CN103079579B - T细胞介导的免疫病症的治疗 - Google Patents

Abstract

一种用于抑制T细胞活化的方法，所述方法包括在体外或离体使包含T细胞的细胞群体与有效量的STRO‑1⁺细胞和/或由其得到的可溶性因子接触以抑制T细胞活化。

Description

T细胞介导的免疫病症的治疗

领域

本发明提供用于在离体或体内抑制T细胞活化的方法和组合物。所述方法和组合物适用于治疗由过度或异常T细胞活化引起的病症，诸如自体免疫性疾病。

背景

CD4⁺T淋巴细胞(在本文中称为CD4⁺T细胞)由于其在击退感染和潜在癌性细胞时提供给其它白细胞的“帮助”而在免疫系统中起中枢作用。CD4⁺T细胞在体液和细胞介导的免疫中都起必不可少的作用，并且此外，其在寄生虫感染期间起作用以促进嗜酸性粒细胞和肥大细胞的分化。如果CD4⁺T细胞缺失(如同在AIDS患者中的情况)，那么会使得宿主容易感染多种通常不会对宿主造成威胁的病原体和肿瘤。

因此尽管CD4⁺T在疾病预防中起重要的有益作用，但这些细胞的功能异常会导致严重问题。在一些个体中，CD4⁺T细胞功能异常导致自体免疫性和其它疾病状态。牵涉到CD4⁺T细胞的自体免疫性疾病包括多发性硬化症、类风湿性关节炎和自体免疫性葡萄膜炎。实质上，这些疾病涉及免疫反应异常，其中免疫系统攻击入侵病原体的正常作用受到破坏，而是改为攻击宿主身体组织，导致疾病并且甚至引起死亡。所靶向的宿主组织随自体免疫性疾病而不同，例如在多发性硬化症中，免疫系统攻击脑和脊髓的白质，在类风湿性关节炎中，免疫系统攻击关节的滑膜内衬层。活化的CD4⁺T细胞也与包括移植组织和器官的排斥反应在内的其它疾病以及CD4⁺T细胞淋巴瘤的发展有关。

对由CD4⁺T细胞活性异常引起的病状进行的研究着重于若干动物模型，并且尤其着重于多种实验诱发的自体免疫性疾病。对动物中这些实验诱发的疾病进行研究的前提在于认为它们将提供适用于治疗对应人疾病的信息。出于这一目标，已表明CD4⁺T细胞是引起动物的若干实验诱发的自体免疫性疾病的原因，包括实验性自体免疫性脑脊髓炎(EAE)、胶原蛋白诱发的关节炎(CIA)和实验性自体免疫性葡萄膜炎(EAU)。

EAE是通过使动物对髓鞘碱性蛋白(MBP，脑和脊髓的白质的一种组分)自体免疫化而诱发并且产生与多发性硬化症中所观察到相同的临床症状：脱髓鞘和麻痹。EAE模型作为多发性硬化症比较模型的价值已通过显示这些病状共有因果关系的证据得到证明：Steinman和合作者证实多发性硬化症患者的脑病变中发现的主要细胞类型是CD4⁺T细胞(Oksenberg等，1990，Nature345：344-345)以及与这些脑病变中的细胞相关的T细胞受体(负责抗原识别的分子)具有与造成引起实验性自体免疫性脑脊髓炎(EAE)的CD4⁺T细胞上相同的用于抗原识别的3个氨基酸的结合基元(Oksenberg等，1993，Nature362：68-70)。因此所述证据表明，EAE模型将适用于测试由异常CD4⁺T细胞活性引起的病症的治疗。

虽然似乎破坏CD4⁺T细胞群体的治疗方法可能有效改善这些自体免疫性疾病，但这一方法具有一个极为重要的缺点。所述治疗不仅破坏可与抗原反应并因此参与自体免疫性疾病过程的那些CD4⁺T细胞，而且也破坏并不具活性且未在疾病中涉及的CD4⁺T细胞。因为CD4⁺T细胞在普通免疫反应中起重要作用(保护身体免受感染原侵害)，因此破坏整个CD4⁺T细胞群体导致患者严重免疫受损并因此极易感染。优选方式为在过度或异常CD4⁺T细胞活性的情况下抑制CD4⁺T细胞的活化。

概述

本发明提供用于抑制T细胞活化的方法，所述方法包括在体外或离体使包含T细胞的细胞群体与有效量的STRO-1⁺细胞和/或由其得到的可溶性因子接触以抑制T细胞活化。

在一个实例中，STRO-1⁺细胞和/或由其得到的可溶性因子抑制T细胞受体活化。

在一个实例中，细胞群体是外周血液单核细胞样品。

在另一实例中，细胞群体包含天然表型的CD25⁺CD4⁺T细胞(CD45RA⁺)。

在另一实例中，所述方法包括在体外或离体使包含T细胞的细胞群体与有效量的STRO-1⁺细胞和/或由其得到的可溶性因子和一种或多种诱导形成调节性T细胞的因子接触。

一种或多种诱导形成调节性T细胞的因子可选自由以下组成的组：α-黑素细胞刺激激素(α-MSH)、转化生长因子β2(TGF-β2)、维生素D3和/或地塞米松(Dexamethasone)。

在另一实例中，所述方法进一步包括使包含T细胞的细胞群体与一种或多种选自由以下组成的组的试剂接触：白细胞介素、抗原、抗原呈递细胞、凝集素和细胞表面受体的抗体或特异性配体或其组合。

白细胞介素可选自由以下组成的组：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18或其组合。

本发明还提供通过本文所述的方法获得的T细胞的组合物。

本发明还提供包含T细胞、STRO-1⁺细胞和/或由其得到的可溶性因子、一种或多种诱导形成调节性T细胞的因子和药学上可接受的载体的组合物。

本发明还提供用于治疗有需要的受试者的自体免疫性病症的方法，所述方法包括在体外或离体用有效量的STRO-1⁺细胞和/或由其得到的可溶性因子处理包含T细胞的细胞群体以抑制T细胞活化，和将处理过的细胞施用至受试者。

本发明还提供用于治疗或预防由过度或异常T细胞活化引起的病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的STRO-1⁺细胞和/或由其得到的可溶性因子以抑制患者的T细胞活化。

所述方法可以进一步包括向受试者施用一种或多种选自由以下组成的组的试剂：白细胞介素、抗原、抗原呈递细胞、凝集素和细胞表面受体的抗体或特异性配体或其组合。白细胞介素可选自由以下组成的组：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18或其组合。

可与处理过的T细胞或STRO-1⁺细胞和/或由其得到的可溶性因子联合施用的其它活性剂包括但不限于β干扰素、皮质类固醇、非类固醇抗炎药、肿瘤坏死α阻断剂、抗疟药、环孢菌素、肿瘤坏死α抑制剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、抗体治疗剂、基于细胞的疗法和T细胞表位(例如Circassia的ToleroTrans移植物排斥反应疗法等)。

在一些实例中，Stro-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子经过遗传工程改造以表达阻断T的细胞共刺激的分子。

在本发明的方法的一些实例中，STRO-1⁺细胞富含STRO-1^亮细胞。

STRO-1⁺细胞可以是自体的或同种异体的。在一个实例中，STRO-1^亮细胞是同种异体的。

在此方法的另一实例中，在获得可溶性因子之前，STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞已在培养物中扩增。

在此方法的另一实例中，STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞以10⁵至10¹⁰个细胞范围内的剂量施用。

细胞的示例性剂量包括0.1×10⁶至5×10⁶个之间STRO-1⁺细胞和/或其子代。例如，所述方法包括施用0.3×10⁶至2×10⁶个之间STRO-1⁺细胞和/或其子代。

所述方法的一种形式涉及施用低剂量的STRO-1⁺细胞和/或其子代。这种低剂量是例如0.1×10⁵与0.5×10⁶个之间的STRO-1⁺细胞和/或其子代，诸如约0.3×10⁶个STRO-1⁺细胞和/或其子代。

本发明还涵盖多次施用所述细胞和/或可溶性因子。例如，所述方法可涉及施用所述细胞和监测受试者以确定发生或复发自体免疫性病症的一种或多种症状的时间，以及施用另一剂量的所述细胞和/或可溶性因子。用于评估自体免疫性病症的症状的适合方法对于本领域的技术人员将是显而易见的和/或在本文中描述。

在一个实例中，富含STRO-1⁺细胞和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子的群体每周施用一次或频率更低，诸如每四周一次或频率更低。

在另一实施方案中，富含STRO-1^亮细胞和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子的细胞群体是全身性施用。例如，富含STRO-1^亮细胞和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子的细胞群体可以静脉内、动脉内、肌肉内、皮下施用、施用至主动脉中、心脏的心房或心室中或连接至器官的血管中，例如腹主动脉、肠系膜上动脉、胰十二指肠动脉或脾动脉。

在另一实例中，本发明方法进一步包括施用免疫抑制剂。免疫抑制剂可施用足以允许所述移植细胞具有功能的时间。在一个实例中，免疫抑制剂是环孢菌素。环孢菌素可以每公斤体重5mg至40mg的剂量施用。

在本说明书中，用语“包括(comprise)”或变形(诸如“comprises”或“comprising”)应理解为意指包括所述要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤的组，而不排除任何其它要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤的组。

附图简述

图1.TNAP(STRO-3)和间质前体细胞标志物STRO-1^亮在成人BMMNC中的共表达。通过孵育MACS选择的BMMNC并用与FITC偶合的山羊抗鼠类IgM抗体间接标记的STRO-1(x轴)和用与PE偶合的山羊抗鼠类IgG间接标记的STRO-3mAb(鼠类IgG1)(y轴)进行双色免疫荧光和流式细胞术。点阵直方图表示以列表模式数据形式收集的5×104个事件。垂直线和水平线设定为小于用在相同条件下处理的同种型匹配对照抗体1B5(IgG)和1A6.12(IgM)获得的平均荧光的1.0％的反应性水平。结果表明STRO-1^亮细胞的较小群体共表达TNAP(右上象限)，而其余STRO-1+细胞未能与STRO-3mAb反应。

图2.经过培养和扩增的STRO-1^亮MPC的STRO-1^亮或STRO-1^暗子代的基因表达谱。通过胰蛋白酶/EDTA处理制备离体扩增的骨髓MPC的单细胞悬浮液。将细胞用STRO-1抗体染色，所述STRO-1抗体随后通过与山羊抗鼠类IgM-异硫氰酸荧光素一起孵育加以显现。荧光活化细胞分选(A)后，由经过纯化的表达STRO-1^暗或STRO-1^亮的细胞的群体制备总细胞RNA。使用RNAzolB提取方法和标准程序，从各子群体分离总RNA并用作cDNA合成的模板。使用如先前所述的标准方案(Gronthos等.J Cell Sci.116：1827-1835，2003)通过PCR扩增评估各种转录物的表达。此研究中所用的引物组在表2中示出。扩增后，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳对各反应混合物进行分析，并通过溴化乙锭染色进行观测(B)。使用ImageQant软件参考持家基因GAPDH的表达来评估各细胞标志物的相对基因表达。

