CN113521031B - 球包球状纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种球包球状纳米颗粒，是由第一单体分子和第二单体分子自组装得到的球状结构，第一单体分子包括相互连接的第一疏水性分子和亲水性抗肿瘤药物，亲水性抗肿瘤药物用于引起肿瘤细胞的死亡，第二单体分子包括依次连接的第二疏水性分子、环境响应性连接分子、亲水性免疫调节佐剂分子，第一单体分子与第二单体分子穿插分布，第一单体分子形成第一球体，第二单体分子形成第二球体，第一球体与第二球体的球心重合，第二球体的外径大于第一球体的外径，第一疏水性佐剂分子分布于第一球体的内侧，第二疏水性佐剂分子分布于第二球体的内侧。本发明还公开了一种球包球状纳米颗粒的制备方法。

Description

球包球状纳米颗粒及其制备方法
技术领域
本发明涉及药物技术领域，特别是涉及球包球状纳米颗粒及其制备方法。
背景技术
纳米药物制剂或纳米药物载体的开发，已成为国际医药领域的热点。纳米药物不仅可以改善药物的稳定性和释放性能，提高药物的生物利用度，还可以提高药物的靶向性和实现多组分功能分子共递送，在肿瘤联合治疗方面具有独特的优势。
然而，目前纳米载体多是采用纳米医用材料制备而成，纳米载体粒子尺寸小、比表面积大、表面态丰富、化学活性高，具有许多块体及普通粉末所没有的特殊性质，如有些无机纳米材料可能会造成细胞死亡、形态改变及染色体损伤，部分有机高分子纳米材料则存在降解和代谢困难等问题。因此传统的纳米载体材料具有潜在的安全性问题。对于那些作用靶点不同的药物，单纳米颗粒负载递送这些药物时很难实现程序性分阶段解体并释放药物。而且，纳米载体的有限药物负载量及复杂的制备过程均限制了纳米载体药物的临床应用。
发明内容
基于此，有必要针对有必要针对传统纳米载体药物安全性差、载药量低、制备过程复杂的问题，提供一种球包球状纳米颗粒及其制备方法。
一种球包球状纳米颗粒，是由第一单体分子和第二单体分子自组装得到的球状结构，所述第一单体分子包括相互连接的第一疏水性分子和亲水性抗肿瘤药物，所述亲水性抗肿瘤药物用于引起肿瘤细胞的死亡，所述第二单体分子包括依次连接的第二疏水性分子、环境响应性连接分子、亲水性免疫调节佐剂分子，所述第一单体分子与所述第二单体分子穿插分布，所述第一单体分子形成第一球体，所述第二单体分子形成第二球体，所述第一球体与所述第二球体的球心重合，所述第二球体的外径大于所述第一球体的外径，所述第一疏水性佐剂分子分布于所述第一球体的内侧，所述亲水性抗肿瘤药物分布于所述第一球体的外侧，所述第二疏水性佐剂分子分布于所述第二球体的内侧，所述亲水性免疫调节佐剂分子分布于所述第二球体的外侧。
在其中一些实施例中，所述第一球体的直径130nm～145nm，所述第二球体的直径为155nm～170nm。
在其中一些实施例中，所述第二单体分子中的所述环境响应性连接分子为一个或多个。
在其中一些实施例中，同一第二单体分子中多个所述环境响应性连接分子为同一种类或不同种类。
在其中一些实施例中，所述环境响应性连接分子选自基质金属蛋白酶响应性多肽、酶解α-乳白蛋白多肽、谷胱甘肽响应性分子、H2O2响应性分子中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述环境响应性连接分子选自序列为SEQ ID NO:1的多肽分子。
在其中一些实施例中，所述亲水性抗肿瘤药物选自化疗药物、光敏药物中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述第一疏水性分子选自脂类分子、非脂类疏水性抗肿瘤药物、非脂类疏水性免疫调节佐剂分子中的至少一种。
在其中一些实施例中，所二疏水性分子选自脂类分子、非脂类疏水性抗肿瘤药物、非脂类疏水性免疫调节佐剂分子中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述亲水性免疫调节佐剂分子选自胞因子类佐剂、小分子肽类佐剂中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述第一疏水性分子选自1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺，所述亲水性抗肿瘤药物选自盐酸阿霉素，所述第二疏水性分子选自1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺，所述环境响应性连接分子选自序列为SEQ ID NO:1的多肽分子，所述亲水性免疫调节佐剂分子选自序列为：5‘(SH)-SEQ ID NO:2-3’的寡聚脱氧核酸。
