TWI765305B - 血小板外泌體結合幹細胞外泌體之混合凍晶粉及其製作方法 - Google Patents

血小板外泌體結合幹細胞外泌體之混合凍晶粉及其製作方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI765305B
TWI765305B TW109125121A TW109125121A TWI765305B TW I765305 B TWI765305 B TW I765305B TW 109125121 A TW109125121 A TW 109125121A TW 109125121 A TW109125121 A TW 109125121A TW I765305 B TWI765305 B TW I765305B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
stem cell
platelet
sample
exosome
exosomes
Prior art date
Application number
TW109125121A
Other languages
English (en)
Other versions
TW202203949A (zh
Inventor
呂瑞華
呂遠融
Original Assignee
呂瑞華
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 呂瑞華 filed Critical 呂瑞華
Priority to TW109125121A priority Critical patent/TWI765305B/zh
Priority to CN202110755875.2A priority patent/CN113969260A/zh
Publication of TW202203949A publication Critical patent/TW202203949A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI765305B publication Critical patent/TWI765305B/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0644—Platelets; Megakaryocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/19—Platelets; Megacaryocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/51—Umbilical cord; Umbilical cord blood; Umbilical stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F26—DRYING
    • F26B—DRYING SOLID MATERIALS OR OBJECTS BY REMOVING LIQUID THEREFROM
    • F26B5/00—Drying solid materials or objects by processes not involving the application of heat
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明提供一種血小板血漿外泌體結合幹細胞外泌體之混合凍晶粉及其製作方法，其步驟包含：對一血小板血漿樣本於無菌環境中進行離心以取得第一血小板外泌體；對一全血樣本於無菌環境中進行離心以取得血小板樣本，接著對該血小板樣本於無菌環境中進行離心以取得第二血小板外泌體；對一幹細胞培養基樣本於無菌環境中進行離心以取得第一幹細胞外泌體；對一幹細胞樣本以超音波震盪及離心的方式取得第二幹細胞外泌體；上述之樣品分別經由冷凍乾燥後，得到血小板外泌體粉末與幹細胞外泌體之混合凍晶粉。

Description

血小板外泌體結合幹細胞外泌體之混合凍晶粉及其製作方法
本發明係關於一種凍晶粉及其製作方法，並且特別地，關於一種結合自富含血小板血漿與人體間質幹細胞所取出外泌體之混合凍晶粉及其製作方法。
外泌體(exosomes)是細胞吞噬異源物質後以出芽方式向內凹陷形成含有多個小泡的多泡體(multivesicular body,MVB)，再由多泡體與細胞膜融合而釋放的小囊泡，其為一種直徑約為30~100nm的細胞外囊性小泡。外泌體可分布於幹細胞、腫瘤細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、肥大細胞、人羊膜上皮細胞、內皮祖細胞等不同類型的細胞釋放，且廣泛分佈於各種體液中，如唾液、腹水、心包積液、尿液、羊水、乳汁、腦脊液和血液等。外泌體還攜帶多種分子成分參與細胞通訊、細胞遷移、血管新生和腫瘤細胞生長等生理和病理過程。外泌體之結構內包含信息核酸結構(mRNA)、微核醣核酸(microRNA)、去氧核核醣核酸(DNA)片段、蛋白質、脂質、等多種物質，其中microRNA是細胞間交流的主要調節物質，能夠通過自身的降解和再表達來調節受體細胞的基因表達，在肺癌、結腸直腸癌、前列腺癌等中可作為癌症早期診斷及預後的生物標誌物如今，研究已經發現外泌體在腫瘤細胞 發生發展、神經細胞信號轉導過程中都發揮著重要作用。
