请要求于2011年6月3日提交的名称为“Methods of treating orpreventing neurological diseases”的美国专利申请号61/493,073的优先权。所述申请的全部内容以引用的方式并入本文。

序列表

序列表与本申请一起以电子形式提交。所述序列表的全部内容以引用的方式并入本文。

领域

本发明涉及用于治疗或预防神经性疾病的方法。

背景

炎症性神经性疾病是一类病状，其中受试者的免疫系统靶标或攻击神经性的组分。这些疾病可以由免疫系统攻击，例如，神经元、施旺细胞或神经性髓磷脂或神经递质的其它细胞来产生。在一些病例中，炎症性神经性疾病可以是现有疾病的并发症或组分，例如，示例性炎症性神经性疾病包括多发性硬化症、系统性红斑狼疮(SLE)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、兰伯特-伊顿肌无力综合征(Lambert-Eaton myasthenicsyndrome)、重症肌无力、横贯性脊髓炎、脑白质营养不良或多灶性白质脑病。

MS是比较常见的炎症性神经性疾病之一。它是人中枢神经系统(CNS)的炎症性和脱髓鞘退行性疾病。它是世界性疾病，仅在美国就影响了大约300,000人。受MS影响的大多数人(约70%-80%的病例)显示出在20岁与40岁之间发病。MS是基于临床过程、磁共振成像(MRI)扫描评价以及活检和尸检材料的病理学分析的异质性病症。疾病表现为缺陷的大量可能的组合，包括脊髓、脑干、颅神经、小脑、大脑以及认知综合征。进行性残疾是患有MS的大多数患者的命运。约一半的MS患者在疾病发病的15年内需要手杖来行走。

在大部分病例(约80%)中，MS呈现出临床复发，其特征在于完全或部分可逆的病灶性神经缺陷。MS的这种形式被称为复发缓解型MS(RRMS)，并且是由炎症和水肿主导的。CNS的活动性炎症在MRI上显现为钆增强白质病变。在约39年的中值后，约一半的RRMS病例在没有如由MRI检测的临床复发或新的脑白质病变的情况下，逐渐积累不可逆的神经缺陷。疾病的这一阶段称为继发进展型MS(SPMS)或慢性疾病。没有呈现RRMS的20%患者呈现出疾病从发病的进行性临床恶化，其称为原发进展型MS(PPMS)，是慢性疾病的另一种形式。

目前，急性MS复发通常使用高剂量、短期静脉内皮质类固醇治疗。这种治疗缩短复发持续时间，但是不改善疾病的恢复程度或长期过程。目前存在美国批准的若干许可的疾病改善疗法，其意在降低临床复发速率、延长到下一次复发的时间和/或减少MRI上新病变的积累。然而，这些疗法仅仅对治疗MS中度有效，特别是在复发-缓解阶段。这些治疗也仅仅延缓疾病的进展，并不会引起髓鞘再生。

SLE是影响机体中不同器官系统的炎症性疾病。患有SLE的受试者可以发展多种神经性病症，如头痛、人格改变、器质性脑综合征、周围神经病变、感觉神经病变、包括妄想症、躁狂症和精神分裂症的精神异常、癫痫、横贯性脊髓炎以及瘫痪和中风。一些这些变化可以通过抗磷脂抗体(例如，抗心磷脂抗体)产生，其可以结合到中枢神经系统的细胞上并且扰乱功能和/或血栓形成。

对狼疮的常规药理学治疗包括皮质类固醇或免疫抑制药物的使用，两者都具有不当副作用并且仅仅在症状发生时治疗。

其它炎症性神经性疾病使用，例如，免疫抑制药物、皮质类固醇、血浆去除法或静脉内免疫球蛋白来治疗，每种所述治疗都冒着感染或其它不良副作用的风险。

因此，对于本领域的技术人员来说将显而易见，在本领域中对于治疗炎症性神经性疾病有用的新疗法存在需要。

概述

发明人已研究了STRO-1⁺多能细胞制剂在炎症性神经性疾病(即，慢性麻痹性实验性炎症性脑脊髓炎(EAE))的公认动物模型中的效果。发明人发现在诱发EAE后施用STRO-1⁺细胞降低了疾病的严重程度。

发明人还发现STRO-1⁺细胞预防了由获自先前用抗原免疫的动物的T细胞进行的针对抗原的免疫反应。

本发明提供了一种用于治疗或预防炎症性神经性疾病的方法，所述方法包括对受试者施用富含STRO-1⁺细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。

在一个实施例中，炎症性神经性疾病与T细胞对炎症性刺激的反应有关或由其产生。

在一个实施例中，所述方法包括施用富含STRO-1^亮细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。

在一个实施例中，炎症性神经性疾病是选自由以下组成的组：多发性硬化症、系统性红斑狼疮、格林-巴利综合征、兰伯特-伊顿肌无力综合征、重症肌无力、横贯性脊髓炎、脑白质营养不良和进行性多灶性白质脑病。

在一个实施例中，疾病是系统性红斑狼疮。

在另一个实施例中，疾病是多发性硬化症。在一个实施例中，疾病是多发性硬化症的慢性进行性形式。在另一个实施例中，疾病是多发性硬化症的复发缓解形式。

在一个实施例中，方法包括施用富含STRO-1^亮细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。在一个实施例中，子代额外富含STRO-1^亮细胞。

示例性细胞和/或子代额外表达组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)和/或热休克蛋白90β(HSP90p)和/或CD146。

在一个实施例中，细胞群获自骨髓或牙髓。

在一个实施例中，富含STRO-1⁺细胞的群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子是全身性地施用。例如，富含Stro-1⁺细胞的细胞群和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子可以静脉内、主动脉中、肌内、皮下地施用至主动脉中、施用至心脏的心房或心室中或施用至连接到受炎症性神经性疾病影响的器官的血管中。例如，群和/或子代和/或可溶性因子是静脉内施用。

在另一个实施例中，富含STRO-1⁺细胞的群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子是施用至脑脊髓液中或施用至中枢神经系统中。

在另一个实施例中，富含STRO-1⁺细胞的群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子是施用至疾病部位，例如，施用至髓磷脂变性部位。

在复发缓解型疾病(例如，复发缓解型MS)的情况下，可以在疾病复发期间施用细胞以预防或延迟疾病的复发。

在一个实施例中，方法包括施用有效量的富含STRO-1⁺细胞的群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。在一个实施例中，有效量是足以增加受试者和/或发病部位处的调节性T(Treg)细胞数量的量。

本文根据任何实施例描述的示例性方法包括施用足以改善炎症性神经性疾病的临床测量和/或减少或预防针对与炎症性神经性疾病相关的抗原的免疫反应的剂量的群和/或子代和/或可溶性因子。

在一个实施例中，方法包括施用有效剂量或治疗有效量的群和/或子代和/或可溶性因子。

在一个实施例中，方法包括施用每公斤1×10⁴至5×10⁶个之间的STRO-1⁺细胞和/或其子代。例如，方法包括施用每公斤约1×10⁵至1×10⁶个STRO-1⁺细胞和/或其子代。例如，方法包括施用每公斤2×10⁵至8×10⁵个STRO-1⁺细胞和/或其子代。例如，方法包括施用每公斤约2×10⁵个STRO-1⁺细胞和/或其子代或每公斤约4×10⁵个STRO-f细胞和/或其子代或每公斤约8×10⁵个STRO-1⁺细胞和/或其子代。

在一个实施例中，本文根据任何实施例描述的方法包括施用低剂量的STRO-1⁺细胞和/或其子代。例如，低剂量的STRO-1⁺细胞和/或其子代包含每公斤1×10³与3×10⁵个之间的STRO-1⁺细胞和/或其子代。

在一个实施例中，群和/或子代和/或可溶性因子施用多次。例如，群和/或子代和/或可溶性因子是一周多次或每四周或更多周一次地施用。

在一个实施例中，群和/或子代和/或可溶性因子是在炎症性神经性病状的缓解期间施用。

在另一个实施例中，富含STRO-1⁺细胞的群和/或其子代是遗传工程改造的以表达阻断T细胞刺激的分子和/或可溶性因子是来自所述遗传修饰细胞的。

在另一个实施例中，富含STRO-1⁺细胞的群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子与化合物一起施用以阻断T细胞的刺激。

富含STRO-1⁺细胞和/或子代细胞的群可以是自体的或异体的和/或可溶性因子可以获自自体或异体细胞。在一个实施例中，细胞和/或子代细胞的群是异体的和/或可溶性因子是获自异体细胞。

在一个实施例中，富含STRO-1⁺细胞和/或子代细胞的群已在施用之前和/或在获得可溶性因子之前经过培养扩增。

在另一个实施例中，本文描述的方法进一步包括施用免疫抑制剂。免疫抑制剂可以施用足以允许所述移植细胞具有功能的时间。

本发明还提供一种用于预防对抗原响应的免疫反应的方法，方法包括对受试者施用富含STRO-1⁺细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。

在一个实施例中，免疫反应是T细胞介导的免疫反应。示例性T细胞介导的免疫反应包括T细胞增殖。

在一个实施例中，对特异性抗原响应抑制了T细胞介导的免疫反应并且对另一种抗原响应的T细胞介导的免疫反应没有被抑制。

在一个实施例中，受试者之前已产生了对抗原的免疫反应，并且群、子代和/或可溶性因子抑制了对抗原的进一步免疫反应。

在一个实施例中，在受试者产生对抗原的免疫反应之后施用群、子代和/或可溶性因子，免疫反应以由此预防对抗原的进一步免疫反应。

在一个实施例中，在施用富含STRO-1⁺细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子后，免疫反应被抑制至少约24天。

本发明还提供一种用于诱导受试者对抗原的耐受性的方法，方法包括对受试者施用富含STRO-1⁺细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。

在本文描述的方法的一个实例中，抗原或特异性抗原是针对其产生炎症性反应的抗原。例如，炎症性反应是炎症性神经性疾病的产生原因。

在本文根据任何实施例描述的方法的一个实例中，富含STRO-1⁺细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子与治疗或预防炎症性神经性疾病的化合物一起施用。示例性化合物是醋酸格拉替雷和/或β干扰素。

化合物可以与群和/或子代和/或可溶性因子混合或同时施用和/或在群和/或子代和/或可溶性因子之前或之后施用(例如，使得化合物和群和/或子代和/或可溶性因子同时提供效益)。

本发明还提供一种富含STRO-1⁺细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子，用于治疗或预防炎症性神经性疾病和/或用于抑制T细胞介导的针对抗原的免疫反应和/或用于诱导对抗原的耐受性。

