ES2651503T3 - Método para tratar o prevenir una disfunción pancreática - Google Patents

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Abstract

Células STRO-1+ para uso en el tratamiento de la diabetes mellitus en un sujeto que lo necesite

Description

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DESCRIPCION
Metodo para tratar o prevenir una disfuncion pancreatica CAMPO DE LA INVENCION
La presente invencion se refiere en general a celulas STRO-1 + para uso en un metodo para mejorar la funcion pancreatica en un sujeto que lo necesite.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
El pancreas es un organo glandula multifuncional en el sistema digestivo y endocrino de los vertebrados. Es una glandula endocrina (que produce varias hormonas, incluida la insulina, glucagon y somatostatina) y una glandula exocrina (que secreta jugo pancreatico que contiene enzimas digestivas que pasan al intestino delgado). Las enzimas en el jugo pancreatico ayudan en la descomposicion de los carbohidratos, las protemas y las grasas en el quimo.
La parte del pancreas con funcion endocrina esta formada por numerosos grupos celulares llamados islotes de Langerhans. Hay cuatro tipos principales de celulas en los islotes clasificados por su secrecion: las celulas a secretan glucagon, las celulas p secretan insulina, las celulas 8 secretan somatostatina y las celulas PP secretan polipeptido pancreatico. Los islotes son una coleccion compacta de celulas endocrinas dispuestas en grupos y cordones y tambien contienen una red de capilares. Los capilares de los islotes estan revestidos por capas de celulas endocrinas en contacto directo con los vasos, y la mayona de las celulas endocrinas estan en contacto directo con los vasos sangumeos, ya sea por procesos citoplasmicos o por aposicion directa.
En contraste con el pancreas endocrino, que secreta hormonas en la sangre, el pancreas exocrino produce enzimas digestivas (por ejemplo, tripsinogeno, quimiotripsinogeno, elastasa, carboxipeptidasa, lipasa pancreatica y amilasa) y un lfquido alcalino, y la secreta al intestino delgado a traves de un sistema de conductos exocrinos en respuesta a las hormonas del intestino delgado secretina y colecistocinina. Las celulas acinares del pancreas exocrino producen y secretan enzimas digestivas. Las celulas espedficas que recubren los conductos pancreaticos, llamadas celulas centroacinadas, secretan una solucion rica en sal y bicarbonato en el intestino delgado.
La disfuncion pancreatica puede conducir a la produccion excesiva o insuficiente de hormonas y/o enzimas producidas por el pancreas. Las condiciones asociadas con o causadas por la disfuncion pancreatica incluyen diabetes mellitus, pancreatitis aguda o cronica, deficiencia de la enzima pancreatica o tumor pancreatico.
La diabetes mellitus (DM) es uno de los trastornos endocrinos cronicos mas comunes en todos los grupos de edad y poblaciones, y es causada por la disfuncion pancreatica. La DM afecta a mas de 100 millones de personas en todo el mundo. Solo en los Estados Unidos, hay mas de 12 millones de personas diagnosticadas con DM, con 600.000 nuevos casos diagnosticados cada ano.
DM es un termino de diagnostico para un grupo de trastornos caracterizados por una homeostasis o metabolismo anormal de carbohidratos (por ejemplo, glucosa) que da como resultado un nivel elevado de azucar en la sangre. Estos trastornos comprenden varios componentes metabolicos, vasculares y neuropaticos interrelacionados. Diversos componentes de la DM son causados por funciones endocrinas y/o exocrinas del pancreas. Por ejemplo, el componente metabolico, generalmente caracterizado por hiperglucemia, comprende alteraciones en el metabolismo de carbohidratos, grasas y protemas causadas por la secrecion ausente o marcadamente reducida de hormonas, particularmente insulina (es decir, funcion endocrina) y/o accion de insulina ineficaz. A nivel exocrino, el pancreas produce diversas enzimas que intervienen en la digestion de los alimentos. Por ejemplo, el pancreas produce amilasa y en la DM puede secretar niveles insuficientes de esta enzima para digerir los carbohidratos que conducen a insuficiencia pancreatica exocrina, desnutricion y perdida de peso. En consecuencia, tanto las funciones endocrinas como las exocrinas del pancreas contribuyen a los componentes metabolicos de la DM. El componente vascular de la DM comprende anormalidades en los vasos sangumeos que conducen a complicaciones cardiovasculares, retinianas y renales. Las anomalfas en los sistemas nerviosos periferico y autonomo tambien son componentes de la DM.
La DM generalmente es causada por una reduccion en la cantidad o insulina circulante y/o una reduccion en la capacidad de respuesta de las celulas en un sujeto a la insulina. La insulina es esencial en el metabolismo de carbohidratos, grasas y protemas. La insulina reduce los niveles de glucosa en sangre al permitir que la glucosa entre en las celulas musculares y en las celulas adiposas y al estimular la conversion de glucosa en glucogeno (glucogenesis) como un deposito de carbohidratos. La insulina tambien inhibe la liberacion de glucosa almacenada del glucogeno hepatico (glucogenolisis) y retarda la descomposicion de la grasa en trigliceridos, acidos grasos libres y cetonas. Ademas, la insulina retarda la descomposicion de la protema para la produccion de glucosa (gluconeogenesis). La insulina es producida y secretada por las celulas p en los islotes de Langerhans del pancreas.
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Hay varios tipos de diabetes, incluida la Tipo I (tambien conocida como diabetes mellitus insulinodependiente o IDDM) y Tipo II (tambien conocida como diabetes mellitus no insulinodependiente o NIDDM), diabetes gestacional y prediabetes (o alteracion del metabolismo de la glucosa). De estos, las dos formas mas comunes de diabetes son diabetes Tipo I y Tipo II. La diabetes tipo I (o diabetes mellitus insulinodependiente, IDDM) es causada por la ausencia, destruccion o perdida de celulas p pancreaticas que resulta en una deficiencia absoluta de insulina. La diabetes tipo II (diabetes no dependiente de insulina, NIDDM) es un trastorno heterogeneo que se caracteriza por resistencia a la insulina.
Diabetes tipo I
La incidencia general de diabetes tipo I es de aproximadamente 15 casos por cada 100.000 individuos solo en los Estados Unidos. Aproximadamente, del 5 al 15 por ciento de todos los casos de diabetes son casos de diabetes tipo I en los Estados Unidos, con medicos que diagnostican alrededor de 10.000 nuevos casos cada ano. A nivel internacional, la incidencia de la diabetes tipo I vana de aproximadamente 0,61 casos por 100.000 personas en China a aproximadamente 34,5 casos por 100.000 en Cerdena, y mas de 40 casos por 100.000 en Finlandia. Muchos pafses tambien informan que la rata de incidencia de diabetes tipo I se ha duplicado en los ultimos 20 anos.
El inicio clmico agudo de la diabetes tipo I se caracteriza por smtomas tales como hiperglucemia, poliuria, polidipsia, perdida de peso o vision borrosa, solos o en combinacion, seguidos de dfas o semanas despues por cetoacidosis. En general, se considera que el inicio agudo de la enfermedad esta precedido por un penodo preclmico largo y asintomatico, durante el cual las celulas p secretoras de insulina son progresivamente destruidas por el sistema inmune del sujeto.
En individuos sanos, el pancreas normalmente contiene de 1 a 1.5 millones de islotes; y aproximadamente el 80 por ciento de las celulas de los islotes son celulas p productoras de insulina. Los smtomas de la diabetes clmica aparecen cuando quedan menos del 10 por ciento de esas celulas beta.
El desequilibrio entre el suministro y la demanda de insulina causada por la perdida de celulas p pancreaticas conduce a un metabolismo anormal de glucosa, lfpidos y protemas. La deficiencia de insulina puede conducir a hiperglucemia y deshidratacion hiperglucemica, niveles elevados de acidos grasos libres, niveles elevados de cetonas en suero, niveles elevados de trigliceridos, aumento de niveles de lipoprotemas de muy baja densidad (VLDLs), aumento de los niveles de aminoacidos de cadena ramificada, disminucion de smtesis de protemas y cetoacidosis. Es probable que un sujeto con diabetes tipo I sufra una o mas de una variedad de complicaciones vasculares y neurologicas. Por ejemplo, los pacientes con diabetes tipo I tienen dos veces mas probabilidades de sufrir un ataque cardfaco que los no diabeticos; tienen cinco veces mas probabilidades de padecer gangrena; diecisiete veces mas probabilidades de tener insuficiencia renal completa y veinticinco veces mas probabilidades de perder la vista.
Tratamiento/profilaxis de la diabetes tipo 1
Actualmente, la diabetes tipo I se trata mediante la administracion de insulina exogena, el ejercicio y el manejo dietetico. Estas formas de terapia no corrigen el dano al pancreas (es decir, reemplazar las celulas p del islote destruidas), sino que reemplazan los factores de crecimiento producidos por las celulas p del islote o intentan evitar el requisito de estos factores.
La mayona de los sujetos que padecen diabetes tipo I requieren algun tipo de terapia con insulina. En este momento, dicha terapia generalmente requiere que el sujeto controle los niveles de glucosa y/o insulina en la sangre e inyecte insulina recombinante o purificada cuando sea necesario. Tambien se estan desarrollando nuevas formas de insulina para permitir la administracion nasal u oral. Sin embargo, esta forma de terapia requiere una vigilancia continua por parte del sujeto y la administracion de insulina al menos una vez al dfa durante la vida del sujeto. Si el sujeto no administra insulina o administra demasiada insulina, existe el riesgo de desarrollar, por ejemplo, hiperglucemia, hipoglucemia o cetoacidosis.
Los compuestos adicionales usados actualmente para el tratamiento de la diabetes tipo I incluyen, por ejemplo, sulfonilurea, biguanida, inhibidor de a-glucosidasa o tiazolidinadiona. Sin embargo, cada uno de estos compuestos tambien tiene desventajas significativas. Por ejemplo, la sulfonilurea causa hipoglucemia e hiperinsulinemia; la biguanida causa acidosis lactica; el inhibidor de a-glucosidasa causa efectos secundarios gastrointestinales; y la tiazolidinadiona tiene un inicio de accion prolongado, se asocia con aumento de peso y requiere pruebas frecuentes de la funcion hepatica.
El peptido-1 similar al glucagon (GLP-1) tambien se ha identificado como un posible agente terapeutico para la diabetes. Este peptido induce la expresion del factor 1 homeobox pancreatico y duodenal (PDX-1), un factor de transcripcion que desempena un papel significativo en el desarrollo del pancreas, diferenciacion de celulas beta y mantenimiento de la funcion de las celulas beta (Babu et al., Mol Endocrinol. 20:3133-3145, 2006). PDX-1 esta involucrado en la induccion de la expresion de glucosa y el metabolismo, como GLUT2, glucocinasa e insulina. El GLP-1 ha sido sugerido como un potencial terapeutico porque puede inducir la expansion de celulas beta
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pancreaticas en un sujeto, ademas de estimular la expresion de insulina (Buteau, Diabetes and Metabolism, 34: S73- S77, 2008). Sin embargo, el uso de agentes disponibles clmicamente que aumentan la disponibilidad intracelular de GLP-1, como los inhibidores de la dipeptidil peptidasa-4 (DPPIV) o los analogos inyectables de GLP-1, se ha limitado al tratamiento de formas leves de diabetes tipo II. La vida media relativamente corta de estos agentes, su necesidad de administracion frecuente y su relativa falta de potencia en casos de perdida grave de celulas beta han impedido su uso como agentes moderadores de insulina para la diabetes tipo I u otros pacientes insulinodependientes. Incluso los analogos de GLP-1 disponibles por via oral tienen una vida media corta y requieren una administracion diaria en altas dosis.
Otras opciones terapeuticas incluyen el trasplante de islote pancreatico de Langerhans, que se ha demostrado que reduce la dependencia de la insulina (Shapiro et al., New Eng. J. Med., 343:230-238, 2000). Sin embargo, la aplicacion de este tratamiento esta restringida por la muy limitada disponibilidad de islotes humanos primarios de donantes, que deben tener un corazon latiente para asegurar la supervivencia celular durante el trasplante (Burns et al., J. Endocrinology, 103: 437-443, 2004)
Las celulas madre, por ejemplo, celulas madre embrionarias (ES) tambien se han propuesto como una fuente adecuada para la produccion de cantidades terapeuticamente relevantes de celulas productoras de insulina. Sin embargo, las celulas p secretoras de insulina no se han producido a partir de celulas madre, y menos al nivel requerido, se estima en 2-4x109 celulas p por trasplante. Dichas terapias con base en celulas tambien deben superar tales dificultades, como que la capacidad proliferativa de las celulas de reemplazo debe controlarse estrechamente para garantizar que no se expandan hasta causar hiperinsulinemia o hipoglucemia, y las celulas trasplantadas deben evitar la destruccion por parte del sistema inmune del receptor. Ademas, en el caso de las terapias con base en celulas ES, cualquier celula ES restante debe ser eliminada para evitar el riesgo de formacion de teratoma.
Diabetes tipo II
La diabetes tipo II representa aproximadamente el 90-95% de los casos de diabetes y mata a unas 193.000 personas por ano solo en los Estados Unidos. La diabetes tipo II es la septima causa principal de todas las muertes. En las sociedades occidentales, la diabetes tipo II afecta actualmente al 6% de la poblacion adulta con una frecuencia mundial que se espera que crezca un 6% por ano. A pesar de que hay ciertos rasgos heredados que pueden predisponer a individuos a desarrollar diabetes tipo II, la principal causa del aumento actual en la incidencia de la enfermedad es el aumento del estilo de vida sedentario, la dieta y la obesidad que prevalecen actualmente en los pafses desarrollados. La diabetes tipo II ahora es reconocida internacionalmente como una de las principales amenazas para la salud humana.
La diabetes tipo II se desarrolla cuando las celulas musculares, adiposas y hepaticas no responden normalmente a la insulina. Esta falta de respuesta (llamada resistencia a la insulina) puede deberse a un numero reducido de receptores de insulina en estas celulas, o una disfuncion de las vfas de senalizacion dentro de las celulas, o ambas. Las celulas p inicialmente compensan esta resistencia a la insulina al aumentar su produccion de insulina. Con el tiempo, estas celulas se vuelven incapaces de producir suficiente insulina para mantener niveles normales de glucosa, lo que indica progresion a diabetes tipo II (Kahn et al, Am. J. Med. 108: 2S-8S). , 2000)
Tratamiento de diabetes tipo II
Los tratamientos convencionales para la diabetes tipo II son muy limitados y se centran en intentar controlar los niveles de glucosa en sangre para minimizar o retrasar las complicaciones. Los tratamientos actuales se dirigen a la resistencia a la insulina (metformina, tiazolidinadionas ("TZDs")) o la liberacion de insulina de las celulas p (sulfonilureas, exanatida). Las sulfonilureas y otros compuestos que actuan despolarizando la celula beta tienen el efecto secundario de la hipoglucemia, ya que provocan la secrecion de insulina independientemente de los niveles circulantes de glucosa. Otros efectos secundarios de las terapias actuales incluyen aumento de peso, perdida de capacidad de respuesta a la terapia a lo largo del tiempo, problemas gastrointestinales y edema.
Un medicamento aprobado actualmente, Januvia (sitagliptina) aumenta los niveles sangumeos de hormonas incretinas, que pueden aumentar la secrecion de insulina, reducir la secrecion de glucagon y tener otros efectos menos bien caracterizados. Sin embargo, Januvia y otros inhibidores de dipeptidil peptidasa IV tambien pueden influir en los niveles tisulares de otras hormonas y peptidos, y las consecuencias a largo plazo de este efecto mas amplio no se han investigado por completo. Ademas, este compuesto no aborda los problemas asociados con la resistencia a la insulina.
Al igual que con la diabetes tipo I, GLP-1 ha sido sugerido como un terapeutico potencial para la diabetes tipo II como resultado de su capacidad para inducir la secrecion de insulina, inducir la expansion de las celulas beta y restablecer la tolerancia a la glucosa en las celulas beta resistentes a la glucosa. Sin embargo, como se discutio anteriormente, GLP-1 y analogos de los mismos son muy limitados en su potencial terapeutico como resultado de su muy corta vida media.
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A partir de lo anterior, queda claro que existe una necesidad en la tecnica para tratar o prevenir o retrasar el inicio o la progresion de trastornos asociados con la funcion pancreatica y/o para mejorar la funcion pancreatica.
RESUMEN DE LA INVENCION
En el trabajo que condujo a la presente invencion, los inventores buscaron determinar el efecto de un subconjunto espedfico de celulas precursoras mesenquimales (MPCs) sobre el desarrollo y/o la progresion de la disfuncion pancreatica. Los inventores hicieron uso de un modelo reconocido en el que la disfuncion pancreatica se induce mediante la administracion de estreptozotocina (STZ) a un raton. Este compuesto induce la inflamacion y la infiltracion de celulas inmunitarias de los islotes pancreaticos, lo que finalmente produce la muerte celular y la disfuncion pancreatica. La STZ causa disfuncion tanto en las funciones endocrinas del pancreas (por ejemplo, reduccion de la produccion de insulina) como en las funciones exocrinas del pancreas (por ejemplo, reduccion de la produccion de amilasa). Este modelo tambien es un modelo aceptado de un trastorno del metabolismo de la glucosa, por ejemplo, diabetes tipo I o diabetes tipo II.
