KR101987642B1

KR101987642B1 - 이식편대숙주 질환의 치료 방법

Info

Publication number: KR101987642B1
Application number: KR1020187017300A
Authority: KR
Inventors: 실뷔 이테스큐; 미카엘 데이비드 슈스터
Original assignee: 메소블라스트, 아이엔씨.
Priority date: 2010-07-02
Filing date: 2011-07-04
Publication date: 2019-06-11
Also published as: AU2011274254A1; US20130171099A1; KR20140009108A; EP2593114A1; SG186244A1; CA2803639C; SG186243A1; US20190030080A1; AU2016219565A1; CN103079579B; KR20130092555A; KR20180072850A; JP6315989B2; JP2013530992A; EP2593114B1; US9301978B2; CN103079578B; CA2803639A1; JP2013530991A; AU2011274255B2

Abstract

STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 및/또는 이들로부터 유래된 가용성 인자가 농축된 세포의 집단을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물 환자에서 GvHD 합병증을 치료하거나, 또는 이들의 발생을 예방하기 위한 방법.

Description

이식편대숙주 질환의 치료 방법{METHOD OF TREATING GRAFT VERSUS HOST DISEASE}

기술분야

본 발명은 조혈 전구 세포(hematopoietic progenitor cell)의 이식(engraftment)을 향상시키고, 골수 이식을 향상시키고, 그리고 이식편대숙주 질환을 예방하거나 감소시키기 위한 방법에 관계한다. 한 구체예에서, 본 발명은 포유동물 환자에서, 특히 인간 환자에서 동종이계 골수 이식 이후에 합병증, 다시 말하면, 이식편대숙주 질환을 예방하거나 경감하는 것에 관계한다.

배경기술

골수 이식은 골수를 파괴하는 과정 이후에 요구된다. 가령, 집중적인 전신 방사선요법 또는 화학요법 이후에, 골수는 기능하지 못하는 첫 번째 표적이다. 전이성 암(metastatic cancer)은 통상적으로, 매우 집중적인 화학요법으로 치료되는데, 이것은 암을 파괴하도록 의도되지만, 골수 역시 효과적으로 파괴한다. 이것은 골수 이식에 대한 필요를 유발한다. 골수 이식으로 골수 질환을 수반하는 임의의, 하지만 가장 급성의 치명적인 장애의 경감은 일반적으로, 이식편대숙주 질환(GvHD)의 발생의 가능성으로 인하여, 매우 위험한 것으로 간주된다.

GvHD는 동종이계 골수 또는 줄기 세포 이식의 성공과 유효성(availability)을 제한하는 주요 인자인 면역 질환이다. GvHD는 만성 질환을 유발하고, 그리고 숙주 포유동물을 사망에 이르게 할 수 있는 전신 염증성 반응이다. 현재, 동종이계 이식물은 공여자가 숙주와 높은 정도의 생체적합성(histocompatibility)을 갖는 경우에도, 연관된 GvHD의 심각한 위험을 필연적으로 유발한다.

GvHD는 전신 분포된 불친화성 숙주 항원에 대항하여 반응하는 공여자 T-세포에 의해 유발되고, 강력한 염증을 유발한다. GvHD에서, 공여자와 숙주 간에 차이를 인식하는 성숙 공여자 T-세포가 전신 활성화된다. GvHD를 예방하고 치료하는 현재의 방법은 시클로스포린(cyclosporin)-A와 코르티코스테로이드(corticosteroid)와 같은 약물의 투여를 필요로 한다. 이들은 심각한 부작용을 갖고, 연장된 기간 동안 제공되어야 하고, 그리고 투여하고 모니터링하는데 많은 비용이 소요된다. GvHD를 예방하기 위해 T-세포 고갈을 이용하려는 시도 역시 있긴 했지만, 이것은 정교하고 값비싼 시설과 전문적 기술을 필요로 한다. 지나친 정도의 T-세포 고갈은 골수 줄기 세포의 이식의 실패, 조혈 복원(hematopoietic reconstitution)의 실패, 감염, 또는 재발의 심각한 문제점을 유발한다. 더욱 제한된 T-세포 고갈은 GvHD를 개시할 만큼 여전히 충분한 세포가 남겨진다. 결과로서, GvHD를 치료하는 현재의 방법은 제한된 공여자와 숙주 조합에서만 성공적이고, 따라서 많은 환자는 잠재적 구명 치료(life-saving treatment)를 제공받을 수 없다.

중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell, MSC)는 임상적 환경(clinical setting)에서 만약 그렇지 않으면, 골수 이식의 치명적 합병증인 이식편대숙주 질환(GvHD)을 치료하는데 성공적으로 활용되는 강력한 면역억제 활성을 나타낸다. 제한된 특성화로 인하여, MSC 제조물은 매우 이질적(heterogenous)이고, 이것은 그들의 면역억제(immunosuppression)의 크기를 제한하고, 따라서 그들의 임상적 이익(clinical benefit)을 제한한다.

요약

본 발명에 이르는 연구에서, 본 발명자들은 GvHD에 대한 효과의 관점에서, 중간엽 줄기 세포와 STRO-1^밝음 다능성 세포 제조물을 비교하였다. 놀랍게도, GvHD의 개선에서 Stro-1^밝음 다능성 세포 제조물은 중간엽 줄기 세포 제조물보다 훨씬 우월하였다.

따라서 본 발명에서는 포유동물 환자에서 GvHD 합병증의 발생을 경감하기 위한 방법을 제시하고, 상기 방법은 STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 및/또는 이들로부터 유래된 가용성 인자가 농축된 세포의 집단을 환자에 투여하는 단계를 포함한다.

한 가지 구체예에서, 포유동물 환자는 골수 이식을 받고 있거나 받을 예정이다.

추가의 구체예에서, 본 발명에서는 골수 이식에 의해 유발된, 포유동물 환자에서 GvHD 합병증의 발생을 경감하기 위한 방법을 제시하고, 상기 방법은 (a) 골수 계통 세포의 전구체, 그리고 (b) STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 및/또는 이들로부터 유래된 가용성 인자가 농축된 세포의 집단을 환자에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 및/또는 이들로부터 유래된 가용성 인자가 농축된 세포의 집단은 환자에서 GvHD의 심각도를 감소시키는 효과량으로 투여된다.

한 가지 구체예에서, 이식편대숙주 질환은 T 세포 면역 반응의 결과이다. 한 가지 실례에서, T 세포는 공여자로부터 유래되고, 그리고 항원은 수용자로부터 유래된다. 가령, T 세포는 이식물 내에 존재할 수 있다. 추가의 구체예에서, T 세포는 수용자로부터 유래되고, 그리고 항원은 공여자로부터 유래된다.

상기 방법의 추가의 구체예에서, STRO-1^{밝음(bright 또는 bri)} 세포 및/또는 이들의 자손 세포 및/또는 이로부터 유래된 가용성 인자는 T-세포의 동시 자극(co-stimulation)을 차단하는 분자를 발현하도록 유전자 조작된다.

STRO-1^밝음 세포는 자가조직(autogeneic) 또는 동종이계(allogenic)일 수 있다. 한 구체예에서, STRO-1^밝음 세포는 동종이계이다.

상기 방법의 추가의 구체예에서, STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포는 가용성 인자를 투여하거나 획득하기에 앞서, 배양 동안 확대된다.

세포의 예시적인 용량에는 0.1 x 10⁶ 내지 5 x 10⁶ STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손이 포함된다. 가령, 상기 방법은 0.3 x 10⁶ 내지 2 x 10⁶ STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손을 투여하는 단계를 포함한다.

상기 방법의 한 가지 형태는 저용량의 STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손을 투여하는 단계를 수반한다. 이런 저용량은 가령, 0.1 x 10⁵ 내지 0.5 x 10⁶ STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손, 예를 들면, 약 0.3 x 10⁶ STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손이다.

본 발명에서는 또한, 이들 세포 및/또는 가용성 인자의 다수 투여를 고려한다. 가령, 이런 방법은 이들 세포를 투여하고, GvHD의 한 가지 또는 그 이상의 증상이 언제 일어나거나 재발하는 지를 결정하기 위해 개체를 모니터링하고, 그리고 이들 세포 및/또는 가용성 인자의 추가 분량을 투여하는 단계를 수반할 수 있다. GvHD의 증상을 평가하는데 적합한 방법은 당업자에게 명백하고 및/또는 본 명세서에서 기술될 것이다.

한 가지 실례에서, STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 및/또는 이로부터 유래된 가용성 인자가 농축되는 집단은 주 1회 또는 그 이하, 예를 들면, 4주마다 1회 또는 그 이하로 투여된다.

추가의 구체예에서, STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포 및/또는 이로부터 유래된 가용성 인자가 농축된 세포의 집단은 전신 투여된다. 가령, STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포 및/또는 이로부터 유래된 가용성 인자가 농축된 세포의 집단은 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하, 대동맥 내로, 심장의 심방 또는 심실 내로, 또는 장기에 연결된 혈관, 예를 들면, 복대동맥, 상장간동맥, 십이지장동맥 또는 비동맥 내로 투여될 수 있다.

추가의 구체예에서, 본 발명의 방법은 면역억제제를 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 면역억제제는 상기 이식된 세포가 기능할 수 있을 만큼 충분한 기간 동안 투여될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 면역억제제는 시클로스포린이다. 시클로스포린은 5 내지 40 mg/체중 kg wt의 용량으로 투여될 수 있다.

본 명세서 전반에서, 단어 "포함한다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 이형은 규정된 원소, 정수 또는 단계, 또는 원소들, 정수들 또는 단계들의 그룹의 포함을 암시하지만, 임의의 다른 원소, 정수 또는 단계, 또는 원소들, 정수들 또는 단계들의 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.

상세한 설명

본 명세서에서 제시된 결과는 STRO-1^밝음 세포가 농축된 세포의 집단이 예상치 않게, GvHD의 개선에서 STRO-1 음성 중간엽 줄기 세포 제조물보다 훨씬 우월하다는 것을 증명한다.

가령, 본 발명에서는 골수 이식에 의해 유발된, 포유동물 환자에서 GvHD 합병증의 발생을 경감하기 위한 방법을 제시하고, 상기 방법은 (a) 골수 계통 세포의 전구체, 그리고 (b) STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 및/또는 이들로부터 유래된 가용성 인자가 농축된 세포의 집단을 환자에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 Stro-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 및/또는 이들로부터 유래된 가용성 인자가 농축된 세포의 집단은 환자에서 GvHD의 심각도를 감소시키는 효과량으로 투여된다.

본 명세서에서, 용어 "가용성 인자"는 물 용해성인 STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손에 의해 생산된, 임의의 분자, 예를 들면, 단백질, 펩티드, 당단백질, 당펩티드, 지질단백질, 지질펩티드, 탄수화물 등을 의미하는 것으로 간주된다. 이런 가용성 인자는 세포내이고 및/또는 세포에 의해 분비될 수 있다. 이런 가용성 인자는 복잡한 혼합물(가령, 상층액) 및/또는 이의 분획이고 및/또는 정제된 인자일 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 가용성 인자는 상층액 내에 포함된다. 따라서 하나 또는 그 이상의 가용성 인자의 투여에 관한 본 명세서에서 임의의 구체예는 상층액의 투여에 준용될 수 있는 것으로 간주된다.

본 발명의 방법은 STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포 단독, 및/또는 이로부터 유래된 가용성 인자가 농축된 세포의 집단의 투여를 수반할 수 있다. 본 발명의 방법은 또한, 자손 세포 단독, 또는 이들 자손 세포로부터 유래된 가용성 인자의 투여를 수반할 수 있다. 본 발명의 방법은 또한, STRO-1^밝음 세포와 이들의 자손 세포의 혼성 집단, 또는 STRO-1^밝음 세포와 이들의 자손 세포의 혼성 배양액으로부터 가용성 인자의 투여를 수반할 수 있다.

본 발명의 바람직한 적용은 인간에 대한 적용이지만, 본 발명은 동물에도 적용될 수 있고, 여기에는 농업 동물, 예를 들면, 소, 양, 돼지 등, 반려 동물, 예를 들면, 개와 고양이, 실험실 동물, 예를 들면, 생쥐, 쥐, 햄스터와 토끼, 또는 스포츠에 이용될 수 있는 동물, 예를 들면, 말이 포함될 수 있을 것으로 기대된다.

