CN116139098A - 一种提高肿瘤治疗药物中外泌体装载效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肿瘤治疗领域，具体涉及一种人骨髓间充质干细胞源外泌体制备高效装载药物的方法，以及该药物在胰腺癌治疗中的应用。采用人骨髓间充质干细胞源外泌体作为装载吉西他滨的载体，利用电穿孔、超声处理的方式进行药物装载，提高了外泌体装载效率，所得药物能够有效地抑制癌细胞增殖、促进癌细胞凋亡，进而用于治疗胰腺癌等多种疾病。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗领域，具体涉及一种人骨髓间充质干细胞源外泌体制备高效装载药物的方法，以及该药物在胰腺癌治疗中的应用。
背景技术
吉西他滨(Gemcitabine，GEM)属于细胞周期特异性抗代谢类抗肿瘤药物，主要作用于DNA合成期的肿瘤细胞，能够断裂DNA进而使细胞死亡，目前用于非小细胞肺癌、胰腺癌和乳腺癌等恶性肿瘤的治疗。盐酸吉西他滨(Gemcitabine Hydrochloride)将吉西他滨制成盐酸盐，改变了药物的生物活性和物理化学稳定性。
外泌体(Exosomes，EXOs)是一种几乎可以被所有类型细胞分泌的细胞外囊泡，其具有脂质双分子层，大小在30-100nm之间。作为天然的胞间信息载体，外泌体有诸多优良特性。首先，外泌体易与受体细胞融合并将药物释放到细胞内部，因而受体细胞对其所负载药物的接收明显强于其他载体。其次，外泌体表面的膜蛋白可以躲避调理素、共刺激分子及补体成分的攻击，增加了其在血液循环中的稳定性。最后，外泌体体积较小，不仅能避免网状系统的捕捉，还可以利用增强渗透滞留效应，有选择性地渗入肿瘤或炎症部位。基于此，外泌体在药物载体领域表现出了显著的优越性和巨大的应用潜力。
目前，有研究采用植物、胃部细胞、血浆等多种来源的外泌体包载化学药物，间充质干细胞或称间充质基质细胞(Mesenchymal Stem/Stromal Cells，MSCs)便是其中一种外泌体来源。现有研究中采用间充质干细胞来源的外泌体同吉西他滨一起施用或是包载盐酸吉西他滨以治疗肿瘤，然而装载效率较低，导致药物的细胞摄取率低、半衰期短且生物利用度低，在临床应用时需频繁、高剂量给药，给患者带来了严重的毒副作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术不足，解决上述背景技术中提到的外泌体装载吉西他滨时装载效率低的问题。
为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种利用超声技术提高肿瘤治疗药物中外泌体装载效率的方法，包括：S10培养人骨髓间充质干细胞；S20利用所述人骨髓间充质干细胞提取所述外泌体；S30将所述外泌体溶于缓冲盐溶液制备外泌体混合溶液，将吉西他滨溶于有机溶剂制备吉西他滨混合溶液，并混合所述外泌体混合溶液、所述吉西他滨混合溶液得到混合物；S40对所述混合物进行超声处理，得到所述外泌体，所述超声处理的条件是振幅为10-30％、超声时间为20-40s、冰上置冷时间为70-110s、循环次数为2-4次。
优选地，所述步骤S40中，所述超声处理的条件是振幅为20％、超声时间为30s、冰上置冷时间为90s、循环次数为3次。
优选地，所述步骤S40中，所述超声处理后还包括将所述外泌体于37℃下孵育2h。
在一些实施例中，所述步骤S10包括：S11采用完全培养基培养所述人骨髓间充质干细胞；S12收集所述完全培养基中含3-10代所述人骨髓间充质干细胞的上清液。
优选地，所述步骤S12中，所述人骨髓间充质干细胞每代汇合度不小于90％。
在一些实施例中，所述步骤S30中，所述缓冲盐溶液选自磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液；所述有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜。
本发明的第二方面，提供一种利用电穿孔技术提高肿瘤治疗药物中外泌体装载效率的方法，包括：S10培养人骨髓间充质干细胞；S20利用所述人骨髓间充质干细胞提取所述外泌体；S30将所述外泌体溶于缓冲盐溶液制备外泌体混合溶液，将吉西他滨溶于有机溶剂制备吉西他滨混合溶液，并混合所述外泌体混合溶液、所述吉西他滨混合溶液得到混合物；S40将所述混合物转移至预冷的比色皿中进行电穿孔处理，得到所述外泌体，所述电穿孔处理的条件是电压为300-500V、电容为100-150μF、脉冲时间为4.5-5.5ms、脉冲次数为2-4次。
优选地，所述步骤S40中，所述电穿孔处理的条件是电压为400V、电容为125μF、脉冲时间为5ms、脉冲次数为3。
优选地，所述步骤S40中，所述电穿孔处理后还包括将所述外泌体放置在冰上5-15分钟。
在一些实施例中，所述步骤S10包括：S11采用完全培养基培养所述人骨髓间充质干细胞；S12收集所述完全培养基中含3-10代所述人骨髓间充质干细胞的上清液。
优选地，所述步骤S12中，所述人骨髓间充质干细胞每代汇合度不小于90％。
在一些实施例中，所述步骤S30中，所述缓冲盐溶液选自磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液；所述有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜。
本发明的第三方面，提供一种肿瘤治疗药物，所述肿瘤治疗药物包括外泌体和吉西他滨，具体通过一种提高肿瘤治疗药物中外泌体装载效率的方法制得。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明通过研究证实了采用人骨髓间充质干细胞源外泌体作为吉西他滨的载体，并通过电穿孔或超声处理进行装载，能够有效地提高药物装载效率。
(2)本发明提供的提高肿瘤治疗药物中外泌体装载效率的方法能够制得细胞摄取率高、半衰期长且生物利用度高的肿瘤治疗药物，在临床应用时无需频繁、高剂量给药，有效降低了毒副作用。
(3)本发明提供的提高肿瘤治疗药物中外泌体装载效率的方法能够制得有效抑制癌细胞增殖、促进癌细胞凋亡的药物，从而为胰腺癌等多种肿瘤的指导治疗提供重要参考。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为流式散点图，其中图1A是对照组、图1B是浓度为0.02μM吉西他滨组、图1C是浓度为0.02μM装载吉西他滨外泌体组、图1D是浓度为0.04μM吉西他滨组、图1E是浓度为0.04μM装载吉西他滨外泌体组、图1F是浓度为0.10μM吉西他滨组、图1G是浓度为0.10μM装载吉西他滨外泌体组；
图2为胰腺癌细胞PANC-1凋亡率统计图。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明，应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本发明利用人骨髓间充质干细胞提取外泌体，并对其进行电穿孔、超声处理以装载吉西他滨，得到包封率较高的EXO-GEM药物，该药物能够有效地抑制癌细胞增殖、促进癌细胞凋亡，进而用于治疗胰腺癌等多种疾病。
本发明生物材料及仪器来源：
吉西他滨HY-17026购于MedChemExpress公司。高效液相色谱仪E2695、XBridgeC18色谱柱购于Waters公司。
实施例1：外泌体的制备
(1)培养人骨髓间充质干细胞
在10％无外泌体血清和1％双抗条件下的完全培养基DMEM/F12中培养人骨髓间充质干细胞(HU-BMSC)，并收集P3-P10代的汇合度达90％以上的细胞上清液，暂存于-80℃，其他细胞则继续传代。
(2)提取外泌体
将收集的细胞上清液在2000×g离心15min，以去除死细胞，再于10,000×g离心30min，以去除细胞碎片等杂质。而后，取上清液经120,000×g离心70min得到主要成分为外泌体的管底片层沉淀。将沉淀用磷酸缓冲生理盐水(PBS)冲洗吹打重悬，再次以120,000×g离心70min，除去吸附的杂质，所得沉淀即为外泌体。
