CN110753751A

CN110753751A - 具有增强的免疫抑制的间充质谱系前体或干细胞

Info

Publication number: CN110753751A
Application number: CN201880036997.2A
Authority: CN
Inventors: S·伊特斯库; P·西蒙斯
Original assignee: Mesoblast International SARL
Current assignee: Mesoblast International SARL
Priority date: 2017-05-04
Filing date: 2018-05-04
Publication date: 2020-02-04
Also published as: US20200325450A1; CA3062112A1; JP7398959B2; KR20240056790A; AU2018262788B2; JP2023174760A; JP2020518260A; WO2018202853A1; SG11201909856XA; KR102660506B1; EP3619294A1; AU2018262788A1; KR20200003044A; BR112019022901A2; EP4137562A1

Abstract

本公开涉及包含间充质谱系前体或干细胞的细胞治疗产品和这些产品的效力测定。本公开还涉及用于通过施用间充质谱系前体或干细胞治疗免疫或炎性病症以及治疗或预防移植物抗宿主病(GVHD)或与GVHD相关联的一种或多种症状的方法。

Description

具有增强的免疫抑制的间充质谱系前体或干细胞

本文引用或参考的所有文献和本文引用的文献中引用或参考的所有文献以及本文提及或以引用的方式并入本文的任何文献中的任何产品的制造商说明书、描述、产品规格和产品表特此以引用的方式整体并入本文。

本公开要求2017年5月4日提交的标题为“Potency assay forimmunosuppression”的澳大利亚临时申请AU 2017901633；2017年5月4日提交的标题为“Method for treating Graft versus Host Disease(GVDH)”的澳大利亚临时申请AU2017901636；以及2018年2月21日提交的标题为“Potency assay for immunosuppressionII”的澳大利亚临时专利申请AU 2018900551的优先权。这些文献的全部内容特此以引用的方式整体并入本文。

技术领域

背景技术

再生性或免疫疗法应用的若干种细胞治疗产品已进行至临床评估和市场授权。然而，将这些细胞治疗产品投入到市场中由于其复杂性和异质性而受阻，其复杂性和异质性使得相关生物活性的鉴定变得困难，并且因此使得限定恒定的细胞治疗产品质量变得困难。

理化参数(例如，大小、形态、散光特效、拉伸强度、细胞数量、汇合度、表型标记物的鉴定、分泌物质、基因型、基因表达谱的表征)常规地用于鉴定和定量活性物质、中间体、杂质和污染物。然而，理化参数不能确认产品将是生物活性且有效力的(即，产生希望的效果)。相比之下，生物表征考虑产品对于在动物中并最终在临床中体外或体内建模的生物系统的作用。

美国和欧洲的药物法规要求分子结构不能被完全定义的活性物质在投放到市场中之前进行效力评估。法律要求评估每个批次的授权细胞治疗产品的效力。

效力测试必须证明产品的一种或多种相关生物活性。并不要求效力测试反映产品的所有生物功能，但是其应指示一种或多种相关生物功能。预期将针对效力测试中使用的分析方法建立准确性、敏感性、特异性和再现性，并且它们将是适当稳健的。

需要开发对于需要免疫抑制的疾病治疗具有改善效力的产品。还优选的是，鉴定对于细胞治疗产品的功效重要的参数并且控制它们(例如，经由效力测试)，使得可以制造具有恒定质量的产品。

发明内容

申请人已开发一种现成的离体扩增的同种异体间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)产品，其具有改善的免疫抑制活性。

本公开提供一种组合物，其包含间充质谱系前体或干细胞或其子代，其中所述间充质谱系前体或干细胞是冻存的，并且在解冻之后使PBMC样品中活化T细胞的增殖抑制至少约65％。

在一个实施方案中，所述抑制通过将间充质谱系前体或干细胞与PBMC以1个间充质谱系前体或干细胞:5个PBMC或更小比例共同培养来测量。例如，1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70 1:80、1:90或1个间充质谱系前体或干细胞:100个PBMC或更小。

在一个实施方案中，将间充质谱系前体或干细胞与PBMC以1个间充质谱系前体或干细胞:5个PBMC或更小比例共同培养使T细胞增殖抑制至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％。

在一个实施方案中，活化T细胞的增殖的抑制通过活化T细胞中IL-2R 2Rα表达的抑制来测量。

在一个实施方案中，间充质谱系前体或干细胞组合物以至少110pg/ml的量表达TNFR1。例如，间充质谱系前体或干细胞组合物以至少150pg/ml、或至少200pg/ml、或至少250pg/ml、或至少300pg/ml、或至少320pg/ml、或至少330pg/ml、或至少340pg/ml、或至少350pg/ml的量表达TNFR1。

在一个实施方案中，间充质谱系前体或干细胞以至少13pg/10⁶个细胞的量表达TNFR1。例如，间充质谱系前体或干细胞以至少15pg/10⁶个细胞、或至少20pg/10⁶个细胞、或至少25pg/10⁶个细胞、或至少30pg/10⁶个细胞、或至少35pg/10⁶个细胞、或至少40pg/10⁶个细胞、或至少45pg/10⁶个细胞、或至少50pg/10⁶个细胞的量表达TNFR1。

在一个实施方案中，通过免疫选择分离间充质谱系前体或干细胞，并且然后进行培养扩增。

在一个实施方案中，间充质谱系前体或干细胞进行培养扩增。在一个实施方案中，分离或者分离并富集间充质谱系前体或干细胞，并且在冻存之前进行离体或体外培养扩增。在另一个实例中，分离或者分离并富集间充质谱系前体或干细胞，进行冻存、解冻并且随后进行培养扩增。在又一个实例中，间充质谱系前体或干细胞在冻存之前和之后进行培养扩增。

在一个实施方案中，间充质谱系前体或干细胞占所述组合物的细胞群体的至少5％。

在一个实施方案中，所述组合物冻存在42.5％Profreeze^TM/50％αMEM/7.5％DMSO中。

在一个实施方案中，所述组合物冻存在勃脉力-A(Plasmalyte-A)、25％HSA和DMSO中。

虽然本发明的范围不限于任何理论推理，但是本发明人已发现，使T细胞的增殖抑制至少约65％的间充质谱系前体或干细胞特别可用于抑制免疫应答，并且更具体地，此类间充质谱系前体或干细胞可用于预防或治疗移植物抗宿主病；实体器官植入物排斥，例如像心脏植入物排斥、肝脏植入物排斥、胰腺植入物排斥、肠植入物排斥和肾植入物排斥；以及自身免疫疾病，例如像类风湿性关节炎、多发性硬化症、I型糖尿病、克罗恩氏病、格-巴二氏综合征(Guillain-Barre syndrome)、红斑狼疮、重症肌无力、视神经炎、银屑病、格雷夫斯病(Graves'disease)、桥本氏病(Hashimoto's disease)、奥德氏甲状腺炎(Ord'sthyroiditis)、再生障碍性贫血、赖特综合征(Reiter's syndrome)、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、抗磷脂抗体综合征、眼阵挛-肌阵挛综合征、颞动脉炎、急性播散性脑脊髓炎、肺出血肾炎综合征(Goodpasture's syndrome)、韦格纳肉芽肿(Wegener'sgranulomatosis)、乳糜泻、天疱疮、多发性关节炎、温抗体型自身免疫性溶血性贫血和硬皮病。

本发明人还发现，间充质谱系前体或干细胞还可用于治疗炎性疾病，具体地T细胞介导的炎性病症。

本发明还提供一种用于生产间充质谱系前体或干细胞群体的方法，其包括以下步骤中的一个或多个：

在包含重组胰蛋白酶的培养基中培养间充质谱系前体或干细胞群体；

在具有一个或多个附接的空气过滤器的细胞工厂中培养所述细胞；

使用切向流过滤(TFF)浓缩和/或洗涤所述细胞；或者

将所收获的细胞穿过双重筛网过滤器，从而减少可见颗粒和/或细胞聚集体。

在一个实施方案中，所述方法包括

在包含重组胰蛋白酶的培养基中培养间充质谱系前体或干细胞群体；以及

使用切向流过滤(TFF)浓缩和/或洗涤所述细胞。

在一个实施方案中，所述方法包括

使用切向流过滤(TFF)浓缩和/或洗涤所述细胞；并且

在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：

使用切向流过滤(TFF)浓缩和/或洗涤所述细胞；并且

在一个实施方案中，所述方法包括图2中概括的步骤中的一个或多个或全部。

在一个实施方案中，通过免疫选择分离间充质谱系前体或干细胞。例如，通过免疫选择分离的间充质谱系前体或干细胞可以是STRO-1+间充质前体细胞或其子代。

在一个实施方案中，通过塑料粘附技术分离间充质谱系前体或干细胞。例如，通过塑料粘附技术分离的间充质谱系前体或干细胞可以是间充质干细胞或其子代。

本发明人还开发了一种测量包含间充质谱系前体或干细胞的细胞治疗产品的生物活性或治疗功效的效力测定。

因此，本公开还提供一种用于确定间充质谱系前体或干细胞的效力的方法，其包括：

(i)获得包含间充质谱系前体或干细胞的细胞群体，其中所述细胞已冻存并解冻；

(ii)在具有包含T细胞的细胞群体的培养基中培养所述细胞；

(iii)确定T细胞IL-2Rα表达的抑制水平，其中≥65％抑制的量指示间充质谱系前体或干细胞的生物活性或治疗功效。例如，至少约70％抑制、至少约75％抑制、至少约80％抑制、至少约85％抑制或至少约90％抑制的量指示生物活性或治疗功效。

在一个实施方案中，至少约65％抑制的量指示抑制免疫应答的细胞治疗功效。

在一个或另一个实施方案中，至少约65％抑制的量指示预防或治疗移植物抗宿主病的细胞治疗功效。

本公开还提供一种用于选择有效的间充质谱系前体或干细胞的方法，其包括：

(ii)在具有包含T细胞的细胞群体的培养基中培养所述细胞；

(iii)选择表现出T细胞IL-2Rα表达的≥65％抑制的抑制水平的细胞。

在一个实施方案中，以上所述的测定方法或选择方法用于确定间充质谱系前体干细胞的富集群体的效力。例如，所述间充质谱系前体或干细胞富含间充质干细胞。在另一个实施方案中，通过选择STRO-1+细胞富集间充质谱系前体或干细胞。在一个实施方案中，所述间充质谱系前体细胞是STRO-1^亮细胞。

在一个或另一个实施方案中，所述测定或选择方法用于确定间充质谱系前体或干细胞的离体或体外扩增群体的效力或选择所述离体或体外扩增群体。在一个实例中，分离或者分离并富集间充质谱系前体或干细胞，并且在冻存之前进行离体或体外培养扩增。在另一个实例中，分离或者分离并富集间充质谱系前体或干细胞，进行冻存、解冻并且随后进行培养扩增。在又一个实例中，间充质谱系前体或干细胞在冻存之前和之后进行培养扩增。

在一个实施方案中，所述间充质谱系前体或干细胞是人间充质谱系前体或干细胞。

在一个实施方案中，所述T细胞是人T细胞。在另一个实施方案中，所述T细胞表达CD4和CD8。在另一个实施方案中，所述T细胞表达CD69和/或CD137。

在一个或另一个实例中，包含T细胞的群体是外周血单核细胞(PBMC)的群体。

在一个实施方案中，所述测定或选择方法包括在包含一种或多种T细胞刺激配体的培养基中培养间充质谱系前体或干细胞和T细胞。例如，培养基包含抗CD3抗体或其片段和抗CD28抗体或其片段。在另一个或再一个实施方案中，所述方法包括培养间充质谱系前体或干细胞和在与间充质谱系前体细胞共同培养之前刺激和/或活化的T细胞。

在一个实施方案中，所述测定或选择方法包括在补充有10％FBS和2mM谷氨酰胺并且任选地包含一种或多种T细胞刺激配体的DMEM中培养所述细胞。

在一个实施方案中，所述方法包括将间充质谱系前体或干细胞与T细胞以约1个间充质谱系前体或干细胞:2个T细胞或更小比例共同培养。例如，1:3、1:4、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70 1:80、1:90或1个间充质谱系前体或干细胞:100个T细胞或更小。

在一个实施方案中，所述方法包括在确定IL-2Rα表达之前共同培养所述细胞60至84小时。

在一个或另一个实施方案中，所述方法包括在共同培养之后采集所述细胞并且使其裂解以产生细胞裂解液。

在一个或另一个实施方案中，所述方法包括通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定所述细胞裂解液中IL-2Rα的量。

在一个实例中，所述ELISA包括：

(i)将样品稀释液添加到预涂覆有对于IL-2Rα特异性的单克隆抗体的微孔板的每个孔中；

(ii)将共同培养的样品添加到预涂覆有对于IL-2Rα特异性的单克隆抗体的微孔板的孔中；

(iii)将所述微孔板温育足够的时间以允许对于IL-2Rα特异性的单克隆抗体特异性结合至样品中的任何IL-2Rα；

(iv)洗涤所述微孔板；

(v)将IL-2Rα缀合物添加到所述孔中；

(vi)将所述微孔板温育足够的时间以允许所述缀合物特异性结合至任何捕获的IL-2Rα；

(vii)洗涤所述微孔板；

(viii)将底物溶液添加到所述孔中；

(ix)将所述微孔板温育足够的时间以用于显色；

(x)将终止溶液添加到所述孔中；

(xi)在设定至450nm、在570nm处进行波长校准的微孔板读数器上读取光密度；

(xii)确定IL-2Rα的浓度。

在一个实施方案中，所述方法还包括：

在样品稀释液中制备系列稀释度的IL-2Rα标准品以得到例如范围是7.8至500pg/ml的最终浓度；

在步骤(iii)之前将所述标准品添加到所述微孔板中；

使用四参数逻辑曲线拟合构建标准曲线；以及

通过参考所述标准曲线确定IL-2Rα的浓度。

在一个实施方案中，所述方法还包括：

确定间充质谱系前体或干细胞群体的TNFR1表达，其中≥100pg/ml TNFR1的量指示间充质谱系前体或干细胞的生物活性或治疗功效。例如，至少约101pg/ml TNFR1、至少约102pg/ml TNFβ1、至少约103pg/ml TNFR1、至少约104pg/ml TNFR1、至少约105pg/ml TNFR、至少约106pg/ml TNFR1、至少约107pg/ml TNFR1、至少约108pg/ml TNFR1、至少约109pg/mlTNFR1、或至少约110pg/ml TNFR1、或至少约150pg/ml、或至少约200pg/ml、或至少约250pg/ml、或至少约300pg/ml、或至少约320pg/ml、或至少约330pg/ml、或至少约340pg/ml、或至少约350pg/ml的量指示生物活性或治疗功效。

本公开还提供一种抑制有需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含本公开的MLPSC的群体的组合物。

本公开还提供一种预防或治疗有需要的受试者的炎性病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含本公开的MLPSC的组合物。所述炎性病症可以是T细胞介导的炎性病症。

本公开还提供一种预防受试者的移植物抗宿主病、缓解移植物抗宿主病的发展或治疗移植物抗宿主病的方法，其包括向所述受试者施用包含本公开的MLPSC的组合物至所述受试者。

本公开还提供一种预防受试者的移植物抗宿主病的方法，所述方法包括向所述受试者施用与本公开的MLPSC的共同培养的造血干细胞。

在一个实施方案中，每周一次(qw)向所述受试者施用小于3x 10⁶个细胞/kg体重的剂量的所述组合物。

本公开还提供一种用于预防哺乳动物受试者的移植物抗宿主病(GVHD)、缓解移植物抗宿主病的发展或治疗移植物抗宿主病的方法，其包括每周一次(qw)向所述受试者施用小于3x 10⁶个细胞/kg体重的剂量的MLPSC和/或其子代细胞。

在一个实施方案中，向所述受试者qw施用约2x 10⁶个细胞/kg体重的剂量的MLPSC。在另一个实施方案中，向所述受试者qw施用高达2x 10⁶个细胞/kg体重qw的剂量的细胞。在另一个实施方案中，向所述受试者qw施用2x 10⁶个细胞/kg体重的最大剂量。为了避免质疑，术语“一周”、“每周”或“qw”旨在意指每7天一次的周期。

在另一个实施方案中，MLPSC每周一次(qw)作为单一剂量施用。在另一个实施方案中，MLPSC每周(即，7天)作为分开剂量施用。例如，所述受试者可以在一周的过程内接受2个剂量，每个剂量1x 10⁶个细胞/kg体重。在其他实施方案中，所述受试者可以每周接受2个或更多个剂量，其中接受的总剂量为2x 10⁶个细胞/kg体重。

在一个实施方案中，所述移植物包含同种异体细胞。在另一个实施方案中，所述移植物包含自体细胞。

在一个实施方案中，向所述受试者施用的MLPSC是MPC和/或其子代细胞。

在另一个实施方案中，向所述受试者施用的MLPSC是MSC和/或其子代细胞。

在一个实施方案中，所述MLPSC和/或其子代细胞作为单一剂量qw递送。在另一个实施方案中，所述MLPSC和/或其子代细胞在一周的过程内作为分开剂量递送。

在一个实施方案中，所述哺乳动物受试者是人受试者。在一个实施方案中，所述受试者是儿科受试者。在另一个实施方案中，所述受试者是成人受试者。

在另一个实施方案中，根据本公开的受试者是患有恶性或遗传性血液病症(例如，癌症)的受试者。在另一个实例中，所述受试者已接受、正在接受或将要接受包含造血细胞的供体移植物。

包含造血细胞的移植物可以选自由以下组成的组：血液、外周血单核细胞(PBMC)、血液产物或造血细胞存在于其中的实体器官。在一个实例中，所述移植物包含造血干细胞(HSC)。

在一个实施方案中，所述受试者患有急性GVHD。急性GVHD的症状通常通过标准临床准则来分级(Glucksberg H.等人(1974)Transplantation 1974；18(4):295-304)。

在一个实施方案中，所述受试者在施用间充质谱系前体或干细胞之前已接受类固醇疗法。在一个实例中，所述类固醇是甲泼尼龙。在另一个实例中，所述类固醇在施用所述MLPSC和/或其子代细胞之前至少(3)天向所述受试者施用。