所述的球包球状纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
a、将所述第一单体分子与所述第二单体分子混合，进行超声处理；
b、将超声处理后的混合物在20℃～30℃下进行搅拌反应。
在其中一些实施例中，所述搅拌反应的时间为12h～24h。
本发明涉及一种环境响应性“球包球”纳米颗粒及其制备方法与用途。该纳米颗粒是由两种不同长短的两亲性单体分子作为基元，通过自组装制备而成的“球包球”纳米颗粒。两种两亲性单体分子，第一单体分子包括相互连接的第一疏水性分子和亲水性抗肿瘤药物，第二单体分子包括依次连接的第二疏水性分子、环境响应性连接分子、亲水性免疫调节佐剂分子。该球包球状纳米颗粒到达肿瘤局部时环境响应性连接分子在微环境条件下响应性断裂、外部亲水性免疫调节佐剂分子与内部的球形抗肿瘤药物(化疗药物/光敏药物等)的第一球体解体释放，第一球体作用于肿瘤细胞，引起肿瘤细胞的死亡，激活炎症小体通路，同时肿瘤细胞凋亡产生的自抗原与游离的佐剂分子协同作用于免疫细胞，激活抗原特异性免疫反应。释放的免疫调节佐剂分子作用于肿瘤局部的抗原提呈细胞，增强肿瘤免疫反应，实现化疗/光动力疗法等与免疫治疗的协同治疗作用。除了构建纳米颗粒的药物分子可进行免疫治疗与化疗或光动力等疗法的联合治疗，还可以作为纳米载体，在纳米颗粒的不同空间部位，如疏水分子位置等负载其它治疗药物进行递送，实现多重联合治疗，提高肿瘤的治疗效果，同时降低全身的毒副作用。
附图说明
图1为本发明一实施例的球包球状纳米颗粒结构示意图；
图2A为本发明一实施例的环境响应性“球包球”纳米颗粒动态光散射粒径图；
图2B为本发明一实施例的环境响应性“球包球”纳米颗粒电位检测结果图；
图3为本发明一实施例的环境响应性“球包球”纳米颗粒透射电子显微镜图；
图4为本发明一实施例的肿瘤细胞摄取环境响应性“球包球”纳米颗粒共聚焦成像结果图；
图5A为本发明一实施例的环境响应性“球包球”纳米颗粒对CD40细胞的促成熟情况图；
图5B为本发明一实施例的环境响应性“球包球”纳米颗粒对CD86细胞的促成熟情况图；
图6为本发明一实施例的DC细胞与环境响应性“球包球”纳米颗粒孵育后细胞因子分泌情况图；
图7A为本发明一实施例的环境响应性“球包球”纳米颗粒对肿瘤的治疗效果-肿瘤体积图；
图7B为本发明一实施例的环境响应性“球包球”纳米颗粒对肿瘤的治疗效果-存活率图；
图8为本发明一对比例的环境响应性“球包球”纳米颗粒动态光散射粒径图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
如图1所示，本发明实施例提供一种球包球状纳米颗粒，是由第一单体分子和第二单体分子自组装得到的球状结构，所述第一单体分子包括相互连接的第一疏水性分子和亲水性抗肿瘤药物，所述亲水性抗肿瘤药物用于引起肿瘤细胞的死亡，所述第二单体分子包括依次连接的第二疏水性分子、环境响应性连接分子、亲水性免疫调节佐剂分子，所述第一单体分子与所述第二单体分子穿插分布，所述第一单体分子形成第一球体，所述第二单体分子形成第二球体，所述第一球体与所述第二球体的球心重合，所述第二球体的外径大于所述第一球体的外径，所述第一疏水性佐剂分子分布于所述第一球体的内侧，所述亲水性抗肿瘤药物分布于所述第一球体的外侧，所述第二疏水性佐剂分子分布于所述第二球体的内侧，所述亲水性免疫调节佐剂分子分布于所述第二球体的外侧。
本发明涉及一种环境响应性“球包球”纳米颗粒及其制备方法与用途。该纳米颗粒是由两种不同长短的两亲性单体分子作为基元，通过自组装制备而成的“球包球”纳米颗粒。两种两亲性单体分子，第一单体分子包括相互连接的第一疏水性分子和亲水性抗肿瘤药物，第二单体分子包括依次连接的第二疏水性分子、环境响应性连接分子、亲水性免疫调节佐剂分子。该球包球状纳米颗粒到达肿瘤局部时环境响应性连接分子在微环境条件下响应性断裂、外部亲水性免疫调节佐剂分子与内部的球形抗肿瘤药物(化疗药物/光敏药物等)的第一球体解体释放，第一球体作用于肿瘤细胞，引起肿瘤细胞的死亡，激活炎症小体通路，同时肿瘤细胞凋亡产生的自抗原与游离的佐剂分子协同作用于免疫细胞，激活抗原特异性免疫反应。释放的免疫调节佐剂分子作用于肿瘤局部的抗原提呈细胞，增强肿瘤免疫反应，实现化疗/光动力疗法等与免疫治疗的协同治疗作用。除了构建纳米颗粒的药物分子可进行免疫治疗与化疗或光动力等疗法的联合治疗，还可以作为纳米载体，在纳米颗粒的不同空间部位，如疏水分子位置等负载其它治疗药物进行递送，实现多重联合治疗，提高肿瘤的治疗效果，同时降低全身的毒副作用。