따라서 STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포 및/또는 이들로부터 유래된 가용성 인자는 공여자 세포의 이식에 앞서 또는 이식과 동시에, 수용자의 T 세포에 의한 이식물에 대한 면역 반응을 감소시키거나 제거하는데 효과적인 양으로 STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포 및/또는 이들로부터 유래된 가용성 인자를 수용자에게 투여함으로써, 공여자 또는 외래 골수 세포에 대한 수용자의 면역계를 조절하는데 이용될 수 있다. STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포 및/또는 이들로부터 유래된 가용성 인자는 수용자의 T 세포에 영향을 주고, 따라서 공여자 또는 외래 조직이 제공될 때 T 세포 반응이 감소되거나 제거된다.

따라서 골수(조혈 줄기 세포) 이식의 문맥에서, 이식편에 의한 숙주의 공격이 감소되거나 제거될 수 있다. 공여자 골수는 수용자 내로 골수 또는 말초혈 줄기 세포의 이식에 앞서, 수용자 STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포 및/또는 이들로부터 유래된 가용성 인자로 전처리될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 공여자 골수는 먼저, 수용자 조직/세포에 노출되고, 이후 STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포 및/또는 이들로부터 유래된 가용성 인자로 처리된다. 비록 거기에 제한되지 않지만, 수용자 조직 또는 세포와의 최초 접촉은 골수에서 T 세포를 활성화시키는 기능을 하는 것으로 생각된다. STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포 및/또는 이들로부터 유래된 가용성 인자로 차후 치료는 골수에서 T 세포의 더욱 활성화를 저해하거나 제거하고, 따라서 공여자 조직에 의한 유해한 효과를 감소시키거나 제거한다, 다시 말하면, 이러한 치료는 이식편대숙주 반응(graft versus host response)을 감소시키거나 제거한다.

추가의 구체예에서, 이식편대숙주 질환을 앓는 이식 수용자는 숙주의 이식 거부반응(graft rejection)을 감소시키거나 제거하는데 효과적인 양으로, 공여자에 자기조직 또는 동종이계인 STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포 및/또는 이들로부터 유래된 가용성 인자를 이런 수용자에 투여함으로써 이의 심각도를 감소시키거나 제거하기 위해 치료될 수 있고, 상기 동종이계 세포는 수용자에 자기조직인 STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포, 또는 제3자 STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포일 수 있다. STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포 및/또는 이들로부터 유래된 가용성 인자는 공여자 조직에서 활성화된 T 세포가 수용자에 대한 면역 반응을 증가시키는 것을 저해하거나 억제하여, 이식편대숙주 반응을 감소시키거나 제거한다.

수용자의 STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포 및/또는 이들로부터 유래된 가용성 인자는 이식에 앞서 수용자로부터 획득될 수 있고, 그리고 보관되고 및/또는 숙주에 대한 진행성 이식편 공격(graft attack)을 치료하기 위한 충분한 양으로 STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포 및/또는 이들로부터 유래된 가용성 인자의 예비(reserve)를 제공하기 위해 배양-확대될 수 있다.

게다가, 본 발명의 STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포 및/또는 이로부터 유래된 가용성 인자로 단일 치료만 요구되고, 장기적인 면역억제 약물 요법이 필요하지 않은 것으로 고려된다. 대안으로, Stro-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포 및/또는 이로부터 유래된 가용성 인자의 복수 투여가 이용될 수 있다.

STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포 및/또는 이로부터 유래된 가용성 인자의 용량은 넓은 범위 내에서 변하고, 그리고 당연히, 각 특정 사례에서 개별 요구에 적합될 것이다. 일반적으로, 비경구 투여의 경우에, 수용자 체중 킬로그램당 약 0.01 내지 약 5 백만 개 세포를 투여하는 것이 관례이다. 이용된 세포의 숫자는 수용자의 체중과 상태, 투여의 횟수 또는 빈도, 그리고 당업자에게 공지된 다른 변수에 좌우될 것이다.

이들 세포는 약 0.01 내지 약 5 x 10⁶ 세포/ml의 농도에서, 적절한 희석제에 현탁될 수 있다. 상기 방법의 한 가지 형태는 저용량의 STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손을 투여하는 것을 수반한다. 이런 저용량은 예로써, 0.1 x 10⁵ 내지 0.5 x 10⁶ STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손, 예를 들면, 약 0.3 x 10⁶ STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손이다.

주사 용액에 적합한 부형제는 이들 세포 및 수용자와 생물학적으로 및 생리학적으로 조화성인 것들, 예를 들면, 완충된 염수 용액 또는 기타 적절한 부형제이다. 투여를 위한 조성물은 바람직하게는, 적절한 멸균성(sterility)과 안정성(stability)을 충족하는 표준 방법에 따라 조제되고, 생산되고, 보관된다.

하기 실례는 본 발명의 양상을 더욱 예시한다. 하지만, 이들은 본 명세서에서 진술된 바와 같은 본 발명의 교시 또는 개시를 결코 한정하지 않는다.

STRO-1 ^밝음 세포 또는 자손 세포, 그리고 상층액 또는 이로부터 유래된 하나 또는 그 이상의 가용성 인자

STRO-1^밝음 세포는 골수, 혈액, 치수 세포, 지방 조직, 피부, 비장, 췌장, 뇌, 신장, 간, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 장, 폐, 림프절, 흉선, 골, 인대, 힘줄, 골격근, 피부, 그리고 골막에서 발견되는 세포이고; 그리고 전형적으로, 생식세포주(germ line), 예를 들면, 중배엽(mesoderm) 및/또는 내배엽(endoderm) 및/또는 외배엽(ectoderm)으로 분화할 수 있다. 따라서 STRO-1^밝음 세포는 지방성, 골질, 연골성, 탄성, 근육성, 그리고 섬유성 연결 조직이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다수의 세포 유형으로 분화할 수 있다. 이들 세포가 들어가는 특정한 계통 결정(lineage-commitment)과 분화 경로는 기계적 영향 및/또는 내인성 생물활성 인자, 예를 들면, 성장 인자, 사이토킨, 및/또는 숙주 조직에 의해 확립된 국소 미세환경 조건(local microenvironmental condition)으로부터 다양한 영향에 좌우된다. 따라서 STRO-1^밝음세포는 바람직하게는, 분열하여 딸 세포를 산출하는 비-조혈성 기원 세포이고, 이들은 줄기 세포이거나, 또는 때가 되면, 비가역적으로 분화하여 표현형 세포를 산출하는 전구 세포이다.

바람직한 구체예에서, STRO-1^밝음 세포는 개체, 예를 들면, 치료되는 개체 또는 관련된 개체 또는 관련 없는 개체(동일한 종 또는 상이한 종인지에 상관없이)로부터 획득된 샘플로부터 농축된다. 본 명세서에서, 용어 '농축되는', '농축' 또는 이의 변형은 처리되지 않은 집단과 비교할 때, 한 가지 특정 세포 유형의 비율 또는 다수의 특정 세포 유형의 비율이 증가되는 세포의 집단을 기술하는데 이용된다.

한 가지 구체예에서, STRO-1^밝음 세포는 STRO-1^흐림(dim) 또는 STRO-1^중간(intermediate) 세포에 비하여 우선적으로 농축된다.

바람직한 구체예에서, 본 발명에 이용된 세포는 TNAP⁺, VCAM-1⁺, THY-1⁺, STRO-2⁺, CD45⁺, CD146⁺, 3G5⁺ 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 개별적으로 또는 집단적으로 선택되는 하나 또는 그 이상의 마커를 발현한다.

"개별적으로"는 본 발명이 언급된 마커 또는 마커의 그룹을 하나하나씩 포함하고, 그리고 개별 마커 또는 마커의 그룹이 본 명세서에 하나하나씩 열거되지 않았음에도 불구하고, 첨부된 청구항이 이런 마커 또는 마커의 그룹을 하나하나씩 및 서로로부터 나누어 정의한다는 것을 의미한다.

"집단적으로"는 본 발명이 임의의 숫자 또는 조합의 언급된 마커 또는 마커의 그룹을 포함하고, 그리고 이런 숫자 또는 조합의 마커 또는 마커의 그룹이 본 명세서에 구체적으로 열거되지 않았음에도 불구하고, 첨부된 청구항이 이런 조합 또는 하위-조합을 하나하나씩, 그리고 임의의 다른 조합의 마커 또는 마커의 그룹으로부터 나누어 정의한다는 것을 의미한다.

바람직하게는, STRO-1^밝음 세포는 추가적으로, TNAP⁺, VCAM-1⁺, THY-1^+, STRO-2⁺ 및/또는 CD146⁺중에서 하나 또는 그 이상이다.

소정의 마커에 대해 "양성"인 것으로 지칭되는 세포는 마커가 세포 표면 상에 존재하는 정도에 따라, 상기 마커를 낮은(lo 또는 흐림) 또는 높은(밝음(bright), 밝음(bri)) 수준으로 발현할 수 있고, 여기서 이들 용어는 세포의 분류 과정에 이용된 형광 또는 다른 마커의 강도에 관계한다. lo(또는 흐림 또는 둔감) 및 밝음의 구별은 분류되는 특정 세포 집단에서 이용된 마커의 문맥에서 이해될 것이다. 소정의 마커에 대해 "음성"인 것으로 지칭되는 세포는 상기 세포로부터 반드시 완전하게 부재하는 것은 아니다. 상기 용어는 마커가 상기 세포에 의해 상대적으로 매우 낮은 수준에서 발현되고, 그리고 검출가능하게 표지될 때 매우 낮은 신호를 발생시키거나, 또는 배경 수준 이상으로 검출되지 않는다는 것을 의미한다.

본 명세서에서, 용어 "밝음"은 검출가능하게 표지될 때 상대적으로 높은 신호를 발생시키는 세포 표면 상에 마커를 지칭한다. 이론에 한정됨 없이, "밝음" 세포는 샘플 내에 다른 세포보다 표적 마커 단백질(가령, STRO-1에 의해 인식되는 항원)을 더욱 많이 발현하는 것으로 제안된다. 가령, STRO-1^밝음 세포는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석에 의한 측정에서 FITC-접합된 STRO-1 항체로 표지될 때, 비-밝음 세포(STRO-1^{둔감/흐림})보다 더욱 큰 형광 신호를 발생시킨다. 바람직하게는, "밝음" 세포는 출발 샘플 내에 포함된 가장 밝게 표지된 골수 단핵 세포 중에서 적어도 약 0.1%를 구성한다. 추가의 구체예에서, "밝음" 세포는 출발 샘플 내에 포함된 가장 밝게 표지된 골수 단핵 세포 중에서 적어도 약 0.1%, 적어도 약 0.5%, 적어도 약 1%, 적어도 약 1.5%, 또는 적어도 약 2%를 구성한다. 바람직한 구체예에서, STRO-1^밝음 세포는 "배경", 다시 말하면, STRO-1^-세포에 비하여, STRO-1 표면 발현의 2 로그 크기(log magnitude) 높은 발현을 갖는다. 그에 비해, STRO-1^흐림 및/또는 STRO-1^중간 세포는 "배경"보다 STRO-1 표면 발현의 2 로그 크기 이하, 전형적으로 약 1 로그 또는 그 이하 높은 발현을 갖는다.

본 명세서에서, 용어 "TNAP"는 조직 비-특이적 알칼리성 포스파타아제의 모든 동족체(isoform)를 포함하는 것으로 의도된다. 가령, 상기 용어는 간 동족체(LAP), 골 동족체(BAP) 및 신장 동족체(KAP)를 포함한다. 바람직한 구체예에서, TNAP는 BAP이다. 특히 바람직한 구체예에서, 본 명세서에서 TNAP는 Budapest Treaty의 규정 하에 수탁 번호 PTA-7282로 2005년 12월 19일자에 ATCC에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 STRO-3 항체에 결합할 수 있는 분자를 지칭한다.

더 나아가, 바람직한 구체예에서, STRO-1^밝음 세포는 클론원성 CFU-F를 발생시킬 수 있다.