Como se ejemplifica aqrn, los inventores han demostrado que la administracion de celulas STRO-1 + a ratones tratados con STZ aumenta los niveles de insulina en suero y reduce los niveles de glucosa en sangre en comparacion con ratones tratados con STZ que no han recibido celulas STRO-1+. Los inventores tambien demostraron que las celulas STRO-1+ inducen o aumentan el numero de celulas que expresan PDX-1 en el pancreas y/o aumentan el numero de celulas y/o islotes pancreaticos beta en un sujeto (por ejemplo, promueven la regeneracion de celulas beta pancreaticas). Los inventores tambien encontraron que las celulas STRO-1+ restauran la proporcion de celulas beta pancreaticas a celulas alfa pancreaticas al aumentar el numero de celulas beta y/o al reducir el numero de celulas alfa. Los inventores encontraron adicionalmente que el tratamiento con celulas STRO- 1+ induce la formacion de vasos sangumeos en el pancreas de un sujeto. En conjunto, estos datos indican que las celulas STRO-1+ y/o las celulas de su progenie y/o los factores secretados de las mismas inducen o promueven la regeneracion pancreatica y/o mejoran la funcion pancreatica. Por consiguiente, las celulas STRO-1+ o su celula de progenie o un factor derivado de las mismas son capaces de tratar y/o prevenir y/o reducir los efectos toxicos de STZ del pancreas. Se deduce que estos datos indican que las celulas STRO-1+ o celulas de progenie de las mismas o uno o mas factores derivados de las mismas son capaces de tratar o prevenir o retrasar la aparicion de o reduccion de la gravedad de la disfuncion pancreatica y/o mejorar la funcion pancreatica y/o inducir la regeneracion de pancreas o sus celulas y/o mejorar el metabolismo de la glucosa (por ejemplo, aumentando los niveles de insulina circulantes).
Los descubrimientos de los inventores proporcionan la base para tratar y/o prevenir y/o retrasar la aparicion y/o retraso de la progresion de la disfuncion pancreatica, tal como la diabetes.
En consecuencia, la presente invencion proporciona celulas STRO-1+ para uso en el tratamiento de la diabetes mellitus en un sujeto que lo necesite. La diabetes mellitus puede ser diabetes mellitus tipo I o diabetes mellitus tipo II. Las celulas STRO-1+ pueden ser para administracion directa en el flujo sangumeo de un sujeto, preferiblemente intraarterialmente. Las celulas STRO-1+ para la administracion al sujeto pueden ser STRO-1bri, y/o expresar la fosfatasa alcalina no espedfica de tejido (TNAP). Las celulas STRO-1+ pueden cultivarse previamente in vitro.
Las celulas STRO-1+ pueden promover o inducir la regeneracion pancreatica en un sujeto (por ejemplo, en un sujeto que padece una disfuncion pancreatica). Por ejemplo, la produccion de nuevas celulas beta y/o microvasos en un pancreas puede inducirse o promoverse.
Las celulas STRO-1+ pueden inducir o promover la regeneracion de celulas beta pancreaticas y/o islotes pancreaticos.
Las celulas STRO-1+ pueden reducir los niveles de glucosa en sangre y/o aumentar los niveles de insulina en sangre/suero en un sujeto.
Las celulas STRO-1+ pueden aumentar el numero de celulas beta pancreaticas y/o aumentar el numero de celulas beta pancreaticas en relacion con las celulas alfa pancreaticas y/o reducir el numero de celulas alfa pancreaticas y/o aumentar el numero de islotes pancreaticos en un sujeto.
Las celulas STRO-1+ pueden aumentar la expresion de factor-1 de homeobox pancreatico y duodenal (PDX-I) y/o aumentar el numero de celulas que expresan PDX-I en el pancreas de un sujeto.
Las celulas STRO-1+ pueden inducir o promover la arteriogenesis y la angiogenesis en el pancreas de un sujeto.
Las celulas STRO-1+ pueden aumentar el numero de precursores de celulas beta pancreaticas o inducir o promover la proliferacion de precursores de celulas beta pancreaticas en un sujeto.
Como se usa aqrn, la disfuncion pancreatica puede estar asociada o ser el resultado de la disfuncion de la funcion endocrina del pancreas y/o la funcion exocrina del pancreas. La disfuncion pancreatica puede dar como resultado o
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estar asociada a una funcion pancreatica reducida, por ejemplo, funcion endocrina pancreatica reducida o funcion exocrina pancreatica reducida.
La disfuncion pancreatica puede estar asociada o causar un trastorno del metabolismo de los carbohidratos. Tal trastorno del metabolismo de carbohidratos puede ser causado por una disfuncion pancreatica endocrina y/o exocrina. En un ejemplo, el trastorno del metabolismo de carbohidratos es causado por la produccion reducida de insulina por el pancreas. En otro ejemplo, el trastorno del metabolismo de los carbohidratos esta causado por niveles de glucagon incrementados (por ejemplo, un mayor numero de celulas alfa y/o un aumento de los niveles de glucagon y/o produccion y/o secrecion). En otro ejemplo, el trastorno del metabolismo de los carbohidratos es causado por la produccion reducida de amilasa por el pancreas. La persona experimentada en la materia sabra en base a la descripcion aqm, que un trastorno del metabolismo de los carbohidratos (o disfuncion pancreatica) no necesita caracterizarse unicamente por la funcion pancreatica. Por ejemplo, un trastorno del metabolismo de carbohidratos tambien puede caracterizarse por resistencia a la insulina y/o por un componente vascular y/o por un componente neuropatico. En la presente invencion, la disfuncion pancreatica es diabetes mellitus, por ejemplo, diabetes mellitus tipo I o diabetes mellitus tipo II.
Preferiblemente, se administra una cantidad eficaz o una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de celulas STRO-1+. En un ejemplo, se administra una cantidad de celulas STRO-1 + suficiente para inducir la produccion de insulina en un sujeto, preferiblemente para inducir la produccion de insulina durante al menos aproximadamente 1 semana o 2 semanas o 3 semanas o 4 semanas.
En un ejemplo, las celulas STRO-1+ se administran directamente en el torrente sangumeo de un sujeto, sin embargo, no se excluyen otros sitios de administracion. Preferiblemente, las celulas STRO-1+ son para administracion sistemica. Por ejemplo, las celulas STRO-1+ son para administracion intravenosa, intraarterial, en una aorta, en una auricula o ventnculo del corazon o en un vaso sangumeo conectado a un pancreas, por ejemplo, una aorta abdominal, una arteria mesenterica superior, una arteria pancreaticoduodenal o una arteria esplenica. En un ejemplo preferido, las celulas STRO-1+ son para administracion intraarterial, por ejemplo, en una arteria femoral o en una arteria celfaca, por ejemplo, usando un cateter.
Alternativamente, o ademas, las celulas STRO-1+ son para administracion al pancreas o a una parte del mismo de un sujeto.
En un ejemplo, las celulas STRO-1+ para administracion al sujeto son STRO-1bn, y/o expresan fosfatasa alcalina no espedfica de tejido (TNAP). Se describen poblaciones adicionales de celulas STRO-1+ caracterizadas por marcadores de superficie celular espedficos o combinaciones de los mismos. Las celulas de progenie y/o los factores solubles pueden derivarse de celulas que expresan STRO-1 o que son STRO-1bn y/o expresan TNAP. Dichas celulas de progenie tambien pueden expresar STRO-1 o ser STRO-1bn y/o expresar TNAP.
De acuerdo con los metodos dirigidos a tratar o retrasar la progresion de la disfuncion pancreatica, se prefiere que las celulas STRO-1+ y/o celulas progenie de las mismas y/o los factores solubles derivados de las mismas se administren despues del diagnostico del trastorno, por ejemplo, usando metodos estandar conocidos en la tecnica. Para aquellos metodos dirigidos a prevenir o retrasar el inicio de la disfuncion pancreatica, se prefiere que las celulas STRO-1+ se administren antes del diagnostico clmico del trastorno, por ejemplo, cuando el sujeto padece tolerancia alterada a la glucosa y/o glucemia alterada en ayunas y/o en el caso de diabetes tipo I antes o concomitante con una respuesta autoinmune tal como se indica por la expansion de una poblacion de celulas T y/o celulas B y/o por la produccion de autoanticuerpos (por ejemplo, expansion de celulas T citotoxicas contra las celulas p del islote pancreatico y/o autoanticuerpos contra uno o mas marcadores de celulas p del islote pancreatico en el inicio o la progresion de la diabetes tipo 1).
Preferiblemente, se puede realizar monitoreo adicional o deteccion de inicio y/o progresion de disfuncion pancreatica y/o niveles de glucosa en sangre y/o niveles de insulina en sangre/suero y/o el numero de celulas beta y/o el numero de celulas alfa y/o el numero de islotes pancreaticos y/o el numero de celulas que expresan PDX-1 y/o la cantidad de expresion de PDX-1 y/o el numero de vasos sangumeos. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo pruebas adicionales de tolerancia a la glucosa y/o pruebas de glucemia en ayunas y/o midiendo los niveles de una hormona o enzima producida por el pancreas y/o la obtencion de una muestra de pancreas para determinar el numero de celulas beta y/o el numero de las celulas alfa y/o el numero de islotes pancreaticos y/o el numero de celulas que expresan PDX-1 y/o la cantidad de expresion de PDX-1 y/o el numero de vasos sangumeos. Tal supervision puede indicar que se requiere o es deseable una administracion posterior de celulas STRO-1+.
Como sera evidente para la persona experimentada en la tecnica a partir del parrafo anterior, la invencion no se considerara limitada a una unica administracion de celulas STRO-1+. La presente invencion abarca explfcitamente multiples administraciones en el mismo sitio o en sitios diferentes o mediante la misma ruta o rutas diferentes. La presente invencion tambien contempla una sola administracion de celulas STRO-1+.
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En un ejemplo, las celulas STRO-1 + se administran en forma de una composicion, por ejemplo, una composicion que comprende dichas celulas STRO-1 + y un portador y/o excipiente. Los portadores y/o excipientes adecuados seran evidentes para la persona experimentada en la tecnica y/o se describen aqrn.
Dicha composicion puede comprender factores adicionales utiles para tratar o prevenir un trastorno del metabolismo de los carbohidratos, por ejemplo, insulina o amilasa y/o un peptido o polipeptido asociado con la funcion pancreatica normal, por ejemplo, colecistoquinina octapeptido o somatostatina o glucagon o tripsinogeno o quimiotripsinogeno o elastasa o carboxipeptidasa o lipasa pancreatica. Alternativamente, o ademas, una celula STRO-1+ puede modificarse geneticamente para expresar y preferiblemente, secretar, dicho factor adicional, por ejemplo, insulina o amilasa y/o un peptido o polipeptido asociado con la funcion pancreatica normal, por ejemplo, colecistoquinina octapeptido o somatostatina o glucagon o tripsinogeno o quimotripsinogeno o elastasa o carboxipeptidasa o lipasa pancreatica.
Las celulas STRO-1+ y/o las celulas de su progenie y/o los factores solubles derivados de las mismas o una composicion que las comprende pueden usarse para:
(i) tratamiento de la disfuncion pancreatica; y/o
(ii) mejorar la funcion pancreatica; y/o
(iii) inducir o promover la regeneracion de celulas beta pancreaticas y/o islotes pancreaticos; y/o
(iv) reducir los niveles de glucosa en sangre y/o aumentar los niveles de insulina en sangre/suero; y/o
(v) aumentar el numero de celulas beta pancreaticas y/o para aumentar el numero de celulas beta pancreaticas en relacion con las celulas alfa pancreaticas y/o para reducir el numero de celulas alfa pancreaticas y/o para aumentar el numero de islotes pancreaticos; y/o
(vi) aumentar la expresion de factor-1 de homeobox pancreatico y duodenal (PDX-1) y/o para aumentar el numero de celulas que expresan PDX-1 en un pancreas; y/o
(vii) inducir o promover la arteriogenesis o la angiogenesis en el pancreas.
Las celulas STRO-1+ y/o las celulas de su progenie y/o los factores solubles derivados de las mismas se pueden usar en la fabricacion de un medicamento para:
(i) tratamiento de la disfuncion pancreatica; y/o
(ii) mejorar la funcion pancreatica; y/o
(iii) inducir o promover la regeneracion de celulas beta pancreaticas y/o islotes pancreaticos; y/o
(iv) reducir los niveles de glucosa en sangre y/o aumentar los niveles de insulina en sangre/suero; y/o
(v) aumentar el numero de celulas beta pancreaticas y/o para aumentar el numero de celulas beta pancreaticas en relacion con las celulas alfa pancreaticas y/o para reducir el numero de celulas alfa pancreaticas y/o para aumentar el numero de islotes pancreaticos; y/o
(vi) aumentar la expresion de factor-1 de homeobox pancreatico y duodenal (PDX-1) y/o para aumentar el numero de celulas que expresan PDX-1 en un pancreas; y/o
(vii) inducir o promover la arteriogenesis o la angiogenesis en el pancreas.
La presente invencion es aplicable a una amplia gama de animales. Por ejemplo, el sujeto es un mairnfero tal como un humano, perro, gato, caballo, vaca u oveja, preferiblemente, el sujeto es un humano. En un ejemplo, el sujeto es un humano. En otro ejemplo, el sujeto es un mamffero no humano.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 es una representacion grafica que representa los efectos de las celulas STRO-1+ en los niveles de glucosa en sangre (BGL) en ratones NOD/scid diabeticos inducidos con STZ. Los niveles de glucosa en sangre se determinaron en ratones diabeticos que se inyectaron el dfa 10 despues del tratamiento con STZ (flechas) con celulas STRO-1+ en el ventnculo izquierdo (CM) o con el vetuculo (CV). Los valores de glucosa en sangre son glucosa media (mM) +/- SE. La prueba t de Student se realizo con significacion a p <0,05.
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La Figura 2 es una representacion grafica que muestra los efectos de las celulas STRO-1 + en los niveles de glucosa en sangre (BGL) en ratones NOD/scid diabeticos inducidos con STZ a los 7, 14 y 21 dfas despues del tratamiento en comparacion con los valores basales en el dfa 10 despues del tratamiento con STZ. Se determinaron los niveles de glucosa en sangre en ratones diabeticos inyectados en el ventnculo izquierdo con vetuculo (CV) o con celulas STRO-1 + (CM). Los resultados se expresan como % de cambio en BGL en relacion con el inicio de la terapia celular el dfa 10. La prueba t de Student se realizo con significacion a p <0,05.
La Figura 3 es una representacion grafica que muestra el efecto de las celulas STRO-1+ sobre los niveles de insulina en ratones NOD/scid diabeticos inducidos con STZ, 21 dfas despues de la dosis de terapia celular. Los niveles sericos de insulina en ratones se determinaron en ratones diabeticos inyectados en el ventnculo izquierdo con vetuculo (CV) o con celulas STRO-1+ (CM). Los valores de insulina de raton estan en pg/L +/- SE. La prueba t de Student se realizo con significacion a p <0,05.
La Figura 4A es una representacion grafica que muestra el efecto de las celulas intra-arteriales STRO-1+ en la densidad de microvasos pancreaticos en ratones NOD/scid diabeticos inducidos con STZ, 21 dfas despues de la dosis de terapia celular. El numero total de microvasos tenidos con actina anti musculo liso (SMA) se determino en funcion de la distribucion del tamano por area de seccion transversal de la seccion pancreatica. Los datos representan la media +/- sem; con grupo de vetuculo N= 8, y terapia con STRO-1 N= 6 animales. La prueba T de Student se realizo con significacion a p <0,05.
La Figura 4B es una copia de una micrograffa (200x) que muestra microvasos tenidos con IgG2a-FITC de anti actina de musculo liso de raton de diferentes diametros en tejido pancreatico de ratones tratados con celulas STRO-1.
La Figura 5A es una representacion grafica que muestra el efecto de celulas intra-arteriales STRO-1 + en el perfil de ARNm pancreatico en ratones NOD/scid diabeticos inducidos con STZ 21 dfas despues de la dosis de terapia celular. El ARN se extrajo del tejido pancreatico del vetuculo (CV) y de los grupos de terapia STRO-1 (CM), se transcribio de forma inversa y se amplifico por PCR para los factores de transcripcion relevantes para la regeneracion de celulas beta: Mafa, Ngn3, Pdx-1. El contenido total de ARN se normalizo con respecto al gen de mantenimiento beta-actina. Los datos representan la media +/- sem; con grupo de vetuculo N= 8, y terapia con STRO-1 N= 6 animales. La prueba T de Student se realizo con significacion a p <0,05.
La Figura 5B es una representacion grafica que muestra el efecto de las celulas intraarteriales STRO-1+ en celulas positivas para PDX-1 en ratones NOD/scid diabeticos inducidos con STZ, 21 dfas despues de la dosis de terapia celular. Los tejidos pancreaticos tenidos con anti-PDX-1 se analizaron para detectar celulas PDX-1 positivas por mm2 de area de islotes. Los datos representan la media +/- sem; con grupo de vetuculo N= 8, terapia con STRO-1 N= 6 y controles no tratados (sin STZ) N= 3 animales. La prueba T de Student se realizo con significacion a p <0,05.
