CN113679670A - 一种载氯喹化合物的囊泡纳米药物及其制备方法与应用 - Google Patents
一种载氯喹化合物的囊泡纳米药物及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113679670A CN113679670A CN202110877728.2A CN202110877728A CN113679670A CN 113679670 A CN113679670 A CN 113679670A CN 202110877728 A CN202110877728 A CN 202110877728A CN 113679670 A CN113679670 A CN 113679670A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hcq
- drug
- polymer
- man
- nano
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
- A61K9/1273—Polymersomes; Liposomes with polymerisable or polymerised bilayer-forming substances
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
- A61K31/4706—4-Aminoquinolines; 8-Aminoquinolines, e.g. chloroquine, primaquine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明公开了一种载氯喹化合物的囊泡纳米药物及其制备方法与应用。以聚合物、氯喹化合物为原料,制备载氯喹化合物的囊泡纳米药物,聚合物包括亲水链段、疏水链段,所述疏水链段的侧链为含双硫键的二硫戊环。本发明研发了安全高效的巨噬细胞靶向的纳米药物用于治疗类风湿性关节炎,设计聚合物囊泡来高效装载、靶向递送和控制释放药物羟氯喹或者氯喹,提高了药物在细胞质的富集,并复极化M1M为M2M、减少分泌促炎细胞因子、增加分泌抑炎细胞因子,能抑制DC活化,还能清除ROS,在炎症关节富集。体外和体内的实验结果都证实了载氯喹化合物的囊泡纳米药物能靶向治疗类风湿性关节炎。
Description
技术领域
本发明属于纳米药物技术,具体涉及载氯喹化合物的囊泡纳米药物及其制备方法与应用。
背景技术
类风湿性关节炎(RA)是一种慢性自身免疫性疾病,主要症状包括关节疼痛、软骨损伤和骨流失(D. L. Scott, F. Wolfe, T. W. J. Huizinga, Rheumatoid arthritis,The Lancet, 2010, 376, 1094-1108)。目前RA的病因尚不明确,没有根治的方法,需要终身服药。临床上现有的疗法多采用非甾体药物、糖皮质激素、抗风湿药物(DMARDs)和生物制剂联用,例如,低剂量MTX自1980年以来就是临床上最常用的控制RA进程的疗法,经常被作为第一选择,但是MTX在炎症部位的有效浓度较低,系统毒性较大(M. TR, O. D. J, Thechanging face of rheumatoid arthritis therapy: results of serial surveys,Arthritis & rheumatology, 2000, 43, 464-465)。羟氯喹(HCQ)是临床上常见的用于自身免疫性疾病的药物,对RA和系统性红斑狼疮(SLE)有疗效,系统毒性小,但其一天口服剂量在200-400 mg,用药量大、起效慢。近些年来发展的生物药,包括曲妥珠单抗、依那西普和英夫利昔单抗等,可以与IL-6受体或TNF-α受体产生拮抗作用,来缓解RA进程。然而抗体药物存在生物利用度低、生产过程繁琐、价格昂贵的缺陷(P. R. Stocco Romanelli,Biologics for rheumatoid arthritis: an overview of Cochrane reviews, SaoPaulo Medical Journal, 2010, 128, 309-357)。
现有技术使用脂质体、脂质纳米粒、PLGA、银纳米粒子等纳米载体来装载抗炎药物地塞米松、泼尼松龙、对香豆酸、MTX、或siTNF-α等用于治疗RA,取得了一定成果;但是也存在以下问题:稳定性差,药物早释导致系统毒性;药物在炎症部位的有效浓度较低,不能实现有效治疗。因此,亟待研发能特异性靶向RA炎症部位的纳米递送系统,以实现RA的高效靶向治疗。
发明内容
本发明公开了载氯喹化合物的囊泡纳米药物及其制备方法与应用,基于纳米载体的递送系统能改变药物的生物分布,可以在关节部位富集,减少毒副作用,应用于RA的治疗以克服抗RA药物的局限性。
本发明采用如下技术方案:
载氯喹化合物的囊泡纳米药物,包括聚合物囊泡以及氯喹化合物;聚合物包括亲水链段、疏水链段,所述疏水链段的侧链为含双硫键的二硫戊环。优选的,聚合物为非靶向聚合物,或者聚合物为非靶向聚合物与靶向聚合物的混合物;非靶向聚合物包括PEG-P(TMC-DTC) 、PEG-P(CL-DTC)或者PEG-P(LA-DTC) ;靶向聚合物包括B-PEG-P(TMC-DTC)、B-PEG-P(CL-DTC)、或者B-PEG-P(LA-DTC),B为靶向分子,比如叶酸、甘露糖、葡聚糖、透明质酸、半乳糖等。
本发明中,聚合物自组装形成聚合物囊泡;以聚合物、氯喹化合物为原料,制备载氯喹化合物的囊泡纳米药物。优选的,采用pH梯度法把氯喹化合物装载入囊泡,得到载氯喹化合物的囊泡纳米药物。具体的,将聚合物在酸性缓冲液中自组装形成聚合物囊泡溶液,然后在碱性条件下,将氯喹化合物溶液加入聚合物囊泡溶液,得到载氯喹化合物的囊泡纳米药物。
本发明中,聚合物的分子量为10~50 kg/mol,优选的,亲水链段的分子量为2~10kg/mol。
本发明中,聚合物为非靶向聚合物与靶向聚合物的混合物时,非靶向聚合物与靶向聚合物的摩尔比为1∶(0~0.8),不包括0。
本发明中,氯喹化合物为抗自身免疫性疾病药物,为小分子药物,比如羟氯喹、氯喹等。作为一个具体实施例,本发明公开了甘露糖修饰的聚合物囊泡高效装载、靶向递送和控制释放羟氯喹(Man-PS-HCQ),以实现对酵母聚糖诱导的RA小鼠模型(ZIA)的高效安全治疗,该囊泡是由嵌段聚合物聚乙二醇-b-聚(三亚甲基碳酸脂-co-二硫戊环三亚甲基碳酸脂)(PEG-P(TMC-DTC))和偶联了甘露糖的Man-PEG-P(TMC-DTC)自组装并用pH梯度法装载HCQ而成。通过囊泡靶向递送羟氯喹到炎症部位的巨噬细胞,可以提高药物在患病关节处的富集量,提高细胞溶酶体中pH、降低酶活、减少APCs表面MHC-II的表达,减少羟氯喹的用量,降低其毒副作用。实验发现,在关节炎小鼠模型中,尾静脉注射Man-PS-HCQ比自由HCQ和PS-HCQ组展现出更好的疗效,显著减轻了小鼠的关节肿胀,增多了M2M在关节处的富集,而M1M、DC(CD11c+CD80+CD86+)、CD8+ T 细胞和CD4+ T 细胞均减少,说明Man-PS-HCQ能有效改善患病关节处的免疫微环境,有助于缓解炎症反应、软骨损伤和骨流失情况。
本发明公开了载氯喹化合物的囊泡纳米药物冻干粉,其制备方法为,将载氯喹化合物的囊泡纳米药物与冻干保护剂混合后冷冻干燥,得到载氯喹化合物的囊泡纳米药物冻干粉。优选的,冻干保护剂为蔗糖和/或甘露醇;进一步优选的,冻干保护剂的用量为2~6wt%。
本发明公开了载氯喹化合物的囊泡纳米药物在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。本发明公开了载氯喹化合物的囊泡纳米药物在制备复极化M1M巨噬细胞为M2M巨噬细胞的药物中的应用。本发明公开了载氯喹化合物的囊泡纳米药物在制备清除ROS的药物中的应用。本发明公开了载氯喹化合物的囊泡纳米药物在制备抑制BMDC活化的药物中的应用。本发明公开了载氯喹化合物的囊泡纳米药物在制备保护关节软骨和骨组织的药物中的应用。本发明公开了载氯喹化合物的囊泡纳米药物在制备抗炎药物或者抗自身免疫性疾病药物中的应用。
近年研究发现,抗原递呈细胞(APCs)如巨噬细胞、树突状细胞在类风湿性关节炎(RA)的发生和发展过程中起到了重要的作用,RA患者关节处巨噬细胞的含量很多,活化的巨噬细胞能释放大量促炎细胞因子,使得炎症加剧、造成软骨损伤以及骨流失。本发明研发了安全高效的巨噬细胞靶向的纳米药物用于治疗RA,设计聚合物囊泡来高效装载、靶向递送和控制释放抗RA药物。以羟氯喹为例,体外细胞实验结果表明,Man-PS-HCQ能靶向巨噬细胞递送HCQ,提高了HCQ在细胞质的富集,并复极化M1M为M2M、减少分泌促炎细胞因子、增加分泌抑炎细胞因子,能抑制DC活化,还能清除ROS;其还能在ZIA小鼠炎症关节富集。研究发现,Man-PS-HCQ对M2M的靶向效果略强于M1M,而M1M的内吞能力要远远高于M2M,且M1M是RA部位促炎细胞因子的主要来源,其对囊泡的强内吞更有利于将其复极化为M2M,减少促炎细胞因子、增加抑炎细胞因子的分泌。ZIA小鼠的动物实验发现,RA关节处的M1M含量显著上升,Man-PS-HCQ能更多地在小鼠炎症部位聚集,并复极化M1M为M2M。体外和体内的实验结果都证实了Man-PS-HCQ能靶向治疗RA。