本发明还提供了富含STRO-1⁺细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子的用途，其用于制造用于治疗或预防炎症性神经性疾病和/或用于抑制T细胞介导的针对抗原的免疫反应和/或用于诱导对抗原的耐受性的药物。

本发明的每个实施例应理解为在作了必要修改的情况下适用于减少、延迟或预防髓磷脂破坏和/或针对髓磷脂或其组分的炎症性反应的方法。

本发明的每个实施例应理解为在作了必要修改的情况下适用于神经系统或其组分中的炎症。

本发明的每个实施例应理解为在作了必要修改的情况下适用于诱导或促进髓鞘再生或轴突外生长的方法。

附图简要说明

图1.TNAP(STRO-3)和间充质前体细胞标志物STRO-1^亮在成人骨髓单核细胞(BMMNC)中的共表达。通过孵育MACS选择的BMMNC并用与FITC偶合的山羊抗鼠类IgM抗体间接标记的STRO-l(x轴)和用与PE偶合的山羊抗鼠类IgG间接标记的STRO-3mAb(鼠类IgG1)(y轴)进行双色免疫荧光和流式细胞术。点阵直方图表示以列表模式数据形式收集的5×104个事件。垂直线和水平线设定为小于用在相同条件下处理的同种型匹配对照抗体1B5(IgG)和1A6.12(IgM)获得的平均荧光的＜1.0%的反应性水平。结果表明STRO-1^亮细胞的较小群体共表达TNAP(右上象限)，而其余STRO-1⁺细胞未能与STRO-3mAb反应。

图2.培养和扩增的STRO-1^亮MPC的STRO-1^亮或STRO-1^暗子代的基因表达谱。通过胰蛋白酶/EDTA处理制备离体扩增的骨髓MPC的单细胞悬浮液。将细胞用STRO-1抗体染色，所述STRO-1抗体随后通过与山羊抗鼠类IgM-异硫氰酸荧光素一起孵育加以显现。在荧光活化细胞分选之后，由经过纯化的STRO-1^暗或STRO-1^亮表达细胞的群来制备总细胞RNA(A)。使用RNAzolB提取方法和标准程序，从各子群体分离总RNA并且用作cDNA合成的模板。使用如前所述的标准方案(Gronthos等J Cell Sci.775:1827-1835,2003)，通过PCR扩增来评价多种转录物的表达。此研究中所使用的引物组在表2中示出。扩增后，通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳对各反应混合物进行分析，并且通过溴化乙锭染色来显现(B)。使用ImageQant软件，参考管家基因GAPDH的表达，来评价各细胞标志物的相对基因表达(C)。

图3.培养和扩增的STRO-1⁺MPC的STRO-1^亮子代表达高水平的SDF-1、STRO-1^暗子代则不能。(A)使用FACS根据区域STRO-1^亮和STRO-1^暗/深，将通过MACS分离的STRO-1⁺BMMNC的制备物划分为不同的STRO-1子集。从各STRO-1子群制备总RNA并且所述总RNA用于构建STRO-1^亮消减杂交文库(B-C)。复制硝酸纤维素滤膜，所述硝酸纤维素滤膜已用由使用STRO-1^亮消减的cDNA转化的细菌克隆所扩增的代表性PCR产物印迹。接着使用[³²P]三磷酸脱氧胞苷(dCTP)标记的STRO-1^亮(B)或STRO-1^暗/深(C)消减的cDNA来探测滤膜。箭头指示含有对应于人SDF-1的cDNA片段的1个克隆的差异表达。(D)逆转录酶(RT)-PCR分析显示出由培养前通过MACS/FACS新鲜分离的BMMNC STRO-1群体制备的总RNA中的SDF-1和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)转录物的相对表达。bp表示碱基对。

图4是示出MPC治疗对慢性进行性EAE模型的平均临床疾病评分的效果的图形表示。使用MOG35-55在0天使C57BL/6小鼠免疫，然后在疾病诱发后，在8、10和12天使用静脉内注射MPC来治疗。表示出MPC的剂量。

图5是示出MPC治疗诱导慢性进行性EAE的累积病情指数(平均临床疾病评分的曲线下总面积分析)的剂量依赖性降低的图形表示。

图6是示出与使用MOG35.55刺激后未受刺激的脾细胞相比，从使用MOG35.55免疫的小鼠中分离的脾细胞的增殖的倍数变化的图形表示。

图7是示出与使用PMA/离子霉素非特异性再刺激后未受刺激的脾细胞相比，从使用MOG35.55免疫的小鼠中分离的脾细胞的增殖的倍数变化的图形表示。

序列表注释

SEQ ID NO:1，用于扩增编码GAPDH的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:2，用于扩增编码GAPDH的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:3，用于扩增编码SDF-1的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:4，用于扩增编码SDF-1的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:5，用于扩增编码IL-Iβ的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:6，用于扩增编码IL-Iβ的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:7，用于扩增编码FLT-1的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:8，用于扩增编码FLT-1的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:9，用于扩增编码TNF-a的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:10，用于扩增编码TNF-a的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:11，用于扩增编码KDR的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:12，用于扩增编码KDR的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:13，用于扩增编码RANKL的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:14，用于扩增编码RANKL的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:15，用于扩增编码瘦素的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:16，用于扩增编码瘦素的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:17，用于扩增编码CBFA-1的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:18，用于扩增编码CBFA-1的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:19，用于扩增编码PPARy2的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:20，用于扩增编码PPARy2的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:21，用于扩增编码OCN的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:22，用于扩增编码OCN的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:23，用于扩增编码MyoD的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:24，用于扩增编码MyoD的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:25，用于扩增编码SMMHC的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:26，用于扩增编码SMMHC的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:27，用于扩增编码GFAP的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:28，用于扩增编码GFAP的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:29，用于扩增编码巢蛋白的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:30，用于扩增编码巢蛋白的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:31，用于扩增编码SOX9的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:32，用于扩增编码SOX9的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:33，用于扩增编码X型胶原的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:34，用于扩增编码X型胶原的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:35，用于扩增编码聚集蛋白聚糖的核酸的寡核苷酸

SEQ ID NO:36，用于扩增编码聚集蛋白聚糖的核酸的寡核苷酸详细描述

通用技术和选定的定义

在本说明书中，除非另有特别说明或上下文另有要求，否则提及单个步骤、物质的组合物、步骤的组或物质组合物的组应视为包括那些步骤、物质组合物、步骤的组或物质组合物的组中的一个或多个(即，一个或多个)。

除非特别声明，否则本文描述的每个实施例在作必要的修改的情况下适用于本发明各个和每个其它实施例。

本领域的技术人员应了解，本发明容许具体描述的内容以外的变化和修改。应理解，本发明包括所有这些变化和修改。本发明还包括在本说明书中个别地或共同地提及或指示的所有的步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何和所有组合或其任何两者或多者。

本发明的范围不受本文描述的具体实施例限制，所述实施例意欲只是用于示例的目的。功能上等同的产物、组合物以及方法显然在本发明的范围内。

除非另有指示，否则在不进行过度实验的情况下使用分子生物学、微生物学、病毒学、重组DNA技术、溶液相肽合成、固相肽合成以及免疫学的常规技术来执行本发明。所述程序描述于以下文献中，例如Sambrook,Fritsch和Maniatis,Molecular Cloning:ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，第二版(1989)，卷I、II以及III全部；DNA Cloning:A Practical Approach，卷I和II(D.N.Glover编著,1985),IRL Press，Oxford，全文；

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Immobilized Cells and Enzymes:A Practical Approach(1986)IRL Press，Oxford，全文；Perbal,B.,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；Methods InEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan编著,Academic Press,Inc.)，全系列；J.F.RamalhoOrtigao,"The Chemistry of Peptide Synthesis"见：Knowledge database of Accessto Virtual Laboratory website(Interactiva,Germany)；Sakakibara,D.,Teichman,J.,Lien,E.Land Fenichel,R.L.(1976).Biochem.Biophys.Res.Commun.73336-342；Merrifield,R.B.(1963).J.Am.Chem.Soc.85,2149-2154；

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在本说明书中，除非全文另有要求，否则词语“包括(comprise)，或变化形式如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”，将被理解为意指包括所述步骤或要素或整数或者步骤或要素或整体的组，但是不排除任何其它的步骤或要素或整数或者要素或整数的组。

如本文中所用的，术语“来源于”应意味指示指定的整数可从特定的来源来获得，即使不一定直接来自该来源。在由STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞得到的可溶性因子的上下文中，这个术语应意味一种或多种因子，例如蛋白质、肽、碳水化合物等等是在体外培养STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞期间产生。

如本文中所用的，术语“炎症性神经性疾病”应意味包括任何病症，其特征在于神经信号的缺陷和/或神经功能障碍和/或炎症性反应导致的神经细胞死亡，以及，在一些实施例中，自身免疫反应。在一个实施例中，炎症性神经性病症是与髓磷脂变性和/或针对神经系统的组分(例如像髓磷脂的组分或磷脂或神经节苷脂)的自身抗体相关或由其产生的病症。炎症性神经性疾病可以是原发性疾病或可以是现有疾病(例如，在一些情况下，SLE)的并发症。

如本文中所用的，术语“有效量”应意味意指减轻导致神经性疾病或与之相关的受试者的炎症性反应的STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子的充足量。例如，有效量的STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子可以减轻脑或脊髓中的，例如如使用磁共振成像(MRI)和/或针对髓磷脂的自身抗体和/或CSF中的寡克隆带可探测的病变。

如本文中所用的，术语“治疗有效量”应意味意指减少或抑制临床炎症性神经性疾病的一种或多种症状的STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子的充足量。

如本文中所用的，术语“预防有效量”应意味意指预防或抑制或延迟临床炎症性神经性疾病的一种或多种可探测症状的发病的STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子的充足量。

如本文中所用的，术语“低剂量”应被理解为意指STRO-1⁺细胞和/或其子代的量少于0.7×10⁶个，但仍然足以抑制导致炎症性神经性疾病或与之相关的受试者的脂质和/或脂蛋白水平和/或足以治疗或预防炎症性神经性疾病。例如，低剂量包含0.5×10⁶个或更少的细胞，或0.4×10⁶个或更少的细胞或0.3×1O⁶个或更少的细胞或0.2×10⁶或更少的细胞。