采用分阶段解体的方式，第二球体的亲水性免疫调节佐剂分子解体一步后，含有抗肿瘤药物的第一球体，仍然具有纳米的优势，如提高肿瘤细胞对其的内吞量，从而集中性加强该抗肿瘤药物对肿瘤的杀伤力。在此同时，免疫调节佐剂分子也集中释放，与抗肿瘤药物协同，达到智能程序性释放的特性，化疗/光动力疗法等与免疫治疗的协同治疗作用。
该纳米颗粒是由具有治疗功能的药物分子通过自组装构建而成，并且不涉及其它非功能纳米材料，具有良好的生物安全性。同时该纳米颗粒解体具有肿瘤微环境响应性，药物仅在肿瘤局部释放，不仅降低了药物的全身毒副反应，还增强了不同疗法的协同治疗作用。
在一些实施方案中，所述第一球体的直径130nm～145nm。所述第二球体的直径为155nm～170nm。第一球体的直径可以为130nm、132nm、134nm、136nm、138nm、140nm、142nm、145nm。第二球体的直径可以为155nm、157nm、160nm、162nm、164nm、167nm、170nm。在一具体实施方案中，第二球体的直径为159.3nm～161.9nm，第一球体的直径为134.6nm～141.8nm。
在一些实施方案中，所述第二单体分子中的所述环境响应性连接分子为一个或多个。在环境响应性连接分子的种类确定时，连接分子的数量决定了纳米颗粒的粒径，而纳米颗粒的粒径与其呈递和转移又具有密切的联系。
在一些实施方案中，同一第二单体分子中多个所述环境响应性连接分子为同一种类或不同种类。可根据实验目的(是单环境响应还是多个环境响应)来设计是需要一种还是多种连接分子。同一单体分子中多个所述环境响应性连接分子为同一种类时，则该纳米颗粒的分阶段解体释放专一性更强，只有当一种特定的环境刺激时，相应的单体分子才会发生响应，避免误解体释放现象的发生。同一单体分子中多个所述环境响应性连接分子为同一种类时，则该纳米颗粒的分阶段解体释放灵活性更强，单体分子可对多环境刺激发生响应，对特定部位环境变化的要求降低。
根据自身体系的设计和作用原理来选择相符的环境响应性连接。例如根据药物释放的靶点要求进行选择。在一些实施方案中，所述环境响应性连接分子选自基质金属蛋白酶响应性多肽、酶解α-乳白蛋白多肽、谷胱甘肽响应性分子、H2O2响应性分子中的至少一种。其中，谷胱甘肽响应性分子可选自叶酸、生物素、微生物B2、微生物B12等中的任意一种或多种。
在一些实施方案中，所述环境响应性连接分子选自序列为SEQ ID NO:1--ESWTKKSPSPEFSGMGPQGIAGQR的多肽分子。
在一些实施方案中，所述亲水性抗肿瘤药物选自化疗药物、光敏药物中的至少一种。
在一些实施方案中，所述第一疏水性分子选自脂类分子、非脂类疏水性抗肿瘤药物、非脂类疏水性免疫调节佐剂分子中的至少一种。
在一些实施方案中，所述第二疏水性分子选自脂类分子、非脂类疏水性抗肿瘤药物、非脂类疏水性免疫调节佐剂分子中的至少一种。
第一疏水性分子与第二疏水性分子的种类可以相同或不同。
在一些实施方案中，所述亲水性免疫调节佐剂分子选自胞因子类佐剂、小分子肽类佐剂中的至少一种。细胞因子类佐剂例如可以为GM-CSF等。小分子肽类佐剂例如可以为Q11、Hp91等。
本发明实施例还提供了上述任一实施方案中的球包球状纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
a、将所述第一单体分子与所述第二单体分子混合，进行超声处理；
b、将超声处理后的混合物在20℃～30℃下进行搅拌反应。
通过对第一单体分子、第二单体分子的自组装趋势进行研究发现，搅拌前进行超声处理，然后再在接近室温的条件下进行搅拌反应，有利于自组装的进行。发明人认为可能是因为超声处理打散已经自组装的两种单体分子，然后在合适的条件下可以更好地重新进行第一单体分子、第二单体分子的自组装。
在一些实施方案中，步骤a的超声处理可以为10秒～15秒。
第一单体分子上第一疏水性分子和亲水性抗肿瘤药物分子之间的连接反应可以为羟基与羧酸形成酯的反应、酰胺化反应等等，这里不作限制。第二单体分子上第二疏水性分子、环境响应性连接分子、亲水性免疫调节佐剂分子之间的连接反应也不作限制，可以为羟基与羧酸形成酯的反应、酰胺化反应等等。只要能够实现基本的连接并且不影响该球包球纳米颗粒的反应机理即可。可根据连接的各分子的基团类型选择合适的反应类型。
本发明球包球状纳米颗粒由第一单体分子和第二单体分子自组装得到，因此，第一单体分子与第二单体分子的反应时间和温度对于是否能够自组装成预期的球包球状结构具有重要影响。
在一些实施方案中，步骤b在20℃～30℃下搅拌进行，搅拌反应时间为12小时～24小时。具体的，搅拌温度可以为20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃。反应时间可以为12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时。优选的，搅拌温度为24℃～26℃。反应时间为16小时至20小时。
在一具体实施方案中，球包球状纳米颗粒中，所述第一疏水性分子选自1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺，所述亲水性抗肿瘤药物选自盐酸阿霉素，所述第二疏水性分子选自1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺，所述环境响应性连接分子选自序列为SEQ IDNO:1--ESWTKKSPSPEFSGMGPQGIAGQR的多肽分子，所述亲水性免疫调节佐剂分子选自序列为：5‘(SH)-TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO:2)-3’的寡聚脱氧核酸。
在一些实施方案中，其第一单体分子的制备方法包括以下步骤：
X1、对1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺进行巯基修饰；
X2、对盐酸阿霉素进行吡啶基二硫醇修饰；
X3、将步骤X1、X2得到的产物混合，在20℃～30℃下进行搅拌反应。
步骤X3的搅拌反应时间可以为24h～48h。具体的，搅拌温度可以为20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃。反应时间可以为24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、44小时、46小时、48小时。
在一些实施方案中，其第二单体分子的制备方法包括以下步骤：
Y1、将环境响应性分子MMP-9多肽(序列为：NH2-ESWTKKSPSPEFSGM GPQGIAGQR(SEQID NO:1)-COOH的羧基活化为酯；
Y2、将步骤Y1产物与疏水性分子1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺在室温下搅拌反应24h～48h；
Y3、对步骤Y 2得到的产物分子上的氨基进行吡啶基二硫醇修饰；
Y4、将Y3得到的产物与亲水性免疫调节佐剂分子选自序列为：5‘(SH)-TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO:2)-3’混合，在20℃～30℃下反应10h～14h。
步骤Y1中的活化剂可以为1,2-二氯乙烷和N-羟基丁二酰亚胺、N,N-二环己基碳二亚胺，氯甲酸异丁酯等中的任意一种。
优选的，该实施例中的第一单体分子与第二单体分子反应的摩尔比为(16～53):1。
以下为具体实施例。
实施例：
S1：向疏水性分子1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺中加入3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和二硫代苏糖醇进行巯基修饰，三者质量比为(5.2～10.4)mg:(3～6)mg：(3.9～7.8)mg，室温下搅拌反应12～24h；
S2：向亲水性药物分子盐酸阿霉素加入3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯进行吡啶基二硫醇修饰，所述盐酸阿霉素和3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的质量比值为(4.0～8.0)mg:(3.0～6.0)mg，室温下搅拌反应8～16h；
S3：将上述S1、S2得到的物质混合，室温下搅拌反应24～48h后透析、冻干；
S4：将环境响应性连接分子MMP-9多肽(序列为：NH2-ESWTKKSPSPEFSGMGPQGIAGQR(SEQ ID NO:1)-COOH)与活化剂1,2-二氯乙烷和N-羟基丁二酰亚胺混合，发生取代反应将羧基活化成酯，为下一步的酰胺反应做准备，三者加入质量比为(0.9～1.8)mg:(0.6～1.2)mg:(0.7～1.4)mg，40℃下搅拌反应4h。N,N-二环己基碳二亚胺，氯甲酸异丁酯等也可以作为活化剂用于羧基端的活化；
S5：向上述S4得到的物质中加入疏水性分子1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺(0.5～1)mg，室温下搅拌反应24～48h，通过酰胺反应将疏水分子连接在活化的羧基端；
S6：向S5得到的物质中加入3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(0.5～1)mg，对S5产物分子上的氨基进行吡啶基二硫醇修饰，室温下搅拌反应8～16h；
S7：将S6得到的物质与亲水性佐剂功能性寡聚脱氧核酸CPG-ODN(序列为：5‘(SH)-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(SEQ ID NO:2)-3’)混合，加入量为(5～10)OD，室温下反应过夜；
S8：将S3、S7得到的物质按照S3与S7的单体分子的摩尔为(800～1600)nmol:(27.6～55.2)nmol混合，超声处理10～15s，然后室温下500rpm搅拌反应12～24h，得到所述MMP-9环境响应性纳米颗粒。如图2A、图2B、图3所示。MMP-9环境响应性“球包球”纳米颗粒动态光散射粒径测量的直径为159.3～161.9nm,电位为-26.2mV～-24.4mV。MMP-9环境响应性“球包球”纳米颗粒在透射电子显微镜下呈均匀分布状。
实验例：
1、基质金属酶9(MMP-9)响应性“球包球”纳米颗粒的细胞摄取实验：
为了观察肿瘤细胞对MMP-9环境响应性“球包球”纳米颗粒的摄取情况，将E.G7-OVA肿瘤细胞铺于共聚焦皿中，肿瘤细胞与纳米颗粒共孵育2h后(按照盐酸阿霉素2μM计算给药量)，PBS进行洗涤，固定液进行固定，利用激光共聚焦显微镜(Leica,TCS SP5)观察MMP-9环境响应性“球包球”纳米颗粒在肿瘤细胞中的分布情况，全程避光操作。用同浓度的单体分子A作对照，单体分子A为S3所得产物。如图4所示，相比于单独的化疗药物分子，MMP-9环境响应性“球包球”纳米颗粒促进了肿瘤细胞对化疗药物的摄取。
2、MMP-9环境响应性“球包球”纳米颗粒对BMDCs成熟的影响：
流式细胞术检测纳米颗粒对于BMDCs细胞促成熟情况，先将肿瘤细胞与MMP-9环境响应性“球包球”纳米颗粒共孵育12h(按照盐酸阿霉素2μM计算给药量)，然后将BMDC与含有纳米颗粒的肿瘤细胞共孵育24h，收集细胞，标记CD11C、CD40及CD86等流式抗体，用流式细胞仪进行检测。用PBS、同浓度的游离盐酸阿霉素、同浓度的游离盐酸阿霉素+CPG-ODN混合液作对照。(其中游离盐酸阿霉素用DOX表示，游离盐酸阿霉素+CPG-ODN用Free DC表示，纳米颗粒用NPs表示)。如图5A、图5B所示，相比于游离化疗药物和游离化疗药+佐剂，MMP-9环境响应性“球包球”纳米颗粒对DC细胞的促成熟效果更强。
3、ELISA法测定MMP-9环境响应性“球包球”纳米颗粒对BMDCs细胞因子分泌影响：
收集BMDCs，接种于96孔板种。先将肿瘤细胞与MMP-9环境响应性“球包球”纳米颗粒共孵育12h(按照盐酸阿霉素2μM计算给药量)，然后将含有纳米颗粒的肿瘤细胞与96孔板中的BMDC共孵育24h后，离心取上清。按照ELISA试剂盒说明书方法对BMDCs上清液进行细胞因子TNF-α(Tumor Necrosis Factor-α，肿瘤坏死因子-α)的含量测定。使用酶标仪测定450nm处的吸光度OD值，根据标准品吸光度与浓度绘制标准曲线，计算样品浓度。用PBS、同浓度的游离盐酸阿霉素、同浓度的游离盐酸阿霉素+CPG-ODN混合液作对照。(其中游离盐酸阿霉素用DOX表示，游离盐酸阿霉素+CPG-ODN用Free DC表示，纳米颗粒用NPs表示)。如图6所示，MMP-9环境响应性“球包球”纳米颗粒可显著促进BMDCs细胞因子分泌，具有促进抗原提呈细胞活化的作用。
4、MMP-9环境响应性“球包球”纳米颗粒在荷瘤小鼠体内抗肿瘤疗效：