实施例2：EXO-GEM的电穿孔制备
将1mg吉西他滨溶解于1mL二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)中配制1mg/mL的吉西他滨母液，同时，将1mg外泌体用1mL磷酸缓冲生理盐水复溶，然后取100μL吉西他滨母液和900μL含外泌体的磷酸缓冲生理盐水溶液混匀。将混合物转移至预冷的2mm比色皿内，在电压为400V、电容为125μF的条件下进行3次5ms的脉冲。电穿孔后将外泌体置于冰上10min，恢复脂质双分子层膜，从而得到装载了吉西他滨的外泌体EXO-GEM。
实施例3：EXO-GEM的超声法制备
溶解二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)以配制1mg/mL的吉西他滨母液，外泌体用磷酸缓冲生理盐水复溶，取100μL吉西他滨母液和900μL实施例1中含外泌体的磷酸缓冲生理盐水溶液混匀。然后在超声波裂解器中对混合物进行超声处理，其中，振幅为20％，超声时间为30s，再冰上置冷90s，共执行3个循环，结束后将其置于37℃孵育2h，进而得到装载了吉西他滨的外泌体EXO-GEM。
实施例4：EXO-GEM的共孵育法制备
将生长状态良好的经过完全培养基DMEM/F12培养的、收集的P3-P10代的人骨髓间充质干细胞按照每皿5×105个接种到100mm的细胞培养皿中，过夜后用磷酸缓冲生理盐水清洗两遍细胞。而后，用含无外泌体血清的培养基将吉西他滨稀释成10μM的浓度，以每皿10mL的体积加入到骨髓间充质干细胞的培养基中培养96h。最后，收集细胞上清液200mL，经120,000×g超速离心70min后获得装载了吉西他滨的外泌体EXO-GEM，其中
实施例5：EXO-GEM包封率的检测
采用电转后沉淀外泌体法对实施例2、3、4中装载了吉西他滨的外泌体进行装载效率检测。首先将外泌体用生理盐水复溶后，混匀100μL吉西他滨母液和900μL含外泌体的磷酸缓冲生理盐水溶液进行电转处理。然后将处理后的1mL混合溶液配以6mL磷酸缓冲生理盐水，于4℃下110,000×g超速离心70min。离心后取1mL上清液于-20℃保存，并在解冻后于4℃下5500rpm离心5min，取此次离心后的10μL上清液进行高效液相色谱检测。
高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)检测的条件为：柱温40℃，流速为1.0mL/min，紫外检测波长为268nm，进样量为10μL。为绘制标准曲线，将1mg/mL的吉西他滨母液用生理盐水稀释，分别配制成1.0、5.0、10.0、50.0、100.0μg/mL的工作液，再根据浓度和曲线下面积计算得线性方程式Y＝25489X+15095(r2＝0.9996)。
根据公式(1)计算包封率，其中W总量表示向体系中加入的吉西他滨的总量，W上清表示上清液中未装载至外泌体中的吉西他滨的质量。
包封率＝(W总量-W上清)/W总量×100％ (1)
以电转法为例，说明包封率的计算过程。100μL吉西他滨母液中吉西他滨的含量为100μg，即向体系中加入的吉西他滨的总量为100μg。通过HPLC计算，电转法后沉淀得到的上清液中吉西他滨含量为91.98μg，因此外泌体中装载吉西他滨的量为8.02μg，包封率即为8.02％。
经HPLC间接检测后计算，电转法的包封率为8.02％，超声法的包封率为7.74％，共孵育法的包封率为0.33％。实验结果显示，利用电转法将吉西他滨载入外泌体后通过沉淀法得到的外泌体载药效果最好，后续将采用电转法进行吉西他滨装载。
此外，还可以根据公式(2)计算装载效率，其中WGEM总量表示向体系中加入的吉西他滨的总量，W上清表示上清液中未装载至外泌体中的吉西他滨的质量，WEXO总量表示向体系中加入的外泌体的总量。
载药率＝(WGEM总量-W上清)/WEXO总量×100％ (2)
实施例6：EXO-GEM抑制胰腺癌细胞增殖效果的检测
将消化后的人胰腺癌细胞Panc-1在96孔板上进行铺板，每孔2000个细胞，每组4个复孔。24h后分别将吉西他滨和装载吉西他滨的外泌体稀释至0.02μM，加入至含胰腺癌细胞的孔板中孵育72h。而后每孔各加入10μL浓度为5mg/mL的CCK-8，并于1.5h后将酶标仪的测定波长设置为450nm，检测光密度(Optical Density，OD)值。
依据光密度值，根据公式(2)计算细胞活力，其中OD加药表示具有胰腺癌细胞、CCK-8和吉西他滨的孔的OD值，OD无药表示具有胰腺癌细胞、CCK-8但没有吉西他滨的孔的OD值，OD空白表示没有胰腺癌细胞的孔的OD值。
细胞活力＝(OD加药-OD空白)/(OD无药-OD空白)×100％ (2)
表1胰腺癌细胞细胞活力表
结果如表1所示，作为空白对照的四组细胞活力均为100％，加入吉西他滨后胰腺癌细胞的活力有所下降，而加入装载了吉西他滨的外泌体后胰腺癌细胞的活力明显下降，其药效显著高于单纯加入吉西他滨的效果，说明装载了吉西他滨的外泌体能够有效抑制胰腺癌细胞的增殖。
实施例7：EXO-GEM影响胰腺癌细胞凋亡效果的检测
将消化后的人胰腺癌细胞Panc-1在6孔板上进行铺板，24h后分别将吉西他滨和装载吉西他滨的外泌体稀释至0.02μM、0.04μM和0.1μM，并加入至含胰腺癌细胞的孔板中孵育72h。之后，利用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集细胞，经磷酸缓冲生理盐水洗涤两遍后，加入结合缓冲液(Binding Buffer)重悬细胞，然后通过Annexin V-EGFP/PI双标记进行染色，于室温避光反应5-15min后用流式细胞仪分析胰腺癌细胞凋亡情况。
细胞早期凋亡时，磷酯酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)会外翻到细胞膜外侧，促进凝血和炎症反应，而利用绿色荧光探针EGFP标记的Annexin V能够选择性结合外翻的磷酯酰丝氨酸，因而Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)是一种DNA结合染料，能够将坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞以呈现红色荧光。所以，通过Annexin V-EGFP/PI双标记能够区分活细胞、早期凋亡细胞和死细胞。
图1显示了流式细胞二维散点图的结果。其中Annexin V-EGFP的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测，PI红色荧光通过PI通道(FL3)检测。Q1区域Annexin V-EGFP显示阴性、PI显示阳性，该区域中的细胞为坏死细胞，可能有少数晚期凋亡细胞和机械损伤的细胞，此外，该象限的细胞比例越大，实验结果的可信度可能越低。图中结果显示，7组的Q1区域占比均较少，结果具有一定可靠性。此外，图1F显示了较高浓度(0.10μM)下，直接加入吉西他滨会使胰腺癌细胞死亡数量相对大幅度的增加。Q2区域显示，直接加入吉西他滨时，随着投药量的增加，Q2区域的占比逐渐增多，晚期凋亡细胞增多。而利用外泌体包载吉西他滨再加入时，在相对的低浓度(0.02μM)条件下，晚期凋亡细胞的数量较多。Q3区域显示，利用外泌体包载吉西他滨再加入时，随着浓度的增加，Q3区域的占比增大，早期凋亡细胞的数量增多。Q4区域显示，相同浓度下，相比使用外泌体包载吉西他滨而言，直接加入吉西他滨时活细胞数量较多。此外，对比图1C和图1F可以发现，在较低浓度(0.02μM)下使用外泌体包载吉西他滨和在高浓度(0.10μM)下直接加入吉西他滨对早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的影响差异并不大，并且包载药物再加入表现出了更好地促进癌细胞凋亡的效果。综合来讲，图1表明了使用外泌体包载吉西他滨后再加入表现出了较直接加入吉西他滨而言更优良的效果，包载后的药物能够在低浓度下较好地促进胰腺癌细胞凋亡。
图2统计了不同情况下胰腺癌细胞的凋亡率，可以发现直接加入0.02μM的吉西他滨对胰腺癌细胞凋亡的影响很小，为使吉西他滨发挥其作用，必须加大投入剂量。此外，相同浓度下，吉西他滨是否采用外泌体装载对胰腺癌细胞凋亡的影响显示出了明显的差异，装载后胰腺癌细胞的凋亡率显著升高。进一步地说，加入0.02μM装载了吉西他滨的外泌体相比于直接加入0.1μM的吉西他滨而言，促进了胰腺癌细胞的凋亡，说明外泌体能够装载吉西他滨并有效地促进了胰腺癌细胞凋亡。
综上所述，本申请从现有胰腺癌化疗副作用大出发，考量提高吉西他滨细胞摄取率的可行性，设计了一种高效包载药物的外泌体。采用该外泌体装载吉西他滨能够提高装载效率，进而结果提高药物的细胞摄取率，解决半衰期短、生物利用度低等一系列问题，避免了临床应用时因频繁、高剂量给药引起的严重副作用，为胰腺癌等多种肿瘤的指导治疗提供了重要参考。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种提高肿瘤治疗药物中外泌体装载效率的方法，其特征在于，所述方法包括：
S10培养人骨髓间充质干细胞；
S20利用所述人骨髓间充质干细胞提取所述外泌体；
S30将所述外泌体溶于缓冲盐溶液制备外泌体混合溶液，将吉西他滨溶于有机溶剂制备吉西他滨混合溶液，并混合所述外泌体混合溶液、所述吉西他滨混合溶液得到混合物；
S40对所述混合物进行超声处理，得到所述外泌体，所述超声处理的条件是振幅为10-30％、超声时间为20-40s、冰上置冷时间为70-110s、循环次数为2-4次。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S40中，所述超声处理的条件是振幅为20％、超声时间为30s、冰上置冷时间为90s、循环次数为3次。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S40中，所述超声处理后还包括将所述外泌体于37℃下孵育1.5-2.5h。
4.一种提高肿瘤治疗药物中外泌体装载效率的方法，其特征在于，所述方法包括：
S10培养人骨髓间充质干细胞；
S20利用所述人骨髓间充质干细胞提取所述外泌体；
S30将所述外泌体溶于缓冲盐溶液制备外泌体混合溶液，将吉西他滨溶于有机溶剂制备吉西他滨混合溶液，并混合所述外泌体混合溶液、所述吉西他滨混合溶液得到混合物；
S40将所述混合物转移至预冷的比色皿中进行电穿孔处理，得到所述外泌体，所述电穿孔处理的条件是电压为300-500V、电容为100-150μF、脉冲时间为4.5-5.5ms、脉冲次数为2-4次。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤S40中，所述电穿孔处理的条件是电压为400V、电容为125μF、脉冲时间为5ms、脉冲次数为3。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S40中，所述电穿孔处理后还包括将所述外泌体放置在冰上5-15分钟。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤S10包括：
S11采用完全培养基培养所述人骨髓间充质干细胞；
S12收集所述完全培养基中含3-10代所述人骨髓间充质干细胞的上清液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤S12中，所述人骨髓间充质干细胞每代汇合度不小于90％。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤S30中，
所述缓冲盐溶液选自磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液；
所述有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜。
10.一种肿瘤治疗药物，其特征在于，所述肿瘤治疗药物根据权利要求1-9所述方法制得。
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