ES2665328T3

ES2665328T3 - Células que expresan STRO-1bright para tratar la enfermedad de injerto contra huésped

Info

Publication number: ES2665328T3
Application number: ES11799995.3T
Authority: ES
Inventors: Silviu Itescu; Michael David Schuster
Original assignee: Mesoblast Inc
Current assignee: Mesoblast Inc
Priority date: 2010-07-02
Filing date: 2011-07-04
Publication date: 2018-04-25
Anticipated expiration: 2031-07-04
Also published as: US10849932B2; US20130171113A1; WO2012000065A1; US10105394B2; JP2013530991A; EP3366298A1; EP2593114B1; CA2803639A1; JP2017095523A; EP3366298B1; AU2016219565A1; JP6385674B2; US20130171099A1; JP2013530992A; AU2011274254B2; KR20140009108A; KR101891260B1; WO2012000064A1; KR101871472B1; AU2020204056A1

Abstract

Una población de células enriquecidas en células que expresan STRO-1bright para su uso en un procedimiento para tratar complicaciones de enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) en un paciente mamífero, cuyo procedimiento comprende la administración de la población de células al paciente mamífero.

Description

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En una realización, las células STRO-1bright se enriquecen preferentemente con respecto a células STRO-1dim o STRO-1

intermedias

.

En una realización preferida, las células usadas en la presente divulgación expresan uno o más marcadores individual o colectivamente seleccionados del grupo que consiste en TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, CD45+, CD146+, 3G5+ o cualquier combinación de los mismos.

Por "individualmente" se entiende que la divulgación abarca los marcadores enumerados o grupos de marcadores por separado, y que, a pesar de que los marcadores individuales o grupos de marcadores no se enumeren por separado en este documento, las reivindicaciones adjuntas pueden definir dicho marcador o grupos de marcadores por separado y divisiblemente el uno del otro.

Por "colectivamente" se entiende que la divulgación abarca cualquier número o combinación de los marcadores enumerados o grupos de péptidos, y que, a pesar de que tales números o combinaciones de marcadores o grupos de marcadores pueden no enumerarse específicamente en este documento, las reivindicaciones adjuntas pueden definir tales combinaciones o subcombinaciones por separado y divisiblemente de cualquier otra combinación de marcadores o grupos de marcadores.

Preferiblemente, las células STRO-1bright son adicionalmente una o más de TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+ y/o CD146+.

Una célula a la que se hace referencia como "positiva" para un marcador dado, puede expresar ya sea un nivel bajo (lo

o dim) o alto (bright, bri) de ese marcador dependiendo del grado en que el marcador está presente en la superficie de la célula, donde los términos se relacionan con la intensidad de la fluorescencia u otro marcador usado en el procedimiento de clasificación de las células. La distinción de lo (o dim o dull) y bri se entenderá en el contexto del marcador usado en una población de células particular que se está ordenando. Una célula que se conoce como "negativa" para un marcador dado no está necesariamente ausente por completo de esa célula. Estos términos significan que el marcador se expresa a un nivel relativamente muy bajo por esa célula, y que genera una señal muy baja cuando se detecta de manera detectable o es indetectable por encima de los niveles de referencia.

El término " bright", cuando se usa en este documento, se refiere a un marcador en una superficie celular que genera una señal relativamente alta cuando se marca de forma detectable. Sin desear estar limitado por la teoría, se propone que las células "bright" expresen más de la proteína marcadora diana (por ejemplo, el antígeno reconocido por STRO-1) que otras células en la muestra. Por ejemplo, las células STRO-1bright producen una señal fluorescente mayor, cuando se marcan con un anticuerpo STRO-1 conjugado con FITC como se determina mediante el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), que las células no bright (STRO-1dull/dim). Preferiblemente, las células "bright" constituyen al menos aproximadamente el 0.1% de las células mononucleares de la médula ósea marcadas de manera más brillante contenidas en la muestra de partida. En otras realizaciones, las células "bright" constituyen al menos aproximadamente 0.1%, al menos aproximadamente 0.5%, al menos aproximadamente 1%, al menos aproximadamente 1.5%, o al menos aproximadamente 2%, de las células mononucleares de la médula ósea marcadas de manera más brillante contenidas en la muestra de partida. En una realización preferida, las células STRO-1bright tienen una magnitud 2 log de la expresión mayor de la expresión superficial STRO-1 con respecto a la "referencia", a saber, las células que son STRO-1-. En comparación, las células STRO-1dim y/o STRO-1intermedias tienen una magnitud de menos de 2 log de la expresión mayor de la expresión superficial STRO-1, por lo general aproximadamente 1 log o menos que la "referencia".