如本文中所用的，术语“治疗”应被理解为意指施用治疗有效量的可溶性因子和/或细胞并且降低或抑制与炎症性神经性病状相关或由其导致的临床病状的至少一种症状。

如本文中所用的，术语“预防”应被理解为意指施用预防有效量的可溶性因子和/或细胞并且停止或阻止或延迟临床炎症性神经性病状的至少一种症状的发展或进展。

如本文中所用的，术语“可溶性因子”应理解为指可溶于水的由STRO-1⁺细胞和/或其子代产生的任何分子，例如蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、脂蛋白、脂肽、碳水化合物等。所述可溶性因子可以在细胞内和/或由细胞分泌。所述可溶性因子可以是复杂混合物(例如上清液)和/或其组分和/或可以是纯化的因子。在本发明的一个实施例中，可溶性因子是上清液或含于上清液内。因此，本文涉及施用一种或多种可溶性因子的任何实施例应理解为在作了必要的修改的情况下适用于施用上清液。

如本文中所用的，术语“上清液”指的是在合适的培养基(如，液体培养基)中体外培养间充质前体细胞和/或其子代细胞后产生的非细胞物质。通常，上清液由在适宜的条件和时间下在培养基中培养细胞，随后通过如离心等过程移除细胞物质后所产生。在施用之前，上清液可能会或可能不会经受进一步的纯化步骤。在一个实施例中，上清液包含少于10⁵个，如，少于10⁴个，例如，少于10³个以及如，无活细胞。

如本文中所用的，术语“预防对抗原的免疫反应”将被理解为意指本文中根据任何实施例描述的群和/或子代和/或可溶性因子延迟和/或减少和/或停止了免疫反应的发展，而不是抑制预先存在的免疫反应。在本文的一些实施例中，针对预防对抗原的免疫反应的本发明的实施例应被理解为在作了必要修改的情况下适用于降低或抑制现有的对抗原的免疫反应。

如本文中所用的，术语“正常或健康个体”应被理解为意指如通过本领域已知的和/或本文描述的任何方法所评价后，未患炎症性神经性病状的受试者。

如本文中所用的，术语“醋酸格拉替雷”将被理解为意指包含在髓磷脂碱性蛋白中发现的四种氨基酸(即谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸和酪氨酸)的无规聚合物的免疫调节剂药物，其目前以商品名称考帕松(Copaxone)出售。

STRO-1⁺细胞或子代细胞，和由其得到的上清液或者一种或多种可溶性因子

STRO-1⁺细胞为在骨髓、血液、牙髓细胞、脂肪组织、皮肤、脾、胰、脑、肾、肝、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、骨、韧带、肌腱、骨骼肌、真皮和骨膜中发现的细胞；并且能够分化成生殖系，如中胚层和/或内胚层和/或外胚层。

在一个实施例中，STRO-1⁺细胞是多能细胞，其能够分化成大量细胞类型，包括但不限于脂肪组织、骨组织、软骨组织、弹性组织、肌肉组织和纤维结缔组织。这些细胞所进入的特定谱系决定和分化路径取决于来自机械影响和/或内源性生物活性因子(如生长因子、细胞因子)和/或由宿主组织建立的局部微环境条件的各种影响。STRO-1⁺多能细胞因此为非造血祖细胞，其分裂产生子细胞，所述子细胞为干细胞或适时不可逆分化产生表型细胞的前体细胞。

在一个实施例中，STRO-1⁺细胞是从由受试者(例如欲治疗的受试者或相关受试者或不相关受试者(无论是相同物种抑或不同物种))获得的样本富集而来。术语“富含”或其变形在本文中用于描述一种细胞群体，其中当与细胞的未处理群体(例如处于天然环境中的细胞)相比较时，一种特定细胞类型的比例或者多种特定细胞类型的比例增加。在一个实施例中，富含STRO-1^*细胞的群包含至少约0.1%或0.5%或1%或2%或5%或10%或15%或20%或25%或30%或50%或75%的STRO-1⁺_细胞。在这方面，术语“富含STRO-1⁺细胞的细胞群”将被理解为为术语“包含X%STRO1^*细胞的细胞群”提供明确的支持，其中X%是本文列举的百分比。在某些实施例中，STRO-1⁺细胞可以形成无性系的集落，例如，CFU-F(成纤维细胞)或其亚群(例如50%或60%或70%或70%或90%或95%)可以具有这种活性。

在一个实施例中，细胞群是富含包含处于可选择的形式的STRO-1⁺细胞的细胞制剂。在这方面，术语“可选择的形式”将被理解为意指细胞表达允许选择STRO-1⁺细胞的标志物(例如，一种细胞表面标志物)。标志物可以是STRO-1，但不一定是。例如，如本文描述的和/或例证的，表达STRO-2和/或STRO-3(TNAP)和/或STRO-4和/或VCAM-1和/或CD146和/或3G5的细胞(例如MPC)也表达STRO-1(并且可以是STRO-1^亮)。因此，表明细胞是STRO-1⁺并不意指细胞由STRO-1表达来选择。在一个实施例中，细胞是基于至少表达STRO-3来选择，例如，它们是STRO-3⁺(TNAP^*)。

提及选择细胞或其群不需要从特定的组织来源进行选择。如本文描述的，STRO-1^*细胞可以是从种类繁多的来源中进行选择或分离或富集的。也就是说，在某些实施例中，这些术语为从任何包含STRO-1^*细胞(例如，MPC)的组织或血管化组织或包含周细胞(例如STRO-1^*周细胞)的组织或本文描述的组织中的任何一种或多种中进行选择提供支持。

在一个实施例中，在本发明中所用的细胞表达一种或多种个别地或全体选自由以下组成的组的标志物：TNAP^*、VCAM-1^*、THY-1^*、STRO-4^*(HSP-90p)、STRO-2^*、CD45^*、CD146^*、3G5^*或其任何组合。

“个别地”指本发明独立地涵盖所述标志物或标志物组，以及虽然个别标志物或标志物组可能未独立地在本文中列出，但随附权利要求书仍可彼此独立地和分开地定义所述标志物或标志物组。

“全体”指本发明涵盖任何数量的所述标志物或肽组或其组合，以及虽然所述数量的标志物或标志物组或其组合可能未在本文中具体列出，但随附权利要求书仍可将所述组合或子组合与标志物或标志物组的任何其它组合独立地和分开地定义。

在一个实施例中，STRO-1⁺细胞是STRO-1^亮(同义词STRO-1^亮)。在一个实施例中，相对于STRO-1^暗或STRO-1^中间细胞，Stro-1^亮细胞优先富集。

在一个实施例中，STRO-1^亮细胞另外是TNAP⁺、VCAM-1⁺、THY-1⁺'STRO-4⁺(HSP-90p)、STRO-2⁺和/或CD146⁺中的一种或多种。例如，细胞是为一种或多种的前述标志物而选择和/或显示表达一种或多种前述标志物。在这方面，显示表达标志物的细胞不需要被特别地测试，而是可以测试预先富集或分离的细胞并且随后使用，可以合理地假设分离的或富集的细胞也表达同样的标志物。

在一个实施例中，间充质前体细胞是WO2004/85630中所定义的血管周围间充质前体细胞。例如，间充质前体细胞表达血管周围细胞的标志物，例如，细胞是STRO-1⁺或STRO-1^亮和/或3G5⁺。在一个实施例中，细胞是或以前或是从血管化组织或器官或其部分中分离的子代细胞。

对于指定标志物称为“阳性”的细胞，其可能根据标志物存在于细胞表面上的程度而表达低(lo或暗)或高(亮、亮)水平的所述标志物，其中所述术语涉及细胞分选过程中所用的荧光或其它标志物的强度。lo(或暗或深)和亮的区别应放在所分选特定细胞群体上所用的标志物的情形中加以理解。对于指定标志物称为“阴性”的细胞不一定完全不存在于所述细胞。所述术语指细胞表达所述标志物的水平相对极低，并且当在可检测标记时产生极低信号或者在背景水平以上不可检测，例如使用同种型对照抗体检测到的水平。

当在本文中使用时，术语“亮”是指细胞表面上的标志物在可检测标记时产生相对较高的信号。虽然不希望受理论限制，但提出“亮”细胞所表达的靶标志物蛋白(例如由STRO-1识别的抗原)比样本中的其它细胞多。例如，当用缀合FITC的STRO-1抗体标记时，如通过荧光活化细胞分选(FACS)分析所测定的STRO-1^亮细胞产生比非亮细胞(STRO-1^深/暗)高的荧光信号。在一个实施例中，“亮”细胞构成起始样本中所含的最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0.1%。在其它实施例中，“亮”细胞构成起始样本中所含的最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0.1%、至少约0.5%、至少约1%、至少约1.5%或至少约2%。在实施例中，STRO-1^亮细胞的STRO-1表面表达相对于“背景”(即STRO-1"细胞)具有2个对数量级以上的表达。相比之下，STRO-1^暗和/或STRO-1^中间细胞的STRO-1表面表达与“背景”相比具有小于2个对数量级的表达，通常与“背景”相比约1个对数以下。

如本文所用，术语“TNAP”意欲涵盖组织非特异性碱性磷酸酶的所有亚型。例如，所述术语涵盖肝亚型(LAP)、骨亚型(BAP)和肾亚型(KAP)。在实施例中，TNAP是BAP。在实施例中，如本文所用的TNAP是指可以结合由2005年12月19日根据布达佩斯条约(BudapestTreaty)的规定以保藏编号PTA-7282保藏于ATCC的杂交瘤细胞系产生的STRO-3抗体的分子。

此外，在实施例中，STRO-1^*细胞能够产生克隆CFU-F。

在一个实施例中，大比例的STRO-1⁺多能细胞能够分化成至少两种不同生殖系。多能细胞可以发展成的谱系的非限制性实例包括骨前体细胞；肝细胞祖细胞，其具有胆道上皮细胞和肝细胞的多潜能；神经限制细胞，其可以产生会发展成少突胶质细胞和星形胶质细胞的神经胶质细胞前体；神经元前体，其会发展出神经元；心肌和心肌细胞、葡萄糖反应性胰岛素分泌胰腺β细胞系的前体。其它谱系包括但不限于，成牙质细胞、牙质产生细胞和软骨细胞，以及以下的前体细胞：视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞(诸如角化细胞)、树突状细胞、毛囊细胞、输尿管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮、神经胶质、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

在另一个实施例中，STRO-1⁺细胞在培养时不能产生造血细胞。

在一个实施例中，细胞是取自欲治疗的受试者，使用标准技术在体外培养并且用于获得上清液或可溶性因子或扩增细胞以自体或同种异体组合物形式施用至受试者。在可选实施例中，使用一种或多种已建立的人细胞系的细胞。在本发明的另一适用实施例中，使用非人动物的细胞(或者如果患者不是人，而来自于另一物种)。