La figura 5C es una copia de una serie de micrograffas (400x) que muestran secciones incrustadas en parafina fijadas con formalina recuperadas con antfgeno que se tineron con anti-PDX-1 de raton (IgG2b) y se detectaron con conjugado de cabra anti-IgG2b-Alexa 555 de raton.
La Figura 6A es una representacion grafica que muestra el efecto de las celulas intraarteriales STRO-1+ en las caractensticas de los islotes pancreaticos en ratones NOD/scid diabeticos inducidos con STZ, despues de 21 dfas de terapia celular. Los tejidos pancreaticos tenidos con H&E se analizaron para determinar la densidad de los islotes, que se normalizo con respecto al area seccional examinada. Los datos representan la media +/- sem; con grupo de vehuculo N= 8, y terapia con STRO-1 N= 6 animales. La prueba T de Student se realizo con significacion a p <0,05.
La Figura 6B es una representacion grafica que muestra el efecto de las celulas intraarteriales STRO-1+ en las caractensticas de los islotes pancreaticos en ratones NOD/scid diabeticos inducidos con STZ despues de 21 dfas de terapia celular. Los tejidos pancreaticos tenidos con H&E se analizaron para determinar el diametro medio del islote, que se normalizo con respecto al area seccional examinada. Los datos representan la media +/- sem; con grupo de vetuculo N= 8, y terapia con STRO-1 N= 6 animales.
La Figura 6C es una representacion grafica que muestra el efecto de las celulas intraarteriales STRO-1+ en las caractensticas de los islotes pancreaticos en ratones NOD/scid diabeticos inducidos con STZ despues de 21 dfas de terapia celular. Los tejidos pancreaticos tenidos con H&E se analizaron para determinar el area media del islote, que se normalizo con respecto al area seccional examinada. Los datos representan la media +/- sem; con grupo de vetuculo N= 8, y terapia con STRO-1 N= 6 animales.
La Figura 7A es una representacion grafica que muestra el efecto de las celulas intra-arteriales STRO-1+ en las caractensticas de los islotes en ratones NOD/scid diabeticos inducidos con STZ, despues de 21 dfas de terapia celular. Los tejidos pancreaticos tenidos con anti insulina se analizaron para determinar las celulas positivas a la insulina por mm2 de area del islote. Los datos representan la media +/- sem; con grupo de vetuculo N= 8, terapia con STRO-1 N= 6 y controles no tratados (sin STZ) N= 3 animales. La prueba T de Student se realizo con significacion a p <0,05.
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La Figura 7B es una copia de una serie de micrograffas (200x) que muestran secciones incrustadas en parafina fijadas con formalina recuperadas con antigeno que se tineron con antiinsulina de cobayo y se detectaron con
conjugado de anti-IgG-rodamina de cobayo. Los grupos de tratamiento estan indicados en la base de cada
fotomicrograffa.
La Figura 7C es una representacion grafica que muestra el efecto de las celulas intraarteriales STRO-1 + en las caractensticas de los islotes en ratones NOD/scid diabeticos inducidos con STZ, despues de 21 dfas de terapia celular. Los tejidos pancreaticos tenidos con anti glucagon se analizaron para detectar celulas positivas al glucagon por mm2 del area del islote. Los datos representan la media +/- sem; con grupo de veldculo N= 8, terapia con STRO- 1 N= 6 y controles no tratados (sin STZ) N= 3 animales. La prueba T de Student se realizo con significacion a p <0,05.
La Figura 7D es una copia de una serie de micrograffas (200x) que muestran secciones incrustadas en parafina fijadas con formalina recuperadas con antfgeno que se tineron con anti-glucagon de raton y se detectaron con
conjugado de cabra anti IgG-FITC de raton. Los grupos de tratamiento estan indicados en la base de cada
fotomicrograffa.
La Figura 7E es una representacion grafica que muestra el numero de celulas beta intraislotes como una proporcion del total de celulas alfa + beta. Los datos mostrados se calcularon a partir del numero de celulas positivas para insulina/mm2 del area del islote y el numero de celulas positivas para el glucagon/mm2 del area del islote. Los datos representan la media +/- sem; con grupo de vehmulo N= 8, terapia con STRO-1 N= 6 y controles no tratados (sin STZ) N= 3 animales. La prueba T de Student se realizo con significacion a p <0,05.
DESCRIPCION DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS
Tecnicas generales y definiciones seleccionadas
A lo largo de esta especificacion, a menos que se especifique lo contrario o el contexto requiera lo contrario, la referencia a un solo paso, composicion de materia, grupo de pasos o grupo de composiciones de materia se tomara para abarcar uno y una pluralidad (es decir, uno o mas) de aquellos pasos, composiciones de materia, grupos de pasos o grupo de composiciones de materia.
Cada realizacion o ejemplo descrito aqrn debe aplicarse mutatis mutandis a todas y cada una de las realizaciones a menos que se indique espedficamente lo contrario. Por ejemplo, cada realizacion o ejemplo descrito aqrn dirigido a tratar y/o prevenir y/o retrasar la aparicion y/o retraso de la progresion de la disfuncion pancreatica en un sujeto se aplicara mutatis mutandis a metodos para mejorar la funcion pancreatica y/o para inducir o promover la regeneracion pancreatica como si esas realizaciones se citaran explfcitamente aqrn.
Cada realizacion descrita aqrn con respecto al tratamiento de la disfuncion pancreatica se tomara para aplicarse mutatis mutandis para tratamiento de un trastorno del metabolismo de carbohidratos como si esas realizaciones se citaran explfcitamente aqrn.
Cada realizacion descrita aqrn con respecto al tratamiento de la disfuncion pancreatica se debe aplicar mutatis mutandis para el tratamiento de la diabetes mellitus, por ejemplo, diabetes mellitus tipo I o diabetes mellitus tipo II como si esas realizaciones se citaran explfcitamente aqrn.
Las personas experimentadas en la materia apreciaran que la invencion descrita en este documento es susceptible a variaciones y modificaciones distintas a las espedficamente descritas. Debe entenderse que la invencion incluye todas las variaciones y modificaciones de este tipo. La invencion tambien incluye todos los pasos, caractensticas, composiciones y compuestos mencionados o indicados en esta especificacion, individual o colectivamente, y cualquiera y todas las combinaciones o cualquiera de dos o mas de dichos pasos o caractensticas.
La presente invencion no tiene un alcance limitado por las realizaciones espedficas descritas aqrn, que estan destinadas solo para fines de ejemplificacion. Los productos, composiciones y metodos funcionalmente equivalentes estan claramente dentro del alcance de la invencion, como se describe aqrn.
La presente invencion se realiza sin una excesiva experimentacion utilizando, a menos que se indique lo contrario, tecnicas convencionales de biologfa molecular, microbiologfa, virologfa, tecnologfa de ADN recombinante, smtesis de peptidos en solucion, smtesis de peptidos en fase solida e inmunologfa. Dichos procedimientos se describen, por ejemplo, en Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Second Edition (1989), VoIs I, II, completos y DI; DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I y II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford, texto completo; Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed, 1984) IRL Press, Oxford, texto completo, y particularmente los papeles ad por Gait, ppl-22; Atkinson et al, pp35-81; Sproat et al, pp 83-115; y Wu et al, pp 135-151; 4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford, texto completo; Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford, texto completo; Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning
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(1984); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.), serie completa; J.F. Ramalho Ortigao, "The Chemistry of Peptide Synthesis" In: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva, Germany); Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. Land Fenichel, R.L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73 336-342; Merrifield, R.B. (1963). J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154; Barany, G. y Merrifield, R.B. (1979) en The Peptides (Gross, E. and Meienhofer, J. eds.), vol. 2, pp. 1-284, Academic Press, New York. 12. Wunsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden en Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Muler, E., ed.), vol. 15, 4th edn., Partes 1 y 2, Thieme, Stuttgart; Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer- Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474; Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); y Animal Cell Culture: Practical Approach, Third Edition (John R. W. Masters, ed., 2000), ISBN 0199637970, texto completo.
A lo largo de esta especificacion, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entendera que la palabra "comprender" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" implica la inclusion de un paso, elemento o entero determinado o grupo de pasos o elementos o enteros pero no la exclusion de ningun otro paso o elemento o entero o grupo de elementos o enteros.
Como se usa aqrn, el termino "derivado de" se tomara para indicar que se puede obtener un numero entero especificado de una fuente particular, aunque no necesariamente directamente de esa fuente. En el contexto de factores solubles derivados de celulas STRO-1 + y/o celulas de progenie de los mismos, este termino se debe tomar para referirse a uno o mas factores, por ejemplo, protemas, peptidos, carbohidratos, etc., producidos durante el cultivo in nitro de celulas STRO-1 + y/o celulas de progenie de las mismas.
Como se usa aqrn, el termino "mejorar la funcion pancreatica" se debe entender que significa que una o mas funciones de un pancreas en un sujeto se potencian en comparacion con la misma funcion en un sujeto que no se ha tratado de acuerdo con la presente invencion (preferiblemente, en el sujeto antes del tratamiento). Tal termino abarca, por ejemplo, aumentar el nivel de secrecion de insulina o mejorar la regulacion de la secrecion de insulina en un sujeto que puede o no sufrir un trastorno del metabolismo de la glucosa. El termino tambien abarca reducir la secrecion de, por ejemplo, glucagon en un sujeto que tiene niveles aumentados de esa hormona (por ejemplo, como resultado de un tumor que secreta glucagon) y/o un sujeto que padece de hipoglucemia.
Como se usa aqrn, el termino "disfuncion pancreatica" se debe entender como cualquier afeccion en la que una o mas de las funciones de un pancreas en un sujeto es/son diferentes a la misma funcion en un individuo normal y/o sano. Por ejemplo, el termino "disfuncion pancreatica" abarca afecciones en las que se potencia o reduce una funcion endocrina y/o una funcion exocrina de un pancreas en un sujeto en comparacion con un individuo normal y/o sano. Por ejemplo, la "disfuncion pancreatica" puede caracterizarse por, asociada con o causada por niveles aberrantes (es decir, aumentados o reducidos) de insulina, glucagon, somatostatina, polipeptido pancreatico, tripsinogeno, quimotripsinogeno, elastasa, carboxipeptidasa, lipasa pancreatica o amilasa. Sera evidente para las personas experimentadas en la materia a partir de lo anterior que el termino "tratar la disfuncion pancreatica" abarca la normalizacion de una funcion del pancreas (por ejemplo, tratar a un sujeto de modo que una o mas funciones del pancreas que son anormales se reducen o mejoran de tal manera que son mas similares a la misma funcion en un individuo normal y/o saludable). Por ejemplo, dicho tratamiento puede dar como resultado niveles aumentados de insulina y/o un numero creciente de celulas beta pancreaticas y/o islotes pancreaticos en un sujeto que tiene niveles aberrantes reducidos de insulina y/o celulas beta y/o islotes. Tal tratamiento puede reducir igualmente los niveles de glucagon aberrantes, por ejemplo, en el caso de un tumor del pancreas que secreta glucagon, por ejemplo, reduciendo el numero de celulas alfa secretoras de glucagon y/o reduciendo la expresion, produccion y/o secrecion de glucagon. El significado del termino "prevenir o retrasar la disfuncion pancreatica" sera evidente para la persona experimentada en la materia en base a lo anterior.
La disfuncion pancreatica puede estar asociada con o causar una afeccion que produzca malabsorcion de nutrientes, por ejemplo, carbohidratos, lfpidos o protemas, por ejemplo, como resultado de un nivel reducido de una enzima digestiva producida por el pancreas, por ejemplo, lipasa o amilasa y/o por la produccion reducida de jugo pancreatico. Tales afecciones incluyen pancreatitis, insuficiencia pancreatica, smdrome de deficiencia autoinmune adquirida, cancer, fibrosis qmstica o smdrome de Zollinger Ellison. En un ejemplo preferido, la condicion es causada por o esta asociada con la amilasa o lipasa reducida producida por el pancreas.
La disfuncion pancreatica tambien puede estar asociada o causar una afeccion asociada con el uso aberrante o metabolismo de nutrientes por un sujeto, por ejemplo, dando como resultado hiperglucemia o hipoglucemia, niveles reducidos de aminoacidos sericos, proteinuria, eritema migratorio necrolftico. Dichas afecciones incluyen trastornos del metabolismo de carbohidratos, por ejemplo, diabetes mellitus. Otras afecciones incluyen, por ejemplo, tumores (por ejemplo, tumores secretores de glucagon, que pueden causar hiperglucemia). Tumores de ejemplo incluyen glucagonomas.
Como se usa aqrn, el termino "trastorno del metabolismo de carbohidratos" se debe entender como cualquier trastorno en el que un sujeto no puede o tiene una capacidad reducida de descomponer o metabolizar o utilizar una o mas formas de carbohidrato, generalmente causando niveles aumentados de ese/esos carbohidratos en el torrente
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sangumeo del sujeto. Preferiblemente, el trastorno del metabolismo de los carbohidratos esta asociado o es causado por la produccion reducida por parte del pancreas de una hormona implicada en la descomposicion de un carbohidrato, por ejemplo, la produccion de amilasa. Mas preferiblemente, el trastorno del metabolismo de los carbohidratos esta asociado con o es causado por la produccion reducida por parte del pancreas de una hormona implicada en la absorcion de un carbohidrato, por ejemplo, la produccion de insulina. Los trastornos del metabolismo de carbohidratos de ejemplo incluyen diabetes mellitus tipo I, diabetes mellitus tipo II, diabetes idiopatica tipo I (tipo Ib), diabetes tipo II de comienzo temprano (EOD), diabetes atfpica de inicio en la juventud (YOAD), diabetes de inicio de la madurez de los jovenes (MODY), diabetes relacionada con la desnutricion, diabetes gestacional, condiciones de intolerancia a la glucosa (IGT), condiciones de alteracion de la glucosa plasmatica en ayunas, acidosis metabolica, cetosis, smdrome X, hiperglucemia, hipoinsulinemia, resistencia a la insulina, alfa manosidosis, beta manosidosis, intolerancia a la fructosa, fucosidosis, galactosemia, enfermedad de Leigh, mucolipidosis, mucopolisacaridosis o una complicacion de uno o mas de los anteriores. Preferiblemente, el trastorno del metabolismo de carbohidratos es diabetes, por ejemplo, diabetes tipo I o diabetes tipo II.
Preferiblemente, un sujeto que padece diabetes tiene un marcador de diabetes clmicamente aceptado, tal como:
• Glucosa en plasma en ayunas mayor o igual a 7 nmol/L o 126 mg/dl;
• Glucosa en plasma ocasional (tomada en cualquier momento del dfa) mayor o igual a 11,1 nmol/L o 200 mg/dl con los smtomas de la diabetes.
• Valor de prueba oral de tolerancia a la glucosa (OGTT) mayor o igual a 11,1 nmol/L o 200 mg/dl medido en un intervalo de dos horas. El OGTT se administra en un lapso de tiempo de dos o tres horas.
Como se usa aqrn, el termino "cantidad efectiva" se tomara para significar una cantidad suficiente de celulas STRO- 1+ y/o celulas progenie de las mismas y/o factores solubles derivados de las mismas para mejorar la funcion pancreatica en un sujeto al que las celulas STRO-1 + y/o celulas progenie de las mismas y/o factores solubles derivados de las mismas se administran en comparacion con su funcion pancreatica antes de la administracion y/o se comparan con un sujeto al que las celulas STRO-1+ y/o sus celulas progenie y/o factores solubles derivados de estos no son administrados. Por ejemplo, una cantidad efectiva de celulas STRO-1+ y/o celulas progenie de las mismas y/o factores solubles derivados de las mismas pueden reducir los niveles de glucosa basal o en reposo (glucemia) y/o mejorar la tolerancia a la glucosa y/o aumentar los niveles de insulina en sangre y/o aumentar los niveles de glucagon, somatostatina, polipeptido pancreatico, tripsinogeno, quimotripsinogeno, elastasa, carboxipeptidasa, lipasa pancreatica o amilasa en suero o en el pancreas o en el sistema digestivo. Una cantidad efectiva de celulas STRO-1+ y/o celulas progenie de las mismas y/o factores solubles derivados de las mismas tambien puede aumentar el suministro sangumeo a un pancreas o a una region del mismo, por ejemplo, aumentando la vasculatura alrededor o dentro de un pancreas o una region del mismo. La persona experimentada en la materia sabra que dicha cantidad variara dependiendo de, por ejemplo, las celulas STRO-1+ y/o las celulas de su progenie y/o los factores solubles derivados de las mismas y/o el sujeto particular y/o el tipo o gravedad de la disfuncion pancreatica. Por consiguiente, este termino no debe interpretarse para limitar la invencion a una cantidad espedfica, por ejemplo, peso o numero de celulas, sino que la presente invencion abarca cualquier cantidad de celulas STRO-1+ suficientes para tratar diabetes mellitus en un sujeto. Los metodos para detectar la funcion pancreatica y/o para determinar la cantidad de celulas STRO-1+ y/o celulas progenie de los mismos y/o los factores solubles derivados de los mismos suficientes para mejorar la funcion pancreatica seran evidentes para la persona experimentada en la tecnica y/o se describen aqrn. Una cantidad efectiva no necesita necesariamente tratar o prevenir la disfuncion pancreatica.