Como se usa en este documento, el término "TNAP" pretende abarcar todas las isoformas de fosfatasa alcalina no específica de tejido. Por ejemplo, el término abarca la isoforma hepática (LAP), la isoforma ósea (BAP) y la isoforma renal (KAP). En una realización preferida, la TNAP es BAP. En una realización particularmente preferida, TNAP como se usa en este documento se refiere a una molécula que puede unirse al anticuerpo STRO-3 producido por la línea celular de hibridoma depositada en ATCC el 19 de diciembre de 2005 bajo las disposiciones del Tratado de Budapest con el número de acceso de depósito PTA-7282.

Además, en una realización preferida, las células STRO-1bright son capaces de dar lugar a CFU-F clonogénica.

Se prefiere que una proporción significativa de las células multipotenciales sea capaz de diferenciarse en al menos dos líneas germinales diferentes. Los ejemplos no limitantes de los linajes a los que pueden comprometerse las células multipotenciales incluyen células precursoras de huesos; progenitores de hepatocitos, que son multipotentes para células epiteliales de los conductos biliares y hepatocitos; células restringidas neuronales, que pueden generar precursores de células gliales que progresan a oligodendrocitos y astrocitos; precursores neuronales que progresan a neuronas; precursores de músculo cardiaco y cardiomiocitos, líneas celulares beta pancreáticas secretoras de insulina que responden a la glucosa. Otros linajes incluyen, pero no se limitan a, odontoblastos, células productoras de dentina y condrocitos, y células precursoras de los siguientes: células epiteliales pigmentarias de la retina, fibroblastos, células de la piel tales como queratinocitos, células dendríticas, células del folículo piloso, células epiteliales del conducto renal, células del músculo liso y esquelético, progenitores testiculares, células endoteliales vasculares, tendón, ligamento,

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célula de mamífero es, por ejemplo, un vector del conjunto de vectores ADNpc suministrado por Invitrogen, un vector del conjunto de vectores pCI (Promega), un vector del conjunto de vectores pCMV (Clontech), un vector pM (Clontech), un vector pSI (Promega), un vector VP 16 (Clontech) o un vector del conjunto de vectores ADNpc (Invitrogen).

El experto en el arte conocerá vectores y fuentes adicionales de dichos vectores, tales como, por ejemplo, Invitrogen Corporation, Clontech o Promega.

Los medios para introducir la molécula de ácido nucleico aislada o una construcción génica que los comprende en una célula para expresión son conocidos para los expertos en el arte. La técnica usada para un organismo dado depende de las técnicas exitosas conocidas. Los medios para introducir ADN recombinante en las células incluyen microinyección, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposomas tal como mediante el uso de lipofectamina (Gibco, MD, EUA) y/o cellfectina (Gibco, MD, EE. UU.), captación de ADN mediada por PEG, electroporación y bombardeo de micropartículas tal como mediante el uso de tungsteno recubierto con ADN o partículas de oro (Agracetus Inc., WI, EUA), entre otros.

Alternativamente, una construcción de expresión de la divulgación es un vector viral. Los vectores virales apropiados son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente. Los sistemas basados en virus convencionales para la administración de un ácido nucleico y la integración de ese ácido nucleico en el genoma de una célula huésped incluyen, por ejemplo, un vector retroviral, un vector lentiviral o un vector viral adenoasociado. Alternativamente, un vector adenovírico es útil para introducir un ácido nucleico que permanece episomal en una célula huésped. Los vectores virales tienen un procedimiento eficiente y versátil de transferencia de genes en células y tejidos diana. Además, se han observado eficiencias de transducción elevadas en muchos tipos de células y tejidos diana diferentes.

Por ejemplo, un vector retroviral generalmente comprende repeticiones terminales largas (LTR) que actúan en cis con capacidad de empaquetamiento para hasta 6-10 kb de secuencia foránea. Los mínimos LTR que actúan en cis son suficientes para la replicación y el empaquetamiento de un vector, que luego se usa para integrar la construcción de expresión en la célula diana para proporcionar una expresión a largo plazo. Los vectores retrovirales ampliamente usados incluyen aquellos basados en el virus de la leucemia murina (MuLV), virus de leucemia del mono gibbon (GaLV), virus de inmunodeficiencia en simios (SrV), virus de inmunodeficiencia humana (HIV) y combinaciones de los mismos (véase, por ejemplo, Buchscher et al., J Virol. 56:2731-2739 (1992); Johann et al, J. virol. 65:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al, Virol. 76:58-59 (1990); Wilson et al, J. Viol, 63:274-2318 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700; Miller and Rosman BioTechniques 7:980-990, 1989; Miller, A. D. Human Gene Therapy 7:514, 1990; Scarpa et al Virology 75:849-852, 1991; Burns et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:8033-8037, 1993).