本发明还涵盖使用由自体外培养物产生的STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞(后者也称为扩增细胞)获得或得到的上清液或可溶性因子。本发明的扩增细胞根据培养条件(包括培养基中刺激因子的数量和/或类型)、传代次数等可以具有多种表型。在某些实施例中，子代细胞是在从亲本群体传代约2次、约3次、约4次、约5次、约6次、约7次、约8次、约9次或约10次后获得。然而，子代细胞可以在从亲本群体传代任何次后获得。

子代细胞可以通过在任何适合培养基中培养而获得。如本文在提及细胞培养时使用的术语“培养基”包括细胞周围环境的组分。培养基可以是固体、液体、气态或相和材料的混合物。培养基包括液体生长培养基以及不供养细胞生长的液体培养基。培养基也包括胶状培养基，诸如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原蛋白基质。示例性气态培养基包括在皮氏培养皿(petri dish)或其它固体或半固体支持物上生长的细胞所暴露的气相。术语“培养基”也指意欲用于细胞培养中的材料，即使其尚未与细胞接触。换句话说，制备用于细菌培养的富营养液体是培养基。当与水或其它液体混合时变得适于细胞培养的粉末混合物可称为“粉状培养基”。

在一个实施例中，适用于本发明方法的子代细胞是通过使用经过STRO-3抗体标记的磁性珠粒从骨髓分离TNAP⁺STRO-1⁺细胞，并接着培养扩增所分离的细胞来获得(关于适合培养条件的实例，请参见Gronthos等Blood85:929-940,1995)。

在一个实施例中，所述扩增细胞(子代)(例如至少在5次传代后)可以是TNAP-、CC9⁺、I⁺类HLA、II"类HLA、CD14\CD19-、CD3"、CD1lac'、CD31^*、CD86-、CD34"和/或CD80'。然而，在与本文所述不同的培养条件下，不同标志物的表达有可能会变化。此外，虽然具有这些表型的细胞可在扩增细胞群体中占优势，但这并不指较小比例的细胞不具有此表型(例如，小百分比的扩增细胞可以是CC9')。在一个实施例中，扩增细胞仍具有分化成不同细胞类型的能力。

在一个实施例中，用于获得上清液或可溶性因子或细胞本身的扩增细胞群体包含其中至少25%(如至少50%的细胞)的细胞是CC9⁺。

在另一实施例中，用于获得上清液或可溶性因子或细胞本身的扩增细胞群体包含其中至少40%(如至少45%的细胞)的细胞是STRO-1⁺。

在另一实施例中，扩增细胞可表达一种或多种全体或个别地选自由以下组成的组的标志物：LFA-3、THY-1、VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、P-选择蛋白、L-选择蛋白、3G5、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD90、CD29、CD18、CD61、整联蛋白β6-19、血栓调节蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦素-R(STRO-2=瘦素-R)、RANKL、STRO-1^亮和CD146或这些标志物的任何组合。

在一个实施例中，子代细胞是如WO2006/032092中所定义和/或所述的多能扩增STRO-1⁺多能细胞子代(MEMP)。制备可用于得到子代的STRO-1⁺多能细胞的富集群体的方法描述于WO01/04268和WO2004/085630中。在体外情形中，STRO-1⁺多能细胞极少以绝对纯制备物形式存在，而是一般与作为组织特异性定向细胞(TSCC)的其它细胞一起存在。WO01/04268提出以约0.1%至90%的纯度水平从骨髓采集所述细胞。包含可得到子代的MPC的群体可直接从组织来源采集，或者其可为已在离体扩增的群体。

例如，子代可获自大致上纯化的STRO-1⁺多能细胞的已采集且未扩增的群体，其构成其所存在的群体总细胞的至少约0.1%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或95%。此水平可以通过例如选择对至少一种个别地或全体选自由TNAP、STRO-1^{^}’、3G5⁺、VCAM-1、THY-1、CD146和STRO-2组成的组的标志物呈阳性的细胞来实现。

MEMPS与新鲜采集的STRO-1⁺多能细胞的区别之处可在于其对于标志物STRO-1^亮呈阳性且对于标志物碱性磷酸酶(ALP)呈阴性。相比之下，新鲜分离的STRO-1⁺多能细胞对于STRO-1^亮和ALP两者都呈阳性。在本发明的实施例中，至少15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的所施用细胞具有表型STRO-1^亮、ALP'。在一个实施例中，MEMPS对于标志物Ki67、CD44和/或CD49c/CD29、VLA-3、α3β1中的一种或多种呈阳性。在另一实施例中，MEMP不显示TERT活性和/或对于标志物CD18呈阴性。

STRO-1⁺细胞起始群体可源自WO01/04268或WO2004/085630中所述的任一种或多种组织类型，即骨髓、牙髓细胞、脂肪组织和皮肤，或许更广泛来说来自脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰、骨、韧带、骨髓、肌腱和骨骼肌。

应理解，在进行本发明时，带有任何指定细胞表面标志物的细胞的分离可以通过多种不同方法来实现，然而，一些方法依赖于结合剂(例如抗体或其抗原结合片段)与所关注标志物的结合，随后分离显示结合(为高水平结合或低水平结合)或不结合的那些细胞。最适宜结合剂为抗体或基于抗体的分子，如单克隆抗体或基于单克隆抗体的分子，因为后面所说的这些结合剂具有特异性。抗体在两个步骤中都可使用，然而也可以使用其它试剂，因此这些标志物的配体也可以用于富集带有所述标志物或缺乏所述标志物的细胞。

抗体或配体可连接至固体支持物以允许粗分离。在一个实施例中，分离技术最大程度地保持欲收集的部分的活力。具有不同功效的各种技术可用于获得相对较粗的分离。所用特定技术将取决于分离效率、相关细胞毒性、执行的容易性和速度，以及复杂设备和/或技术技能的必要性。分离程序可包括但不限于使用涂有抗体的磁性珠粒的磁性分离、亲和色谱和利用连接至固体基质的抗体的“淘选”。提供精确分离的技术包括但不限于FACS。执行FACS的方法对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

针对本文所述的各标志物的抗体可商购获得(例如抗STRO-1的单克隆抗体可从R&D Systems,USA商购获得)、从ATCC或其它保藏组织获得和/或可使用业内公认的技术产生。

分离STRO-1⁺细胞的方法例如包括第一步骤，其为利用例如识别STRO-1的高水平表达的磁性活化细胞分选(MACS)的固相分选步骤。接着必要时可进行第二分选步骤以得到更高水平的前体细胞表达，如专利说明书WO01/14268中所述。此第二分选步骤可能涉及使用两种或更多种标志物。

获得STRO-1⁺细胞的方法还可能包括使用已知技术进行第一富集步骤之前采集细胞来源。因此，组织将以手术方式移除。接着将构成来源组织的细胞分离为所谓单细胞悬浮液。此分离可以通过物理和或酶学方式达成。

一旦获得了适合的STRO-1⁺细胞群体，就可以通过任何适合方式对其进行培养或扩增以获得MEMP。

在一个实施例中，细胞是取自欲治疗的受试者，使用标准技术在体外培养并且用于获得上清液或可溶性因子或扩增细胞以自体或同种异体组合物形式施用至受试者。在可选实施例中，使用一种或多种已建立的人细胞系的细胞来获得上清液或可溶性因子。在本发明的另一适用实施例中，使用非人动物的细胞(或者如果患者不是人，则来自另一物种)来获得上清液或可溶性因子。

本发明可以使用来自任何非人动物物种的细胞加以实施，包括但不限于非人灵长类动物细胞、有蹄类动物、犬科动物、猫科动物、兔类动物、啮齿动物、鸟类动物和鱼类动物细胞。可用于实施本发明的灵长类动物细胞包括但不限于黑猩猩、狒狒、食蟹猕猴和任何其它新世界或旧世界猴类的细胞。可用于实施本发明的有蹄类动物细胞包括但不限于牛、猪、绵羊、山羊、马、水牛和野牛的细胞。可用于实施本发明的啮齿动物细胞包括但不限于小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠和沙鼠细胞。可用于实施本发明的兔类动物物种的实施例包括家兔、长腿大野兔、野兔、棉尾兔、雪地兔和鼠兔。鸡(原鸡(Gallus gallus))为可用于实施本发明的鸟类物种的一个实施例。

适用于本发明方法的细胞在使用前或获得上清液或可溶性因子前可储存。保藏和储存真核细胞和尤其哺乳动物细胞的方法和方案在本领域中是已知的(参见例如Pollard,J.W.和Walker,J.M.(1997)Basic Cell Culture Protocols,第二版,Humana Press,Totowa,N.J.；Freshney,R.I.(2000)Culture of Animal Cells,第四版,Wiley-Liss,Hoboken,N.J.)。维持所分离的干细胞(诸如间充质干细胞/祖细胞)或其子代的生物活性的任何方法都可以结合本发明来使用。在一个实施例中，通过使用低温保藏来维持和储存细胞。

遗传修饰细胞

在一个实施例中，对STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞进行遗传修饰，例如，以表达和/或分泌相关蛋白质，例如提供治疗和/或预防效益的蛋白质、例如减少或预防T细胞活化或诱导神经元的增殖和/或分化和/或髓磷脂产生的多肽。示例性T细胞拮抗剂包括，例如在Toda等,Eur.J.Immunol.,30:403-414,2000中描述的肽。

在另一个实施例中，对STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞进行遗传修饰以表达治疗炎症性神经性病状的蛋白质，例如，β-干扰素。

遗传修饰细胞的方法对于本领域的技术人员来说是显而易见的。例如，使欲在细胞中表达的核酸可操作地连接至用于在细胞中诱导表达的启动子。例如，将核酸连接至可在受试者的多种细胞中可操作的启动子，诸如病毒启动子，例如CMV启动子(例如CMV-IE启动子)或SV-40启动子。其它适合启动子在本领域中是已知的并且应理解为在作了必要修改的情况下适用于本发明的实施例。

例如，核酸以表达构建体的形式提供。如本文所用，术语“表达构建体”是指具有在细胞中将表达赋予到可操作地连接的核酸(例如报道基因和/或可反选择的报道基因)的能力的核酸。在本发明的上下文中，应了解，表达构建体可包含或为质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒亚基因组或基因组片段或能够以可表达格式维持和/或复制异源DNA的其它核酸。