在一个实施方案中，在接受所述移植物(例如，骨髓或PBMC)的同一天向所述受试者施用MLPSC和/或其子代细胞。

所述MLPSC和/或其子代细胞可以在适当的时间向所述受试者施用，所述适当的时间可以是在所述移植物植入期间或之后。例如，出于预防目的，所述MLPSC和/或其子代细胞可以在所述移植物植入的当天开始向所述受试者施用。在另一个实例中，所述MLPSC和/或其子代细胞可以在接受所述移植物之前向所述受试者施用。在另一个实例中，所述MLPSC和/或其子代细胞可以在接受所述移植物之前7天内、5天内、3天内或2天内施用。在另一个实例中，所述MLPSC和/或其子代细胞在接受所述移植物前一天向所述受试者施用。

在另一个实施方案中，所述MLPSC和/或其子代细胞在确定所述受试者为类固醇难治性的之后向所述受试者施用。虽然关于类固醇难治性的急性GVHD的定义未达成共识，但是通常类固醇难治性的急性GVHD是指在3-5天的类固醇治疗之后恶化、在5-7天之后未改善或在14天之后未完全免除的GVHD。在另一个实例中，所述MLPSC和/或其子代细胞在至少3天的类固醇或免疫抑制治疗之后向所述受试者施用。在另一个实例中，所述MLPSC和/或其子代细胞在至少1个月的类固醇或免疫抑制治疗之后向所述受试者施用。在一个实例中，类固醇难治性受试者是在至少3天的类固醇(例如，甲泼尼龙或等效物)之后对于针对B-D等级急性GVHD的类固醇治疗无应答的受试者。在另一个实例中，所述受试者对于>1mg/kg/天的甲泼尼龙或等效物无应答。

在另一个实施方案中，所述受试者在施用MLPSC和/或其子代细胞之前已接受非类固醇免疫抑制疗法。在另一个实例中，所述受试者已接受一种或多种非类固醇疗法，其选自由以下组成的组：体外光致迁动(ECP)、英夫利西单抗(infliximab)、芦可替尼(ruxolitinib)、麦考酚酸莫酯(MMF)、依那西普(etanercept)和巴利昔单抗(basiliximab)。在一个实例中，向用非类固醇剂进行的免疫抑制治疗难治的受试者施用MLPSC和/或其子代细胞。

在一个实例中，向所述受试者施用MLPSC和/或其子代细胞，直至观察到GVHD改善为止。在另一个实例中，向所述受试者施用MLPSC和/或其子代细胞，直至观察到GVHD缓和为止。

在一个实例中，施用MLPSC和/或其子代细胞预防、缓解或治疗不良事件，其选自以下中的一种或多种：输液相关的反应、高血压、呕吐、恶心、心动过缓和发热。在一个实例中，与未接受MLPSC和/或其子代细胞的受试者相比，施用MLPSC和/或其子代细胞减少所述受试者所经历的不良事件的数量。

在一个实例中，所述受试者患有急性GVHD等级B、C或D。在另一个实例中，GVHD涉及皮肤、胃肠道或肝脏或这些组织中的任一种或多种的组合。

在一个实例中，GVHD由T细胞免疫应答引起。在一个实例中，T细胞来自供体，并且抗原来自受体。例如，T细胞可以存在于植入物中。在另一个实施方案中，T细胞来自供体，并且抗原来自供体。

在此方法的另一个实施方案中，所述间充质谱系前体或干细胞进行遗传工程改造以表达阻断T细胞的共刺激的分子。

在此方法的另一个实施方案中，所述间充质谱系前体或干细胞在向所述受试者施用之前在培养物中扩增。

在一个实施方案中，所述MLPSC和/或其子代细胞以药学上可接受的组合物的形式施用。在另一个实例中，所述药学上可接受的组合物包含药学上可接受的载剂和/或赋形剂。

所述MLPSC和/或其子代细胞可以每周向所述受试者施用，持续连续四(4)周，每周进行。在另一个实例中，MLPSC和/或其子代细胞每周向所述受试者施用，持续连续8周，每周进行。在另一个实例中，在4个每周一次输注之后评定受试者的GVHD，并且如果受试者的GVHD应答是部分或混合的，则所述受试者有资格接受额外的4个每周一次输注。在一个实例中，向所述受试者施用最多8次MLPSC和/或其子代细胞。在另一个实例中，向所述受试者施用总计8次MPC和/或其子代细胞。在另一个实例中，每周向所述受试者施用MLPSC和/或其子代细胞输注，直至至少观察到部分或完全应答。

在一个实施方案中，在第0天的基线(筛选)处评定受试者的GVHD状态或分级。

在另一个实施方案中，在第14天、第28天、第56天和第100天评定受试者的GVHD状态或分级。在另一个实施方案中，在这些天中的一些处(例如，基线(第0天)、第28天和第100天)评定GVHD。

所述受试者可以被评定为具有完全应答、部分应答、混合应答、恶化应答或没有应答。

本公开还提供一种组合物，其包含每周小于3x 10⁶个细胞/kg体重的剂量的MLPSC和/或其子代细胞，以用于预防哺乳动物受试者的移植物抗宿主病(GVHD)、缓解移植物抗宿主病的发展或治疗移植物抗宿主病。

在一个实施方案中，所述组合物包含约2x 10⁶个细胞/kg体重的剂量的MLPSC和/或其子代细胞。在另一个实施方案中，所述组合物包含高达2x 10⁶个细胞/kg体重的剂量的MPC和/或其子代细胞。在另一个实施方案中，所述组合物包含其2x 10⁶个细胞/kg体重的最大剂量。

在一个实例中，所述组合物是药物组合物。

本公开还提供包含小于3x 10⁶个细胞/kg体重的剂量的MLPSC和/或其子代细胞在用于预防哺乳动物受试者的GVHD的发展或治疗GVHD的药物的制造中的用途。在一个实例中，所述MLPSC和/或其子代细胞旨在每周一次(qw)向有需要的受试者施用。

在一个实施方案中，所述药物包含约2x 10⁶个细胞/kg体重的剂量的MLPSC和/或其子代细胞。在另一个实例中，所述药物包含高达2x 10⁶个细胞/kg体重的剂量的MLPSC和/或其子代细胞。在另一个实例中，所述药物包含2x 10⁶个细胞/kg体重的最大剂量。

在一个实例中，所述间充质谱系前体或干细胞是富集STRO-1^亮细胞的细胞群体。在另一个实例中，所述间充质谱系前体或干细胞是富集一种或多种额外的标记物的细胞群体，所述标记物选自TNAP+、VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、STRO-4+(HSP-90β)和/或CD146+。

在一个实例中，所述间充质谱系前体或干细胞是间充质干细胞的群体

在一个实例中，所述MLPSC和/或其子代细胞全身施用。例如，所述MLPSC和/或其子代细胞可以静脉内施用、动脉内施用、肌内施用、皮下施用、施用到主动脉中、施用到心脏的心房或心室中或施用到连接到器官的血管中，例如腹主动脉、肠系膜上动脉、胰十二指肠动脉或脾动脉。

在另一个实施方案中，本公开的方法还包括施用免疫抑制剂。所述免疫抑制剂可以施用足以允许植入的造血细胞具有功能的时间。所述免疫抑制剂可以选自以下中的一种或多种，包括但不限于皮质类固醇，诸如强的松、布地奈德和泼尼松龙；钙调神经素抑制剂(calcineurin inhibitor)，诸如环孢霉素和他克莫司；mTOR抑制剂，诸如西罗莫司(sirolimus)和依维莫司；IMDH抑制剂，诸如硫唑嘌呤、来氟米特和麦考酚酯；生物制剂，诸如阿巴西普、阿达木单抗、依那西普、英夫利西单抗或利妥昔单抗。

在一个实例中，所述免疫抑制剂是环孢霉素。所述环孢霉素可以5至40mg/kg体重的剂量施用。

附图说明

图1：未刺激的人PBMC、经刺激的人PBMC和共同培养的人MPC(长、平)和人PBMC(圆、环形和一些聚集体)的形态。

图2：在先前制造条件下产生的三种不同的MLPSC样品(即，样品MLPSC A、MLPSC B和MLPSC C)和三种不同的改善的免疫选择的MLPSC样品(即，样品MLPSC D、MLPSC E和MLPSCF)上进行的T细胞增殖测定(IL2R的抑制％)的结果。

图3：在先前制造条件产生的三种不同的MLPSC样品(即，样品MLPSC A、MLPSC B和MLPSC C)和三种不同的改善的免疫选择的MLPSC样品(即，样品MLPSC D、MLPSC E和MLPSCF)上进行的TNFR1表达的测定的结果。

图4：示出在输注MPC之后应答者对比非应答者受试者存活至100天。在第28天具有应答的全部9个受试者存活至第100天，然而在第28天的仅三分之一的非应答者存活至第100天(p值＝0.0068)。

图5：改善的培养扩增的MLPSC制造工艺中涉及的步骤。

图6：在改善的制造条件下产生的10个不同的MLPSC批次产品上执行的TNFR1表达的测定结果。

图7：在改善的制造条件下产生的10个不同的MLPSC批次产品上执行的T细胞增殖测定(IL2R的抑制％)的结果。

具体实施方式

一般技术和定义

贯穿本说明书，除非另外特别声明或情况另外要求，否则对单个步骤、物质组合物、步骤的组或物质组合物的组的提及应涵盖这些步骤、物质组合物、步骤的组或物质组合物的组中的一个和多个(即，一个或多个)。

本领域技术人员将了解的是，本文所述的公开易于获得除特别描述的那些变化和修改之外的变化和修改。应理解，本公开包括所有此类变化和修改。本公开还包括说明书单个地或共同提及或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物以及所述步骤或特征的任何和所有组合或任何两种或更多种。

本公开的范围不被本文所述的具体实施方案限制，所述具体实施方案仅用于例示的目的。功能上等效的产品、组合物和方法明确地在本公开的范围内。

除非另外特别声明，否则本文公开的任何实例应在经适当修改之后应用于任何其他实例。

除非另外特别定义，否则本文所用的所有技术和科学术语应具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同含义(例如，在细胞培养、分子遗传学、干细胞分化、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学中)。

除非另外指示，否则本公开中所使用的干细胞、细胞培养和外科技术是本领域技术人员熟知的标准程序。此类技术在诸如以下的来源中贯穿文献描述并解释：Perbal,1984；Sambrook&Green,2012；Brown,1991；Glover&Hames,1995和1996；Ausubel.,1987，包括目前为止的所有更新；Harlow&Lane,1988；以及Coligan等人,1991，包括目前为止的所有更新。

如在本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另外明确规定，否则单数和单数形式的“一个/种(a/an)”和“所述(the)”例如任选地包括复数指示物。

术语“移植物抗宿主病”或“GVHD”是指同种异体造血细胞植入的并发症，其中宿主的组织(更频繁地皮肤、肝脏和肠)被来自供体的淋巴细胞破坏。此疾病在以下更详细地讨论。

如本文所用的术语“受试者”是指哺乳动物，包括人和非人动物。更具体地，哺乳动物是人。诸如“受试者”、“患者”或“个体”的术语是在上下文中可以在本公开中可互换使用的术语。在某些实例中，受试者可以是成人或儿童(儿科)受试者。

“有效量”是指在必需剂量下且持续必需的时期，至少有效实现所希望的治疗或预防结果的量。有效量可以在一次或多次施用中提供。在本公开的一些实例中，术语“有效量”用于是指实现如上文所述的疾病或病症的治疗所必需的量。有效量可以根据待治疗的疾病或病症而变化，并且还根据体重、年龄、种族背景、性别、健康和/或身体状况和与治疗的哺乳动物相关的其他因素而变化。通常，有效量将落在可以由执业医生通过常规试验和实验确定的相对宽的范围(例如，“剂量”范围)内。有效量可以单一剂量施用或以在治疗时间段内重复一次货若干次的剂量施用。

“治疗有效量”是实现特定病症(例如，GVHD)的可测量改善所需要的细胞的至少最低浓度。本文中的治疗有效量可以根据诸如患者的疾病状态、年龄、性别和体重以及细胞化合物在个体中引发所需应答的能力的因素而变化。治疗有效量还是其中治疗上有益的效果超过组合物的任何毒性或有害影响的量。在GVHD的情况下，治疗有效量可以降低GVHD的严重性、抑制或延迟GVHD的进展和/或在一定程度上减轻与所述病症相关联的一种或多种症状。

如本文所用的术语“预防(preventing)”或“预防(prevent)”意指预防、延迟与GVHD相关联的症状和/或降低所述症状的严重性。这与“治疗”不同，“治疗”在GVHD的第一症状发作之后发生。

如本文所用的术语“减轻”是指降低疾病和/或与疾病(例如，GVHD)相关联的一种或多种症状的严重性。它不暗示疾病的完全取消或消除。

如本文所用，术语“治疗”是指设计来在临床病理学过程中改变所治疗的个体或细胞的自然过程的临床干预。治疗的希望效果包括降低疾病进展速率、改善或缓解疾病病况和缓和或预后改良。例如当与疾病相关联的一种或多种症状得到减轻或消除时，个体得到成功“治疗”。

如本文指代的术语“完全应答”或“CR”被定义为在没有第二GVHD疗法的情况下，所有器官中的急性GVHD症状被完全解决。

如本文指代的术语“部分应答”或“PR”被定义为在没有第二GVHD疗法的情况下，所有初始GVHD靶器官中至少一个GVHD阶段得以改善而在任何其他GVHD靶器官中没有完全解决且没有恶化。

如本文指代的术语“无应答”或“NR”被定义为任何器官中相同等级的GVHD或GVHD进展(例如，至少一种可评估的器官症状恶化一个阶段或更多)或死亡或者添加第二GVHD疗法。

如本文所用的术语“恶化”是指在任何器官中具有或没有改善的情况下，至少一个器官中的GVHD进展恶化。

术语“非常良好的部分应答(VGPR)”是指满足完全应答准则，以下一种或多种除外：(i)非进行期1皮疹，不包括残留轻微红斑或色素沉着过度，(ii)解决<25％基线的总血清胆红素升高；或者(iii)最少胃肠症状。

如本文所用的术语“混合应答”或“MR”是指在至少一个可评估器官阶段中改善而在另一个阶段中恶化。

术语“进展”是指在至少一个器官系统中恶化一个阶段或更多而在任何其他器官中没有改善。

如本文所用的术语“成人”意指18岁年龄或更大的人受试者。

如本文所用的术语“儿科”意指在从出生到(且包括)17岁年龄的年龄范围内的人受试者。

如本文所用的术语“急性GVHD”是指通常在接受移植物(例如，骨髓植入物)的前6个月内发生的GVHD。它可以在接受移植物的数天内发生。

如本文所用的术语“慢性GVHD”是指通常在接受移植物之后进行超过3个月的GVHD。慢性GVHD的症状可以持续一生的时间。

如本文所用的术语“移植物”是指选自以下的生物样品：骨髓、血液(例如，全血或外周血单核细胞(PBMC))、血液产物或造血细胞存在于其中的实体器官。

如本文所用的术语“同种异体的”是指由遗传特征不同于供体的遗传特征(尤其是关于在个体细胞的表面上表达的主要组织相容性复合物(MHC)和次要组织相容性剂)的个体提供的移植物(例如，造血细胞)。

如本文所用的术语“自体的”是指使用受试者自身的细胞的移植物(例如，存在于骨髓或外周血中的造血细胞)。通常在受试者进行治疗(例如，化疗)之前收获细胞，存储并且然后再输注回到受试者中。

如本文所用的术语“类固醇难治性的”是指在3-5天的类固醇治疗之后恶化、在5-7天之后未改善或在14天之后未完全免除的GVHD。

术语“和/或”(例如，“X和/或Y”)应理解为意指“X和Y”或者“X或Y”，并且应提供对于两种含义或对于任一种含义的明确支持。

如本文所用，除非相反地声明，否则术语约是指指定值的+/-10％，更优选地+/-5％。

贯穿本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”，或变化形式诸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”将应理解为意指包括所述要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤的组，但是不排除任何其他的要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤的组。

间充质谱系前体或干细胞

如本文所用，术语“间充质谱系前体或干细胞”是指未分化的多能细胞，其能够自我更新同时维持多能性，并且能够分化为多种间充质来源的细胞类型，例如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、基质细胞、成纤维细胞和肌腱，或者非间充质来源的细胞类型，例如肝细胞、神经细胞和上皮细胞。

术语“间充质谱系前体或干细胞”包括亲本细胞及其未分化子代两者。所述术语还包括间充质前体细胞(MPC)、多能基质细胞、间充质干细胞、血管周围间充质前体细胞及其未分化子代。

间充质谱系前体或干细胞可以是自体的、同种异体的、异种的、同基因的或等基因的。自体细胞从它们将再植入的相同个体分离。同种异体细胞从相同物种的供体分离。异种细胞从另一种物种的供体分离。同基因或等基因细胞从遗传上相同的生物(诸如双胞胎、克隆或高度近交研究动物模型)分离。

间充质谱系前体或干细胞主要存在于骨髓中，但是也显示存在于不同的宿主组织中，包括例如脐带血和脐带、成人外周血、脂肪组织、小梁骨和牙髓。

间充质谱系前体或干细胞可以从宿主组织分离并且通过免疫选择富集。例如，来自受试者的骨髓抽取物可以用STRO-1或TNAP的抗体进一步处理以便能够选择间充质谱系前体或干细胞。在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞可以通过使用Simmons&Torok-Storb,1991中所述的STRO-1抗体富集。

STRO-1+细胞是存在于以下中的细胞：骨髓、血液、牙髓细胞、脂肪细胞、皮肤、脾脏、胰腺、脑、肾、肝脏、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、骨、韧带、肌腱、骨骼肌、真皮和骨膜；并且能够分化为生殖细胞系，诸如中胚层和/或内胚层和/或外胚层。因此，STRO-1+细胞能够分化为大量细胞类型，包括但不限于脂肪、骨、软骨、弹性、肌肉和纤维结缔组织。这些细胞所进入的具体谱系提交和分化途径取决于来自机械影响和内源生物活性因子的各种影响，诸如生长因子、细胞因子和/或由宿主组织建立的局部微环境条件。