Se han desarrollado también diversos sistemas de vectores de virus adenoasociados (AAV) para la administración de ácido nucleico. Los vectores AAV se pueden construir fácilmente usando técnicas conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,173,414 y 5,139,941; las Publicaciones Internacionales Nos. WO 92/01070 y WO 93/03769; Lebkowski et al. Molec. Cell. Biol. 5:3988-3996, 1988; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter Current Opinion in Biotechnology 5:533-539, 1992; Muzyczka. Current Topics in Microbiol, and Immunol. 158:97-129, 1992; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801, 1994; Shelling and Smith Gene Therapy 7:165-169, 1994; y Zhou et al. JExp. Med. 179:1867-1875, 1994.

Los vectores virales adicionales útiles para administrar una construcción de expresión de la divulgación incluyen, por ejemplo, los derivados de la familia de virus de la viruela, tales como el virus vaccinia y el poxvirus aviar o un alfavirus o un vector del virus conjugado (por ejemplo, el descrito en Fisher-Hoch et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 56:317-321, 1989).

Ensayo de potencial terapéutico/profiláctico de células y factores solubles

Los procedimientos para determinar la capacidad de los factores solubles derivados de las células STRO-1bright para tratar o prevenir o retrasar el inicio o la progresión de GvHD serán evidentes para el experto en el arte.

Por ejemplo, los ensayos in vitro apropiados para determinar la actividad inmunosupresora de los factores solubles se describen en el ejemplo 5 de este documento.

En otro ejemplo, la eficacia de los factores solubles se puede evaluar en un modelo in vivo de GvHD como se describe en los ejemplos 6 y 7 en este documento.

Será evidente para los expertos en el arte a partir de lo anterior que la presente divulgación también proporciona un procedimiento para identificar o aislar un factor soluble para el tratamiento, prevención o retraso de GvHD, comprendiendo el procedimiento:

(i) administrar un factor soluble a un sujeto de prueba que padece GvHD y evaluar la progresión de GvHD en el sujeto;

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apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de surfactantes. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Además, los factores solubles se pueden administrar en una formulación de liberación temporal, por ejemplo, en una composición que incluye un polímero de liberación lenta. Los compuestos activos se pueden preparar con portadores que protegerán el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tal como etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico y poliláctico, copolímeros poliglicólicos (PLG). Muchos procedimientos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son conocidos en general para los expertos en el arte.

El sobrenadante o los factores solubles se pueden administrar en combinación con una matriz apropiada, por ejemplo, para proporcionar una liberación lenta de los factores solubles.

Modos de administración

El sobrenadante o los factores solubles derivados de células STRO-1bright, las células STRO-1bright o su progenie se pueden implantar quirúrgicamente, inyectar, administrar (por ejemplo, por medio de un catéter o jeringa) o de otra manera administrar directa o indirectamente en el sitio que necesita reparación o aumento, por ejemplo, un órgano o en el sistema sanguíneo de un sujeto.

Preferiblemente, el sobrenadante o los factores solubles derivados de células STRO-1bright, las células STRO-1bright o su progenie se administran a la corriente sanguínea de un sujeto. Por ejemplo, el sobrenadante o factores solubles derivados de células STRO-1bright, las células STRO-1bright o su progenie se administran por vía parenteral. Las rutas de ejemplo de administración parenteral incluyen, pero no están limitadas a, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraarterial, intraperitoneal, intraventricular, intracerebroventricular, intratecal. Preferiblemente, el sobrenadante o factores solubles derivados de células STRO-1bright, células STRO-1bright o su progenie se administran intraarterialmente, en una aorta, en una aurícula o ventrículo del corazón o en un vaso sanguíneo conectado a un páncreas, por ejemplo, una aorta abdominal, una arteria mesentérica superior, una arteria pancreaticoduodenal o una arteria esplénica.

En el caso de la administración de células a una aurícula o ventrículo del corazón, se prefiere que las células se administren a la aurícula o ventrículo izquierdo para evitar las complicaciones que pueden surgir de la entrega rápida de células a los pulmones.

Preferiblemente, el sobrenadante o los factores solubles derivados de las células STRO-1bright, las células STRO-1bright o su progenie se inyectan en el sitio de administración, por ejemplo, usando una jeringa o a través de un catéter o una línea central.