图3.经过培养和扩增的STRO-1⁺MPC的STRO-1^亮子代表达高水平的SDF-1，STRO-1^暗子代不能。(A)使用FACS根据区域STRO-1^亮和STRO-1^暗/深将通过MACS分离的STRO-1⁺BMMNC制备物划分为不同STRO-1子集。从各STRO-1子群制备总RNA并用于构建STRO-1^亮消减杂交文库(B-C)。复制已用由经过STRO-1^亮消减cDNA转化的细菌克隆扩增的代表性PCR产物点印的硝化纤维素过滤器。过滤器接着用[³²P]三磷酸脱氧胞苷(dCTP)标记的STRO-1^亮(B)或STRO-1^暗/深(C)消减cDNA探测。箭头指示含有对应于人SDF-1的cDNA片段的1个克隆的差异表达。(D)逆转录酶(RT)-PCR分析显示由培养前通过MACS/FACS新鲜分离的BMMNC STRO-1群体制备的总RNA中SDF-1和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)转录物的相对表达。bp表示碱基对。

图4.STRO-1阴性MSC(制备物A)和STRO-1^亮MPC(制备物B)抑制T细胞增殖的功效的比较。在不存在或存在制备物A或B下将PBMC用经过CD3/CD28涂布的珠粒刺激4天。通过³H-Tdr并入根据每分钟计数(cpm)测量T细胞增殖。

图5.STRO-1阴性MSC(制备物A)和STRO-1^亮MPC(制备物B)抑制T细胞增殖的功效的比较。在不同浓度的制备物A或B存在下将PBMC用经过CD3/CD28涂布的珠粒刺激4天。通过³H-Tdr并入测量各种培养物中的T细胞增殖并报道为在不存在MSC下刺激PBMC时对照T细胞增殖的百分比。

图6.STRO-1^亮MPC减少或阻止对特定抗原的T细胞免疫反应。在MOG_35-55免疫接种后第36天时从经过MPC处理的小鼠和对照组获得脾细胞。将脾细胞在体外培养并再用MOG_35-55刺激且通过[³H]-胸苷并入测量T细胞增殖反应。

图7.经过STRO-3免疫选择且培养扩增的人MPC抑制T细胞的PHA活化。将PMBC用植物血球凝集素(PHA)刺激以引发淋巴细胞增殖。经过STRO-3选择的MPC在一定浓度范围内能够显著抑制PMBC T细胞增殖。

图8.经过STRO-3免疫选择且培养扩增的绵羊STRO-1^亮细胞(MPC)诱导极低水平的同种免疫反应，并且抑制T细胞的PHA活化。绵羊MPC当以1％、5％、10％、20％或50％稀释度用于刺激物细胞(stimulator cell)时不直接诱导淋巴细胞增殖，并且能够显著抑制对用PHA刺激的绵羊PBMC的同种免疫反应的水平。

图9.经过STRO-3免疫选择且培养扩增的绵羊STRO-1^亮细胞(MPC)对PHA介导的淋巴细胞增殖的剂量依赖性免疫抑制作用。绵羊MPC当用作针对绵羊PBMC或纯化的绵羊T细胞(使用Miltenyi T细胞分离试剂盒选择)的刺激物时能够以剂量依赖性方式抑制淋巴细胞增殖。

详细描述

本发明显示STRO-1⁺细胞通过抗原和非抗原特异性机制来抑制T细胞活化。例如，本发明显示STRO-1⁺细胞在体内抑制MOG-特异性T细胞增殖反应。本发明还显示STRO-1⁺细胞在体外抑制抗CD3介导的T细胞增殖反应。本发明因此提供用于治疗或预防已观察到调节性T细胞数量和/或功能异常(例如在自体免疫性病症中)的疾病的新型治疗方法。

定义

如本文所用，术语“治疗(treatment、treating)”是指获得所需药理学和/或生理学作用。所述作用就完全或部分预防病症或其症状来说可以是预防性的和/或就部分或完全治愈病症(例如自体免疫性疾病)和/或可归因于所述病症的不良影响来说可以是治疗性的。如本文所用的“治疗”涵盖哺乳动物，尤其是人的疾病的任何治疗，且包括：(a)增加存活时间；(b)降低由疾病导致的死亡的风险；(c)在可能有疾病倾向但还未诊断为患有所述疾病的受试者中预防疾病发生；(d)抑制疾病，即阻止其发展(例如降低疾病进展速率)；和(e)减轻疾病，即引起疾病衰退。

如本文所用，“预防”病症或病状的治疗剂是指一种化合物，其在统计学样本中，相对于未治疗对照样本使在所治疗样本中的病症或病状的发生率降低，或者相对于未治疗对照样本延迟病症或病状的一种或多种症状的发作或降低其严重性。

如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指动物，包括哺乳动物，包括人。术语“哺乳动物”包括灵长类动物、驯养动物(包括狗、猫、绵羊、牛、马、山羊、猪、小鼠、大鼠、兔、天竺鼠)、捕获动物(诸如动物园动物)和野生动物。

治疗方法

本发明提供可在体外或体内实现的用于抑制T细胞活化的方法。

在一些实施方案中，用于抑制T细胞活化的方法包括在体外或离体使包含T细胞的细胞群体与有效量的STRO-1⁺细胞和/或由其得到的可溶性因子接触足以抑制T细胞活化的时间段。

在一些实施方案中，所述方法包括获得包含T细胞(例如CD4⁺细胞)的细胞群体，和使所述T细胞与STRO-1⁺细胞和/或由其得到的可溶性因子接触足以抑制T细胞受体活化的时间段。

在一个实施方案中，STRO-1⁺细胞和/或由其得到的可溶性因子刺激细胞群体内调节性T细胞的形成或扩增。调节性T细胞是抑制效应物T细胞的活性并且特征为标志物CD4⁺CD25⁺的T细胞子集。在一些实施方案中，调节性T细胞是FoxP3⁺和/或产生IL-10的调节性T细胞。

因此，在另一实施方案中，本发明方法包括在体外或离体将包含T细胞的细胞群体与有效量的STRO-1⁺细胞和/或由其得到的可溶性因子和一种或多种刺激形成调节性T细胞的因子(诸如α黑素细胞刺激激素(α-MSH)和/或转化生长因子β2(TGF-β2)一起培养。在一些方面，培养物还含有维生素D3和/或地塞米松，其已证明促进产生IL-10的调节性T细胞的产生(Barrat等J.Exp.Med.195(5)：2002，603-616)。

在一些实施方案中，T细胞分离自暴露于STRO-1⁺细胞和/或由其得到的可溶性因子之前的哺乳动物样本。

关于T细胞的术语“分离”是指细胞群体制备物处于具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％的T细胞的形式。在一些方面，使所需细胞群体与其它细胞组分分离，在一些情况下特别排除可能会“污染”或干扰对分离中的细胞进行的研究的其它细胞类型。然而应了解，这种“分离的”细胞群体可以包含细胞存活或达到本发明提供的所需结果所必需的其它细胞类型。例如，抗原呈递细胞诸如单核细胞(巨噬细胞)或树突状细胞可以存在于T细胞的“分离的”细胞群体中或者加入到用于产生调节性T细胞的分离的T细胞群体中。在一些方面，这些抗原呈递细胞可以是活化的单核细胞或树突状细胞。

供本发明方法中使用的包含T细胞的细胞群体可以从取自哺乳动物受试者的生物样本中分离。样本可以来源于多种来源，包括但不限于外周血液、去白细胞血液产品、成分血产品(apheresis blood product)、骨髓、胸腺、组织活检体、肿瘤、淋巴结组织、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、肝、免疫病变部位(例如滑液)、胰和脑脊髓液。供体受试者优选为人，并且可以是胎儿、新生儿、儿童、成人，而且可以是正常人、病人或者易患目标疾病的人。

在一些实施方案中，T细胞样本包含来自血液样本的外周血液单核细胞(PBMC)。“外周血液单核细胞”或“PBMC”指淋巴细胞(包括T细胞、B细胞、NK细胞等)和单核细胞。一般来说，PBMC使用标准技术从患者分离。在一些实施方案中，仅获取PBMC，而将大致上全部红细胞和多形核白细胞留下或返回至供体。PBMC可以使用本领域中已知的方法诸如白细胞除去法分离。一般来说，进行5至7升白细胞除去法步骤，其基本上从患者移除PBMC，而将剩余血液组分返回。样本的收集优选在抗凝剂(例如肝素)存在下进行。

包含PBMC或分离的T细胞的含T细胞样本在用STRO-1⁺细胞和/或由其得到的可溶性因子处理之前可以使用各种方法预处理。一般来说，收集后，可另外对细胞进行浓缩，如果此浓缩未与收集同时进行，或者进一步纯化和/或浓缩细胞。例如，PBMC可通过密度梯度离心(例如通过Ficoll-Hypaque梯度)部分纯化。通常使用本领域中熟知的技术对从供体样本分离的细胞进行洗涤以移除血清蛋白质和可溶性血液组分，诸如自体抗体、抑制因子等。一般来说，这涉及加入生理介质或缓冲液，接着进行离心。必要时可重复此举。接着对细胞进行计数，并且通常从5-7升白细胞除去法收集1×10⁹至2×10⁹个血液白细胞。经过纯化的细胞可以在适合介质或缓冲液中再悬浮以维持活力。适用于再悬浮的溶液通常为任选地补充有胎牛血清、BSA、HSA、正常山羊血清和/或其它天然存在的因子的平衡盐溶液(例如生理盐水、PBS、汉克氏平衡盐溶液(Hank′s balanced salt solution)等)与低浓度(通常为5-50mM)可接受的缓冲液的结合。适宜的缓冲液包括但不限于HEPES、磷酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液等。

可以使用富集具有所需特征(例如CD4⁺、FoxP3⁺等)的细胞的技术从细胞的复杂混合物分离特定细胞类型(例如效应物T细胞、调节性T细胞等)。大部分标准分离方法使用亲和纯化技术来获得基本上分离的细胞群体。用于亲和分离的技术包括但不限于磁性分离(例如使用抗体涂布的磁性珠粒)、亲和色谱、与单克隆抗体连接的细胞毒性剂(例如补体和细胞毒素)和利用与固体基质连接的抗体的“淘选法(panning)”。提供精确分离的技术包括荧光活化细胞分选，其可具有不同程度的复杂度，诸如多色通道、阻抗通道等。可以通过采用与死亡细胞缔合的染料(例如碘化丙锭、LDS等)来针对死亡细胞选择活细胞。可以使用对所选细胞的活力不会过分有害的任何技术。

所用亲和试剂可以是细胞表面分子的特异性受体或配体(例如CD4、CD25等)。抗体可以是单克隆或多克隆抗体并且可以由转基因动物、经过免疫的动物、永生化B细胞和经过编码所述抗体的DNA载体转染的细胞产生。抗体制备的详情和所述抗体用作指定结合成员的适合性对于本领域的技术人员来说是熟知的。除抗体试剂外，还可以使用肽-MHC抗原和T细胞受体对，以及肽配体、效应物和受体分子。