构建适用于实施本发明的表达构建体的方法对于本领域的技术人员来说将是显而易见的并且描述于以下文献中：例如Ausubel等(见：Current Protocols in MolecularBiology.Wiley Interscience,ISBN047150338,1987)或Sambrook等(见：MolecularCloning:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratories,New York,第三版2001)。例如，使用例如PCR从适合模板核酸扩增表达构建体的各组分并随后克隆至适合的表达构建体(如质粒或噬菌粒)中。

适于所述表达构建体的载体在本领域中是已知的和/或在本文中描述。例如，适于哺乳动物细胞中的本发明方法的表达载体为例如由Invitrogen供应的pcDNA载体套装的载体、pCI载体套装的载体(Promega)、pCMV载体套装的载体(Clontech)、pM载体(Clontech)、pSI载体(Promega)、VP16载体(Clontech)或pcDNA载体套装的载体(Invitrogen)。

本领域的技术人员将认识到其它载体和所述载体的来源，例如像LifeTechnologies公司、Clontech或Promega。

用于将分离的核酸分子或包含所述核酸的基因构建体引入细胞中用于表达的方式对于本领域的技术人员来说是已知的。用于指定生物体的技术取决于已知的成功技术。用于将重组DNA引入细胞中的方式包括显微注射、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体(如使用lipofectamine(Gibco,MD,USA)和/或cellfectin(Gibco,MD,USA))介导的转染、PEG介导的DNA吸收、电穿孔和微粒轰击(如使用涂有DNA的钨粒子或金粒子(Agracetus Inc.,WI,USA)以及其它方式。

或者，本发明的表达构件体是病毒载体。适合病毒在本领域中是已知的并且可商购获得。用于递送核酸和使所述核酸整合至宿主细胞基因组中的常规基于病毒的系统包括例如逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体。或者，腺病毒载体适用于将保持游离形式的核酸引入宿主细胞中。病毒载体为靶细胞和组织中基因转移的有效且通用的方法。另外，已在多种不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。

例如，逆转录病毒通常包含包装能力高达6-10kb外来序列的顺式作用长末端重复(LTR)。最小顺式作用LTR就足以用于载体的复制和包装，其接着用于将表达构建体整合至靶细胞中以提供长期表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于以下病毒的载体：鼠类白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SrV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和其组合(参见例如Buchscher等,J Virol.5(5:2731-2739(1992)；Johann等,J.Virol.65:1635-1640(1992)；Sommerfelt等,Virol.76:58-59(1990)；Wilson等,J.Virol.65:274-2318(1989)；Miller等,J.Virol.65:2220-2224(1991)；PCT/US94/05700；Miller和Rosman BioTechniques7:980-990,1989；Miller,A.D.Human Gene Therapy7:5-14,1990；Scarpa等Virology75:849-852,1991；Burns等Proc.Natl.Acad.Sci USA90:8033-8037,1993)。

已开发各种腺相关病毒(AAV)载体系统用于核酸递送。AAV载体可以使用本领域中已知的技术容易地构建。参见例如美国专利号5,173,414和5,139,941；国际公布号WO92/01070和WO93/03769；Lebkowski等Molec.Cell.Biol.5:3988-3996,1988；Vincent等(1990)Vaccines90(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter Current Opinion inBiotechnology5:533-539,1992；Muzyczka.Current Topics in Microbiol,andImmunol.158:97-129,1992；Kotin,Human Gene Therapy5:793-801,1994；Shelling和Smith Gene Therapy7:165-169,1994；和Zhou等J Exp.Med.779:1867-1875,1994。

适用于递送本发明的表达构建体的其它病毒载体包括例如来源于痘病毒家族的载体，如牛痘病毒和禽痘病毒或α病毒或缀合病毒载体(例如Fisher-Hoch等,Proc.NatlAcad.Sci.USA56:317-321,1989中所述的载体)。

细胞和可溶性因子的治疗/预防潜能的测定

用于确定细胞或可溶性因子治疗或预防或延迟炎症性神经性病状的发病或进展的的能力的方法对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

例如，将细胞或可溶性因子(例如，因子或单个因子或因子片段(例如，通过亲和纯化或色谱得到的)混合物)在炎症性神经性疾病(例如，MS)病理学组分的体外模型中筛选以鉴别治疗剂。示例性模型包括使用分离的T细胞或混合的淋巴细胞群的那些模型，所述混合的淋巴细胞群来自包含与鞘组分(例如，髓磷脂碱性蛋白、髓磷脂少突胶质糖蛋白或髓磷脂蛋白脂质蛋白)反应的转基因T细胞受体的MS的转基因小鼠模型。细胞在细胞和/或可溶性因子的存在或不存在的情况下与髓磷脂蛋白接触并且例如，通过探测促炎症性细胞因子(如白细胞介素(IL)-2或γ干扰素)的分泌评价了炎症性反应的水平。或者，或另外，例如，使用(³H)胸腺嘧啶核苷掺入来评价细胞的增殖反应。选择减少炎症性反应的细胞和/或可溶性因子作为治疗。示例性评价在Illes等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,101:11749-11754,2004或Rossi等,J.Biomolecular Screening,12:481-489,2007中描述。

细胞和/或可溶性因子还在炎症性神经性疾病的体内模型中进行测试。示例性模型包括EAE模型，其中使用髓鞘蛋白或由其得到的肽(例如，MOG、MBP或PLP)使小鼠或大鼠免疫并且针对蛋白产生免疫反应，从而诱导MS模型。或者，将使用髓鞘蛋白得到的免疫反应性T细胞引入小鼠或大鼠来诱发EAE。示例性EAE模型在例如Tsunoda和Fujinami,JNeuropathol Exp Neurol.55:673-686,1996中综述。

MS的其它模型包括对髓磷脂蛋白(例如，MOG、MBP或PLP)特异性表达T细胞受体的转基因动物。示例性模型在例如Bettelli等,JEM797:1073-1081,2003;Illes等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,101:11749-11754,2004;或Rossi等,J.BiomolecularScreening,12:481-489,2007中描述，或是可商购获得的，例如从Jackson LaboratoriesUSA(例如，具有与MOG反应的转基因T细胞受体的小鼠2D2)。

发展炎症性神经性综合征的SLE的示例性模型包括抗磷脂综合征模型(例如，如在Ziporen等,J.Clin,Invest.,100::613-613,1997中描述)或在Brey等,Annals NY AcadSci.,823:97-106,1996中综述的模型。

格林-巴利综合征模型包括使用神经节苷脂GM1致敏动物，例如，兔子，产生的那些模型(例如，如在Yuki等，Ann Neurol.49:712-720,2001中描述的)。

对于本领域的技术人员来说从前述内容显而易见，本发明还提供用于鉴别或分离用于治疗、预防或延迟炎症性神经性病状的细胞或可溶性因子的方法，所述方法包括：

(i)对患有炎症性神经性病状的测试受试者施用细胞或可溶性因子并且对受试者的炎症性反应或神经性功能/功能障碍进行评价；

(ii)对受试者的炎症性反应或神经性功能/功能障碍进行比较，(i)比较患有炎症性神经性病状而没有施用细胞或可溶性因子的对照受试者的炎症性反应或神经性功能/功能障碍，

其中与对照受试者相比，测试受试者的炎症性反应或神经性功能/功能障碍改善表明细胞或可溶性因子治疗炎症性神经性病状。

所述细胞可以是本文根据任何实施例描述的任何细胞。

细胞组合物

在本发明的一个实施例中，STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞是以组合物形式施用。例如，所述组合物包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。

术语“载体”和“赋形剂”是指在本领域中常规用于促进活性化合物的储存、施用和/或生物活性的物质的组合物(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Mac Publishing Company(1980)。载体还可减少活性化合物的任何不当副作用。适合载体例如是稳定的，例如不能与载体中的其它成分反应。在一个实施例中，载体在用于治疗的剂量和浓度下在接受者体内不产生明显的局部或全身性不良作用。

适用于本发明的载体包括那些常规使用的载体，例如水、盐水、右旋糖水溶液、乳糖、林格氏溶液(Ringer's solution)、缓冲溶液、透明质酸和二醇是示例性液体载体，特别是(当等渗时)对于溶液来说。适合药用载体和赋形剂包括淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等。

在另一实施例中，载体是介质组合物，例如细胞在其中生长或悬浮的介质组合物。例如，所述介质组合物不在其所施用的受试者中诱发任何不良作用。

示例性介质和赋形剂不会不利地影响细胞活力和/或细胞减少、预防或延迟炎症性神经性病状的能力。

在一个实施例中，载体或赋形剂提供缓冲活性以使细胞和/或可溶性因子维持在适合pH下，由此发挥生物活性，例如载体或赋形剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。PBS代表一种有吸引力的载体或赋形剂，因为其与细胞和因子相互作用的程度最低并且允许快速释放细胞和因子，在这种情况下，可将本发明的组合物制造为用于例如通过注射直接施加至血流或组织或围绕组织或与组织相邻的区域中的液体。

STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞也可以并入或包埋于与接受者相容并且降解为对接受者无害的产物的骨架中。所述骨架提供对欲移植到接受受试者体内的细胞的支持和保护。天然和/或合成生物可降解性骨架为所述骨架的实例。

多种不同的骨架可成功用于实施本发明。示例性骨架包括但不限于生物可降解的骨架。天然生物可降解骨架包括胶原蛋白、纤连蛋白和层连蛋白骨架。适用于细胞移植骨架的合成材料应能够支持广泛细胞生长和细胞功能。所述骨架也可被吸收。适合骨架包括聚乙醇酸骨架，例如Vacanti等,J.Ped.Surg.23:3-91988；Cima等,Biotechnol.Bioeng.55:1451991；Vacanti等,Plast.Reconstr.Surg.55:753-91991所述，或合成聚合物，如聚酸酐、聚原酸酯和聚乳酸。

在另一实施例中，细胞可在凝胶骨架(如来自Upjohn公司的Gelfoam)中施用。

适用于本文所述方法的细胞组合物可以单独施用或作为与其它细胞的混合物施用。可结合本发明组合物施用的细胞包括但不限于其它多效或多能细胞或干细胞，或骨髓细胞。不同类型的细胞可在临施用前或施用前不久与本发明组合物混合，或者其可以在施用前一起共培养一段时间。

在一个实施例中，组合物包含有效量或治疗或预防有效量的细胞。例如，组合物包含约I×1O⁵个STRO-1⁺细胞/kg至约1×1O⁷个STRO-1⁺细胞/kg或约1×1O⁶个STRO-1⁺细胞/kg至约5×10⁶个STRO-1⁺细胞/kg。欲施用的细胞的确切量取决于多种因素，包括患者的年龄、体重和性别以及炎症性神经性病状的范围和严重程度。