바람직하게는, 이들 다능성 세포 중에서 유의미한 부분이 적어도 2가지 상이한 생식세포주로 분화할 수 있다. 다능성 세포가 결정(commitment)될 수 있는 계통의 무제한적 실례에는 골 전구 세포; 담관 상피 세포와 간세포에 대해 다능성인 간세포 기원; 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)와 별아교세포(astrocyte)로 진행하는 아교 세포 전구체를 발생시킬 수 있는 신경 국한된 세포; 뉴런으로 진행하는 뉴런 전구체; 심근과 심근세포, 글루코오스-반응성 인슐린 분비 췌장 베타 세포주에 대한 전구체가 포함된다. 다른 계통에는 치아모세포(odontoblast), 상아질-생산 세포(dentin-producing cell)와 연골세포, 그리고 망막 색소 상피 세포, 섬유아세포, 피부 세포, 예를 들면, 케라티노사이트, 수상돌기 세포, 모낭 세포, 신관 상피 세포, 평활근과 골격근 세포, 고환 기원(testicular progenitor), 혈관 내피 세포, 힘줄, 인대, 연골, 지방세포, 섬유아세포, 골수 간질, 심근, 평활근, 골격근, 혈관주위, 혈관, 상피, 아교, 뉴런, 별아교 및 희소돌기아교 세포의 전구 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

추가의 구체예에서, Stro-1^밝음 세포는 배양 시에, 조혈 세포를 발생시킬 수 없다.

한 가지 구체예에서, 이들 세포는 치료되는 개체로부터 채취되고, 표준 기술을 이용하여 시험관내에서 배양되고, 그리고 자기조직 또는 동종이계 조성물로서 개체에 투여를 위한 상층액 또는 가용성 인자 또는 확대된 세포를 획득하는데 이용된다. 대안적 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 확립된 인간 세포주의 세포가 이용된다. 본 발명의 다른 유용한 구체예에서, 비-인간 동물의 세포(또는 환자가 인간이 아니면, 다른 종으로부터)가 이용된다.

본 발명에서는 또한, 시험관내 배양액으로부터 생산되는 STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포(후자는 또한, 확대된 세포로서 지칭됨)로부터 획득되거나 유래되는 상층액 또는 가용성 인자의 이용을 고려한다. 본 발명의 확대된 세포는 배양 조건(배양 배지에서 자극 인자의 숫자 및/또는 유형 포함), 계대배양(passage)의 횟수 등에 따라, 매우 다양한 표현형을 가질 수 있다. 일정한 구체예에서, 자손 세포는 모(母) 집단으로부터 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10회 계대배양(passage)후 획득된다. 하지만, 자손 세포는 모(母) 집단으로부터 임의의 횟수의 계대배양후 획득될 수도 있다.

자손 세포는 적절한 배지에서 배양함으로써 획득될 수 있다. 세포 배양액과 관련하여 이용될 때, 용어 "배지"는 세포를 둘러싸는 환경의 성분을 포함한다. 배지는 고체, 액체, 가스 또는 상(phase)과 물질(material)의 혼합물일 수 있다. 배지에는 액체 성장 배지뿐만 아니라 세포 성장을 유지하지 않는 액체 배지가 포함된다. 배지에는 또한, 아교질 배지, 예를 들면, 아가, 아가로오스, 젤라틴 및 콜라겐 매트릭스가 포함된다. 예시적인 가스 배지에는 페트리 접시 또는 다른 고형 또는 반고형 서포트 상에서 성장하는 세포가 노출되는 가스 상(gaseous phase)이 포함된다. 용어 "배지"는 또한, 비록 세포와 아직 접촉되지 않은 경우에도 세포 배양에서 이용이 의도되는 물질을 지칭한다. 다시 말하면, 박테리아 배양액에 대해 제조된 영양소 풍부한 액체가 배지이다. 물 또는 다른 액체와 혼합될 때 세포 배양에 적합해지는 분말 혼합물은 "분말 배지"로 명명될 수 있다.

한 가지 구체예에서, 본 발명의 방법에 유용한 자손 세포는 STRO-3 항체로 표지된 자성 구슬을 이용하여 골수로부터 TNAP⁺ STRO-1⁺ 다능성 세포를 단리하고, 그리고 이후, 단리된 세포를 배양 확대함으로써 획득된다(적절한 배양 조건의 실례를 위해 Gronthos et al. Blood 85: 929-940, 1995를 참고한다).

한 가지 구체예에서, 이런 확대된 세포(자손)(바람직하게는, 적어도 5회 계대배양후)는 TNAP^-, CC9⁺, HLA 클래스 I⁺, HLA 클래스 II^-, CD14^-, CD19^-, CD3^-, CD11a^-c^-, CD31^-, CD86^-, CD34^- 및/또는 CD80^-일 수 있다. 하지만, 본 명세서에서 기술된 것들과 상이한 배양 조건 하에, 상이한 마커의 발현이 변할 수도 있다. 또한, 이들 표현형의 세포가 확대된 세포 집단에서 우세할 수 있긴 하지만, 이것은 이러한 표현형(들)을 갖지 않는 적은 분율의 세포가 존재한다는 것을 의미하지 않는다(가령, 확대된 세포 중에서 적은 비율은 CC9^-일 수 있다). 바람직한 구체예에서, 확대된 세포는 상이한 세포 유형으로 분화하는 능력을 여전히 갖는다.

한 가지 구체예에서, 상층액 또는 가용성 인자, 또는 세포 그 자체를 획득하는데 이용되는 확대된 세포 집단은 세포 중에서 적어도 25%, 더욱 바람직하게는, 적어도 50%가 CC9⁺인 세포를 포함한다.

추가의 구체예에서, 상층액 또는 가용성 인자, 또는 세포 그 자체를 획득하는데 이용되는 확대된 세포 집단은 세포 중에서 적어도 40%, 더욱 바람직하게는, 적어도 45%가 STRO-1⁺인 세포를 포함한다.

추가의 구체예에서, 확대된 세포는 LFA-3, THY-1, VCAM-1, ICAM-1, PECAM-1, P-셀렉틴, L-셀렉틴, 3G5, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD 90, CD29, CD18, CD61, 인테그린 베타 6-19, 트롬보모듈린, CD10, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGF1-R, NGF-R, FGF-R, 렙틴-R(STRO-2 = 렙틴-R), RANKL, STRO-1^밝음 및 CD146 또는 이들 마커의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 마커를 집단적으로 또는 개별적으로 발현할 수 있다.

한 가지 구체예에서, STRO-1^밝음 세포로부터 유래된 자손 세포는 마커 Stro-1^흐림에 대해 양성이다. 이들 세포는 조직 특이적 결정 세포(Tissue Specific Committed Cell, TSCC)로서 지칭되고 STRO-1^밝음세포보다 분화에 더욱 결정되고, 따라서 유도성 인자에 반응하는 능력이 덜하다. TSCC가 결정될 수 있는 계통의 무제한적 실례에는 담관 상피 세포와 간세포에 대해 만능성인 간세포 기원; 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)와 별아교세포(astrocyte)로 진행하는 아교 세포 전구체, 그리고 뉴런으로 진행하는 뉴런 전구체를 발생시킬 수 있는 신경 국한된 세포; 심근과 심근세포, 글루코오스-반응성 인슐린 분비 췌장 베타 세포주에 대한 전구체가 포함된다. 다른 결정된 전구 세포에는 연골세포, 골아세포, 치아모세포(odontoblast), 상아질-생산 세포(dentin-producing cell)와 연골세포, 그리고 망막 색소 상피 세포, 섬유아세포, 피부 세포, 예를 들면, 케라티노사이트, 수상돌기 세포, 모낭 세포, 신관 상피 세포, 평활근과 골격근 세포, 고환 기원(testicular progenitor), 혈관 내피 세포, 힘줄, 인대, 연골, 지방세포, 섬유아세포, 골수 간질, 파골세포와 조혈-지지 간질, 심근, 평활근, 골격근, 혈관주위, 혈관, 상피, 아교, 뉴런, 별아교 및 희소돌기아교 세포의 전구 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 전구체에는 특히, 지방성, 그물눈 모양(areolar), 골질, 연골성, 탄성과 섬유성 연결 조직을 비롯한 연결 조직을 특정적으로 발생시킬 수 있는 것들이 포함된다.

추가의 구체예에서, 자손 세포는 WO 2006/032092에서 정의되고 및/또는 기술된 바와 같은 다능성 확대된 STRO-1⁺ 다능성 세포 자손(MEMP)이다. 자손이 유래될 수 있는 STRO-1⁺ 다능성 세포의 농축된 집단을 제조하는 방법은 WO 01/04268 및 WO 2004/085630에서 기술된다. 시험관내 배경에서, STRO-1⁺ 다능성 세포는 드물게는, 절대 순수한 제조물로서 존재하고, 그리고 일반적으로 조직 특이적 결정된 세포(TSCC)인 다른 세포와 함께 존재할 것이다. WO 01/04268에서는 약 0.1% 내지 90%의 순도 수준에서 골수로부터 이런 세포를 수확하는 것을 언급한다. 자손이 유래되는 MPC를 포함하는 집단은 조직 공급원으로부터 직접적으로 수확되거나, 또는 대안으로, 탈체에서 이미 확대된 집단일 수 있다.

가령, 자손은 그들이 존재하는 집단의 전체 세포 중에서 적어도 약 0.1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 95%를 포함하는, 실질적으로 정제된 STRO-1⁺ 다능성 세포의 수확된, 확대되지 않은 집단으로부터 획득될 수 있다. 이러한 수준은 예로써, TNAP, STRO-1^밝음, 3G5⁺, VCAM-1, THY-1, CD146 및 STRO-2로 구성된 군에서 개별적으로 또는 집단적으로 선택되는 적어도 하나의 마커에 대해 양성인 세포를 선별함으로써 달성될 수 있다.

MEMPS는 그들이 마커 STRO-1^밝음에 대해 양성이고 마커 알칼리성 포스파타아제(ALP)에 대해 음성인 점에서, 새로 수확된 STRO-1^밝음 세포로부터 구별될 수 있다. 대조적으로, 새로 단리된 Stro-1^밝음 세포는 STRO-1^밝음과 ALP 둘 모두에 대해 양성이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 투여된 세포 중에서 적어도 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%는 표현형 STRO-1^밝음, ALP^-를 갖는다. 더욱 바람직한 구체예에서, MEMPS는 마커 Ki67, CD44 및/또는 CD49c/CD29, VLA-3, α3β1 중에서 하나 또는 그 이상에 대해 양성이다. 더욱 바람직한 구체예에서, MEMPS는 TERT 활성을 나타내지 않고 및/또는 마커 CD18에 대해 음성이다.

STRO-1^밝음 세포 출발 집단은 골수, 치수 세포, 지방 조직 및 피부, 또는 아마도 더욱 넓게는, 지방 조직, 치아, 치수, 피부, 간, 신장, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 장, 폐, 비장, 림프절, 흉선, 췌장, 골, 인대, 골수, 힘줄 및 골격근을 비롯한 임의의 하나 또는 그 이상의 조직 유형으로부터 유래될 수 있다.

본 발명을 실시함에 있어서, 임의의 소정의 세포 표면 마커를 보유하는 세포의 분리가 다수의 상이한 방법에 의해 달성될 수 있지만, 바람직한 방법은 관련된 마커에 결합제(가령, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 결합, 그 이후에 높은 수준 결합, 또는 낮은 수준 결합 또는 결합 없음을 나타내는 것들의 분리에 의존하는 것으로 이해될 것이다. 가장 편의한 결합 작용제는 항체 또는 항체-기초된 분자이고, 바람직하게는, 단클론 항체이거나, 또는 이들 후자 작용제의 특이성으로 인하여 단클론 항체에 기초된다. 항체가 양쪽 단계에 이용될 수 있지만, 다른 작용제가 이용될 수도 있고, 따라서 이들 마커에 대한 리간드는 또한, 그들을 보유하거나, 또는 그들이 없는 세포를 농축하는데 이용될 수 있다.

항체 또는 리간드는 조제(粗製) 분리를 가능하게 하는 고형 서포트에 부착될 수 있다. 분리 기술은 바람직하게는, 수집되는 분획의 생존능의 유지를 극대화시킨다. 상이한 효능의 다양한 기술이 상대적 조제(粗製) 분리를 달성하는데 이용될 수 있다. 이용되는 특정 기술은 분리의 효능, 연관된 세포독성, 수행의 용이함과 속도, 그리고 정교한 장비 및/또는 기술에 대한 필요성에 좌우될 것이다. 분리를 위한 절차에는 항체-코팅된 자성 구슬을 이용한 자성 분리, 친화성 크로마토그래피 및 고형 매트릭스에 부착된 항체로 "팬닝"이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 정확한 분리를 제공하는 기술에는 FACS가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. FACS를 수행하는 방법은 당업자에게 명백할 것이다.

본 명세서에서 기술된 각 마커에 대한 항체는 상업적으로 구입가능하고(가령, STRO-1에 대한 단클론 항체는 R&D Systems(USA)로부터 상업적으로 구입가능하다), ATCC 또는 다른 기탁 기관으로부터 입수가능하고 및/또는 당분야의 인정된 기술을 이용하여 생산될 수 있다.