Como se usa aqrn, el termino "cantidad terapeuticamente efectiva" se tomara para significar una cantidad suficiente de celulas STRO-1+ y/o celulas progenie de las mismas y/o factores solubles derivados de las mismas para reducir o inhibir uno o mas smtomas de una condicion clmica asociada con o causada por la disfuncion pancreatica a un nivel que esta por debajo de lo observado y aceptado como diagnostico clmico de esa afeccion. Por ejemplo, una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas STRO-1+ y/o celulas de progenie de las mismas y/o factores solubles derivados de las mismas puede reducir la tolerancia a la glucosa en un sujeto desde un nivel observado en un sujeto diabetico hasta un nivel observado en un sujeto presintomatico (por ejemplo, que padecen tolerancia alterada a la glucosa o glucemia en reposo alterada) o en un sujeto normal o saludable.
Como se usa aqrn, el termino "cantidad profilacticamente eficaz" se tomara para indicar una cantidad suficiente de celulas STRO-1+ y/o celulas progenie de las mismas y/o factores solubles derivados de ellas para prevenir o inhibir la aparicion de uno o mas smtomas detectables de una condicion clmica asociada con o causada por una disfuncion pancreatica. Por ejemplo, una cantidad profilacticamente eficaz de celulas STRO-1+ y/o celulas progenie de las mismas y/o factores solubles derivados de las mismas puede evitar que la tolerancia a la glucosa en un sujeto se deteriore hasta tal punto que el sujeto se diagnostica clmicamente con diabetes.
Como se usa aqrn, el termino "trata" o "tratamiento" o "tratar" debe entenderse como administrar una cantidad terapeuticamente efectiva de factores solubles y/o celulas y reducir o inhibir al menos un smtoma de una condicion clmica asociada con o causada por la disfuncion pancreatica.
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Como se usa aqrn, el termino "prevenir" o "previniendo" o "prevencion" se debe entender como administrar una cantidad profilacticamente eficaz de factores solubles y/o celulas y detener o dificultar el desarrollo de al menos un smtoma de una condicion clmica asociada con o causada por una disfuncion pancreatica.
Por "retrasar la progresion de la disfuncion pancreatica" se entiende que un tratamiento reduce la gravedad de la disfuncion pancreatica en un sujeto. Dicha reduccion en la gravedad puede ser, por ejemplo, la prevencion de una o mas complicaciones de la disfuncion pancreatica, tales como, por ejemplo, malabsorcion de nutrientes, hipoglucemia, hiperglucemia, cetoacidosis, retinopatfa, cataratas, hipertension, insuficiencia renal, enfermedad arterial coronaria, enfermedad periferica vascular, neuropatfa (por ejemplo, neuropatfa periferica o neuropatfa autonoma) o mayor riesgo de infeccion. Alternativamente, o ademas, una reduccion en la severidad de la disfuncion pancreatica se caracteriza por una reduccion en el requerimiento de tratamiento terapeutico (por ejemplo, administracion de insulina) o la regularidad del tratamiento terapeutico de un sujeto en comparacion con un sujeto que no ha recibido tratamiento usando el metodo de la invencion. Alternativamente, o ademas, "reducir la progresion de la disfuncion pancreatica" es un retraso en la aparicion de uno o mas smtomas detectables de disfuncion pancreatica en comparacion con un sujeto diabetico que no ha recibido tratamiento con un compuesto que reduce la progresion de la disfuncion pancreatica.
Como se usa aqrn, el termino "factores solubles" se tomara para significar cualquier molecula, por ejemplo, protema, peptido, glicoprotema, glicopeptido, lipoprotema, lipopeptido, carbohidrato, etc. producidos por celulas STRO-1 + y/o progenie de las mismas que son solubles en agua. Dichos factores solubles pueden ser intracelulares y/o secretados por una celula. Dichos factores solubles pueden ser una mezcla compleja (por ejemplo, sobrenadante) y/o una fraccion de los mismos y/o pueden ser un factor purificado. Los factores solubles pueden estar contenidos en el sobrenadante. Por consiguiente, se tomara cualquier ejemplo aqrn dirigido a la administracion de uno o mas factores solubles para aplicar mutatis mutandis a la administracion de sobrenadante.
Como se usa aqrn, el termino "sobrenadante" se refiere al material no celular producido despues del cultivo in vitro de celulas precursoras mesenquimales, y/o celulas de progenie de las mismas, en un medio adecuado, preferiblemente medio lfquido. Tfpicamente, el sobrenadante se produce cultivando las celulas en el medio bajo condiciones y tiempo adecuados, seguido de eliminacion del material celular mediante un proceso tal como centrifugacion. El sobrenadante puede o no haber sido sometido a otras etapas de purificacion antes de la administracion. En el ejemplo preferido, el sobrenadante comprende menos de 105, mas preferiblemente menos de 104, mas preferiblemente menos de 103 y aun mas preferiblemente no hay celulas vivas.
Como se usa aqrn, el termino "individuo normal o sano" se tomara para referirse a un sujeto que no sufre de disfuncion pancreatica segun se evalua mediante cualquier metodo conocido en la tecnica y/o descrito aqrn.
Celulas STRO-1 + o celulas de progenie, y sobrenadante o uno o mas factores solubles derivados de las mismas
Las celulas STRO-1 + son celulas que se encuentran en la medula osea, sangre, celulas de pulpa dental, tejido adiposo, piel, bazo, pancreas, cerebro, rinon, Idgado, corazon, retina, cerebro, folfculos pilosos, intestino, pulmon, nodulo linfatico, timo, hueso, ligamento, tendon, musculo esqueletico, dermis y periostio; y son capaces de diferenciarse en lmeas germinales tales como mesodermo y/o endodermo y/o ectodermo.
En una realizacion, las celulas STRO-1+ son celulas multipotenciales que son capaces de diferenciarse en un gran numero de tipos de celulas que incluyen, pero no se limitan a, tejidos conectivos adiposos, oseos, cartilaginosos, elasticos, musculares y fibrosos. La via espedfica de compromiso y diferenciacion de linaje en la que entran estas celulas depende de varias influencias de influencias mecanicas y/o factores bioactivos endogenos, tales como factores de crecimiento, citocinas y/o condiciones microambientales locales establecidas por los tejidos del huesped. Las celulas multipotenciales STRO-1+ son por lo tanto celulas progenitoras no hematopoyeticas que se dividen para producir celulas hijas que son celulas madre o son celulas precursoras que con el tiempo se diferenciaran irreversiblemente para producir una celula fenotfpica.
En un ejemplo preferido, las celulas STRO-1+ se enriquecen a partir de una muestra obtenida de un sujeto, por ejemplo, un sujeto a tratar o un sujeto relacionado o un sujeto no relacionado (ya sea de la misma especie o diferente). Los terminos "enriquecido", "enriquecimiento" o variaciones del mismo se usan aqrn para describir una poblacion de celulas en la que la proporcion de un tipo de celula particular o la proporcion de un numero de tipos de celulas particulares aumenta cuando se compara con la poblacion no tratada.
En un ejemplo preferido, las celulas usadas en la presente invencion expresan uno o mas marcadores individualmente o colectivamente seleccionados del grupo que consiste en TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, CD45+, CD146+, 3G5+ o cualquier otra combinacion de los mismos
Por "individualmente" se entiende que la invencion abarca los marcadores o grupos de marcadores enumerados por separado, y que, a pesar de que los marcadores individuales o grupos de marcadores puede que no se enumeren por separado aqrn, las reivindicaciones adjuntas pueden definir dicho marcador o grupos de marcadores por separado y divisiblemente de cada uno.
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Por "colectivamente" se entiende que la invencion abarca cualquier numero o combinacion de los marcadores enumerados o grupos de peptidos, y que, a pesar de que dichos numeros o combinaciones de marcadores o grupos de marcadores pueden no enumerarse espedficamente aqrn, las reivindicaciones adjuntas pueden definir tales combinaciones o subcombinaciones separadamente y divisiblemente de cualquier otra combinacion de marcadores o grupos de marcadores.
Preferiblemente, las celulas STRO-1 + son STRO-1bnllante (sinonimo STRO-1bn). Preferiblemente, las celulas STRO- 1brillante son adicionalmente una o mas de TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+ y/o CD146+.
En un ejemplo, las celulas precursoras mesenquimales son celulas precursoras mesenquimales perivasculares como se define en el documento WO 2004/85630.
Una celula a la que se hace referencia como "positiva" para un marcador dado, puede expresar un nivel bajo (lo o tenue) o alto (brillante, bri) de ese marcador, dependiendo del grado en que el marcador este presente en la superficie celular, donde los terminos se relacionan con la intensidad de la fluorescencia u otro marcador utilizado en el proceso de clasificacion de las celulas. La distincion de lo (o tenue o apagado) y bri se entendera en el contexto del marcador utilizado en una poblacion celular particular que se esta ordenando. Una celula que se conoce como "negativa" para un marcador dado no esta necesariamente ausente por completo de esa celula. Estos terminos significan que el marcador se expresa a un nivel relativamente muy bajo por esa celula, y que genera una senal muy baja cuando se detecta de manera detectable o es indetectable por encima de los niveles de fondo.
El termino "brillante", cuando se usa aqrn, se refiere a un marcador en una superficie de la celula que genera una senal relativamente alta cuando se marca de manera detectable. Sin desear estar limitado por la teona, se propone que las celulas "brillantes" expresan mas protema marcadora diana (por ejemplo, el antfgeno reconocido por sTrO- 1) que otras celulas en la muestra. Por ejemplo, las celulas STRO-1bn producen una senal fluorescente mayor, cuando se marcan con un anticuerpo STRO-1 conjugado con FITC como es determinado por analisis de clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS), que las celulas no brillantes (STRO-1tenue/apagado).
Preferiblemente, las celulas "brillantes" constituyen al menos aproximadamente el 0,1% de las celulas mononucleares de medula osea marcadas de manera mas brillante contenidas en la muestra de inicial. En otros ejemplos, las celulas "brillantes" constituyen al menos aproximadamente 0,1%, al menos aproximadamente 0,5%, al menos aproximadamente 1%, al menos aproximadamente 1,5%, o al menos aproximadamente 2%, de las celulas mononucleares de medula osea marcadas de forma mas brillante contenidas en la muestra inicial. En un ejemplo preferido, las celulas STRO-1bnllante tienen una expresion de 2 log de magnitud mas alta de expresion de superficie STRO-1 en relacion con el "fondo", es decir, celulas que son STRO-1-. En comparacion, las celulas STRO-1apagado y/o sTRO-1intermedia tienen una expresion inferior a 2 log de magnitud mas alta de expresion de superficie STRO-1, tipicamente alrededor de 1 log o menos que el "fondo".
Como se usa aqrn, el termino "TNAP" pretende abarcar todas las isoformas de fosfatasa alcalina no espedfica de tejido. Por ejemplo, el termino abarca la isoforma hepatica (LAP), la isoforma osea (BAP) y la isoforma renal (KAP). En un ejemplo preferido, el TNAP es BAP. En un ejemplo particularmente preferido, TNAP como se usa aqrn se refiere a una molecula que puede enlazar el anticuerpo STRO-3 producido por la lmea celular de hibridoma depositada con ATCC el 19 de diciembre de 2005 bajo las disposiciones del Tratado de Budapest con el numero de acceso de deposito PTA-7282.
Ademas, en un ejemplo preferido, las celulas STRO-1+ son capaces de dar lugar a CFU-F clonogenica.
Se prefiere que una proporcion significativa de las celulas multipotenciales STRO-1+ sean capaces de diferenciarse en al menos dos lmeas germinales diferentes. Los ejemplos no limitantes de los linajes a los que pueden comprometerse las celulas multipotenciales incluyen celulas precursoras de huesos; progenitores de hepatocitos, que son multipotentes para celulas epiteliales de los conductos biliares y hepatocitos; celulas restringidas neuronales, que pueden generar precursores de celulas gliales que progresan a oligodendrocitos y astrocitos; precursores neuronales que progresan a neuronas; precursores de musculo cardfaco y cardiomiocitos, lmeas celulares beta pancreaticas secretoras de insulina que responden a la glucosa. Otros linajes incluyen, pero no se limitan a, odontoblastos, celulas productoras de dentina y condrocitos, y celulas precursoras de los siguientes: celulas epiteliales pigmentarias de la retina, fibroblastos, celulas de la piel tales como queratinocitos, celulas dendnticas, celulas del folmulo piloso, celulas epiteliales del conducto renal, celulas del musculo liso y esqueletico, progenitores testiculares, celulas endoteliales vasculares, tendon, ligamento, cartflago, adipocito, fibroblastos, estroma medular, musculo cardfaco, musculo liso, musculo esqueletico, pericito, celulas vasculares, epiteliales, gliales, neuronales, astrocitos y oligodendrocitos .
En otro ejemplo, las celulas STRO-1+ no son capaces de generar, tras el cultivo, celulas hematopoyeticas.
En un ejemplo, las celulas se toman del sujeto a tratar, se cultivan in vitro usando tecnicas estandar y se usan para obtener factores sobrenadantes o solubles o celulas expandidas para administracion al sujeto como una composicion autologa o alogenica. En un ejemplo alternativo, se usan celulas de una o mas de las lmeas celulares
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humanas establecidas. En otro ejemplo util de la invencion, se usan celulas de un animal no humano (o si el paciente no es un humano, de otra especie).
Aqu se divulga el uso de factores sobrenadantes o solubles obtenidos o derivados de celulas STRO-1 + y/o celulas de progenie de las mismas (estas ultimas tambien se denominan celulas expandidas) que se producen a partir de cultivo in vitro. Las celulas expandidas pueden tener una amplia variedad de fenotipos dependiendo de las condiciones de cultivo (incluyendo el numero y/o tipo de factores estimuladores en el medio de cultivo), el numero de pasajes y similares. En ciertos ejemplos, las celulas de la progenie se obtienen despues de aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, o aproximadamente 10 pasajes de la poblacion original. Sin embargo, las celulas de la progenie se pueden obtener despues de cualquier cantidad de pasajes de la poblacion original.
Las celulas de la progenie se pueden obtener cultivando en cualquier medio adecuado. El termino "medio", como se usa en referencia a un cultivo celular, incluye los componentes del entorno que rodea las celulas. Los medios pueden ser solidos, lfquidos, gaseosos o una mezcla de fases y materiales. Los medios incluyen medios de crecimiento lfquido, asf como medios lfquidos que no sostienen el crecimiento celular. Los medios tambien incluyen medios gelatinosos tales como agar, agarosa, gelatina y matrices de colageno. Los medios gaseosos de ejemplo incluyen la fase gaseosa a la que estan expuestas las celulas que crecen en una placa de petri u otro soporte solido o semisolido. El termino "medio" tambien se refiere al material que esta destinado para su uso en un cultivo celular, incluso si todavfa no se ha contactado con las celulas. En otras palabras, un lfquido rico en nutrientes preparado para cultivo bacteriano es un medio. Una mezcla en polvo que cuando se mezcla con agua u otro lfquido se vuelve adecuada para el cultivo celular puede denominarse un "medio en polvo".
En un ejemplo, las celulas de progenie utiles para los metodos descritos en este documento se obtienen aislando celulas TNAP+ STRO-1 + de medula osea usando perlas magneticas marcadas con el anticuerpo STRO-3, y luego cultivo expandiendo las celulas aisladas (vease Gronthos et al. 85: 929-940, 1995 para un ejemplo de condiciones de cultivo adecuadas).
En un ejemplo, dichas celulas expandidas (progenie) (preferiblemente, al menos despues de 5 pasajes) pueden ser TNAP", CC9+, HLA clase I+, HLA clase IT, CD14-, CD19-, CD3", CD11ac, CD31-, CD86-, CD34- y/o CD80'. Sin embargo, es posible que bajo diferentes condiciones de cultivo a las descritas aqrn, la expresion de diferentes marcadores pueda variar. Ademas, aunque las celulas de estos fenotipos pueden predominar en la poblacion de celulas agotadas, no significa que hay una proporcion menor de las celulas que no tienen este fenotipo o fenotipos (por ejemplo, un pequeno porcentaje de las celulas expandidas puede ser CC9") En un ejemplo preferido, las celulas expandidas todavfa tienen la capacidad de diferenciarse en diferentes tipos de celulas.
En un ejemplo, una poblacion celular expandida utilizada para obtener factores sobrenadantes o solubles, o celulas per se, comprende celulas en las que al menos el 25%, mas preferiblemente al menos el 50%, de las celulas son CC9+.
En otro ejemplo, una poblacion celular expandida usada para obtener factores sobrenadantes o solubles, o celulas per se, comprende celulas en las que al menos 40%, mas preferiblemente al menos 45%, de las celulas son STRO- 1+.