富含血小板血漿(platelet rich plasma,PRP)因含有大量具有生物活性的血小板，在一定的條件下，這些血小板可以透過活化過程將儲存在其中的多種細胞因子釋放在周圍環境中，以促進細胞增殖、分化及組織重建修復，因此，對於治療及醫美方面屬一新穎且便利之技術。
自體血小板血漿技術除了可運用於骨科治療之外，在傷口的處理上也已經大量運用在糖尿病足、褥瘡等慢性傷口的照顧，同時，眼科也應用此自體血小板血漿治療角膜潰瘍或乾眼症，而牙科則可應用於植牙拔牙牙根傷口的填補修復。另外，在醫學美容的領域中，可應用此技術於消除皺紋及改善禿髮。
幹細胞內之間質幹細胞(Mensenchymal stem cells,MSC)是一種來源於中胚層的細胞，具有自我更新及多向分化能力。而且MSC能從多種組織中分離得到，常見的MSC一般是從骨髓、脂肪、臍帶、臍血等組織提取，因此推動了其應用。在許多動物模型中可觀察到MSC的旁分泌作用，相關研究證明，MSC是通過分泌因子來發揮其治療作用以減少細胞損傷和增強修復的，這種分泌因子是被稱為外泌體的膜囊泡。在臨床組織再生應用的研究中指出，所述之細胞生長因子可促進毛髮生長。此外，所述之細胞生長因子對於糖尿病患者所造成的局部組織缺血以及在整形手術做為傷口和疤痕的修復擁有一定程度的幫助。
MSC作為外泌體的來源具有兩個顯著的特徵，即免疫調節特性和低生產成本。MSC來源的外泌體可調控固有免疫與適應性免疫應答，通過抑制T淋巴細胞功能，降低B細胞活化、增殖與分泌，影響巨噬細胞分化與樹突狀細胞成熟，抑制自然殺傷細胞的細胞毒活性來發揮其 免疫調控作用，從而提高MSC外泌體衍生藥物遞送載體的壽命和藥物的生物利用度。而且，越來越多的證據顯示MSC相比其他細胞能產生大量的外泌體。
因此，高純度的外泌體有利於進行內容物的分析和功能的研究，並且由高純度的外泌體取得分泌因子之效率較高。然而在習知技術中，由血小板取出的外泌體所製成的混合凍晶粉所得到的外泌體純度較低。有鑑於此，本發明提出一種結合血小板外泌體與幹細胞分外泌體之客製化混合凍晶粉及其製作方法。
本發明之一範疇在於提供一種血小板外泌體結合幹細胞外泌體之混合凍晶粉。根據本發明之一具體實施例，混合凍晶粉包含有血小板外泌體之粉末及幹細胞外泌體之粉末。
其中，血小板外泌體係由欲使用混合凍晶粉之使用者血液中取得。
其中，幹細胞外泌體係由骨骼幹細胞、臍帶幹細胞、脂肪幹細胞等細胞取得。
其中，血小板之外泌體粉末與該幹細胞外泌體粉末之取得係分別對該血小板之外泌體與幹細胞之外泌體經由超速離心法萃取而得，接著再將兩者經由-80℃急速冷凍與-55℃冷凍乾燥12~16小時後混合形成該混合凍晶粉。
本發明之另一範疇在於提供一種血小板之外泌體結合幹細胞之外泌體之混合凍晶粉的製作方法。根據本發明之另一具體實施例，混合凍晶粉的製作方法包含下列步驟：對一血小板血漿樣本於無菌環境中進行離心以取得第一血小板外泌體；對一全血樣本於無菌環境中進行離心以取得血小板樣本，接著對血小板樣本於無菌環境中進行離心以 取得第二血小板外泌體；對一幹細胞培養基樣本於無菌環境中進行離心以取得第一幹細胞外泌體；對一幹細胞樣本以超音波震盪及離心的方式取得第二幹細胞外泌體；分別冷凍乾燥第一血小板之外泌體、第二血小板外泌體、第一幹細胞外泌體以及第二幹細胞外泌體，以形成第一血小板外泌體之粉末、第二血小板外泌體之粉末、第一幹細胞外泌體之粉末及第二幹細胞外泌體之粉末；以及，將第一血小板外泌體粉末及第二血小板外泌體粉末中之一者與第一幹細胞外泌體之粉末及第二幹細胞外泌體之粉末中之一者混合以形成混合凍晶粉。
其中，對血小板血漿樣本於無菌環境中進行離心以取得第一血小板外泌體之步驟，進一步包含以下子步驟：以300xg之加速度對血小板血漿樣本進行離心15分鐘以獲得第一血小板血漿樣本；以2000xg之加速度對第一血小板血漿樣本進行離心15分鐘以獲得第二血小板血漿樣本；以孔徑為0.22μm之過濾器過濾第二血小板血漿樣本；以4000xg之加速度對過濾後之第二血小板血漿樣本進行離心15分鐘以獲得第三血小板血漿樣本；以及，以切向流過濾系統(Tangential Flow Filtration System,TFF)對該第三血小板血漿樣本進行分離以取得第一血小板外泌體。
其中，對全血樣本於無菌環境中進行離心以取得血小板樣本，接著對血小板樣本於無菌環境中進行離心以取得第二血小板外泌體之步驟，進一步包含以下子步驟：將全血樣本於室溫中以2600xg之加速度離心30分鐘，以獲得全血樣本沉澱物以及上清液；將上清液加入2U/mL之肝素並以500xg之加速度離心10分鐘兩次以產生第一上清液；將第一上清液以2000xg之加速度離心15分鐘兩次以產生第二上清液；將第二上清液以10000xg之加速度離心30分鐘兩次以產生第三上清液；將第三 上清液以30000rpm之轉速於4℃溫度下離心1小時以產生第四上清液；以孔徑為0.22μm之一過濾器過濾第四上清液；以4000xg之加速度對過濾後之第四上清液樣本進行離心90分鐘以產生第五上清液；以及，以切向流過濾系統(Tangential Flow Filtration System,TFF)對該第五上清液進行分離以取得第二血小板外泌體。