바람직하게는, STRO-1^밝음 세포를 단리하는 방법은 예로써, STRO-1의 높은 수준 발현을 인식하는 자성 활성화된 세포 분리(MACS)를 이용하는 고형 상 분류 단계인 첫 번째 단계를 포함한다. 더욱 높은 수준의 전구 세포 발현을 유발하기 위해 요망되면, 두 번째 분류 단계가 뒤따를 수 있다. 이러한 두 번째 분류 단계는 2개 또는 그 이상 마커의 이용을 필요로 할지도 모른다.

STRO-1^밝음 세포를 획득하는 방법은 또한, 공지된 기술을 이용한 첫 번째 농축 단계전 이들 세포의 공급원의 수확을 포함할 지도 모른다. 따라서 상기 조직은 외과적으로 제거될 것이다. 공급원 조직을 포함하는 세포는 이후, 소위 단일 세포 현탁액 내로 분리될 것이다. 이러한 분리는 물리적 및/또는 효소적 수단에 의해 달성될 수 있다.

일단 적절한 STRO-1^밝음 세포 집단이 획득되면, 이것은 임의의 적절한 수단에 의해 배양되거나 확대되어 MEMP가 획득될 수 있다.

한 가지 구체예에서, 이들 세포는 치료되는 개체로부터 채취되고, 표준 기술을 이용하여 시험관내에서 배양되고, 그리고 자기조직 또는 동종이계 조성물로서 개체에 투여를 위해 상층액 또는 가용성 인자 또는 확대된 세포를 획득하는데 이용된다. 대안적 구체예에서, 확립된 인간 세포주 중에서 하나 또는 그 이상의 세포는 상층액 또는 가용성 인자를 획득하는데 이용된다. 본 발명의 다른 유용한 구체예에서, 비-인간 동물의 세포(또는 환자가 인간이 아니면, 다른 종으로부터)가 상층액 또는 가용성 인자를 획득하는데 이용된다.

본 발명은 비-인간 영장류 세포, 유제류, 개, 고양이, 토끼목, 설치류, 조류, 그리고 어류 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 비-인간 동물 종으로부터 세포를 이용하여 실시될 수 있다. 본 발명이 실시될 수 있는 영장류 세포에는 침팬지, 비비, 시노몰구스 원숭이, 그리고 임의의 다른 신세계 또는 구세계 원숭이의 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명이 실시될 수 있는 유제류 세포에는 소, 돼지, 양, 염소, 말, 물소 및 들소의 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명이 실시될 수 있는 설치류 세포에는 생쥐, 쥐, 기니 피그, 햄스터 및 게르빌루스 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명이 실시될 수 있는 토끼목 종의 실례에는 집토끼, 산토끼, 야토, 솜꼬리토끼, 눈신토끼, 그리고 새앙토끼가 포함된다. 닭(Gallus gallus)은 본 발명이 실시될 수 있는 조류 종의 실례이다.

본 발명의 방법에 유용한 세포는 사용에 앞서, 또는 상층액 또는 가용성 인자를 획득하기에 앞서 보관될 수 있다. 진핵 세포, 특히 포유동물 세포의 보존과 보관을 위한 방법과 프로토콜은 당분야에 공지되어 있다(예로써, Pollard, J. W. and Walker, J. M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Second Edition, Humana Press, Totowa, N.J.; Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, Fourth Edition, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.를 참고한다).

유전자 조작된 세포

한 구체예에서, STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포는 예로써, 목적 단백질, 예를 들면, 치료적 및/또는 예방적 이점을 제공하는 단백질, 예를 들면, 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 트립시노겐, 키모트립시노겐, 엘라스타제, 카르복시펩티다아제, 췌장 리파아제 또는 아밀라아제, 또는 증강된 혈관신생(angiogenesis)과 연관되거나 이의 원인이 되는 폴리펩티드, 또는 췌장 세포 또는 혈관 세포로 세포의 분화와 연관된 폴리펩티드를 발현 및/또는 분비하도록 유전자 조작된다.

세포를 유전자 조작하기 위한 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 가령, 세포 내에서 발현되는 핵산은 세포 내에서 발현을 유도하기 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 가령, 핵산은 개체의 다양한 세포에서 작동하는 프로모터, 예를 들면, 바이러스 프로모터, 예를 들면, CMV 프로모터(가령, CMV-IE 프로모터) 또는 SV-40 프로모터에 연결된다. 추가 적절한 프로모터는 당분야에 공지되어 있고, 그리고 본 발명의 현재 구체예에 준용될 것이다.

바람직하게는, 핵산은 발현 구조체의 형태로 제공된다. 본 명세서에서, 용어 "발현 구조체"는 세포 내에서, 발현 구조체가 작동가능하게 연결되는 핵산(가령, 리포터 유전자 및/또는 역-선택가능 리포터 유전자)에 발현을 공여하는 능력을 갖는 핵산을 지칭한다. 본 발명의 문맥 내에서, 발현 구조체는 이종기원 DNA를 발현가능 형식으로 유지하고 및/또는 복제할 수 있는 플라스미드, 박테리오파아지, 파지미드, 코스미드, 바이러스 하위-게놈 또는 게놈 단편, 또는 기타 핵산이거나, 또는 이를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.

본 발명의 실시를 위한 적절한 발현 구조체의 작제를 위한 방법은 당업자에게 명백할 것이고, 그리고 예로써, Ausubel et al (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987) 또는 Sambrook et al (In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001)에서 기술된다. 가령, 발현 구조체의 각 성분은 예로써, PCR을 이용하여 적절한 주형 핵산으로부터 증폭되고, 그리고 적절한 발현 구조체, 예를 들면, 플라스미드 또는 파지미드 내로 차후 클로닝된다.

이런 발현 구조체에 적합한 벡터는 당분야에 공지되어 있고 및/또는 본 명세서에서 기술된다. 가령, 포유동물 세포에서 본 발명의 방법에 적합한 발현 벡터는 예로써, Invitrogen에 의해 공급된 pcDNA 벡터 스위트의 벡터, pCI 벡터 스위트(Promega)의 벡터, pCMV 벡터 스위트(Clontech)의 벡터, pM 벡터(Clontech), pSI 벡터(Promega), VP 16 벡터(Clontech) 또는 pcDNA 벡터 스위트(Invitrogen)의 벡터이다.

당업자는 추가 벡터 및 이런 벡터의 공급원, 예를 들면, Invitrogen Corporation, Clontech 또는 Promega을 인지할 것이다.

발현을 위한 세포 내로 단리된 핵산 분자 또는 이를 포함하는 유전자 구조체를 도입하기 위한 수단은 당업자에게 공지되어 있다. 소정의 생물체에 대해 이용되는 기술은 공지된 성공적인 기술에 의존한다. 세포 내로 재조합 DNA를 도입하기 위한 수단에는 그 중에서도 특히, 미세주사, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염(transfection), 리포좀(liposome), 예를 들면, 리포펙타민(lipofectamine)(Gibco, MD, USA) 및/또는 셀펙틴(cellfectin)(Gibco, MD, USA)에 의해 매개된 형질감염, PEG-매개된 DNA 흡수, 전기천공(electroporation) 및 예로써, DNA-코팅된 텅스텐 또는 금 입자(Agracetus Inc., WI, USA)를 이용한 미세입자 폭발(microparticle bombardment)이 포함된다.

대안으로, 본 발명의 발현 구조체는 바이러스 벡터이다. 적절한 바이러스 벡터는 당분야에 공지되어 있고 상업적으로 구입가능하다. 핵산의 전달 및 상기 핵산의 숙주 세포 게놈으로의 통합(integration)을 위한 전통적인 바이러스-기초된 시스템에는 예로써, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노-연관된 바이러스 벡터가 포함된다. 대안으로, 아데노바이러스 벡터는 에피솜(episomal) 상태로 남아있는 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는데 유용하다. 바이러스 벡터는 표적 세포와 조직에서 유전자 전달의 효율적이고 다재다능한 방법이다. 추가적으로, 높은 형질도입(transduction) 효율이 많은 상이한 세포 유형과 표적 조직에서 관찰되었다.

가령, 레트로바이러스 벡터는 일반적으로, 최대 6-10 kb의 외래 서열에 대한 포장 수용력(packaging capacity)을 갖는 시스-작용 긴 말단 반복(long terminal repeat, LTR)을 포함한다. 최소 시스-작용 LTR은 벡터의 복제와 포장에 충분하고, 이것은 이후, 발현 구조체를 표적 세포 내로 통합하여 장기 발현을 제공하는데 이용된다. 폭넓게 이용되는 레트로바이러스 벡터에는 뮤린 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 유인원 면역결핍 바이러스(SrV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 그리고 이들의 조합에 기초된 것들이 포함된다(예로써, Buchscher et al., J Virol. 56:2731-2739 (1992); Johann et al, J. Virol. 65:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al, Virol. 76:58-59 (1990); Wilson et al, J. Virol. 63:274-2318 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700; Miller and Rosman BioTechniques 7:980-990, 1989; Miller, A. D. Human Gene Therapy 7:5-14, 1990; Scarpa et al Virology 75:849-852, 1991; Burns et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:8033-8037, 1993).

핵산 전달을 위해 다양한 아데노-연관된 바이러스(AAV) 벡터 시스템 역시 개발되었다. AAV 벡터는 당분야에 공지된 기술을 이용하여 용이하게 작제될 수 있다. 예로써, U.S. Pat. Nos. 5,173,414와 5,139,941; International Publication Nos. WO 92/01070과 WO 93/03769; Lebkowski et al. Molec. Cell. Biol. 5:3988-3996, 1988; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter Current Opinion in Biotechnology 5:533-539, 1992; Muzyczka. Current Topics in Microbiol, and Immunol. 158:97-129, 1992; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801, 1994; Shelling and Smith Gene Therapy 7:165-169, 1994; 그리고 Zhou et al. J Exp. Med. 179:1867-1875, 1994를 참고한다.

본 발명의 발현 구조체를 전달하는데 유용한 추가 바이러스 벡터에는 예로써, 바이러스의 폭스 패밀리(pox family), 예를 들면, 우두 바이러스(vaccinia virus) 및 조류 폭스바이러스(avian poxvirus) 또는 알파바이러스(alphavirus) 또는 접합체 바이러스 벡터로부터 유래된 것들(가령, Fisher-Hoch et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 56:317-321, 1989에서 기술된 것들)이 포함된다.

세포 및 가용성 인자의 치료적/예방적 잠재력 검정

GvHD를 치료하거나, GvHD를 예방하거나, 또는 GvHD의 발생 또는 진행을 지연시키기 위한, STRO-1^밝음 세포로부터 유래된 가용성 인자의 능력을 결정하는 방법은 당업자에게 명백할 것이다.

가령, 가용성 인자의 면역억제 활성을 결정하기 위한 적절한 시험관내 검사는 본 명세서의 실시예 5에서 기술된다.

추가의 구체예에서, 가용성 인자의 효능은 본 명세서의 실시예 6과 7에서 기술된 바와 같은 GvHD의 생체내 모델에서 평가될 수 있다.

본 발명이 GvHD의 치료, 예방 또는 지연을 가용성 인자를 확인하거나 단리하기 위한 방법 역시 제시한다는 것은 전술한 내용으로부터 당업자에게 명백할 것이고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

(i) 가용성 인자를 GvHD를 앓는 검사 개체에 투여하고 상기 개체에서 GvHD의 진행을 평가하는 단계;

(ii) (i)에서 개체에서 GvHD의 수준을 가용성 인자가 투여되지 않은, GvHD를 앓는 대조 개체에서 GvHD의 수준과 비교하는 단계,

여기서 대조 개체와 비교하여 검사 개체에서 감소된 GvHD는 가용성 인자가 GvHD를 치료하거나, 예방하거나, 또는 지연시킨다는 것을 지시한다.

세포 조성물

본 발명의 한 구체예에서, STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포는 조성물의 형태로 투여된다. 바람직하게는, 이런 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함한다.

용어 "담체"와 "부형제"는 활성 화합물의 보관, 투여, 및/또는 생물학적 활성을 용이하게 하기 위해 당분야에서 편의적으로 이용되는 물질의 조성(composition of matter)을 지칭한다(예로써, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mac Publishing Company (1980)을 참고한다). 담체는 또한, 활성 화합물의 임의의 바람직하지 않은 부작용을 감소시킬 수 있다. 적절한 담체는 예로써, 안정하다, 예를 들면, 담체 내에 다른 성분과 반응할 수 없다. 한 가지 구체예에서, 담체는 치료에 이용되는 용량과 농도에서 수용자에서 유의미한 국소 또는 전신 부작용을 발생시키지 않는다.