附图说明
图1为NHS-PEG-P(TMC-DTC) (a)、Man-PEG-P(TMC-DTC) (b) 的1H NMR图 (400MHz, DMSO-d 6);
图2为Man-PS-HCQ和PS-HCQ的理化性质(a)由DLS确定的尺寸和尺寸分布(插图:TEM图像)。(b)不同浓度(1.0 mg/mL,50倍稀释(0.02 mg/mL)的PS-HCQ和Man PS-HCQ的大小和大小分布的变化,(c)在含有10%FBS溶液的PB(pH7.4)中放置24小时,或(d)在37℃下放置PB(pH7.4,10 mM GSH)24小时,(e)37℃条件下含或不含10 mM GSH(囊泡浓度:1.3 mg/mL)Man-PS-HCQ的体外释放曲线,(f)在37°C下放置24小时(n=3),PS-HCQ和Man-PS-HCQ在PB(pH6.0,3%H2O2)中的尺寸和尺寸分布变化(g) pH6.0,3%H2O2,37℃(囊泡浓度:1.3mg/mL)条件下,PS-HCQ和Man-PS-HCQ的体外释放曲线,在(h)4.4 wt.%和(i)2.2 wt.%浓度下,冻干PS-HCQ粉在去离子水中的粒度分布;
图3为Man-PS-HCQ和PS-HCQ对LPS处理的RAW 264.7细胞和LPS/IFN-γ共处理BMDM表达细胞因子LPS/IFN-γ的影响(10g HCQ/mL)。LPS(100ng/mL)刺激的RAW 264.7细胞与PBS、游离HCQ、PS-HCQ或Man-PS-HCQ孵育24h(a、 b),用ELISA试剂盒测定IL-6和IL-10蛋白水平(c、d),qRT-PCR检测IL-6和IL-10的mRNA表达。以GAPDH表达水平对数据进行标准化处理。LPS(100ng/mL)和IFN-γ(20 ng/mL)处理的BMDM细胞与PBS、人PS、游离HCQ、PS-HCQ或Man-PS-HCQ孵育24小时(e、 f)IL-6和IL-10的蛋白水平,(g)IL-10与IL-6的比值。(h)HCQ浓度对BMDMs产生IL-10的影响(n=6);
图4为Man-PS-HCQ、PS-HCQ和游离HCQ(10g HCQ/mL)与LPS (100 ng/mL)/IFN-γ(20 ng/mL)刺激BMDMs(CD11b+F4/80+CD206+细胞)孵育24 h复极效应的流式细胞术分析;
图5为(a)用PS-Cy5和Man-PS-Cy5(0.2 μg Cy5/mL)孵育4小时后不同表型BMDM的流式细胞术分析,(b)M0M、M1M和M2M的CD206表达;
图6为Man-PS-HCQ (8.5 μg HCQ/mL, 24 h)对CpG (0.4 μg/mL)预处理的BMDC的(CD80+CD86+)(a)、MHC-II+表达(b)、及其定量(c)的影响,以PBS、游离HCQ或PS-HCQ为对照(n=3);
图7(a)RAW 264.7细胞和(b)用DCFH-DA(绿色)染色的BMDM细胞内ROS的CLSM图像。LPS或LPS/ IFN-γ预处理的细胞与HCQ制剂孵育24小时。比例尺:(a)500 μm和(b)100 μm(n=3);
图8 为PS-HCQ和Man-PS-HCQ的细胞毒性(HCQ浓度为5、10 μg/mL)。(a)RAW 264.7细胞和(b)BMDMs细胞,培养24小时(n=6);
图9为静脉注射Cy5标记的Man-PS-HCQ和PS-HCQ(0.3 μg Cy5 equv./mice, 1.2mg HCQ/kg, n = 3)后ZIA小鼠模型的荧光图像 (a)活体成像和(b)左腿半定量(n=3);
图10为Man-PS-HCQ对ZIA小鼠作用的初步研究(n=5)(a)治疗方案。在第0天和第3天分别给予0.6、1.2或2.4 mg HCQ/kg的药物(b)腿围和(c)膝盖直径(d )相对体重,(e、f,g,h,I)在第1天、第0天、第3天或第7天进行不同治疗下的血清转化生长因子TGF-β浓度(n=5);
图11为Man-PS-HCQ对ZIA小鼠模型的抗RA治疗(a)治疗计划,(b)小鼠的腿围,(c)膝盖直径或(d)体重的变化;在第0天和第3天以1.2 mg HCQ/kg静脉注射HCQ制剂;第0、3、7天检测血清IL-6(e)和TGF-β浓度 (f);在用HCQ制剂治疗的小鼠的血清(g)和关节(h)中IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-10和TGF-β的表达(n=6);
图12为H&E、番红固绿、Trap染色的小鼠关节处的切片图像,如图11所示的方案治疗小鼠;
图13为用图11所示的方案治疗小鼠的主要脏器切片的H&E染色分析;
图14为用图11所示的方案治疗小鼠的骨关节切片的CD206抗体的染色分析;
图15为ZIA模型的建立(PBS组)以及小鼠关节处的细胞表征数据。
具体实施方式
硫酸羟氯喹(HCQ,> 99%,北京伊诺凯科技有限公司)、磷酸氯喹(CQ,> 99%,阿拉丁试剂(上海)有限公司)、D-甘露糖胺盐酸盐(> 98%,百灵威)、谷胱甘肽(GSH,> 99%,Roche)、CpG(上海吉玛制药技术有限公司)、脂多糖(LPS,sigma-aldrich)购买后直接使用。IL-4、IFN-γ、M-CSF、GM-CSF均为> 99%,购自PeproTech直接使用。小鼠白细胞介素-6、10、1β(IL-6、10、1β)、转化生长因子-β(TGF-β)和细胞坏死因子-α(TNF-α)的ELISA检测试剂盒(Invivogen)、以及小鼠荧光标记的各种抗体(Biolegend)CD80-APC、CD86-PE、CD11c-FITC、CD11b-FITC、CD206-APC、F4/80-PE、CD3-APC、CD4-PE和CD8-FITC等试剂盒和抗体均购买后按说明书使用。
核磁共振氢谱(1H NMR)用型号为Unity Inova 400的核磁共振波谱仪测试,氘代试剂为DMSO-d 6,化学位移以残留DMSO信号峰为标准。聚合物囊泡的粒径、PDI以及表面zeta电势由Zetasizer Nano-ZS(Malven Instruments, 英国)测定,采用633 nm波长的He-Ne激光光源和背散射检测器。样品的微观形貌由Tecnai G220透射电镜(TEM)在120 kV加速电压下测定,样品用1% 磷钨酸溶液染色。细胞对于囊泡的摄取情况通过使用BD FACSVerse流式细胞仪(Becton Dickinsion, FACSVerse,美国)测定。HCQ在囊泡中的载药量通过UV-Vis光谱仪(HITACHI)在343 nm测定。通过冷冻干燥机(CHIRIST,ALPHA1-2)冻干获取纳米粒冻干粉制剂。体外药物释放实验中,HCQ浓度由配有反相C18色谱柱(4.6×150 mm, 5μm)的高效液相色谱仪(HPLC)测试得到,A相为乙腈,B相为水相(50 mM 磷酸二氢钾,6.5 mM乙烷磺酸钠,7 mM三乙胺,用磷酸将pH值调至3.0)。流动相为A:B = 22:78(v/v),流速为1 mL/min,检测波长为330 nm。酶标仪(Thermo Multiskan FC)用来测定活细胞与MTT形成的紫色甲瓒在570 nm处的吸光度值。多功能酶标仪(Varioskan LUX, Thermo Scientific)用来进行细胞因子的ELISA检测。小鼠在体、离体成像通过红外荧光成像仪(IVIS,Lumina II;Caliper,MA)拍摄。
细胞培养与实验动物
小鼠巨噬细胞细胞株RAW 264.7是从中科院上海细胞库购买。骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)和骨髓来源的树突状细胞(BMDC)提取步骤如下:将小鼠通过颈椎脱臼处死,全身喷洒酒精,转置超净台中。取出小鼠四肢的骨头,泡入PBS中,转移至细胞房内超净台,通过PBS灌注的方式洗下小鼠四肢骨骨髓中的细胞到离心管中。用滤膜过滤细胞中的杂质,再离心(1500 rpm)5 min。弃去上清,下层细胞中加入3 mL细胞裂红液5-8 min裂解红细胞。加入10 mL的PBS中和后再离心,弃去上清,将下层细胞按3×106/孔的密度铺至6孔板中。用含25ng/mL M-CSF的1640培养基培养3天后全换液,5天后半换液,7天后即得BMDM;用含20 ng/mLGM-CSF的1640培养基培养2天后全换液,4天、6天和8天后半换液,9天后即得BMDC。
提取细胞所用小鼠为5-6周龄的雌性C57BL/6,建立ZIA模型的小鼠为12周龄的雌性C57BL/6,小鼠从北京维通利华实验动物技术有限公司购买。所有动物实验及操作均获得苏州大学实验动物中心和苏州大学的动物护理和使用委员会的批准。
制备例
