CN115707336A - 外泌体回收方法 - Google Patents
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Abstract
提供一种高效地大量回收来自间充质干细胞的外泌体的回收方法。其特征在于：具有：在含有糖的培养基中以三维结构的无纺布为支架对间充质干细胞进行三维培养的三维培养工序；在间充质干细胞的糖消耗量达到平稳后进一步对所述间充质干细胞进行一定时间的培养的平稳状态后培养工序；以及回收来自间充质干细胞的外泌体的外泌体回收工序。间充质干细胞例如是脂肪源性间充质干细胞。
Description
技术领域
本发明涉及一种回收来自间充质干细胞的外泌体的回收方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cell：MSC)是具有多分化能力的干细胞，其存在于间充质组织即来自中胚层的结缔组织中。还明确已知间充质干细胞在未分化状态下分泌具有炎症抑制效果、细胞增殖促进效果、血管生成促进效果等的细胞因子·增殖因子，并通过旁分泌来支持组织修复(非专利文献1)。未分化间充质干细胞所分泌的分子群所具有的治疗效果并不局限于有限的特定疾病，而是对各种疾病均具有治疗效果。通过使用幼稚间充质干细胞，无需将间充质干细胞诱导分化为欲修复的组织的细胞，而且无需对细胞进行任何转基因等人为操作，即能够进行组织再生。
外泌体能够通过使蛋白质、脂质以及RNA在细胞间移动来介导细胞间的信息传递(非专利文献2、3)。已发现外泌体所包含的蛋白质、microRNA、mRNA等分子具有与其来源的细胞类似的功能。因此，期待作为针对广泛疾病的细胞疗法的来源而备受瞩目的间充质干细胞所分泌的外泌体具有与MSC相同的治疗效果(非专利文献4)。
专利文献1中记载了从培养到的神经干细胞系(NSCL)分离出的外泌体。该外泌体能够促进纤维细胞的迁移、人脐带静脉内皮细胞的分叉、以及神经突起的伸长。
与干细胞相比，外泌体含有相对较少的动物血清，从而也能够排除由动物血清感染而引起的症状的危险性。因此，利用了外泌体的细胞疗法能够克服现有干细胞疗法的局限性。
作为外泌体的回收方法，有超速离心法、沉淀法等方法，但这些方法难以大量回收治疗所需的外泌体量。因此，专利文献2中公开了使用鞘氨醇碱的外泌体回收方法。然而，专利文献2中记载的外泌体回收方法仅限于在神经细胞中回收外泌体以治愈阿尔茨海默病。
非专利文献5中公开了制作将抗CD63抗体固定安装的装置，并且公开了使用该装置的、实施从数百μl的血清样本中分离和回收囊泡(vesicle)的微流体系统。但是，非专利文献5中记载的外泌体回收方法由于是利用抗体的捕捉，因此回收量依然不充分，从而需要提出一种大量回收的技术。
专利文献1：国际公开第2013/150303号
专利文献2：日本公开专利公报特开2019-156786号公报
非专利文献1：Chamberlain G,Fox J，Ashton B,Middleton J,Concise review:mesenchymal stem cells:their phenotype,differentiation capacity,immunologicalfeatures,and potential for homing.Stem Cells.25(2007)2739-2749
非专利文献2：Simons and Raposo、Curropin Cell Biology 2009；21:575-581
非专利文献3：Skog et al.，Nat Cell Biology2008；10:1470～1476；Valadi etal.，Nat Cell Biology 2007；9:654～659
非专利文献4：Katsuda T,Kosaka N,Takeshita F,Ochiya T.The therapeuticpotential of mesenchymal stem cell-derived extracellularvesicles.Proteomics.13(2013)1637-1653.