본 발명에 적합한 담체에는 편의적으로 이용되는 것들이 포함된다, 예를 들면, 물, 염수, 수성 덱스트로스, 락토오스, 링거 용액, 완충된 용액, 히알루로난(hyaluronan)과 글리콜은 특히, 용액(등장성일 때)에 대한 선호되는 액체 담체이다. 적절한 약학적 담체와 부형제에는 전분, 셀룰로오스, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 염화나트륨, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다.

다른 실례에서, 담체는 예로써, 세포가 성장되거나 현탁되는 배지 조성물이다. 바람직하게는, 이런 배지 조성물은 투여되는 개체에서 임의의 유해한 효과를 유도하지 않는다.

바람직한 담체와 부형제는 세포의 생존능 및/또는 췌장 기능장애를 감소, 예방 또는 지연시키는 세포의 능력에 유해한 영향을 주지 않는다.

한 가지 실례에서, 담체 또는 부형제는 세포 및/또는 가용성 인자를 적절한 pH에 유지시켜 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 완충 활성을 제공한다, 예를 들면, 담체 또는 부형제는 포스페이트 완충된 염수(PBS)이다. PBS는 매력적인 담체 또는 부형제인데, 그 이유는 이것이 세포 및 인자와 최소한으로 상호작용하고 세포 및 인자의 신속한 방출을 가능하게 하기 때문이고, 이런 경우에 본 발명의 조성물은 예로써, 주사에 의해 혈류에, 또는 조직 또는 조직을 둘러싸거나 조직에 인접한 구역 내로 직접 적용을 위한 액체로서 생산될 수 있다.

STRO-1^밝음 세포 및/또는 이들의 자손 세포는 또한, 수용자-조화성이고 수용자에게 유해하지 않는 산물로 분해되는 골격(scaffold) 내에 함입되거나 끼워 넣어질 수 있다. 이들 골격은 수용자 개체 내로 이식되는 세포에 대한 서포트와 보호를 제공한다. 자연 및/또는 합성 생물분해성 골격은 이런 골격의 실례이다.

다양한 상이한 골격이 본 발명의 실시에 성공적으로 이용될 수 있다. 바람직한 골격에는 생물학적, 분해성 골격이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 자연 생물분해성 골격에는 콜라겐, 피브로넥틴, 그리고 라미닌 골격이 포함된다. 세포 이식 골격에 적합한 합성 재료는 광범위한 세포 성장과 세포 기능을 지원할 수 있어야 한다. 이런 골격은 또한, 재흡수될 수도 있다. 적절한 골격에는 예로써, Vacanti, et al. J. Ped. Surg. 23:3-9 1988; Cima, et al. Biotechnol. Bioeng. 38:145 1991; Vacanti, et al. Plast. Reconstr. Surg. 88:753-9 1991에서 기술된 바와 같은 폴리글리콜산(polyglycolic acid) 골격; 또는 합성 중합체(synthetic polymer), 예를 들면, 폴리무수물(polyanhydride), 폴리오르토에스테르(polyorthoester), 그리고 폴리락트산(polylactic acid)이 포함된다.

추가의 구체예에서, 이들 세포는 겔 골격(가령, Upjohn Company로부터 Gelfoam)에 담겨 투여될 수 있다.

본 발명에 유용한 세포 조성물은 단독으로, 또는 다른 세포와의 혼합물로서 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물과 공동으로 투여될 수 있는 세포에는 다능성(multipotent) 또는 만능성(pluripotent) 세포 또는 줄기 세포, 또는 골수 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 상이한 유형의 세포는 투여 직전에 또는 조금 전에 본 발명의 조성물과 혼합되거나, 또는 이들은 투여에 앞서 일정한 기간 동안 함께 공동-배양될 수 있다.

바람직하게는, 조성물은 효과량 또는 치료적 또는 예방적 효과량의 세포를 포함한다. 가령, 조성물은 약 1x10⁵ STRO-1^밝음 세포/kg 내지 약 1x10⁷ STRO-1^밝음 세포/kg 또는 약 1x10⁶ STRO-1^밝음 세포/kg 내지 약 5x10⁶ STRO-1^밝음 세포/kg을 포함한다. 투여되는 세포의 정확한 양은 환자의 연령, 체중과 성별, 그리고 췌장 기능장애의 정도와 심각도를 비롯한 다양한 인자에 좌우된다.

일부 구체예에서, 세포는 이들 세포가 개체의 순환(circulation) 내로 빠져나가는 것을 허용하지 않지만, 이들 세포에 의해 분비되는 인자가 순환 내로 들어가도록 허용하는 챔버 내에 포함된다. 이러한 방식으로, 가용성 인자는 세포가 이들 인자를 개체의 순환 내로 분비하도록 허용함으로써 개체에 투여될 수 있다. 이런 챔버는 가용성 인자의 국소 수준을 증가시키기 위해 개체 내의 부위에 동등하게 이식될 수 있다, 예를 들면, 이식된 장기 내에 또는 인근에 이식될 수 있다.

본 발명의 일부 구체예에서, 세포 조성물로 치료의 개시에 앞서 환자를 면역억제하는 것이 필요하거나 바람직하지 않을 수도 있다. 따라서 동종이계, 또는 심지어 이종 STRO-1^밝음 세포 또는 이의 자손으로 이식이 일부 경우에 관용될 수 있다.

하지만, 다른 경우에, 세포 요법을 시작하기에 앞서, 환자를 약리학적으로 면역억제하는 것이 바람직하거나 적절할 수 있다. 이것은 전신 또는 국소 면역억제 작용제의 이용을 통해 달성되거나, 또는 캡슐화된 장치에서 세포를 전달함으로써 달성될 수 있다. 세포는 세포 및 세포의 치료 인자에 의해 요구되는 영양소와 산소에 침투성이고, 그리고 면역 체액 인자와 세포에 불침투성인 캡슐 내에 캡슐화될 수 있다. 바람직하게는, 봉합제(encapsulant)는 저자극성(hypoallergenic)이고, 표적 조직 내에 쉽고 안정되게 위치되고, 그리고 이식된 구조에 부가된 보호를 제공한다. 이식된 세포에 대한 면역 반응을 감소시키거나 제거하기 위한 이들 수단 및 다른 수단은 당분야에 공지되어 있다. 대안으로서, 이들 세포는 그들의 면역원성을 줄이기 위해 유전자 조작될 수 있다.

가용성 인자의 조성물

본 발명의 한 구체예에서, STRO-1^밝음 세포-유래된 및/또는 자손 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자는 예로써, 적절한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 조성물의 형태로 투여된다. 바람직하게는, 담체 또는 부형제는 가용성 인자 또는 상층액의 생물학적 효과에 부정적인 영향을 주지 않는다.

한 구체예에서, 조성물은 상층액의 가용성 인자 또는 성분, 예를 들면, 프로테아제 저해제를 안정화시키는 물질의 조성을 포함한다. 바람직하게는, 프로테아제 저해제는 개체에 대한 유해한 효과가 나타날 만큼 충분한 양으로 포함되지 않는다.

STRO-1^밝음 세포-유래된 및/또는 자손 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자를 포함하는 조성물은 예로써, 배양액 배지에서 또는 안정된 담체 또는 완충액 용액, 예를 들면, 포스페이트 완충된 염수에서 적절한 액체 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적절한 담체는 본 명세서에서 앞서 기술된다. 다른 실례에서, Stro-1^밝음 세포-유래된 및/또는 자손 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자를 포함하는 현탁액은 주사를 위한 유성 현탁액이다. 적절한 친유성 용매 또는 운반제에는 지방 오일, 예를 들면, 참깨 오일; 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들면, 에틸 올리에이트 또는 트리글리세리드; 또는 리포좀이 포함된다. 주사에 이용되는 현탁액은 또한, 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들면, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 내포할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한, 고도로 농축된 용액의 제조가 가능하도록 화합물의 용해도를 증가시키기 위해 적절한 안정화제 또는 작용제를 내포할 수 있다.

무균 주사가능 용액은 적절한 용매에서 필요한 양으로 상층액 또는 가용성 인자를 필요에 따라, 앞서 열거된 성분 중에서 한 가지 또는 이들의 조합과 통합하고, 그 이후에 여과된 멸균에 의해 제조될 수 있다.

일반적으로, 분산액은 상층액 또는 가용성 인자를 기본 분산 매체 및 앞서 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분을 내포하는 무균 운반제 내로 통합함으로써 제조된다. 무균 주사가능 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 미리 무균-여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가 원하는 성분의 분말을 산출하는 진공 건조(vacuum drying) 및 냉동-건조(freeze-drying)이다. 본 발명의 대안적 양상에 따라서, 상층액 또는 가용성 인자는 용해성을 증강시키는 하나 또는 그 이상의 추가 화합물로 조제될 수 있다.

다른 예시적인 담체 또는 부형제는 예로써, Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N. Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N. Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y에서 기술된다.

치료적 조성물은 전형적으로, 제조와 보관의 조건 하에 무균이고 안정되어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀, 또는 기타 정연한 구조로서 조제될 수 있다. 담체는 예로써, 물, 에탄올, 폴리올(가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 그리고 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 그리고 이들의 적절한 혼합물을 내포하는 용매 또는 분산 매체일 수 있다. 적절한 유동성(fluidity)은 예로써, 레시틴과 같은 코팅의 이용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 조성물 내에 등장성 작용제, 예를 들면, 당, 다가알코올, 예를 들면, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들면, 모노스테아레이트 염과 젤라틴을 조성물 내에 포함함으로써 달성될 수 있다. 게다가, 가용성 인자는 시한 방출 제제(time release formulation), 예를 들면, 느린 방출 중합체(slow release polymer)를 포함하는 조성물에 담겨 투여될 수 있다. 활성 화합물은 급속한 방출로부터 화합물을 보호하는 담체로, 이식물 및 미세캡슐화된 전달 시스템(microencapsulated delivery system)을 비롯한 방출 제어형 제제(controlled release formulation)로서 제조될 수 있다. 생물분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 폴리락트산 및 폴리락틱, 폴리글리콜릭 공중합체(PLG)가 이용될 수 있다. 이런 제제의 제조를 위한 많은 방법이 특허화되거나, 또는 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다.

상층액 또는 가용성 인자는 예로써, 가용성 인자의 느린 방출을 제공하기 위해 적절한 매트릭스와 공동으로 투여될 수 있다.

투여 방식

STRO-1^밝음세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자, STRO-1^밝음 세포 또는 이의 자손은 외과적으로 이식되거나, 주사되거나, 전달되거나(가령, 카테터 또는 주사기에 의해), 또는 수복 또는 강화가 요구되는 부위, 예를 들면, 개체의 장기에 또는 개체의 혈관계 내로 직접적으로 또는 간접적으로 달리 투여될 수 있다.

바람직하게는, STRO-1^밝음 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자, STRO-1^밝음 세포 또는 이의 자손은 개체의 혈류로 전달된다. 가령, STRO-1^밝음 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자, STRO-1^밝음 세포 또는 이의 자손은 비경구 전달된다. 비경구 투여의 예시적인 루트에는 정맥내, 근육내, 피하, 동맥내, 복막내, 심실내, 뇌실내, 척수강내가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 바람직하게는, STRO-1^밝음 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자, STRO-1^밝음 세포 또는 이의 자손은 동맥내, 대동맥 내로, 심장의 심방 또는 심실 내로, 또는 췌장에 연결된 혈관, 예를 들면, 복대동맥, 상장간동맥, 십이지장동맥 또는 비동맥 내로 전달된다.

심장의 심방 또는 심실에 세포 전달의 경우에, 세포는 폐에 세포의 급속한 전달로부터 발생할 수 있는 합병증을 피하기 위해 왼쪽 심방 또는 심실에 투여되는 것이 바람직하다.

바람직하게는, STRO-1^밝음 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자, STRO-1^밝음 세포 또는 이의 자손은 예로써, 주사기를 이용하여, 또는 카테터 또는 중심선(central line)을 통해 전달 부위 내로 주사된다.

치료적 제제에 대한 투여 섭생의 선별은 독립체의 혈청 또는 조직 회전율(turnover rate), 증상의 수준, 그리고 독립체의 면역원성(immunogenicity)을 비롯한 여러 인자에 좌우된다. 바람직하게는, 투여 섭생은 허용되는 수준의 부작용과 일관되게, 환자에 전달되는 치료적 화합물의 양을 극대화시킨다. 따라서 전달되는 제제의 양은 특정 독립체 및 치료되는 질환의 심각도에 부분적으로 좌우된다.