用作用于纯化的亲和试剂的抗体一般与用于分离中的标记缀合。标记可包括磁性珠粒(其允许直接分离)、生物素(其可以用与支持物结合的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素移除)、荧光染料(其可以用于荧光活化细胞分选器)或允许容易地分离特定细胞类型的其它此类标记。荧光染料可包括藻胆蛋白(诸如藻红蛋白和别藻蓝蛋白)、荧光素和德克萨斯红(Texas red)。经常，各抗体用不同荧光染料标记以允许针对各标志物独立地分选。

为纯化所需的细胞群体，将细胞特异性抗体加入到细胞悬浮液中并孵育足以结合可用细胞表面抗原的时间段。孵育通常为至少约5分钟并且通常少于约30分钟。希望抗体在反应混合物中具有足够浓度，以使分离效率不受抗体缺乏的限制(即，使用饱和量的抗体)。也可以通过滴定来确定适当浓度。细胞在其中分离的介质将是维持细胞的活力的任何介质。优选的介质是含有0.1％至0.5％BSA的磷酸盐缓冲盐水。各种介质可商购获得并且可以根据细胞的性质加以使用，包括达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s ModifiedEagle Medium)、汉克氏基本盐溶液(Hank′s Basic Salt Solution)、达尔伯克磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco′s phosphate buffered saline)、RPMI、伊斯科夫培养基(Iscove′smedium)、含5mM EDTA的PBS等，任选地补充有胎牛血清、BSA、HSA等。

细胞的染色强度可以通过流式细胞术来监测，其中激光检测荧光染料的定量水平(其与由抗体结合的细胞表面抗原的量成比例)。流式细胞术或荧光活化细胞分选(FACS)还可以用于基于抗体染色强度以及其它参数(诸如细胞尺寸和光散射)来分离细胞群体。尽管染色的绝对水平可能随特定荧光染料和抗体制备物而不同，但数据可以针对对照物进行标准化。

接着根据指定标准物(例如CD4、CD25等)的表达对标记的细胞进行分离。分离的细胞可以收集于维持细胞活力的任何适当介质中，通常在收集管的底部具有血清缓冲垫。各种介质可商购获得并且可以根据细胞的性质加以使用，包括dMEM、HBSS、dPBS、RPMI、伊斯科夫培养基等，经常补充有胎牛血清。

高度富含所需特征的细胞群体(例如CD4⁺T细胞、CD4⁺CD25⁺调节性T细胞等)是以此方式实现。所需群体占细胞组合物的70％或约70％或更多，且通常占细胞组合物的90％或约90％或更多，并且可以多达细胞群体的约95％或更多。富集的细胞群体可以立即使用。细胞也可以冷冻，不过优选在分离程序之前冷冻细胞。或者，细胞可在液氮温度下冷冻并且长时间储存，解冻和能够再使用。细胞通常在DMSO和/或FCS与培养基、葡萄糖等的组合中储存。解冻后，可通过使用生长因子、抗原、刺激、抗原呈递细胞(例如树突状细胞)等使细胞扩增用于增殖和分化。

PBMC或分离的T细胞已进行了任何必要的预处理后，即用STRO-1⁺细胞和/或由其得到的可溶性因子处理细胞。“处理”在本文中指将细胞在适合营养培养基中与STRO-1⁺细胞和/或由其得到的可溶性因子一起孵育足以产生具有抑制由效应T细胞介导的免疫反应的能力的调节性T细胞的时间段。在一些实施方案中，将第一培养物用大致相等体积的营养培养基稀释。在其它方面，将第一细胞培养物分为两个或更多个部分，随后用营养培养基稀释。培养物划分的优势在于在第一培养物的划分中，于第一培养物中形成的细胞集簇(数千个细胞)被机械破坏并形成较小细胞集簇(数十个至数百个细胞)。这些较小集簇随后在下一生长期中能够生长成较大集簇。以此方式产生的细胞培养物可以使用类似方法亚培养两次或更多次。

细胞群体可以在体外在各种培养条件下生长。培养基可以是液体或半固体(例如含有琼脂、甲基纤维素等)。细胞群体宜悬浮于任何适当营养培养基中，包括但不限于伊斯科夫改良达尔伯克培养基或RPMI-1640，通常补充有胎牛血清(约5-10％)、L-谷氨酰胺和抗生素(例如青霉素和链霉素)。

细胞培养物可以含有细胞可以反应的生长因子。如本文所定义的生长因子是在培养物或完整组织中能够通过对跨膜受体的特异性作用来促进细胞的存活、生长和/或分化的分子。生长因子包括多肽和非多肽因子。可以用于培养目标细胞的具体生长因子包括白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18等)和抗原(例如肽抗原、蛋白质抗原诸如同种异体抗原)，优选与抗原呈递细胞、凝集素、非特异性刺激物(例如Con A、LPS等)组合。培养物也可含有可以刺激调节性T细胞活性的细胞表面受体的抗体(例如抗CD3)或特异性配体(呈纯化配体、Fc融合蛋白形式或其它重组标记形式，如亮氨酸拉链形式)。例如，结合调节性T细胞上的TNFR或其它共刺激分子并且可以刺激和增强调节性T细胞活性的mAB或配体。

T细胞群体可以在用STRO-1⁺细胞和/或由其得到的可溶性因子处理之前、期间或之后与未成熟或成熟树突状细胞以及其它抗原呈递细胞(例如单核细胞、B细胞、巨噬细胞等)共培养。

在一些方面，本发明方法适用于离体产生用于移植到患者体内或者开发关于调节性T细胞功能的体外模型和分析的调节性T细胞。调节性T细胞培养物充当新型调节性因子和药物的有价值来源。

过继转移T细胞的方法在本领域中已有描述，例如参见美国专利申请2006/0115899、2005/0196386、2003/0049696、2006/0292164和2007/0172947(其内容以引用的方式并入本文)。因此，熟练从业者将能够容易地将通过本发明的方法获得的处理过的T细胞群体移植或再引入有需要的患者体内。移植的T细胞可以来源于由患者本人或由不接受治疗的另一供体获得的含T细胞的样本。这通常如本领域中所已知来进行并且常包括通过静脉内施用将处理过的细胞再注射(或其它引入方法)到患者体内。例如，可以使用无菌注射器或其它无菌转移机制通过注射将细胞置于50ml Fenwall输注袋中。接着立即将细胞通过静脉内施用历经一段时间通过自由流动静脉内管线输注至患者体内。在一些方面，也可以加入其它试剂，诸如缓冲液或盐。

本发明的另一方面提供用于通过联合施用通过本发明方法获得的处理过的T细胞和至少一种其它活性剂来治疗自体免疫相关病症的方法。在一些实施方案中，其它活性剂是用于治疗或预防自体免疫性疾病的治疗剂。本发明的活性剂可以包括但不限于β干扰素、皮质类固醇、非类固醇抗炎药、肿瘤坏死阻断剂、抗疟药、环孢菌素、肿瘤坏死α抑制剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、细胞因子、抗移植物排斥反应治疗剂、维生素D3、地塞米松、抗体治疗剂和T细胞表位(例如Circassia的ToleroTrans移植物排斥反应疗法等)。适于联合施用的细胞因子可以包括但不限于IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、TGF-β、IL-15和/或IL-17。在一些实施方案中，其它活性剂可以是包含除调节性T细胞以外的其它细胞类型的细胞群体。例如，处理过的T细胞可以与一种或多种抗原呈递细胞类型(诸如单核细胞或树突状细胞)联合施用至有需要的患者。在一些方面，这些抗原呈递细胞可以是活化的单核细胞或树突状细胞。

在移植至患者体内后，必要时可评估治疗的效果。本领域的技术人员将认识到，存在多种评估自体免疫性疾病的免疫学表现的方法(例如定量特定免疫球蛋白的总抗体效价、肾功能测试、组织损伤评估等)。也可进行T细胞功能(诸如T细胞数量、表型、活化状态和对抗原和/或有丝分裂原反应的能力)的测试。

本发明的一个方面提供通过向有需要的患者施用有效抑制患者的T细胞活化的量的STRO-1⁺细胞和/或由其得到的可溶性因子来治疗或预防患者的由过度T细胞活化引起的病症(诸如自体免疫性病症或病状)的方法。

本发明的实例表明向小鼠模型施用STRO-1⁺细胞和/或由其得到的可溶性因子导致效应物T细胞活性的抑制。

在一个实施方案中，本发明提供施用STRO-1⁺细胞和/或由其得到的可溶性因子以促进调节性T细胞介导的对自体免疫性病症或病状的抑制的方法。

虽然本发明的方法可用于治疗罹患自体免疫性病症的患者，但在一些实施方案中，所述方法也适用于尚未患病但有发展自体免疫性反应的患者。

本发明提供通过联合施用STRO-1⁺细胞和/或由其得到的可溶性因子与至少一种其它活性剂来治疗自体免疫相关病症的方法。本发明的活性剂可以包括但不限于β干扰素、皮质类固醇、非类固醇抗炎药、肿瘤坏死阻断剂、抗疟药、环孢菌素、肿瘤坏死α抑制剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、细胞因子、抗移植物排斥反应治疗剂、基于细胞的治疗剂、维生素D3、地塞米松和抗体治疗剂。适于联合施用的细胞因子可以包括但不限于IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β、IL-15和/或IL-17。在一些实施方案中，其它活性剂是用于治疗或预防自体免疫性疾病的治疗剂。

据信多种自体免疫性疾病的发病机理是由自体免疫性T细胞对有机体中存在的自身抗原的反应引起。例如，自体反应性T细胞与以下的发病机理有关：I型糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、自体免疫性心肌炎、天疱疮、乳糜泻、重症肌无力、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、格雷夫氏病(Graves′disease)、阿狄森氏病(Addison′s disease)、自体免疫性肝炎、慢性莱姆关节炎(chronic Lyme arthritis)、家族性扩张性心肌病、青少年皮肌炎、多软骨炎、体格伦氏综合症(sjogren′s syndrome)、牛皮癣、青少年特发性关节炎、炎症性肠病、全身性红斑狼疮和移植物抗宿主疾病。

如本文所用，术语“可溶性因子”应理解为指可溶于水的由STRO-1⁺细胞和/或其子代产生的任何分子，例如蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、脂蛋白、脂肽、碳水化合物等。所述可溶性因子可以在细胞内和/或由细胞分泌。所述可溶性因子可以是复杂混合物(例如上清液)和/或其组分和/或可以是纯化的因子。在本发明的一个实施方案中，可溶性因子是上清液或是含于上清液内。因此，本文涉及施用一种或多种可溶性因子的任何实施方案应理解为对上清液的施用作了必要修改。

本发明的方法可能涉及施用仅仅富含STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞的细胞群体，和/或由其得到的可溶性因子。本发明方法还可能涉及施用仅仅子代细胞，或由所述子代细胞得到的可溶性因子。本发明方法还可能涉及施用STRO-1^亮细胞和其子代细胞的混合群体，或来自STRO-1^亮细胞和其子代细胞的混合培养物的可溶性因子。

进一步预期，可能仅需要本发明的STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子的单次治疗，从而消除对长期免疫抑制药物疗法的需要。或者，可能采用多次施用STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子。

STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子的剂量可在宽泛限度内变化，并且当然适于各特定情况下的个别要求。一般来说，在肠胃外施用的情况下，通常每公斤接受者体重施用约1万至5百万个细胞。所用细胞的数量将取决于接受者的体重和病状、施用的次数或频率以及本领域的技术人员已知的其它变量。

细胞的示例性剂量包括0.1×10⁶至5×10⁶个之间的STRO-1⁺细胞和/或其子代。例如，所述方法包括施用0.3×10⁶至2×10⁶个之间的STRO-1⁺细胞和/或其子代。

所述方法的一种形式涉及施用低剂量的STRO-1⁺细胞和/或其子代。这种低剂量是例如0.1×10⁵与0.5×10⁶个之间的STRO-1⁺细胞和/或其子代，诸如约0.3×10⁶个STRO-1⁺细胞和/或其子代。

细胞可以悬浮于适当稀释剂中，浓度为每毫升约0.01至约5×10⁶个细胞。适用于注射溶液的赋形剂为在生物学上和生理学上与细胞和与接受者相容的赋形剂，诸如缓冲盐水溶液或其它适合赋形剂。用于施用的组合物优选根据符合适当无菌性和稳定性的标准方法配制、制备和储存。

以下实例进一步说明本发明的各方面。然而，它们绝不对本文所述的本发明的教导和公开构成限制。

STRO-1 ⁺ 细胞或子代细胞，和由其得到的上清液或者一种或多种可溶性因子

STRO-1⁺细胞为在骨髓、血液、牙髓细胞、脂肪组织、皮肤、脾、胰、脑、肾、肝、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、骨、韧带、肌腱、骨骼肌、真皮和骨膜中发现的细胞；并且能够分化成生殖系(germ line)，诸如中胚层和/或内胚层和/或外胚层。

在一个实施方案中，STRO-1⁺细胞是多能细胞，其能够分化成大量细胞类型，包括但不限于脂肪组织、骨组织、软骨组织、弹性组织、肌肉组织和纤维结缔组织。这些细胞所进入的特定谱系决定和分化路径取决于来自机械影响和/或内源性生物活性因子(诸如生长因子、细胞因子)和/或由宿主组织建立的局部微环境条件的各种影响。STRO-1⁺多能细胞因此为非造血祖细胞，其分裂产生子细胞，所述子细胞为干细胞或适时不可逆分化产生表型细胞的前体细胞。

在一个实例中，STRO-1⁺细胞是从由受试者(例如欲治疗的受试者或相关受试者或不相关受试者(无论是相同物种抑或不同物种))获得的样本富集而来。术语“富集”或其变形在本文中用于描述一种细胞群体，其中当与细胞的未处理群体(例如处于天然环境中的细胞)相比较时，一种特定细胞类型的比例或者多种特定细胞类型的比例增加。

在一个实例中，本发明中所用的细胞表达一种或多种个别地或全体选自由以下组成的组的标志物：TNAP⁺、VCAM-1⁺、THY-1⁺、STRO-4⁺(HSP-90β)、STRO-2⁺、CD45⁺、CD146⁺、3G5⁺或其任何组合。

“个别地”指本发明独立地涵盖所述标志物或标志物组，以及虽然个别标志物或标志物组不能独立地在本文中列出，但随附权利要求书仍可彼此独立地和分开地定义所述标志物或标志物组。

“全体”指本发明涵盖任何数量的所述标志物或肽组或其组合，以及虽然所述数量的标志物或标志物组或其组合不能在本文中具体列出，但随附权利要求书仍可将所述组合或子组合与标志物或标志物组的任何其它组合独立地和分开地定义。

在一个实例中，STRO-1⁺细胞是STRO-1^亮(同义词STRO-1^亮)。在一个实例中，相对于STRO-1^暗或STRO-1^中间细胞，Stro-1^亮细胞优先富集。

在一个实例中，STRO-1^亮细胞另外是TNAP⁺、VCAM-1⁺、THY-1⁺、STRO-4⁺(HSP-90β)、STRO-2⁺和/或CD146⁺中的一种或多种。

在一个实例中，间质前体细胞是WO2004/85630中所定义的血管周围间质前体细胞。

对于指定标志物称为“阳性”的细胞，其可能根据标志物存在于细胞表面上的程度而表达低(lo或暗)或高(亮、亮)水平的所述标志物，其中所述术语涉及细胞分选过程中所用的荧光或其它标志物的强度。lo(或暗或深)和亮的区别应放在所分选特定细胞群体上所用的标志物的情形中加以理解。对于指定标志物称为“阴性”的细胞不一定完全不存在于所述细胞。所述术语指细胞表达所述标志物的水平相对极低，并且当在可检测标记时产生极低信号或者在背景水平以上不可检测，例如使用同种型对照抗体检测到的水平。

当在本文中使用时，术语“亮”是指细胞表面上的标志物在可检测标记时产生相对较高的信号。虽然不希望受理论限制，但提出“亮”细胞所表达的靶标志物蛋白(例如由STRO-1识别的抗原)比样本中的其它细胞多。例如，当用缀合FITC的STRO-1抗体标记时，如通过荧光活化细胞分选(FACS)分析所测定的STRO-1^亮细胞产生比非亮细胞((STRO-1^深/暗)高的荧光信号。在一个实例中，“亮”细胞构成起始样本中所含的最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0.1％。在其它实例中，“亮”细胞构成起始样本中所含的最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0.1％、至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％或至少约2％。在一个实例中，STRO-1^亮细胞的STRO-1表面表达相对于“背景”(即STRO-1^-细胞)具有2个对数量级以上的表达。相比之下，STRO-1^暗和/或STRO-1^中间细胞的STRO-1表面表达与“背景”相比具有小于2个对数量级的表达，通常与“背景”相比约1个对数以下。

如本文所用，术语“TNAP”意欲涵盖组织非特异性碱性磷酸酶的所有亚型。例如，所述术语涵盖肝亚型(LAP)、骨亚型(BAP)和肾亚型(KAP)。在一个实例中，TNAP是BAP。在一个实例中，如本文所用的TNAP是指可以结合由2005年12月19日根据布达佩斯条约(BudapestTreaty)的规定以保藏编号PTA-7282保藏于ATCC的杂交瘤细胞系产生的STRO-3抗体的分子。

此外，在一个实例中，STRO-1⁺细胞能够产生克隆CFU-F。

在一个实例中，大比例的STRO-1⁺多能细胞能够分化成至少两种不同生殖系。多能细胞可以发展成的谱系的非限制性实例包括骨前体细胞；肝细胞祖细胞，其具有胆道上皮细胞和肝细胞的多潜能；神经限制细胞，其可以产生会发展成少突胶质细胞和星形胶质细胞的神经胶质细胞前体；神经元前体，其会发展出神经元；心肌和心肌细胞、葡萄糖反应性胰岛素分泌胰腺β细胞系的前体。其它谱系包括但不限于成牙质细胞、牙质产生细胞和软骨细胞，以及以下的前体细胞：视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞(诸如角化细胞)、树突状细胞、毛囊细胞、输尿管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮、神经胶质、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

在另一实例中，STRO-1⁺细胞在培养时不能产生造血细胞。

在一个实例中，细胞是取自欲治疗的受试者，使用标准技术在体外培养并且用于获得上清液或可溶性因子或扩增细胞以自体或同种异体组合物形式施用至受试者。在可选实例中，使用一种或多种已建立的人细胞系的细胞。在本发明的另一适用实例中，使用非人动物的细胞(或者如果患者不是人，而来自于另一物种)。

本发明还涵盖使用由自体外培养物产生的STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞(后者也称为扩增细胞)获得或得到的上清液或可溶性因子。本发明的扩增细胞根据培养条件(包括培养基中刺激因子的数量和/或类型)、传代次数等可以具有多种表型。在某些实例中，子代细胞是在从亲本群体传代约2次、约3次、约4次、约5次、约6次、约7次、约8次、约9次或约10次后获得。然而，子代细胞可以在从亲本群体传代任何次后获得。

子代细胞可以通过在任何适合培养基中培养而获得。如本文在提及细胞培养时使用的术语“培养基”包括细胞周围环境的组分。培养基可以是固体、液体、气态或相和材料的混合物。培养基包括液体生长培养基以及不供养细胞生长的液体培养基。培养基也包括胶状培养基，诸如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原蛋白基质。示例性气态培养基包括在皮氏培养皿(petri dish)或其它固体或半固体支持物上生长的细胞所暴露的气相。术语“培养基”也指意欲用于细胞培养中的材料，即使其尚未与细胞接触。换句话说，制备用于细菌培养的富营养液体是培养基。当与水或其它液体混合时变得适于细胞培养的粉末混合物可称为“粉状培养基”。

在一个实例中，适用于本发明方法的子代细胞是通过使用经过STRO-3抗体标记的磁性珠粒从骨髓分离TNAP⁺STRO-1⁺细胞，并接着培养扩增所分离的细胞来获得(关于适合培养条件的实例，请参见Gronthos等Blood85：929-940，1995)。

在一个实例中，所述扩增细胞(子代)(例如至少在5次传代后)可以是TNAP^-、CC9⁺、I类HLA⁺、II类HLA^-、CD14^-、CD19^-、CD3^-、CD11a^-c^-、CD31^-、CD86^-、CD34^-和/或CD80^-。然而，在与本文所述不同的培养条件下，不同标志物的表达有可能会变化。此外，虽然具有这些表型的细胞可在扩增细胞群体中占优势，但这并不指较小比例的细胞不具有此表型(例如，小百分比的扩增细胞可以是CC9^-)。在一个实例中，扩增细胞仍具有分化成不同细胞类型的能力。

在一个实例中，用于获得上清液或可溶性因子或细胞本身的扩增细胞群体包含其中至少25％(诸如至少50％的细胞)的细胞是CC9⁺。

在另一实例中，用于获得上清液或可溶性因子或细胞本身的扩增细胞群体包含其中至少40％(诸如至少45％的细胞)的细胞是STRO-1⁺。

在另一实例中，扩增细胞可表达一种或多种全体或个别地选自由以下组成的组的标志物：LFA-3、THY-1、VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、P-选择蛋白、L-选择蛋白、3G5、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD90、CD29、CD18、CD61、整联蛋白B6-19、血栓调节蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦素-R(STRO-2＝瘦素-R)、RANKL、STRO-1^亮和CD146或这些标志物的任何组合。

在一个实例中，子代细胞是如WO2006/032092中所定义和/或所述的多能扩增STRO-1⁺多能细胞子代(MEMP)。制备可用于得到子代的STRO-1⁺多能细胞的富集群体的方法描述于WO01/04268和WO2004/085630中。在体外情形中，STRO-1⁺多能细胞极少以绝对纯制备物形式存在，而是一般与作为组织特异性定向细胞(TSCC)的其它细胞一起存在。WO01/04268提出以约0.1％至90％的纯度水平从骨髓采集所述细胞。包含可得到子代的MPC的群体可直接从组织来源采集，或者其可为已在离体扩增的群体。

例如，子代可获自大致上纯化的STRO-1⁺多能细胞的已采集且未扩增的群体，其构成其所存在的群体总细胞的至少约0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或95％。此水平可以通过例如选择对至少一种个别地或全体选自由TNAP、STRO-1^亮、3G5⁺、VCAM-1、THY-1、CD146和STRO-2组成的组的标志物呈阳性的细胞来实现。