本发明公开的聚合物为现有技术,其制备以及表征可参考申请人已经公开的文献或者专利申请,比如CN2016105581166、Y. Fang, W. Yang, L. Cheng, F. Meng, J.Zhang, Z. Zhong, EGFR-targeted multifunctional polymersomal doxorubicininduces selective and potent suppression of orthotopic human liver cancer invivo, Acta Biomaterialia, 2017, 64, 323-333。以用于实施例的PEG-P(TMC-DTC)(5k-15k-2k)和NHS-PEG-P(TMC-DTC)(6.5k-15k-2k)的制备为例做简单说明。
在氮气环境下,依次称取MeO-PEG-OH (M n =5.0 kg/mol, 0.009 mmol), TMC(1.93 mmol) 和DTC (0.21 mmol) 并溶解在二氯甲烷(DCM,6.8 mL)中,搅拌加入催化剂磷酸二苯酯(DPP,DPP/OH 摩尔比为10/1)。密闭反应器密封好放置40 °C油浴中磁力搅拌下反应24小时。冰醋酸终止反应后在冰乙醚中沉淀两次、抽滤、常温真空干燥后得到产物PEG-P(TMC-DTC)(5k-15k-2k)。产率:91.8%。
反应示意如下:
将上述引发剂MeO-PEG-OH换为N-羟基琥珀酰亚胺官能化的NHS-PEG6.5k-OH,开环聚合TMC和DTC得到NHS-PEG-P(TMC-DTC)(6.5k-15k-2k)。
D-甘露糖胺和NHS-PEG-P(TMC-DTC)的PEG上NHS发生酰胺化反应,可制备得到Man-PEG-P(TMC-DTC),制备路线如下所示:
具体方法为:在氮气环境下,先将NHS-PEG-P(TMC-DTC)(523 mg, 22.2 nmol)溶解在无水DMF(100 mg/mL)中。再将D-甘露糖胺盐酸盐(24 mg, 111 nmol)用三乙胺(22.5 mg,222 nmol)反应溶解脱盐得到D-甘露糖胺溶液,然后缓慢滴加到37oC的NHS-PEG-P(TMC-DTC)的DMF溶液中,滴加完毕后继续反应48 h。将反应液在DMF中透析两天(MWCO 7000 Da)、DCM透析一天,最后在30倍体积的冰乙醚中沉淀两次,抽滤、真空干燥24小时,得到白色固体Man-PEG-P(TMC-DTC)。产率:92%。氢核磁谱图(图1,DMSO-d 6,400 MHz,ppm)显示了聚合物的各特征峰:δ1.91(-OCOCH2CH2CH2CO-)、3.04 (-C(CH2SSCH2)C-)、3.48 (-CH2CH2O-)、4.11(-OCOCH2CH2CH2O-)、4.22 (-OCOC H 2 (CH2SSCH2)C H 2 O-)。在4.9附近出现了Man的特征峰,通过2.51处NHS特征峰的减少与3.48处PEG峰的比例计算得出Man官能化度为95%。
通过调整使用的原料比例或者更换不同封端基团的PEG可得到不同分子量的聚合物,见表1。
同样的,带有反应端基的嵌段聚合物和D-甘露糖胺盐酸盐(Man)反应,得到甘露糖靶向的两亲性聚合物。
实施例一甘露糖修饰的氯喹化合物的囊泡的制备和表征
甘露糖修饰的载羟氯喹的囊泡(Man-PS-HCQ)的制备和表征
采用pH梯度法把羟氯喹装载入囊泡。将Man-PEG-P(TMC-DTC)和PEG-P(TMC-DTC)两种聚合物分别用DMF溶解,再按10/90的摩尔比混合,加入到150 nM的柠檬酸-柠檬酸钠(pH=3.0)缓冲溶液中,搅拌3分钟形成囊泡,室温放置1小时后,加入NaOH水溶液调节pH为8.5建立囊泡内外的pH梯度。再加入一定量的HCQ水溶液,在摇床(37oC,100 rpm)中过夜,再用二次水透析8小时,每小时更换介质,得到载药囊泡10Man-PS-HCQ。
根据上述方法,仅以PEG-P(TMC-DTC)为聚合物,不加Man-PEG-P(TMC-DTC),得到载药囊泡PS-HCQ;根据上述方法,按20/80的摩尔比混合Man-PEG-P(TMC-DTC)和PEG-P(TMC-DTC),得到载药囊泡20Man-PS-HCQ。根据上述方法,不加入羟氯喹,得到空囊泡,即按照Man-PEG-P(TMC-DTC)的摩尔含量为0、10%、或20%的比例和PEG-P(TMC-DTC)的DMF溶液混合即可得到空聚合物囊泡Man-PS。
用动态激光光散射仪(DLS)测定新制备的囊泡、稀释50倍、10% FBS以及体外模拟还原条件下粒径和粒径分布的变化。HCQ通过在343 nm的紫外吸光度、基于标准曲线定量,可常规计算载药量(DLC)和载药效率(DLE):
HCQ的载药量计算结果显示,靶向分子密度的增加并不会影响HCQ在囊泡中装载效率(表 2)。当载药量从20 wt.%提高到33.3 wt.%时,最终的载药量分别为13 wt.%和20wt.%。Man密度和载药量的增加都不会对囊泡药物的表面电势有显著的影响,呈电中性。DLS结果显示,载药量在20 wt.%和33.3 wt.%的囊泡均具有较小的尺寸(46-49 nm),粒径分布PDI在0.12-0.15(图2 a),TEM图片也显示Man-PS-HCQ具有明显的囊泡结构,粒径也与DLS测得结果相近,现有技术公开的羟氯喹脂质体粒径在90~100 nm之间,且PDI达到0.18~0.2。下文中如无说明,使用的囊泡药物都是靶向密度为10%的Man,简写为Man-PS-HCQ,对应的空囊泡为Man-PS。
甘露糖修饰的载氯喹的囊泡(Man-PS-CQ)的制备和表征
采用pH梯度法把氯喹装载入囊泡。将Man-PEG-P(TMC-DTC)和PEG-P(TMC-DTC)两种聚合物分别用DMF溶解,再按10/90的摩尔比混合,加入到150 nM的柠檬酸-柠檬酸钠(pH=3.0)缓冲溶液中,搅拌3分钟形成囊泡,室温放置1小时后,加入NaOH水溶液调节pH为8.5建立囊泡内外的pH梯度。再加入一定量的CQ水溶液,在摇床(37℃,100 rpm)中过夜,再用二次水透析8小时,每小时更换介质,得到载药囊泡10Man-PS-CQ。同样的方法,改变Man-PEG-P(TMC-DTC)和PEG-P(TMC-DTC)两种聚合物比例,得到PS-CQ、20Man-PS-CQ,表征结果见表2。
将Man-PEG-P(TMC-DTC)和PEG-P(TMC-DTC)更换为表1的聚合物或者申请人之前公开的含有DTC单元的其他两亲性聚合物,采用上述方法亦可得到聚合物囊泡装载羟氯喹、靶向聚合物囊泡装载羟氯喹,可作为纳米药物。或者将羟氯喹更换为氯喹,得到聚合物囊泡装载氯喹、靶向聚合物囊泡装载氯喹,可作为纳米药物。
采用pH梯度法把羟氯喹装载入囊泡。将PEG-P(TMC-DTC)聚合物用DMF溶解,加入到150 nM的柠檬酸-柠檬酸钠(pH=3.0)缓冲溶液中,搅拌3分钟形成囊泡,室温放置1小时后,加入NaOH水溶液调节pH为7.4建立囊泡内外的pH梯度。再加入一定量的HCQ水溶液,在摇床(37oC,100 rpm)中过夜,再用二次水透析8小时,每小时更换介质,得到载药囊泡PS-HCQ,理论载药量为20%时,实际载药量为6.3±0.2%。同样方法把羟氯喹更换成氯喹,得到载药囊泡PS-CQ,理论载药量为20%时,实际载药量为8.1±0.2%。
实施例二 Man-PS-HCQ的体外药物释放。
将1 mL的Man-PS-HCQ(浓度:1.3 mg/mL,HCQ载药量:12.5wt.%)加入透析袋(MWCO12000 Da)中,分别没入20 mL的pH 7.4的二次水及模拟细胞质内还原环境(pH 7.4,10 mMGSH)水溶液中,置于37度空气摇床(200 rpm)中,在设定的时间点(0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24小时)取出5 mL透析液,再加入5 mL相应的新鲜透析液。用HPLC测试取出的介质中HCQ的浓度并计算累计释放量(n = 3,实验结果取平均值)。累计释放量可以通过下列公式计算得到:
式中:Er为HCQ的累计释放量,%;Ve:介质的置换体积,5 mL;V0:介质的总体积,20mL;Ci:第i次取样时介质中的HCQ浓度,μg/mL;m:Man-PS-HCQ中HCQ的总质量,μg;n:置换介质的次数。
制备的囊泡纳米药物具有非常好的重现性。此外,Man-PS-HCQ不仅在存放1-2月时粒径维持不变,在模拟静脉注射的稀释后(图2 b)、在含有10% FBS的溶液中(图2 c)中仍能保持粒径稳定,显示了较好的胶体稳定性。然而在模拟细胞内还原条件(10 mM GSH)时,囊泡在8小时就出现100-1000 nm的峰(图2 d),Man-PS-HCQ在同一还原条件下,4小时HCQ就释放了70-80%,而在生理条件下,12小时内药物释放量< 15%(图2 e),显示了其在巨噬细胞内快速释放HCQ的可能性。
为了研究纳米药物在炎症部位的降解和药物释放情况,在体外模拟炎症微环境(pH 6.0,3% H2O2 PB溶液)中,将1 mL的PS-HCQ或Man-PS-HCQ(囊泡浓度:1.3 mg/mL,HCQ载药量:12.5 wt.%)加入透析袋中,分别没入20 mL上述模拟炎症溶液中,置于37度空气摇床(200 rpm)中,在设定的时间点(2、4、12、24小时)取出4 mL透析液,再加入4 mL相应的新鲜透析液。透析液用于HPLC测定,并在相应的时间点取出适量纳米药物用DLS测试其粒径变化。