其中，對幹細胞培養基樣本於無菌環境中進行離心以取得第一幹細胞外泌體之步驟，進一步包含以下子步驟：將幹細胞培養基樣本培養48小時後，以孔徑0.22μm之過濾器過濾幹細胞培養基樣本，以獲得第一幹細胞培養基樣本；以200xg之加速度對第一幹細胞培養基樣本進行離心以獲得第二幹細胞培養基樣本；以2000xg之加速度對第二幹細胞培養基樣本進行離心以獲得第三幹細胞培養基樣本；以及，以切向流過濾系統(Tangential Flow Filtration System,TFF)對該第三幹細胞培養基樣本進行分離以取得第一幹細胞外泌體。
其中，對該幹細胞樣本以超音波震盪及離心的方式取得第二幹細胞外泌體之步驟，進一步包含以下子步驟：將幹細胞樣本培養48小時後，以預定頻率對該幹細胞樣本進行超音波震盪10分鐘後，停止兩分鐘重新再以超音波震盪設定最大震幅之25%振幅進行超音波震盪10分鐘以獲得第一幹細胞樣本；將第一幹細胞樣本放置於室溫下靜置孵育15分鐘後進行MNase消化，再以200xg之加速度進行離心以獲得第二幹細胞樣本；以2000xg之加速度對第二幹細胞樣本進行離心以獲得第三幹細胞培養基樣本；以及，以切向流過濾系統(Tangential Flow Filtration System,TFF)對該第三幹細胞培養基樣本進行分離以取得第二幹細胞外泌體。
其中，分別冷凍乾燥第一血小板之外泌體、第二血小板外泌體、 第一幹細胞外泌體以及第二幹細胞外泌體之步驟包含以下子步驟：分別急速冷凍第一血小板之外泌體、第二血小板外泌體、第一幹細胞外泌體以及第二幹細胞外泌體至-80℃；以及於-55℃之溫度下乾燥急速冷凍後之血小板之外泌體與幹細胞之外泌體，以獲得第一血小板外泌體粉末、該第二血小板外泌體粉末、第一幹細胞外泌體之粉末及第二幹細胞外泌體之粉末。
本發明之另一範疇在於提供一種血小板之外泌體結合幹細胞之外泌體之混合凍晶粉的製作方法。根據本發明之另一具體實施例，混合凍晶粉的製作方法包含下列步驟：對血小板血漿樣本於無菌環境中進行離心以獲得第一血小板外泌體；對全血樣本於無菌環境中進行離心以取得血小板樣本，接著對血小板樣本於無菌環境中進行離心以取得第二血小板外泌體；對幹細胞培養基樣本於無菌環境中進行離心以取得第一幹細胞外泌體；對幹細胞樣本以超音波震盪及離心的方式取得第二幹細胞外泌體；分別混合第一血小板外泌體及第二血小板外泌體中之一者與第一幹細胞外泌體及第二幹細胞外泌體中之一者，以形成一混合物質；以及，對混合物質進行冷凍與乾燥過程以形成該混合凍晶粉。
相較於習知技術，本發明富含血小板外泌體結合幹細胞外泌體之混合凍晶粉及其製作方法，係利用自體血小板外泌體之凍晶粉混合間質幹細胞外泌體之凍晶粉以客製化所需之混合凍晶粉，具有後續保存簡單並在使用時僅需搭配溶劑注射或直接擦拭以簡化使用步驟等特點。進一步地，混合凍晶粉之外泌體來源為自體，將不會產生因異體注射後所產生之排斥現象。同時，細胞培養所使用的培養液為人類的血小板血漿而非動物胎牛血清，可以減少胎牛血清的蛋白變異發生。
關於本發明之優點與精神可以藉由以下的發明詳述以及所附圖式得到進一步的了解。
圖一係繪示根據本發明之一具體實施例之混合凍晶粉的製作方法的步驟流程圖。
圖二係繪示圖一之混合凍晶粉的製作方法之取得第一血小板外泌體的步驟之更進一步的步驟流程圖。
圖三係繪示圖一之混合凍晶粉的製作方法之取得第二血小板外泌體的步驟之更進一步的步驟流程圖。
圖四係繪示圖一之混合凍晶粉的製作方法之取得第一幹細胞外泌體的步驟之更進一步的步驟流程圖。
圖五係繪示圖一之混合凍晶粉的製作方法之取得第二幹細胞外泌體的步驟之更進一步的步驟流程圖。
圖六係繪示根據本發明之一具體實施例之混合凍晶粉的製作方法的更進一步驟流程圖。
圖七係繪示根據本發明之另一具體實施例之混合凍晶粉的製作方法的驟流程圖。
圖八係繪示根據本發明之一具體實施例之混合凍晶粉的製作方法的更進一步的步驟流程圖。
為使本發明之目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下參照附圖並舉實施例，對本發明作進一步詳細說明。
請參照圖一，圖一係繪示根據本發明之一具體實施例之混合凍晶粉的製作方法的步驟流程圖。如圖一所示，於本具體實施例中，混合 凍晶粉的製作方法包含下列步驟：步驟S1：對血小板血漿樣本於無菌環境中進行離心以取得第一血小板外泌體；步驟S2：對全血樣本於無菌環境中進行離心以取得血小板樣本，接著對血小板樣本於無菌環境中進行離心以取得第二血小板外泌體；步驟S3：對幹細胞培養基樣本於無菌環境中進行離心以取得第一幹細胞外泌體；步驟S4：對幹細胞樣本以超音波震盪及離心的方式取得第二幹細胞外泌體；步驟S5：冷凍乾燥第一血小板外泌體、第二血小板外泌體、第一幹細胞外泌體及第二幹細胞外泌體以形成第一血小板外泌體之粉末、第二血小板外泌體之粉末、第一幹細胞外泌體之粉末及第二幹細胞外泌體之粉末；步驟S6：混合第一血小板外泌體粉末及第二血小板外泌體末中之一者與第一幹細胞外泌體之粉末及第二幹細胞外泌體之粉末中之一者以形成該混合凍晶粉。
以下再進一步針對本具體實施例之混合凍晶粉製作方法的各步驟進行詳細說明。