在一些实施例中，细胞是含于不允许细胞离开进入受试者循环中，然而允许由细胞分泌的因子进入循环中的腔室中。以此方式，可通过允许细胞分泌因子进入受试者循环中来向受试者施用可溶性因子。所述腔室同样可植入受试者的部位以增加可溶性因子的局部水平。

在本发明的一些实施例中，可不必或不需要在起始细胞组合物疗法前对患者进行免疫抑制。因此，移植同种异体或者甚至异种的STRO-1⁺细胞或其子代在一些情况下可能是耐受的。

然而，在其它情况下，在起始细胞疗法前以药理学方式对患者进行免疫抑制和/或针对细胞组合物减少受试者的免疫反应可能是需要或适当的。这可以通过使用全身性或局部免疫抑制剂来实现，或者这可以通过在囊封装置中递送细胞来实现。细胞可以囊封在细胞所需要的营养物和氧以及治疗因子可透过，而细胞不可透过的胶囊中来免疫体液因子和细胞。在一个实施例中，囊封剂具有低变应原性，容易地且稳定地位于靶组织中，并且对所植入的结构提供附加保护。降低或消除对移植细胞的免疫反应的这些和其它方式在本领域中是已知的。作为替代，可对细胞进行遗传修饰以降低其免疫原性。

可溶性因子的组合物

在本发明的一个实施例中，由STRO-1^*细胞得到和/或由子代细胞得到的上清液或可溶性因子是以例如包含适合载体和/或赋形剂的组合物形式施用。例如，载体或赋形剂不会不利地影响可溶性因子或上清液的生物学作用。

在一个实施例中，组合物包含稳定可溶性因子或上清液组分(例如蛋白酶抑制剂)的物质的组合物。例如，所包括的蛋白酶抑制剂的量不足以对受试者产生不良影响。

包含由STRO-1⁺细胞得到和/或由子代细胞得到的上清液或可溶性因子的组合物可制备为适当液体悬浮液，例如于培养基或于稳定载体或缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)中的悬浮液。适合载体在上文中描述。在另一实施例中，包含由STRO-1⁺细胞得到和/或由子代细胞得到的上清液或可溶性因子的悬浮液是用于注射的油性悬浮液。适合亲脂性溶剂或媒剂包括脂肪油，如芝麻油；或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。欲用于注射的悬浮液也可含有增加悬浮液的粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或聚葡萄糖。任选地，悬浮液也可含有适合的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩溶液的试剂。

可以通过在具有上述成分之一或其组合的适当溶剂中并入所需量的上清液或可溶性因子，需要时随后过滤灭菌来制备无菌注射溶液。

一般来说，通过将上清液或可溶性因子并入含有基本分散介质或来自以上列出成分的其它所需成分的无菌媒剂中来制备分散液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，示例性制备方法是真空干燥和冷冻干燥，此举产生活性成分加来自其先前无菌过滤溶液的任何其它所需成分的粉末。根据本发明的替代方面，上清液或可溶性因子可以与一种或多种增强它的溶解度的其它化合物一起配制。

其它示例性载体或赋形剂描述于以下文献中：例如Hardman等,(2001)Goodman和Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,N.Y.；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams以及Wilkins,New York,N.Y.；Avis等,(编著)(1993)Pharmaceutical DosageForms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等,(编著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等,(编著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity andSafety,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.。

治疗组合物通常应无菌且在制造和储存条件下稳定。组合物可配制成溶液、微乳液、脂质体或其它有序结构。载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合混合物的溶剂或分散介质。可例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度和通过使用表面活性剂来维持适当流动性。在许多情况下，在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬酯酸盐和明胶)来达成。此外，可溶性因子可以于时间释放制剂中施用，例如于包括缓慢释放聚合物的组合物中施用。活性化合物可用保护化合物免于快速释放的载体制备，诸如控制释放制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLG)。多种用于制备所述制剂的方法已获得专利或通常为本领域的技术人员所已知。

上清液或可溶性因子可与例如提供可溶性因子的缓慢释放的适当基质组合施用。

组合物的附加组分

STRO-1⁺细胞得到的上清液或可溶性细胞因子、STRO-1⁺细胞或其子代可以与其它有益的药物或生物分子(生长因子、营养因子)一起施用。当与其它药剂一起施用时，它们可以在单一药物组合物中、或在分开的药物组合物中、与其它药剂同时或按序(在施用其它药剂之前或之后)一起施用。可以共施用的生物活性因子包括抗细胞凋亡剂(例如EPO、EPO模拟体、TPO、IGF-I和IGF-II、HGF、半胱氨酸蛋白酶抑制剂)；消炎药(例如，p38MAPK抑制剂、TGF-β抑制剂、他汀类、IL-6和IL-1抑制剂、PEMIROLAST、TRANLAST、REMICADE、SIROLIMUS，以及NSAID(非类固醇消炎药，例如TEPOXALIN、TOLMETIN、SUPROFEN)；免疫抑制/免疫调节剂(例如钙调神经磷酸酶抑制剂，例如环孢素、他克莫司；mTOR抑制剂(例如，SIROLIMUS、EVEROLIMUS)；抗增生剂(例如，咪唑硫嘌呤、霉酚酸酯)；皮质类固醇(例如，泼尼松龙、氢化可的松)；抗体例如单克隆抗-IL-2α受体抗体(例如，巴利昔单抗、达克珠单抗)、多克隆抗T细胞抗体(例如抗胸腺细胞球蛋白(ATG)；抗淋巴细胞球蛋白(ALG)；单克隆抗T细胞抗体OKT3))；抗血栓形成剂(例如，肝素、肝素衍生物、尿激酶、PPack(右旋苯基丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)、抗凝血酶化合物、血小板受体拮抗剂、抗凝血酶抗体、抗血小板受体抗体、阿司匹林、双嘧达莫、鱼精蛋白、水蛭素、前列腺素抑制剂和血小板抑制剂)；和抗氧化剂(例如普罗布考、维生素A、抗坏血酸、生育酚、辅酶Q-10、谷胱甘肽、L-半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸)，以及局部麻醉剂。

在一个实施例中，如本文根据任何实施例描述的组合物包含用于治疗或预防炎症性神经性病状的另一因子。

替代地，或此外，如本文根据任何实施例描述的细胞、分泌因子和/或组合物与炎症性神经性病状的已知治疗组合。

在一个实施例中，如本文根据任何实施例描述的药物组合物包含用于治疗炎症性神经性病状或其症状的化合物。或者，如本文根据本发明的任何实施例描述的治疗/预防的方法另外包括施用用于治疗炎症性神经性病状或其症状的化合物。示例性化合物包括细胞毒性剂、化疗剂、免疫抑制剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂或抗体、生长因子、激素、整合素、整合素拮抗剂或抗体(例如，抗LFA-1抗体，如可商购自Genentech的依法利珠单抗或抗α-4整合素抗体，如可商购自Biogen Idee/Elan Pharmaceuticals,Inc的那他珠单抗等，或结合B细胞表面标志物的抗体(例如抗CD20抗体，如利妥昔单抗或或ocrelizumab(均可购自Genentech)或可购自Genmab/Glaxo Group的奥法木单抗

在组合治疗的某些实施例中，细胞、因子和/或组合物是与以下组合使用的：干扰素类药物如IFN-β-1a和或IFN-β-lb寡肽如醋酸格拉替雷细胞毒性剂如米托蒽醌氨甲喋呤、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、硫唑嘌呤；静脉内免疫球蛋白(丙种球蛋白)；淋巴细胞耗减疗法(例如，米托蒽醌、环磷酰胺、阿伦单抗、抗CD4抗体、克拉屈滨、全身照射、骨髓移植)；皮质类固醇(例如甲基强的松龙、强的松、地塞米松、或糖皮质素)，包括全身性皮脂类固醇疗法；非淋巴细胞耗减性免疫抑制疗法(例如，霉酚酸酯(MMF)或环孢菌素)；“他汀”类降胆固醇药物，其中包括西立伐他汀氟伐他汀阿托伐他汀洛伐他汀普伐他汀辛伐他汀雌二醇；睾酮(任选以升高的剂量；Stuve等Neurology8:290-301,2002)；激素替代疗法；用于继发性症状或与MS相关(例如，痉挛，失禁，疼痛，疲劳)的治疗；抗风湿疾病修饰药物(DMARD)；非甾体抗炎症性药物(NSAID)；血浆去除法；左甲状腺素；环孢菌素A；生长激素抑制素类似物；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂；抗代谢物；免疫抑制剂；康复手术；放射性碘或甲状腺切除术。

在另一个实施例中，如本文根据任何实施例描述的组合物另外包含诱导或增强祖细胞分化为血管内皮细胞的因子。示例性因子包括血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF，例如PDGF-BB)以及FGF。

在另一个实施例中，如本文根据任何实施例描述的组合物另外包含组织特异性定向细胞(TSCC)。在这方面，国际专利申请号PCT/AU2005/001445示范了施用TSCC和STRO-1⁺细胞可以使得TSCC的增殖增强。在一个实施例中，TSCC是神经元细胞，例如，神经元、神经元祖细胞或施旺细胞。对受试者施用所述组合物导致了例如神经元或髓磷脂的产生增加。在另一个实施例中，TSCC是血管细胞。对受试者施用所述组合物可以导致血管的产生增加，例如导致被递送至受影响的组织的营养成分增加。

医疗装置

本发明还提供了用于使用或当在如本文根据任何实施例描述的方法中使用时的医疗装置。例如，本发明提供包含如本文根据任何实施例描述的STRO-1⁺细胞和/或其子代和/或其可溶性因子和/或组合物的注射器或导管或其它合适的递送装置。任选地，注射器或导管与如本文根据任何实施例描述的方法的说明书一起包装。

在另一个实施例中，本发明提供包含如本文根据任何实施例描述的STRO-1⁺细胞和/或其子代和/或其可溶性因子和/或组合物的植入物。任选地，植入物与如本文根据任何实施例描述的方法的说明书一起包装。合适的植入物可以形成为具有支架，例如如上文所述，和STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或其可溶性因子。

施用模式

由STRO-1⁺细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1⁺细胞或其子代可手术植入、注射、递送(例如借助于导管或注射器)或以其它方式直接或间接施用至需要修复或增强的部位。

在一个实施例中，由STRO-1⁺细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1⁺细胞或其子代是递送至受试者的血流中。例如，由STRO-1⁺细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1⁺细胞或其子代是以肠胃外方式递送。肠胃外施用的示例性途径包括但不限于腹腔、脑室、脑室内、鞘内。在一个实施例中，由STRO-1^*细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1⁺细胞或其子代是动脉内递送至主动脉中、心脏的心房或心室中或血管中。