在体外模拟炎症微环境(pH 6.0,含3% H2O2的PB)中,囊泡12 h出现明显的溶胀(图2 f),囊泡在此条件下2 h就能释放出60%左右的HCQ,24 h后释放量可以达到90%以上(图2g)。结合前面囊泡在模拟细胞中还原条件下的药物释放,这些结果证实Man-PS-HCQ可能实现体内的循环稳定性,在炎症部位及细胞中快速释放药物,达到调节炎症微环境的目的。
为了实现纳米药物的长时间保存和长距离运输,使用冻干保护剂制备囊泡的冻干粉,主要研究了冻干剂的种类、配比、及浓度对冻干复溶后的囊泡粒径的影响。典型的例子为:向制备的囊泡溶液中(4 mg/mL, 200 μL)加入质量浓度4.4 wt.%的蔗糖/甘露醇(50:50, w/w),混匀后,置于液氮速冻2 min,然后用冷冻干燥机冻干24 h(压力0.37 mbar,温度-30℃),得到冻干粉制剂保存到-20oC冰箱中。使用前取出恢复到室温后加入800 μL二次水吹打均匀,即可得到1 mg/mL的PS-HCQ或Man-PS-HCQ。Man-PS-HCQ冻干前后的形态观察、粒径由DLS测定。研究发现,最佳冻干保护剂为蔗糖:甘露醇= 50:50(w/w),在水相中浓度为4.4 wt.%,该冻干粉复溶后粒径和新鲜制备的囊泡相比增大了20-30 nm,但PDI保持小于0.2(图2 h, i)。冻干粉的制备不仅使用方便,也为长期保存和运输提供了基础。
实施例三 Man-PS-HCQ在巨噬细胞中的体外抗炎实验
目前HCQ抗炎作用的机理尚不明确。本发明首先研究了Man-PS-HCQ在体外模拟炎症的巨噬细胞中的抗炎效果。脂多糖(LPS)和γ-干扰素(IFN-γ)是最常用的诱导细胞产生氧化应激而产生大量炎症相关细胞因子的试剂,使用它们来刺激两种巨噬细胞RAW 264.7和BMDM来诱导在炎症中起到主要作用的M1M,然后在其中研究HCQ制剂的作用。
向铺在12孔板中RAW 264.7细胞加入LPS(100 ng/mL),再加入PBS、自由HCQ、PS-HCQ或Man-PS-HCQ(10 μg HCQ/mL)孵育24 h,未加LPS刺激细胞为阴性对照(control)。随后,取细胞培养基,以便用相应Elisa试剂盒测试其中促炎细胞因子IL-6、抑炎细胞因子IL-10的浓度,同时提取下层贴壁细胞的RNA,用qRT-PCR测试细胞中IL-6和IL-10 mRNA的表达。向接种于12孔板中(1×106个/孔)的BMDM加入有LPS(100 ng/mL)和IFN-γ(10 ng/mL),再加入PBS、Man-PS、自由HCQ、PS-HCQ、或Man-PS-HCQ(10 μg HCQ/mL)孵育24 h,未刺激细胞为阴性对照(control)。取细胞培养基测试其中IL-6和IL-10的浓度。同时将细胞用刮刀刮下悬浮,加入anti-CD11b、anti-F4/80、anti-CD206抗体来标记巨噬细胞,使用FACS测试巨噬细胞中M1M(CD206-)和M2M(CD206+)的比例,以此表征Man-PS-HCQ的抗炎效果。
结果如图3所示,control组为未刺激的细胞,而PBS组为相应的诱导出来的M1M,可见其中显著提高的促炎细胞因子IL-6。从图3 a、c中可以看出,和自由HCQ和PBS组相比,Man-PS-HCQ能够显著抑制RAW 264.7分泌IL-6,并且降低细胞中IL-6 mRNA的表达量。此外,Man-PS-HCQ也能极大程度地刺激RAW 264.7产生抑炎细胞因子IL-10,显著提高细胞中IL-10 mRNA的表达量(图3 b、d)。自由HCQ对RAW 264.7分泌IL-6、IL-10的情况未见明显影响,PS-HCQ和Man-PS-HCQ对抑制RAW 264.7产生IL-6都展现出了较好的效果,但是Man-PS-HCQ相较而言能够刺激细胞分泌显著增多的IL-10(****p),RAW 264.7的IL-10表达量要更高(*p),这对于缓解炎症至关重要。
此外,在LPS(100 ng/mL)和IFN-γ(10 ng/mL)刺激的小鼠原代细胞BMDM中,分泌的IL-6和IL-10量明显上升。值得注意的是,Man-PS-HCQ同样也能显著抑制BMDM分泌IL-6(**p, ****p),并且促进其分泌IL-10(图3 e, f)。Man-PS-HCQ组IL-10/IL-6的比例要比自由HCQ和PS-HCQ组都高很多(****p, 图3 g),这说明Man-PS-HCQ能提供非常有利的抗炎环境,对于缓解炎症有更强的作用。从图3 e、f中可以看出,空囊泡(Man-PS)对于BMDM分泌IL-6和IL-10基本没有影响,自由HCQ对促进IL-10分泌的作用也很小,这就说明Man-PS-HCQ的抗炎作用主要是由Man-PS、HCQ协同作用所致。HCQ浓度范围内,浓度越大,抗炎能力越强(图3 h);在2.5 μg/mL时对IL-10的分泌基本没有影响,HCQ在5 μg/mL时,IL-10浓度显著提升(*p),而当HCQ浓度为10 μg/mL时Man-PS-HCQ诱导BMDM产生了显著增多的IL-10(***p)。
Man-PS-HCQ对巨噬细胞的复极化作用。众所周知,巨噬细胞可以被分为两种表型,促炎的M1型巨噬细胞(M1M, CD206-)和抑炎的M2型巨噬细胞(M2M, CD206+),而这两种细胞也分别是促炎细胞因子如IL-6和抑炎细胞因子如IL-10的主要来源。从流式细胞仪测定的结果(图4)可以分析得出,和提取出来的BMDM的control组(以CD206+ 的M2M为多)相比,刺激后的PBS组的M2M下降、M1M上升。和PBS组相比,PS-HCQ和Man-PS-HCQ能够降低促炎的M1M(CD206-)的比例,同时M2M(CD206+)的比例由61.8%分别增加到68.0%和72.5%。而空囊泡(Man-PS)对细胞表型变化的作用不大。因此,Man-PS-HCQ能将部分M1M复极化为M2M,这样会提升抑炎的IL-10的分泌、抑制促炎细胞因子的分泌,这也与上文中的结果相符合。
实施例四 Man-PS-HCQ在BMDM中的摄取研究
将三种亚型的BMDM细胞(M0M、M1M和M2M)接种于6孔板中(5×105个/孔),每孔中加入200 μL Cy5标记的囊泡PS-Cy5或Man-PS-Cy5(Cy5浓度为0.2 μg/mL),PBS组为对照。孵育4 h后用细胞刮刀刮取细胞,离心(1000 rpm,3 min),用PBS洗两遍,最后用500 μL PBS分散后加入流式管中,一小时内用流式细胞仪(FACS)测定。M1M和M2M分别通过LPS和IL-4刺激得到。流式细胞仪结果分析显示,M1M和M2M对Man-PS-Cy5的摄取量分别是对PS-Cy5摄取量的1.20倍和1.36倍(图5 a)。看上去Man-PS-Cy5对M2M有着更强的靶向效果,测试了得到的M0M、M1M、M2M上的CD206的表达量,结果显示M2M上CD206的表达量的确要显著高于M0M和M1M(***p,图5 b)。值得注意的是,M1M摄取的Man-PS-Cy5和PS-Cy5均比M2M的摄取量要高3-4倍,显示了M1M的确有更强的内吞能力,这也有利于炎症相关疾病的治疗。
实施例五 Man-PS-HCQ对BMDC活化的抑制情况
将BMDC细胞接种于12孔板中(1×106个/孔)培养过夜,换为含有CpG(0.4 μg/mL)的新鲜培养基,再加入PBS、自由HCQ、PS-HCQ、或Man-PS-HCQ(10 μg HCQ/mL)孵育24 h,不加CpG的细胞作为阴性对照组(Control)。随后,加入anti-CD11c、anti-CD80、anti-CD86、和anti-MHC-II抗体来标记DC表面标志物,使用FACS测试表征Man-PS-HCQ对DC活化的抑制能力。
使用CpG(0.4 μg/mL)来激活BMDC,发现DC激活的两个典型的标志物有了很大提升(图6):CD80+CD86+的BMDC的比例由22.6%(control组)上升到46.5%(PBS组),MHC-II+的BMDC的比例由别25.9%(control组)上升到49.6%(PBS组),表明成功激活了BMDC。从流式细胞仪结果的分析(图6 c)可以看出,HCQ和PS-HCQ明显抑制了BMDC的成熟(**p),而Man-PS-HCQ更显著降低了成熟BMDC的比例,CD80+CD86+的BMDC从46.5%降到了22.8%。此外,APC上表达的MHC-II分子能够呈递抗原肽给CD4+ T细胞识别,从而激活免疫系统。研究结果显示,Man-PS-HCQ能够极大程度地下调激活的BMDC的MHC-II表达量,由49.6%(PBS组)降低到29.2%。可见,Man-PS-HCQ更高的细胞摄取能力有可能通过抑制TLR9通路来抑制DC活化、通过抑制MHC-II的表达来抑制T细胞的免疫应答。
实施例六 Man-PS-HCQ的ROS清除能力研究
向RAW 264.7细胞加入LPS(100 ng/mL),再分别加入PBS、自由HCQ、PS-HCQ、或Man-PS-HCQ孵育24 h,未刺激细胞为阴性对照(Control)。后将培养基换为无血清的培养基,在培养箱中培养30分钟后加入ROS染料2ʹ,7ʹ-二氯荧光素二乙酸酯DCFH-DA(1 mL,20 μM),室温染色10分钟后用PBS洗3遍,用倒置显微镜观察并拍照。BMDM中加入LPS(100 ng/mL)和IFN-γ(10 ng/mL),再分别加入PBS、自由HCQ、PS-HCQ、或Man-PS-HCQ孵育24 h,未刺激细胞为阴性对照(Control)。其余操作与上述RAW 264.7细胞相同。