La selección de un régimen de administración para una formulación terapéutica depende de varios factores, que incluyen la tasa de renovación de suero o tejido de la entidad, el nivel de síntomas y la inmunogenicidad de la entidad. Preferiblemente, un régimen de administración maximiza la cantidad de compuesto terapéutico entregado al paciente consistente con un nivel aceptable de efectos secundarios. De acuerdo con lo anterior, la cantidad de formulación administrada depende en parte de la entidad particular y de la gravedad de la afección que se trata.

En una realización, los factores solubles o sobrenadantes derivados de células STRO-1bright, las células STRO-1bright o su progenie se administran como una única dosis de bolo. Alternativamente, los factores solubles o sobrenadantes derivados de células STRO-1bright, células STRO-1bright o su progenie se administran mediante infusión continua, o mediante dosis a intervalos de, por ejemplo, un día, una semana o 1-7 veces por semana. Un protocolo de dosis preferido es uno que implica la dosis máxima o frecuencia de dosis que evita los efectos secundarios indeseables significativos. Una dosis semanal total depende del tipo y la actividad del compuesto que se usa. La determinación de la dosis apropiada se realiza por un médico, por ejemplo, usando parámetros o factores conocidos o sospechosos en la técnica para afectar el tratamiento o se prevé que afecten al tratamiento. Generalmente, la dosis comienza con una cantidad algo menor que la dosis óptima y se incrementa en pequeños incrementos a partir de entonces hasta que se alcanza el efecto deseado u óptimo con respecto a cualquier efecto secundario negativo. Las medidas diagnósticas importantes incluyen las de los síntomas de la diabetes.

Los ejemplos que no están cubiertos por las reivindicaciones adjuntas se dan solo con fines comparativos.

Ejemplos

Ejemplo 1: preparación de MSC

Las MSC se generan de novo a partir de la médula ósea como se describe en el documento US 5,837,539. Aproximadamente 80-100 ml de médula se aspiraron en jeringas que contenían heparina estéril y se llevaron al

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confirmó mediante RT-PCR semicuantitativa de RNA total preparado a partir de subpoblaciones STRO-1bright recién clasificadas, STRO-1dull y STRO-1negativa de la médula ósea (Figura 3D y Tabla 3).

Tabla 2. cebadores de RT-PCR y condiciones para la amplificación específica de ARNm humana

Gen diana: Secuencias cebadoras (5’-3’) sentido/antisentido Tamaño del producto

GAPDH: 417

SDF-1: 364

IL-1: 151

FLT-1: 380

TNF-: 361

KDR: 450

RANKL: 538

Leptina: 492

CBFA-1: 632

PPAR2: imagen13 341

OCN: 289

MyoD: 270

SMMHC: 150

GFAP: 370

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Nestina: 460

SOX9: 598

Colágeno tipo X: 387

Aggrecan: 184

Tabla 3. Resumen de la expresión génica relativa en poblaciones de STRO-1Bright y STRO-1Dull. Se presenta una lista de genes que muestran expresión medible y diferencial entre las poblaciones STRO-1Bright y STRO-1Dull, según lo determinado por la PCR de transcripción inversa. Los valores representan la expresión génica relativa con referencia al gen de mantenimiento de la casa, GAPDH.

Expresión génica relativa a GAPDH

Tejido: Marcador STRO-1Bright STRO-1Dull

Neuronas: GFAP (Proteína ácida fibrilar glial) 0.1 0.7

Hueso: OCN (Osteocalcina) 1.1 2.5

OSX (Osterix): 0.4 1.3

CBFA-1 (Factor de unión a la proteína-1 del núcleo): 0.3 0.6

Inmunoregulador: RANKL (Activador del receptor del factor nuclear κ B) 1.6 0.3

SDF-1-alfa (factor-1-alfa derivado del estroma): 3.2 0.1

Grasa: Leptina 3.1 4.2

Cardiomiocitos: GATA-4 1.1 2.9

Células endoteliales: Ang-1 (Angiopoyetina-1) 1.5 0.8

Condrocitos: Sox 9 0.3 1.1

COL X (Colágeno X): 3.5 2.8

Citoquinas proinflamatorias: TNF-alfa (Necrosis tumoral alfa) 1.7 0.9

Para correlacionar la expresión de la superficie de la proteína con la densidad de expresión de STRO-1, se prepararon suspensiones de células individuales de MPC de la médula ósea derivadas de células expandidas ex vivo por separación de tripsina/EDTA y posteriormente se incubaron con el anticuerpo STRO-1 en combinación con anticuerpos 10 que identifican una amplia gama de marcadores asociados al linaje celular. Se identificó STRO-1 usando un isotiocianato de fluoresceína -IgM de cabra anti-murino, mientras que todos los demás marcadores se identificaron usando ya sea ficoeritrina -IgG-de cabra anti-ratón o anti-conejo. Para aquellos anticuerpos que identifican antígenos intracelulares, las preparaciones celulares se marcaron primero con el anticuerpo STRO-1, se fijaron con etanol al 70% frío para permeabilizar la membrana celular y luego se incubaron con anticuerpos específicos del antígeno intracelular. 15 Los anticuerpos de control emparejados con isotipo se usaron en condiciones idénticas. El análisis de citometría de flujo de doble color se realizó usando un citómetro de flujo COULTER EPICS y se recogieron los datos de modo de lista. Los

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gráficos de transferencia representan 5,000 eventos de modo de lista que indican el nivel de intensidad de fluorescencia para cada marcador de célula de linaje (eje y) y STRO-1 (eje x). Los cuadrantes verticales y horizontales se establecieron con referencia a los anticuerpos de control negativo de isotipo coincidente.

Tabla 4. Resumen de la expresión de proteína relativa en poblaciones de STRO-1Bright y STRO-1Dull. Se presenta una lista de proteínas que muestran expresión diferencial entre las poblaciones de STRO-1Bright y STRO-1Dull según lo determinado por citometría de flujo. Los valores representan la intensidad de fluorescencia media relativa de la tinción.

Intensidad media de fluorescencia

Tejido: Marcador STRO-1Bright STRO-1Dull

Neuronas: Neurofilamento 1.7 20.5

Hueso: ALK PHOS (fosfatasa alcalina) 5.7 44.5

Inmunoregulador: RANKL (Activador del receptor del factor nuclear κ B) 658.5 31.0

Células epiteliales: CytoKeratin 10+13 1.2 23.3

Cytokeratin 14: 1.8 8.8

Músculo liso: -SMA (Actina del músculo liso alfa) 318.0 286.0

Condrocitos: Biglycan 84.4 65.9

Fibroblasto Basal: Tenascina C 22.2 6.9

Cardiomiocito: Troponina C 2.5 15.0

Estos resultados muestran que SDF-1alfa y RANKL son altamente expresados por células STRO-1bright. Esto es importante porque se sabe que ambas proteínas están implicadas en la regulación positiva de las células T reguladoras CD4+ CD25+ que confieren protección contra trastornos inmunes tales como GVHD (Loser et al., Nature Medicine 12:1372-1379, 2006; Hess, Biol. Blood Marrow Transplant, 12 (1 Suppl 2):13-21, 2006; y Meiron et al., J. Exp. Medicine 205:2643-2655, 2008).

Ejemplo 5. Actividad inmunosupresora in vitro

Para evaluar la actividad inmunosupresora de células STRO-1bright expandidas en cultivo (MPC (B)), se usó estimulación con CD3/CD28 como lectura. Los resultados se compararon con una población de células de STRO-1 negativas derivadas de la médula ósea, expandidas en cultivo, aisladas como en el ejemplo 1 (MSC (A)). Se estimularon células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) con perlas recubiertas con CD3/CD28 en presencia de 4 concentraciones crecientes de preparaciones de MSC y MPC. La proliferación de células T se midió mediante la incorporación de 3H-Tdr.

Se analizaron las MSC (A) y MPC STRO-1bright (B) para determinar su capacidad para suprimir la respuesta de las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) a la estimulación con CD3/CD28. Se añadieron MSC y MPC o MSC humano de control adquirido comercialmente (Lonza) en diferentes proporciones a los cultivos de PBMC. Después de 3 días, se añadió 3H-Tdr durante 18 horas y luego se recogieron los cultivos.

La proliferación de PBMC en respuesta a CD3/CD28 se inhibió de una manera dependiente de la dosis por todas las preparaciones. Sin embargo, la preparación B fue claramente superior al efecto producido por la preparación A así como también al control hMSC (Figura 4). En una proporción MSC: PBMC 1: 100, MPC B inhibía todavía el 70% de la proliferación de células T de control, mientras que el control adquirido comercialmente MSC (Lonza) y MSC A producían una inhibición del 50% y 60%, respectivamente (Figura 5).

Ejemplo 6: Inducción y tratamiento de GvHD

Se investigó la actividad inmunosupresora in vivo de células STRO-1bright (MPC (B)) usando un modelo de enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) basado en un par de receptores donantes no apareados para múltiples loci de histocompatibilidad menores. Se inyectaron células mononucleares de la médula ósea agotadas de células (BMMC) (5x106) y esplenocitos (30x106) de donantes B10.D2 (H2d) por vía intravenosa en ratones receptores BALB/c (H2d)

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