非专利文献5：Chen,C.,Skog,J.,Hsu,C.,Lessard,R.T.,Balaj,L.,Wurdinger,T.,Carter,B.S.,Breakefield,X.O.,Toner,M.,Irimia,D.Microfluidic isolation andtranscriptome analysis of serum microvesicles.Lab Chip.10,505-511(2010)
发明内容
－发明要解决的技术问题－
本发明正是为解决上述技术问题而完成的，其目的在于：提供一种大量回收来自间充质干细胞的外泌体的外泌体回收方法。
－用以解决技术问题的技术方案－
本发明所涉及的外泌体回收方法，是回收来自间充质干细胞的外泌体的回收方法，所述外泌体回收方法的特征在于：具有：三维培养工序，在所述三维培养工序中，一边测量培养基中的被所述间充质干细胞代谢的物质的量，一边以无纺布为支架在所述培养基中对间充质干细胞进行三维培养；平稳状态后培养工序，在所述平稳状态后培养工序中，在所述培养基中的所述物质的量达到平稳后进一步对所述间充质干细胞进行一定时间的培养；以及外泌体回收工序，在所述外泌体回收工序中，在所述一定时间的培养后，从所述间充质干细胞回收外泌体。在此，外泌体是指从细胞向细胞外释放的膜囊。外泌体包含miRNA、mRNA、lncRNA、蛋白质、代谢小分子化合物等，这些来自将外泌体释放到脂质双分子层的袋内的细胞。
－发明的效果－
根据本发明，能够高效地大量回收来自间充质干细胞的外泌体。
附图说明
图1是示出在骨髓源性间充质干细胞的情况下，以无纺布为支架的培养下的糖消耗量与培养时间之间的关系的图；
图2是示出在脂肪源性间充质干细胞的情况下，以无纺布为支架的培养下的糖消耗量与培养时间之间的关系的图；
图3是在骨髓源性间充质干细胞和脂肪源性间充质干细胞的情况下，比较无纺布培养(3D)和培养皿培养(2D)中根据最终细胞数补正的外泌体数的图；
图4是在骨髓源性间充质干细胞的情况下，比较无纺布培养(3D)和培养皿培养(2D)中通过NTA测量的外泌体数的图。
具体实施方式
下面，参照附图具体地说明本发明的实施方式，该实施方式只是为了易于理解本发明的原理，本发明的范围并不限于以下实施方式，本领域技术人员通过对以下实施方式的构成方式做适当的置换而得到的其他实施方式也包括在本发明的范围内。
本发明所涉及的外泌体回收方法具有：(1)三维培养工序，一边测量培养基中的被间充质干细胞代谢的物质的量，一边以无纺布为支架在所述培养基中对间充质干细胞进行三维培养；(2)平稳状态后培养工序，在培养基中的物质的量达到平稳后进一步对间充质干细胞进行一定时间的培养；以及(3)外泌体回收工序，在一定时间的培养后，从间充质干细胞回收外泌体。即，本发明人作为新知识发现了以下事实，并基于该事实完成了本发明，上述事实是：不仅以无纺布为支架培养间充质干细胞，而且通过细胞进行代谢从而该细胞所消耗的培养基中的物质的量或从细胞产生到培养基中的量达到平稳后进行一定时间的培养，由此能够使来自间充质干细胞的外泌体回收量显著增加。
(1)三维培养工序
在三维培养工序中，一边测量培养基中的被间充质干细胞代谢的物质的量，一边以无纺布为支架，在培养基中对间充质干细胞进行三维培养(需要说明的是，在本说明书中有时将三维记为3D。)。