MEMPS可与新鲜采集的STRO-1⁺多能细胞的区别之处在于其对于标志物STRO-1^亮呈阳性且对于标志物碱性磷酸酶(ALP)呈阴性。相比之下，新鲜分离的STRO-1⁺多能细胞对于STRO-1^亮和ALP两者都呈阳性。在本发明的一个实例中，至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的所施用细胞具有表型STRO-1^亮、ALP^-。在一个实例中，MEMPS对于标志物Ki67、CD44和/或CD49c/CD29、VLA-3、α3β1中的一种或多种呈阳性。在另一实例中，MEMP不显示TERT活性和/或对于标志物CD18呈阴性。

STRO-1⁺细胞起始群体可源自WO01/04268或WO2004/085630中所述的任一种或多种组织类型，即骨髓、牙髓细胞、脂肪组织和皮肤，或许更广泛来说来自脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰、骨、韧带、骨髓、肌腱和骨骼肌。

应理解，在进行本发明时，带有任何指定细胞表面标志物的细胞的分离可以通过多种不同方法来实现，然而，一些方法依赖于结合剂(例如抗体或其抗原结合片段)与所关注标志物的结合，随后分离显示结合(为高水平结合或低水平结合)或不结合的那些细胞。最适宜结合剂为诸如单克隆抗体或基于单克隆抗体的抗体或基于抗体的分子，因为后者具有特异性。抗体在两个步骤中都可使用，然而也可以使用其它试剂，因此这些标志物的配体也可以用于富集带有所述标志物或缺乏所述标志物的细胞。

抗体或配体可连接至固体支持物以允许粗分离。分离技术优选使欲收集的部分的活力保持最大。具有不同功效的各种技术可用于获得相对较粗的分离。所用特定技术将取决于分离效率、相关细胞毒性、执行的容易性和速度，以及复杂设备和/或技术技能的必要性。分离程序可包括但不限于使用涂有抗体的磁性珠粒的磁性分离、亲和色谱和利用连接至固体基质的抗体的“淘选”。提供精确分离的技术包括但不限于FACS。执行FACS的方法对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

针对本文所述的各标志物的抗体可商购获得(例如抗STRO-1的单克隆抗体可从R&D Systems，USA商购获得)、从ATCC或其它保藏组织获得和/或可使用业内公认的技术产生。

分离STRO-1⁺细胞的方法例如包括第一步骤，其为利用例如识别STRO-1的高水平表达的磁性活化细胞分选(MACS)的固相分选步骤。接着必要时可进行第二分选步骤以得到更高水平的前体细胞表达，如专利说明书WO01/14268中所述。此第二分选步骤可能涉及使用两种或更多种标志物。

获得STRO-1⁺细胞的方法还可能包括使用已知技术进行第一富集步骤之前采集细胞来源。因此，组织将以手术方式移除。接着将构成来源组织的细胞分离为所谓单细胞悬浮液。此分离可以通过物理和或酶学方式达成。

一旦获得了适合的STRO-1⁺细胞群体，就可以通过任何适合方式对其进行培养或扩增以获得MEMP。

在一个实例中，细胞是取自欲治疗的受试者，使用标准技术在体外培养并且用于获得上清液或可溶性因子或扩增细胞以作为自体或同种异体组合物形式施用至受试者。在可选实例中，使用一种或多种已建立的人细胞系的细胞来获得上清液或可溶性因子。在本发明的另一适用实例中，使用非人动物的细胞(或者如果患者不是人，来自另一物种)来获得上清液或可溶性因子。

本发明可以使用来自任何非人动物物种的细胞加以实施，包括但不限于非人灵长类动物细胞、有蹄类动物、犬科动物、猫科动物、兔类动物、啮齿动物、鸟类动物和鱼类动物细胞。可用于实施本发明的灵长类动物细胞包括但不限于黑猩猩、狒狒、食蟹猕猴和任何其它新世界或旧世界猴类的细胞。可用于实施本发明的有蹄类动物细胞包括但不限于牛、猪、绵羊、山羊、马、水牛和野牛的细胞。可用于实施本发明的啮齿动物细胞包括但不限于小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠和沙鼠细胞。可用于实施本发明的兔类动物物种的实例包括家兔、长腿大野兔、野兔、棉尾兔、雪地兔和鼠兔。鸡(原鸡(Gallus gallus))为可用于实施本发明的鸟类物种的一个实例。

适用于本发明方法的细胞在使用前或获得上清液或可溶性因子前可储存。保藏和储存真核细胞和尤其哺乳动物细胞的方法和方案在本领域中是已知的(参见例如Pollard，J.W.和Walker，J.M.(1997)Basic Cell Culture Protocols，第二版，Humana Press，Totowa，N.J.；Freshney，R.I.(2000)Culture of Animal Cells，第四版，Wiley-Liss，Hoboken，N.J.)。维持所分离的干细胞(诸如间质干细胞/祖细胞)或其子代的生物活性的任何方法都可以结合本发明使用。在一个实例中，通过使用低温保藏来维持和储存细胞。

遗传修饰的细胞

在一个实施方案中，对STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞进行遗传修饰，例如表达和/或分泌目标蛋白质，例如提供治疗和/或预防效益的蛋白质，例如胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、弹性蛋白酶、羧肽酶、胰脂肪酶或淀粉酶，或与血管生成增强有关或引起血管生成的多肽，或与细胞分化成胰腺细胞或血管细胞有关的多肽。

遗传修饰细胞的方法对于本领域的技术人员来说是显而易见的。例如，使欲在细胞中表达的核酸可操作地连接至用于在细胞中诱导表达的启动子。例如，将核酸连接至可在受试者的多种细胞中可操作的启动子，诸如病毒启动子，例如CMV启动子(例如CMV-IE启动子)或SV-40启动子。其它适合启动子在本领域中是已知的并且应理解为在作了必要修改的情况下适用于本发明的实施方案。

优选地，核酸是以表达构建体的形式提供。如本文所用，术语“表达构建体”是指具有在细胞中将表达赋予到可操作地连接的核酸(例如报道基因和/或可反选择的报道基因)的能力的核酸。在本发明的上下文中，应了解，表达构建体可包含或为质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒亚基因组或基因组片段或能够以可表达格式维持和/或复制异源DNA的其它核酸。

构建适用于实施本发明的表达构建体的方法对于本领域的技术人员来说将是显而易见的并且描述于以下文献中：例如Ausubel等(Current Protocols in MolecularBiology.Wiley Interscience，ISBN047150338，1987)或Sambrook等(Molecular Cloning：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，NewYork，第三版2001)。例如，使用例如PCR从适合模板核酸扩增表达构建体的各组分并随后克隆至适合的表达构建体(诸如质粒或噬菌粒)中。

适于所述表达构建体的载体在本领域中是已知的和/或在本文中描述。例如，适于哺乳动物细胞中的本发明方法的表达载体为例如由Invitrogen供应的pcDNA载体套装的载体、pCI载体套装的载体(Promega)、pCMV载体套装的载体(Clontech)、pM载体(Clontech)、pSI载体(Promega)、VP16载体(Clontech)或pcDNA载体套装的载体(Invitrogen)。

本领域的技术人员将认识到其它载体和所述载体的来源，诸如Invitrogen公司、Clontech或Promega。

用于将分离的核酸分子或包含所述核酸的基因构建体引入细胞中用于表达的方式对于本领域的技术人员来说是已知的。用于指定生物体的技术取决于已知的成功技术。用于将重组DNA引入细胞中的方式包括显微注射、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体(诸如使用lipofectamine(Gibco，MD，USA)和/或cellfectin(Gibco，MD，USA))介导的转染、PEG介导的DNA吸收、电穿孔和微粒轰击(诸如使用涂有DNA的钨粒子或金粒子(Agracetus Inc.，WI，USA)以及其它方式。

或者，本发明的表达构建体是病毒载体。适合病毒在本领域中是已知的并且可商购获得。用于递送核酸和使所述核酸整合至宿主细胞基因组中的常规基于病毒的系统包括例如逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体。或者，腺病毒载体适用于将保持游离形式的核酸引入宿主细胞中。病毒载体为靶细胞和组织中基因转移的有效且通用的方法。另外，已在多种不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。

例如，逆转录病毒通常包含包装能力高达6-10kb外来序列的顺式作用长末端重复(LTR)。最小顺式作用LTR就足以用于载体的复制和包装，其接着用于将表达构建体整合至靶细胞中以提供长期表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于以下病毒的载体：鼠类白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SrV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和其组合(参见例如Buchscher等，J Virol.56：2731-2739(1992)；Johann等，J.Virol.65：1635-1640(1992)；Sommerfelt等，Virol.76：58-59(1990)；Wilson等，J.Virol.63：274-2318(1989)；Miller等，J.Virol.65：2220-2224(1991)；PCT/US94/05700；Miller和Rosman BioTechniques7：980-990，1989；Miller，A.D.Human Gene Therapy7：5-14，1990；Scarpa等Virology75：849-852，1991；Burns等Proc.Natl.Acad.Sci USA90：8033-8037，1993)。

已开发各种腺相关病毒(AAV)载体系统用于核酸递送。AAV载体可以使用本领域中已知的技术容易地构建。参见例如美国专利号5,173,414和5,139,941；国际公布号WO92/01070和WO93/03769；Lebkowski等Molec.Cell.Biol.5：3988-3996，1988；Vincent等(1990)Vaccines90(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter Current Opinion inBiotechnology5：533-539，1992；Muzyczka.Current Topics in Microbiol，andImmunol.158：97-129，1992；Kotin，Human Gene Therapy5：793-801，1994；Shelling和Smith Gene Therapy7：165-169，1994；和Zhou等J Exp.Med.179：1867-1875，1994。

适用于递送本发明的表达构建体的其它病毒载体包括例如来源于痘病毒家族的载体，诸如牛痘病毒和禽痘病毒或α病毒或缀合病毒载体(例如Fisher-Hoch等，Proc.NatlAcad.Sci.USA56：317-321，1989中所述的载体)。

细胞和可溶性因子的治疗/预防潜能的分析

测定由STRO-1^亮细胞得到的可溶性因子抑制T细胞活化的能力的方法对于本领域的技术人员将是显而易见的。

例如，适于测定可溶性因子的免疫抑制活性的体外测试描述于本文的实施例5和8中。

在另一实例中，如本文实施例6中所述在实验性炎症脑脊髓炎(EAE)的体内模型中评估本文所述的细胞和/或可溶性因子的功效。

本领域的技术人员根据前述内容显而易见，本发明还提供用于鉴别或分离用于抑制T细胞活化的可溶性因子的方法，所述方法包括：

(i)向罹患EAE的测试受试者施用可溶性因子并评估所述受试者中EAE的进展；

(ii)比较(i)受试者中EAE的水平与罹患EAE但未施用可溶性因子的对照受试者体内EAE的水平，

其中测试受试者体内的EAE相较于对照受试者降低表明所述可溶性因子治疗、预防或延缓EAE。

细胞组合物

在本发明的一个实施方案中，STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞是以组合物形式施用。优选地，所述组合物包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。