En un ejemplo adicional, las celulas expandidas pueden expresar uno o mas marcadores seleccionados colectivamente o individualmente del grupo que consiste en LFA-3, THY-1, VCAM-1, ICAM-1, PECAM-1, P- selectina, L-selectina , 3G5, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD90, CD29, CD18, CD61, integrina beta 6-19, trombomodulina, CD10, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGF1-R, NGF-R, FGF-R, leptina-R (STRO-2 = leptina-R), RANKL, STRO-1bnllante y CD146 o cualquier combinacion de estos marcadores.
En un ejemplo, las celulas de progenie son progenie de celulas Multipotenciales STRO-1+ expandidas multipotenciales (MEMPs) como se define y/o se describe en el documento WO 2006/032092. Los metodos para preparar poblaciones enriquecidas de celulas multipotenciales STRO-1+ de las que se puede derivar la progenie se describen en los documentos WO 01/04268 y WO 2004/085630. En un contexto in vitro, las celulas multipotenciales STRO-1+ raramente estaran presentes como una preparacion absolutamente pura y generalmente estaran presentes con otras celulas que son celulas comprometidas espedficas de tejido (TSCCs). El documento WO 01/04268 se refiere a cosechar dichas celulas de la medula osea a niveles de pureza de aproximadamente 0,1% a 90%. La poblacion que comprende MPCs de los que se deriva la progenie se puede cosechar directamente de una fuente de tejido, o alternativamente puede ser una poblacion que ya se ha expandido ex vivo.
Por ejemplo, la progenie se puede obtener a partir de una poblacion cosechada, no expandida, de celulas multipotenciales STRO-1+ sustancialmente purificadas, que comprende al menos aproximadamente 0,1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o el 95% de las celulas totales de la poblacion en la que estan presentes. Este nivel se puede lograr, por ejemplo, seleccionando celulas que sean positivas para al menos un marcador seleccionado individual o colectivamente del grupo que consiste en TNAP, STRO-1brillante, 3G5+, VCAM-1, THY-1, CD146 y STRO-2.
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Las MEMPS se pueden distinguir de las celulas multipotenciales STRO-1 + reden cosechadas porque son positivas para el marcador STRO-1bri y negativas para el marcador fosfatasa alcalina (ALP). En contraste, las celulas multiprotenciales STRO-1 + recien aisladas son positivas tanto para STRO-1bn como para ALP. En un ejemplo preferido de la presente invencion, al menos 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de las celulas administradas tienen el fenotipo STRO-1bn, ALP". En otro ejemplo preferido, las MEMPS son positivas para uno o mas de los marcadores Ki67, CD44 y/o CD49c/CD29, VLA-3, a3p1. En aun otro ejemplo preferido, los MEMPs no muestran actividad TERT y/o son negativos para el marcador CD18.
La poblacion inicial de celulas STRO-1+ puede derivarse de uno o mas tipos de tejidos establecidos en WO 01/04268 o WO 2004/085630, espedficamente, medula osea, celulas de pulpa dental, tejido adiposo y piel, o tal vez mas ampliamente a partir de tejido adiposo, dientes, pulpa dental, piel, tngado, rinon, corazon, retina, cerebro, folfculos pilosos, intestino, pulmon, bazo, nodulo linfatico, timo, pancreas, hueso, ligamento, medula osea, tendon y musculo esqueletico.
Se entendera que al realizar la presente invencion, la separacion de celulas portadoras de cualquier marcador de superficie celular puede efectuarse mediante varios metodos diferentes, sin embargo, los metodos preferidos dependen del enlace de un agente de enlace (por ejemplo, un fragmento de enlace de anticuerpo o antigeno del mismo) al marcador en cuestion seguido de una separacion de aquellos que muestran enlace, ya sea enlace de alto nivel, o enlace de bajo nivel o sin enlace. Los agentes de enlace mas convenientes son anticuerpos o moleculas con base en anticuerpos, preferiblemente siendo anticuerpos monoclonales o con base en anticuerpos monoclonales debido a la especificidad de estos ultimos agentes. Los anticuerpos pueden usarse para ambos pasos, sin embargo, tambien se pueden usar otros agentes, por lo que los ligandos para estos marcadores tambien se pueden emplear para enriquecer las celulas que los portan, o que carecen de ellos.
Los anticuerpos o ligandos se pueden unir a un soporte solido para permitir una separacion cruda. Las tecnicas de separacion preferiblemente maximizan la retencion de la viabilidad de la fraccion a recolectar. Se pueden emplear diversas tecnicas de diferente eficacia para obtener separaciones relativamente crudas. La tecnica particular empleada dependera de la eficacia de la separacion, la citotoxicidad asociada, la facilidad y la velocidad de rendimiento, y la necesidad de equipos sofisticados y/o habilidades tecnicas. Los procedimientos para la separacion pueden incluir, pero sin limitacion, separacion magnetica, uso de perlas magneticas recubiertas de anticuerpo, cromatograffa de afinidad y "criba" con anticuerpo unido a una matriz solida. Las tecnicas que proporcionan una separacion precisa incluyen, pero no se limitan a, FACS. Los metodos para realizar FACS seran evidentes para la persona experimentada en la tecnica.
Los anticuerpos contra cada uno de los marcadores descritos aqrn estan disponibles comercialmente (por ejemplo, anticuerpos monoclonales contra STRO-1 comercializados por R&DSystems, EE. UU.), disponibles en AtcC u otra organizacion depositaria y/o pueden producirse usando tecnicas reconocidas en la tecnica.
Se prefiere que el metodo para aislar celulas STRO-1+, por ejemplo, comprenda un primer paso que es una etapa de clasificacion en fase solida que utiliza, por ejemplo, seleccion de celulas activadas magneticamente (MACS) que reconoce la expresion de alto nivel de sTrO-1. A continuacion, puede seguir una segunda etapa de clasificacion, si se desea, para dar como resultado un nivel superior de expresion de celulas precursoras como se describe en la especificacion de patente WO 01/14268. Este segundo paso de clasificacion podna implicar el uso de dos o mas marcadores.
El metodo para obtener celulas STRO-1+ tambien podna incluir la cosecha de una fuente de las celulas antes del primer paso de enriquecimiento usando tecnicas conocidas. Por lo tanto, el tejido se eliminara quirurgicamente. Las celulas que comprenden el tejido de origen se separaran luego en una denominada suspension de celulas individuales. Esta separacion se puede lograr por medios ffsicos o enzimaticos.
Una vez que se ha obtenido una poblacion de celulas STRO-1+ adecuada, se puede cultivar o expandir por cualquier medio adecuado para obtener MEMPs.
En un ejemplo, las celulas se toman del sujeto a tratar, se cultivan in vitro usando tecnicas estandar y se usan para obtener factores sobrenadantes o solubles o celulas expandidas para administracion al sujeto como una composicion autologa o alogenica. En un ejemplo alternativo, las celulas de una o mas de las lrneas celulares humanas establecidas se usan para obtener los factores sobrenadantes o solubles. En otro ejemplo util, las celulas de un animal no humano (o si el paciente no es un ser humano, de otra especie) se usan para obtener factores sobrenadantes o solubles.
La invencion se puede poner en practica usando celulas de cualquier especie animal no humana, que incluye, pero no se limita a, celulas de primate no humano, celulas de ungulados, caninos, felinos, lagomorfos, roedores, aviares y peces. Las celulas de primates con las que se puede realizar la invencion incluyen, pero no se limitan a, celulas de chimpances, mandriles, monos cynomolgus y cualquier otro mono del nuevo o del viejo mundo. Las celulas de ungulados con las que se puede realizar la invencion incluyen, pero no se limitan a, celulas de bovinos, porcinos, ovinos, caprinos, equinos, bufalos y bisontes. Las celulas de roedor con las que se puede realizar la invencion
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incluyen, pero no se limitan a, celulas de raton, rata, cobayo, hamster y jerbo. Los ejemplos de especies de lagomorfos con los que se puede realizar la invencion incluyen conejos domesticados, liebre norteamericana, liebres, conejo de cola de algodon, liebre americana y ochotona. Los pollos (Gallus gallus) son un ejemplo de una especie aviar con la cual se puede realizar la invencion.
Las celulas utiles para la invencion se pueden almacenar antes del uso. Los metodos y protocolos para preservar y almacenar celulas eucariotas, y en particular celulas de mairnfero, son conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Pollard, J.W. and Walker, J.M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Segunda Edicion, Humana Press, Totowa, NJ; Freshney, R.I. (2000) Culture of Animal Cells, Cuarta Edicion, Wiley-Liss, Hoboken, NJ). Se puede utilizar cualquier metodo que mantenga la actividad biologica de las celulas madre aisladas tales como las celulas madre mesenquimales/celulas progenitoras, o su progenie, en conexion con la presente invencion. En un ejemplo preferido, las celulas se mantienen y almacenan usando criopreservacion.
Celulas geneticamente modificadas
En un ejemplo, las celulas STRO-1 + y/o las celulas de su progenie estan geneticamente modificadas, por ejemplo, para expresar y/o secretar una protema de interes, por ejemplo, una protema que proporciona un beneficio terapeutico y/o profilactico, por ejemplo, insulina, glucagon, somatostatina, tripsinogeno, quimotripsinogeno, elastasa, carboxipeptidasa, lipasa o amilasa pancreatica o un polipeptido asociado o causante de la angiogenesis potenciada o un polipeptido asociado con la diferenciacion de una celula en una celula pancreatica o una celula vascular.
Los metodos para modificar geneticamente una celula seran evidentes para la persona experimentada en la tecnica. Por ejemplo, un acido nucleico que se va a expresar en una celula se une operativamente a un promotor para inducir la expresion en la celula. Por ejemplo, el acido nucleico esta unido a un promotor operable en una variedad de celulas de un sujeto, tal como, por ejemplo, un promotor viral, por ejemplo, un promotor CMV (por ejemplo, un promotor CMV-IE) o un promotor SV-40. Se conocen promotores adecuados adicionales en la tecnica y se tomaran para aplicar mutatis mutandis al presente ejemplo de la invencion.
Preferiblemente, el acido nucleico se proporciona en forma de una construccion de expresion. Como se usa aqrn, el termino "estructura de expresion" se refiere a un acido nucleico que tiene la capacidad de conferir expresion en un acido nucleico (por ejemplo, un gen informador y/o un gen informador contraseleccionable) al que esta operativamente conectado, en una celula. Dentro del contexto de la presente invencion, debe entenderse que una estructura de expresion puede comprender o ser un plasmido, bacteriofago, fagemido, cosmido, fragmento subgenomico o genomico del virus u otro acido nucleico capaz de mantener y/o replicar ADN heterologo en un formato expresable.
Los metodos para la construccion de una estructura de expresion adecuada para la realizacion de la invencion seran evidentes para la persona experimentada en la tecnica y se describen, por ejemplo, en Ausubel et al. (En: Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, IsBn 047 150338, 1987) o Sambrook et al (en: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, tercera edicion 2001). Por ejemplo, cada uno de los componentes de la estructura de expresion se amplifica a partir de un molde de acido nucleico adecuado usando, por ejemplo, PCR y posteriormente se clona en una estructura de expresion adecuada, tal como, por ejemplo, un plasmido o un fagemido.
Los vectores adecuados para tal estructura de expresion son conocidos en la tecnica y/o se describen aqrn. Por ejemplo, un vector de expresion adecuado para el metodo de la presente invencion en una celula de mamffero es, por ejemplo, un vector del conjunto de vectores pcADN suministrado por Invitrogen, un vector del conjunto de vectores pCI (Promega), un vector del conjunto de vectores pCMV (Clontech), un vector pM (Clontech), un vector pSI (Promega), un vector VP 16 (Clontech) o un vector del conjunto de vectores pcADN (Invitrogen).
El experto en la tecnica conocera vectores y fuentes adicionales de dichos vectores, tales como, por ejemplo, Invitrogen Corporation, Clontech o Promega.
Los medios para introducir la molecula de acido nucleico aislada o una estructura genica que los comprende en una celula para la expresion son conocidos por los expertos en la tecnica. La tecnica utilizada para un organismo dado depende de las tecnicas exitosas conocidas. Los medios para introducir ADN recombinante en las celulas incluyen microinyeccion, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, transfeccion mediada por liposomas tal como mediante el uso de lipofectamina (Gibco, MD, Estados Unidos) y/o celfectina (Gibco, MD, Estados Unidos), captacion de ADN mediada por PEG , electroporacion y bombardeo de micropartmulas, como el uso de partmulas de oro o tungsteno recubiertas de ADN (Agracetus Inc., WI, Estados Unidos), entre otros.
Alternativamente, una estructura de expresion de la invencion es un vector viral. Los vectores virales adecuados son conocidos en la tecnica y estan disponibles comercialmente. Los sistemas con base en virus convencionales para la administracion de un acido nucleico y la integracion de ese acido nucleico en el genoma de una celula huesped incluyen, por ejemplo, un vector retroviral, un vector lentiviral o un vector viral adenoasociado. Alternativamente, un
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vector adenovrnco es util para introducir un acido nucleico que permanece episomal en una celula huesped. Los vectores virales son un metodo eficiente y versatil de transferencia de genes en celulas y tejidos diana. Ademas, se han observado eficiencias de transduccion elevadas en muchos tipos de celulas y tejidos diana diferentes.
Por ejemplo, un vector retroviral generalmente comprende repeticiones terminales largas (LTRs) que actuan en cis con capacidad de empaquetamiento para hasta 6-l0 kb de secuencia extrana. Los LTRs mmimos que actuan en cis son suficientes para la replicacion y el empaquetamiento de un vector, que luego se usa para integrar la estructura de expresion en la celula diana para proporcionar expresion a largo plazo. Los vectores retrovirales ampliamente usados incluyen aquellos con base en el virus de la leucemia murina (MuLV), virus de leucemia mono de gibbon (GaLV), virus de la inmunodeficiencia simia (SrV), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y combinaciones de los mismos (vease, por ejemplo, Buchscher et al., J Virol. 56:2731-2739 (1992); Johann et al, J. Virol. 65:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al, Virol. 76:58-59 (1990); Wilson et al, J. Virol. 63:274-2318 (1989); Miller et al., J Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700; Miller and Rosman BioTechniques 7:980-990, 1989; Miller, A. D. Human Gene Therapy 7:5-14, 1990; Scarpa et al Virology 75:849-852, 1991; Burns et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:80338037, 1993).
Diversos sistemas de vectores de virus adenoasociados (AAV) tambien se han desarrollado para la administracion de acido nucleico. Los vectores AAV se pueden construir facilmente usando tecnicas conocidas en la tecnica. Ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,173,414 y 5,139,941; Publicaciones Internacionales Nos. WO 92/01070 y WO 93/03769; Lebkowski et al. Molec. Cell. Biol. 5:3988-3996, 1988; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter Current Opinion in Biotechnology 5:533-539, 1992; Muzyczka. Current Topics in Microbiol, and Immunol. 158:97-129, 1992; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801, 1994; Shelling and Smith Gene Therapy 7:165-169, 1994; y Zhou et al. J Exp. Med. 179:1867-1875, 1994.
Vectores virales adicionales utiles para administrar una estructura de expresion de la invencion incluyen, por ejemplo, los derivados de la familia de virus de viruela, tales como virus vaccinia y virus de viruela aviar o un alfavirus o un vector de virus conjugado (por ejemplo, el descrito en Fisher-Hoch et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 56: 317-321, 1989).
Ensayo de potencial terapeutico/profilactico de celulas y factores solubles
Los metodos para determinar la capacidad de las celulas o los factores solubles para tratar o prevenir o retrasar el inicio o la progresion de la disfuncion pancreatica seran evidentes para las personas experimentadas en la tecnica.
Por ejemplo, celulas o factores solubles (por ejemplo, una mezcla de factores o un solo factor o una fraccion de factores (por ejemplo, derivados por purificacion por afinidad o cromatograffa)) se administran a un sujeto de prueba, por ejemplo, un animal de prueba por un tiempo y en condiciones suficientes para proporcionar un beneficio terapeutico/profilactico y se evaluen los niveles de glucosa en reposo o basales o en ayunas y/o se realiza una prueba de tolerancia a la glucosa. Tales pruebas se realizan usando kits y/o dispositivos disponibles comercialmente. Los niveles basales o de glucosa en ayunas se evaluan despues de ayunar, por ejemplo, durante aproximadamente 8 a aproximadamente 14 horas. Para una prueba de tolerancia a la glucosa, un sujeto ayuna durante aproximadamente 8 a aproximadamente 14 horas y luego consume glucosa (por ejemplo, aproximadamente
I, 75 gramos de glucosa por kilogramo de peso corporal) y se evalua el nivel de glucosa sangumea despues de aproximadamente 2 a 3 horas. Segun la Organizacion Mundial de la Salud, la glucosa plasmatica en ayunas debe ser inferior a 6,1 mmol/l (100 mg/dl). Los niveles de ayuno entre 6,1 y 7,0 mmol/l (100 y 126 mg/dl) estan en el lfmite ("glucemia alterada en ayunas") y los niveles de ayuno repetidamente a o superiores a 7,0 mmol/l (126 mg/dl) son diagnosticos de diabetes. El nivel de glucosa de 2 horas debe estar por debajo de 7,8 mmol/l (140 mg/dl). Niveles entre esto y 11,1 mmol/l (200 mg/dl) indican tolerancia alterada a la glucosa. Los niveles de glucosa superiores a
II, 1 mmol/l (200 mg/dl) a las 2 horas confirman un diagnostico de diabetes.