請參照圖二，圖二係繪示圖一之步驟S1更進一步的步驟流程圖。如圖二所示，於本具體實施例中，圖一之混合凍晶粉製作方法的步驟S1進一步包含下列步驟：步驟S11：以300xg之加速度對血小板血漿樣本進行離心15分鐘以獲得第一血小板血漿樣本；步驟S12：以2000xg之加速度對第一血小板血漿樣本進行離心15分鐘以獲得第二血小板血漿樣本；步驟S13：以孔徑為0.22μm之過濾器過濾第二血小板血漿樣本；步驟S14：以4000xg之加速度對過濾後之第二血小板血漿樣本進行離心70分鐘以獲得第三血小板血漿樣本；步驟S15：以切向流過濾系統(Tangential Flow Filtration System,TFF)對第三血小板血漿樣本進行分離以取得第一血小板外泌體。
於實務中，步驟S11的血小板血漿樣本可由全血樣本於無菌環境中自離心而取得，詳細步驟如下：自欲使用混合凍晶粉之一使用者身體抽取全血樣本；接著，將全血樣本於無菌環境中以每分鐘1,000~1,500轉的轉速離心5~15分鐘；最後，於無菌環境中取出離心後之富含血小板血漿之全血樣本之上層液，即可得到血小板血漿樣本。
於一具體實施例中，步驟15的血小板血漿樣本於TFF系統分離時，以中空纖維膜(Hollow Fiber)與多管透析濃縮膜(Midikors Filiter Module)分離第三血小板血漿樣本(1~250ml)以獲得第一血小板外泌體(Mw：500KD)，最後將第一血小板外泌體濃縮至2-10ml。
實務中，上述全血樣本可包含有一抗凝固劑，以防止其於離心過程或其他處理流程中凝固。舉例來說，可將含有抗凝固劑之全血樣本經過每分鐘1,200轉之轉速離心10分鐘以分離出血漿及血球，並於無菌環境中將富含血小板血漿之上層液體取出做後續處理，進而獲得血小板血漿樣本。因此，步驟S11所述之血小板血漿樣本係由欲使用混合凍晶粉之使用者自體血液中取得，所取得的第一血小板外泌體不會因來源不潔而造成肝炎、愛滋等血液傳染的問題，亦不會產生排他性，對於人體吸收及安全性將有更進一步的保障。
請參照圖三，圖三係繪示圖一之步驟S2更進一步的步驟流程圖。如圖三所示，於本具體實施例中，圖一之混合凍晶粉製作方法的步驟S2進一步包含下列步驟：步驟S21：將全血樣本於室溫中以2600xg之加速度離心30分鐘，以獲得全血樣本沉澱物以及上清液；步驟S22：將上清液加入2U/mL之肝素並以500xg之加速度離心10分鐘兩次以產生第一上清液；步驟S23：將第一上清液以2000xg之加速度離心15分鐘兩次以產生第二上清液；步驟S24：將第二上清液以10000xg之加速度離心 30分鐘兩次以產生第三上清液；步驟S25：將第三上清液以30000rpm之轉速於4℃溫度下離心1小時以產生第四上清液；步驟S26：以孔徑為0.22μm之過濾器過濾第四上清液，以及以4000xg之加速度對過濾後之第四上清液樣本進行離心90分鐘以產生第五上清液；以及步驟S27：以切向流過濾系統(Tangential Flow Filtration System,TFF)對第五上清液進行分離以取得第二血小板外泌體。
於實務中，步驟S21中全血樣本係由使用者自體血液中取得，並可加入一抗凝固劑，以防止其於離心過程或後續處理流程中凝固。由於使用之全血樣本係由使用者自體血液中取得，所取得的第二血小板外泌體不會因來源不潔而造成肝炎、愛滋等血液傳染的問題，亦不會產生排他性，對於人體吸收及安全性將有更進一步的保障。
於一具體實施例中，步驟27於TFF系統分離時，以中空纖維膜(Hollow Fiber)與多管透析濃縮膜(Midikors Filiter Module)分離第五上清液(1~250ml)以獲得第二血小板外泌體(Mw：500KD)，最後將第二血小板外泌體濃縮至2-10ml。請參照圖四，圖四係繪示圖一之步驟S3更進一步的步驟流程圖。如圖四所示，於本具體實施例中，圖一之混合凍晶粉製作方法的步驟S3進一步包含下列步驟：步驟S31：將幹細胞培養基樣本培養48小時後，以孔徑0.22μm之過濾器過濾幹細胞培養基樣本，以獲得第一幹細胞培養基樣本；步驟S32：以200xg之加速度對第一幹細胞培養基樣本進行離心以獲得第二幹細胞培養基樣本；步驟S33：以2000xg之加速度對第二幹細胞培養基樣本進行離心以獲得第三幹細胞培養基樣本；步驟S34：以切向流過濾系統對第三幹細胞培養基樣本進行分離以取得第一幹細胞外泌體。
於實務中，可在無菌環境中於生長液內培養人體間質幹細胞，並 當生長液內之人體間質幹細胞之細胞培養48小時後收集培養液，此培養液即為步驟S31之幹細胞培養基樣本。此外，上述之人體間質幹細胞係取自人體骨骼、臍帶、脂肪或纖維母細胞，進一步地可自欲使用混合凍晶粉之使用者的骨骼、臍帶、脂肪或纖維母細胞等取得，以增進第一幹細胞外泌體的適應性。
於一具體實施例中，步驟34於TFF系統分離時，以中空纖維膜(Hollow Fiber)與多管透析濃縮膜(Midikors Filiter Module)分離第三幹細胞培養基樣本(1~250ml)以獲得第一幹細胞外泌體(Mw：500KD)，最後將第一幹細胞外泌體濃縮至2-10ml。
於實務中，上述的生長液可包含DMEM培養基、5%之人體血小板血漿及1mM之非必要胺基酸。所使用之DMEM培養基包含有4.0mM之左旋麩醯胺酸(L-Glutamine)及4500mg/L之葡萄糖(Glucose)，且不含丙酮酸鈉(Sodium Pyruvate)、酚紅(Phenol Red)及抗生素，可避免產生免疫排斥現象及變易。添加5%之人體血小板血漿及1mM之非必要胺基酸可加速細胞的生長，所使用之5%人體血小板血漿不限於由欲使用混合凍晶粉之使用者身上取得，即代表可使用市售之人體血小板血漿。