如本文所用的术语“富集”描述细胞群体，其中与未处理细胞群体(例如，其天然环境中的细胞)相比，一种特定细胞类型的比例或多种特定细胞类型的比例增加。在一个实例中，富集STRO-1+细胞的群体包含至少约0.1％或0.5％或1％或2％或5％或10％或15％或20％或25％或30％或50％或75％STRO-1+细胞。在这方面，术语“富集STRO-1+细胞的细胞群体”应提供对于术语“包含X％STRO-1+细胞的细胞群体”的明确支持，其中X％是如本文引用的百分比。在一些实例中，STRO-1+细胞可以形成克隆形成菌落，例如CFU-F(成纤维细胞)或其子组(例如，50％或60％或70％或70％或90％或95％)可以具有此活性。

在一个实例中，细胞群体由包含呈可选择形式的STRO-1+细胞的细胞制品富集。在这方面，术语“可选择形式”应理解为所述细胞表达允许选择STRO-1+细胞的标记物(例如，细胞表面标记物)。所述标记物可以是STRO-1，但不必要。例如，如本文所述和/或例示，表达STRO-2和/或STRO-3(TNAP)和/或STRO-4和/或VCAM-1和/或CD146和/或3G5的细胞(例如，MPC)也表达STRO-1(并且可以是STRO-1^亮的)。因此，细胞是STRO-1+的指示并不意指所述细胞通过STRO-1表达选择。在一个实例中，至少基于STRO-3表达来选择细胞，例如，它们是STRO-3+(TNAP+)。

选择细胞或其群体的提及并不一定需要从特定组织来源选择。如本文所述，STRO-1+细胞可以从各种来源选择或从各种来源分离或从各种来源富集。也就是说，在一些实例中，这些术语提供对于从包含STRO-1+细胞的任何组织或血管化组织或包含周细胞(例如，STRO-1+周细胞)的组织或本文引用的任一种或多种组织进行选择的支持。

在一个实例中，本公开的间充质谱系前体或干细胞表达一种或多种标记物，其单个地或共同选自由以下组成的组：TNAP+、VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、STRO-4+(HSP-90β)、CD45+、CD146+、3G5+。

“单个地”意指本公开单独地涵盖所引用的标记物或标记物的组，并且虽然个体标记物或标记物的组可能在本文中未单独列出，但是所附权利要求可以单独且彼此可分开地限定此类标记物或标记物的组。

“共同地”意指本公开涵盖任何数量或组合的所引用的标记物或标记物的组，并且虽然此类数量或组合的标记物或标记物的组可能未在本文中具体列出，但是所附权利要求可以单独并且与任何其他组合的标记物或标记物的组可分开地限定此类组合或子组合。

指代为对于给定标记物为“阳性的”细胞可以表达低(lo或微弱或暗淡)、中等(中间)或高(亮，bri)水平的此标记物，这取决于标记物存在于细胞表面上的程度，其中所述术语与荧光强度或细胞分选工艺或细胞的流式细胞术分析中所使用的其他标记物相关。低(lo或微弱或暗淡)、中等(中间)或高(亮，bri)的差别将在分选或分析的具体细胞群体上使用的标记物的环境下进行理解。指代为对于给定标记物为“阴性的”细胞不需要在此细胞中完全不存在。此术语意指标记物以相对非常低的水平由此细胞表达，并且当可检测地标记时，它生成非常低的信号，或者在高于背景水平(例如，使用同种型对照抗体检测的水平)下不可检测。

如本文所用的术语“亮”或bri是指当可检测地标记时，在细胞表面上生成相对高的信号的标记物。虽然不希望受理论限制，但是认为，“亮”细胞比样品中的其他细胞表达更多的靶标记物蛋白(例如，由STRO-1抗体识别的抗原)。例如，当用FITC缀合的STRO-1抗体标记时，STRO-1^bri细胞比非亮细胞(STRO-1^{lo/微弱/暗淡/中等/中间})产生更大的荧光信号，如通过荧光活化细胞分选(FACS)分析所确定的。在一个实例中，从骨髓分离间充质谱系前体或干细胞并且通过选择STRO-1+细胞富集。在此实例中，“亮”细胞构成起始样品中所含有的最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0.1％。在其他实例中，“亮”细胞构成起始样品中所含有的最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0.1％、至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％或至少约2％。在一个实例中，STRO-1^亮细胞具有相对于“背景”(即，STRO-1-的细胞)的STRO-1表面表达的2log量级更高表达。相比之下，STRO-1^{lo/微弱/暗淡}和/或STRO-1^{中等/中间}细胞具有相比于“背景”的STRO-1表面表达的小于2log量级更高表达，通常约1log或更小。

在一个实例中，STRO-1+细胞是STRO-1^亮。在一个实例中，STRO-1^亮细胞优先地相对于STRO-1^{lo/微弱/暗淡}或STRO-1^{中等/中间}细胞富集。

在一个实例中，STRO-1^亮细胞是TNAP+、VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、STRO-4+(HSP-90β)和/或CD146+中的额外一种或多种。例如，细胞针对前述标记物中的一种或多种选择和/或显示表达前述标记物中的一种或多种。在这方面，不需要特别测试显示表达标记物的细胞，相反，可以测试并且随后使用先前富集或分离的细胞，可以合理地认为分离或富集的细胞也表达相同的标记物。

在一个实例中，STRO-1^亮细胞是如WO 2004/85630中定义的血管周围间充质前体细胞，在血管周围标记物3G5的存在下表征。

如本文所用，术语“TNAP”旨在涵盖组织非特异性碱性磷酸酶的所有亚型。例如，所述术语涵盖肝亚型(LAP)、骨亚型(BAP)和肾亚型(KAP)。在一个实例中，TNAP是BAP。在一个实例中,TNAP是指可以结合由杂交瘤细胞系产生的STRO-3抗体的分子，所述杂交瘤细胞系在2005年12月19日以保藏登录号PTA-7282根据布达佩斯条约保藏。

此外，在一个实例中，STRO-1+细胞能够产生克隆形成的CFU-F。

在一个实例中，显著比例的STRO-1+细胞能够分化为至少两种不同的生殖细胞系。细胞可以定向至的谱系的非限制性实例包括骨前体细胞；肝细胞祖细胞，其对于胆管上皮细胞和肝细胞是多能的；神经限制细胞，其可以生成进展至少突胶质细胞和星形胶质细胞的胶质细胞前体；神经元前体，其进展至神经元；心肌和心肌细胞、分泌葡萄糖反应性胰岛素的胰腺β细胞系的前体。其他谱系包括但不限于成牙本质细胞、产生牙本质的细胞和软骨细胞以及以下的前体细胞：视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞诸如角质细胞、树突细胞、毛囊细胞、肾导管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮细胞、胶质细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞是间充质干细胞(MSC)。所述MSC可以是均质组合物，或者可以是富含MSC的混合细胞群体。均质MSC组合物可以通过培养粘附骨髓或骨膜细胞来获得，并且MSC可以通过特定细胞表面标记物鉴定，所述特定细胞表面标记物用独特的单克隆抗体鉴定。用于施用塑料粘附技术获得富含MSC的细胞群体的方法描述于例如美国专利5486359。通过常规塑料粘附分离制备的MSC依赖于CFU-F的非特异性塑料粘附特性。MSC的替代性来源包括但不限于血液、皮肤、脐带血、肌肉、脂肪、骨和软骨膜。

间充质谱系前体或干细胞可以在向受试者施用之前冻存。

在本发明的一个优选的实施方案中，间充质谱系前体或干细胞从主细胞库获得，所述主细胞库来源于从健康志愿者的骨髓富集的间充质谱系前体或干细胞。来源于这种来源的间充质谱系前体或干细胞的使用对于没有可以充当间充质谱系前体或干细胞供体的适当家族成员，或者需要立即治疗以及在生成间充质谱系前体或干细胞的时间期间具有复发、疾病相关的衰弱或死亡的高风险的受试者是特别有利的。

本发明人已示出，本公开的间充质前体细胞在其冻存并解冻之后抑制T细胞增殖的能力方面具有意料之外的高效力。相比之下，之前的公布教导了冻存的间充质干细胞在解冻之后展示出受损的免疫抑制特性(Francois等人,2012；Chinnadurai等人,2016)。

分离或富集的间充质谱系前体或干细胞可以通过培养离体或体外扩增。如本领域技术人员将理解的，分离或富集的间充质谱系前体或干细胞可以进行冻存，解冻并且随后或进一步通过培养离体或体外扩增。

培养的间充质谱系前体或干细胞在表型上与体内细胞不同。例如，在一个实施方案中，它们表达以下标记物中的一种或多种：CD44、NG2、DC146和CD140b。

培养的间充质谱系前体或干细胞在生物上与体内细胞不同，与体内很大程度上非循环(静止性)细胞相比具有更高的增殖速率。

在一个实例中，将富含间充质谱系前体或干细胞的细胞群体以约6000至7000个活细胞/cm²接种在补充血清的培养基中，例如补充10％胎牛血清(FBS)和2mM谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)，并且使其在37℃、20％O₂下粘附至培养瓶。在一个实施方案中，将细胞以约6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6810、6820、6830、6840、6850、6860、6870、6880、6890、6890、6900、6910、6920、6930、6940、6970、6980、6990或7000个活细胞/cm²，优选地以约6850至6860个活细胞/cm²接种。随后更换培养基，并且将细胞在37℃、5％O₂下培养总计68至72小时，之后与T细胞共同培养，并且确定由T细胞表达的IL-2Rα的量。

Ang1和VEGF水平

在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞以至少0.1μg/106个细胞的量表达Ang1。然而，在其他实例中，MLPSC以至少0.2μg/106个细胞、0.3μg/106个细胞、0.4μg/10⁶个细胞、0.5μg/10⁶个细胞、0.6μg/10⁶个细胞、0.7μg/10⁶个细胞、0.8μg/10⁶个细胞、0.9μg/10⁶个细胞、1μg/10⁶个细胞、1.1μg/10⁶个细胞、1.2μg/10⁶个细胞、1.3μg/10⁶个细胞、1.4μg/10⁶个细胞、1.5μg/10⁶个细胞的量表达Ang1。

在另一个实例中，MLPSC以小于约0.05μg/10⁶个细胞的量表达VEGF。然而，在其他实例中，间充质前体细胞以小于约0.05μg/10⁶个细胞、0.04μg/10⁶个细胞、0.03μg/10⁶个细胞、0.02μg/10⁶个细胞、0.01μg/10⁶个细胞、0.009μg/10⁶个细胞、0.008μg/10⁶个细胞、0.007μg/10⁶个细胞、0.006μg/10⁶个细胞、0.005μg/10⁶个细胞、0.004μg/10⁶个细胞、0.003μg/10⁶个细胞、0.002μg/10⁶个细胞、0.001μg/10⁶个细胞的量表达VEGF。

MLPSC的组合物或培养物中表达的细胞Ang1和/或VEGF的量可以通过本领域技术人员已知的方法确定。此类方法包括但不限于定量测定，例如像定量ELISA测定。在此实例中，将来自间充质前体细胞的培养物的细胞裂解液添加到ELISA板的孔中。孔可以用针对Ang1或VEGF的一级抗体(一种或多种单克隆或多克隆抗体)涂覆。然后洗涤孔，并且然后与针对初级抗体的二级抗体(一种或多种单克隆或多克隆抗体)接触。二级抗体缀合至适当的酶，例如像辣根过氧化物酶。然后可以温育孔，并且然后在温育时间段之后洗涤。然后将孔与缀合至二级抗体的酶的适当底物(诸如一种或多种发色体)接触。可以采用的发色体包括但不限于过氧化氢和四甲基联苯胺。在添加一种或多种底物之后，将孔温育适当的时间段。在完成温育之后，向孔添加“终止”溶液以便使酶与一种或多种底物的反应终止。然后测量样品的光密度(OD)。样品的光密度与含有已知量的Ang1或VEGF的样品的光密度相关，以便确定由所测试的干细胞的培养物表达的Ang1或VEGF的量。

在另一个实例中，MLPSC表达至少约2:1比例的Ang1:VEGF。然而，在其他实例中，间充质前体细胞表达至少约10:1、15:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、50:1比例的Ang1:VEGF。

用于确定Ang1:VEGF表达比例的方法对于本领域技术人员是显而易见的。例如，Ang1和VEGF表达水平可以经由如上所讨论的定量ELISA定量。在定量Ang1和VEGF的水平之后，基于Ang1和VEGF的定量水平的比例可以表示为：(Ang1水平/VEGF水平)＝Ang1:VEGF比例。

在一个实例中，本公开的MLPSC不经遗传修饰来表达以上例示的水平或比例的Ang1和/或VEGF。不经遗传修饰来表达Ang1和/或VEGF的细胞不通过用表达或编码Ang1和/或VEGF的核酸转染来修饰。为了避免质疑，在本公开的上下文中，用编码Ang1和/或VEGF的核酸转染的间充质前体细胞被认为是遗传修饰的。在本公开的上下文中，未经遗传修饰以表达Ang1和/或VEGF的细胞在一定程度上天然地表达Ang1和/或VEGF而不用编码Ang1和/或VEGF1的核酸转染。

T细胞

本公开的效力测定需要将间充质谱系前体或干细胞与T细胞共同培养。在一个实施方案中，将间充质谱系前体或干细胞与T细胞在包含至少一种T细胞刺激配体的培养基中共同培养。在一个实施方案或另一个实施方案中，T细胞被活化。T细胞可以在与间充质谱系前体或干细胞共同培养之前首先被刺激或活化。

如本文所用的术语“T细胞”是指参与各种细胞介导的免疫反应的胸腺来源的细胞。

如本文所用的术语“刺激”意指通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体结合而诱导的初级应答，从而介导信号转导事件，诸如但不限于，经由TCR/CD3复合物进行信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，诸如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的重构等。

如本文所用的术语“活化”是指经足够刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。活化也可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应功能相关联。术语“活化T细胞”是指经历细胞分裂的T细胞等。

最近被活化的T细胞通常在活化之后在不同的时间点处表达一系列活化标记物。活化标记物包括受体诸如趋化因子和细胞因子受体、粘附分子、共刺激分子和MHC II类蛋白。流式细胞术可以用于评估各种类型的指示T细胞的活化状态的表面或细胞内标记物。用于评定人外周血单核(PBMC)T细胞的活化状态的最常用的立即早期活化标记物中的两种是CD69和CD40L。

CD69(AIM，Leu23，MLR3)是参与诱导T细胞增殖的信号传导膜糖蛋白。CD69通常以非常低的水平在PBMC中的静止CD4+或CD8+T细胞上表达(<5-10％)，并且是最早可评定的活化标记物中的一种，其在1小时的TCR刺激内在CD4+或CD8+T细胞上或者经由蛋白激酶C(PKC)依赖性途径在其他T细胞活化物(诸如佛波醇酯)上上调。CD69的表达通常在16-24小时达到峰值并且然后降低，在取消刺激物之后72小时几乎不可检测。

CD40L(CD154)是通过结合CD40充当共刺激分子的TNF受体超家族的成员，所述CD40在抗原递呈细胞(APC)上组成型表达。CD40L-CD40连接导致多种下游途径，包括MAPK(JNK，p38，ERK1/2)、NF-κB和STAT3转录因子的活化。CD40L表达在经由转录因子NFAT和AP-1进行的TCR刺激之后1-2小时内快速上调。CD40L表达在刺激之后接近6小时达到峰值，并且在16-24小时下降。然而，CD40L表达是双向的，并且添加抗CD28或IL-2以及TCR刺激通常引起若干天的持续表达。

如本文所用的术语“特异性结合”意指识别并与样品中存在的同源结合配偶体(例如，T细胞上存在的刺激和/或共刺激分子)结合，但是基本上不识别或结合样品中的其他分子的配体，例如抗体。

如本文所用的术语“刺激配体”意指可以与T细胞上的同源结合配偶体(在本文中指代为“刺激分子”)特异性结合、从而介导T细胞进行的初级应答的配体。刺激配体是本领域中熟知的，并且除其他之外涵盖负载肽的MHC I类分子、抗CD3抗体、超激动剂抗CD28抗体和超激动剂抗CD2抗体。刺激配体可以可溶性形式使用，表达或附接至细胞表面或固定在表面上。

如本文所用的术语“超激动剂抗体”意指与T细胞上的分子特异性结合并且可以介导T细胞中的初级活化信号事件而没有T细胞上的TCR/CD3复合物或CD2的相互作用的抗体。示例性超激动剂抗体包括但不限于超激动剂抗CD28抗体和超激动剂抗CD2抗体。除非被指代为“超激动剂”，否则抗CD2抗体或抗CD28抗体等是如本文中其他地方定义的共刺激配体，并且提供共刺激信号而非初级活化信号。

如本文所用的术语“刺激分子”意指T细胞上与同源刺激配体特异性结合的分子。

如本文所用的术语“共刺激信号”是指与初级信号(诸如TCR/CD3连接)组合介导T细胞应答的信号，所述T细胞应答诸如但不限于活化、增殖、分化为效应细胞、诱导细胞毒性或细胞因子分泌。

如本文所用的术语“共刺激配体”包括抗原递呈细胞(APC)(例如，树突细胞、B细胞等)或人工APC(aAPC)上的分子，其与T细胞上的同源共刺激分子特异性结合，从而提供除例如由TCR/CD3复合物与负载肽的MHC分子的结合提供的初级信号之外的信号，所述信号介导T细胞应答，包括但不限于活化、增殖、分化为效应细胞、诱导细胞毒性或细胞因子分泌。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞内粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体除其他之外还涵盖与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的抗体，诸如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。这些和其他配体在本领域中是熟知的并且是良好表征的，如例如Schwartz等人,2001；Schwartz等人,2002；以及Zhang等人,2004中所述。本领域技术人员将理解，可以使用已知配体的突变体或变体，并且产生此类突变体和变体的方法在本领域中是熟知的。