产生外泌体的间充质干细胞是属于间充质系的细胞，是指具有向一种以上的细胞(骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、腱细胞、脂肪细胞等)、优选两种以上的细胞、更优选三种以上的细胞分化的能力，且能够在维持该能力的状态下增殖的细胞。作为含有间充质干细胞的组织能够例举的例如有：脂肪组织、脐带、骨髓、脐带血、子宫内膜、胎盘、羊膜、绒毛膜、蜕膜、真皮、骨骼肌、骨膜、牙囊、牙周膜、牙髓、牙胚等。具体而言，能够例举出的间充质干细胞有脂肪源性间充质干细胞(有时记为ADSC)、骨髓源性间充质干细胞(有时记为BMSC)、脐带源性间充质干细胞、胎盘源性间充质干细胞、牙髓源性间充质干细胞等，间充质干细胞优选脂肪源性间充质干细胞或骨髓源性间充质干细胞，特别优选脂肪源性间充质干细胞。
与骨髓源性间充质干细胞相比，脂肪源性间充质干细胞具有细胞增殖快、分泌更多的再生促进因子、免疫抑制能力高的有利特征。而且，由于能够从腹部或臀部的脂肪组织得到脂肪源性间充质干细胞，因此，与需要采集骨髓的骨髓源性间充质干细胞相比，脂肪源性间充质干细胞还具有易于安全地确保足够的量的有利特征。将来自患者自身脂肪组织的间充质干细胞用于患者的治疗，这在以下方面是优异的：没有伦理上的问题、没有免疫排斥反应、感染症等问题较少、静脉给药有治疗效果等。
培养基是间充质干细胞用培养基，能够例举出例如DMEM、MEMα、DMEM/F12、MEM等。培养基中的由于间充质干细胞进行代谢而被消耗的物质没有特别限定，例如为糖，糖类中优选为葡萄糖。通过间充质干细胞进行代谢而产生到培养基中的物质没有特别限定，能够例举出例如LDH、乳酸等。
使用的支架是无纺布。无纺布的单位面积重量为1～500g/m2即可，例如优选为50～200g/m2。无纺布也可以是经过了亲水化处理的无纺布。无纺布的亲水化是能够通过氟气处理、常压等离子体处理、真空等离子体处理、电晕处理、亲水性单体的接枝聚合处理、磺化处理或表面活性剂赋予处理来实施的，优选氟气处理、常压等离子体处理。
构成无纺布的纤维优选为聚烯烃类聚合物，作为聚烯烃类聚合物例如能够例举出：乙烯、丙烯、1-丁烯、1-戊烯、3-甲基-1-丁烯、1-己烯、1-辛烯、1-十二烯、1-十八烯等。
构成无纺布的纤维优选为纤维直径小的纤维，平均纤维直径优选为200μm以下，更优选为10～100μm、，特别优选为15～50μm。纤维中也可以混合存在纤维直径相对较大的纤维和纤维直径相对较小的纤维。
无纺布优选具有多孔性。多孔性具有以下重要意义：向使组织再生时所需的细胞补充充分的氧和营养、迅速排出二氧化碳和废物。通过具有多孔性，比表面积变大，细胞粘附性提高。这种情况下的平均孔径例如为5μm～200μm、20μm～100μm、25μm～100μm、30μm～100μm、35μm～100μm、40μm～100μm、50μm～100μm或60μm～100μm，优选为50μm～300μm。
无纺布的形式没有特别限定，但优选为无纺布片。优选地，无纺布片包括沿厚度方向贯通无纺布片的多个通孔。无纺布片的总膜厚例如可以为5μm以上、10μm以上、20μm以上或25μm以上，也可以为500μm以下、300μm以下、100μm以下、75μm以下或50μm以下。优选为30～2000μm，更优选为500～1000μm。
在该三维培养工序中，一边测量培养基中的被间充质干细胞代谢的物质的量，一边对间充质干细胞进行三维培养，并继续培养直至培养基中的该物质的量达到平稳。在以培养皿为支架的细胞培养中，细胞二维地增殖，因此容易掌握细胞完全覆盖培养皿表面时的状态。但是，在以无纺布为支架的细胞培养中，由于细胞三维地增殖，因此难以掌握细胞完全覆盖无纺布时的状态。因此，继续培养直至培养基中的供细胞消耗或由细胞产生的物质的量达到平稳。
对培养基中的供细胞消耗或由细胞产生的物质的量的测量没有特别限定，例如，在测量培养基中的供细胞消耗的物质的量情况下，按培养时间测量间充质干细胞的糖消耗量。优选按照如上所述的方式测量培养基中的葡萄糖量。在测量间充质干细胞的葡萄糖消耗量的情况下，能够使用市售的测量细胞培养上清液中的葡萄糖量的葡萄糖检测分析试剂盒(glucose assay kit)，能够使摄入到细胞内的2-脱氧葡萄糖与酶反应来进行测量。
关于培养基中的供细胞消耗或由细胞产生的物质的量达到平稳的判断没有特别限定，例如，制作培养基中的物质的量与培养天数的曲线图，由此导出作为近似线的一次函数(y＝ax+b)，将该一次函数的斜率a变为横向的情况判断为物质的量达到平稳。作为近似线的一次函数的斜率a变为横向的情况例如为-0.1≤a≤0.1，优选为-0.01≤a≤0.01，更优选为a＝0。在对培养基中的物质的量达到平稳的判断中，不仅包括培养基中的物质的量与培养天数之间的关系式的近似线即一次函数(y＝ax+b)的斜率a变为横向的情况，也可以包括培养基中的消耗量或产生量变为负的情况。作为近似线的一次函数的斜率a变为负的情况例如为-0.5≤a≤-0.01，优选为-0.1≤a≤-0.05。
(2)平稳状态后培养工序
在平稳状态后培养工序中，培养基中的间充质干细胞的物质的量达到平稳后进一步进行一定时间的培养。
培养基中的物质的量达到平稳后的培养时间没有特别限定，例如为12小时～72小时，优选为18小时～66小时，更优选为24小时～60小时，特别优选为36小时～54小时，最优选为48小时。
(3)外泌体回收工序
最后回收来自间充质干细胞的外泌体。在上述平稳状态后培养工序完成后，产生了大量的外泌体，能够利用通常使用的方法回收所产生的大量的外泌体。作为外泌体的回收方法，没有特别限定，能够例举出例如超速离心法。能够例举出作为超速离心法的例如有：颗粒沉淀法、蔗糖垫层法、密度梯度离心法等。
使用本发明所涉及的外泌体回收方法获得的外泌体能够用作含有外泌体的制剂。含有外泌体的制剂的形式没有特别限定，例如可以是注射剂、悬浮剂、溶液剂、喷雾剂之类的液剂，也可以是片状制剂或凝胶状制剂。
含有外泌体的制剂的使用方法没有限定，例如，能够用于直接给予受试者，或者用作在生物体外进行的、用于组织或器官的重建的供给源。
含有外泌体的制剂能够用于治疗疾病或残疾。能够例举出可作为对象的疾病或残疾有：免疫性疾病、缺血性疾病(下肢缺血、缺血性心脏疾病(心肌梗塞等)、冠心病、脑血管缺血、肾缺血、肺缺血等)、神经疾病、克罗恩氏病、移植物抗宿主病(GVHD)、包括溃疡性大肠炎的炎症性肠病、包括全身性红斑狼疮的胶原病、肝硬化、脑梗死、脑内血肿、脑血管痉挛、放射性肠炎、特应性皮炎、多发性硬化、类风湿关节炎、牛皮癣、红斑狼疮、糖尿病、蕈样真菌病(Alibert-Bazin综合症)、硬皮症、由软骨等结缔组织的变性和/或炎症引起的疾病、眼疾、血管生成相关疾患、充血性心力衰竭、心肌病、创伤、上皮损伤、纤维化、肺病、癌等疾病或残疾。
含有外泌体的制剂也能够用于美容目的的治疗、处理或改善。美容目的不仅仅是单纯的以成为健康状态的美容为目的，还包括对手术后或外部创伤后的变形和先天性的变形的美容治疗。例如，能够用于乳腺的组织增大术(丰乳、乳腺再造)、针对脸颊或上下眼睑的凹陷的组织增大术、以及对半侧面部萎缩症、面部或漏斗胸的组织增大术。
含有外泌体的制剂除了外泌体以外还可以含有药学上可接受的载体或添加物。作为这样的载体或添加物，例如能够例举出：等渗剂、增粘剂、糖类、糖醇类、防腐剂(保存剂)、杀菌剂或抗菌剂、pH调节剂、稳定剂、螯合剂、油性基剂、凝胶基剂、表面活性剂、悬浮剂、结合剂、赋形剂、润滑剂、崩解剂、发泡剂、流动助剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、助溶剂、抗氧化剂、甜味剂、酸味剂、着色剂、呈味剂、香料或清凉助剂等，但并不限定于这些。
实施例
1.以无纺布(3D)为支架的外泌体的大量回收(实施例)
下面，记载以无纺布(3D)为支架进行培养，然后在糖消耗量为平稳状态下培养后的外泌体大量回收所涉及的实施例。
1-1.三维培养工序
在三维培养工序中，以无纺布为支架对细胞进行了三维培养，直至细胞的糖消耗量(本实施例中为培养基中的葡萄糖消耗量)达到平稳。
将骨髓源性间充质干细胞(BMSC)和脂肪源性间充质干细胞(ADSC)播种到支架上。支架使用了作为三维结构体的无纺布(3D、BioNOCII、CESCO公司、非粘附性24孔板(PrimeSurface(注册商标)住友电木))。
在各孔(well)中播种了6×103个BMSC，且在各孔中播种了4×104个ADSC。基础培养基为1.5ml的10％FBS/DMEM F12(Sigma)。需要说明的是，DMEM/F12是将DMEM(DMEM包含葡萄糖)和Ham's F-12以1∶1混合而成的培养基，相对于培养基添加了10％的FBS来使用。
从第二天开始，每天更换1.5ml培养基，测量了使用完毕的培养液的糖消耗量。培养细胞直至细胞的糖消耗量达到平稳。在BMSC的情况下，细胞的糖消耗量达到平稳为止的培养时间为10天。在ADSC的情况下，细胞的糖消耗量达到平稳为止的培养时间为8天。
1-2.平稳状态后培养工序
在平稳状态后培养工序中，在细胞的糖消耗量达到平稳后，对细胞进行了一定时间的三维培养。
即，在BMSC和ADSC的糖消耗量开始达到平稳后立即改变培养基。使用了在DMEMF12中添加了10％ExoFBS(Funakoshi)的培养基。改变培养基后，BMSC的情况下培养了48小时，ADSC的情况下培养了48小时。即，在BMSC的情况下，培养了10天后，葡萄糖消耗量达到了平稳，因此将培养基改变为DMEM F12+10％ExoFBS，进一步培养了48小时。在ADSC的情况下，培养了8天后，葡萄糖消耗量达到了平稳，因此将培养基改变为DMEM F12+10％ExoFBS，进一步培养了48小时。
1.3.外泌体回收工序
在BMSC的情况下回收了48小时后的全部培养上清液1.5ml，并且，在ADSC的情况下回收了48小时后的全部培养上清液1.5ml。通过超速离心法从回收到的培养上清液中回收了外泌体。从支架上剥离细胞，测量了最终细胞数。
2.以培养皿(2D)为支架的外泌体的回收(比较例)
下面，记载以培养皿(2D)为支架进行培养，然后在糖消耗量为平稳状态下培养后的外泌体回收所涉及的比较例。
将BMSC和ADSC播种到支架上。支架使用了6cm培养皿(2D、粘附性细胞培养皿、住友电木)。在各孔中播种了6×103个BMSC，且在各孔中播种了4×104个ADSC。基础培养基为1.5ml的10％FBS/DMEM F12(Sigma)。
从第二天开始，每天更换1.5ml培养基，测量了使用完毕的培养液的糖消耗量。培养细胞直至细胞的糖消耗量达到平稳。在BMSC的情况下，细胞的糖消耗量达到平稳为止的培养时间为10天。在ADSC的情况下，细胞的糖消耗量达到平稳为止的培养时间为8天。
然后，在BMSC和ADSC的糖消耗量开始达到平稳后立即改变培养基。使用了在DMEMF12中添加了10％ExoFBS(Funakoshi)的培养基。改变培养基后，BMSC的情况下培养了48小时，ADSC的情况下培养了48小时。
在BMSC的情况下回收了48小时后的全部培养上清液1.5ml，并且，在ADSC的情况下回收了48小时后的全部培养上清液1.5ml。从回收到的培养上清液中回收了外泌体。
3.糖消耗量平稳前培养后的回收外泌体(比较例)
下面，记载在糖消耗量平稳前的培养后的外泌体回收所涉及的比较例。
将BMSC和ADSC播种到支架上。支架使用了作为三维结构体的无纺布(3D、BioNOCII、CESCO公司、非粘附性24孔板(PrimeSurface(注册商标)住友电木)和6cm培养皿(2D、粘附细胞培养皿、住友电木)。在无纺布支架和培养皿支架的各孔中播种了6×103个BMSC，且在无纺布支架和培养皿支架的各孔中播种了4×104个ADSC。基础培养基为1.5ml的10％FBS/DMEM F12(Sigma)。
从第二天开始，每天更换1.5ml培养基，测量了使用完毕的培养液的糖消耗量。BMSC和ADSC均在无纺布支架和培养皿支架中培养至第七天，该第七天是细胞的糖消耗量达到平稳之前的阶段。
然后，在第七天后立即更换了培养基。使用了在DMEM F12中添加了10％ExoFBS(Funakoshi)的培养基。改变培养基，然后将BMSC和ADSC均在无纺布支架和培养皿支架上培养了48小时。回收了48小时后的全部的培养上清液1.5ml。从回收到的培养上清液中回收了外泌体。
4.外泌体评价
4-1.使用了三维结构体即无纺布的效果
在全部回收到的培养上清液1.5ml中，用ExoCounter(JVCKENWOOD)测量了每个评价项目各50μl(将CD63和CD81定量为外泌体标记)。
图1是在BMSC的请情况下，以无纺布为支架进行培养的情况下的糖消耗量与培养时间之间的关系。如图1所示，能够根据绘图值确认：近似线y＝5.4833x+4.287，且在第十天的糖消耗量为平稳状态。
图2是在ADSC的情况下，以无纺布作为支架进行培养的情况下的糖消耗量与培养时间之间的关系。如图2所示，能够根据绘图值确认：近似线y＝7.0952x－3.8571，且在第八天的糖消耗量为平稳状态。
尝试了对用各细胞支架中的最终细胞数分别补正过的外泌体产生量进行比较研究。
首先，下述表1示出BMSC和ADSC的情况下的细胞数。
[表1]
在用ExoCounter测量出的外泌体的数值中，用根据各个测试体的最终细胞数得到的补正值，制作了图(图3)。在BMSC的情况下，就CD63而言，3D无纺布培养下的每单位细胞数的外泌体数是2D培养皿培养下的每单位细胞数的外泌体数×1.23，就CD81而言，3D无纺布培养下的每单位细胞数的外泌体数是2D培养皿培养下的每单位细胞数的外泌体数×1.39。在ADSC的情况下，就CD63而言，3D无纺布培养下的每单位细胞数的外泌体数是2D培养皿培养下的每单位细胞数的外泌体数×2.08，就CD81而言，3D无纺布培养下的每单位细胞数的外泌体数是2D培养皿培养下的每单位细胞数的外泌体数×1.74。
因此，BMSC和ADSC都证实了在利用无纺布(3D)培养的外泌体回收的方法中外泌体产生量增加。
关于BMSC，实施NTA测量(粒子分布、细胞数比补正值(3D/2D比率))，并进行了比较研究。根据NTA测定值(3D：10.1×109个、2D：7.1×109个)，3D/2D比率为×1.46，使用上述表1的细胞数比(×1.18)补正后的外泌体增加量为×1.24(图4)。即，NTA测量也证实了外泌体产生量增加。
4-2.培养到糖消耗量达到平稳的效果
在无纺布支架(3D)和培养皿支架(2D)中，在将BMSC和ADSC均培养到细胞的糖消耗量达到平稳之前的阶段即第七天的情况下，无纺布支架中细胞数为1.11±0.04×105个，培养皿支架中细胞数为1.43±0.12×105个。细胞数的比率为无纺布支架(3D)/培养皿支架(2D)比率即×0.776。
接下来，无纺布支架(3D)中的CD63外泌体产生量为145,863，培养皿支架(2D)中的CD63外泌体产生量为189,653。CD63外泌体产生量的比率是3D/2D比率即×0.769。如果用细胞数比补正外泌体产生量的比率就变为0.99，发现了即使使用无纺布支架(3D)，外泌体的产生量也没有增大。
接下来，无纺布支架(3D)的CD81外泌体产生量为139,287，培养皿支架(2D)的CD81外泌体产生量为186,584。CD81外泌体产生量的比率是3D/2D比率即×0.747。如果用细胞数比补正外泌体产生量的比率就变为0.96，即使使用无纺布支架(3D)，外泌体的产生量也没有增大。
像这样，BMSC和ADSC均证实了：不能仅通过无纺布(3D)培养来增大外泌体产生量，通过(a)以无纺布(3D)为支架进行培养、(b)然后在糖消耗量为平稳状态下进行培养，由此能够实现大量回收外泌体。
－产业实用性－
能够用于外泌体的大量产生。
Claims (8)
1.一种外泌体回收方法，是回收来自间充质干细胞的外泌体的回收方法，所述外泌体回收方法的特征在于：具有：
三维培养工序，在所述三维培养工序中，一边测量培养基中的被所述间充质干细胞代谢的物质的量，一边以无纺布为支架在所述培养基中对间充质干细胞进行三维培养；
平稳状态后培养工序，在所述平稳状态后培养工序中，在所述培养基中的所述物质的量达到平稳后进一步对所述间充质干细胞进行一定时间的培养；以及
外泌体回收工序，在所述外泌体回收工序中，在所述一定时间的培养后，从所述间充质干细胞回收外泌体。
2.根据权利要求1所述的外泌体回收方法，其特征在于：
所述培养基中的被所述间充质干细胞代谢的物质为糖，
测量所述间充质干细胞的相对于培养时间的糖消耗量，
在所述平稳状态后培养工序，在所述糖消耗量达到平稳状态后进一步对所述间充质干细胞进行一定时间的培养。
3.根据权利要求2所述的外泌体回收方法，其特征在于：
在所述平稳状态后培养工序中，在所述间充质干细胞的相对于培养时间的糖消耗量的测量中，测量葡萄糖的消耗量。
4.根据权利要求1到3中任一项权利要求所述的外泌体回收方法，其特征在于：
在所述平稳状态后培养工序中，所述物质的量达到平稳状态后的培养时间为24小时以上72小时以下。
5.根据权利要求1到4中任一项权利要求所述的外泌体回收方法，其特征在于：
所述间充质干细胞为脂肪源性间充质干细胞。
6.根据权利要求5所述的外泌体回收方法，其特征在于：
在所述间充质干细胞为脂肪源性间充质干细胞的情况下，所述三维培养工序中的脂肪源性间充质干细胞的培养时间为7天以上9天以下。
7.根据权利要求1到4中任一项权利要求所述的外泌体回收方法，其特征在于：
所述间充质干细胞为骨髓源性间充质干细胞。
8.根据权利要求7所述的外泌体回收方法，其特征在于：
在所述间充质干细胞为骨髓源性间充质干细胞的情况下，所述三维培养工序中的骨髓源性间充质干细胞的培养时间为9天以上11天以下。
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