如图7 a所示,与未刺激组(control)相比,LPS组细胞中DCF绿色荧光显著增强,证实了LPS不仅能促进M1M的分化以及相关促炎细胞因子的分泌,还能刺激RAW 264.7细胞产生大量ROS。而该细胞和自由HCQ、PS-HCQ或Man-PS-HCQ孵育后,其中ROS的含量大幅度降低(****p),Man-PS-HCQ比自由HCQ和PS-HCQ的ROS清除能力还要更强(**p)。在LPS/IFN-γ共刺激激活的BMDM细胞中,自由HCQ和PS-HCQ也能降低ROS的浓度,但是Man-PS-HCQ也展现出了比自由HCQ和PS-HCQ更强的ROS清除能力(图7 b)。
这些结果说明,靶向巨噬细胞递送HCQ能够提高HCQ在细胞质的富集,进而有利于清除ROS,发挥抗炎症作用。RA病变局部产生大量的ROS是造成RA患者软骨损伤的主要原因,过量的ROS能够抑制软骨细胞的增殖,诱导其凋亡,ROS和NO都能提高关节组织内的基质金属蛋白酶(MMP)含量、降低软骨自身修复能力。因此,Man-PS-HCQ的能显著降低炎症部位ROS的能力有可能在动物模型上保护小鼠软骨不受破坏。
实施例七细胞毒性实验
利用两种小鼠巨噬细胞细胞系(RAW 264.7和BMDM)评估了PS-HCQ和Man-PS-HCQ的毒性。将从健康C57BL/6小鼠骨髓中提取的BMDM(5×104个/孔)铺于96孔板中,在1640培养基中培养24 h,然后分别在三种条件下培养:在1640培养基中继续培养24 h,此为M0型巨噬细胞(M0M);在含有IL-4(40 ng/mL)的1640培养基培养24 h后得到M2型巨噬细胞(M2M);在含有LPS(100 ng/mL)和IFN-γ(10 ng/mL)的1640培养基中培养24 h后得到M1型巨噬细胞(M1M)。分别将20μL不同浓度的PS-HCQ或Man-PS-HCQ加入96孔板中孵育24小时,孔内HCQ的最终浓度为5、10μg/mL(PBS为对照)。随后加入10 μL的MTT溶液(5 mg/mL)孵育4小时,吸走培养基,加入150 μL的DMSO溶液,在37°C、100 rpm 摇床中孵育30 min,使得活细胞与MTT生成的蓝紫色结晶甲瓒完全溶解,最后用酶标仪测试570 nm处紫外吸光度值,细胞存活率等于实验组吸光度值与PBS组吸光度值的比值(n = 6)。
将RAW 264.7细胞接种于96孔板中(1×104个/孔),也是同上分别在三种条件下培养,区别在于用LPS(100 ng/mL)细胞刺激为M1M,其余操作同上。
通过MTT法来考察PS-HCQ和Man-PS-HCQ对RAW 264.7细胞和BMDM的细胞毒性。如图8所示,PS-HCQ和Man-PS-HCQ在5-10 μg HCQ/mL及以下时候和两种巨噬细胞孵育24小时无明显毒性。同样的方法考察PS-CQ和Man-PS-CQ对RAW 264.7细胞的毒性,发现较PS-HCQ和Man-PS-HCQ大。
实施例八酵母聚糖诱导的类风湿关节炎(ZIA)小鼠模型的建立和Man-PS-HCQ的生物分布研究
为建立ZIA小鼠模型,向酵母聚糖中按照浓度10 mg/mL加二次水,加热沸腾后继续煮5-10分钟成为乳液状,再超声20分钟即可使用。在C57BL/6小鼠左腿关节腔注射50 μL酵母聚糖乳液,诱导成为急性关节炎,24小时后,可见小鼠膝关节处出现明显肿胀及炎症现象,腿围达到最大值,即建成ZIA小鼠模型可用于实验。为研究甘露糖修饰的囊泡在ZIA小鼠炎症部位的靶向作用,在模型建立24小时后,将小鼠分为两组(每组3只),通过尾静脉注射200 μL的Cy5标记的载药囊泡PS-HCQ-Cy5或Man-PS-HCQ-Cy5(0.3 μg Cy5/只),在预定时间点对小鼠活体成像。纳米药物在ZIA小鼠炎症部位的富集情况对于治疗效果有显著影响,在正常组织的大量累积会导致严重毒副作用。在小鼠左腿关节部位建立了ZIA模型,24小时后待小鼠腿部肿胀程度达到峰值,将Cy5标记的囊泡PS-HCQ或Man-PS-HCQ经尾静脉注射到小鼠体内(1.2 mg HCQ/kg),通过活体荧光成像来观察囊泡在小鼠主要器官及炎症部位的分布随时间的变化。结果显示,Man-PS-HCQ在小鼠左腿RA关节处迅速富集,三只小鼠平均富集量在8 h达到峰值,随后稍微降低(图9 a, b)。观察的48小时内,无靶组PS-HCQ的左腿RA关节处荧光显著要低,Man-PS-HCQ在RA关节的富集是PS-HCQ组的2.4-5.0倍(**p),且滞留时间更长,48 h仍保持高荧光强度。
实施例九 Man-PS-HCQ对ZIA小鼠的疗效
为研究HCQ剂量和甘露糖表面密度的影响,在酵母聚糖诱导后24小时,将小鼠分为8组(每组5只)。通过尾静脉给ZIA小鼠注射200 μL自由HCQ(1.2 mg HCQ/kg)、PS-HCQ(1.2mg HCQ/kg)、10Man-PS-HCQ(0.6 mg HCQ/kg)、10Man-PS-HCQ(1.2 mg HCQ/kg)、10Man-PS-HCQ(2.4 mg HCQ/kg)或是20Man-PS-HCQ(1.2 mg HCQ/kg),每三天给一次药,一共给两次,PBS组和健康组小鼠为对照(图10 a)。开始治疗记为第0天。每天观察关节肿胀、测量左腿的腿围和体重,在第-1、0、1、3和7天取血,测试血浆中的TGF-β的含量。小鼠腿围(legcircum.)的计算公式如下:
公式中:T为小鼠腿的厚度,W为小鼠腿的宽度。
从小鼠左腿肿胀情况(图10 b, c)可以看出,相对于自由HCQ,所有组别HCQ都展现了优异的缓解关节肿胀作用(*p,**p),三个10% Man的Man-PS-HCQ组小鼠患病关节的直径均一直呈现下降趋势,其中的剂量为1.2 mg HCQ/kg组治疗效果最好,和健康组无统计学差异。对小鼠血清中产生的抑炎TGF-β含量进行了监测,结果显示,在健康小鼠体内TGF-β含量较低,在第一针给药4小时后,给药组的TGF-β含量都有所上升。24小时后(即day 1),相较于自由HCQ,10Man-PS-HCQ(1.2 mg HCQ/kg)组的TGF-β含量明显升高(*p)。在给药第二针4小时(即day 3)后,TGF-β分泌比第一针后上升的更多,这说明本发明的纳米药物能在多次给药促进TGF-β的分泌进一步上升,而在day 7,所有组别的 TGF-β分泌均大大下降。体重监测发现,小鼠体重在ZIA建模后24小时由于急性炎症导致出现了明显的下降(图10 d),随着时间的延长体重又恢复到正常范围。所以,可以初步判定,Man密度为10%、HCQ剂量为1.2 mg/kg的Man-PS-HCQ的ZIA疗效最好(图10 e-i),该配方用在接下来的系统的ZIA小鼠治疗研究和免疫分析。
为了更系统深入地研究Man-PS-HCQ对ZIA小鼠炎症消除的优异效果、对关节的软骨和骨的保护情况以及患病关节处的免疫环境的调控,接下来我们增加每组ZIA小鼠到12只(n = 12),尾静脉注射自由HCQ、PS-HCQ、Man-PS-HCQ(1.2 mg HCQ/kg),每三天给药,共给两次(图11 a),PBS组和健康组小鼠作为对照。开始治疗记为第0天。每天观察关节肿胀、测量左腿的腿围和体重,在第0,3,7天取血,测试其中的IL-6及TGF-β含量,以评判疗效。然后,在第七天每组随机取六只小鼠解剖,取患病部位软骨和滑膜,匀浆后,用micro BCA测定研磨液中的蛋白含量,用相应的Elisa试剂盒测定其中的细胞因子(IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β)的含量。此外,每组随机取另外三只小鼠牺牲,取出患病关节软骨,切片用于CD206抗体的标记、H&E、番红固绿以及Trap染色,以评估软骨和滑膜的受损情况。剩余每组三只小鼠继续观察至第三周,解剖取出关节和腿骨,扫micro CT来分析小鼠关节处骨流失情况。
同样发现,第0天ZIA小鼠腿部、膝盖都出现明显红肿,血清中的IL-6含量和健康组相比有显著增加,TGF-β和健康组相差不多,体重有少许下降,之后所有小鼠体重未出现明显减小(图11 a-c)。给予HCQ制剂后,小鼠的腿围和膝盖直径均持续、大幅度下降。自由HCQ展现出一定的抑制促炎性细胞因子的能力,但对于小鼠关节处的红肿症状没有缓解。与之相比,在第6天,Man-PS-HCQ对关节处的红肿有着明显的缓解,显著小于其他组,无肉眼可见的红肿现象,和健康组无显著性差异(图11 a-c)。血清测试发现,在第3、7天HCQ制剂都显著下调了IL-6、上调了TGF-β的分泌,但是Man-PS-HCQ和PS-HCQ组要明显好于自由HCQ。总体看,由于该模型为急性炎症模型,随时间延长到第7天IL-6浓度急剧下降,而TGF-β的下降不多(图11 e, f)。第7天牺牲小鼠,Elisa测试发现,Man-PS-HCQ对研究的血清中三种促炎细胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β均有显著抑制,和健康组无异;而对抑炎细胞因子IL-10和TGF-β的分泌和PS-HCQ相比有更强的促进作用(*p)(图11 g)。