請參照圖五，圖五係繪示圖一之步驟S4更進一步的步驟流程圖。如圖五所示，於本具體實施例中，圖一之混合凍晶粉製作方法的步驟S4進一步包含下列步驟：步驟S41：將幹細胞樣本培養48小時後，以一預定頻率對幹細胞樣本進行超音波震盪10分鐘後，停止兩分鐘後重新再以超音波震盪設定最大震幅之25%振幅進行超音波震盪10分鐘以獲得第一幹細胞樣本；步驟S42：將第一幹細胞樣本放置於室溫下靜置孵育15分鐘後進行MNase消化，再以200xg之加速度進行離心以獲得第二幹細胞樣本；步驟S43：以2000xg之加速度對第二幹細胞樣本進行離心 以獲得第三幹細胞樣本；步驟S44：以切向流過濾系統(Tangential Flow Filtration System,TFF)對第三幹細胞培養基樣本進行分離以取得第二幹細胞外泌體。
於實務中，步驟S41之幹細胞樣本在無菌環境中於一生長液內培養人體幹細胞，當生長液內之人體幹細胞之細胞培養48小時後，收集細胞樣本並於1ml生理食鹽水中。此外，步驟S42可利用微球菌核酸酶(Micrococcal Nuclease,MNase)對第一幹細胞樣本中之細胞進行細胞裂解作用，以取得細胞內釋放之物質，此即為MNase消化。
於一具體實施例中，步驟S44於TFF系統分離時，以中空纖維膜(Hollow Fiber)與多管透析濃縮膜(Midikors Filiter Module)分離第三幹細胞培養基樣本(1~250ml)以獲得第二幹細胞外泌體(Mw：500KD)，最後將第二幹細胞外泌體濃縮至2-10ml。
請參照圖六，圖六係繪示圖一之步驟S4更進一步的步驟流程圖。如圖六所示，於本具體實施例中，圖一之混合凍晶粉製作方法的步驟S5進一步包含下列步驟：步驟S51：分別急速冷凍第一血小板之外泌體、第二血小板外泌體、第一幹細胞外泌體以及第二幹細胞外泌體至-80℃；以及步驟S52：於-55℃之溫度下乾燥急速冷凍後之血小板外泌體與幹細胞外泌體，以得該第一血小板外泌體粉末、第二血小板外泌體粉末、第一幹細胞外泌體粉末、第二幹細胞外泌體粉末。
於實務中，步驟S52可分別於-55℃對第一血小板外泌體、及第二血小板外泌體、第一幹細胞外泌體、第二幹細胞外泌體進行乾燥急速冷凍12~16小時以得第一血小板外泌體之粉末、及第二血小板外泌體粉末、第一幹細胞外泌體之粉末、第二幹細胞外泌體之粉末。
如前所述，本發明之血小板外泌體及幹細胞外泌體皆可由欲使用 混合凍晶粉之使用者本身之血小板、間質幹細胞或纖維母細胞培養而得，由於大部分原料係來自使用者本身，較不易產生身體排斥問題。此外，於實務中，本發明之混合凍晶粉使用時可溶解於一溶劑中以便注射使用，或混合於一漿料以便於擦拭使用。
請參照圖七，圖七係繪示根據本發明之另一具體實施例之混合凍晶粉製作方法的步驟流程圖。如圖七所示，本具體實施例與前一具體實施例不同處，在於本具體實施例之混合凍晶粉製作方法進一步包含以下步驟：步驟S5’：混合第一血小板外泌體及第二血小板外泌體中之一者與第一幹細胞外泌體及第二幹細胞外泌體中之一者以形成混合物質；以及，步驟S6’：冷凍乾燥急速冷凍該混合物質以形成混合凍晶粉。請注意，本具體實施例之方法的其他步驟，係與前一具體實施例相對應的步驟大致相同，故於此不再贅述。
此外，請參照圖八，圖八係繪示圖七之步驟S6’更進一步的步驟流程圖。如圖八所示，於本具體實施例中，圖七之混合凍晶粉製作方法的步驟S6’進一步包含下列步驟：步驟S61：分別急速冷凍該混合物質至-80℃；以及步驟S62：於-55℃之溫度下乾燥急速該混合物質以形成該混合凍晶粉。
實務中，步驟S62分別於-55℃對第一血小板外泌體、及第二血小板外泌體、第一幹細胞外泌體、第二幹細胞外泌體進行乾燥急速冷凍12~16小時。
於本具體實施例中，由於先製備了混合物質再對混合物質進行冷凍及脫水動作，可減少所需製程之動作，進而降低過程中受汙染之可能性。
綜上所述，本發明血小板血漿外泌體結合幹細胞外泌體之混合凍 晶粉及其製作方法利用使用者自體血液作為素材以增進混合凍晶粉之人體吸收效益及安全性，並利用凍乾技術以克服熱敏性及時效所造成之變質問題。同時可依據後續之注射使用或擦拭吸收方式的不同客製混合比例，再將本發明之混合凍晶粉與所需溶劑或漿料混合後做進一步的使用。
相較於習知技術，本發明血小板血漿外泌體結合幹細胞外泌體之混合凍晶粉及其製作方法利用自體血小板血漿之凍晶粉混合幹細胞外泌體之凍晶粉以客製化所需之混合凍晶粉，具有提高外泌體純度之方法並且製程凍晶粉具有後續保存簡單並在使用時僅需搭配溶劑注射或直接擦拭以簡化使用步驟等特點。進一步地，製成幹細胞外泌體凍晶粉之樣品來源為自體，將不會產生因異體注射後所產生之排斥現象。同時，細胞培養所使用的培養液為人類的血小板血漿而非動物胎牛血清，得以減少胎牛血清的蛋白變異發生。
藉由以上較佳具體實施例之詳述，係希望能更加清楚描述本發明之特徵與精神，而並非以上述所揭露的較佳具體實施例來對本發明之範疇加以限制。相反地，其目的是希望能涵蓋各種改變及具相等性的安排於本發明所欲申請之專利範圍的範疇內。
S1~S6:流程步驟

Claims (11)

  1. 一種混合凍晶粉，包含有：一第一血小板外泌體，係一血小板血漿樣本經離心及切向流過濾系統分離而取得；一第二血小板外泌體，係一血小板樣本經離心及切向流過濾系統分離而取得；一第一幹細胞外泌體，係一幹細胞培養基樣本經離心及切向流過濾系統分離而取得；以及一第二幹細胞外泌體，係一幹細胞樣本經離心及切向流過濾系統分離而取得；其中，該混合凍晶粉係由該第一血小板外泌體之粉末、該第二血小板外泌體之粉末、該第一幹細胞外泌體之粉末及該第二幹細胞外泌體之粉末混合而形成。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之混合凍晶粉，其中該血小板之外泌體係由一使用者血液中取得。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之混合凍晶粉，其中該幹細胞之外泌體係由人體骨骼、人體臍帶、人體脂肪、以及人體血液之幹細胞等取得。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之混合凍晶粉，其中該血小板之外泌體粉末與該幹細胞外泌體粉末之取得係分別對一血小板血漿樣本或一全血樣本以及一幹細胞樣本或幹細胞培養基樣本經由超速離心法萃取而得該血小板之外泌體以及該幹細胞之外泌體，接著再將兩者經由-80℃急速冷凍與-55℃冷凍乾燥12~16小時後混合形成該混合凍晶粉。
  5. 一種混合凍晶粉的製作方法，其包含下列步驟：對一血小板血漿樣本於無菌環境中進行離心及於切向流過濾系統進行分離以取得一第一血小板外泌體；對一全血樣本於無菌環境中進行離心及於切向流過濾系統進行 分離以取得一血小板樣本，接著對該血小板樣本於無菌環境中進行離心以取得一第二血小板外泌體；對一幹細胞培養基樣本於無菌環境中進行離心及於切向流過濾系統進行分離以取得一第一幹細胞外泌體；對一幹細胞樣本以超音波震盪及離心及於切向流過濾系統進行分離的方式取得一第二幹細胞外泌體；分別冷凍乾燥該第一血小板之外泌體、該第二血小板外泌體、該第一幹細胞外泌體以及第二幹細胞外泌體，以形成一第一血小板外泌體之粉末、一第二血小板外泌體之粉末、一第一幹細胞外泌體之粉末及一第二幹細胞外泌體之粉末；以及將該第一血小板外泌體粉末及該第二血小板外泌體粉末中之一者與該第一幹細胞外泌體之粉末及該第二幹細胞外泌體之粉末中之一者混合以形成該混合凍晶粉。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中對該血小板血漿樣本於無菌環境中進行離心以取得一第一血小板外泌體之步驟，進一步包含以下子步驟：以300xg之加速度對該血小板血漿樣本進行離心15分鐘以獲得一第一血小板血漿樣本；以2000xg之加速度對該第一血小板血漿樣本進行離心15分鐘以獲得一第二血小板血漿樣本；以孔徑為0.22μm之過濾器過濾該第二血小板血漿樣本；以4000xg之加速度對過濾後之該第二血小板血漿樣本進行離心15分鐘以獲得一第三血小板血漿樣本；以及以切向流過濾系統(Tangential Flow Filtration System,TFF)對該第三血小板血漿樣本進行分離以取得該第一血小板外泌體。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中對該全血樣本於無菌環境中進行離心以取得該血小板樣本，接著對該血小板樣本於無菌環境中進行離心以取得該第二血小板外泌體之步驟，進一步包含以下子步驟： 將該全血樣本於室溫中以2600xg之加速度離心30分鐘，以獲得一全血樣本沉澱物以及一上清液；將該上清液加入2U/mL之肝素並以500xg之加速度離心10分鐘兩次以產生一第一上清液；將該第一上清液以2000xg之加速度離心15分鐘兩次以產生一第二上清液；將該第二上清液以10000xg之加速度離心30分鐘兩次以產生一第三上清液；將該第三上清液以30000rpm之轉速於4℃溫度下離心1小時以產生一第四上清液；以孔徑為0.22μm之一過濾器過濾該第四上清液；以及以4000xg之加速度對過濾後之該第四上清液樣本進行離心90分鐘以產生一第五上清液；以切向流過濾系統對該第五上清液進行分離以取得該第二血小板外泌體。
  8. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中對該幹細胞培養基樣本於無菌環境中進行離心以取得該第一幹細胞外泌體之步驟，進一步包含以下子步驟：將該幹細胞培養基樣本培養48小時後，以孔徑0.22μm之過濾器過濾該幹細胞培養基樣本，以獲得一第一幹細胞培養基樣本；以200xg之加速度對該第一幹細胞培養基樣本進行離心以獲得一第二幹細胞培養基樣本；以2000xg之加速度對該第二幹細胞培養基樣本進行離心以獲得一第三幹細胞培養基樣本；以及以切向流過濾系統對該第三幹細胞培養基樣本進行分離以取得該第一幹細胞外泌體。
  9. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中對該幹細胞樣本以超音波震盪及離心的方式取得該第二幹細胞外泌體之步驟，進一步包含以下子步驟： 將該幹細胞樣本培養48小時後，以一預定頻率對該幹細胞樣本進行超音波震盪10分鐘後，停止兩分鐘重新再以25%振幅進行超音波震盪10分鐘以獲得一第一幹細胞樣本；將該第一幹細胞樣本放置於室溫下靜置孵育15分鐘後進行MNase消化，再以200xg之加速度進行離心以獲得一第二幹細胞樣本；以2000xg之加速度對該第二幹細胞樣本進行離心以獲得一第三幹細胞樣本；以及以切向流過濾系統對該第三幹細胞培養基樣本進行分離以取得該第二幹細胞外泌體。