选用饲养在SPF级别饲养室、健康6周龄的雌性C57BL/6小鼠建立淋巴瘤小鼠异位肿瘤移植模型。待实验动物适应饲养环境以后，将小鼠背部及腹股沟等部位的被毛除去，于右侧腹股沟皮下接种处于对数生长期且培养状态良好的EG7-OVA细胞(约5×105个/只)。待接种小鼠肿瘤直径约5mm时，将生长状况相近的荷瘤小鼠随机分成PBS、游离盐酸阿霉素、游离盐酸阿霉素+CPG和杂合纳米粒四组，并在接种肿瘤细胞第7天、第14天、第21天时分别给予等体积的新鲜无菌PBS溶液、游离盐酸阿霉素、游离盐酸阿霉素+CPG和纳米粒溶液(按照盐酸阿霉素0.1mg/只计算给药量)。仔细观察小鼠生存情况、饮食情况及精神状态，每两天利用数显游标卡尺测量并记录荷瘤小鼠肿瘤长度和宽度，小鼠肿瘤体积(mm3)＝1/2×长度×宽度2。(其中游离盐酸阿霉素用DOX表示，游离盐酸阿霉素+CPG-ODN用Free DC表示，纳米颗粒用NPs表示)。如如图7A、图7B所示，MMP-9环境响应性“球包球”纳米颗粒对肿瘤生长可产生较强的抑制效果并显著延长了小鼠生存期。
对比例1
对比例1与实施例1的纳米颗粒的制备方法基本相同，区别仅在于按照S3与S7的单体分子的摩尔为800nmol:82.8nmol混合，如图8所示，单体分子或者纳米颗粒不能自组装成如实施例1所示的球包球结构。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医学科学院生物医学工程研究所
<120> 球包球状纳米颗粒及其制备方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Glu Ser Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Gly
1 5 10 15
Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg
20
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Thr Cys Cys Ala Thr Gly Ala Cys Gly Thr Thr Cys Cys Thr Gly Ala
1 5 10 15
Cys Gly Thr Thr
20

Claims (3)

1.一种球包球状纳米颗粒，其特征在于，是由第一单体分子和第二单体分子自组装得到的球状结构，所述第一单体分子包括相互连接的第一疏水性分子和亲水性抗肿瘤药物，所述亲水性抗肿瘤药物用于引起肿瘤细胞的死亡，所述第二单体分子包括依次连接的第二疏水性分子、环境响应性连接分子、亲水性免疫调节佐剂分子，所述第一单体分子与所述第二单体分子穿插分布，所述第一单体分子形成第一球体，所述第二单体分子形成第二球体，所述第一球体与所述第二球体的球心重合，所述第二球体的外径大于所述第一球体的外径，所述第一疏水性佐剂分子分布于所述第一球体的内侧，所述亲水性抗肿瘤药物分布于所述第一球体的外侧，所述第二疏水性佐剂分子分布于所述第二球体的内侧，所述亲水性免疫调节佐剂分子分布于所述第二球体的外侧；
所述第一疏水性分子选自1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺，所述亲水性抗肿瘤药物选自盐酸阿霉素，所述第二疏水性分子选自1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺，所述环境响应性连接分子选自序列为SEQ ID NO:1的多肽分子，所述亲水性免疫调节佐剂分子选自序列为：5‘(SH)-SEQ ID NO:2-3’的寡聚脱氧核酸；
所述第一球体的直径130nm～145nm，所述第二球体的直径为155nm～170nm；
所述的球包球状纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、将所述第一单体分子与所述第二单体分子混合，进行超声处理；
b、将超声处理后的混合物在20℃～30℃下进行搅拌12h～24h。
2.根据权利要求1所述的球包球状纳米颗粒，其特征在于，所述第二单体分子中的所述环境响应性连接分子为一个或多个。
3.根据权利要求2所述的球包球状纳米颗粒，其特征在于，同一第二单体分子中多个所述环境响应性连接分子为同一种类或不同种类。
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