如本文所用的术语“aAPC”包括但不限于基于细胞的aAPC、基于珠粒的APC、微颗粒aAPC和纳米颗粒aAPC。使用的材料包括玻璃、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、铁氧化物、脂质体、脂质双层、琼脂糖和聚苯乙烯。aAPC包含刺激配体，例如与TCR/CD3复合物特异性结合，使得初级信号被转导的刺激配体。aAPC还包含至少一种共刺激配体，其与T细胞上存在的至少一种共刺激分子特异性结合。

出于本公开的目的，术语“抗体”包括能够通过Fv内含有的抗原结合结构域特异性结合至T细胞上的刺激分子的蛋白质。此术语包括四链抗体(例如，两条轻(L)链和两条重(H)链)、重组或修饰的抗体(例如，嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR移植抗体、灵长类化抗体、去免疫抗体、同人源化抗体、半抗体、双特异性抗体)。

如本文所用，“可变区”是指如本文定义的抗体的轻链和/或重链的部分，其能够特异性结合至抗原，并且包含互补决定区(CDR)(即，CDR1、CDR2和CDR3)和框架区(FR)的氨基酸序列。例如，可变区包含三个或四个FR(例如，FR1、FR2、FR3和任选地FR4)以及三个CDR。V_H是指重链的可变区。V_L是指轻链的可变区。

如本文所用，术语“互补决定区”(缩写CDR，即CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变区的其存在是特异性抗原结合所必需的氨基酸残基。各可变区结构域(V_H或V_L)通常具有3个标识为CDR1、CDR2和CDR3的CDR区。

“框架区”(FR)是除CDR残基之外的那些可变区残基。

如本文所用，术语“Fv”应意指包含多个多肽或单个多肽的任何蛋白质，其中V_L和V_H缔合并且形成具有能够特异性结合至抗原的抗原结合结构域的复合物。形成抗原结合结构域的V_H和V_L可以在单条多肽链中或在不同的多肽链中。此外，本公开的Fv(以及本公开的任何蛋白质)可以具有多个抗原结合结构域，其可以或可以不结合相同的抗原。此术语应被理解为涵盖直接来源于抗体的片段以及对应于使用重组手段产生的这种片段的蛋白质。在一些实例中，V_H不连接至重链恒定区(C_H)1，并且/或者V_L不连接至轻链恒定区(C_L)。含有多肽或蛋白质的示例性Fv包括Fab片段、Fab’片段、F(ab')片段、scFv、双抗体、三抗体、四抗体或更高级复合物或者连接至恒定区或其结构域(例如，C_H2或C_H3结构域)的前述中的任一种，例如微抗体。

“Fab片段”由免疫球蛋白的单价抗原结合片段组成，并且可以通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体来产生，以便产生由轻链和重链的一部分组成的片段，或者可以使用重组手段产生。

抗体的“Fab'片段”可以通过用胃蛋白酶处理完整抗体，接着还原来获得，以便产生由完整轻链和重链的包含V_H和单一恒定结构域的一部分组成的分子。每个以这种方式处理的抗体获得两个Fab’片段。Fab’片段还可以通过重组手段产生。

抗体的“F(ab')₂片段”由通过两个二硫键保持在一起的两个Fab’片段的二聚体组成，并且通过用胃蛋白酶处理完整抗体分子而没有随后的还原来获得。

“Fab₂”片段是包含使用例如亮氨酸拉链或C_H3结构域连接的两个Fab片段的重组片段。

“单链Fv”或“scFv”是含有抗体的可变区片段(Fv)的重组分子，其中轻链的可变区和重链的可变区通过合适的柔性多肽接头共价连接。

T细胞刺激

在本公开的一个实施方案中，T细胞可以通过单一药剂刺激。在另一个实施方案中，T细胞用两种药剂刺激，一种诱导初级信号，并且第二种是共刺激信号。

可用于刺激单一信号或刺激初级信号的配体和刺激第二信号的辅助分子可以可溶性形式使用，表达或附接至细胞表面或固定在表面上。

所述表面可以是能够使药剂/配体结合至其或整合到其中且可生物相容的(即，对于待刺激的靶细胞基本上是无毒的)的任何表面。可生物相容的表面可以是可生物降解的或不可生物降解的。所述表面可以是自然的或合成的，并且合成表面可以是聚合物。

药剂可以通过本领域已知且可用的各种方法附接或偶联至或者整合到表面中。所述药剂可以是天然配体、蛋白质配体或合成配体。所述附接可以是共价或非共价的、静电的或疏水的，并且可以通过各种附接手段实现，包括例如化学手段、机械手段、酶促手段、静电手段或配体能够由此刺激细胞的其他手段。例如，配体的抗体首先可以附接至表面，或者亲和素或链酶亲和素可以附接至表面以用于结合至生物素酰化的配体。配体的抗体可以经由抗独特型抗体附接至表面。另一个实例包括使用蛋白质A或蛋白质G，或者其他非特异性抗体结合分子，附接至表面以结合抗体。可替代地，配体可以通过化学手段附接至表面，诸如使用可商购获得的交联剂(Pierce,Rockford,IL)或其他手段交联至表面。

如果表面是珠粒的表面，则附接至表面的特定配体的量可以易于通过流式细胞术分析确定，或者如果表面是例如组织培养皿、网、纤维、袋，则所述量可以易于通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定。

当与表面偶联时，药剂可以偶联至相同的表面(即“顺式”形成)或分开的表面(即“反式”形成)。可替代地，可以将一种药剂偶联至表面而使另一种药剂处于溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的药剂与细胞表面结合，并且提供初级活化信号的药剂处于溶液中或偶联至表面。在一个优选的实施方案中，将两种药剂固定在珠粒上，固定在同一珠粒上(即“顺式”)或者固定至分开的珠粒(即“反式”)。

在一个实施方案中，提供初级活化信号的分子是CD3配体，并且共刺激分子是CD28配体。在一个优选的实施方案中，CD3配体是抗CD3抗体或其片段，并且CD28配体是抗CD28抗体或其片段。在一个实施方案中，抗CD3抗体或其片段和抗CD28抗体或其片段以可溶形式使用。在一个可替代实施方案中，抗CD3抗体或其片段和抗CD28抗体或其片段中的一者或两者固定到表面上。在一个实施方案中，抗CD3抗体或其片段和抗CD28抗体或其片段两者共固定在相同表面(例如，珠粒)上。

在一个实施方案中，与珠粒结合的CD3:CD28抗体的比例范围是100:1至1:100，以及其间的所有整数值。在本发明的一方面，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3:CD28的比例小于1。在本发明的某些实施方案中，与珠粒结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比例大于2:1。在一个特定实施方案中，使用与珠粒结合的抗体的1:100CD3:CD28比例。在另一个实施方案中，使用与珠粒结合的抗体的1:75CD3:CD28比例。在另一个实施方案中，使用与珠粒结合的抗体的1:50CD3:CD28比例。在另一个实施方案中，使用与珠粒结合的抗体的1:30CD3:CD28比例。在一个优选的实施方案中，使用与珠粒结合的抗体的1:10CD3:CD28比例。在另一个实施方案中，使用与珠粒结合的抗体的1:3CD3:CD28比例。在又一个实施方案中，使用与珠粒结合的抗体的3:1CD3:CD28比例。

本领域技术人员将理解，用于刺激T细胞的一种或多种药剂以足以介导T细胞应答的量提供，所述T细胞应答诸如但不限于活化、增殖、分化为效应细胞、诱导细胞毒性或细胞因子分泌。优选地，用于刺激T细胞的一种或多种药剂以足以介导T细胞增殖的量提供。

T细胞来源

在刺激/活化之前，从受试者获得T细胞来源。术语“受试者”旨在包括可以在其中引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在本发明的某些实施方案中，可以使用任何数量本领域可得的T细胞系。在本发明的某些实施方案中，可以使用任何数量本领域技术人员已知的技术(诸如ficoll分离)从自受试者采集的血液单位获得T细胞。在一个优选的实施方案中，来自个体循环血液的细胞通过单采血液成分术或白细胞单采术获得。单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞(包括T细胞)、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤由单采血液成分术采集的细胞以除去血浆部分并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。在本发明的一个实施方案中，使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤这些细胞。在一个替代性实施方案中，洗涤溶液缺少钙并且可能缺少镁，或者可能缺少许多(如果不是全部)二价阳离子。如本领域普通技术人员易于理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法实现，例如通过根据制造商的说明书使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、百特(Baxter)CytoMate、或汉尼帝克(Haemonetics)细胞回收器5)来实现。在洗涤后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，例如像无Ca、无Mg的PBS、勃脉力A或者含有或不含缓冲液的其他盐水溶液。可替代地，可去除单采血液成分术样品中不合需要的成分，并将细胞直接重悬浮于培养基中。

可以用针对阴性选择的细胞特有的表面标记的抗体组合来完成通过阴性选择富集T细胞群。一种方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，所述负磁性免疫吸附或流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集T细胞(CD3+)，单克隆抗体混合物通常包括对于B细胞(CD19)、单核细胞(CD14)、NK细胞(CD56)等特异性的抗体。抗体通常固定在表面(例如，颗粒，诸如珠粒)上。

为了通过阳性或阴性选择分离所需的细胞群体，可以改变细胞对珠粒的浓度。在某些实施方案中，可能希望显著降低珠粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和珠粒的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方案中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在另一个实施方案中，使用大于100百万个细胞/ml。在另一个实施方案中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50百万个细胞/ml的细胞浓度。在又一个实施方案中，使用75、80、85、90、95或100百万个细胞/ml的细胞浓度。在另外的实施方案中，可使用125或150百万个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以引起细胞产量、细胞活化和细胞扩增增加。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，诸如CD28阴性T细胞。

如果需要或必要，单核细胞群体(即，CD14⁺细胞)可以在与间充质谱系前体或干细胞共同培养或通过各种方法离体扩增之前从血液制品耗尽，所述各种方法包括抗CD14涂覆的珠粒或柱、或利用这些细胞的吞噬活性以促进去除或通过使用对流离心洗脱法。因此，在一个实施方案中，本发明使用具有足以通过吞噬性单核细胞吞没的大小的顺磁性颗粒。在某些实施方案中，顺磁性颗粒是可商购获得的珠粒，例如由Dynal AS生产的商品名为Dynabeads^TM的那些。在这方面，示例性Dynabeads^TM是M-280、M-450和M-500。在一方面，其他非特异性细胞通过用“非相关”蛋白(例如，血清蛋白或抗体)涂覆顺磁性颗粒来去除。非相关蛋白和抗体包括不特异性靶向待扩增的T细胞的那些蛋白质和抗体或其片段。在某些实施方案中，非相关珠粒包括用绵羊抗小鼠抗体、山羊抗小鼠抗体和人血清白蛋白涂覆的珠粒。

T细胞的扩增

刺激或活化T细胞可以使用本领域通常已知的方法在细胞培养物中进一步扩增。

在一个实施方案中，用于扩增T细胞的培养基包含可以刺激CD3的药剂和可以刺激T细胞上的CD28的药剂。

间充质谱系前体或干细胞与刺激或活化T细胞的共同培养

本发明的效力测定测量将T细胞与间充质谱系前体或干细胞共同培养之后T细胞IL-2Rα表达的抑制。IL-2Rα表达的抑制与对于T细胞增殖的抑制性作用相关联。虽然不希望受理论限制，但是本领域技术人员将理解，间充质谱系前体或干细胞可以抑制或阻抑T细胞刺激和/或活化，并且从而阻抑T细胞增殖，或者它们可以用于阻抑活化T细胞的增殖。

在一个实施方案中，将T细胞与间充质谱系前体或干细胞在包含至少一种T细胞刺激剂的培养基中优选地以能够刺激和/或活化T细胞的浓度下共同培养。在另一个实施方案中，T细胞在与间充质谱系前体或干细胞共同培养之前首先被刺激和/或活化。

在一个实施方案中，间充质谱系前体或干细胞与PBMC共同培养。

在一个实施方案中，间充质谱系前体或干细胞与PBMC在包含可以刺激CD3的药剂和可以刺激T细胞上的CD28的药剂(诸如CD3的抗体和CD28的抗体，例如小鼠抗人CD3和小鼠抗人CD28)的培养基中共同培养。在一个实施方案中，将CD3的抗体和/或CD28的抗体以可溶性形式添加到培养基中，各自以约2μg/ml的浓度添加。

在一个实施方案中，将PBMC与间充质前体或干细胞以5个PBMC:1个间充质前体或干细胞的比例共同培养。例如，1x10⁶个PBMC可以与2x10⁵个从间充质谱系前体或干细胞的富集群体扩增的细胞共同培养。在另一个实施方案中，所述细胞以1ml的最终体积共同培养。

在一个实施方案中，分离或富集的间充质谱系前体或干细胞首先通过培养离体或体外扩增，并且随后与PBMC共同培养。

在一个替代性实施方案中，分离或富集或培养的间充质谱系前体或干细胞与富集和/或扩增的T细胞群体共同培养。

优选的是，将间充质谱系前体或干细胞与T细胞在包含一种或多种T细胞刺激剂/配体的培养基中共同培养。本领域技术人员将理解，T细胞可以首先进行刺激和/或活化，并且然后与间充质谱系前体或干细胞在至少一种T细胞刺激剂的存在或不存在下共同培养。

确定IL-2Rα水平的量

本公开设想任何形式的测定，包括蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光联免疫吸附测定(FLISA)、竞争测定、放射免疫测定、横向流动免疫测定、流通免疫测定、电化学发光测定、基于浑浊度的测定、基于浊度的测定、用于检测用于培养间充质谱系或前体细胞的培养基中的TGFβ1的基于荧光活化细胞分选(FACS)的测定和表面等离子体共振(SPR或Biacore)。

在间充质谱系前体或干细胞与T细胞的共同培养之后，可以采集所述细胞并且使用本领域熟知的方法裂解。然后可以例如通过ELISA或FLISA测定细胞裂解液的IL-2Rα的存在。可替代地，IL-2Rα表达的水平可以通过例如通过流式细胞术测定完整细胞来确定。

一种形式的合适测定是例如ELISA或FLISA。

在一种形式中，这种测定涉及将IL-2Rα结合蛋白固定在固体基质上，例如像聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔或测深尺、膜或玻璃支持物(例如，玻璃载玻片)。然后将测试样品与IL-2Rα结合蛋白直接接触，并且样品中的IL-2Rα被结合或捕获。在洗涤以去除样品中的任何未结合蛋白之后，将在不同表位处结合至IL-2Rα的蛋白质与捕获的IL-2Rα直接接触。此检测物蛋白通常用可检测的报告基因分子标记，例如像酶(例如，辣根过氧化物酶(HRP))、碱性磷酸酶(AP)或在ELISA的情况下的β-半乳糖苷酶或在FLISA的情况下的荧光团。可替代地，可以使用结合至检测物蛋白的第二标记蛋白。在洗涤以去除任何未结合的蛋白质之后，通过添加在ELISA的情况下的底物(例如像过氧化氢、TMB或甲苯胺或5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(x-gal))来检测可检测的报告基因分子。当然，可以相反的方式使用固定(捕获)的蛋白质和检测物蛋白。

然后使用标准曲线确定样品中的IL-2Rα的水平，所述标准曲线使用已知量的标记物或通过与对照样品进行比较来产生。

在一个实施方案中，通过将包含T细胞的细胞群体的IL-2Rα表达水平与在将包含T细胞的细胞群体与包含间充质谱系前体或干细胞的细胞群体共同培养之后细胞群体的IL-2Rα水平进行比较来测量IL-2Rα表达的抑制，并且差值表达为“抑制百分比”。

以上所述的测定易于修改以使用化学发光或电化学发光作为检测的基础。

如对于本领域技术人员显而易见的，基于免疫吸附测定的其他检测方法可用于执行本公开。例如，基于以上描述的使用用于检测的放射标记、或用于检测的金标记(例如，胶体金)、或用于检测的例如包封NAD+的脂质体的免疫吸附方法，或吖啶联免疫吸附测定。

在本公开的一些实例中，使用以下确定IL-2Rα的水平：表面等离子体共振检测器(例如，BIAcore^TM,GE Healthcare,Piscataway,N.J.)、流通装置(例如，如美国专利7205159中所述)、微或纳米免疫测定装置(例如，如美国专利7271007中所述)、横向流动装置(例如，如美国公布20040228761或美国公布20040265926中所述)、荧光偏振免疫测定(FPIA，例如，如美国专利4593089或美国专利4751190中所述)或免疫浊度测定(例如，如美国专利5571728或美国专利6248597中所述)。

确定TNFR1水平的量

本公开的效力测定还可以包括确定由间充质谱系前体或干细胞进行的TNFR1表达的步骤。TNFR1可以是可溶性TNFR1(sTNFR1)。此步骤可以在将间充质谱系前体或干细胞与T细胞共同培养之后进行。可替代地，可以在与T细胞共同培养之前在分离或富集或扩增的间充质谱系前体或干细胞的细胞裂解液中测量TNFR1表达。在一个实施方案中，在冻存的富集和/或扩增的间充质谱系前体或干细胞的细胞裂解液中测量TNFR1表达。

本领域技术人员将理解，以上所述的用于检测IL-2Rα表达的方法也可以用于检测TNFR1表达。在一个优选的实施方案中，通过ELISA或FLISA测定细胞裂解液。

在一种形式中，这种测定涉及将TNFR1结合蛋白固定到固体基质上。然后将测试样品与TNFR1结合蛋白直接接触，并且样品中的TNFR1被结合或捕获。在洗涤以去除样品中的任何未结合蛋白之后，将在不同表位处结合至TNFR1的蛋白质与捕获的TNFR1直接接触。此检测物蛋白通常如上所述进行标记。可替代地，可以使用结合至检测物蛋白的第二标记蛋白。在洗涤以去除任何未结合的蛋白质之后，通过添加如上所述的在ELISA的情况下的底物来检测可检测的报告基因分子。然后使用标准曲线确定样品中的TNFR1的水平，所述标准曲线使用已知量的标记物或通过与对照样品进行比较来产生。