术语“载体”和“赋形剂”是指在本领域中常规用于促进活性化合物的储存、施用和/或生物活性的物质的组合物(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Mac Publishing Company(1980)。载体还可减少活性化合物的任何不当副作用。适合载体例如是稳定的，例如不能与载体中的其它成分反应。在一个实例中，载体在用于治疗的剂量和浓度下在接受者体内不产生明显的局部或全身性不良作用。

适用于本发明的载体包括那些常规使用的载体，例如水、盐水、右旋糖水溶液、乳糖、林格氏溶液(Ringer′s solution)、缓冲溶液、透明质酸和二醇是优选液体载体，特别是(当等渗时)溶液的载体。适合药用载体和赋形剂包括淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等。

在另一实例中，载体是介质组合物，例如细胞在其中生长或悬浮的介质组合物。优选地，所述介质组合物不在其所施用的受试者中诱发任何不良作用。

优选介质和赋形剂不会不利地影响细胞活力和/或细胞减少、预防或延迟胰腺功能异常的能力。

在一个实例中，载体和赋形剂提供缓冲活性以使细胞和/或可溶性因子维持在适合pH下，由此发挥生物活性，例如载体或赋形剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。PBS代表一种有吸引力的载体或赋形剂，因为其与细胞和因子相互作用的程度最低并且允许快速释放细胞和因子，在这种情况下，可将本发明的组合物制造为用于例如通过注射直接应用至血流或组织或围绕组织周围或与组织相邻的区域中的液体。

STRO-1⁺细胞和/或其子代细胞也可以并入或包埋于与接受者相容并且降解为对接受者无害的产物的骨架中。所述骨架提供对欲移植到接受受试者体内的细胞的支持和保护。天然和/或合成生物可降解性骨架为所述骨架的实例。

多种不同的骨架可成功用于实施本发明。优选骨架包括但不限于生物可降解的骨架。天然生物可降解骨架包括胶原蛋白、纤连蛋白和层连蛋白骨架。适用于细胞移植骨架的合成材料应能够支持广泛细胞生长和细胞功能。所述骨架也可被吸收。适合骨架包括聚乙醇酸骨架，例如如Vacanti等，J.Ped.Surg.23：3-91988；Cima等，Biotechnol.Bioeng.38：1451991；Vacanti等，Plast.Reconstr.Surg.88：753-91991所述，或合成聚合物，诸如聚酸酐、聚原酸酯和聚乳酸。

在另一实例中，细胞可在凝胶骨架(诸如来自Upjohn公司的Gelfoam)中施用。

适用于本发明的细胞组合物可以单独施用或作为与其它细胞的混合物施用。可结合本发明组合物施用的细胞包括但不限于其它多效或多能细胞或干细胞，或骨髓细胞。不同类型的细胞可在临施用前或施用前不久与本发明组合物混合，或者其可以在施用前一起共培养一段时间。

优选地，组合物包含有效量或治疗或预防有效量的细胞。例如，组合物包含约1×10⁵个STRO-1⁺细胞/kg至约1×10⁷个STRO-1⁺细胞/kg或约1×10⁶个STRO-1⁺细胞/kg至约5×10⁶个STRO-1⁺细胞/kg。欲施用的细胞的确切量取决于多种因素，包括患者的年龄、体重和性别以及胰腺功能异常的程度和严重性。

在一些实施方案中，细胞是含于不允许细胞离开进入受试者循环中，然而允许由细胞分泌的因子进入循环中的腔室中。以此方式，可通过允许细胞分泌因子进入受试者循环中来向受试者施用可溶性因子。所述腔室同样可植入受试者的某一部位以增加可溶性因子的局部水平，例如在移植器官中或其附近植入。

在本发明的一些实施方案中，可不必或不需要在起始细胞组合物疗法前对患者进行免疫抑制。因此，移植同种异体或者甚至异种的Stro-1^亮细胞或其子代在一些情况下可能是耐受的。

然而，在其它情况下，在起始细胞疗法前以药理学方式对患者进行免疫抑制可能是需要或适当的。这可以通过使用全身性或局部免疫抑制剂来实现，或者这可以通过在囊封装置中递送细胞来实现。细胞可以囊封在细胞所需要的营养物和氧以及治疗因子可透过，而细胞不可透过的胶囊中来免疫体液因子和细胞。优选地，囊封剂具有低变应原性，容易地且稳定地位于靶组织中，并且对所植入的结构提供额外保护。降低或消除对移植细胞的免疫反应的这些和其它方式在本领域中是已知的。作为替代，可对细胞进行遗传修饰以降低其免疫原性。

可溶性因子的组合物

在本发明的一个实施方案中，由STRO-1⁺细胞得到和/或由子代细胞得到的上清液或可溶性因子是以例如包含适合载体和/或赋形剂的组合物形式施用。优选地，载体或赋形剂不会不利地影响可溶性因子或上清液的生物学作用。

在一个实施方案中，组合物包含稳定可溶性因子或上清液组份(例如蛋白酶抑制剂)的物质的组合物。优选地，所包括蛋白酶抑制剂的量不足以对受试者产生不良影响。

包含由STRO-1⁺细胞得到和/或由子代细胞得到的上清液或可溶性因子的组合物可制备为适当液体悬浮液，例如于培养基或于稳定载体或缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)中的悬浮液。适合载体在上文中描述。在另一实例中，包含由STRO-1⁺细胞得到和/或由子代细胞得到的上清液或可溶性因子的悬浮液是用于注射的油性悬浮液。适合亲脂性溶剂或媒剂包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。欲用于注射的悬浮液也可含有增加悬浮液的粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或聚葡萄糖。任选地，悬浮液也可含有适合的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩溶液的试剂。

可以通过在具有上述成分之一或其组合的适当溶剂中并入所需量的上清液或可溶性因子，需要时随后过滤灭菌来制备无菌注射溶液。

一般来说，通过将上清液或可溶性因子并入含有基本分散介质或来自以上列出成分的其它所需成分的无菌媒剂中来制备分散液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，此举产生活性成分加来自其前述无菌过滤溶液的任何其它所需成分的粉末。根据本发明的替代方面，上清液或可溶性因子可以与一种或多种增强它的溶解度的其它化合物一起配制。

其它示例性载体或赋形剂描述于以下文献中：例如Hardman等，(2001)Goodmanand Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，McGraw-Hill，New York，N.Y.；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Lippincott，Williams，and Wilkins，New York，N.Y.；Avis等，(编著)(1993)Pharmaceutical DosageForms：Parenteral Medications，Marcel Dekker，NY；Lieberman等，(编著)(1990)Pharmaceuticai Dosage Forms：Tablets，Marcel Dekker，NY；Lieberman等，(编著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems，Marcel Dekker，NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.。

治疗性组合物通常应无菌且在制造和储存条件下稳定。组合物可配制成溶液、微乳液、脂质体或其它有序结构。载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合混合物的溶剂或分散介质。可例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度和通过使用表面活性剂来维持适当流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂(例如糖)、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬酯酸盐和明胶)来达成。此外，可溶性因子可以于时间释放制剂中施用，例如于包括缓慢释放聚合物的组合物中施用。活性化合物可用保护化合物免于快速释放的载体制备，诸如控制释放制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLG)。多种用于制备所述制剂的方法已获得专利或通常为本领域的技术人员所已知。

上清液或可溶性因子可与例如提供可溶性因子的缓慢释放的适当基质组合施用。

施用模式

由STRO-1⁺细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1⁺细胞或其子代可手术植入、注射、递送(例如借助于导管或注射器)或以其它方式直接或间接施用至需要修复或增强的部位(例如器官)或施用至受试者的血液系统中。

优选地，由STRO-1⁺细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1⁺细胞或其子代是递送至受试者的血流中。例如，由Stro-1^亮细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1⁺细胞或其子代是以肠胃外方式递送。肠胃外施用的示例性途径包括但不限于静脉内、肌肉内、皮下、动脉内、腹膜内、心室内、脑室内、鞘内。优选地，由STRO-1⁺细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1⁺细胞或其子代是动脉内递送至主动脉、心脏的心房或心室或连接至胰腺的血管(例如腹主动脉、肠系膜上动脉、胰十二指肠动脉或脾动脉)中。

在细胞递送至心脏的心房或心室的情况下，优选将细胞施用至左心房或左心室以避免可能由细胞快速递送至肺而引起的并发症。

优选地，例如使用注射器或通过导管或中心管线将由STRO-1⁺细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1⁺细胞或其子代注射至递送部位中。

用于治疗性制剂的施用方案的选择取决于若干因素，包括实体的血清或组织周转率、症状水平和实体的免疫原性。优选地，施用方案使与可接受水平的副作用相一致的递送至患者的治疗性化合物的量达到最大。因此，所递送制剂的量部分取决于特定实体和所治疗病状的严重性。

在一个实施方案中，由STRO-1⁺细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1⁺细胞或其子代是以单次推注剂量来递送。或者通过连续输注、或通过间隔为例如一天、一周或每周1-7次的剂量来施用由STRO-1⁺细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1⁺细胞或其子代。优选剂量方案是涉及最大化剂量或避免明显不当副作用的剂量频率的方案。总每周剂量取决于所使用化合物的类型和活性。适当剂量由临床医师例如使用本领域中已知或怀疑影响治疗或预测影响治疗的参数或因素来确定。一般来说，剂量始于稍小于最佳剂量的量并在此后以较小增量增加直至相对于任何负面副作用达成所需或最佳的效果。重要诊断指标包括糖尿病症状指标。

实施例

实施例1：MSC制备

MSC是如US5,837,539中所述由骨髓重新产生。将约80-100ml骨髓抽吸至含肝素无菌注射器中并送至MDACC细胞疗法实验室(MDACC Cell Therapy Laboratory)以供产生MSC。使用ficoll-hypaque分离骨髓单核细胞并置于两个T175烧瓶中，其中每个烧瓶具有50mlMSC扩增培养基，所述培养基包括含有庆大霉素、谷氨酰胺(2mM)和20％(v/v)胎牛血清(FBS)(Hyclone)的α改良MEM(αMEM)。

将细胞在37℃、5％CO₂下培养2-3天，此时移除未粘附细胞；连续培养其余粘附细胞直至细胞汇合度达到70％或更高(7-10天)，并接着将细胞用胰蛋白酶处理且置于六个具有MSC扩增培养基的T175烧瓶中(每个烧瓶50ml培养基)。如US5,837,539的表5中所述，以此方式分离和扩增的MSC为STRO-1阴性。

实施例2：通过选择STRO-3+细胞对MPC进行免疫选择

根据皇家阿德莱德医院(Royal Adelaide Hospital)的机构伦理委员会(Institutional Ethics Committee)批准的程序从健康正常的成人志愿者(20-35岁)采集骨髓(BM)。简单地说，从髂后嵴抽吸40ml BM至含肝素锂抗凝剂的试管中。