Preferiblemente, el sujeto de prueba sufre de disfuncion pancreatica. Por ejemplo, el sujeto de prueba es un raton diabetico no obeso (NOD) (un modelo de diabetes tipo I) o un raton o rata a los que se ha administrado estreptozotocina (modelos de diabetes tipo I y/o tipo II; ver Lukic et al.,Developmental Immunol. 6: 119-128, 1998 y Arulmozhi et al., Indian J. Pharmacol., 36: 217-221, 2004), Goto Kakizaki (GK) rata (modelo de diabetes tipo II), Nueva Zelanda raton obeso (NZO) (modelo de diabetes tipo II). Otros modelos de diabetes tipo I y/o tipo II se describen en, por ejemplo, Rees and Alcolado, Diabet. Med. 22:359-70, 2005.
Las celulas y/o factores solubles que reducen los niveles basales de glucosa y/o mejoran la tolerancia a la glucosa en dicho modelo de disfuncion pancreatica en comparacion con un animal no tratado o el animal de prueba antes del tratamiento se consideran probables para tratar o prevenir o retrasar el inicio o la progresion de disfuncion pancreatica.
Alternativamente, o ademas, los niveles de insulina se evaluan en la circulacion de un sujeto de prueba, por ejemplo, usando un ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzima o ligado a fluorescencia. Las celulas y/o los factores solubles que aumentan los niveles de insulina en la circulacion de un sujeto de prueba, se considera que es probable que traten, prevengan o retrasen el inicio o la progresion de la disfuncion pancreatica.
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Los kits y ensayos para determinar los niveles sericos de glucagon o somatostatina son conocidos en la tecnica y/o estan disponibles comercialmente, por ejemplo, de Immuno-Biological Laboratories, Inc o Millipore Corporation.
Alternativamente, o ademas, se determina un nivel serico de amilasa usando un ensayo colorimetrico, por ejemplo, como se describe en Caraway, Am. J. Clin. Pathol., 32: 97-99, 1959 o un ensayo fluorometrico, por ejemplo, como se describe en Rinderknecht y Marbach, Clin. Chem. Acta., 29: 107-110, 1972. los factores o celulas que mantienen los niveles de amilasa serica a niveles normales (por ejemplo, 21-101 U/L) se considera que es probable que traten o prevengan o retrasen el inicio o la progresion de la disfuncion pancreatica.
Los niveles de amilasa tambien pueden determinarse en secciones de pancreas o en jugo pancreatico, por ejemplo, obtenidos por intubacion duodenal peroral. Estas muestras tambien proporcionan muestras para medir los niveles de tripsinogeno, quimotripsinogeno, elastasa, carboxipeptidasa, lipasa pancreatica. Por ejemplo, Connon et al., Digestive Diseases and Sciences, 23: 472-475, 1978 describen un ensayo para determinar los niveles de lipasa pancreatica en el jugo pancreatico.
Los ensayos descritos en los parrafos anteriores tambien son adecuados para la monitorizacion continua de un sujeto que recibe un tratamiento como se describe aqrn segun cualquier ejemplo.
Sera evidente para la persona experimentada en la tecnica de lo anterior que un metodo para identificar o aislar una celula o un factor soluble para el tratamiento de disfunciones pancreaticas puede comprender:
(i) administrar una celula o un factor soluble a un sujeto de prueba que padece una disfuncion pancreatica y evaluar la funcion pancreatica del sujeto;
(ii) comparar la funcion pancreatica del sujeto en (i) con la funcion pancreatica de un sujeto de control que padece una disfuncion pancreatica a la que no se le ha administrado la celula o el factor soluble,
en el que la funcion pancreatica mejorada en el sujeto de prueba en comparacion con el sujeto de control indica que la celula o factor soluble trata la disfuncion pancreatica.
Un metodo para identificar o aislar una celula para un factor soluble para la prevencion o retraso de las disfunciones pancreaticas puede comprender:
(i) administrar una celula o un factor soluble a un sujeto de prueba y luego inducir una disfuncion pancreatica en el sujeto de prueba;
(ii) comparar la funcion pancreatica del sujeto en (i) con la funcion pancreatica de un sujeto de control que padece una disfuncion pancreatica a la que no se le ha administrado la celula o el factor soluble,
en el que la funcion pancreatica mejorada en el sujeto de prueba en comparacion con el sujeto de control indica que la celula o el factor soluble previenen o retrasan el inicio de la disfuncion pancreatica.
La celula puede ser cualquier celula descrita aqrn de acuerdo con cualquier ejemplo.
Composiciones celulares
En un ejemplo de la presente invencion, las celulas STRO-1 + se administran en forma de una composicion. Preferiblemente, dicha composicion comprende un portador y/o excipiente farmaceuticamente aceptable.
Los terminos "portador" y "excipiente" se refieren a composiciones de materia que se usan convencionalmente en la tecnica para facilitar el almacenamiento, la administracion, y/o la actividad biologica de un compuesto activo (vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Ed. Mac Publishing Company (1980). Un portador tambien puede reducir cualquier efecto secundario indeseable del compuesto activo. Un portador adecuado es, por ejemplo, estable, por ejemplo, incapaz de reaccionar con otros ingredientes en el portador. En un ejemplo, el portador no produce un efecto adverso significativo local o sistemico en los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas para el tratamiento.
Los portadores adecuados para esta invencion incluyen los usados convencionalmente, por ejemplo, agua, solucion salina, dextrosa acuosa, lactosa, solucion de Ringer, una solucion regulada, hialuronano y glicoles son portadores lfquidos preferidos, particularmente (cuando son isotonicos) para soluciones. Los portadores y excipientes farmaceuticos adecuados incluyen almidon, celulosa, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sflice, estearato de magnesio, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, cloruro de sodio, glicerol, propilenglicol, agua, etanol, y similares.
En otro ejemplo, un vehfculo es una composicion de medios, por ejemplo, en la que una celula crece o se suspende. Preferiblemente, dicha composicion de medios no induce ningun efecto adverso en un sujeto al que se administra.
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Los portadores y excipientes preferidos no afectan adversamente la viabilidad de una celula y/o la capacidad de una celula para reducir, prevenir o retrasar la disfuncion pancreatica.
En un ejemplo, el portador o excipiente proporciona una actividad reguladora para mantener las celulas y/o los factores solubles a un pH adecuado para ejercer de ese modo una actividad biologica, por ejemplo, el portador o excipiente es solucion salina regulada con fosfato (PBS). PBS representa un portador o excipiente atractivo porque interacciona mmimamente con celulas y factores y permite la liberacion rapida de las celulas y factores, en tal caso, la composicion de la invencion se puede producir como un lfquido para la aplicacion directa a la corriente sangumea o en un tejido o una region que rodea o adyacente a un tejido, por ejemplo, mediante inyeccion.
Las celulas STRO-1+ tambien se pueden incorporar o incrustar dentro de armazones que son compatibles con el receptor y que se degradan en productos que no son perjudiciales para el receptor. Estos armazones proporcionan soporte y proteccion para las celulas que se van a trasplantar a los sujetos receptores. Los armazones biodegradables naturales y/o sinteticos son ejemplos de tales armazones.
Una variedad de diferentes armazones se puede usar con exito en la practica de la invencion. Los armazones preferidos incluyen, pero no se limitan a armazones biologicos y degradables. Los armazones biodegradables naturales incluyen armazones de colageno, fibronectina y laminina. El material sintetico adecuado para un armazon de trasplante celular debena ser capaz de soportar un crecimiento celular y un funcionamiento celular extensos. Tales armazones tambien pueden ser reabsorbibles. Los armazones adecuados incluyen armazones de acido poliglicolico, por ejemplo, como se describe por Vacanti, et al. J. Ped. Surg. 23: 3-9 1988; Cima, et al. Biotechnol. Bioeng. 38:145 1991; Vacanti, et al. Plast. Reconstr. Surg. 88: 753-9 1991; o polfmeros sinteticos tales como poliantndridos, poliortoesteres y acido polilactico.
En otro ejemplo, las celulas pueden administrarse en un armazon de gel (tal como Gelfoam de Upjohn Company.
Las composiciones celulares utiles para la presente invencion se pueden administrar solas o como mezclas con otras celulas. Las celulas que pueden administrarse junto con las composiciones de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, otras celulas multipotentes o pluripotentes o celulas madre, o celulas de medula osea. Las celulas de diferentes tipos se pueden mezclar con una composicion de la invencion inmediatamente o poco antes de la administracion, o se pueden cultivar conjuntamente durante un penodo de tiempo antes de la administracion.
Preferiblemente, la composicion comprende una cantidad efectiva o una cantidad de celulas terapeutica o profilacticamente efectiva. Por ejemplo, la composicion comprende aproximadamente 1x105 celulas STRO-1+/kg a aproximadamente 1x107 celulas STRO-1+/kg o aproximadamente 1x106 celulas STRO-1+/kg a aproximadamente 5x106 celulas STRO-1+/kg. La cantidad exacta de celulas a administrar depende de una variedad de factores, que incluyen la edad, el peso y el sexo del paciente, y el alcance y la gravedad de la disfuncion pancreatica.
En algunos ejemplos, las celulas estan contenidas dentro de una camara que no permite que las celulas salgan a la circulacion de un sujeto, sin embargo, eso permite que los factores secretados por las celulas entren en la circulacion. De esta manera, los factores solubles se pueden administrar a un sujeto permitiendo que las celulas secreten los factores en la circulacion del sujeto. Dicha camara puede implantarse igualmente en un sitio en un sujeto para aumentar los niveles locales de los factores solubles, por ejemplo, implantados en o cerca de un pancreas.
En algunos ejemplos de la invencion, puede no ser necesario o deseable inmunosuprimir a un paciente antes del inicio de la terapia con composiciones celulares. En consecuencia, el trasplante con STRO-1+ alogenico, o incluso xenogenico, puede ser tolerado en algunos casos.
Sin embargo, en otros casos puede ser deseable o apropiado inmunosuprimir farmacologicamente a un paciente antes de iniciar la terapia celular. Esto se puede lograr mediante el uso de agentes inmunosupresores sistemicos o locales, o se puede lograr administrando las celulas en un dispositivo encapsulado. Las celulas pueden estar encapsuladas en una capsula que es permeable a los nutrientes y el oxfgeno requerido por la celula y los factores terapeuticos que la celula aun es impermeable a los factores y celulas inmunes humorales. Preferiblemente, el encapsulante es hipoalergenico, esta situado de manera facil y estable en un tejido diana, y proporciona proteccion adicional a la estructura implantada. Estos y otros medios para reducir o eliminar una respuesta inmune a las celulas trasplantadas son conocidos en la tecnica. Como alternativa, las celulas pueden modificarse geneticamente para reducir su inmunogenicidad.
Composiciones de factores solubles
Los factores solubles o sobrenadantes derivados de celulas STRO-1+ y/o de celulas de progenie se administran en la forma de una composicion, por ejemplo, que comprende un portador y/o excipiente adecuado. Preferiblemente, el portador o excipiente no afecta adversamente al efecto biologico de los factores solubles o sobrenadante.
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En un ejemplo, la composicion comprende una composicion de materia para estabilizar un factor soluble o un componente del sobrenadante, por ejemplo, un inhibidor de proteasa. Preferiblemente, el inhibidor de proteasa no esta incluido en una cantidad suficiente para tener un efecto adverso sobre un sujeto.
Las composiciones que comprenden sobrenadantes o factores solubles derivados de celulas STRO-1 + y/o derivadas de celulas progenie se pueden preparar como suspensiones lfquidas apropiadas, por ejemplo, en medio de cultivo o en un portador estable o una solucion reguladora, por ejemplo, solucion salina regulada con fosfato. Los portadores adecuados se describen aqu anteriormente. En otro ejemplo, las suspensiones que comprenden sobrenadante o factores solubles derivados de celulas STRO-1 + y/o celulas de progenie son suspensiones oleosas para inyeccion. Los disolventes o vehfculos lipofilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sesamo; o esteres de acidos grasos sinteticos, tales como oleato de etilo o trigliceridos; o liposomas. Las suspensiones que se utilizaran para inyeccion tambien pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspension tambien puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumenten la solubilidad de los compuestos para permitir la preparacion de soluciones altamente concentradas.
Las soluciones inyectables esteriles se pueden preparar incorporando los factores sobrenadantes o solubles en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinacion de ingredientes descritos anteriormente, segun se requiera, seguido de esterilizacion por filtracion.
Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los factores sobrenadantes o solubles en un vehnculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son el secado al vado y la liofilizacion que produce un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente deseado adicional de una solucion previamente esterilizada filtrada del mismo. De acuerdo con un aspecto alternativo de la invencion, los factores sobrenadantes o solubles se pueden formular con uno o mas compuestos adicionales que mejoran su solubilidad.
Se describen otros portadores o excipientes a modo de ejemplo, por ejemplo, Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N. Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N. Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y.
Las composiciones terapeuticas tfpicamente debenan ser esteriles y estables bajo las condiciones de fabricacion y almacenamiento. La composicion se puede formular como una solucion, microemulsion, liposoma u otra estructura ordenada. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de la dispersion y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, sera preferible incluir en la composicion agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composicion un agente que retrasa la absorcion, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Ademas, los factores solubles se pueden administrar en una formulacion de liberacion temporal, por ejemplo en una composicion que incluye un polfmero de liberacion lenta. Los compuestos activos pueden prepararse con portadores que protegeran el compuesto contra la liberacion rapida, tal como una formulacion de liberacion controlada, que incluye implantes y sistemas de administracion microencapsulados. Se pueden usar polfmeros biodegradables y biocompatibles, como etileno acetato de vinilo, polianhndridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres, acido polilactico y polilactico, copolfmeros poliglicolicos (PLG). Muchos metodos para la preparacion de tales formulaciones estan patentados o son conocidos en general por las personas experimentadas en la tecnica.
Los factores sobrenadantes o solubles pueden administrarse en combinacion con una matriz apropiada, por ejemplo, para proporcionar una liberacion lenta de los factores solubles.
Componentes adicionales de las composiciones
El sobrenadante derivado de celulas STRO-1+ o los factores solubles, las celulas STRO-1+ o la progenie de las mismas se pueden administrar con otros farmacos beneficiosos o moleculas biologicas (factores de crecimiento, factores troficos). Cuando se administran con otros agentes, se pueden administrar juntos en una unica composicion farmaceutica, o en composiciones farmaceuticas separadas, simultanea o secuencialmente con los otros agentes (ya sea antes o despues de la administracion de los otros agentes). Los factores bioactivos que pueden administrarse conjuntamente incluyen agentes antiapoptoticos (por ejemplo, EPO, mimeticuerpo de EPO, TPO, IGF-I e IGF-II, HGF, inhibidores de caspasa); agentes antiinflamatorios (por ejemplo, inhibidores de MAPK p38, inhibidores de TGF-beta, estatinas, inhibidores de IL-6 e IL-1, PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE, SIROLIMUS y AINEs
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(farmacos antiinflamatorios no esteroideos, por ejemplo, TEPOXALINA, TOLMETIN, SUPROFEN); agentes inmunosupresores/inmunomoduladores (por ejemplo, inhibidores de calcineurina, tales como ciclosporina, tacrolimus, inhibidores de mTOR (por ejemplo, SIROLIMUS, EVEROLIMUS), antiproliferativos (por ejemplo, azatioprina, micofenolato mofetilo), corticosteroides (por ejemplo, prednisolona, hidrocortisona); anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales anti receptor IL-2Ralfa (por ejemplo, basiliximab, daclizumab), anticuerpos policlonales anti celulas T (por ejemplo, globulina antitimocito (ATG), globulina antilinfocito (ALG), anticuerpo monoclonal anti celulas T (OKT3)); agentes antitrombogenicos (por ejemplo, heparina, derivados de heparina, uroquinasa, PPack (dextrofenilalanina prolina arginina clorometilcetona), compuestos antitrombina, antagonistas del receptor plaquetario, anticuerpos antitrombina, anticuerpos anti receptor plaquetario, aspirina, dipiridamol, protamina, hirudina, inhibidores de la prostaglandina e inhibidores de plaquetas); y antioxidantes (por ejemplo, probucol, vitamina A, acido ascorbico, tocoferol, coenzima Q-10, glutation, L-cistema, N-acetilcistema) asf como anestesicos locales.
En un ejemplo, una composicion como se describe aqrn de acuerdo con cualquier ejemplo comprende un factor adicional para el tratamiento o la profilaxis de una disfuncion pancreatica. Por ejemplo, la composicion comprende una biguanida, una tiazolidindiona, una sulfonilurea, un derivado de acido benzoico, un inhibidor de alfa-glucosidasa, un inhibidor de SGLT2, y un peptido INGAP, un inhibidor de dipeptidil peptidasa-IV, un sensibilizador de insulina (por ejemplo, un agonista de PPAR o una biguanida), insulina, un mimetico de insulina, un antagonista del receptor de glucagon, un GLP-1, un mimetico de GLP-1, un agonista del receptor de GLP-1; GIP, un mimetico de GIP, un agonista de receptor de GIMP, PACAP, un mimetico de PACAP, un agonista de receptor 3 de PACAP; un agente reductor del colesterol (por ejemplo, inhibidor de la HMG-CoA reductasa, un secuestrante, un alcohol nicotirnlico, un acido nicotmico), un agonista doble de PPARa/Y o un compuesto antiobesidad.
En otro ejemplo, una composicion como se describe aqrn de acuerdo con cualquier ejemplo comprende
adicionalmente un factor que induce o potencia la diferenciacion de una celula progenitora en una celula pancreatica. Los ejemplos de factores incluyen, Wnt, factor de crecimiento epidermico, factor de crecimiento de fibroblastos o TGFp.
En otro ejemplo, una composicion como se describe aqrn de acuerdo con cualquier ejemplo comprende
adicionalmente un factor que induce o potencia la diferenciacion de una celula progenitora en una celula vascular.
Los ejemplos de factores incluyen, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, por ejemplo, PDGF-BB) y FGF.
En otro ejemplo, una composicion como se describe aqrn de acuerdo con cualquier ejemplo comprende
adicionalmente una celula comprometida espedfica de tejido (TSCC). A este respecto, la Solicitud de Patente Internacional No. WO 2006/032092 demuestra que la administracion de celulas TSCC y STRO-1 + puede conducir a una proliferacion mejorada del TSCC. En un ejemplo, el TSCC es una celula pancreatica, por ejemplo, una celula p o una mezcla de celulas pancreaticas, por ejemplo, un islote de Langerhans. La administracion de tal composicion a un sujeto puede conducir a una produccion incrementada de, por ejemplo, islotes de celulas p de Langerhans. En otro ejemplo, el TSCC es una celula vascular. La administracion de tal composicion a un sujeto puede conducir a una produccion incrementada de vasculatura, por ejemplo, en un pancreas, por ejemplo, conduciendo a que se administren nutrientes incrementados al pancreas.
Dispositivos medicos
Tambien se divulgan aqrn dispositivos medicos para su uso o cuando se usan en un metodo como se describe aqrn de acuerdo con cualquier ejemplo. Por ejemplo, una jeringa o cateter u otro dispositivo de administracion adecuado puede comprender celulas STRO-1 + y/o celulas de progenie de las mismas y/o factores solubles de las mismas y/o una composicion de la invencion. Opcionalmente, la jeringa o el cateter se empaca con instrucciones de uso en un metodo como se describe aqrn de acuerdo con cualquier ejemplo.
Se puede proporcionar un implante que comprende celulas STRO-1+ y/o celulas de progenie de las mismas y/o factores solubles a partir del mismo y/o una composicion de la invencion. Opcionalmente, el implante se empaca con instrucciones para su uso en un metodo como se describe aqrn de acuerdo con cualquier ejemplo. Los implantes adecuados pueden formarse con un armazon, por ejemplo, como se describe anteriormente aqrn y celulas STRO-1 + y/o celulas de progenie de los mismos y/o factores solubles del mismo.
Modos de administracion
Las celulas STRO-1+ pueden implantarse quirurgicamente, inyectarse, administrarse (por ejemplo, a traves de un cateter o jeringa) o administrarse directa o indirectamente al sitio que necesita reparacion o aumento, por ejemplo, un pancreas o en el sistema sangumeo de un sujeto.
Preferiblemente, las celulas STRO-1+ se administran a la corriente sangumea de un sujeto. Por ejemplo, las celulas STRO-1+ se administran por via parenteral. Las rutas de ejemplo de administracion parenteral incluyen, pero no se limitan a, intraperitoneal, intraventricular, intracerebroventricular, intratecal. Preferiblemente, las celulas STRO-1+ se
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administran intraarterialmente, en una aorta, en una auricula o ventriculo del corazon o en un vaso sangumeo conectado a un pancreas, por ejemplo, una aorta abdominal, una arteria mesenterica superior, una arteria pancreaticoduodenal o una arteria esplenica. En otro ejemplo, las celulas STRO-1 + se administran a una arteria femoral o a una arteria celfaca.
En el caso de la administracion de celulas a una auricula o ventriculo del corazon, se prefiere que las celulas se administren a la auricula o ventriculo izquierdo para evitar las complicaciones que pueden surgir del suministro rapido de celulas a los pulmones.
Preferiblemente, las celulas STRO-1 + se inyectan en el sitio de administracion, por ejemplo, usando una jeringa o a traves de un cateter o una lmea central.
La seleccion de un regimen de administracion para una formulacion terapeutica depende de varios factores, que incluyen la rata de renovacion del suero o del tejido de la entidad, el nivel de smtomas y la inmunogenicidad de la entidad. Preferiblemente, un regimen de administracion maximiza la cantidad de compuesto terapeutico administrado al paciente consistente con un nivel aceptable de efectos secundarios. Por consiguiente, la cantidad de formulacion administrada depende en parte de la entidad particular y de la gravedad de la afeccion que se trata.
En un ejemplo, las celulas STRO-1+ se administran como una sola dosis de bolo. Alternativamente, las celulas STRO-1+ se administran mediante infusion continua, o mediante dosis a intervalos de, por ejemplo, un dfa, una semana o 1-7 veces por semana. Un protocolo de dosis preferido es uno que implica la dosis maxima o frecuencia de dosis que evita los efectos secundarios indeseables significativos. Una dosis semanal total depende del tipo y la actividad del compuesto utilizado. La determinacion de la dosis apropiada se realiza por un medico, por ejemplo, usando parametros o factores conocidos o sospechosos en la tecnica para afectar el tratamiento o se predice que afectara el tratamiento. Generalmente, la dosis comienza con una cantidad algo menor que la dosis optima y se aumenta en pequerios incrementos a partir de entonces hasta que se alcanza el efecto deseado u optimo con respecto a cualquier efecto secundario negativo. Las medidas diagnosticas importantes incluyen las de los smtomas de la diabetes.
De acuerdo con los metodos dirigidos a tratar o retrasar la progresion de la disfuncion pancreatica, se prefiere que las celulas STRO-1+ se administren despues del diagnostico del trastorno, por ejemplo, usando metodos estandar conocidos en la tecnica y/o descritos aqrn, por ejemplo, tolerancia a la glucosa.
Para aquellos ejemplos dirigidos a prevenir o retrasar el inicio de la disfuncion pancreatica, se prefiere que las celulas STRO-1+ se administren antes del diagnostico clmico del trastorno, por ejemplo, cuando el sujeto padece tolerancia alterada a la glucosa y/o glucemia alterada en ayunas y/o en el caso de diabetes tipo I antes de o concomitante con una respuesta autoinmune tal como se indica por la expansion de una poblacion de celulas T y/o celulas B y/o por la produccion de autoanticuerpos (por ejemplo, expansion de celulas T citotoxicas) contra las celulas del islote pancreatico p y/o autoanticuerpos contra uno o mas marcadores de celulas del islote pancreatico P en el inicio o la progresion de la diabetes tipo 1). Los metodos para determinar o predecir el inicio de una respuesta autoinmune seran evidentes para la persona experimentada y/o se describiran aqrn. Por ejemplo, la deteccion de un autoanticuerpo contra un anrigeno derivado de o sobre la superficie de una celula pancreatica p es indicativa de una respuesta inmune contra dicha celula por un sujeto. Uno de tales ensayos detecta anticuerpos de celulas de islotes en el suero de un sujeto. Este ensayo comprende poner en contacto una seccion de un pancreas que comprende una celula de islote con suero de un sujeto de prueba. La inmunoglobulina en el suero del sujeto que es capaz de enlazarse a una celula de islote pancreatico p se detecta a continuacion usando un anticuerpo secundario marcado que se enlaza a la inmunoglobulina humana. Un metodo adecuado para detectar anticuerpos de celulas de islotes utilizando un marcador fluorescente se describe, por ejemplo, en Bottazzo et al, Lancet 2: 127983, 1974. Alternativamente, o ademas, se usa un ensayo para detectar un autoanticuerpo que se enlaza a un anrigeno espedfico en un sujeto. A modo de ejemplo, Brooking et al. (Clin Chim Acta 331:55-59, 2003) describen un ensayo con base en ELISA para la deteccion de autoanticuerpos contra GAD65. El ensayo descrito utiliza una baja concentracion del anrigeno GAD en una placa de microtitulacion para capturar los autoanticuerpos en una muestra. Se agrega GAD biotinilada en la fase fluida y es capturada por el segundo sitio de enlace del autoanticuerpo, y es la GAD65 biotinilada la que se detecta para producir una serial detectable no isotopica. Nagata et al., Ann. New York Acad. Sci 1037: 10-15, 2004 describen un ensayo ELISPOT util para detectar la presencia de autoanticuerpos contra insulina, IA-2 y GAD65.
Metodos para controlar la terapia/profilaxis
Los metodos para controlar la terapia/profilaxis seran evidentes para la persona experimentada en la tecnica en base a la descripcion aqrn. Por ejemplo, los niveles de glucosa en sangre y/o los niveles de insulina y/o los niveles de amilasa se evaluan usando metodos conocidos en la tecnica y/o descritos aqrn.
En otro ejemplo, se obtiene una muestra de pancreas (por ejemplo, una biopsia) despues del tratamiento y el numero de celulas beta (por ejemplo, celulas que expresan insulina) y/o celulas alfa (por ejemplo, celulas que expresan glucagon) y/o islotes y/o celulas que expresan PDX-1, por ejemplo, usando inmunohistoqmmica,
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inmunofluorescencia o un ensayo de amplificacion de acido nucleico, por ejemplo, reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Dichos ensayos se describen aqm.
La presente invencion se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1
Tratamiento de ratones diabeticos con celulas STRO-1 +
1.1 Materiales y Metodos
Diabetes inducida por estreptozotocina (STZ) en ratones
Ratones NOD/scid machos inmunodeficientes (NOD.CB17-Prkdcscid/J; Animal Research Centre, Perth, Australia) a las 7-8 semanas de edad se inyectaron por via intraperitoneal (i.p.) con 35 mg/kg de la toxina de celulas beta, estreptozotocina (STZ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) diariamente en los dfas 1-4 despues de 4 horas de ayuno matutino. STZ se disolvio en regulador de citrato de sodio, pH 4,5, y se inyecto dentro de los 15 minutos de preparacion. Los ratones se mantuvieron bajo condiciones esteriles.
Infusion de celulas y grupos de tratamiento
Celulas estromales STRO-1 + inmunomagneticamente seleccionadas de celulas de medula osea depositadas se expandieron en cultivo esencialmente como se describe por Gronthos y Zannetino (Methods Mol Biol. 449:45-57, 2008) y se obtuvieron de Angioblast Systems, Estados Unidos. El pasaje 4, celulas estromales STRO-1 + crioconservadas en ProFreeze™-CDM (Lonza, Estados Unidos) se descongelaron y se constituyeron 2,5 x 106 celulas en 200 pl de veldculo por raton para inyeccion inmediata. En el dfa 10, despues del tratamiento con STZ, a los ratones NOD/scid se les inyecto una sola dosis de celulas a traves de la pared toracica en el ventnculo izquierdo (ruta arterial) de ratones anestesiados. A los ratones de control se les inyectaron 200 pl de veldculo (ProFreeze™- CDM que contema DMSO al 7,5% y alfa-MEM) a traves de las vfas arterial o venosa.
Ensayos para glucosa en sangre e insulina
La glucosa en sangre se analizo en sangre de la vena de la cola con un glucometro (Optimum Xceed™ Diabetes Monitoring System, Abbott Diagnostics, Victoria, Australia) despues de 4 horas de ayuno matutino. La insulina sangumea se ensayo en sangre obtenida por puncion intracardfaca de ratones anestesiados antes de que se sacrificaran el dfa 32 mediante el uso de un kit ELISA espedfico para raton (Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA Mercodia, Uppsala, Suecia).
Preparacion de muestras de tejido
Los animales se sacrificaron mediante dislocacion cervical y el pancreas se extrajo y se diseco simetricamente, con una mitad fijada en formalina neutra al 10% y la otra incrustada en el compuesto Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA) y se congelaron en hielo seco y se almacenaron a -70 °C. Si bien el pancreas se uso espedficamente para la mayona del analisis en este estudio, otros tejidos como pulmon, hfgado, corazon, bazo, estomago, intestino/ciego, vejiga, tesdculos y cerebro fueron recolectados para histopatologfa.
Tincion histologica e inmunofluorescente del tejido pancreatico
Para la histologfa del pancreas, las secciones fijadas en formol incrustadas en parafina (FFPE) se tineron con hematoxilina y eosina (H&E). Las secciones de tejido de FFPE (5 pm) montadas en portaobjetos de microscopio de vidrio se desparafinaron y se sometieron a recuperacion de andgeno por calentamiento en regulador de citrato en una olla a presion. Despues las secciones de recuperacion de andgenos se bloquearon con suero normal de cabra al 10% durante 2 horas y se utilizaron para la deteccion por inmunofluorescencia utilizando los siguientes anticuerpos que se han probado previamente y se ha demostrado que detectan moleculas espedficas de raton en los tejidos recuperados de andgeno: antiinsulina de cobayo (1:100; Millipore, Estados Unidos), antiglucagon de raton (10 pg/ml; clon K79bB10; AbCAM), antiPDX-1 de raton (10 pg/ml; clon 267712; R&D Systems). Despues del paso de incubacion del anticuerpo primario durante 2 horas, los portaobjetos se lavaron tres veces durante 5 minutos con suero normal de cabra/PBS al 0,1% y se incubaron durante 90 minutos adicionales a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios espedficos de especie (1:400; cabra antiraton Alexa Fluor 555; sonda molecular o Rhodamina de cabra anticobayo; Jackson Laboratories o IgG1-FITC de cabra antiraton; AbCAM). Los controles incluyeron omision del anticuerpo primario. La tincion de la actina de musculo liso (SMA) en tejidos pancreaticos se realizo por inmunofluorescencia directa usando un mAb anti-SMA-FITC de raton (2 mg/ml, clon 1A4; AbCAM).
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Evaluacion de la inmunotincion
Los portaobjetos se visualizaron en un microscopio Zeiss Observer Z1 (Alemania) y las imagenes se fotografiaron utilizando AxioCam MRm. Las imagenes capturadas de secciones pancreaticas tenidas con H&E o anticuerpos a insulina, glucagon, PDX-1 y SMA y detectadas con sondas fluorescentes se analizaron con el software Axio Vision Rel 4.7. Cada seccion de H&E de 5 mm de cada animal experimental se uso para contar el numero total de islotes y se analizaron para determinar el tamano del islote (medidas de area y diametro) y se normalizaron para cada area de seccion total respectiva medida por analisis de imagenes. Ademas, cada antigeno recuperado de 5 pm de seccion de FFPE tenida con antiinsulina, glucagon o anticuerpo PDX-1 se contaron para el numero total de celulas tenidas positivamente y se normalizaron al area total de la seccion medida total o al area del islote total. La distribucion de los microvasos pancreaticos de diferentes diametros se contaron y se midieron mediante analisis de imagen y se normalizaron a su respectiva area de seccion examinada. Todas las imagenes se analizaron con objetivos de 20-40x magnificacion.
Analisis de ARN por RAT-PCR semicuantitativa
Las muestras de ARN de los pancreas de los grupos experimentales se extrajeron en reactivo Trizol a partir de un total de secciones de 100 mm de cada tejido congelado. Los extractos de tejido Trizol se purificaron para ARN utilizando el Mini kit illustra de aislamiento de ARN ARNspin (GE Healthcare, Reino Unido). El ARN total se cuantifico espectrofotometricamente y se sometio a transcripcion inversa 1 pg con oligo-dT (pdTi2-i8) y transcriptasa inversa MMLV. Las muestras de ADNc se amplificaron por PCR usando cebadores para genes murinos para MafA, Ngn3 y Pdx-1 usando ADN polimerasa Tth Plus (Roche Applied Science) bajo condiciones de amplificacion especificadas en la Tabla 1. El gen de beta-actina se uso para normalizar la expresion del gen diana. Los productos de PCR se cuantificaron por analisis densitometrico de bandas visualizadas bajo iluminacion UV usando el software Kodak ID 3,5.
Tabla 1. Condiciones de PCR
gen
producto bp Condiciones dclicas ciclos
Actina
238 94°C 1min/55°C 30seg/72°C 30seg 28
NGN3
347 94°C 1min/55°C 30seg/72°C 30seg 45
MafA
393 94°C 1min/58°C 30sec/72°C 30sec 45
PDX-1
243 94°C 1min/55°C 30seg/72°C 30seg 30
Analisis estadfstico
La prueba T de Student se uso para los valores P. 1.2 Resultados
Hiperglucemia inducida por estreptozotocina en ratones NOD/scid
La hiperglucemia se indujo en ratones NOD/scid mediante cuatro inyecciones intraperitoneales diarias de 35 mg/kg/dfa de STZ. En el dfa 1 del estudio, es decir, antes de la primera inyeccion de STZ, el nivel medio de glucosa en sangre en ayunas (BGL) para todo el grupo de animales (N=80) fue 7 mM +/-1,5 desviaciones estandar (SD). Se considero que los animales desarrollaban hiperglucemia si teman un BGL en el dfa 10 del estudio (es decir, 5 dfas despues de la finalizacion del curso de STZ) que era mayor que 3SD por encima del nivel medio de glucosa en ratones no tratados. Los ratones que no lograron hiperglucemia de acuerdo con este criterio fueron posteriormente excluidos de todos los analisis. Hubo 29 ratones que cumplieron el criterio anterior para la hiperglucemia en el dfa 10. En estos ratones, el BGL medio en el dfa 10 fue 15,2 mM +/- 0,6, un incremento del 217% por encima del valor basal.