在一个实施方案中，在冻存的富集和/或扩增的间充质谱系前体或干细胞的细胞裂解液中测量TNFR1表达，并且至少100pg/mL TNFR1指示治疗功效的生物活性。

组合物和施用

包含间充质谱系前体或干细胞的组合物可以在药学上可接受的载剂中制备。如本文所用的术语“药学上可接受的载剂”是指有利于储存、施用和/或维持间充质谱系前体或干细胞的生物活性的物质组合物。

在一个实例中，载剂不在供体中产生显著的局部或全身性不良作用。药学上可接受的载剂可以是固体或液体。药学上可接受的载剂的实例包括但不限于稀释剂、溶剂、表面活性剂、赋形剂、悬浮剂、缓冲剂、润滑剂、助剂、媒介物、乳化剂、吸附剂、分散体介质、涂层、稳定剂、保护性胶体、粘合剂、增稠剂、触变剂、渗透剂、螯合剂、支架、不影响间充质谱系前体或干细胞的活力和活性的等渗和吸附延迟剂。合适载剂的选择在本领域普通技术人员的技术之内。

本公开的组合物可以方便地以单位剂量的形式提供并且可以通过本领域熟知的任何方法进行制备。如本文所用的术语“剂量单位形式”是指适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理上离散单位；每个单位含有预先确定量的活性化合物，其经计算与药物载剂缔合产生所需治疗或预防效果。间充质谱系前体或干细胞的剂量可以根据诸如以下的因素而变化：待治疗的受试者的疾病状态、年龄、性别和体重。

术语“受试者”是指动物，优选地哺乳动物，包括非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠或小鼠)和灵长类动物(例如，猴或人)。在一个优选的实施方案中，受试者是人。

示例性剂量包括至少约1x 10⁶个细胞。例如，剂量可以包括约1.0x 10⁶至约1x10¹⁰个细胞，例如约1.1x 10⁶至约1x10⁹个细胞，例如约1.2x 10⁶至约1x 10⁸个细胞，例如约1.3x10⁶至约1x 10⁷个细胞，例如约1.4x 10⁶至约9x 10⁶个细胞，例如约1.5x 10⁶至约8x 10⁶个细胞，例如约1.6x 10⁶至约7x 10⁶个细胞，例如约1.7x 10⁶至约6x 10⁶个细胞，例如约1.8x 10⁶至约5x 10⁶个细胞，例如约1.9x 10⁶至约4x 10⁶个细胞，例如约2x 10⁶至约3x 10⁶个细胞。

在一个实例中，剂量包括约5x 10⁵至2x10⁷个细胞，例如约6x10⁶个细胞至约1.8x10⁷个细胞。剂量可以是例如约6x 10⁶个细胞或约1.8x 10⁷个细胞。

间充质谱系前体或干细胞占所述组合物的细胞群体的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。

本公开的组合物可以是冻存的。间充质谱系前体或干细胞的冻存可以使用本领域已知的慢速率冻存方法或‘快速’冷冻方案进行。优选地，冻存方法维持与未冷冻细胞相比相似的表型、细胞表面标记物和冻存细胞的生长速率。

冻存组合物可以包含冻存溶液。冻存溶液的pH通常为6.5至8，优选地7.4。

冻存溶液可以包含无菌非致热等渗溶液，例如像PlasmaLyte A^TM。100mL的PlasmaLyte A^TM含有526mg的氯化钠，USP(NaCl)；502mg的葡萄糖酸钠(C₆H₁₁NaO₇)；368mg的三水醋酸钠，USP(C₂H₃NaO₂·3H₂O)；37mg的氯化钾，USP(KCl)；以及30mg的氯化镁，USP(MgCl₂·6H₂O)。它不含抗微生物剂。pH用氢氧化钠调整。pH为7.4(6.5至8.0)。

冻存溶液可以包含Profreeze^TM。冻存溶液可以额外或可替代地包含培养基。

为了有利于冷冻，通常将冷冻保护剂(例如像二甲基亚砜(DMSO))添加到冻存溶液中。理想地，冷冻保护剂应对于细胞和患者是无毒的，非抗原性的，化学上惰性的，在解冻之后提供高存活率并且允许在没有洗涤的情况下进行植入。然而，最常用的冷冻保护剂DMSO显示一定的细胞毒性。羟乙基淀粉(HES)可以用作替代物或与DMSO组合以降低冻存溶液的细胞毒性。

冻存溶液可以包含DMSO、羟乙基淀粉、人血清组分和其他蛋白质填充剂中的一种或多种。在一个实例中，冻存溶液包含约5％人血清白蛋白(HSA)和约10％DMSO。冻存溶液还可以包含甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和海藻糖。

在一个实施方案中，细胞悬浮于42.5％Profreeze^TM/50％αMEM/7.5％DMSO中，并且在速率受控的冷冻机中冷却。

可以解冻冻存组合物并且直接施用给受试者，或添加到另一种例如包含HA的溶液中。可替代地，可以解冻冻存组合物，并且间充质谱系前体或干细胞在施用之前重悬浮于替代载剂中。

本公开的组合物可以通过适用于待治疗的特定疾病状态的途径施用。例如，本公开的组合物可以全身性地施用，即肠胃外、静脉内或通过注射施用。本公开的组合物可以靶向特定组织或器官。

可以调整给药方案以提供最佳的治疗响应。例如，可以施用单次推注，随着时间推移可以施用若干分开剂量或如由治疗情况的紧急状态指示，剂量可以按比例减少或增加。为了便于施用和实现剂量均匀性，以剂量单位形式配制肠胃外组合物可以是有利的。

在一些实施方案中，在开始用细胞组合物进行的疗法之前，可能不需要或不希望对患者进行免疫抑制。事实上，在绵羊中植入同种异体STRO-1+细胞在免疫抑制不存在的情况下是良好耐受的。然而，在其他情况下，在开始细胞治疗之前在药理学上对患者进行免疫抑制可能是希望的或适当的。这可以通过使用全身性或局部免疫抑制剂来实现，或者这可以通过递送在包封装置中的细胞来实现。细胞可以包封在胶囊中，所述胶囊对于细胞所需要的营养物质和氧气以及治疗性因子是可透过的，细胞对于免疫体液因子和细胞是不可透过的。优选地，包封剂是低过敏性的，易于且稳定地位于靶组织中，并且为植入结构提供增加的保护。这些手段和用于减少或消除对植入细胞的免疫应答的其他手段在本领域中是已知的。作为替代方案，细胞可以在遗传上修饰以降低其免疫原性。

应理解，间充质谱系前体或干细胞可以与其他有益的药物或生物分子一起施用。当与其他药剂一起施用时，它们可以单一药物组合物，或以单独的药物组合物，与其他药剂同时或顺序地(在其他药剂之前或之后施用)一起施用。可以共同施用的生物活性因子包括抗凋亡剂(例如，EPO、EPO模拟体、TPO、IGF-I和IGF-II、HGF、半胱天冬酶抑制剂)；抗炎剂(例如，p38 MAPK抑制剂、TGF-β抑制剂、他汀类、IL-6和IL-1抑制剂、PEMIROLAST^TM、TRANILAST^TM、REMICADE^TM、SIROLIMUS^TM和非类固醇抗炎药物(NSAID)，诸如TEPOXALIN^TM、TOLMETIN^TM、SUPROFEN^TM)；免疫抑制/免疫调节剂(例如，钙调神经素抑制剂，诸如环孢霉素、他克莫司)；mTOR抑制剂(例如，SIROLIMUS^TM、EVEROLIMUS^TM)；抗增殖剂(例如，硫唑嘌呤、麦考酚酸莫酯)；皮质类固醇(例如，泼尼松龙、氢化可的松)；抗体，诸如单克隆抗IL-2Rα受体抗体(例如，巴利昔单抗、达利珠单抗)，多克隆抗T细胞抗体(例如，抗胸腺淋巴细胞球蛋白(ATG)；抗淋巴细胞球蛋白(ALG)；单克隆抗T细胞抗体OKT3))；抗血栓形成剂(例如，肝素、肝素衍生物、尿激酶、PPack(右旋苯丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)、抗凝血酶化合物、血小板受体拮抗剂、抗凝血酶受体、抗血小板受体抗体、阿司匹林、潘生丁、鱼精蛋白、水蛭素、前列腺素合成抑制剂和血小板抑制剂)；和抗氧化剂(例如，普罗布考、维生素A、抗坏血酸、生育酚、辅酶Q-10、谷胱甘肽、L-半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸)以及局部麻醉剂。

移植物抗宿主病及其阶段

急性和慢性移植物抗宿主病(GVHD)是多系统病症，其为同种异体造血细胞植入的并发症(通常呈骨髓或外周血干细胞收获物的形式)。当从非相同供体(移植物)植入的免疫细胞将植入物供体(宿主)识别为外源性时，GVHD发生，从而引发导致植入物供体的疾病的免疫反应。急性GVHD的临床表现包括经典的斑丘疹、持续性恶心和/或呕吐；腹部痉挛伴随腹泻；以及血清胆红素浓度升高。相比之下，患有慢性GVHD的患者通常表现出涉及皮肤的类似的扁平苔藓或硬皮病的皮肤表现；口腔粘膜干燥，伴随胃肠道的溃疡和硬化；以及血清胆红素浓度升高。

GVHD已使用100天的截止值基于发病时间在临床上分为急性和慢性变体。然而，此常规分类由于认识到急性和慢性GVHD的现象可能在这些指定时间段之外发生而受到挑战。这一观察使得增加使用临床发现而非设定时间段来区分慢性和急性GVHD。广泛接受的美国国立卫生研究院(NIH)共识准则用于将GVHD的GVHD分类表现诊断为“诊断性”或“辨别性”慢性GVHD或诊断为急性和慢性GVHD所共同的(Filipovich AH等人(2005)Biol Blood MarrowTransplant 11:945)。

患有GVHD的患者基于呈现时间和所存在的特征而进行亚分类：

·经典急性GVHD–病情在造血细胞植入(HCT)的100天内存在并展现出急性GVHD的特征。不存在慢性GVHD的诊断性和辨别性特征。

·持续性、复发性、晚期发作急性GVHD–病情在HCT后存在大于100天并伴随急性GVHD的特征。不存在慢性GVHD的诊断性和辨别性特征。

·经典慢性GVHD-病情可能在HCT后任何时间存在。存在慢性GVHD的诊断性和辨别性特征。没有急性GVHD的特征。

·重叠综合征–病情可能在HCT后任何时间存在，伴随慢性GVHD和急性GVHD的特征。这有时在口语上被称为“慢加急”GVHD。

急性GVHD的病理生理学已被良好地描述并被广泛地综述(Ferrara JL等人(2006)Semin Hematol 43(1):3-10)。简而言之，导致临床上明显的GVHD的发展的事件在植入前情况下开始，在此期间，植入物供体接受高剂量化疗和/或放疗。由于高剂量疗法而发生的组织损伤导致宿主抗原呈递细胞(APC)的活化，APC表面上主要组织相容性抗原的上调和宿主抗原的呈递。与干细胞移植物一起输注的供体T淋巴细胞在这种情况下通过克隆扩增、组织迁移和直接细胞-细胞毒性来对抗原性差异做出反应。高水平的促炎细胞因子，特别是肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)和白介素-2(IL-2)以及丰富的宿主抗原引起炎性级联，其可能导致严重的组织损伤、器官功能障碍和死亡。

临床上显著的急性GVHD在接受同种异体造血细胞植入物(HCT)的患者中发生，尽管使用免疫抑制剂进行了强化预防。同种异体HCT之后急性GVHD的确切发病率是未知的。报告的发病率范围在接受来自基因型上HLA相同的同胞的同种异体HCT的患者中为9％至50％(Lee SE等人(2013)Bone Marrow Transplant 48:587)。

急性GVHD在匹配的非相关供体中和在半相合的相关供体中也是常见的。

多种研究已鉴定了以下发展急性移植物抗宿主病(GVHD)的风险因子(Hahn T等人(2008)J Clin Oncol 26:5728)：

·HLA差异程度(HLA错配或非相关供体)；

·供体和供体性别差异(雌性供体与雄性供体)；

·植入物预处理方案的强度；

·所使用的急性GVHD预防方案；以及

·移植物来源(外周血或骨髓大于脐带血)。

较未良好建立的风险因子包括增加的宿主年龄、供体和宿主的巨细胞病毒(CMV)状态、供体爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)血清阳性(Styczynski J等人(2016)J Clin Oncol34:2212)；外周血干细胞相对于骨髓植入、无菌环境的存在(包括净化)和特定HLA单倍型。然而，急性GVHD的风险因子由于基础疾病而不同，从而需要每种病状的不同风险模型(HahnT等人(2008)J Clin Oncol 26:5728)。

GVHD是在植入后时间段早期经典地呈现的同种异体造血细胞植入物(HCT)的常见并发症。急性GVHD的初始现象和症状最常见地发生在大约白细胞移植时。虽然急性GVHD的初始定义要求在植入后100天之前症状发作，但是目前的美国国立卫生研究院(NIH)共识准则使用临床发现而非设定时间段来区分急性和慢性GVHD。由此，在第100天之前呈现急性GVHD的典型发现的患者被认为患有“经典急性GVHD”，而通常在减少免疫抑制时在第100天之后呈现相同发现的患者被分类为患有“晚期发作的急性GVHD”(Vigorito AC等人(2009)Blood 114:702)。一些临床医生也使用术语“早期发作的急性GVHD”或“超急性GVHD”来描述在植入14天内发生的急性GVHD的症状(Sullivan KM等人(1986)Blood 67:1172)。

器官损害

皮肤、胃肠道和肝是患有急性GVHD的患者的主要靶器官。在大部分患者中，急性GVHD的第一(并且最常见的)临床表现是斑丘疹，通常在白细胞移植时或附近发生。皮疹初始涉及颈的背部、耳朵、肩部、手掌和脚底。它可以描述为晒斑并且可能是瘙痒或疼痛的。皮肤的组织学检查揭示真皮和表皮层的变化(Sale GE等人(1977)Am J Pathol 89:621)。特征性发现包括胞外分泌的淋巴细胞、角化不良的表皮角质细胞、滤泡损害、角化不良的表皮角质细胞相邻或周围的卫星淋巴细胞以及真皮血管周围淋巴细胞浸润(Darmstadt GL等人(1992)J Invest Dermatol 99:397)。皮肤损害的阶段与关于胃肠道和肝损害的阶段的信息组合以确定急性GVHD的总体严重性等级。

急性GVHD频繁地涉及上胃肠道和下胃肠道。胃肠损害通常与腹泻和腹痛一起呈现，但是还可以表现为恶心、呕吐和厌食。诊断确认通过病理学评估通过上消化道内窥镜检查、直肠活检或结肠镜检查获得的组织来提供。胃肠损害的诊断需要组织的病理学评估。一旦被诊断，胃肠损害的程度基于腹泻的严重性的分级：阶段1–腹泻500至1000mL/天；阶段2–腹泻1000至1500mL/天；阶段3–腹泻1500至2000mL/天；以及阶段4–腹泻>2000mL/天或疼痛或肠阻塞。

患有急性GVHD的下胃肠道的损害常常是严重的，并且特征在于腹泻、具有或没有便血以及腹部痉挛。诊断确认通过病理学评估通过直肠活检或结肠镜检查获得的组织来进行。患有急性GVHD的患者可能发展严重腹泻，有时超过10升一天。粪便初始可能是多水的，但是频繁地变得出血。腹泻是分泌性的，并且即使禁食也特征性地继续，并且日夜发生。它可能伴随痉挛性腹痛，其可能是难以医治的。严重的肠阻塞可能与急性GVHD共同发展，或者由控制身体不适所需的增加阿片类药物使用引起。直肠活检通常在进行影响胃肠道的急性GVHD的诊断方面是有用的。在组织学检查时，隐窝细胞坏死在死亡隐窝中的退行性物质积累的情况下观察到。

患有急性GVHD的上胃肠道的损害常常与厌食、消化不良、食物不耐受、恶心和呕吐一起呈现(Weisdorf DJ等人(1990)Blood76:624)。患者还可能表现出齿龈炎和粘膜炎，虽然这些发现最常见地是由于预处理方案的作用而产生。诊断通过食道和胃的阳性上部内窥镜活检验证。鉴别诊断包括单纯疱疹病毒或念珠菌性食管炎、胃炎、消化性溃疡以及由于化疗和/或放射引起的胃肠毒性。

肝损害通常在具有皮肤和/或胃肠急性GVHD的现象的患者中呈现(Ratanatharathorn V等人(1998)Blood 92:2303)。患者很少患有中等至严重肝GVHD而没有其他器官损害的证据。虽然肝损害可以通过皮肤或胃肠GVHD的环境中肝功能测试的异常来暗示，但是需要肝活检来证明肝的GVHD。肝损害通过异常肝功能测试来表现，其中最早和最常见的发现是缀合的胆红素和碱性磷酸酶的血清水平升高。血清胆固醇通常升高，同时凝血病和高氨血症是非常罕见的，但是可能在严重病例中发展。患者还可能表现出疼痛的肝肿大、小便黄赤、粪便发白、液体潴留和瘙痒。发热、厌食和恶心是常见的非特异性症状。虽然特征性皮疹的并发性存在提供暗示性临床证据，但是活检是诊断肝的GVHD的最确定的方法。然而，由于HCT之后不久严重血小板减少引起的急性出血的可能性，这可能是不适用的。

用于诊断急性GVHD的生物标记物

使用用于诊断急性GVHD的血清生物标记物是活动研究区域。生物标记物或生物标记物的组通常彼此或与其他发现组合使用。理想生物标记物能够不仅能够预测临床急性GVHD的出现，还能够引导治疗。存在许多候选生物标记物，但是均不适用于临床应用。

一种候选生物标记物是致瘤性抑制素2(ST2)，其为白介素-1受体家族的成员。

使用蛋白质组学分析血浆和尿液多肽的模式已显示能够早期诊断急性GVHD的希望(Srinivasan R等人(2006)Exp Hematol 34:796)。作为一个实例，已提出标记物的组(包括白介素-2受体-α、肿瘤坏死因子受体-1、白介素-8和肝细胞生长因子)可以在临床症状发作时确认急性GVHD的诊断，并且提供预后信息，无论GVHD严重性如何(Paczesny S等人(2009)Blood 113:273)。还发现使用Reg3可用于诊断急性肠GVHD(Ferrara JL等人(2011)Blood 118:6702)。另外，还发现CD30的血浆水平在患有急性GVHD的患者中升高(Chen YB等人(2012)Blood 120:691)。