在细胞递送至心脏的心房或心室的情况下，可以将细胞施用至左心房或左心室以避免可能由细胞快速递送至肺而引起的并发症。

在一个实施例中，使用注射器或通过导管或中心管线将由STRO-1⁺细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1⁺细胞或其子代注射至递送部位中。

用于治疗性制剂的施用方案的选择取决于若干因素，包括实体的血清或组织周转率、症状水平和实体的免疫原性。例如，施用方案使与可接受水平的副作用相一致的递送至患者的治疗性化合物的量达到最大。因此，所递送制剂的量部分取决于特定实体和所治疗病状的严重程度。

在一个实施例中，由STRO-1^*细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1⁺细胞或其子代是以单次推注剂量来递送。或者通过连续输注、或通过间隔为例如一天、一周或每周1-7次的剂量来施用由STRO-1⁺细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1⁺细胞或其子代。示例性剂量方案是涉及最大剂量或避免明显不当副作用的剂量频率的方案。总每周剂量取决于所使用化合物的类型和活性。适当剂量由临床医师例如使用本领域中已知或怀疑影响治疗或预测影响治疗的参数或因素来确定。一般来说，剂量始于稍小于最佳剂量的量并在此后以较小增量增加直至相对于任何负面副作用达成所需或最佳的效果。

根据本发明针对治疗或延迟炎症性神经性病状的进展的实施例，STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或其得到的可溶性因子可以在例如使用本领域已知的和/或本文描述的标准方法诊断出病症之后施用。

对于针对预防或延迟炎症性神经性病状的发病的那些实施例来说，STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子可以在病症的临床诊断前施用，例如，当受试者已经患有髓磷脂病变而尚未确诊患有MS和/或已产生抗磷脂抗体时。

在以下非限制性实施例中进一步描述本发明。

实施例

实施例1：通过选择STRO-3*细胞对MPC进行免疫选择

骨髓(BM)是从健康正常的成人志愿者(20-35岁)中采集。简单地说，从髂后嵴抽吸40ml BM至含肝素锂抗凝剂的试管中。

如先前所述(Zannettino,A.C.等(1998)Blood92:2613-2628)使用Lymphoprep^TM(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)通过密度梯度分离制备BMMNC。在4℃下以400×g离心30分钟后，用转移吸管移除白细胞层并在由含有5%胎牛血清(FCS；CSL Limited,Victoria,Australia)的汉克氏平衡盐溶液(HBSS；Life Technologies,Gaithersburg,MD)构成的“HHF”中洗涤三次。

随后如先前所述(Gronthos等(2003)Journal of Cell Science116:1827-1835；Gronthos,S.和Simmons,P.J.(1995)Blood85:929-940)通过磁性活化细胞分选法分离STRO-3⁺(或TNAP⁺)细胞。简单地说，在冰上将约1-3×10⁸个BMMNC在由10%(v/v)正常兔血清于HHF中组成的阻断缓冲液中孵育20分钟。在冰上将细胞与200μl的STRO-3mAb于阻断缓冲液中的^{^}μg/ml溶液一起孵育1小时。随后通过在400×g下离心将细胞在HHF中洗涤两次。加入山羊抗小鼠γ-生物素(Southern Biotechnology Associates,Birmingham,UK)于HHF缓冲液中的1/50稀释液且在冰上将细胞孵育1小时。如上将细胞在MACS缓冲液(补充有1%BSA、5mM EDTA和0.01%叠氮化钠的无Ca²⁺且无Mn²⁺的PBS)中洗涤两次并重悬于最终体积为0.9ml的MACS缓冲液中。

将100μl抗生蛋白链菌素微珠(Miltenyi Biotec;Bergisch Gladbach,Germany)加入细胞悬浮液中且在冰上孵育15分钟。将细胞悬浮液洗涤两次并重悬于0.5ml MACS缓冲液中且随后上样至微型MACS管柱(MS Columns,Miltenyi Biotec)上，并用0.5ml MACS缓冲液洗涤三次以回收未结合STRO-3mAb的细胞(于2005年12月19日保藏于美国典型培养物中心(American Type Culture Collection；ATCC)，保藏编号PTA-7282-参见国际公布号WO2006/108229)。再加入1ml MACS缓冲液后，由磁体移除管柱并通过正压力分离TNAP⁺细胞。将来自各部分的细胞等分试样用抗生蛋白链菌素-FITC染色并通过流式细胞术评价纯度。

实施例2：通过STRO-3mAb选择的细胞是STRO-1^亮细胞

设计实验以证实使用STRO-3mAb作为用于分离细胞STRO-1^亮细胞的单一试剂的可能性。

鉴于STRO-3(IgG1)的同种型与STRO-1(IgM)的同种型不同，因此通过双色FACS分析基于与使用MACS程序分离的STRO-1⁺细胞的共表达评价STRO-3鉴定克隆CFU-F的能力(图1)。点阵直方图表示以列表模式数据形式收集的5×10⁴个事件。垂直线和水平线设定为小于用在相同条件下处理的同种型匹配对照抗体1B5(IgG)和1A6.12(IgM)获得的平均荧光的＜1.0%的反应性水平。结果表明STRO-1^亮细胞的较小群体共表达TNAP(右上象限)，而其余STRO-1⁺细胞未能与STRO-3mAb反应。随后测定所有四个象限的通过FACS分离的细胞的CFU-F发生率(表1)。

表1：通过双色FACS分析基于细胞表面标志物STRO-1和TNAP的共表达富集人骨髓细胞(参考图1)。将FACS分选的细胞在标准克隆条件下在补充有20%FCS的αMEM中培养。数据表示铺板的每10⁵个细胞中第14天群落形成细胞(CFU-F)的平均数±SE(n=3个不同骨髓抽吸物)。这些数据表明人MPC仅局限于BM(其明显共表达STRO-1抗原)的TNAP阳性部分。

实施例3：STRO-1^深和STRO-1^亮细胞的相对基因和表面蛋白质表达

在第一系列实验中，采用半定量RT-PCR分析来检验由通过荧光活化细胞分选法分离的STRO-1^深或STRO-1^亮群体表达的各种谱系相关基因的基因表达谱(图2A)。在第二系列中实验，采用流式细胞术和平均通道荧光分析来检验由过荧光活化细胞分选法分离的STRO-1^深或STRO-1^亮群体表达的各种谱系相关蛋白质的表面蛋白表达谱。

总细胞RNA从2×10⁶个STRO-1^亮或STRO-1^深分选的原代细胞、软骨细胞沉淀和其它诱导的培养物来制备，并且使用RNAzolB提取方法(Biotecx Lab.Inc.,Houston,TX)、根据制造商的建议来裂解。然后将从每个亚群体分离的RNA用作cDNA合成的模板，使用第一链cDNA合成试剂盒(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)进行制备。使用如前所述的标准方案(Gronthos等J Bone and Mini Res.74:48-57,1999)，通过PCR扩增来评价多种转录物的表达。此研究中所使用的引物组在表2中示出。扩增后，通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳对各反应混合物进行分析，并且通过溴化乙锭染色来显现。通过GAPDH的表达来评价RNA完整性。

使用ImageQant软件、参考管家基因GAPDH的表达，来评价各细胞标志物的相对基因表达(图2B、图2C)。另外，与STRO-1抗体组合基于多种多样的细胞谱系相关标志物的表达使用双色流式细胞分析来检验离体扩增的MPC的蛋白质表达谱。基于STRO-1^深和STRO-1^亮培养细胞的基因和蛋白质表达的一般表型的概述在表3中呈现。数据表明，离体扩增的STRO-1^亮MPC表现出与血管周围细胞相关的标志物(包括血管位蛋白1、VCAM-1、SDF-1、IL-1p、TNFa以及RANKL)的差异较高表达。STRO-1^深和STRO-1^亮培养细胞的蛋白质和基因表达谱之间的比较总结于表3和表4中。

还进行消减杂交研究以鉴别由STRO-1^亮细胞独特表达的基因。简单地说，如上所述分离STRO-1^深和STRO-1^亮(参见图3A)。使用RNA STAT-60系统(TEL-TEST)由从5个不同的骨髓样品汇集的STRO-1^深和STRO-1^亮细胞来制备总RNA。使用SMART cDNA合成试剂盒(ClontechLaboratories)来进行第一链合成。根据制造商的说明书，使用在初始RT过程中形成的3'和5'初始末端上的特异性引物位点，通过长距离PCR(Advantage2PCR试剂盒；Clontech)扩增所得到的mRNA/单链cDNA杂交体。用RsaI消化STRO-1^亮cDNA之后，使用Clontech PCR-SelectcDNA消减试剂盒，用2个等分试样来连接不同特异性接头寡核苷酸。根据制造商的方案使用STRO-1^亮(测试子)和STRO-1^深(驱赶子)cDNA(反之亦然)来进行两轮消减杂交。还使用STRO-1^深测试子cDNA针对STRO-1^亮驱动子cDNA杂交来逆向执行此程序。

为了鉴别由STRO-1^亮群体独特表达的基因，使用STRO-1^亮消减cDNA来构建包含200个随机选择的、用连接至T/A克隆载体中的STRO-1^亮消减cDNA转化的细菌克隆的重复低密度微阵列过滤器。。随后用[³²P]dCTP标记的STRO-1^亮或STRO-1^深消减cDNA探测微阵列(图3B-3C)。差异筛选鉴别出总共44个克隆，其在STRO-1^深和STRO-1^亮亚群体之间高度地差异表达。对所有差异表达的克隆进行DNA测序揭示，仅1个克隆代表已知的基质细胞有丝分裂原，即，血小板衍生生长因子(PDGF)(Gronthos和Simmons,Blood.85:929-940,1995)。有趣的是，发现44个克隆中有6个含有对应于趋化因子、基质衍生因子1(SDF-1)的DNA插入子。人STRO-1^亮细胞中SDF-1转录物的高丰度通过从新鲜分选的STRO-1^亮、STRO-1^深和STRO-1^阴性骨髓亚群体制备的总RNA的半定量RT-PCR得到证实(图3D和表3)。

表2.用于特异性扩增人mRNA的RT-PCR引物和条件

表3.STRO-1^亮和STRO-1^深群体中相对基因表达的概述。呈现当通过逆转录PCR进行测定时在STRO-1^亮与STRO-1^深群体之间显示可测量且差异表达的基因列表。值表示参考管家基因GAPDH的相对基因表达。

为了使蛋白表面表达与STRO-1表达的密度相关联，通过胰蛋白酶/EDTA分离制备离体扩增的由骨髓MPC得到的细胞的单细胞悬浮液并且随后与STRO-1抗体与鉴别多种多样细胞谱系相关标志物的抗体的组合一起孵育。使用山羊抗鼠类IgM-异硫氰酸荧光素鉴别STRO-1，同时使用山羊抗小鼠或抗兔IgG-藻红蛋白鉴别所有其它标志物。对于鉴别细胞内抗原的那些抗体，首先使用STRO-1抗体标记细胞制备物，用70%冷乙醇固定以使细胞膜渗透并且接着与细胞内抗原特异性抗体一起孵育。在相同条件下使用同种型匹配对照抗体。使用COULTER EPICS流式细胞仪进行双色流式细胞分析，并且收集列表模式数据。点阵图表示指示各谱系细胞标志物(y轴)和STRO-1(x轴)的荧光强度水平的5,000个列表模式事件。参考同种型匹配阴性对照抗体建立垂直和水平象限。

表4.STRO-1^亮和STRO-1^深群体中相对蛋白质表达的概述呈现当通过流式细胞术进行测定时在STRo-1^亮与STRO-1^深群体之间显示差异表达的蛋白质的列表。值表示染色的相对平均荧光强度。

这些结果显示SDF-1α和RANKL通过STRO-1^亮细胞高表达。这很重要，因为这些蛋白均被认为涉及针对如EAE的免疫性病症给予保护的CD4⁺CD25⁺调节性T(Treg)细胞的上调(Loser等,NatureMedicine12:1372-1379,2006；Hess,Biol.Blood Marrow Transplant,12(1增刊2):13-21,2006；和Meiron等,J.Exp.Medicine205:2643-2655,2008)。

实施例4-STRO-1⁺细胞在EAE中的作用

对于以下实验，使用了C57Bl/6J小鼠中髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)诱发的实验性炎症性脑脊髓炎(EAE)。C57Bl/6J小鼠显示与MS患者类似的表型症状(进行性麻痹)以及示出CNS中的广泛炎症、脱髓鞘和轴突缺失/损伤。用于诱发EAE的免疫程序、临床症状的评价和所用的MPC移植如下。

EAE的活性诱发

使用溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS)并且与等体积的含有400μg灭活的结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Ra的弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant)混合的200μg重组MOG对小鼠进行免疫。使用25号(G)针头将0.1ml此混合物皮下注射到右侧腹和左侧腹中(每只小鼠共0.2ml)。在第0天和第2天，还使用29G针头用溶于0.30ml PBS中的350ng灭活的百日咳博德特氏杆菌(Bordetella pertussis)毒素经由尾静脉静脉注射(i.v.)对小鼠进行免疫。注射后对静脉注射部位施加轻缓压力30秒以降低静脉注射部位出血的风险。

每2-5分钟监测小鼠持续10-15分钟以确保没有活动性出血。

使用MPC治疗

基本上如实施例1中所述分离MPC。疾病诱发后第8、10和12天，溶于200μl PBS体积的2×10⁵或4×10⁵个MPC作为单次静脉内(i.v.)注射来施用(参见表5)。对照仅接受静脉内注射等体积的PBS。每天监测小鼠并根据下文所述的量表对临床体征进行评分。实验持续约36天以监测疾病过程。在实验终止时，解剖脑、脊髓和视神经并在福尔马林溶液中固定。

表5：治疗方案概述

小鼠的监测

在整个实验中，每天检验所有小鼠的神经性功能障碍的体征。

神经性功能障碍分级：

0-正常

1-仅丧失尾音

2-1个或2个后肢轻度无力和步态异常

3-无法移动后肢

4-无法移动后肢和轻微的前肢无力

5-死亡

结果

对照C57Bl/6J小鼠显示出类似于MS患者的表型症状(进行性麻痹)以及示出CNS中的广泛炎症、脱髓鞘和轴突缺失/损伤。

如图4示出的，与使用PBS治疗的EAE动物相比，在EAE疾病诱导发病时施用的静脉内施用的MPC能够在超过36天的过程中抑制平均临床疾病评分的严重程度。

图5示出MPC治疗诱导了慢性进行性EAE的累积病情指数(平均临床疾病评分的曲线下总面积分析)的剂量依赖性降低。

施用MPC的效果在表6中概述：

表6：使用MPC治疗后小鼠EAE模型的临床结果的概述

表6中的数据示出在使用MOG肽35-55诱发EAE后的10-18天之间所有动物显示了神经性疾病。与使用MPC治疗的的动物相比(15只动物0死亡)，25%(3/12)的使用PBS治疗的对照动物死亡。对照组中的最大临床评分最高，并且所有MPC治疗组显示出较低的最大临床评分。

与观察到的对照组的累积病情指数相比，MPC治疗组的为期36天的平均临床评分的累积病情指数(平均临床评分的曲线(AUC)下的面积)均较低，表明MPC的强劲和持续的EAE疾病抑制。

这些数据示出在这个人炎症性神经性病状模型中，人MPC对降低EAE的临床严重程度有效。

实施例4-MPC对T细胞增殖的作用

在疾病诱发(MOG35-55免疫)后第36天将如在实施例3中描述的MPC治疗的小鼠和对照扑杀。将脾细胞在体外仅用培养基培养或使用MOG35.55再刺激并且接着通过[³H]-胸腺嘧啶核苷掺入来测量T细胞增殖反应。将对MOG的特异性增殖反应与仅在培养基中培养(未受刺激)的匹配脾细胞相比较。在PMA/离子霉素中培养的脾细胞用于测定T细胞增殖的非特异性(不依赖于抗原的)刺激。

图6中呈现的数据表明，与来自对照动物的培养T细胞相比，T细胞对使用MOG的次级体外抗原激发的免疫反应受到抑制。图7中的数据示出，与来自PBS治疗的对照动物的培养T细胞相比，先前使用MPC体内治疗的动物的T细胞免疫反应对体内使用PMA/离子霉素非特异性刺激保持了强有力的反应。这种对非特异性刺激的过度反应可能反映小鼠T细胞对人抗原的异种反应。

这些数据表明，即使在最后一次施用MPC之后的24天，人MPC也减少或预防对特异性抗原(例如通过MOG进行的抗原刺激)的T细胞免疫反应。数据表明，富含STRO-1的MPC诱导对多发性硬化症抗原的耐受性。

实施例6-MPC的体外作用

通过如下文所述的增殖分析、混合淋巴细胞反应和细胞因子产生来测试MPC的免疫调节特性。

增殖分析和混合淋巴细胞反应

基本上如实施例4所述从使用MPC或仅使用媒剂治疗的健康C57BL/6小鼠、2D2转基因小鼠或MOG免疫小鼠的脾收集单核细胞。在含有10%FBS、2mM L-谷氨酰胺、1OO单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素(均来自Invitrogen)、ImM丙酮酸钠(Sigma)和50μMβ-巯基乙醇(Sigma)的完全RPMI培养基中制备单细胞悬浮液。红血球裂解后，将细胞洗涤两次并接着在20μg/ml MOG35.55(GL Biochem)、800ng/ml离子霉素和20pg/ml豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)(都来自Sigma)中的任一个的存在下，以每孔2.5×10⁵个细胞的浓度一式三份接种于96孔平底微量滴定板(Nunc)中，或者接种至预涂有10μg/ml抗CD3和^{^}μg/ml抗CD8(都来自BD)的孔中。接着将细胞在37℃、5%CO₂下孵育72小时并且在最后18小时培养期间每孔加入^{^}Ci[3H]胸腺嘧啶核苷。将细胞采集至过滤器垫上并且掺入放射性核酸，在顶部计数采集器(TopCount Havester)(Packard Biosciences)上进行计数。对于涉及由MPC抑制T细胞增殖的实验，在加入脾细胞之前，以每孔从2.5至0.002×10⁴个细胞变化的MPC浓度进行接种。

在混合淋巴细胞反应(MLR)中，将来自C57BL/6小鼠(反应者)的2×10⁵个脾细胞与相等数量的受照射的(20Gy)Balb/c刺激者或受照射的MPC一起孵育并且培养5天的时间，其中在最后24小时培养期间每孔加入1μCi[3H]胸腺嘧啶核苷。

在涉及T细胞抑制的MLR中，在加入脾细胞之前，将2×10⁴个受照射的MPC接种至孔中。

细胞因子产生

用于分析细胞因子产生的上清液获自2.5×10⁶个脾细胞的两天共培养物，所述脾细胞来自单独或在2x10⁴个MPC存在下(MPC:脾细胞比率为1:10)使用20μg/ml MOG35.55刺激的2D2转基因小鼠。我们使用小鼠Th1/Th2/Th17细胞计数珠粒阵列(CBA)试剂盒(BD)，基本上根据制造商的说明执行细胞因子的定量分析，并且在BDFACSCanto II流式细胞仪上进行分析。测量以下细胞因子：白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-a)。

Claims (10)

1.治疗有效量的富含STRO-1⁺TNAP⁺多能细胞的细胞群作为活性组分在制备用于治疗或预防个体的炎症性神经性疾病的药物中的用途，其中所述富含STRO-1⁺TNAP⁺多能细胞的细胞群包含至少5％的STRO-1⁺TNAP⁺多能细胞。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述炎症性神经性疾病是与T细胞对炎症性刺激的反应有关或由其产生。

3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述炎症性神经性疾病是选自由以下组成的组：多发性硬化症、系统性红斑狼疮、格林-巴利综合征、兰伯特-伊顿肌无力综合征、重症肌无力、横贯性脊髓炎、脑白质营养不良和进行性多灶性白质脑病。

4.如权利要求1或2所述的用途，其中所述疾病是多发性硬化症。

5.如权利要求4所述的用途，其中所述疾病是多发性硬化症的慢性进行性形式或多发性硬化症的复发缓解形式。

6.如权利要求1或4所述的用途，其中所述药物用于全身性地施用。

7.如权利要求1或4所述的用途，其中所述治疗有效量能有效增加所述受试者和/或所述疾病的所述发病部位处的调节性T(Treg)细胞的数量。

8.如权利要求1或4所述的用途，其中所述STRO-1⁺TNAP⁺多能细胞经过遗传工程改造以表达阻断T细胞刺激的分子。

9.如权利要求1或4所述的用途，其中所述STRO-1⁺TNAP⁺多能细胞是自体的或异体的。

10.如权利要求1或4所述的用途，其中所述富含STRO-1⁺TNAP⁺多能细胞的群在制备药物之前经过培养扩增。