  10. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中分別冷凍乾燥該第一血小板之外泌體、該第二血小板外泌體、該第一幹細胞外泌體以及該第二幹細胞外泌體之步驟包含以下子步驟：分別急速冷凍該第一血小板之外泌體、該第二血小板外泌體、該第一幹細胞外泌體以及該第二幹細胞外泌體至-80℃；以及於-55℃之溫度下乾燥急速冷凍後之血小板之外泌體與幹細胞之外泌體，以獲得該第一血小板外泌體粉末、該第二血小板外泌體、第一幹細胞外泌體之粉末以及該第二幹細胞外泌體之粉末。
  11. 一種混合凍晶粉的製作方法，其包含下列步驟：對一血小板血漿樣本於無菌環境中進行離心及於切向流過濾系統進行分離以獲得一第一血小板外泌體；對一全血樣本於無菌環境中進行離心以取得一血小板樣本，接著對該血小板樣本於無菌環境中進行離心及於切向流過濾系統進行分離以取得一第二血小板外泌體；對一幹細胞培養基樣本於無菌環境中進行離心及於切向流過濾系統進行分離以取得一第一幹細胞外泌體；對一幹細胞樣本以超音波震盪及離心及於切向流過濾系統進行分離的方式取得一第二幹細胞外泌體； 分別混合該第一血小板外泌體及該第二血小板外泌體中之一者與該第一幹細胞外泌體及該第二幹細胞外泌體中之一者，以形成一混合物質；以及對該混合物質進行冷凍與乾燥過程以形成該混合凍晶粉。
TW109125121A 2020-07-24 2020-07-24 血小板外泌體結合幹細胞外泌體之混合凍晶粉及其製作方法 TWI765305B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW109125121A TWI765305B (zh) 2020-07-24 2020-07-24 血小板外泌體結合幹細胞外泌體之混合凍晶粉及其製作方法
CN202110755875.2A CN113969260A (zh) 2020-07-24 2021-07-05 血小板外泌体结合干细胞外泌体的混合冻晶粉及其制作方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW109125121A TWI765305B (zh) 2020-07-24 2020-07-24 血小板外泌體結合幹細胞外泌體之混合凍晶粉及其製作方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202203949A TW202203949A (zh) 2022-02-01
TWI765305B true TWI765305B (zh) 2022-05-21

Family

ID=79586183

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW109125121A TWI765305B (zh) 2020-07-24 2020-07-24 血小板外泌體結合幹細胞外泌體之混合凍晶粉及其製作方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN113969260A (zh)
TW (1) TWI765305B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201817417A (zh) * 2016-11-07 2018-05-16 呂瑞華 富含血小板血漿結合人體間質幹細胞分泌因子之混合凍晶粉及其製作方法
CN111163787A (zh) * 2017-04-20 2020-05-15 北卡罗来纳州立大学 用于靶向组织修复的血小板囊泡工程化的细胞和细胞外囊泡

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111212653A (zh) * 2017-08-15 2020-05-29 儿童医学中心公司 经纯化间充质干细胞外排体及其用途
WO2019099927A1 (en) * 2017-11-16 2019-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for production of msc-derived exosomes
US20220079987A1 (en) * 2019-01-04 2022-03-17 Direct Biologics Llc Isolation and use of autogenous platelet derived exosomes

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201817417A (zh) * 2016-11-07 2018-05-16 呂瑞華 富含血小板血漿結合人體間質幹細胞分泌因子之混合凍晶粉及其製作方法
CN111163787A (zh) * 2017-04-20 2020-05-15 北卡罗来纳州立大学 用于靶向组织修复的血小板囊泡工程化的细胞和细胞外囊泡

Also Published As

Publication number Publication date
TW202203949A (zh) 2022-02-01
CN113969260A (zh) 2022-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230364150A1 (en) Method for isolation and purification of microvesicles from cell culture supernatants and biological fluids
Trivisonno et al. Intraoperative strategies for minimal manipulation of autologous adipose tissue for cell-and tissue-based therapies: concise review
WO2020103192A1 (zh) 外泌体的提取方法
JP2022502032A (ja) 誘導されたエキソソームを含む皮膚再生及び創傷治癒用組成物
Kumar et al. Role of plasma-rich fibrin in oral surgery
CN103767985A (zh) 人源血液或间充质干细胞分泌exosome的制备与应用
JP2010538681A (ja) 人または動物胚から間葉系幹細胞を抽出及びその分泌物を抽出する方法
US20140271589A1 (en) Treatment of collagen defects using protein solutions
JPWO2004018615A1 (ja) フィブリン含有組成物
US20230018329A1 (en) Cellular component concentrator and filter apparatus
Feng et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into neuronal cells on fetal bovine acellular dermal matrix as a tissue engineered nerve scaffold
Yang et al. Extracellular vesicles modulate key signalling pathways in refractory wound healing
TWI630927B (zh) 富含血小板血漿結合人體間質幹細胞分泌因子之混合凍晶粉及其製作方法
TWI765305B (zh) 血小板外泌體結合幹細胞外泌體之混合凍晶粉及其製作方法
Elowsson et al. Evaluation of macroporous blood and plasma scaffolds for skeletal muscle tissue engineering
Lamblet et al. Fat obtained from plastic surgery procedures—stem cells derived from adipose tissue and their potential in technological innovation: a narrative literature review and perspective on dissociative methods
CN107412878B (zh) 复合纤维支架及其制备方法
Angelini et al. Exosomes isolation protocols: facts and artifacts for cardiac regeneration
US8691263B2 (en) Extracellular matrix comprising platelet concentrate and cryoprecipitate polymerized in situ
Lambrichts et al. The Effect of Leukocyte-and Platelet-Rich Fibrin on Central and Peripheral Nervous System Neurons—Implications for Biomaterial Applicability
Gentile et al. Mechanical Purification of Lipofilling: The Relationship Between Cell Yield, Cell Growth, and Fat Volume Maintenance
Zheng et al. Small extracellular vesicles purification and scale-up
CN113774019A (zh) 一种脐带血间充质干细胞无血清培养基、培养方法及其应用
Lee et al. Platelet rich plasma and amnion-derived fluid as clinical options for regenerative medicine applications
US9757418B1 (en) Process for removing growth factors from platelets