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Efecto de la inyeccion intraarterial de diabeticos NOD/scid
Como se muestra en la Figura 1, hiperglucemicos por v^a intraarterial posteriores a la terapia celular.
La Figura 1 muestra que una unica inyeccion intraarterial de celulas STRO-1 + indujo la reduccion temprana de BGL en ratones diabeticos en comparacion con la inyeccion intraarterial del vehmulo solo. La reduccion en BGL fue evidente tan temprano como en el dfa 17, fue maxima en el dfa 24 (reduccion media del 35%, BGL medio 12,7 mM +/-1.2 vs 19,6 mM +/- 2,1, p=0,012), y persistio a lo largo de las tres semanas de seguimiento.
La inyeccion intraarterial unica de celulas STRO-1 + da como resultado una reduccion temprana y persistente de los niveles de glucosa en sangre en relacion con el valor basal
celulas estromales STRO-1 + en los niveles de glucosa en sangre en ratones
una dosis unica de 2,5 x 106 celulas STRO-1 + inyectadas en ratones dio como resultado una reduccion de BGL a lo largo de las 3 semanas
Los ratones tratados con STZ que recibieron una unica inyeccion intraarterial de celulas STRO-1 + demostraron una reduccion persistente en BGL media en relacion con el nivel de valor basal en el dfa 10 a lo largo de las tres semanas de seguimiento. Como se muestra en la Figura 2, este grupo de animales tema valores medios de BGL por debajo de los niveles previos a la terapia a lo largo de todo el penodo de estudio, mientras que los controles tratados con medios demostraron un aumento progresivo de los niveles de BGL. El grupo que recibio una inyeccion intraarterial de celulas STRO-1+ en el dfa 10 despues del tratamiento con STZ demostro una reduccion media de BGL de -11%, -14% y -4% con respecto al valor basal de BGL en los dfas 7, 14 y 21, respectivamente. Por el contrario, el grupo de control que recibio medios intraarteriales solos demostro aumentos medios de BGL de +8%, +20% y +17% con respecto al valor basal de BGL en los dfas 7, 4 y 21, respectivamente.
La inyeccion intraarterial unica de celulas humanas STRO-1+ en ratones NOD/scid diabeticos da como resultado un aumento significativo de los niveles circulantes de insulina en ratones tres semanas despues
Como se muestra en la Figura 3, los niveles de insulina en suero circulante medidos el dfa 21 despues del tratamiento, con ELISA de insulina espedfico de raton demostraron que los ratones diabeticos inyectados intraarterialmente tres semanas antes con celulas STRO-1+ ternan niveles de insulina endogena circulante significativamente mas altos en comparacion con ratones diabeticos tratados con vehmulo (0,79 mg/L +/- 0,11 vs 0,57 mg/L +/-0,02; p=0,009).
La inyeccion intraarterial unica de celulas STRO-1+ da como resultado una mayor densidad de microvasos pancreaticos en ratones diabeticos NOD/scid
Los tejidos pancreaticos se tineron con un anticuerpo monoclonal directamente conjugado (mAb) contra la protema actina del musculo liso para determinar si la terapia celular STRO-1+ induce la arteriogenesis en el pancreas danado. Despues de la inmunotincion, se exploro toda la seccion y se conto el numero total de microvasos y se normalizo el area total de la seccion. Los numeros de vasos se contaron y categorizaron segun el tamano en 3 diametros de vasos distintos de <20 pm, 20-100 pm y >100 pm. La Figura 4 muestra que hubo un aumento del 176% en el numero de microvasos positivos para actina de musculo liso con diametros <20 pm en el grupo de terapia celular STRO-1+ en comparacion con el grupo de vehroulo (299,8 +/- 52 vs 169,1 +/- 18,5; p=0,01). Por lo tanto, la terapia con celulas STRO-1+ inducen una respuesta arteriolar de pequeno calibre dentro del pancreas danado.
La infeccion intraarterial unica de las celulas STRO-1+ da como resultado una expresion pancreatica aumentada del factor de transcripcion PDX-1 en ratones NOD/scid diabeticos
Para evaluar si la terapia celular humana STRO-1+ podna inducir una respuesta regenerativa en celulas beta endogenas de ratones NOD/scid diabeticos, niveles de expresion de ARNm de los factores de transcripcion PDX-1, MafA y Ngn3 asociados con el desarrollo pancreatico y la generacion de celulas beta (Zhou et al., Nature 455:627632, 2008) fueron examinados. Como se muestra en la Figura 5A, hubo un aumento de 2,5 veces (p=0,01) en los niveles medios de ARNm pancreatico para el factor de transcripcion PDX-1 en el grupo de terapia celular STRO-1 + en comparacion con el grupo de vehroulos. Tambien se observaron aumentos en los niveles de ARNm pancreatico para los factores de transcripcion MafA y Ngn3, pero estos no alcanzaron importancia.
Para confirmar que los niveles aumentados de protema del factor de transcripcion PDX se expresaron en islotes pancreaticos expuestos a terapia celular STRO-1+, secciones de islotes de ratones NOD/scid sanos no diabeticos, ratones NOD/scid diabeticos tratados con medios de control y ratones NOD/scid diabeticos tratados con celulas STRO-1+ se examinaron inmunohistoqmmicamente usando mAb anti-PDX-1. Como se muestra en la Figura 5B, el tratamiento con estreptozotocina dio como resultado una reduccion del 59% en el numero medio de celulas de los islotes que fueron positivas a la protema PDX-1 en comparacion con ratones sanos no diabeticos (37,1 +/- media 12 celulas positivas/islote frente a 15,1 +/- 4,8 media de celulas positivas/islote, p=0,03). En comparacion con los animales tratados con estreptozotocina que recibieron medios de control, la inyeccion intraarterial de celulas STRO-
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1+ aumento el numero de celulas de los islotes que eran positivos a la protema PDX-1 por una media del 71% (25,7 +/- 2,2 media celulas positivas/islote, p=0,049), dando como resultado una reduccion media en las celulas positivas a la protema PDX-1 en comparacion con los animales no diabeticos de solo el 31% (p=NS). La fotomicrograffa fluorescente en la Figura 5C muestra que los islotes pancreaticos de animales NOD/scid representativos que no eran diabeticos o que eran diabeticos y se trataron con celulas STRO-1 + demostraron numeros similares de celulas positivas para PDX-1. Por el contrario, un islote pancreatico de un animal NOD/scid representativo que era diabetico y recibio medios de control demostro numeros significativamente reducidos de celulas que son positivas a la protema PDX-1.
La infeccion intraarterial unica de las celulas STRO-1+ da como resultado un aumento en el numero de islotes pancreaticos
Tambien se evaluo el efecto del tratamiento con celulas STRO-1+ sobre el numero total de islotes pancreaticos. Como se muestra en la Figura 6A, los animales que recibieron una sola inyeccion intraarterial de celulas STRO-1 + tres semanas antes demostraron durante el sacrificio mas del doble numero de islotes pancreaticos en comparacion con los controles inyectados con solo medio (0,78 +/- 0,07 frente a 0,38 +/- 0,07 islotes/mm2, p=0,0012). Aparte de un aumento en el numero total de islotes, no se observaron cambios significativos en el diametro medio del islote o el area del islote entre los grupos de tratamiento, Figuras 6B y 6C.
La inyeccion intraarterial unica de celulas STRO-1+ da como resultado numeros incrementados de celulas beta endogenas, reduccion en celulas alfa y restablecimiento de una proporcion de celulas beta/alfa de Norman dentro de los islotes en ratones NOD/scid diabeticos
Se uso tincion de mAb de insulina anti-raton para cuantificar numeros de celulas beta dentro de islotes en secciones pancreaticas de ratones NOD/scid sanos no diabeticos, ratones NOD/scid diabeticos tratados con medios de control y ratones NOD/scid diabeticos tratados intraarterialmente con celulas STRO-1+. Como se muestra en la Figura 7A, el tratamiento con estreptozotocina produjo una reduccion del 21% en el numero de celulas beta dentro del islote en comparacion con ratones sanos no diabeticos (6.726 +/- 450/mm2 area del islote frente a 5.289 +/- 387/mm2, p=0,04). En comparacion con los animales tratados con estreptozotocina que recibieron control, la inyeccion intraarterial de celulas STRO-1+ aumento el numero de celulas beta en una media del 8% (5.709 +/- 690/mm2), lo que resulto en una reduccion media de las celulas beta en comparacion con animales no diabeticos de solo el 15% (p=NS). En la fotomicrograffa fluorescente en la Figura B, las celulas beta dentro de un islote de un animal de control no diabetico representativo demuestran la localizacion de celulas fluorescentes positivas a la insulina ffpicamente empaquetadas densamente en el area central del islote. Sin embargo, en un raton representativo tratado con STZ, las celulas beta son menos abundantes y muestran un patron alterado en el islote. Las celulas beta en un raton representativo tratado con celulas STRO-1+ demuestran un patron intermedio de fluorescencia que es mas abundante y menos alterado.
La tincion con mAb antiglucagon se uso para cuantificar numeros de celulas alfa dentro de islotes en secciones pancreaticas de ratones NOD/scid sanos no diabeticos, ratones NOD/scid diabeticos tratados con medios de control y ratones NOD/scid diabeticos tratados intraarterialmente con celulas STRO-1+. Como se muestra en la Figura 7C, el tratamiento con estreptozotocina produjo un aumento del 470% en el numero de celulas alfa en un islote en comparacion con ratones sanos no diabeticos (1.046 +/- 46/mm2 area del islote frente a 4.954 +/- 632/mm2, p=0,003). En comparacion con los animales tratados con estreptozotocina que recibieron medios de control, la inyeccion intraarterial de celulas STRO-1+ redujo el numero de celulas alfa en una media del 44% (2.764 +/- 274/mm2, p=0,008), lo que resulto en una media aumento en las celulas alfa en comparacion con los animales no diabeticos de solo el 164% (p=0,002). En la fotomicrograffa fluorescente mostrada en la Figura 7D, las celulas alfa dentro del islote normal de un animal de control no diabetico representativo pueden identificarse como celulas tenidas con glucagon ordenadas de forma cuidadosa circunferencialmente. Sin embargo, en un raton representativo tratado con STZ, las celulas alfa son mas abundantes y muestran un patron difuso en todo el islote. Las celulas alfa en el islote de un raton representativo tratadas con celulas STRO-1+ demuestran un patron de fluorescencia mas periferico y son menos abundantes en todo el centro del islote.
La Figura 7E representa la proporcion de celulas beta en relacion con celulas alfa dentro de islotes de secciones pancreaticas de ratones NOD/scid sanos no diabeticos, ratones diabeticos NOD/scid tratados con medios de control y ratones NOD/scid diabeticos tratados intraarterialmente con celulas STRO-1+. El tratamiento con estreptozotocina produjo una disminucion del 40% en el porcentaje de numeros de celulas beta en relacion con las celulas alfa y beta totales dentro de un islote en comparacion con ratones sanos no diabeticos (86 +/- 0,9% frente a 52 +/- 2,6%, p=0,00002). En comparacion con los animales tratados con estreptozotocina que recibieron medios de control, la inyeccion intraarterial de celulas STRO-1+ aumento la proporcion de celulas beta en relacion con las celulas alfa en una media del 29% (52 +/- 2,6% frente a 67 +/- 3,9%, p=0,005). Por lo tanto, el tratamiento con celulas STRO-1+ de ratones NOD/scid convertidos en diabeticos por la estreptozotocina dio como resultado un restablecimiento de una proporcion mas normal de celulas beta a celulas alfa dentro de los islotes pancreaticos.
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Discusion
Este estudio proporciona evidencia por primera vez de que una sola dosis de celulas humanas STRO-1 + fue efectiva para inducir la regeneracion sostenida de celulas beta e invertir la hiperglucemia en ratones NOD/scid diabeticos por estreptozotocina. El modelo experimental de diabetes inducido por estreptozotocina (STZ) da como resultado un fenotipo diabetico similar al observado despues de la cafda del gen PDX-1, con numeros reducidos de celulas beta productoras de insulina, aumento de celulas alfa productoras de glucagon y reduccion del ARNm de GLUT2 y expresion de protema (Liu et al., Mol Ther 15:86-93, 2007, y Wang et al., Diabetes 47:50-6, 1998). Una sola dosis de celulas STRO-1 + dio como resultado una activacion sostenida de PDX-1, un aumento en el numero de celulas beta endogenas, una reduccion de las celulas alfa que expresan glucagon y una produccion mejorada de insulina.
La induccion sostenida en la expresion de PDX-1 y la homeostasis reestablecida entre celulas pancreaticas beta y alfa en ratones diabeticos NOD/scid tratados con STZ despues de una dosis unica de celulas STRO-1+ son caractensticas sorprendentemente similares a las informadas despues de la administracion de terapia genica que inducen la sobreexpresion a largo plazo del peptido-1 similar al glucagon (GLP-1) en el mismo modelo murino (Liu et al., Mol Ther 15:86-93, 2007). GLP-1 es un peptido derivado del intestino que migra al pancreas, activa PDX-1 y GLUT2, y da como resultado un aumento de la secrecion de insulina. Su descubrimiento ha llevado al desarrollo de dos nuevas clases de agentes que resultan en una mayor actividad de GLP-1 en celulas beta: (a) analogos de GLP- 1 que son agonistas de receptores de accion prolongada o resistentes a la degradacion por el antagonista natural de GLP-1, dipeptidil peptidasa IV (DPPIV), y (2) antagonistas de DPPIV oralmente activos que dan como resultado un aumento de la actividad endogena de GLP-1.
Sin embargo, el uso clmico de estos agentes se ha limitado al tratamiento de formas leves de diabetes tipo II. Su vida media relativamente corta, la necesidad de una administracion frecuente y la relativa falta de potencia en casos de perdida grave de celulas beta han impedido su uso como agentes ahorradores de insulina para diabeticos tipo 1 u otros pacientes dependientes de insulina. De hecho, los antagonistas de DPPIV son incapaces de revertir la diabetes establecida en ratones tratados con STZ a pesar de aumentar los niveles endogenos de GLP-1 (Kim et al., Diabetes 50:1562-1570, 2001), y solo pueden mejorar la hiperglucemia en el contexto de administracion sostenida concomitante con dosis bajas de STZ y perdida parcial de celulas beta (Mu et al., Diabetes 55:1695-1704, 2006). De manera similar, los agonistas de GLP-1 son solo efectivos cuando se administran antes o de forma concomitante con STZ y requieren administracion sostenida (Tourrell et al., Diabetes 50:1562-1570, 2001; Li et al., J Biol Chem 278:471-478, 2003; Gezginci-Oktayoglu and Bolkent, Biochem Cell Biol 87:641-651, 2009). En conjunto, estos datos sugieren que los inhibidores de DPPIV y los analogos de GLP-1 son solo efectivos para facilitar la regeneracion de celulas beta cuando aun existe una masa de celulas beta significativa.
En contraste, el presente estudio sugiere que incluso una sola inyeccion de celulas STRO-1+ puede inducir la regeneracion sostenida de las celulas beta incluso cuando todavfa existe poca masa de celulas beta. Esto se evidencia por la capacidad de las celulas para revertir la hiperglucemia establecida cuando se administran 5 dfas despues de la finalizacion de un ciclo de altas dosis de STZ, un modelo de perdida completa de celulas beta. Resultados similares solo pueden lograrse mediante la sobreexpresion sostenida de GLP-1 usando terapia genica (Liu et al., Mol Ther 15:86-93, 2007). Los efectos potentes y duraderos de la terapia STRO-1+ indican que este tipo de terapia celular puede proporcionar el control sostenido de la glucosa y los efectos ahorradores de insulina en diabeticos dependientes de insulina que no pueden proporcionar los inhibidores de DPPIV o los analogos de GLP-1.

Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Celulas STRO-1 + para uso en el tratamiento de la diabetes mellitus en un sujeto que lo necesite.
    5 2. Las celulas para el uso de la reivindicacion 1, en las que la diabetes mellitus es diabetes mellitus tipo I o diabetes
    mellitus tipo II.
  2. 3. Las celulas para el uso de la reivindicacion 1, en las que las celulas STRO-1 + son para administracion directamente en el flujo sangumeo de un sujeto.
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  3. 4. Las celulas para el uso de la reivindicacion 3, en las que las celulas STRO-1+ son para administracion intraarterial.
  4. 5. Las celulas para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en las que las celulas STRO-1+ para administracion al sujeto son STRO-1bri y/o expresan fosfatasa alcalina no espedfica de tejido (TNAP).
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  5. 6. Las celulas para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en las que las celulas STRO-1+ se cultivaron previamente in vitro.
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