分析血浆微小RNA特征可以为急性GVHD提供非侵入性生物标记物。在一个研究中，评估六个微小RNA的组能够从没有急性GVHD的患者中区分患有急性GVHD的HCT供体，并且能够预测急性GVHD的严重性(Xiao B等人(2013)Blood 122:3365)。四个组成预测急性GVHD的组，并且miRNA生物标记物的水平与急性GVHD严重性正相关。更重要的是，那些升高的miRNA可以在急性GVHD发作之前检测。这些数据较大患者组中经过验证。

GVHD的阶段

已开发用于对急性GVHD进行分级的若干系统。最普遍的两种是Glucksberg等级(I-IV)(Glucksberg H等人(1974)Transplantation18(4):295)和国际骨髓植入物登记处(IBMTR)分级系统(A-D)(Rowlings PA等人,(1997)Br J Hematol 97(4):855)。急性GVHD的严重性通过评定皮肤、肝和胃肠道的损害程度来确定。个体器官损害的阶段与(Glucksberg)或不与(IBMTR)患者的表现状态组合来产生总体等级，其具有预后重要性。等级I(A)GVHD表征为温和型疾病，等级II(B)GVHD表征为中等疾病，等级III(C)表征为严重疾病，并且等级IV(D)表征为威胁生命的(Przepiorka D,Weisdorf D,Martin P,KlingemannHG,Beatty P,Hows J,Thomas ED(1995)Bone Marrow Transplant.1995；15(6):825；CahnJY等人(2005)Blood 106(4):1495)。

IBMTR分级系统如下定义急性GVHD的严重性：

·等级A–阶段1，单独的皮肤损害(斑丘疹超过身体的<25％)，没有肝或胃肠损害

·等级B–阶段2，皮肤损害；等级1至2，肠或肝损害

·等级C–阶段3，任何器官系统的损害(全身性红皮病；胆红素6.1至15.0mg/dL；腹泻1500至2000mL/天)

·等级D–阶段4，任何器官系统的损害(全身性红皮病，具有大疱形成；胆红素>15mg/dL；腹泻>2000mL/天或疼痛或肠阻塞)。

分级在评定对预防或治疗的反应、对存活率的影响和与移植物抗白血病作用的关联性方面是重要的。患有中等至严重GVHD的患者与患有温和型疾病的那些患者相比具有显著更高的死亡率。作为一个实例，患有等级III(C)和等级IV(D)急性GVHD的患者的估计的五年存活率分别为25％和5％(Przepiorka D等人(1995)Bone Marrow Transplant 15:825)。然而，鉴于HCT后护理的变化，在将这些估计的存活率应用于当前的患者群体时，必须要谨慎。当前的预防性方案可能改变疾病的总体结果和表现。在类固醇疗法开始的10天窗口期(-5至+5天)内计算每种器官的典型初始分级。然后通过主治医生在实验室和临床信息和组织学确认(当可能时)的支持下，每周确定实时阶段和分级。

最近的研究(参见例如，MacMillan ML等人(2010)Blood115:5412-5417)已提出并入第28天应答(包括PR和Cr)作为早期靶，其可以预测患有急性GVHD的患者的晚期和更关键的结果。

造血干细胞植入(HSCT)

“造血干细胞植入(HSCT)”是包含多能性造血干细胞的移植物，所述多能性造血干细胞可以例如源自骨髓或外周血。植入物可以包含一些非干细胞，例如包括DC和/或淋巴细胞的APC。

“造血干细胞”可以自我更新并且分化以产生所有的血细胞类型，包括髓细胞(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞)、红系细胞(红细胞)、巨核细胞(血小板)和淋巴谱系细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)。在整个分化过程中，造血干细胞首先丧失其自我更新能力，然后在其变为成熟效应细胞时逐步丧失谱系潜力。通常Lin-、CD34+、CD38-、CD90+、CD45RA-人细胞是造血干细胞。在一个实例中，CD34的表达用于鉴定从人供体分离的外周血中的造血干细胞。

HSCT可以用于治疗需要干细胞植入物的疾病和病状。例如，干细胞可以用于治疗正常血细胞产生和成熟化的故障或功能障碍、血液恶性肿瘤、自身免疫性疾病、肝疾病或免疫缺陷(由于例如放射、化疗或病原体感染)。

干细胞可以在施用给受试者之前离体扩增或分化。

同种异体造血干细胞植入可以用于治疗以下病状中的一种或多种：急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生性病症、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏病、再生障碍性贫血、纯红细胞再生障碍、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、范可尼贫血、地中海贫血、镰状细胞性贫血、严重联合免疫缺陷(SCID)、维-奥综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)、先天性代谢缺陷(例如，黏多糖病、戈谢病、异染性脑白质营养不良和肾上腺脑白质营养不良)。

GVHD的预防或治疗

间充质谱系前体或干细胞和/或其子代细胞可以在用于预防或治疗患有GVDH的受试者的方法中使用，所述方法包括向受试者施用用于预防或治疗的有效剂量的细胞。在一个实施方案中，所述受试者接受引起GVHD的一种或多种同种异体造血干细胞。

GVHD的症状包括皮肤硬化、口服摄入受限、眼睛干涩、胃肠(GI)道症状(诸如吞咽困难、厌食、恶心、呕吐、腹痛或腹泻)、通过胆红素升高、碱性磷酸酶升高和丙氨酸氨基转移酶(ALT)/天冬氨酸氨基转移酶(AST)(AST/ALT)比例升高所表现的肝症状、呼吸短促和/或手臂或腿部绷紧。

受试者可以根据受移植物抗宿主病影响的组织而表现出多种症状。一些受试者具有4-5种症状，其他可以具有1-2种症状。间充质谱系前体或干细胞和/或其子代细胞可以用于治疗受试者的与GVHD相关联的症状中的一种或多种或全部和全部。

用于治疗哺乳动物和具体地人的GVHD或GVHD的症状的间充质谱系前体或干细胞和/或其子代细胞的每次注射的有效剂量可以是介于1x10⁴个细胞/kg体重与1x10⁸个细胞/kg体重之间；介于1x10⁴个细胞/kg体重与1x10⁸个细胞/kg体重之间；介于2x10⁴个细胞/kg体重与1x10⁸个细胞/kg体重之间；介于2.5x10⁴个细胞/kg体重与1x10⁸个细胞/kg体重之间；介于2x10⁴个细胞/kg体重与1x10⁷个细胞/kg体重之间；介于2.5x10⁴个细胞/kg体重与1x10⁷个细胞/kg体重之间；介于2x10⁴个细胞/kg体重与3x10⁶个细胞/kg体重之间；介于2.5x10⁴个细胞/kg体重与3x10⁶个细胞/kg体重之间；介于2x10⁴个细胞/kg体重与2x10⁶个细胞/kg体重之间；介于2.5x10⁴个细胞/kg体重与2x10⁶个细胞/kg体重之间；介于2x10⁴个细胞/kg体重与1x10⁶个细胞/kg体重之间；介于2.5x10⁴个细胞/kg体重与1x10⁶个细胞/kg体重之间；介于2x10⁴个细胞/kg体重与1x10⁵个细胞/kg体重之间；或介于2.5x10⁴个细胞/kg体重与1x10⁵个细胞/kg体重之间。

间充质谱系前体或干细胞和/或其子代细胞可以手术植入、注射、递送(例如，通过导管或注射器)或以其他方式直接或间接施用到需要恢复或加强的部位，例如器官或施用到受试者的血液系统中。

在一个实施方案中，间充质谱系前体或干细胞和/或其子代细胞递送到受试者的血流。例如，间充质谱系前体或干细胞和/或其子代细胞在肠胃外递送。肠胃外施用的示例性途径包括但不限于静脉内、肌内、皮下、动脉内、腹膜内、脑室内、侧脑室内、鞘内。

在一个实施方案中，间充质谱系前体或干细胞和/或其子代细胞例如使用注射器或通过导管或中心线注射到递送位点中。

选择治疗性制剂的施用方案取决于若干因素，包括实体的血清或组织周转率、症状水平和实体的免疫原性。优选地，施用方案使递送至患者的治疗性化合物的量最大化，与可接受水平的副作用一致。

在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞和/或其子代细胞作为单次推注剂量递送。可替代地，间充质谱系前体或干细胞和/或其子代细胞通过连续输注施用。

不限于任何特定施用方法，非口服施用方法是优选的。虽然全身或部分身体施用是可能的，但是全身施用是优选的并且静脉内注射是最优选的。

间充质谱系前体或干细胞和/或其子代细胞或包含其的组合物可以用于与一种或多种其他活性剂组合。例如，本公开的间充质谱系前体或干细胞可以与皮质类固醇、非类固醇抗炎化合物或其他可用于治疗炎症的药剂组合。间充质谱系前体或干细胞与这些其他药剂的组合使用可以是同时的或顺序给与，即，间充质谱系前体或干细胞或包含其的组合物可以在用一种或多种其他活性剂治疗之前或之后给与。

在一个实施方案中，间充质谱系前体或干细胞和/或其子代细胞在施用造血干细胞之前、与其同时或之后施用。

在另一个实施方案中，造血干细胞在施用至受试者之前与间充质谱系前体或干细胞和/或其子代细胞共同培养。

主治医生可以决定施用间充质谱系前体或干细胞或包含其的组合物与其他活性剂组合的的适当顺序。

炎性病症的治疗

本公开还提供一种治疗受试者的自身免疫疾病的方法。所述方法包括向受试者施用有效治疗受试者的自身免疫疾病的量的如本文所述的间充质谱系前体或干细胞或其子代。可以根据本公开治疗的自身免疫疾病包括但不限于多发性硬化症、1型糖尿病、类风湿性关节炎、葡萄膜炎、乳糜泻、狼疮、自身免疫性甲状腺病、炎性肠病、自身免疫性淋巴增殖性病(ALPS)、脱髓鞘病、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性胃炎(AIG)和自身免疫性肾小球疾病。

遗传修饰的细胞

在一个实施方案中，间充质谱系前体或干细胞进行遗传修饰以例如表达和/或分泌感兴趣的蛋白质，例如提供治疗性和/或预防性益处的蛋白质。

用于遗传修饰细胞的方法对于本领域技术人员是显而易见的。例如，在细胞中表达的核酸可操作地连接到用于在细胞中诱导表达的启动子。例如，核酸连接到在受试者的各种细胞中可操作的启动子，例如像病毒启动子，例如CMV启动子(例如，CMV-IE启动子)或SV-40启动子。额外的合适的启动子在本领域中是已知的。

优选地，核酸以表达构建体的形式提供。如本文所用的术语“表达构建体”是指一种核酸，其具有在细胞中在其可操作地连接到的核酸(例如，报告基因和/或反向可选择的报告基因)上赋予表达。在本公开的上下文内，应理解，表达构建体可以包含或者是质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒亚基因组或基因组片段或其他能够以可表达形式维持和/或复制异源DNA的核酸。

用于构建进行本发明的合适表达构建体的方法对于本领域技术人员是显而易见的，并且描述于例如Ausubel F.M.,1987，包括目前为止的所有更新；或者Sambrook&Green,2012中。例如，表达构建体的每种组分使用例如PCR由合适的模板核酸扩增，并且随后克隆到合适的表达构建体，例如像质粒或噬菌粒中。

适用于这种表达构建体的载体在本领域中是已知的和/或在本文中描述。例如，哺乳动物中的适用于本发明的方法的表达载体是例如pcDNA载体组(Invitrogen)的载体、pCI载体组(Promega)的载体、pCMV载体组(Clontech)的载体、pM载体(Clontech)、pSI载体(Promega)、VP 16载体(Clontech)或pcDNA载体组(Invitrogen)的载体。

本领域技术人员知道额外的载体和此类载体的来源，例如像Invitrogen公司、Clontech或Promega。

用于将分离的核酸分子或包含其的基因构建体引入到细胞中以用于表达的手段在本领域中是已知的。用于给定生物的技术取决于已知的成功技术。用于将重组DNA引入到细胞中的手段包括微注射、通过DEAE-葡聚糖介导的转染、诸如通过使用阳离子脂质体(Gibco,MD,USA)和/或cellfectin(Gibco,MD,USA)由脂质体介导的转染、PEG介导的DNA吸收、诸如通过使用DNA涂覆的钨或金颗粒(Agracetus Inc.,WI,USA)进行的电穿孔和微颗粒轰击等。

可替代地，本发明的表达构建体是病毒载体。合适的表达载体在本领域中是已知的并且是可商购获得的。用于递送核酸并将此核酸整合到宿主细胞基因组中的常规的基于病毒的系统包括例如逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒相关病毒载体。可替代地，腺病毒载体可用于将保持游离状态的核酸引入到宿主细胞中。病毒载体是在靶细胞和组织中进行基因转移的有效且多功能的方法。另外，在许多不同的细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。

例如，慢病毒载体通常包含顺式作用的长末端重复序列(LTR)，其具有多达6-10kb的外源序列的包装能力。最小的顺式作用的LTR足以复制并包装载体，然后将其用于将表达构建体整合到靶细胞中以提供长期表达。广泛使用的慢病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SrV)、人免疫缺陷病毒(HIV)及其组合的那些慢病毒载体(参见例如，国际公布WO1994/026877；Buchschacher&Panganiban,1992；Johann等人,1992；Sommerfelt&Weiss,1990；Wilson等人,1989；Miller等人,1991；Lynch,等人,1991；Miller&Rosman,1989；Miller,1990；Scarpa等人,1991；Burnset等人,1993。

还开发了各种腺相关病毒(AAV)载体系统以用于核酸递送。AAV载体可以易于使用本领域已知的技术构建。(参见比如，美国专利5173414和5139941；国际公布WO 92/01070和WO 93/03769；Lebkowski等人,1988；Vincent等人,1990；Carter,1992；Muzyczka,1992；Kotin,1994；Shelling&Smith,1994；Zhou等人,1994。

可用于递送本发明的表达构建体的额外病毒载体包括例如来源于痘病毒科的那些，诸如牛痘病毒和禽痘病毒或甲病毒或缀合物病毒载体的那些(例如，Fisher-Hoch等人,1989中所述。

本领域技术人员应理解，在不脱离本公开的广泛总体范围的情况下，可以对上述实施方案进行各种变化和/或修改。因此，本发明的实施方案在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。

造血细胞

在一些实例中，供体受试者接受了包含造血细胞的供体移植物。在其他实例中，供体移植物是骨髓或从血液收获的外周血单核细胞(PBMC)。此类移植物包含造血细胞。诸如骨髓植入物、PBMC植入物的术语用于描述含有造血细胞的植入物。造血细胞植入(HCT)是针对各种各样的恶性和非恶性疾病的重要且潜在治愈性治疗选择。此程序所需要的多能性造血干细胞通常从相关或非相关供体的骨髓或外周血获得。脐带血(婴儿出生后脐带和胎盘中留下的血液)已作为同种异体HCT中造血干细胞的已建立的替代性来源出现。

如本文指代的术语“造血细胞”是指代来自任何来源(例如，骨髓、外周血、脐带血)的祖细胞/造血干细胞的通用术语。另外，此类细胞的来源是指定的(例如，自体外周血祖细胞植入)。

在一些实例中，PBMC通过供体的单采血液成分术获得。在此情况下，供体可以是非相关供体，其中移植物指代为同种异体PBPC移植物。在其他实例中，PBMC从接受治疗(例如，化疗治疗)之前的供体获得。在此情况下，移植物被称为自体PBPC移植物。

在一些实例中，PBPC在供体(或供体)接受粒细胞集落干细胞因子(G-CSF)注射过程之后获得。不希望受理论限制，通常受试者接受G-CSF的每日皮下注射，并且每几天一次监测其白细胞计数以监测干细胞到外周血中的移动。在一些实例中，受试者接受G-CSF的连续每天注射，持续至少7天。在一些实例中，受试者接受G-CSF的连续每天注射，持续至少10天。在一些实例中，G-CSF可以与另一种药剂(例如，普乐沙福注射或干细胞因子(SCF))组合。

实施例

实施例1材料和方法

使用塑料粘附技术制备的间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)

重新由骨髓生成MLPSC，如US 5,837,539中所述。将大约80-100ml的骨髓抽吸到无菌的含有肝素的注射器中，并且带到MDACC细胞治疗实验室以用于MSC生成。使用ficoll-泛影葡胺分离骨髓单核细胞，并且将其置于两个T175烧瓶中，每个烧瓶具有50ml的MLPSC扩增培养基，所述培养基包括α改进的MEM(αMEM)，其包含庆大霉素、谷氨酰胺(2mM)和20％(v/v)胎牛血清(FBS)(Hyclone)。

将细胞在37℃、5％CO₂中培养2-3天，此时去除非粘附细胞；继续培养剩余的粘附细胞，直至细胞汇合度达到70％或更高(7-10天)，并且然后对细胞进行胰蛋白酶化并重新置于具有扩增培养基的六个T175烧瓶中(每个烧瓶50ml培养基)。

间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)的免疫选择

从健康正常成人志愿者(20-35岁)收获骨髓(BM)。简而言之，将来自后髂嵴的40mlBM抽吸到含有锂-肝素抗凝剂的管中。

使用Lymphoprep^TM(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)通过密度梯度分离制备骨髓单核细胞(BMMNC)，如先前由Zannettino等人,1998所述。在4℃下在400x g下离心30分钟之后，用移液管取出棕黄色层并在包含Hank平衡盐溶液(HBSS；Life Technologies,Gaithersburg,MD)的含有5％胎牛血清(FCS，CSL Limited,Victoria,Australia)的“HHF”中洗涤三次。