如先前所述(Zannettino，A.C.等(1998)Blood92：2613-2628)使用Lymphoprep^TM(Nycomed Pharma，Oslo，Norway)通过密度梯度分离制备BMMNC。在4℃下以400×g离心30分钟后，用转移吸管移除白细胞层并在由含有5％胎牛血清(FCS；CSL Limited，Victoria，Australia)的汉克氏平衡盐溶液(HBSS；Life Technologies，Gaithersburg，MD)构成的“HHF”中洗涤三次。

随后如前所述(Gronthos等(2003)Journal of Cell Science116：1827-1835；Gronthos，S.和Simmons，P.J.(1995)Blood85：929-940)通过磁性活化细胞分选分离STRO-3⁺(或TNAP⁺)细胞。简单地说，在冰上将约1-3×10⁸个BMMNC在由10％(v/v)正常兔血清于HHF中组成的阻断缓冲液中孵育20分钟。在冰上将细胞用200μl的STRO-3mAb于阻断缓冲液中的10μg/ml溶液孵育1小时。随后通过在400×g下离心将细胞在HHF中洗涤两次。加入山羊抗小鼠γ-生物素(Southern Biotechnology Associates，Birmingham，UK)于HHF缓冲液中的1/50稀释液且在冰上将细胞孵育1小时。如上将细胞在MACS缓冲液(补充有1％BSA，5mM EDTA和0.01％叠氮化钠的无Ca²⁺且无Mn²⁺的PBS)中洗涤两次并再悬浮于最终体积为0.9ml的MACS缓冲液中。

将100μl抗生蛋白链菌素微珠(Miltenyi Biotec；Bergisch Gladbach，Germany)加入细胞悬浮液中且在冰上孵育15分钟。将细胞悬浮液洗涤两次并再悬浮于0.5ml MACS缓冲液中且随后上样至微型MACS管柱(MS Columns，Miltenyi Biotec)上，并用0.5ml MACS缓冲液洗涤三次以恢复未结合STRO-3mAb(于2005年12月19日保藏于美国典型培养物中心(American Type Culture Collection；ATCC)，保藏编号PTA-7282-参见国际公布号WO2006/108229)。再加入1ml MACS缓冲液后，由磁体移除管柱并通过正压力分离TNAP⁺细胞。将来自各部分的细胞等分试样用抗生蛋白链菌素-FITC染色并通过流式细胞术评估纯度。

实施例3：通过STRO-3mAb选择的细胞是STRO-1 ^亮 细胞

设计实验以证实使用STRO-3mAb作为用于分离细胞STRO-1^亮细胞的单一试剂的可能性。

鉴于STRO-3(IgG1)的同种型与STRO-1(IgM)的同种型不同，因此通过双色FACS分析基于与使用MACS程序分离的STRO-1⁺细胞的共表达评估STRO-3鉴定克隆CFU-F的能力(图1)。点阵直方图表示以列表模式数据形式收集的5×10⁴个事件。垂直线和水平线设定为小于用在相同条件下处理的同种型匹配对照抗体1B5(IgG)和1A6.12(IgM)获得的平均荧光的1.0％的反应性水平。结果表明较小群体的STRO-1亮细胞共表达TNAP(右上象限)，而其余STRO-1⁺细胞未能与STRO-3mAb反应。随后分析所有四个象限的通过FACS分离的细胞的CFU-F发生率(表1)。

表1：通过双色FACS分析基于细胞表面标志物STRO-1和TNAP的共表达富集人骨髓细胞(参考图1)。将FACS分选的细胞在标准克隆条件下在补充有20％FCS的αMEM中培养。数据表示铺板的每10⁵个细胞中第14天群落形成细胞(CFU-F)的平均数±SE(n＝3个不同骨髓抽吸物)。这些数据表明人MPC仅局限于BM(其明显共表达STRO-1抗原)的TNAP阳性部分。

实施例4：Stro-1 ^深 和Stro-1 ^亮 细胞的相对基因和表面蛋白表达

在第一系列实验中，采用半定量RT-PCR分析来检验由通过荧光活化细胞分选分离的STRO-1^深或STRO-1^亮群体表达的各种谱系相关基因的基因表达谱(图2A)。在第二系列实验中，采用流式细胞术和平均通道荧光分析来检验由通过荧光活化细胞分选分离的STRO-1^深或STRO-1^亮群体表达的各种谱系相关蛋白质的表面蛋白质表达谱。

从2×10⁶个STRO-1^亮或STRO-1^深分选的原代细胞、软骨细胞集结粒和其它诱导培养物制备总细胞RNA，并使用RNAzolB提取方法(Biotecx Lab.Inc.，Houston，TX)根据制造商的推荐裂解。从各子群分离的RNA接着用作cDNA合成的模板，使用第一链cDNA合成试剂盒(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)进行制备。如前所述(Gronthos等，J.Bone andMin.Res.14：48-57，1999)通过PCR扩增使用标准方案评估各种转录物的表达。此研究中所用的引物组在表2中示出。扩增后，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳对各反应混合物进行分析，并通过溴化乙锭染色进行观测。通过GAPDH的表达来评估RNA完整性。

使用ImageQant软件参考持家基因GAPDH的表达来评估各细胞标志物的相对基因表达(图2B、2C)。另外，与STRO-1抗体组合基于多种细胞谱系相关标志物的表达使用双色流式细胞分析来检验离体扩增的MPC的蛋白质表达谱。基于STRO-1^深和STRO-1^亮培养细胞的基因和蛋白质表达的一般表型的概述表示于表3中。数据表明，离体扩增的STRO-1^亮MPC显示与血管周围细胞相关的标志物(包括血管位蛋白1、VCAM-1、SDF-1、IL-1_β、TNFα和RANKL)的差异表达较高。STRO-1^深和STRO-1^亮培养细胞的蛋白质和基因表达谱之间的比较概述于表3和表4中。

还进行消减杂交研究以鉴定由STRO-1^亮细胞唯一表达的基因。简单地说，如上所述分离STRO-1^深和STRO-1^亮(参见图3A)。使用RNA STAT-60系统(TEL-TEST)由从5个不同骨髓样本汇集的STRO-1^深和STRO-1^亮细胞制备总RNA。使用SMART cDNA合成试剂盒(ClontechLaboratories)进行第一链合成。通过长程PCR(Advantage2PCR；试剂盒Clontech)使用在初始RT过程中形成的3′和5′初始末端上的特定引物位点根据制造商的说明书扩增所得mRNA/单链cDNA杂交体。用RsaI消化STRO-1亮cDNA后，使用2个等分试样利用Clontech PCR-Select cDNA消减试剂盒来连接不同特定接头寡核苷酸。根据制造商的方案使用STRO-1^亮(测试者)和STRO-1^深(驱动者)cDNA且反之亦然来进行两轮消减杂交。也使用针对STRO-1^亮驱动cDNA杂交的STRO-1^深测试cDNA逆向进行此程序。

为鉴定由STRO-1^亮群体唯一表达的基因，使用STRO-1^亮消减cDNA来构建包含200个随机选择的转化有连接至T/A克隆载体中的STRO-1^亮消减cDNA的细菌克隆的重复低密度微阵列过滤器。随后用[³²P]dCTP标记的STRO-1^亮或STRO-1^深消减cDNA探测微阵列(图3B-3C)。不同筛选鉴定出总共44个克隆，其在STRO-1^深与STRO-1^亮子群之间高度地差异表达。对所有差异表达的克隆进行的DNA测序揭示，仅1个克隆代表已知基质细胞有丝分裂原；即，血小板衍生生长因子(PDGF)(Gronthos和Simmons，Blood.85：929-940，1995)。有趣的是，发现44个克隆中有6个含有对应于趋化因子基质衍生因子1(SDF-1)的DNA插入。人STRO-1^亮细胞中SDF-1转录物的高丰度通过由新鲜分选的STRO-1^亮、STRO-1^深和STRO-1^阴性骨髓子群制备的总RNA的半定量RT-PCR得到证实(图3D和表3)。

表2.用于特异性扩增人mRNA的RT-PCR引物和条件

表3.STRO-1^亮和STRO-1^深群体中相对基因表达的概述。示出当通过逆转录PCR测定时在STRO-1^亮与STRO-1^深群体之间显示可测量且差异表达的基因列表。值表示参考持家基因GAPDH的相对基因表达。

为使蛋白质表面表达与STRO-1表达的密度相关联，通过胰蛋白酶/EDTA分离制备离体扩增的由骨髓MPC得到的细胞的单细胞悬浮液并随后与STRO-1抗体与鉴定多种细胞谱系相关标志物的抗体的组合一起孵育。使用山羊抗鼠类IgM-异硫氰酸荧光素鉴定STRO-1，同时使用山羊抗小鼠或抗兔IgG-藻红蛋白鉴定所有其它标志物。对于鉴定细胞内抗原的那些抗体，首先用STRO-1抗体标记细胞制备物，用70％冷乙醇固定以使细胞膜渗透并接着与细胞内抗原特异性抗体一起孵育。在相同条件下使用同种型匹配对照抗体。使用COULTEREPICS流式细胞仪进行双色流式细胞分析并收集列表模式数据。点阵图表示指示各谱系细胞标志物(y轴)和STRO-1(x轴)的荧光强度水平的5,000个列表模式事件。参考同种型匹配阴性对照抗体建立垂直和水平象限。

表4.STRO-1^亮和STRO-1^深群体中相对蛋白质表达的概述。示出当通过流式细胞术测定时在STRO-1^亮与STRO-1^深群体之间显示差异表达的蛋白质的列表。值表示染色的相对平均荧光强度。

这些结果表明SDF-1α和RANKL由STRO-1^亮细胞大量表达。它的重要性在于这些蛋白质都已知参与CD4+CD25+调节性T细胞的上调，所述T细胞赋予抵抗免疫病症(诸如GVHD)的保护作用(Loser等，Nature Medicine12：1372-1379，2006；Hess，Biol.Blood MarrowTransplant，12(1Suppl2)：13-21，2006；和Meiron等，J.Exp.Medicine205：2643-2655，2008)。

实施例5：体外免疫抑制活性

为评估培养扩增的STRO-1^亮细胞(MPC(B))的免疫抑制活性，我们使用CD3/CD28刺激作为读数。将结果与培养扩增的如实施例1中分离的骨髓来源的STRO-1阴性细胞(MSC(A))的群体相比较。在4个递增浓度的MSC和MPC制备物存在下用涂有CD3/CD28的珠粒刺激人外周血液单核细胞(PBMC)。通过3H-Tdr并入测量T细胞的增殖。

测试MSC(A)和Stro-1^亮MPCs(B)抑制人外周血液单核细胞(PBMC)对CD3/CD28刺激的反应的能力。加入与PBMC培养物呈不同比率的MSC和MPC或商购对照人MSC(Lonza)。3天后，加入3H-Tdr维持18个小时并接着采集培养物。

PBMC回应于CD3/CD28的增殖由所有制备物以剂量依赖性方式抑制。然而，制备物B明显优于由制备物A以及对照hMSC产生的作用(图4)。在1∶100MSC∶PBMC比率下，MPC B仍抑制70％的对照T细胞增殖，而对照商购MSC(Lonza)和MSC A分别产生50％和60％抑制(图5)。