接着,研究了治疗后(第7天)小鼠关节腔内促炎、抑炎细胞因子浓度、免疫微环境的调控,以及软骨和骨关节损伤情况,将分别讨论。首先测定了小鼠关节研磨液中的代表性促炎、抑炎细胞因子占所提取的蛋白质总量的比例,发现其变化趋势以及结论和血清中的相同,即Man-PS-HCQ组小鼠治疗效果最好:对于缓解关节红肿症状、下调促炎细胞因子和上调抑炎细胞因子含量有更明显的效果,与健康组小鼠到达同一水平(图11 h)。这些结果证实了Man-PS-HCQ调控促炎和抑炎细胞因子的平衡,实现了优异的抗炎症作用。
实施例八酵母聚糖诱导的类风湿关节炎(ZIA)小鼠模型的建立和Man-PS-HCQ的生物分布研究
为建立ZIA小鼠模型,向酵母聚糖中按照浓度10 mg/mL加二次水,加热沸腾后继续煮5-10分钟成为乳液状,再超声20分钟即可使用。在C57BL/6小鼠左腿关节腔注射50 μL酵母聚糖乳液,诱导成为急性关节炎,24小时后,可见小鼠膝关节处出现明显肿胀及炎症现象,腿围达到最大值,即建成ZIA小鼠模型可用于实验。为研究甘露糖修饰的囊泡在ZIA小鼠炎症部位的靶向作用,在模型建立24小时后,将小鼠分为两组(每组3只),通过尾静脉注射200 μL的Cy5标记的载药囊泡PS-HCQ-Cy5或Man-PS-HCQ-Cy5(0.3 μg Cy5/只),在预定时间点对小鼠活体成像。纳米药物在ZIA小鼠炎症部位的富集情况对于治疗效果有显著影响,在正常组织的大量累积会导致严重毒副作用。在小鼠左腿关节部位建立了ZIA模型,24小时后待小鼠腿部肿胀程度达到峰值,将Cy5标记的囊泡PS-HCQ或Man-PS-HCQ经尾静脉注射到小鼠体内(1.2 mg HCQ/kg),通过活体荧光成像来观察囊泡在小鼠主要器官及炎症部位的分布随时间的变化。结果显示,Man-PS-HCQ在小鼠左腿RA关节处迅速富集,三只小鼠平均富集量在8 h达到峰值,随后稍微降低(图9 a, b)。观察的48小时内,无靶组PS-HCQ的左腿RA关节处荧光显著要低,Man-PS-HCQ在RA关节的富集是PS-HCQ组的2.4-5.0倍(**p),且滞留时间更长,48 h仍保持高荧光强度。
实施例九 Man-PS-HCQ对ZIA小鼠的疗效
为研究HCQ剂量和甘露糖表面密度的影响,在酵母聚糖诱导后24小时,将小鼠分为8组(每组5只)。通过尾静脉给ZIA小鼠注射200 μL自由HCQ(1.2 mg HCQ/kg)、PS-HCQ(1.2mg HCQ/kg)、10Man-PS-HCQ(0.6 mg HCQ/kg)、10Man-PS-HCQ(1.2 mg HCQ/kg)、10Man-PS-HCQ(2.4 mg HCQ/kg)或是20Man-PS-HCQ(1.2 mg HCQ/kg),每三天给一次药,一共给两次,PBS组和健康组小鼠为对照(图10 a)。开始治疗记为第0天。每天观察关节肿胀、测量左腿的腿围和体重,在第-1、0、1、3和7天取血,测试血浆中的TGF-β的含量。小鼠腿围(legcircum.)的计算公式如下:
公式中:T为小鼠腿的厚度,W为小鼠腿的宽度。
从小鼠左腿肿胀情况(图10 b, c)可以看出,相对于自由HCQ,所有组别HCQ都展现了优异的缓解关节肿胀作用(*p,**p),三个10% Man的Man-PS-HCQ组小鼠患病关节的直径均一直呈现下降趋势,其中的剂量为1.2 mg HCQ/kg组治疗效果最好,和健康组无统计学差异。对小鼠血清中产生的抑炎TGF-β含量进行了监测,结果显示,在健康小鼠体内TGF-β含量较低,在第一针给药4小时后,给药组的TGF-β含量都有所上升。24小时后(即day 1),相较于自由HCQ,10Man-PS-HCQ(1.2 mg HCQ/kg)组的TGF-β含量明显升高(*p)。在给药第二针4小时(即day 3)后,TGF-β分泌比第一针后上升的更多,这说明本发明的纳米药物能在多次给药促进TGF-β的分泌进一步上升,而在day 7,所有组别的 TGF-β分泌均大大下降。体重监测发现,小鼠体重在ZIA建模后24小时由于急性炎症导致出现了明显的下降(图10 d),随着时间的延长体重又恢复到正常范围。所以,可以初步判定,Man密度为10%、HCQ剂量为1.2 mg/kg的Man-PS-HCQ的ZIA疗效最好(图10 e-i),该配方用在接下来的系统的ZIA小鼠治疗研究和免疫分析。
为了更系统深入地研究Man-PS-HCQ对ZIA小鼠炎症消除的优异效果、对关节的软骨和骨的保护情况以及患病关节处的免疫环境的调控,接下来我们增加每组ZIA小鼠到12只(n = 12),尾静脉注射自由HCQ、PS-HCQ、Man-PS-HCQ(1.2 mg HCQ/kg),每三天给药,共给两次(图11 a),PBS组和健康组小鼠作为对照。开始治疗记为第0天。每天观察关节肿胀、测量左腿的腿围和体重,在第0,3,7天取血,测试其中的IL-6及TGF-β含量,以评判疗效。然后,在第七天每组随机取六只小鼠解剖,取患病部位软骨和滑膜,匀浆后,用micro BCA测定研磨液中的蛋白含量,用相应的Elisa试剂盒测定其中的细胞因子(IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β)的含量。此外,每组随机取另外三只小鼠牺牲,取出患病关节软骨,切片用于CD206抗体的标记、H&E、番红固绿以及Trap染色,以评估软骨和滑膜的受损情况。剩余每组三只小鼠继续观察至第三周,解剖取出关节和腿骨,扫micro CT来分析小鼠关节处骨流失情况。
同样发现,第0天ZIA小鼠腿部、膝盖都出现明显红肿,血清中的IL-6含量和健康组相比有显著增加,TGF-β和健康组相差不多,体重有少许下降,之后所有小鼠体重未出现明显减小(图11 a-c)。给予HCQ制剂后,小鼠的腿围和膝盖直径均持续、大幅度下降。自由HCQ展现出一定的抑制促炎性细胞因子的能力,但对于小鼠关节处的红肿症状没有缓解。与之相比,在第6天,Man-PS-HCQ对关节处的红肿有着明显的缓解,显著小于其他组,无肉眼可见的红肿现象,和健康组无显著性差异(图11 a-c)。血清测试发现,在第3、7天HCQ制剂都显著下调了IL-6、上调了TGF-β的分泌,但是Man-PS-HCQ和PS-HCQ组要明显好于自由HCQ。总体看,由于该模型为急性炎症模型,随时间延长到第7天IL-6浓度急剧下降,而TGF-β的下降不多(图11 e, f)。第7天牺牲小鼠,Elisa测试发现,Man-PS-HCQ对研究的血清中三种促炎细胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β均有显著抑制,和健康组无异;而对抑炎细胞因子IL-10和TGF-β的分泌和PS-HCQ相比有更强的促进作用(*p)(图11 g)。
接着,研究了治疗后(第7天)小鼠关节腔内促炎、抑炎细胞因子浓度、免疫微环境的调控,以及软骨和骨关节损伤情况,将分别讨论。首先测定了小鼠关节研磨液中的代表性促炎、抑炎细胞因子占所提取的蛋白质总量的比例,发现其变化趋势以及结论和血清中的相同,即Man-PS-HCQ组小鼠治疗效果最好:对于缓解关节红肿症状、下调促炎细胞因子和上调抑炎细胞因子含量有更明显的效果,与健康组小鼠到达同一水平(图11 h)。这些结果证实了Man-PS-HCQ调控促炎和抑炎细胞因子的平衡,实现了优异的抗炎症作用。
实施例十 Man-PS-HCQ对ZIA小鼠关节软骨和骨组织的保护
RA的主要症状除了关节肿胀疼痛,还有严重的软骨损伤和骨流失现象。根据图11的治疗方案,制备小鼠关节处的切片,通过H&E、番红固绿、Trap染色,来研究分析不同HCQ制剂治疗的小鼠关节处的软骨损伤、骨流失、免疫细胞浸润以及破骨细胞含量等情况。H&E和番红固绿(SO-FG)染色图片结果显示,PBS、自由HCQ和PS-HCQ组小鼠关节有明显的滑膜炎症和软骨缺损(黑色箭头),H&E图片可以看出PBS组小鼠滑膜部位存在大量免疫细胞,出现新生血管(红色箭头),自由HCQ和PS-HCQ组治疗对此有一定的缓解,而Man-PS-HCQ组小鼠关节处的免疫细胞浸润、新生血管生成及软骨损伤情况明显减少,关节处的软骨形态和健康组小鼠相似。据文献报道新生血管的生成对关节炎中血管翳的维持具有重要作用,且新生血管有利于免疫细胞的募集,能对关节组织造成持续损伤。Trap染色结果显示与健康组小鼠相比,PBS、自由HCQ和PS-HCQ组小鼠关节有大量破骨细胞(三角形),而Man-PS-HCQ治疗的小鼠关节处的破骨细胞数量较少,接近健康组小鼠(图12)。此外,经过如图11所示的两次给药的小鼠,第7天牺牲后,取主要脏器切片和H&E染色分析以评估毒副作用。结果显示,Man-PS-HCQ与健康组小鼠的心、肝、脾、肺、肾均未出现明显差异,对小鼠无严重副作用(图13)。
小鼠关节切片M2M标志物CD206的免疫荧光染色发现(图14),和健康小鼠相比,PBS组和自由HCQ组小鼠关节处的绿色荧光较弱,说明抑炎M2M含量明显要少,这可能是ZIA小鼠患病关节释放了大量细胞因子和趋化因子,募集了大量M1M浸润造成的。PS-HCQ组关节的M2M相对前两组有很大增加(****p),而Man-PS-HCQ组则进一步显著提升关节处M2M的含量(****p),达到最高,体现了其显著的体内靶向巨噬细胞效果。更多的M2M被募集到小鼠患病关节,有利于释放出更多的抗炎细胞因子(如IL-10和TGF-β),调节患病关节处的炎症微环境。