한 구체예에서, STRO-1^밝음 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자, STRO-1^밝음 세포 또는 이의 자손은 단일 일시주사 복용량(single bolus dose)으로서 전달된다. 대안으로, STRO-1^밝음 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자, STRO-1^밝음 세포 또는 이의 자손은 연속 주입(continuous infusion)에 의해, 또는 예로써, 하루, 1주 또는 주당 1-7회의 간격에서 투약에 의해 투여된다. 바람직한 투약 프로토콜은 유의미한 원치 않는 부작용을 회피하는 최대량 또는 투약 빈도(dose frequency)를 수반하는 것이다. 총 1주 용량은 이용되는 화합물의 유형과 활성에 좌우된다. 적절한 용량의 결정은 예로써, 치료에 영향을 주거나, 또는 치료에 영향을 줄 것으로 예측되는 당분야에서 공지되거나 예상되는 파라미터 또는 인자를 이용하여 임상의에 의해 이루어진다. 일반적으로, 투약은 최적 용량(optimum dose)보다 다소 적은 양으로 시작되고, 그 이후 임의의 부정적인 부작용에 비하여 원하는 또는 최적 효과가 달성될 때까지 작은 증분(increment)에 의해 증가된다. 중요한 진단적 적도(diagnostic measure)는 당뇨병의 증상의 것들을 포함한다.

도면의 간단한 설명
도 1. 성숙 인간 BMMNC에 의한 TNAP(STRO-3) 및 간엽성 전구 세포 마커, STRO-1 ^밝음 의 공동-발현. 이중-칼라 면역형광과 유세포분석법은 FITC(x 축)에 커플링된 염소 항-뮤린 IgM 항체로 간접적으로 표지된 STRO-1 MACS-선별된 BMMNC, 그리고 PE(y 축)에 커플링된 염소 항-뮤린 IgG로 간접적으로 표지된 STRO-3 mAb(뮤린 IgG1)의 배양에 의해 수행되었다. 점도표 히스토그램은 리스트모드 데이터(listmode data)로서 수집된 5 x 10⁴ 사건을 나타낸다. 수직선과 수평선은 동일한 조건 하에 처리된 아이소타입-정합된 대조 항체, 1B5(IgG)와 1A6.12(IgM)로 획득된 <1.0% 평균 형광의 반응성 수준으로 설정되었다. 이들 결과는 STRO-1^밝음 세포의 소수 집단이 TNAP(위쪽 오른쪽 사분면)을 공동-발현하지만, 나머지 STRO-1⁺ 세포가 STRO-3 mAb와 반응하지 않는다는 것을 증명한다.
도 2. 배양되고 확대된 STRO-1 ^밝음 MPC의 STRO-1 ^밝음 또는 STRO-1 ^흐림 자손의 유전자 발현 프로필. 탈체에서 확대된 골수 MPC의 단일 세포 현탁액은 트립신/EDTA 처리에 의해 제조되었다. 세포는 STRO-1 항체로 염색되고, 이것은 차후에, 염소-항 뮤린 IgM-플루오레세인 이소티오시아네이트와 함께 배양에 의해 노출되었다. 전체 세포 RNA는 형광 활성화 세포 분류 이후에, STRO-1^흐림 또는 STRO-1^밝음 발현 세포의 정제된 집단으로부터 제조되었다(A). RNAzolB 추출 방법, 그리고 표준 절차를 이용하여, 전체 RNA는 각 하위집단으로부터 단리되고 cDNA 합성을 위한 주형으로서 이용되었다. 다양한 전사체의 발현은 기존 문헌(Gronthos et al. J Cell Sci. 116:1827-1835, 2003)에서 기술된 바와 같은 표준 프로토콜을 이용하여, PCR 증폭에 의해 평가되었다. 본 연구에 이용된 프라이머 세트는 표 2에 제시된다. 증폭 이후에, 각 반응 혼합물은 1.5% 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석되고, 그리고 브롬화에티듐 염색(ethidium bromide staining)에 의해 가시화되었다(B). 각 세포 마커에 대한 상대적 유전자 발현은 ImageQant 소프트웨어를 이용하여, 가사 유전자, GAPDH의 발현에 관하여 평가되었다(C).
도 3. 배양되고 확대된 STRO-1 ⁺ MPC의 STRO-1 ^밝음 자손은 높은 수준의 SDF-1을 발현하지만, STRO-1 ^흐림 자손은 그렇지 않다. (A) STRO-1⁺ BMMNC의 MACS-단리된 제조물(preparation)은 FACS를 이용하여 구역에 따른 상이한 STRO-1 부분집합, STRO-1^밝음 및 STRO-1^{흐림/둔감}으로 분할되었다. 전체 RNA는 각 STRO-1 하위집단으로부터 준비되고 STRO-1^밝음 공제 혼성화 라이브러리를 작제하는데 이용되었다(B-C). STRO-1^밝음 공제된 cDNA로 형질전환된 박테리아 클론으로부터 증폭된 대표적인 PCR 산물로 블롯팅(blotting)된 니트로셀룰로오스 필터를 반복한다. 이들 필터는 이후, [³²P] 데옥시시티딘 트리포스페이트(dCTP)-표지된 STRO-1^밝음(B) 또는 STRO-1^{흐림/둔감}(C) 공제된 cDNA로 탐침되었다. 화살표는 인간 SDF-1에 상응하는 cDNA 단편을 내포하는 1 클론의 차등적 발현을 표시한다. (D) 배양에 앞서, 새로 MACS/FACS-단리된 BMMNC STRO-1 집단으로부터 준비된 전체 RNA에서 SDF-1과 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH) 전사체의 상대적 발현을 증명하는 역전사효소(RT)-PCR 분석. bp는 염기쌍(base pair)을 표시한다.
도 4. T 세포 증식의 저해에 대한 STRO-1 음성 MSC(제조물 A)와 STRO-1 ^밝음 MPC(제조물 B)의 비교 효능. PBMC는 제조물 A 또는 B의 부재 또는 존재에서 4일 동안, CD3/CD28 코팅된 구슬로 자극되었다. T 세포 증식은 분당 카운트(count per minute, cpm)로서 ³H-Tdr 함입(incorporation)에 의해 측정되었다.
도 5. T 세포 증식의 저해에 대한 STRO-1 음성 MSC(제조물 A)와 STRO-1 ^밝음 MPC(제조물 B)의 비교 효능. PBMC는 상이한 농도의 제조물 A 또는 B의 존재에서 4일 동안, CD3/CD28 코팅된 구슬로 자극되었다. 다양한 배양액에서 T 세포 증식은 ³H-Tdr 함입(incorporation)에 의해 측정되고, 그리고 PBMC가 MSC의 부재에서 자극된 대조 T 세포 증식의 백분율로서 보고되었다.
도 6. GvHD에 대한 STRO-1 음성 MSC(제조물 A)와 STRO-1 ^밝음 MPC(제조물 B)의 비교 효과. B10.D2(H2d) 공여자로부터 T-세포 고갈된 골수 단핵 세포(BMMC)(5x10⁶)와 비장세포(30x10⁶)는 치명적으로 조사(照射)(750cGy)된 BALB/c(H2d) 수용자 생쥐의 정맥내 주사되었다. 4주후, 수용자 생쥐는 생쥐당 1x10⁶ MSC(제조물 A1) 또는 MPC(제조물 B1)가 주사되거나, 또는 추가 치료 없음(대조)이 제공되었다. 군당 8마리 생쥐가 주사되었다. 생쥐는 주 간격으로 평가되었다. 시간은 주(week)의 숫자를 지칭한다.
도 7. GvHD에 대한 STRO-1 음성 MSC(제조물 A)와 STRO-1 ^밝음 MPC(제조물 B)의 비교 효과. B10.D2(H2d) 공여자로부터 T-세포 고갈된 골수 단핵 세포(BMMC)(5x10⁶)와 비장세포(30x10⁶)는 치명적으로 조사(照射)(750cGy)된 BALB/c(H2d) 수용자 생쥐의 정맥내 주사되었다. 4주후, 수용자 생쥐는 1 또는 2x10⁶ 세포의 제조물 A 또는 B(A1, A2, B1, B2)가 주사되거나, 또는 추가 치료 없음(대조)이 제공되었다. 군당 8마리 생쥐가 주사되었다.
도 8. GvHD에 대한 고용량 STRO-1 음성 MSC(제조물 A)와 STRO-1 ^밝음 MPC(제조물 B)의 비교 효과. B10.D2(H2d) 공여자로부터 T-세포 고갈된 골수 단핵 세포(BMMC)(5x10⁶)와 비장세포(30x10⁶)는 치명적으로 조사(照射)(750cGy)된 BALB/c(H2d) 수용자 생쥐의 정맥내 주사되었다. 4주후, 수용자 생쥐는 2x10⁶ 세포의 제조물 A 또는 B(A2, B2)가 주사되거나, 또는 추가 치료 없음(대조 2)이 제공되었다. 군당 8마리 생쥐가 주사되지만, 주사 직후에 각각 군 B2와 A2에서 4마리와 3마리 생쥐가 폐사하였다.
도 9. GvHD에 대한 저용량 STRO-1 음성 MSC(제조물 A)와 STRO-1 ^밝음 MPC(제조물 B)의 비교 효과. B10.D2(H2d) 공여자로부터 T-세포 고갈된 골수 단핵 세포(BMMC)(5x10⁶)와 비장세포(30x10⁶)는 치명적으로 조사(照射)(750cGy)된 BALB/c(H2d) 수용자 생쥐의 정맥내 주사되었다. 4주후, 수용자 생쥐는 0.3x10⁶ 세포의 제조물 A 또는 B(A0.3, B0.3)가 주사되거나, 또는 추가 치료 없음(대조 2)이 제공되었다. 군당 6마리 생쥐가 주사되었다. 그래프는 각 군당 GvHD 스코어를 보고한다.
도 10. GvHD에 대한 저용량 STRO-1 음성 MSC(제조물 A)와 STRO-1 ^밝음 MPC(제조물 B)의 비교 효과. B10.D2(H2d) 공여자로부터 T-세포 고갈된 골수 단핵 세포(BMMC)(5x10⁶)와 비장세포(30x10⁶)는 치명적으로 조사(照射)(750cGy)된 BALB/c(H2d) 수용자 생쥐의 정맥내 주사되었다. 4주후, 수용자 생쥐는 0.3x10⁶ 세포의 제조물 A 또는 B(A0.3, B0.3)가 주사되거나, 또는 추가 치료 없음(대조 2)이 제공되었다. 군당 6마리 생쥐가 주사되었다. 그래프는 각 군에서 평균 GvHD 스코어를 보고한다.

실시예

실시예 1: MSC 제조물

MSC는 US 5,837,539에서 기술된 바와 같이 골수로부터 de novo 산출된다. 대략 80-100 ml의 골수가 무균 헤파린-내포 주사기 내로 흡출되고 MSC 산출을 위해 MDACC Cell Therapy Laboratory에 보내졌다. 골수 단핵 세포는 ficoll-hypaque를 이용하여 단리되고, 그리고 젠타마이신, 글루타민(2 mM) 및 20%(v/v) 소 태아 혈청(FBS)(Hyclone)을 내포하는 알파 변형된 MEM(αMEM)을 포함하는 플라스크당 50 ml의 MSC 확대 배지를 갖는 2개의 T175 플라스크 내로 배치되었다.

이들 세포는 37℃, 5%CO₂에서 2-3일 동안 배양되고, 이 시점에서 비-부착성 세포가 제거되었다; 남아있는 부착성 세포는 세포 합류(confluence)가 70% 또는 그 이상에 도달할 때(7-10일)까지 연속적으로 배양되고, 이후 이들 세포는 트립신처리되고 MSC 확대 배지(플라스크당 50 ml의 배지)를 갖는 6개의 T175 플라스크에서 교체되었다. US 5,837,539의 표 5에서 기술된 바와 같이, 이러한 방식으로 단리되고 확대된 MSC는 STRO-1 음성이다.

실시예 2: STRO-3+ 세포의 선별에 의한 MPC의 면역선별

골수(BM)는 Institutional Ethics Committee of the Royal Adelaide Hospital에 의해 승인된 절차에 따라서, 건강한 정상 성인 지원자(20-35세 연령)로부터 수확되었다. 간단히 말하면, 40 ml의 BM이 후장골극(posterior iliac crest)으로부터 리튬-헤파린 항응혈약-내포 튜브 내로 흡출된다.

BMMNC는 기존 문헌(Zannettino, A.C. et al. (1998) Blood 92: 2613-2628)에서 기술된 바와 같이, Lymphoprep^TM(Nycomed Pharma, Oslo, Norway)을 이용한 밀도 구배 분리에 의해 제조된다. 4℃에서 30분 동안 400 x g에서 원심분리 이후에, 연층(buffy layer)은 이전 피펫(transfer pipette)으로 제거되고, 그리고 5% 소 태아 혈청(FCS, CSL Limited, Victoria, Australia)을 내포하는 Hank 균형 염 용액(HBSS; Life Technologies, Gaithersburg, MD)으로 구성되는 "HHF"에서 3회 세척된다.

STRO-3⁺(또는 TNAP⁺) 세포는 기존 문헌(Gronthos et al. (2003) Journal of Cell Science 116: 1827-1835; Gronthos, S. and Simmons, P.J. (1995) Blood 85: 929-940)에서 기술된 바와 같이, 자성 활성화 세포 분리에 의해 차후 단리되었다. 간단히 말하면, 대략 1-3 x 10⁸ BMMNC는 HHF에서 10%(v/v) 정상 토끼 혈청으로 구성되는 차단 완충액에서, 얼음 위에서 20분 동안 배양되었다. 이들 세포는 차단 완충액에서 STRO-3 mAb의 10 ㎍/ml 용액 200 ㎕와 함께, 얼음 위에서 1시간 동안 배양된다. 이들 세포는 400 x g에서 원심분리에 의해 HHF에서 2회 차후 세척된다. HHF 완충액에서 1/50 희석의 염소 항-생쥐 γ-비오틴(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, UK)이 첨가되고, 그리고 이들 세포는 얼음 위에서 1시간 동안 배양된다. 세포는 MACS 완충액(1% BSA, 5 mM EDTA 및 0.01% 나트륨 아지드로 보충된 Ca²⁺-와 Mn²⁺-없는 PBS)에서 상기와 같이 2회 세척되고 0.9 ml MACS 완충액의 최종 부피에서 재현탁되었다.

100 ㎕ 스트렙타비딘 마이크로구슬(Miltenyi Biotec; Bergisch Gladbach, Germany)이 세포 현탁액에 첨가되고 얼음 위에서 15분 동안 배양된다. 세포 현탁액은 2회 세척되고, 0.5 ml의 MACS 완충액에서 재현탁되고, 그리고 미니 MACS 칼럼(MS Columns, Miltenyi Biotec) 위에 차후 적하되고, 그리고 STRO-3 mAb(수탁 번호 PTA-7282로 2005년 12월 19일자에 American Type Culture Collection(ATCC)에 기탁됨 - International Publication No. WO 2006/108229를 참고한다)에 결합하지 않은 세포를 회수하기 위해 0.5 ml MACS 완충액으로 3회 세척된다. 추가의 1 ml MACS 완충액의 첨가후, 칼럼은 자석으로부터 제거되고, 그리고 TNAP⁺ 세포는 정압(positive pressure)에 의해 단리된다. 각 분획으로부터 세포의 분취량(aliquot)은 스트렙타비딘-FITC로 염색될 수 있고, 그리고 순도는 유세포분석법에 의해 평가될 수 있다.

실시예 3: STRO-3 mAb에 의해 선별된 세포는 STRO-1 ^밝음 세포이다

세포 STRO-1^밝음 세포를 단리하기 위한 단일 반응물로서 STRO-3 mAb를 이용하는 잠재력을 확증하기 위한 실험이 설계되었다.

STRO-3(IgG1)은 STRO-1(IgM)의 것과 상이한 아이소타입이라는 점을 고려하여, 클론원성 CFU-F를 확인하는 STRO-3의 능력은 MACS 절차를 이용하여 단리된 STRO-1⁺ 세포와의 공동-발현에 기초하여 이중-칼라 FACS 분석에 의해 평가되었다(도 1). 점도표 히스토그램은 리스트모드 데이터로서 수집된 5 x 10⁴ 사건을 나타낸다. 수직선과 수평선은 동일한 조건 하에 처리된 아이소타입-정합된 대조 항체, 1B5(IgG)와 1A6.12(IgM)로 획득된 <1.0% 평균 형광의 반응성 수준으로 설정되었다. 이들 결과는 STRO-1^밝음 세포의 소수 집단이 TNAP(위쪽 오른쪽 사분면)을 공동-발현하지만, 나머지 STRO-1⁺ 세포가 STRO-3 mAb와 반응하지 않는다는 것을 증명한다. 4개의 사분면 모두로부터 FACS에 의해 단리된 세포는 CFU-F의 발생에 대해 차후 검정되었다(표 1).

실시예 4: STRO-1 ^둔감 과 STRO-1 ^밝음 세포의 상대적 유전자와 표면 단백질 발현

첫 번째 일련의 실험에서, 형광 활성화 세포 분류에 의해 단리된 STRO-1^둔감 또는 STRO-1^밝음 집단에 의해 발현된 다양한 계통-연관된 유전자의 유전자 발현 프로필을 조사하기 위해 반-정량적 RT-PCR 분석이 이용되었다(도 2A). 두 번째 일련의 실험에서, 형광 활성화 세포 분류에 의해 단리된 STRO-1^둔감 또는 STRO-1^밝음 집단에 의해 발현된 다양한 계통-연관된 단백질의 표면 단백질 발현 프로필을 조사하기 위해 유세포분석법 및 평균 채널 형광 분석이 이용되었다.

전체 세포 RNA는 2 x 10⁶ STRO-1^밝음 또는 STRO-1^둔감 분류된 일차 세포, 연골세포 펠릿 및 기타 유도된 배양액으로부터 준비되고 제조업체의 권고에 따라 RNAzolB 추출 방법(Biotecx Lab. Inc., Houston, TX)을 이용하여 용해되었다. 각 하위집단으로부터 단리된 RNA는 이후, cDNA 합성을 위한 주형으로서 이용되고, 일차-가닥 cDNA 합성 키트(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)를 이용하여 준비되었다. 다양한 전사체의 발현은 기존 문헌(Gronthos et al., J. Bone and Min. Res. 14:48-57, 1999)에서 기술된 바와 같은 표준 프로토콜을 이용한 PCR 증폭에 의해 평가되었다. 본 연구에 이용된 프라이머 세트는 표 2에 제시된다. 증폭 이후에, 각 반응 혼합물은 1.5% 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석되고, 그리고 브롬화에티듐 염색에 의해 가시화되었다. RNA 완전성은 GAPDH의 발현에 의해 평가되었다.

각 세포 마커에 대한 상대적 유전자 발현은 ImageQant 소프트웨어를 이용하여, 가사 유전자, GAPDH의 발현에 관하여 평가되었다(도 2B, C). 이에 더하여, STRO-1 항체와 공동으로 더욱 넓은 범위의 세포 계통-연관된 마커의 발현에 기초하여 탈체에서 확대된 MPC의 단백질 발현 프로필을 조사하기 위해 이중-칼라 유세포 분석이 이용되었다. STRO-1^둔감과 STRO-1^밝음 배양된 세포의 유전자와 단백질 발현에 기초된 전반적 표현형의 요약은 표 3에 제시된다. 상기 데이터는 탈체에서 확대된 STRO-1^밝음 MPC가 안지오포이에틴-1, VCAM-1, SDF-1, IL-1_β, TNFα, 그리고 RANKL을 비롯하여, 혈관주위 세포와 연관된 마커의 차등적으로 더욱 높은 발현을 나타낸다는 것을 지시한다. STRO-1^둔감과 STRO-1^밝음 배양된 세포의 단백질과 유전자 발현 프로필 사이에 비교는 표 3과 4에 요약된다.

STRO-1^밝음 세포에 의해 독특하게 발현되는 유전자를 확인하기 위해, 공제 혼성화(subtractive hybridization) 연구 역시 수행되었다. 간단히 말하면, STRO-1^둔감과 STRO-1^밝음은 앞서 기술된 바와 같이 단리되었다(도 3A 참고). 전체 RNA는 RNA STAT-60 시스템(TEL-TEST)을 이용하여 5개의 상이한 골수 샘플로부터 모아진 STRO-1^둔감과 STRO-1^밝음 세포로부터 준비되었다. 일차-가닥 합성은 SMART cDNA 합성 키트(Clontech Laboratories)를 이용하여 수행되었다. 결과의 mRNA/단일-가닥 cDNA 하이브리드는 제조업체의 명세에 따른 최초 RT 과정 동안 형성된 3'과 5' 프라임 말단(prime end)에서 특이적 프라이머 부위를 이용한 장거리 PCR(Advantage 2 PCR 키트; Clontech)에 의해 증폭되었다. STRO-1^밝음 cDNA의 RsaI 절단 이후에, Clontech PCR-Select cDNA 공제 키트를 이용하여 상이한 특이적 어댑터 올리고뉴클레오티드를 결찰하기 위해 2개의 분취량이 이용되었다. 제조업체의 프로토콜에 따라, STRO-1^밝음(시험기)과 STRO-1^둔감(운전기) cDNA, 그리고 그 반대를 이용하여 2 라운드의 공제 혼성화가 수행되었다. 이러한 절차는 또한, STRO-1^밝음 운전기 cDNA에 대해 혼성화된 STRO-1^둔감 시험기 cDNA를 이용하여 반대로 수행되었다.

STRO-1^밝음 집단에 의해 독특하게 발현된 유전자를 확인하기 위해, STRO-1^밝음-공제된cDNA는 T/A 클로닝벡터 내로 결찰된 STRO-1^밝음공제된 cDNA로 형질전환된 200개의 무작위 선별된 박테리아 클론을 포함하는 복제 저-밀도 마이크로어레이 필터를 작제하는데 이용되었다. 이들 마이크로어레이는 [³²P] dCTP-표지된 STRO-1^밝음 또는 STRO-1^둔감 공제된cDNA로 차후 탐침되었다(도 3B-C). 차등적 스크리닝은 총 44개의 클론을 확인하였는데, 이들은 STRO-1^둔감과 STRO-1^밝음 하위집단 사이에 매우 차등적으로 발현되었다. 모든 차등적으로 발현된 클론의 DNA 염기서열분석(sequencing)은 단지 1개의 클론만 공지된 기질(stromal) 세포 미토겐;다시 말하면, 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF)의 대표라는 것을 노출시켰다(Gronthos and Simmons, Blood. 85: 929-940, 1995). 흥미롭게도, 이들 44개 클론 중에서 6개는 케모킨, 기질(stromal)-유래된 인자-1(SDF-1)에 상응하는 DNA 삽입물(insert)을 내포하는 것으로 밝혀졌다. 인간 STRO-1^밝음 세포 내에서 SDF-1 전사체의 높은 존재비는 새로분류된 STRO-1^밝음, STRO-1^둔감, 그리고 STRO-1^음성 골수하위집단으로부터 준비된 전체 RNA의 반정량적 RT-PCR에 의해 확증되었다(도 3D 및 표 3).

단백질 표면 발현을 STRO-1 발현의 밀도와 상관하기 위해, 탈체에서 확대된 세포 유래된 골수 MPC의 단일 세포 현탁액이 트립신/EDTA 박리(detachment)에 의해 제조되고, 그리고 넓은 범위의 세포 계통-연관된 마커를 확인하는 항체와 공동으로 STRO-1 항체와 함께 차후 배양되었다. STRO-1은 염소 항-뮤린 IgM-플루오레세인 이소티오시아네이트를 이용하여 확인되는 반면, 모든 다른 마커는 염소 항-생쥐 또는 항-토끼 IgG-피코에리트린을 이용하여 확인되었다. 세포내 항원을 확인하는 항체의 경우에, 세포 제조물은 먼저, STRO-1 항체로 표지되고, 세포 막을 투과하기 위하여 차가운 70% 에탄올로 고정되고, 이후 세포내 항원-특이적 항체와 함께 배양되었다. 아이소타입 정합된 대조 항체가 동일한 조건 하에 이용되었다. 이중-칼라 유세포 분석은 COULTER EPICS 유세포분석기 및 수집된 리스트모드 데이터를 이용하여 수행되었다. 이들 점도표는 각 계통 세포 마커(y-축)와 STRO-1(x-축)에 대한 형광 강도의 수준을 지시하는 5,000 리스트모드 사건을 나타낸다. 수직과 수평 사분면은 아이소타입 정합된 음성 대조 항체에 관하여 확립되었다.

이들 결과는 SDF-1알파와 RANKL이 STRO-1^밝음 세포에 의해 고도로 발현된다는 것을 증명한다. 이것은 중요한데, 그 이유는 이들 단백질 둘 모두 면역 질환, 예를 들면, GVHD로부터 보호를 제공하는 CD4+ CD25+ 조절 T 세포의 상향-조절에 관여하는 것으로 알려져 있기 때문이다(Loser et al., Nature Medicine 12:1372-1379, 2006; Hess, Biol. Blood Marrow Transplant, 12 (1 Suppl 2):13-21, 2006; 그리고 Meiron et al., J. Exp. Medicine 205:2643-2655, 2008).

실시예 5. 시험관내 면역억제 활성

배양-확대된 STRO-1^밝음 세포(MPC(B))의 면역억제 활성을 평가하기 위해, CD3/CD28 자극이 판독(read-out)으로서 이용되었다. 결과는 실시예 1에서와 같이 단리된 배양-확대된, 골수-유래된 STRO-1 음성 세포(MSC(A))의 집단과 비교되었다. 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC)는 4가지 상승하는 농도의 MSC와 MPC 제조물의 존재에서 CD3/CD28 코팅된 구슬로 자극되었다. T 세포의 증식은 3H-Tdr 함입에 의해 측정되었다.

MSC(A)와 STRO-1^밝음 MPC(B)는 CD3/CD28 자극에 대한 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC)의 반응을 억제하는 능력에 대해 조사되었다. MSC와 MPC 또는 상업적으로 구입된 대조 인간 MSC(Lonza)가 PBMC의 배양액에 상이한 비율로 첨가되었다. 3일후, 3H-Tdr이 18시간 동안 첨가되고, 이후 배양액이 수확되었다.

CD3/CD28에 대응한 PBMC 증식은 모든 제조물에 의해 용량 의존성 방식으로 저해되었다. 하지만, 제조물 B는 대조 hMSC뿐만 아니라 제조물 A에 의해 산출된 효과보다 명백하게 우월하였다(도 4). 1:100 MSC:PBMC 비율에서, MPC B는 대조 T 세포 증식의 70%를 여전히 저해하는 반면, 상업적으로 구입된 대조 MSC(Lonza)와 MSC A는 각각, 50%와 60% 저해를 산출하였다(도 5).

실시예 6: GvHD의 유도와 치료

STRO-1^밝음 세포(MPC(B))의 생체내 면역억제 활성은 복수의 보조 조직적합성 좌위(minor histocompatibility locus)에 대해 부정합(mismatch)된 공여자 수용자 쌍에 기초된 이식편대숙주 질환(GvHD)의 모델을 이용하여 조사되었다. B10.D2(H2d) 공여자로부터 T-세포 고갈된 골수 단핵 세포(BMMC)(5x10⁶)와 비장세포(30x10⁶)는 치명적으로 조사(照射)(750cGy)된 BALB/c(H2d) 수용자 생쥐 내로 정맥내 주사되었다. 이러한 상황에서, B10.D2로부터 비장 림프구는 BALB/c 수용자 조직을 인식하고 공격하며 체중 감소, 섬유증 및 탈모를 발생시킨다. 상기 질환은 이식후 4-5주부터 동물을 칭량하고 피부 징후표명(manifestation)을 평가함으로써 전통적인 스코어링 시스템을 이용하여 모니터링되었다. 비교로서, 실시예 1에서처럼 단리된 골수-유래된 STRO-1 음성 세포(MSC(A))의 면역억제 활성이 평가되었다.

생쥐의 양성 대조 군은 임의의 추가 치료를 받지 않는 반면, 실험 군은 4주부터 주 3회, 2x10⁶, 1x10⁶, 또는 0.3x10⁶/생쥐의 용량으로 MSC(A) 또는 STRO-1^밝음 MPC(B)가 정맥내 주사되었다. 생쥐는 주 2회 모니터링되었다. 각 군은 8마리 생쥐를 내포하였다.

실시예 7: GvHD의 발생에 대한 MSC와 MPC의 효과

생쥐는 1 또는 2x10⁶ MSC A(A1과 A2), 1 또는 2x10⁶ MPC B(B1과 B2)가 제공되었다. MSC 치료의 부재 또는 존재에서 질환의 동역학은 도 6에서 보고된다. 1x10⁶ 세포의 주입 이후에, B와 A의 효과 간에 명확한 차이가 나타났다. 제조물 A가 제공된 생쥐는 세포 없음이 제공된 것들로부터 실질적인 차이를 나타내지 않는 반면, 제조물 B가 주사된 군은 상기 질환의 심각도에 대한 극적인 유익한 효과를 보였다. 이식후 13주 시점에, B1이 제공된 생쥐는 다른 군에서 2.3과 비교하여 0.5의 평균 GvHD 스코어를 가졌다.

이후, 항-GvHD 효과가 용량 의존성인 지의 여부가 조사되었다. 이런 이유로, 생쥐 군은 이전 투약에서 기술된 동일한 양식(modality)에 따라, 더욱 많은 용량(생쥐당 2x10⁶)과 더욱 적은 용량(생쥐당 0.3x10⁶)의 A 또는 B가 주사되었다. 도 7에서는 최대 용량의 효과를 도시한다. 고용량 MPC(B2)의 치료 효과는 A2에 비하여 우월하였고, 이 군에서 첫 11주 동안 GvHD가 전혀 관찰되지 않았다. 14와 15주 시점에, 생쥐당 GvHD의 결과는 더욱 극적이었고(도 8), A1 군에서 어떤 생쥐도 생존하지 못하였다.

마지막으로, 더욱 적은 용량(생쥐당 0.3x10⁶)의 주사는 9주 시점까지, STRO-1^밝음 MPC(B)가 A보다, GVHD 스코어 감소에 대한 더욱 높은 효과를 가진다는 것을 다시 한 번 증명하였다(도 9와 10).

이러한 파일럿 연구의 데이터는 STRO-1^밝음 MPC가 치료 없음 또는 STRO-1 음성 MSC로 치료와 비교하여 우월한 면역억제 능력을 나타낸다는 것을 일관되게 보였다. 이것은 시험관내 검정에서 및 가장 중요하게는, 생체내 검정에서 증명되었다. STRO-1^밝음 MPC는 생쥐당 0.3-2x10⁶ 세포의 용량 범위에서 제공될 때, GvHD의 예방에 대한 극적인 임상적 효과를 발생시켰다.

본 문서에서 인용된 모든 참고문헌은 본 발명에 참고문헌으로 편입된다.

당업자가 인지하는 바와 같이, 폭넓게 기술된 본 발명의 기술적 사상 또는 범위를 벗어남 없이 특정 구체예에서 제시된 본 발명의 다수의 개변이 만들어질 수 있다. 이런 이유로, 이들 구체예는 모든 측면에서, 예시일 뿐이며 제한으로서 간주되지 않는다.

<110> Mesoblast <120> Method of treating graft versus host disease <130> 12fpi-12-02 <150> US 61/398,950 <151> 2010-07-01 <160> 36 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 1 cactgacacg ttggcagtgg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 2 catggagaag gctggggctc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDF-1 forward primer <400> 3 gagacccgcg ctcgtccgcc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDF-1 reverse primer <400> 4 gctggactcc tactgtaagg g 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta forward primer <400> 5 aggaagatgc tggttccctc tc 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L-1beta reverse primer <400> 6 cagttcagtg atcgtacagg tgc 23 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLT-1 forward primer <400> 7 tcactatgga agatctgatt tcttacagt 29 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLT-1 reverse primer <400> 8 ggtataaata cacatgtgct tctag 25 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha forward primer <400> 9 tcagatcatc ttctcgaacc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha reverse primer <400> 10 cagatagatg ggctcatacc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KDR forward primer <400> 11 tatagatggt gtaacccgga 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KDR reverse primer <400> 12 tttgtcactg agacagcttg g 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RANKL forward primer <400> 13 aacaggcctt tcaaggagct g 21 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RANKL reverse primer <400> 14 taaggagggg ttggagacct cg 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> leptin forward primer <400> 15 atgcattggg aaccctgtgc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> leptin reverse primer <400> 16 gcacccaggg ctgaggtcca 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBFA-1 forward primer <400> 17 gtggacgagg caagagtttc a 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBFA-1 reverse primer <400> 18 tggcaggtag gtgtggtagt g 21 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR gamma 2 forward primer <400> 19 aactgcgggg aaacttggga gattctcc 28 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR gamma 2 reverse primer <400> 20 aataataagg tggagatgca ggctcc 26 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCN forward primer <400> 21 atgagagccc tcacactcct c 21 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCN reverse primer <400> 22 cgtagaagcg ccgataggc 19 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MyoD forward primer <400> 23 aagcgccatc tcttgaggta 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MyoD reverse primer <400> 24 gcgagaaacg tgaacctagc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMMHC forward primer <400> 25 ctgggcaacg tagtaaaacc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMMHC reverse primer <400> 26 tatagctcat tgcagcctcg 20 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFAP forward primer <400> 27 ctgttgccag agatggaggt t 21 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFAP reverse primer <400> 28 tcatcgctca ggaggtcctt 20 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nestin forward primer <400> 29 ggcagcgttg gaacagaggt tgga 24 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nestin reverse primer <400> 30 ctctaaactg gagtggtcag ggct 24 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX9 forward primer <400> 31 ctctgcctgt ttggactttg t 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX9 reverse primer <400> 32 cctttgcttg ccttttacct c 21 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> collagen type X forward primer <400> 33 agccagggtt gccaggacca 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> collagen type x reverse primer <400> 34 ttttcccact ccaggagggc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aggrecan forward primer <400> 35 cactgttacc gccacttccc 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aggrecan reverse primer <400> 36 accagcggaa gtccccttcg 20

Claims

STRO-1^밝음 세포, 이들의 자손, 또는 STRO-1^밝음 세포 및 이들의 자손이 농축된 세포의 집단을 포함하는 골수 계통 세포의 투여에 의해서 유발된 GvHD를 앓고 있는 포유동물 환자에서의 GvHD 증상 치료용 조성물.
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 골수 계통 세포의 전구체는 동종이계인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 STRO-1^밝음 세포, 이들의 자손, 또는 STRO-1^밝음 세포 및 이들의 자손이 동종이계인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 STRO-1^밝음 세포, 이들의 자손, 또는 STRO-1^밝음 세포 및 이들의 자손이 농축된 세포의 집단은 전신 투여되는, 조성물.
제7항에 있어서,
상기 STRO-1^밝음 세포, 이들의 자손, 또는 STRO-1^밝음 세포 및 이들의 자손이 농축된 세포의 집단이 정맥내 주사에 의해 투여되는, 조성물.
제1항 또는 제5항에 있어서, 0.1 x 10⁶ 내지 5 x 10⁶의 STRO-1^밝음 세포, 이들의 자손, 또는 STRO-1^밝음 세포 및 이들의 자손을 포함하는, 조성물.
제1항, 제5항 및 제6항중 어느 한 항에 있어서, 0.3 x 10⁶ 내지 2 x 10⁶의 STRO-1^밝음 세포, 이들의 자손, 또는 STRO-1^밝음 세포 및 이들의 자손을 포함하는, 조성물.
제1항, 제5항, 제6항, 제7항 및 제8항중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물은 사람인 것인, 조성물.
제1항, 제5항, 제6항 및 제7항중 어느 한 항에 있어서, 저용량의 STRO-1^밝음 세포를 포함하고, 상기 저용량의 STRO-1^밝음 세포는 0.1 x 10⁵ 내지 0.5 x 10⁶의 STRO-1^밝음 세포, 이들의 자손, 또는 STRO-1^밝음 세포 및 이들의 자손을 투여하는 것을 포함하는, 조성물.
제1항, 제5항, 제6항 및 제7항중 어느 한 항에 있어서, 저용량의 STRO-1^밝음 세포를 포함하고, 상기 저용량의 STRO-1^밝음 세포는 0.3 x 10⁶의 STRO-1^밝음 세포, 이들의 자손, 또는 STRO-1^밝음 세포 및 이들의 자손을 투여하는 것을 포함하는, 조성물.
제1항, 제5항, 제6항, 제7항 및 제8항중 어느 한 항에 있어서, STRO-1^밝음 세포, 이들의 자손, 또는 STRO-1^밝음 세포 및 이들의 자손이 농축된 세포의 집단이 주 1회 또는 그 이하의 빈도로 투여되는, 조성물.
제1항, 제5항, 제6항, 제7항 및 제8항중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물은 화학요법과 방사선요법 이후에, 무혈성 빈혈, 골수섬유증, 또는 골수 부전을 앓는, 조성물.
제1항, 제5항, 제6항, 제7항 및 제8항중 어느 한 항에 있어서, 면역억제 약물을 더 포함하는, 조성물.