实施例6：MPC对T细胞增殖的体内影响

对于以下实验，在C57B1/6J小鼠中使用由髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)诱发的实验性炎症脑脊髓炎(EAE)。C57Bl/6J小鼠显示与MS患者类似的表型症状(退行性麻痹)以及显示CNS中的广泛炎症、脱髓鞘和轴突缺失/损伤。用于诱发EAE的免疫接种程序、临床症状的评估和所用MPC移植如下。

EAE的活性诱发

将小鼠用溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中且与等体积的含有400μg杀死的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Ra的弗式完全佐剂(Freund′s completeadjuvant)混合的200μg重组MOG免疫接种。使用25号(G)针头将0.1ml此混合物皮下注射至右侧腹和左侧腹中(每只小鼠总共0.2ml)。使用29G针头在第0天和第2天还用0.30ml PBS中的350ng灭活的百日咳博德氏菌(Bordetella pertussis)毒素通过尾静脉静脉内(i.v.)免疫接种。注射后对静脉内部位施加轻缓压力30分钟以降低从静脉内部位出血的风险。

每2-5分钟监测小鼠持续10-15分钟以确保没有活性出血。

用MPC治疗

基本上如实施例2中所述分离MPC。诱发疾病后第8、10和12天，以200μl PBS体积以单次静脉内(i.v.)注射形式施用2×10⁵或4×10⁵个MPC(参见表5)。对照仅接受静脉内注射等体积的PBS。每天监测小鼠并根据下文所述的量表对临床体征进行评分。实验持续约36天以监测疾病过程。在实验终止时，解剖脑、脊髓和视神经并于福尔马林溶液中固定。

表5：治疗方案概述

诱发疾病(MOG35-55免疫接种)后第36天挑选出MPC治疗的小鼠和对照。将脾细胞在体外仅用培养基培养或用MOG_35-55再刺激并接着通过[³H]-胸苷并入测量T细胞增殖反应。将针对MOG的特异性增殖反应与仅培养基中培养的匹配脾细胞(未刺激)相比较。在PMA/离子霉素(Ionomycin)中培养的脾细胞用于测定对T细胞增殖的非特异性(不依赖于抗原的)刺激。

图6中示出的数据表明对MOG次级体外抗原激发的T细胞免疫反应与来自对照动物的培养T细胞相比受到抑制。

这些数据表明，即使在最后施用MPC后24天时，人MPC也减少或预防对特定抗原(例如MOG的抗原刺激)的T细胞免疫反应。数据表明，富含STRO-1的MPC诱导对多发性硬化症抗原的耐受性。

实施例7：MPC的体外作用

通过如下文所述的增殖分析、混合淋巴细胞反应和细胞因子产生来测试MPC的免疫调节特性。

增殖分析和混合淋巴细胞反应

如实施例4所述基本上从仅用MPC或媒剂处理的健康C57BL/6小鼠、2D2转基因小鼠或MOG免疫小鼠的脾收集单核细胞。在含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素(都来自Invitrogen)、1mM丙酮酸钠(Sigma)和50μMβ-巯基乙醇(Sigma)的完全RPMI培养基中制备单细胞悬浮液。红血球裂解后，将细胞洗涤两次并接着在20μg/mlMOG_35-55(GL Biochem)、800ng/ml离子霉素和20pg/ml佛波醇豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)(都来自Sigma)存在下以每孔2.5×10⁵个细胞的浓度一式三份接种于96孔平底微量滴定盘(Nunc)中，或者接种至预涂有10μg/ml抗CD3和10μg/ml抗CD8(都来自BD)的孔中。接着将细胞在37℃、5％CO₂下孵育72小时且在最后18小时培养期间每孔加入1μCi[3H]胸苷。将细胞收获至过滤器垫上且在Top CountHavester(Packard Biosciences)上对所并入的放射性核酸进行计数。对于涉及由MPC抑制T细胞增殖的实验，在加入脾细胞前接种每孔2.5至0.002×10⁴个细胞范围内的MPC浓度。

在混合淋巴细胞反应(MLR)中，将来自C57BL/6小鼠的2×10⁵个脾细胞(反应物)与相等数量的辐照(20Gy)Balb/c刺激物或辐照MPC一起孵育且培养5天的时间，其中在最后24小时培养期间每孔加入1μCi[3H]胸苷。

在涉及T细胞抑制的MLR中，在加入脾细胞之前，将2×10⁴个辐照的MPC接种至孔中。

细胞因子产生

用于分析细胞因子产生的上清液获自单独或在2×10⁴个MPC存在下(MPC：脾细胞比率为1∶10)用20μg/ml MOG_35-55刺激的来自2D2转基因小鼠的2.5×10⁶个脾细胞的两天共培养物。使用小鼠Th1/Th2/Th17细胞计数珠粒阵列(CBA)试剂盒(BD)基本上根据制造商的说明进行细胞因子的定量分析，并在BD FACSCanto II流式细胞仪上进行分析。测量下述细胞因子：白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。

此试验性研究的数据一致表明，与未处理或用STRO-1阴性MSC处理相比，STRO-1^亮MPC显示较高的免疫抑制能力。这在体外分析并且更重要的是在体内分析中是明显的。

实施例8：MPC对PHA介导的淋巴细胞增殖的影响

将PBMC用植物血球凝集素(PHA；10μg/ml；Sigma Chemical公司，St.Louis，Mo.)刺激以引发淋巴细胞增殖。如图7中所示，一系列浓度(参见表6)的STRO-1亮细胞能够显著抑制PBMC T细胞增殖反应。

表6：Stro-1^亮细胞的MLR稀释

反应物细胞#	刺激物细胞(Stro-1亮)#	Stro-1亮细胞％
			50,000/0.1ml	500/0.1ml	1％
50,000/0.1ml	2,500/0.1ml	5％
			50,000/0.1ml	5,000/0.1ml	10％

50,000/0.1ml	10,000/0.1ml	20％
			50,000/0.1ml	25,000/0.1ml	50％
50,000/0.1ml	50,000/0.1ml	100％

类似于人中的结果，绵羊MPC能够显著抑制对用PHA刺激的绵羊PBMC的同种免疫反应的水平(图8)。绵羊STRO-3选择的细胞当用作针对绵羊PBMC或纯化的绵羊T细胞(使用Miltenyi T细胞分离试剂盒选择)的刺激物时以剂量依赖性方式抑制淋巴细胞增殖(图9)。

本文件中引用的所有参考文献都是以引用的方式并入本文。

本领域的技术人员应了解，可在不背离本发明的作广义描述的精神和范围下如特定实施方案中所示对本发明作出多种变化和/或修改。因此在所有方面，本发明的实施方案视为仅具说明性而不具限制性。

Claims (24)

1.有效量的富含表达STRO-1^亮的细胞的细胞群体和/或通过培养所述富含表达STRO-1^亮的细胞的细胞群体得到的可溶性因子用于制备抑制T细胞活化的抑制剂的用途,其中所述抑制通过在体外或离体使包含T细胞的细胞群体与有效量的富含表达STRO-1^亮的细胞的细胞群体和/或通过培养所述富含表达STRO-1^亮的细胞的细胞群体得到的可溶性因子接触来实现。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述包含T细胞的细胞群体是外周血液单核细胞样本。

3.如权利要求2所述的用途，其中所述包含T细胞的细胞群体包含天然表型的CD25⁺CD4⁺T细胞。

4.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述抑制剂还包含一种或多种诱导形成调控性T细胞的因子。

5.如权利要求4所述的用途，其中所述一种或多种诱导形成调控性T细胞的因子选自由以下组成的组：α-黑素细胞刺激激素、转化生长因子β2、维生素D3和/或地塞米松。

6.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述抑制剂还包含一种或多种选自由以下组成的组的试剂：白细胞介素、抗原、抗原呈递细胞、凝集素和细胞表面受体的抗体或特异性配体或其组合。

7.如权利要求6所述的用途，其中所述白细胞介素是IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18或其组合。

8.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述表达STRO-1^亮的细胞占所述富含表达STRO-1^亮的细胞的细胞群体的70％或更多。

9.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述表达STRO-1^亮的细胞是同种异体的。

10.一种组合物，其包含T细胞、富含表达STRO-1^亮的细胞的细胞群体和/或通过培养所述富含表达STRO-1^亮的细胞的细胞群体得到的可溶性因子、一种或多种诱导形成调控性T细胞的因子和药学上可接受的载体。

11.如权利要求10所述的组合物，其中所述表达STRO-1^亮的细胞占所述富含表达STRO-1^亮的细胞的细胞群体的70％或更多。

12.如权利要求10所述的组合物，其中所述表达STRO-1^亮的细胞是同种异体的。

13.有效量的富含表达STRO-1^亮的细胞的细胞群体和/或通过培养富含表达STRO-1^亮的细胞的细胞群体得到的可溶性因子在制备药物中的用途，所述药物用于一种治疗有需要的受试者的T细胞介导的自体免疫性病症的方法，所述方法包括在体外或离体用有效量的富含表达STRO-1^亮的细胞的细胞群体和/或通过培养所述富含表达STRO-1^亮的细胞的细胞群体得到的可溶性因子处理包含T细胞的细胞群体以抑制T细胞活化，和将处理过的细胞施用至所述受试者。

14.富含表达STRO-1^亮的细胞的细胞群体和/或通过培养所述富含表达STRO-1^亮的细胞的细胞群体得到的可溶性因子在制备药物中的用途，所述药物用于一种治疗或预防由过度或异常T细胞活化引起的病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的富含表达STRO-1^亮的细胞的细胞群体和/或通过培养富含表达STRO-1^亮的细胞的细胞群体得到的可溶性因子以抑制所述患者中的T细胞活化。

15.如权利要求13或权利要求14所述的用途，其中所述药物包括0.1×10⁶至5×10⁶个之间的表达STRO-1^亮的细胞和/或其子代。

16.如权利要求13至14中任一项所述的用途，其中所述药物包括0.3×10⁶至2×10⁶个之间的表达STRO-1^亮的细胞和/或其子代。

17.如权利要求13至14中任一项所述的用途，其中所述药物包括低剂量的表达STRO-1^亮的细胞和/或其子代。

18.如权利要求17所述的用途，其中所述低剂量的表达STRO-1^亮的细胞和/或其子代包含0.1×10⁵至0.5×10⁶个之间的表达STRO-1^亮的细胞和/或其子代。

19.如权利要求17所述的用途，其中所述低剂量的表达STRO-1^亮的细胞和/或其子代包含约0.3×10⁶个表达STRO-1^亮的细胞和/或其子代。

20.如权利要求13至14中任一项所述的用途，其中所述药物进一步包括一种或多种选自由以下组成的组的试剂：白细胞介素、抗原、抗原呈递细胞、凝集素和细胞表面受体的抗体或特异性配体或其组合。

21.如权利要求20所述的用途，其中所述白细胞介素是IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18或其组合。

22.如权利要求13至14中任一项所述的用途，其中所述药物进一步包括免疫抑制药物。

23.如权利要求13-14中任一项所述的用途，其中所述表达STRO-1^亮的细胞占所述富含表达STRO-1^亮的细胞的细胞群体的70％或更多。

24.如权利要求13-14中任一项所述的用途，其中所述表达STRO-1^亮的细胞是同种异体的。