为了进一步揭示Man-PS-HCQ在ZIA小鼠中发挥抗炎症的机理,研磨关节混合物得到白细胞,测试了小鼠关节处的免疫微环境,分析了Man-PS-HCQ对免疫微环境的调控。小鼠关节研磨液中的细胞分别用下列抗体染色:anti-CD11b、anti-F4/80、anti-CD206、anti-CD11c、anti-CD80、anti-CD86、anti-CD3、anti-CD4或anti-CD8。结果显示,建立ZIA模型后(PBS组),小鼠关节处的CD11b+F4/80+巨噬细胞、CD11c+ DC以及CD3+ T细胞的比例和健康组小鼠相比都出现了明显增加(图15)。值得注意的是,小鼠关节处巨噬细胞的比例能达到所有细胞的约30.4%,要比远远高于DC(约7.2%)和T细胞(约4.5%)的含量,这也证实了巨噬细胞的确是在RA中起到主导作用的免疫细胞。和健康组小鼠相比,Man-PS-HCQ治疗的关节处巨噬细胞总含量明显增加(*p),且CD206+的M2M比例也显著进一步增加(**p),是Man-PS-HCQ将促炎的M1M复极化为抑炎的M2M,因此小鼠体内抗炎的IL-10和TGF-β分泌量都显著增加,M1M的减少也使得促炎的细胞因子相应降低。此外,ZIA小鼠RA关节处的CD11c+ DC和CD3+T细胞浸润呈现增多现象,Man-PS-HCQ治疗能很大程度地减少它们在关节的浸润(*p),尤其是成熟DC(CD11c+CD80+CD86+)和CD3+CD4+ T细胞的比例显著减少,Man-PS-HCQ大大下调成熟DC和T细胞的浸润,就能减少MHC-II表达及相关抗原的呈递,进而减少促炎细胞因子的分泌,有助于缓解RA症状。检测发现,RA关节处CD3+CD8+ T细胞在治疗前后含量都很低、且基本不变,说明该细胞在RA中作用很小。
针对类风湿关节炎RA,本发明以HCQ为例设计了还原响应性聚合物囊泡装载HCQ用于小鼠RA的靶向治疗。具有代表性的Man-PS-HCQ制备简单、表面Man密度可调、尺寸小而均匀(~46 nm)、稳定性高、还原响应性强。Man-PS-HCQ尺寸小易于在炎症部位富集,在巨噬细胞中有靶向性的摄取,加之其还原响应性的药物释放,可增加炎症部位的有效药物浓度,增强抗炎效果,减少毒副作用。细胞实验显示,Man-PS-HCQ可调节巨噬细胞的细胞因子的分泌,清除ROS,表现出优异的抗炎效果。ZIA小鼠体内实验显示,Man-PS-HCQ在RA关节处快速富集,能减少小鼠血清及关节滑液中促炎细胞因子的分泌、增加抑炎细胞因子的分泌;其能增加关节处的M1M复极化为抑炎的M2M,减少活化的DC和T细胞的数目。所以,Man-PS-HCQ显著消除了患病关节的肿胀,减少了炎症细胞的浸润,降低破骨细胞的数量,保护关节滑膜、软骨和骨组织,显示了优异的抗炎、调节免疫微环境的效果。因此,这种生物可降解的纳米药物为RA的安全高效治疗提供了一种途径。
本发明所有的数据均为平均值±标准偏差(SD)。组间的差异采用ANOVA单因素方差分析来进行评估,*p < 0.05表示有显著性差异,**p < 0.01和***p < 0.001表示有高度显著性差异。
Claims (10)
1.一种载氯喹化合物的囊泡纳米药物,其特征在于,包括聚合物囊泡以及氯喹化合物;聚合物包括亲水链段、疏水链段,所述疏水链段的侧链为含双硫键的二硫戊环。
2.根据权利要求1所述载氯喹化合物的囊泡纳米药物,其特征在于,聚合物自组装形成聚合物囊泡;聚合物为非靶向聚合物,或者聚合物为非靶向聚合物与靶向聚合物的混合物;所述氯喹化合物为抗自身免疫性疾病药物。
3.根据权利要求2所述载氯喹化合物的囊泡纳米药物,其特征在于,非靶向聚合物包括PEG-P(TMC-DTC)、PEG-P(CL-DTC)或者PEG-P(LA-DTC);靶向聚合物包括B-PEG-P(TMC-DTC)、B-PEG-P(CL-DTC)或者B-PEG-P(LA-DTC),B为靶向分子。
4.根据权利要求1所述载氯喹化合物的囊泡纳米药物,其特征在于,聚合物的分子量为10~50 kg/mol。
5.根据权利要求4所述载氯喹化合物的囊泡纳米药物,其特征在于,亲水链段的分子量为2~10 kg/mol。
6.权利要求1所述载氯喹化合物的囊泡纳米药物的制备方法,其特征在于,以聚合物、氯喹化合物为原料,制备载氯喹化合物的囊泡纳米药物。
7.根据权利要求6所述载氯喹化合物的囊泡纳米药物的制备方法,其特征在于,聚合物为非靶向聚合物,或者聚合物为非靶向聚合物与靶向聚合物的混合物;采用pH梯度法将氯喹化合物装载入囊泡,得到载氯喹化合物的囊泡纳米药物。
8.根据权利要求7所述载氯喹化合物的囊泡纳米药物的制备方法,其特征在于,聚合物为非靶向聚合物与靶向聚合物的混合物时,非靶向聚合物与靶向聚合物的摩尔比为1∶(0~0.8),不包括0。
9.一种载氯喹化合物的囊泡纳米药物冻干粉,其制备方法为,将权利要求1所述载氯喹化合物的囊泡纳米药物与冻干保护剂混合后冷冻干燥,得到载氯喹化合物的囊泡纳米药物冻干粉。
10.权利要求1所述载氯喹化合物的囊泡纳米药物在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用或者在制备复极化M1M巨噬细胞为M2M巨噬细胞的药物中的应用或者在制备清除ROS的药物中的应用或者在制备抑制BMDC活化的药物中的应用或者在制备保护关节软骨和骨组织的药物中的应用或者在制备抗炎药物中的应用或者在制备抗自身免疫性疾病药物中的应用。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110877728.2A CN113679670B (zh) | 2021-08-01 | 2021-08-01 | 一种载氯喹化合物的囊泡纳米药物及其制备方法与应用 |
PCT/CN2022/108288 WO2023011287A1 (zh) | 2021-08-01 | 2022-07-27 | 一种载氯喹化合物的囊泡纳米药物及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110877728.2A CN113679670B (zh) | 2021-08-01 | 2021-08-01 | 一种载氯喹化合物的囊泡纳米药物及其制备方法与应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113679670A true CN113679670A (zh) | 2021-11-23 |
CN113679670B CN113679670B (zh) | 2023-05-02 |
Family
ID=78578529
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110877728.2A Active CN113679670B (zh) | 2021-08-01 | 2021-08-01 | 一种载氯喹化合物的囊泡纳米药物及其制备方法与应用 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113679670B (zh) |
WO (1) | WO2023011287A1 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114796126A (zh) * | 2022-04-02 | 2022-07-29 | 复旦大学附属中山医院青浦分院(上海市青浦区中心医院) | 关节腔注射用硫酸羟氯喹缓释微球及其制备方法 |
WO2023011287A1 (zh) * | 2021-08-01 | 2023-02-09 | 苏州大学 | 一种载氯喹化合物的囊泡纳米药物及其制备方法与应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110694076A (zh) * | 2019-09-09 | 2020-01-17 | 浙江大学 | 一种羟基氯喹两亲性聚合物药物前体、制备方法及其应用 |
US20200078300A1 (en) * | 2018-09-12 | 2020-03-12 | University Of Maryland, Baltimore County | Self-assembled particles for targeted delivery of immunomudulators to treat autoimmunity and cancer |
CN111973556A (zh) * | 2020-08-20 | 2020-11-24 | 苏州大学 | 载小分子药聚合物囊泡及其制备方法与应用 |
CN113197860A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-08-03 | 苏州大学 | 聚合物囊泡纳米sting激动剂及其制备方法与应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105997880B (zh) * | 2016-07-15 | 2019-04-05 | 苏州大学 | 一种基于交联生物可降解聚合物囊泡的抗肿瘤纳米药物及其制备方法 |