随后通过磁活化细胞分选分离STRO-3+(或TNAP+)细胞，如先前由Gronthos&Simmons,1995；和Gronthos,2003所述。简而言之，将大约1-3x 10⁸个BMMNC在冰上，在HHF中由10％(v/v)正常兔血清组成的封闭缓冲液中温育20分钟。将细胞在冰上在封闭缓冲液中与200μl的10μg/ml的STRO-3mAb溶液一起温育1小时。随后通过在400x g下离心将细胞在HHF中洗涤两次。添加在HHF缓冲液中的山羊抗小鼠γ-生物素(Southern BiotechnologyAssociates,Birmingham,UK)的1/50稀释液并在冰上温育1小时。将细胞如上在MACS缓冲液(不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS，补充1％BSA、5mM EDTA和0.01％叠氮化钠)中洗涤两次，并且重悬浮于0.9ml最终体积的MACS缓冲液中。

将100μl链霉亲和素珠粒(Miltenyi Biotec；Bergisch Gladbach,Germany)添加到细胞悬浮液中并在冰上温育15min。将细胞悬浮液洗涤两次并重悬浮于0.5ml MACS缓冲液中，并且随后加载到微型MACS柱(MS柱，Miltenyi Biotec)上，并且用0.5ml MACS缓冲液洗涤三次以取回不结合STRO-3mAb(2005年12月19日在保藏号PTA-7282下保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)-参见国际公布WO 2006/108229)的细胞。在添加另外1ml MACS缓冲液之后，从磁体取出柱并且通过正压力分离TNAP+细胞。可以用链霉亲和素-FITC对来自每个级分的等分试样细胞染色，并且通过流式细胞术评定纯度。

IL-2Rα表达的测量

培养基的制备

制备含有10％胎牛血清和2mM GlutaMax-I的DMEM，并且通过0.2μm过滤器过滤并标记为在2-8℃下1个月有效期。在使用之前，将培养基在37℃水浴中预热最少30分钟。

0.5％胰蛋白酶/EDTA的制备

制备含有0.5％EDTA的EDTA并通过0.2μm过滤器过滤，并且标记为12个月有效期或试剂有效期(以较早者为准)，并在-20℃下以等分式样储存。

对MLPSC进行解冻

对MLPSC分批样品小瓶进行解冻。对每个批次最多2份样品进行解冻。从蒸汽相LN₂冷冻机取回样品小瓶，并且如果在≤15分钟内解冻就在干冰上运输，或者如果立即(≤1分钟)解冻就置于湿冰上。将样品小瓶置于37℃±2℃水浴中并解冻≤5分钟，从水浴中取出，用70％异丙醇喷涂或擦拭外表面并转移到生物安全柜。使用配备有16g或更大针头的10ml注射器将细胞逐滴转移到具有15ml预热培养基的50ml离心管中，并且良好混合。随后将细胞通过40μm细胞滤网并且采集在新的50ml管中。然后将细胞在250x g下在RT或2-8℃下离心8分钟。舍弃上清液，并且将细胞重悬浮于8ml培养基(3-5x 10⁶个细胞/ml靶浓度)中。轻轻磨碎细胞以确保均匀悬浮液。将0.2ml样品用于进行台盼蓝细胞计数。平均活力为≥70％。如果测试两份样品，则重复以上程序。

MLPSC预培养

将细胞以6,857个细胞/cm²池接种在最小3、优选地4x T175烧瓶中。轻轻摇动烧瓶以使细胞均匀分布，并且随后在37℃±2℃、5±2％CO₂下温育过夜至24小时。从温育器取出细胞并且在显微镜下检查以确保≥30％汇合度，并且针对可见的污染现象观察细胞形态。无菌地抽吸来自每个烧瓶的培养基并用30mL预热培养基更换。从第一天温育开始时间开始，将烧瓶在37℃±2℃、5±2％CO₂下温育总计60-84小时。

共同培养基的制备

通过添加等体积的培养基和DMEM制备共同培养基。在使用之前，将共同培养基在37℃水浴中预热最少30分钟。

对PBMC进行解冻

对合格的PBMC小瓶进行解冻。解冻的小瓶数量取决于每个小瓶的细胞总数量(基于制造商的声明)。如果>2x 10⁷个活细胞/小瓶，则仅解冻一个小瓶。从蒸汽相LN₂冷冻机取回样品一个或多个小瓶，并且如果在≤15分钟内解冻就在干冰上运输，或者如果立即(≤1分钟)解冻就置于湿冰上。将小瓶置于37℃±2℃水浴中并解冻2-3分钟，从水浴中取出，用70％异丙醇喷涂或擦拭外表面并转移到生物安全柜。使用配备有16g或更大针头的10ml注射器将细胞逐滴转移到具有20mL预热培养基的50ml离心管中，并且良好混合。用培养基冲洗小瓶并且将任何残留细胞添加到管中。随后将细胞通过40μm细胞滤网并且采集在新的50mL管中。然后将细胞在350x g下在RT或2-8℃下离心5分钟。舍弃上清液，并且将细胞重悬浮以2.5x 10⁶个细胞/ml重悬浮于共同培养基中。将0.2ml样品用于进行台盼蓝细胞计数。平均活力为≥70％。在共同培养基中制备2x 10⁶个细胞/ml的8ml PBMC(总计1.6x 10⁷个PBMC)，并且将PBMC在冰上温育，同时制备MLPSC。如果细胞计数之后总活细胞为<1.6x 10⁷，则对另一个PBMC小瓶进行解冻并且重复以上程序。

MLPSC的制备

从温育器取出间充质谱系细胞并且在显微镜下检查，以观察细胞粘附和细胞形态(长且平的成纤维细胞)。无菌地抽吸来自烧瓶的培养基，并且用9ml预热DPBS洗涤细胞。随后抽吸DPBS，并且每个烧瓶添加4ml预热的0.05％胰蛋白酶/EDTA。摇动烧瓶以进行覆盖，并且在37℃下温育3-6分钟。在温育期间轻拍烧瓶侧。在显微镜下检查细胞以确保它们完全脱离。如果未脱离，再次轻拍烧瓶。将7ml预热培养基添加到每个烧瓶以使细胞脱落。将来自烧瓶的细胞汇集到50ml锥形管中。用另外1ml的预热培养基冲洗小瓶并且将任何残留细胞添加到管中。随后将细胞在350x g下在RT或2-8℃下离心5分钟。抽吸上清液，并且将细胞重悬浮于2ml共同培养基/烧瓶中。将0.2ml样品用于进行台盼蓝细胞计数。平均活力为≥70％。在共同培养基中制备4x 10⁵个细胞/ml的1.5ml MLC(总计6x 10⁵个MPC)并搁置一旁，同时刺激PBMC。

PBMC的刺激

将5ml PBMC悬浮于转移到15ml锥形管中，并且添加20μl 1mg/ml CD3抗体储液和20μl 1mg/ml CD28抗体储液以实现4μg/ml抗CD3抗体和4μg/ml抗CD28抗体(刺激的PBMC)的最终浓度。不刺激剩余的PBMC。遵循如下所示的24孔板布局。

将500μl未刺激的PBMC(阴性对照)添加到24孔板的B2、B3、C2和C3孔中。将500μl刺激的PBMC(阳性对照)添加到B4孔和C4孔中。将500μl刺激的PBMC添加到A5、B5、C5和D5孔中。如果仅测试一个MLPSC样品，则将500μl刺激的PBMC添加到仅A5孔和B5孔中。将500μl培养扩增的MLPSC(样品1)添加到A5和B5共同培养孔中。将500μl培养扩增的MLPSC(样品2)添加到C5和D5共同培养孔中。将500μl共同培养基添加到B2、B3、B4、C2、C3和C4孔中。将所有的空孔填充1000μl共同培养基以减少蒸发损失。这些条件代表大约1个MLC:5个PMBC的比例。

将板在37℃±2℃、5±2％CO₂下温育60-84小时，并且观察形态(参见图1)。

ELISA

通过可商购获得的ELISA试剂盒，根据制造商的说明书(R&D systems)测量IL-2Rα表达。遵循制造商的方案进行ELISA。测定采用定量夹心酶免疫测定技术。测定采用包括用对于IL-2Rα特异性的单克隆抗体预涂覆的孔的微孔板。通过固定的IL-2Rα抗体捕获校准器样品、质量控制样品或共同培养样品中存在的IL-2Rα。在洗掉任何未结合的物质之后，将对于IL-2Rα特异性的酶联多克隆抗体添加到孔中。在进行洗涤步骤以去除任何未结合的酶联抗体之后，将底物溶液添加到孔中，并且颜色与结合的IL-2Rα的量成比例显色。然后终止显色，并且使用ELISA读数器测量颜色强度。以下提供ELISA的详情。

使用1000μl移液管收获每个孔中的细胞，并且转移到其相应的微离心管中。用200μl的预热DPBS冲洗孔并且将任何残留细胞添加到管中。在显微镜下观察培养板以验证细胞被完全去除。将细胞在最大rpm下在RT或2-8℃下离心90秒。抽吸上清液，并且将细胞沉淀物置于冰上，同时制备裂解缓冲液。通过将一个完整小片添加到10ml CellLytic-M细胞裂解提取试剂中来制备裂解缓冲液。对裂解缓冲液进行涡旋以混合，并在冰上储存。将250μl裂解缓冲液添加到每个管中。使用1000μl移液管将每个沉淀物重悬浮并进行涡旋。将细胞在冰上温育15分钟。然后汇集并混合一式两份的裂解液。将裂解液在最大rpm下在RT或2-8℃下离心10分钟，并且将裂解液转移到新管中，从而避免任何材料沉淀。将裂解液在≤-60℃下储存多达29天，或者在同一天进行ELIZA。如果在同一天进行ELIZA，则首先将裂解液在干冰上或在≤-60℃冷冻机处冷冻最少15分钟。

将所有样品和试剂升温至环境温度，并且在使用之前使其静置至少30分钟。将20ml浓缩洗涤缓冲液在480ml NANO水中稀释(以产生1:25稀释度)并良好混合。溶液标记为1个月有效期或试剂盒的有效期(以较早者为准)并在2-8℃下储存。在微孔板上将一式三份孔分配为标准品、对照和样品。从微孔板去除过量条带。通过将两个完整小片添加到20mlCellLytic-M试剂中来制备裂解缓冲液。对裂解缓冲液进行涡旋以混合，并在冰上储存。将1ml裂解缓冲液添加到两个IL-2Rα标准品中以产生5000pg/ml标准品。将标准品在轻轻搅动下在RT下温育最少30分钟。在温育之后，汇集每个标准品的量，并且根据以下表1和表2制备系列稀释液和对照稀释液：

表1：系列稀释液

表2：对照稀释液

根据以下表3制备未刺激样品：

表3：未刺激样品(阴性对照)

根据以下表4制备共同培养样品：

表4：共同培养样品

将100μl测定稀释剂RD1-1添加到用抗IL-2Rα单克隆抗体预涂覆的微孔板的所有孔中。将50μl标准品、对照或样品添加到适当的孔中。将多克隆抗IL-2RαHRP缀合物添加到每个孔中，并且将板在轻轻振荡下在RT下在定轨振荡器上温育覆盖3小时±20分钟。然后将板用每孔300μl洗涤缓冲液洗涤4次。在最后一次洗涤之后，通过将板浸渍到吸湿纸上来去除残留液体。在使用15分钟内，通过混合等份的试剂A和试剂B来制备底物溶液。将200μl底物溶液添加到每个孔中，将板覆盖并在黑暗中在RT下温育20±5分钟。将50μl终止溶液添加到每个孔中，并且在5至30分钟内在设定至450nm、在570nm处进行波长校准的微孔板读数器上读取每份样品的光密度(OD)。使用四参数逻辑曲线拟合构建标准曲线。每份样品中的IL-2Rα的浓度衍生自标准曲线并针对稀释度进行校准，以获得最终结果。

TNFR1表达的测量

培养基的制备

制备含有10％胎牛血清和1mM GlutaMax-I的DMEM，并且通过0.2μm过滤器过滤并标记为在2-8℃下1个月有效期。在使用之前，将培养基在37℃水浴中预热最少30分钟。

0.5％胰蛋白酶/EDTA的制备

对间充质谱系细胞进行解冻

对MLPSC分批样品小瓶进行解冻。对每个批次最多2份样品进行解冻。从蒸汽相LN₂冷冻机取回样品小瓶，并且如果在≤15分钟内解冻就在干冰上运输，或者如果立即(≤1分钟)解冻就置于湿冰上。将样品小瓶置于37℃±2℃水浴中并解冻≤5分钟，从水浴中取出，用70％异丙醇喷涂或擦拭外表面并转移到生物安全柜。使用配备有16g或更大针头的10ml注射器将2ml细胞逐滴转移到具有8mL预热培养基的50ml离心管中，并且良好混合。随后将细胞通过40μm细胞滤网并且采集在新的50mL管中。然后将细胞在250x g下在RT或2-8℃下离心5分钟。舍弃上清液，并且将细胞重悬浮于5mL培养基(3-5x 10⁶个细胞/mL靶浓度)中。轻轻磨碎细胞以确保均匀悬浮液。将0.2ml样品用于进行台盼蓝细胞计数。平均活力为≥70％。如果测试两份样品，则重复以上程序。

ELISA

通过可商购获得的ELISA试剂盒Quantikine，根据制造商的说明书(R&D systems)测量TNFRI表达。遵循制造商的方案进行ELISA。此测定提供可溶性以及细胞缔合的TNFRI的测量(Qjwang等人,1997)。测定采用定量夹心酶免疫测定技术。测定采用包括用对于TNFRI特异性的单克隆抗体预涂覆的孔的微孔板。通过固定的TNFRI抗体捕获校准器样品、质量控制样品或MPC细胞裂解液的样品中存在的TNFRI。在洗掉任何未结合的物质之后，将对于TNFRI特异性的酶联多克隆抗体添加到孔中。在进行洗涤步骤以去除任何未结合的酶联抗体之后，将底物溶液添加到孔中，并且颜色与结合的TNFRI的量成比例显色。然后终止显色，并且使用ELISA读数器测量颜色强度。

以下提供ELISA的详情。

将细胞在250x g下在RT或2-8℃下离心5分钟。抽吸上清液，并且将细胞沉淀物置于冰上，同时制备裂解缓冲液。通过将两个完整小片添加到20ml CellLytic-M细胞裂解提取试剂中来制备裂解缓冲液。对裂解缓冲液进行涡旋以混合，并在冰上储存。添加裂解缓冲液。使用1000μl移液管将每个沉淀物重悬浮并进行涡旋。将细胞在冰上温育10-15分钟并且每5分钟涡旋一次。然后汇集一式两份裂解液，混合并且转移至一个或多个2ml微离心管。将裂解液在最大rpm下在2-8℃下离心10分钟，并且将裂解液转移到新管中，从而避免任何材料沉淀。将裂解液在≤-60℃下储存多达29天，或者在同一天进行ELIZA。如果在同一天进行ELIZA，则首先将裂解液在干冰上或在≤-60℃冷冻机处冷冻最少1小时。

将所有样品和试剂升温至环境温度，并且在使用之前使其静置至少30分钟。将20ml浓缩洗涤缓冲液在480ml NANO水中稀释(以产生1:25稀释度)并良好混合。溶液标记为1个月有效期或试剂盒的有效期(以较早者为准)并在2-8℃下储存。在微孔板上将一式三份孔分配为标准品、对照和样品。从微孔板去除过量条带。通过将两个完整小片添加到20mlCellLytic-M试剂中来制备裂解缓冲液。对裂解缓冲液进行涡旋以混合，并在冰上储存。将0.5ml裂解缓冲液添加到sTNFR1标准品中以产生5000pg/ml标准品。将标准品在轻轻搅动下在RT下温育最少15分钟。在温育之后，根据以下表5和表6制备系列稀释液和对照稀释液：

表5：系列稀释液

表6：对照稀释液

根据以下表7制备样品：

表7：样品

将50μl测定稀释剂HD1-7添加到用抗TNFR1单克隆抗体预涂覆的微孔板的所有孔中。将200μl标准品、对照或样品添加到适当的孔中。将板覆盖并且在轻轻振荡下在RT下在定轨振荡器上温育2小时±10分钟。然后将板用每孔300μl洗涤缓冲液洗涤3次。在最后一次洗涤之后，通过将板浸渍到吸湿纸上来去除残留液体。将多克隆抗TNFR1 HRP缀合物添加到每个孔中，并且将板在轻轻振荡下在RT下在定轨振荡器上温育覆盖2小时±10分钟。然后将板用每孔300μl洗涤缓冲液洗涤3次。在最后一次洗涤之后，通过将板浸渍到吸湿纸上来去除残留液体。在使用15分钟内，通过混合等份的试剂A和试剂B来制备底物溶液。将200μl底物溶液添加到每个孔中，将板覆盖并在黑暗中在RT下温育20±10分钟。将50μl终止溶液添加到每个孔中，并且在5至30分钟内在设定至450nm、在570nm处进行波长校准的微孔板读数器上读取每份样品的光密度(OD)。使用四参数逻辑曲线拟合构建标准曲线。每份样品中的TNFR1的浓度衍生自标准曲线并针对稀释度进行校准，以获得最终结果。

统计学分析

在第28天将对用MSC或MPC进行的治疗的急性GVHD(aGVHD)的应答的客观评定确定为总有效率。为了呈现aGVHD器官阶段的变化，将每个器官的从基线至第28天的应答数据分类为完全应答、部分应答、恶化或稳定。

为了评估应答对于总体存活率的影响，进行两个Kaplan-Meier存活率分析，直至第100天。在第28天对实现总体应答(完全应答或部分应答)的患者生成一个Kaplan-Meier曲线，并且在第28天针对非应答者生成另一个Kaplan-Meier曲线。使用商业软件，用时序检验(log-rank test)测试2组之间总体存活率的无差异的零假设。所述测试在p<0.05的显著水平下进行。

分类变量概括为评率和百分比。使用描述性统计(数值、平均值、标准偏差、中值和范围)概括连续变量。所有的置信区间具有95％置信水平。

实施例2：具有增强的免疫抑制特性的免疫选择的间充质谱系前体或干细胞

通过与通过先前制造方法(如US 9,828,586中所述)获得的产品进行比较来评定免疫选择的间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)的免疫抑制潜力。在图2中示出在先前制造条件下产生的三种不同的MLPSC样品(即，样品MLPSC A、MLPSC B和MLPSC C)和与之相比的三种不同的改善的免疫选择的MLPSC样品(即，样品MLPSC D、MLPSC E和MLPSC F)上进行的T细胞增殖测定(IL2R的抑制％)的结果。这些结果显示，所述测定在抑制T细胞增殖的能力方面在第一类多能谱系细胞与第二类多能谱系细胞之间进行区分。具体地，第二类细胞比第一类明显更有效地抑制T细胞增殖。

相比之下，如图3所示的TNFR1表达测定的结果显示相同的两类间充质谱系前体或干细胞之间没有显著差异。TNFR1表达先前已被描述为鉴定抑制T细胞增殖的细胞的标记物(参见US20140248244)。

图2和图3中本文呈现的结果显示，可以产生具有增强的抑制T细胞增殖的能力的改善的间充质谱系前体或干细胞群体。这些改善的间充质谱系前体或干细胞群体是表达高水平的TNFR1的细胞子集。换言之，TNFR1表达可以与某些间充质谱系前体或干细胞群体的T细胞抑制特性分开。鉴于冻存的间充质干细胞在解冻之后表现出受损的免疫抑制特性的常规认知(Francois等人,2012；Chinnadurai等人,2016)，可以产生甚至在冻存和解冻之后表现出增强的抑制T细胞增殖的能力的间充质谱系前体或干细胞群体的事实是特别令人意外的。

实施例3：实施例4：针对类固醇难治性的儿科受试者的治疗输注的具有低IL-2R抑制的间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)

此研究是针对对于急性移植物抗宿主病(GVHD)进行的类固醇治疗没有应答的儿科受试者的治疗。急性GVHD治疗失败被定义为在至少3天的甲泼尼龙(≥1mg/kg/天)或等效物之后没有改善的任何等级B-D的急性GVHD(IBMTR分级)。

每周两次，以2x 10⁶个hMSC/kg(实际体重)的剂量用具有低IL-2R抑制的离体培养的MLPSC治疗患者，持续连续4周，每周进行。至少间隔3天施用输注。

研究设计：

募集241名经历HSCT的儿科患者，并且从2007-2014在北美和欧洲的50个地点进行治疗

年龄2个月–17岁

急性GvHD等级B-D(CIBMTR)

类固醇治疗和多种其他药剂失败

至少3天的甲泼尼龙(至少1mg/kg/天或等效物)之后没有改善的aGVHD

结果：

在EAP下的241名儿童中，在第28天的总体应答(CR+PR)为65％(95％CI:58.9％,70.9％)。100天存活率与总体应答相关，并且在第28天具有应答的那些儿童中显著改善(82％相对于39％，p<0.0001)

实施例4：针对类固醇难治性的儿科受试者的治疗输注的具有高IL-2R抑制的间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)(低剂量)

研究目标

主要目标在于收集在同种异体HSCT之后对类固醇治疗没有应答的患有等级B-DaGVHD的受试者中静脉内施用的重复剂量的具有高IL-2R抑制的MLPSC的安全性的信息，并且评估在同种异体HSCT之后对类固醇治疗没有应答的患有等级B-D aGVHD的受试者中静脉内施用的重复剂量的MPC的效率。

研究的第二目标在于确定第28天对MPC的应答与第100天的存活率之间的相关性。

治疗计划

每周一次以2x 10⁶个MPC/kg(筛选时的体重)^*的剂量用静脉内(IV)MPC治疗儿科受试者，持续连续4周，每周进行。

如果合格，受试者可以在初始四个剂量之后接受1x 10⁶个MPC/kg的降低剂量的额外4个每周一次MPC输注。接受额外疗法的资格取决于受试者的在第28天进行的急性GVHD(aGVHD)应答评定(部分或混合)。

受试者最多接受八次输注。

急性GVDH评定

在筛选时、第14天、第28天、第56天和第100天/研究结束时进行。

受试者人口统计

在七个移植中心处治疗十二(12)名受试者。六名受试者在FedHutchinson癌症研究中心处进行治疗，剩余的受试者各自在不同的移植中心处进行治疗(如表10中所示)。

所有的受试者小于18岁，范围在3岁与17岁之间。平均年龄为10.3岁，并且中值年龄为10.5岁。

有资格参与试验的受试者必须在同种异体造血干细胞植入(HSCT)之后对于针对等级B至D急性GVHD(aGVHD)的类固醇治疗没有应答。对于急性GVHD的类固醇治疗没有应答被定义为在至少三(3)天的甲泼尼龙(>1mg/kg/天)或等效物之后没有改善的任何等级B-D的急性GVHD。

所有的受试者患有内脏器官疾病，包括下胃肠道(GI)和/或肝脏。九命受试者仅具有下GI(8名具有等级D，1名具有等级B)；一名受试者具有等级C下GI和等级D肝脏；一名受试者具有等级B上GI和等级C下GI；并且一名受试者具有等级C肝脏。

在基线处，十二名受试者中的九名(9/12或75％)具有等级D移植物抗宿主病(GVHD)，十二名受试者中的两名(2/12或17％)具有等级C GVHD，并且一名受试者(1/12或18％)具有等级B GVHD。

受试者在MPC治疗之前用平均4.5GVHD疗法治疗，包括以下非类固醇疗法：体外光分离置换疗法(ECP；7名受试者)，英夫利西(5名受试者)，鲁索替尼(3名受试者)，霉酚酸(MMF；3名受试者)，依那西普(1名受试者)或巴利昔单抗(1名受试者)。

基于筛选时的受试者的体重，以2x 10⁶个细胞/kg的剂量静脉内(IV)治疗受试者。每周一次(qw)向受试者递送细胞，持续4周，每周进行。

合格的受试者在初始四个剂量之后接受1x 10⁶个细胞/kg的降低剂量的额外4个每周一次细胞输注。接受额外疗法的资格取决于受试者的在第28天进行的急性GVHD(aGVHD)应答评定(部分或混合)。受试者最多接受八次输注。

在筛选时、第14天、第28天、第56天和第100天(研究结束时)进行GVHD评定。

对治疗的应答和直至100天的存活率

对用具有高IL-2R抑制的MLPSC进行的治疗(每周一次施用2x10⁶个MPC/kg体重)的应答和受试者的存活率在以下表9中总结。在接受细胞输注之后在筛选时(第0天)、第14天、第28天、第56天和第100天进行GVHD评定。用于计算细胞给药的体重是基于筛选时受试者的体重。

十二名受试者中的十名(10/12)(83％)存活至第100天，其中七名接受八次输注，并且三名接受四次输注。所有的12名受试者具有下GI和/或肝脏GVHD，其中9/12名受试者(75％)在基线处具有等级D GVHD，并且仅1名受试者(8％)在基线处具有等级B GVHD。具有急性GVHD的先前治疗的平均值为4.25。

表9：至第100天的受试者的GVHD评定

CR＝完全应答

PR＝部分应答

图4以图形示出应答者相对于非应答者的至100天的存活率，其中针对从第一研究治疗开始的存活天数在Y轴中示出存活率，其中第0天为基线。第28天的所有九命应答者存活至第100天。相比之下，第28天三名非应答者中的一名存活至第28天(即75％相对于8％)。

结果示出第28天的总体应答率(即，完全和部分应答率)为75％。这比在输注MSC之后所见的平均总体应答率高。此外，第28天所见的应答率为第100天的总体存活率的强预测因子(参见表9)。

值得注意的是，在输注具有高IL-2R抑制的MLPSC之后没有观察到鉴定的安全性问题。

对于具有高IL-2R抑制的MLPSC进行的治疗的应答和个体受试者的存活率在以下提供的表10中示出。

表10：受试者的GVHD评定

CR＝完全应答

PR＝部分应答

在治疗的患者中没有鉴定出安全性问题，并且GI道疾病的初步研究展示75％的总体应答率(表1)。在输注具有高IL-2R抑制的MLPSC之后第28天具有应答的受试者中，100％存活至第100天。这指示第28天应答指示持久性的有意义的应答，并且与第100天的存活率相关。

因此，结果显示，可以在以每周一次剂量接受具有高IL-2R抑制的MLPSC(在此情况下，MPC)的受试者中实现相当的(如果不是更优异的话)应答率，所述剂量是施用具有低IL-2R抑制的MLPSC时所需的每周两次2x 10⁶个细胞/kg体重剂量的一半(参见以上比较例3)。

实施例5改善的MSC制造方法

鉴于在用表现出高IL-2R抑制的MLPSC进行的GvHD治疗中获得的更优异结果(如实施例4中所述)，对用于由使用塑料粘附技术分离的干细胞产生高效力MLPSC的方法进行研究。

用于由使用塑料粘附技术分离的细胞产生MLPSC的先前制造方法在US 9,828,586描述。在此先前制造方法中引入以下所述数量的变化。令人意外的是，此改善的制造方法(以下所述)使得生成具有增强的免疫抑制特征的MLPSC。

设备变化

一个设备变化涉及用于洗涤、转移和浓缩细胞的方法。先前的方法在方法的若干不同步骤中针对这些活动使用Cytomate细胞处理器(Baxter)。这件设备是具有相关联的一次性物品的台式装置，其最初被设计用于洗涤、浓缩和转移白细胞。在先前的方法中，Cytomate用于将细胞接种到培养容器(细胞工厂)中，并且在收获时其用于通过体积减少来洗涤并浓缩细胞。在新方法中，用于细胞接种(注射器树)和细胞洗涤和浓缩步骤(切向流过滤(TFF))的程序替换Cytomate。

处理和测试的其他变化

还在改善的制造方法中实施ceMSC产物的制造和测试的以下方面。

·使用在灭菌之前附接(预组装)空气过滤器的细胞工厂降低无菌处理风险。

·引入在酵母中产生的重组胰蛋白酶的使用消除猪胰蛋白酶的使用，以使来自动物来源外源性物质(诸如细小病毒和圆环病毒)的风险最小化。这需要胰蛋白酶温育时间以及在此步骤中使用的细胞和溶液的变化。

·引入血液过滤器的使用来减小/最小化细胞聚集和可见的颗粒物质的可能性。

·引入使用冷冻瓶作为最终容器和4.3mL填充体积而非冷冻袋和15mL填充体积。维持与先前方法相同的细胞/mL的浓度，但是替代一个冷冻袋，将相等数量的细胞分到四个小瓶中。

对解冻之后最终产物中冻存细胞的样品进行所有的最终产物测试。在先前的方法中，对不代表最终容器的管中储存的细胞等分式样进行一些测试。图5示出从供体细胞库(DCB)的解冻到ce-MSC产物的冻存和测试的所有步骤。

实施例6-测试通过改善的制造方法获得的MLPSC产物

针对以下表8中所列出的释放准则测试根据实施例5中所述的改善的制造方法制造的MLPSC最终产物批次：

表8

表8示出由所有所测试的产物批次进行的一致高水平的TNFR1。如图6所示，每个产物批次示出>275pg/ml的TNFR1表达。

表8还示出由所测试的10个产物批次进行的意料之外高水平的IL-2Ra表达抑制。如图7所示，每个产物批次示出80％或更高的抑制水平。

参考文献

Ausubel，F.M.(Ed.).(1987 including all updates untill present).CurrentProtocols in Molecular Biology.New York：John Wiley&Sons.

Brown，T.A.(Ed.).(1991).Essential Molecular Biology：A PracticalApproach(Vol.1 and 2).

Oxford：IRL Press at Oxford University Press.

Buchschacher&Panganiban(1992).Journal of Virology，2731-2739.

Burns et al.，(1993).Proceedings of the National Academy of SciencesUSA，8033-8037.

Carter(1992).Current Opinion in Biotechnology，533-539.

Chinnadurai et al.，(2016).Translational and Clinical Research，34(9)，2429-2442.

Coligan，J.E.，Kruisbeek，A.M.，Margulies，D.H.，Shevach，E.M.，&Strober，W.(Eds.).(1991including all updates until present).Current Protocols inImmunology.New York：John Wiley&Sons.

Fisher-Hoch et al.，(1989).Proceedings of the National Academy ofSciences USA，56，317-321.

Francois et al.，(2012).Cytotherapy，14(2)，147-152.

Glover，M.，&Hames，B.D.(Eds.).(1995 and 1996).DNA Cloning：A PracticalApproach(Vols.1-4).

Gronthos(2003).Journal of Cell Science，116(Pt 9)，1827-1835.

Gronthos&Simmons(1995).Blood，85(4)，929-940.

Harlow，E.，&Lane，D.(1988).Antibodies：A Laboratory Manual.New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press.

Johann et al.，(1992).Journal of Virology，65，1635-1640.

Kotin(1994).Human Gene Therapy，793-801.

Lebkowski et al.，(1988).Molecular and Cellular Biology，3988-3996.

Miller(1990).Human Gene Therapy，7，5-14.

Miller&Rosman(1989).Biotechniques，7，980-990.

Miller et al.，(1991).Journal of Virology，65，2220-2224.

Muzyczka(1992).Current Topics in Microbiology and Immunology，158，97-129.

Perbal，B.V.(1984).A Practical Guide to Molecular Cloning.New York：Wiley.

Qjwang et al.，Biochemistry(1997)36，6033.

Sambrook，J.，&Green，M.R.(2012).Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Fourth Edition).New York：Cold Spring Harbour Laboratory Press.

Scarpa et al.，(1991).Virology，75，849-852.

Schwartz et al.，(2001).Nature 410，604-608.

Schwartz et al.，(2002).Nature Immunol.3，427-434.

Sommerfelt&Weiss(1990).Virology，76，58-59.

Vincent et al.，(1990).Vaccine，353-359.

Wilson et al.，(1989).Journal of Virology，63，2374-2378.

Zannettino et al.，(1998).Blood，92(8)，2613-2628.

Zhang et al.，(2004).Immunity，20，337-347.

Claims

1.一种组合物，其包含间充质谱系前体或干细胞，其中所述间充质谱系前体或干细胞是冻存的，并且在解冻之后使PBMC样品中活化T细胞的增殖抑制至少约65％。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述活化T细胞的增殖的抑制通过所述活化T细胞中IL-2R 2Rα表达的抑制来测量。

3.如权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中间充质谱系前体或干细胞与PMBC以1个间充质谱系前体或干细胞:5个PMBC或更小比例的共同温育使T细胞增殖抑制至少约65％。

4.如权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中间充质谱系前体或干细胞与PMBC以1个间充质谱系前体或干细胞:10个PMBC或更小比例的共同温育使T细胞增殖抑制至少约65％。

5.如权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中间充质谱系前体或干细胞与PMBC以1个间充质谱系前体干细胞:50个PMBC或更小比例的共同温育使T细胞增殖抑制至少约65％。

6.如权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中间充质谱系干细胞与PBMC以1个间充质谱系前体或干细胞:100个PBMC或更小比例的共同温育使T细胞增殖抑制至少约65％。

7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中间充质谱系前体或干细胞与PMBC以1个间充质谱系前体或干细胞:5个PMBC或更小比例的共同温育使T细胞增殖抑制至少约70％。

8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中间充质谱系前体或干细胞与PMBC以1个间充质谱系前体或干细胞:5个PMBC或更小比例的共同温育使T细胞增殖抑制至少约80％。

9.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述间充质谱系前体或干细胞以至少270pg/ml的量表达TNFR1。

10.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述间充质谱系前体或干细胞以至少300pg/ml的量表达TNFR1。

11.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述间充质谱系前体或干细胞以至少320pg/ml的量表达TNFR1。

12.如权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述间充质谱系前体或干细胞通过免疫选择分离。

13.如权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述间充质谱系前体或干细胞是培养扩增的间充质干细胞。

14.一种治疗有需要的受试者的炎性病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1至13中任一项所述的包含间充质谱系前体或干细胞的组合物。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述炎性病症是T细胞介导的炎性病症。

16.一种预防受试者的移植物抗宿主病(GVHD)、缓解移植物抗宿主病的发展或治疗移植物抗宿主病的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1至13中任一项所述的包含间充质谱系前体或干细胞的组合物。

17.如权利要求14至16中任一项所述的方法，其中每周一次(qw)向所述受试者施用小于3x 10⁶个细胞/kg体重的剂量的所述组合物。

18.如权利要求14至17中任一项所述的方法，其中qw向所述受试者施用约2x 10⁶个细胞/kg体重的剂量的所述组合物。

19.如权利要求14至18中任一项所述的方法，其中qw向所述受试者施用最大2x 10⁶个细胞/kg体重的剂量的所述组合物。

20.如权利要求14至19中任一项所述的方法，其中所述组合物作为单一剂量或作为一个或多个分开剂量施用。

21.一种用于预防哺乳动物受试者的移植物抗宿主病(GVHD)、缓解移植物抗宿主病的发展或治疗移植物抗宿主病的方法，所述方法包括每周一次(qw)向所述受试者施用小于3x10⁶个MPC/kg体重的剂量的间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)和/或其子代细胞。

22.如权利要求21所述的方法，其中qw向所述受试者施用约2x 10⁶个细胞/kg体重的剂量的MLPSC和/或其子代细胞。

23.如权利要求21或22所述的方法，其中qw向所述受试者施用最大2x 10⁶个细胞/kg体重的剂量的MLPSC和/或其子代细胞。

24.如权利要求14至23中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是儿科人受试者。

25.如权利要求14至24中任一项所述的方法，其中所述受试者患有恶性或遗传性血液病症。

26.如权利要求14至25中任一项所述的方法，其中所述受试者已接受、正在接受或将要接受包含造血细胞的供体移植物。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述移植物包含造血干细胞(HSC)。

28.如权利要求26或27中任一项所述的方法，其中所述移植物包含同种异体造血细胞。

29.如权利要求14至28中任一项所述的方法，其中所述MLPSC是间充质前体细胞(MPC)。

30.如权利要求14至28中任一项所述的方法，其中所述MLPSC和/或其子代细胞在植入所述移植物的当天开始施用。

31.如权利要求14至28中任一项所述的方法，其中所述MLPSC和/或其子代细胞在所述受试者已被确定为类固醇难治性之后施用。

32.如权利要求14和30中任一项所述的方法，其中所述受试者患有急性GVHD。

33.如权利要求14至31中任一项所述的方法，其中所述细胞以药学上可接受的组合物的形式施用。