CN107281141B (zh) * | 2017-06-26 | 2021-03-02 | 苏州大学 | 生物可降解交联纳米药物冻干粉的制备方法 |
CN107998082B (zh) * | 2017-12-13 | 2020-07-21 | 苏州大学 | 囊泡纳米药物在制备脑肿瘤治疗药物中的应用 |
CN113679670B (zh) * | 2021-08-01 | 2023-05-02 | 苏州大学 | 一种载氯喹化合物的囊泡纳米药物及其制备方法与应用 |
-
2021
- 2021-08-01 CN CN202110877728.2A patent/CN113679670B/zh active Active
-
2022
- 2022-07-27 WO PCT/CN2022/108288 patent/WO2023011287A1/zh unknown
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20200078300A1 (en) * | 2018-09-12 | 2020-03-12 | University Of Maryland, Baltimore County | Self-assembled particles for targeted delivery of immunomudulators to treat autoimmunity and cancer |
CN110694076A (zh) * | 2019-09-09 | 2020-01-17 | 浙江大学 | 一种羟基氯喹两亲性聚合物药物前体、制备方法及其应用 |
CN111973556A (zh) * | 2020-08-20 | 2020-11-24 | 苏州大学 | 载小分子药聚合物囊泡及其制备方法与应用 |
CN113197860A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-08-03 | 苏州大学 | 聚合物囊泡纳米sting激动剂及其制备方法与应用 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023011287A1 (zh) * | 2021-08-01 | 2023-02-09 | 苏州大学 | 一种载氯喹化合物的囊泡纳米药物及其制备方法与应用 |
CN114796126A (zh) * | 2022-04-02 | 2022-07-29 | 复旦大学附属中山医院青浦分院(上海市青浦区中心医院) | 关节腔注射用硫酸羟氯喹缓释微球及其制备方法 |
CN114796126B (zh) * | 2022-04-02 | 2023-04-18 | 复旦大学附属中山医院青浦分院(上海市青浦区中心医院) | 关节腔注射用硫酸羟氯喹缓释微球及其制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2023011287A1 (zh) | 2023-02-09 |
CN113679670B (zh) | 2023-05-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Zhu et al. | Chitosan-based nanoparticle co-delivery of docetaxel and curcumin ameliorates anti-tumor chemoimmunotherapy in lung cancer | |
Gu et al. | Nanotechnology-mediated immunochemotherapy combined with docetaxel and PD-L1 antibody increase therapeutic effects and decrease systemic toxicity | |
Wang et al. | Combinational protective therapy for spinal cord injury medicated by sialic acid-driven and polyethylene glycol based micelles | |
Kim et al. | Doxorubicin/gold-loaded core/shell nanoparticles for combination therapy to treat cancer through the enhanced tumor targeting | |
Mao et al. | A biomimetic nanocomposite made of a ginger-derived exosome and an inorganic framework for high-performance delivery of oral antibodies | |
Wang et al. | Ultrasound-targeted microbubble destruction augmented synergistic therapy of rheumatoid arthritis via targeted liposomes | |
CN113679670B (zh) | 一种载氯喹化合物的囊泡纳米药物及其制备方法与应用 | |
CN110623925B (zh) | 一种雷帕霉素纳米缓释剂及其制备方法 | |
US11938186B2 (en) | Thermosensitive hydrogel for cancer therapeutics and methods of preparation thereof | |
Luo et al. | Charge convertible biomimetic micellar nanoparticles for enhanced melanoma-targeted therapy through tumor cells and tumor-associated macrophages dual chemotherapy with IDO immunotherapy | |
Chou et al. | Glycosylation of OVA antigen-loaded PLGA nanoparticles enhances DC-targeting for cancer vaccination | |
WO2022253342A1 (zh) | 一种小胶束纳米药物及其制备方法与应用 | |
Fu et al. | Combination of oxaliplatin and POM-1 by nanoliposomes to reprogram the tumor immune microenvironment | |
CN111617036A (zh) | 一种靶向控释抗关节炎药物制剂及其制备方法 | |
CN114042147B (zh) | 靶向调控线粒体呼吸链的微纳水凝胶微球及其制备与应用 | |
CN107126425A (zh) | 一种丹参酮iiapeg‑plga‑peg纳米粒及其制备方法 | |
Wang et al. | “Layer peeling” co-delivery system for enhanced RNA interference-based tumor associated macrophages-specific chemoimmunotherapy | |
CN113197860A (zh) | 聚合物囊泡纳米sting激动剂及其制备方法与应用 | |
CN114469953B (zh) | 一种具有协同作用的抗肿瘤药物组合物、纳米制剂及其制备方法和应用 | |
CN115957348A (zh) | 靶向类风湿性关节炎脂质体递药系统、制备方法及应用 | |
CN107669637B (zh) | 一种注射用蒿甲醚脂质体及其制备方法和应用 | |
Li et al. | ROS-responsive EPO nanoparticles ameliorate ionizing radiation-induced hematopoietic injury | |
CN115845059A (zh) | 一种基于聚氨基酸的小分子抑制剂纳米粒及其制备方法与应用 | |
Xia et al. | Microneedles loaded with cerium-manganese oxide nanoparticles for targeting macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis | |
Sun et al. | DOX-encapsulated intelligent PAA-g-PEG/PEG–Fa polymeric micelles for intensifying antitumor therapeutic effect via active-targeted tumor accumulation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |