JP7017011B2 - マイコバクテリウムパラゴルドネの抗癌免疫治療法用途 - Google Patents
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Description
本発明は、マイコバクテリウムパラゴルドネ（Ｍ．paragordonae）による抗癌調節反応と免疫療法とに関する。
悪性腫瘍である癌は、感染性疾患とは異なるように、特定地域に限って発病するのではなく、全世界的に発病している。ＷＨＯ報告によれば、全世界的に、２０１２年１年間に、約１千４百万人の患者が新たに癌と診断されし、約３，３００百万人の患者が癌で苦しんでおち、その年、８２０万人の患者が癌で死亡した。韓国の場合、２０１１年報告によれば、約２２万名の患者が癌と診断され、１１０万人余りが既存にいた癌患者と調査された。それだけではなく、７万２千人の患者が癌で死亡し、疾病による死亡率１位を占めるとで確認された。
癌治療のために、一次的に、外科的切開術が要求されるが、癌の大きさ及び転移程度により、外科的手術が制限されるという限界点がある。現在最も多く使用されている抗癌治療のうち一つである化学療法は、特定治療剤が特定癌にだけ適用可能であるために、１００種余りを超える多様な癌に対する治療剤開発が必要であるという限界点がある。それだけではなく、癌細胞の起源は、正常な細胞であるために、化学療法を適用する場合、正常細胞にも作用し、多様な副作用がもたらされている。他の抗癌治療として使用されている放射線治療法は、多様な癌に対して適用可能であるという長所があるにもかかわらず、化学療法と同様に、深刻な副作用をもたらすと知られている。癌の場合、主に、高齢の患者で発病することを考慮するとき、前述のような療法による副作用は、患者に相当な負担であり、治療を介した生命延長と、生の質向上とが比例しないようである。従って、多様な癌に適用可能であり、副作用が少ない腫瘍免疫療法が大きい関心を集めている。
腫瘍免疫療法は、１８９１年Coleyにより、細菌感染が、癌患者の一時的な病気快方を誘導するという発見から始まり、１９６０年代は、ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis ＢＣＧ）（以下、ＢＣＧ）が一部癌を除去することを確認した。非結核抗酸菌は、複雑な細胞壁構成成分により、免疫誘導能にすぐれると知られておち、多種の癌に対する治療剤開発研究に使用されている（表１）。特に、１９９０年代、ＢＣＧは、膀胱癌に対する腫瘍免疫治療剤として適するというＦＤＡ承認を受け、現在まで使用されており、ＢＣＧを治療剤として使用する場合、再発率を４０％以上低下させると報告された。しかし、ＢＣＧ治療剤は、初期の膀胱癌治療にだけ効果的であり、相当なレベルの副作用が報告された。それだけではなく、治療を受けた膀胱癌患者の９０％が膀胱炎症状を示し、４％の患者から高熱が観察され、まれには、感染による肉芽腫が誘導されもした。肺癌や肝臓癌に対する治療剤として使用する場合には、４０℃の高熱、及び肝臓機能障害のような深刻な副作用発生が報告されたりした。
それにより、癌治療のための新たな免疫治療剤の開発が必要な実情である。
一様相は、抗癌免疫療法に基づくマイコバクテリウムパラゴルドネ（Ｍ．paragordonae）及びその用途を提供することである。
他の様相は、マイコバクテリウムパラゴルドネ、その溶解物または培養液を有効成分として含む癌の予防用または治療用の薬学的組成物を提供することである。
さらに他の様相は、マイコバクテリウムパラゴルドネ、その溶解物または培養液を有効成分として含む癌の免疫治療用ワクチン組成物を提供することである。
さらに他の様相は、マイコバクテリウムパラゴルドネ、その溶解物または培養液を有効成分として含む免疫調節のための健康機能食品組成物を提供することである。
一様相によるマイコバクテリウムパラゴルドネは、癌細胞に対する細胞毒性だけではなく、ナチュラルキラー細胞媒介またはＴ細胞媒介の癌細胞毒性を有し、大食細胞または樹状細胞の癌細胞毒性調節Ｔ細胞の活性化を抑制することによって免疫反応を誘導し、腫瘍形成を抑制し、免疫抗癌剤として有用に使用されるという効果がある。
一様相は、抗癌免疫療法に基づくマイコバクテリウムパラゴルドネ（Ｍ．paragordonae）及びその用途を提供する。
他の様相は、マイコバクテリウムパラゴルドネ（Mycobacterium paragordonae）、その溶解物または培養液を有効成分として含む癌の予防用または治療用の薬学的組成物を提供する。
さらに他の様相は、マイコバクテリウムパラゴルドネ、その溶解物または培養液を有効成分として含む癌の免疫治療用ワクチン組成物を提供する。
さらに他の様相は、薬剤学的有効量のマイコバクテリウムパラゴルドネ、その溶解物または培養液を個体に投与する段階を含む癌を予防または治療する方法を提供する。
さらに他の様相は、薬剤学的有効量のマイコバクテリウムパラゴルドネ、その溶解物または培養液を個体に投与する段階を含む個体の免疫調節する方法を提供する。
さらに他の様相は、癌を治療するための薬学的製剤の製造のためのマイコバクテリウムパラゴルドネ、その溶解物または培養液の用途を提供する。
本明細書において用語「治療（treat）」は、自然治癒に比べて短縮された時間に癌が治癒されることを意味する。前記治療は、癌の予防、改善及び／または緩和を含む。また、前記治療は、癌と係わる疾患の治療をいずれも含むものでもある。
本明細書において用語「薬剤学的有効量」または「有効成分」は、疾患、障害または病態、またはその１以上の症状の軽減、進行抑制または予防に十分な本願で提供される発明を実施する過程で利用される組成物の任意量を意味する。
本明細書で用語「投与する」、「塗布する」、「導入する」及び「移植する」は、相互交換的に使用され、一具体例による組成物の所望する部位への少なくとも部分的局所化をもたらす方法または経路による個体内への一具体例による組成物の配置を意味する。
本明細書において用語「抗癌」という用語は、癌の予防、治療、症状の軽減及び緩和などをいずれも包括する意味であり、前記「癌」という用語は、非制限的には、固形癌と血液癌とを含む。本明細書は、多様な類型の癌、例えば、非制限的には、頭、首、目、口、喉、食道、胸、骨、肺、結腸、直腸、胃、前立腺、乳房、卵巣、腎臓、肝臓膵臓及び脳の癌の治療を含む。「癌」という用語は、異なって示さない限り、一次及び転移性の癌を追加して含む。前記癌の例示は、肺癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、大腸癌、脳癌、乳癌、甲状腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、卵巣癌、黒色腫、頭頸部癌、皮膚癌、前立腺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝細胞癌または子宮頸部癌を含む。
本明細書において用語「溶解物」は、前記マイコバクテリウムパラゴルド内に含まれた細胞内生物学的構成成分、例えば、細胞壁または膜またはバクテリアＤＮＡなどの構成成分、及び前記マイコバクテリウムパラゴルドネが、培養中に細胞外に放出した代謝産物が含有された培養物のような有用成分の破砕物を含むことを意味する。前記溶解物は、滅菌（例えば、湿熱を利用した滅菌）、照射（irradiation）、圧力または超音波破砕によっても製造される。
一具体例において、前記マイコバクテリウムパラゴルドネは、生菌（生きている菌）や死菌（死んでいる菌）でもある。さらに詳細には、前記死菌は、熱処理による死菌でもある。前記熱処理されたマイコバクテリウムは、非病原性または非活性化されたマイコバクテリウムパラゴルドネでもある。
他の具体例において、前記マイコバクテリウムパラゴルドネは、２０１４年７月１７日付でブダペスト条約に基づいて受託番号ＫＣＴＣ １２６２８ＢＰとして韓国生命工学研究院（Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｌｏｇｙ （ＫＲＩＢＢ））の遺伝子銀行（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に国際寄託されたマイコバクテリウムパラゴルドの菌株でもある。
さらに他の具体例において、前記マイコバクテリウムパラゴルドネ、その溶解物または培養液は、抗癌剤と併用投与されるものでもある。本明細書において用語「併用投与」は、「共に」または「同時に」同日に投与されるか、あるいは「順次に」または「別途に」であるならば、互いに異なる日に投与されることを意味する。「同時」投与は、本願で定義されたところにより、約２時間以内または約１時間未満の期間内に、投与または遂行することを含む。「別途」投与は、本願で定義されたところにより、約１２時間以上、約８時間以上、約６時間以上、約４時間以上または約２時間以上の間隔を置き、投与または遂行することを含む。「順次」投与は、本願で定義されたところにより、マイコバクテリウムパラゴルドネと抗癌剤とを、それぞれ複数の分液及び／または用量及び／または別途の時期に投与することを含む。前記抗癌剤の例は、白金系アルキル化抗癌剤を含んでもよい。詳細には、前記白金系アルキル化抗癌剤は、シスプラチン（cisplatin）、カルボプラチン（carboplatin）、オルマプラチン、オキサリプラチン（oxaliplatin）、ドキソルビシン、ゼニプラチン、エンロプラチン、ロバプラチン、スピロプラチン、テトラプラチン、オルミプラチン及びイプロプラチンからなる群のうちから選択された１種以上のものでもある。
特定理論に制限されることなしに、一具体例によるマイコバクテリウムパラゴルドネは、細胞死滅を抑制する因子（例えば、Ｂｃｌ－２）の発現または活性を抑制するか、あるいは細胞毒性因子（例えば、パーフォリン及びグランザイム）の発現または活性を増大させるものでもある。
また、特定理論に制限されることなしに、一具体例によるマイコバクテリウムパラゴルドネは、免疫細胞の腫瘍組織内浸透を誘導するものでもある。さらに詳細には、マイコバクテリウムパラゴルドネは、免疫サイトカインを調節するものでもある。例えば、マイコバクテリウムパラゴルドネは、ＩＬ（interleukin）－１０の発現または活性を抑制するか、あるいはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２またはＩＬ－１２の発現または活性を増大させるものでもある。
また、特定理論に制限されることなしに、一具体例によるマイコバクテリウムパラゴルドネは、ナチュラルキラー細胞（natural killer cell）媒介またはＴ細胞媒介の癌細胞毒性を有するものであるか、あるいはナチュラルキラー細胞、大食細胞または樹状細胞の癌細胞毒性を増大させるか、あるいは体液免疫反応を誘導するものでもある。
一具体例において、マイコバクテリウムパラゴルドネは、前述の効果を有することにより、癌細胞自体に対する細胞毒性だけではなく、免疫反応を誘導することにより、癌の免疫治療用薬学的組成物またはワクチン組成物にも有用に使用される。
前記薬学的組成物またはワクチン組成物は、薬学的に許容可能な担体及び／または添加物を含んでもよい。例えば、滅菌水、生理食塩水、慣用緩衝剤（リン酸、クエン酸、それ以外の有機酸）、安定剤、塩、酸化防止剤（アスコルビン酸など）、界面活性剤、懸濁液剤、等張化剤または保存剤などを含んでもよい。局所投与のために、生体高分子（biopolymer）などの有機物、ハイドロキシアパタイトなどの無機物、具体的には、コラーゲンマトリックス、ポリ乳酸の重合体または共重合体、ポリエチレングリコールの重合体または共重合体、及びその化学的誘導体などと組み合わせるものも含んでもよい。
一具体例による薬学的組成物は、その投与方法や剤形により、必要な場合、懸濁液剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整、無痛化剤、緩衝剤、還元剤、酸化防止剤などを適切に含んでもよい。前述のところに例示されたものを含め、本発明に適する薬学的に許容される担体及び製剤は、文献［Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995］に詳細に記載されている。一具体例による薬学的組成物は、当該発明が属する技術分野において当業者であるならば、容易に実施することができる方法により、薬学的に許容される担体及び／または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位用量形態に製造されるか、あるいは多用量容器内に内入させても製造される。このとき、剤形は、オイル媒質内または水性媒質内の溶液、懸濁液形態または乳化液形態であるか、あるいは粉末、顆粒、錠剤またはカプセルの形態でもある。
前記組成物は、経口または非経口の投与剤形にも剤形化される。該経口投与剤形は、顆粒剤、散剤、液剤、錠剤、カプセル剤、乾燥シロップ剤、またはその組み合わせでもある。該非経口投与剤形は、注射剤または皮膚外用剤でもある。該皮膚外用剤は、クリーム、ゲル、軟膏、皮膚乳化剤、皮膚懸濁液、経皮伝達性パッチ、薬物含有包帯、ローション、またはその組み合わせでもある。前記皮膚外用剤は、通常化粧品であるが、医薬品、医薬外品などの皮膚外用剤に使用される成分、例えば、水性成分、油性成分、粉末成分、アルコール類、保湿剤、増粘剤、紫外線吸収剤、美白剤、防腐剤、酸化防止剤、界面活性剤、香料、色剤、各種皮膚栄養剤、またはそれらの組み合わせと、必要によっては、適切に配合される。前記皮膚外用剤は、エデト酸二ナトリュム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸などの金属封鎖剤；カフェイン、タンニン、ベルラパミル、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬；酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸、トラネキサム酸、及びその誘導体またはその塩などの薬剤；ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸、グルコース、フラクトース、トレハルロースなどの糖類も適切に配合することができる。
また、前記ワクチン組成物は、アジュバント、特に、Ｔ細胞媒介反応を促進または増大させることができる任意の物質または化合物を含んでもよい。一具体例において、該アジュバントは、化学的に、または熱によって死滅した菌が組成物に含まれる場合にも使用される。該アジュバントは、当業界に公知されており、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、架橋ポリアクリル酸重合体、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、免疫調節物質、ラクトフェリンまたはＩＦＮ－ガンマ誘導剤などが使用されてもよい。一具現例において、前記架橋ポリアクリル酸重合体は、カーボポール（登録商標）の単一重合体または共重合体を含み、前記リンフォカインは、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－１、ＩＬ－２またはＩＬ－１２を含み、前記ＩＦＮ－ガンマ誘導剤は、ポリＩ：Ｃを含んでもよい。一具体例において、合成された糖ポリマーである前述の水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは硫酸アルミニウムカリウムは、約０．０５ないし０．１重量％で含まれ、前記架橋ポリアクリル酸重合体は、０．２５重量％でも含まれる。
前記マイコバクテリウムパラゴルドネの投与量は、患者の免疫系が癌または腫瘍に対して効果的な免疫反応を搭載することができるように、患者において、防御的な免疫反応を誘発するのに十分な量でもある。本明細書の特定具現例において、前記マイコバクテリウムパラゴルドネは、１０３個ないし１０１１個、１０４個ないし１０１０個、１０６個ないし１０１０個、または１０６個ないし１０９個でもある。他の例として、用量は、懸濁液剤または乾燥調剤物として提供されるマイコバクテリウムパラゴルドの０．０１ｍｇないし１０ｍｇ、または０．１ｍｇないし１ｍｇでもある。さらに他の例として、前記用量は、１Ｘ１０３ないし１Ｘ１０１１ｃｆｕ／ｍｌ、１Ｘ１０４ないし１Ｘ１０１０ｃｆｕ／ｍｌ、１Ｘ１０６ないし１Ｘ１０１０ｃｆｕ／ｍｌ、または１Ｘ１０６ないし１Ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌでもある。
さらに他の様相は、マイコバクテリウムパラゴルドネ、その溶解物または培養液を有効成分として含む免疫調節のための健康機能食品組成物を提供する。
前記健康機能食品は、免疫調節（例えば、免疫増強）を介した癌の予防または改善のためのものでもある。
前記健康食品組成物は、マイコバクテリウムパラゴルドネ、その溶解物または培養液の単独、あるいは他の食品または食品成分とも共に使用され、一般的な方法によっても、適切に使用される。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康または治療のための処置）によっても、適して決定される。一般的に、食品または飲料の製造時、本明細書の組成物は、原料に対して、１５重量部以下の量でも添加される。前記健康食品の種類には、特別な制限はない。健康食品の種類のうち飲料組成物は、通常の飲料と共に、さまざまな香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含んでもよい。前記天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド；マルトース、スクロースのようなジサッカライド；及びデキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド；キシリトール、ソルビトール、エリトリトールのような糖アルコールである。甘味剤としては、ソーマチン、ステビア抽出物のような天然甘味剤や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味剤などを使用することができる。前記健康食品組成物は、また栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤、またはその組み合わせを含んでもよい。前記健康食品組成物は、また、天然果物ジュース、果物ジュース飲料、野菜飲料の製造のための果肉、またはその組み合わせを含んでもよい。
以下、本発明の一助とするために実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をさらに容易に理解するために提供されるものであるのみ、本発明が下記の実施例に限定されるものではない。
参考例１．細胞株の培養
マウス由来大腸癌細胞株ＭＣ３８と、人体由来乳癌細胞株ＭＣＦ－７は、ＤＭＥＭ（Hyclon）培地を使用して培養し、マウス由来マクロファージ細胞株であるＪ７７４．１Ａ（American Type Culture Collection, Manassa, VA、米国）、マウス由来樹状細胞株（ＤＣ２．４）、人体由来肝臓癌細胞株Ｈｕｈ７、肺癌細胞株Ａ５４９及び膀胱癌細胞株Ｍｂｔ－２は、ＲＰＭＩ１６４０（Hyclon）培地を使用して培養した。前記２つの培地に、１０％ウシ胎児血清（Invitrogen、米国）、２ｍｍｏｌ／ｍｌＬ－グルタミン、１００μｇ／ｍｌペニシリン及び１００units／ｍｌストレプトマイシンを添加し、３７℃、５％ＣＯ２培養器で培養した。
マウス由来大腸癌細胞株ＭＣ３８と、人体由来乳癌細胞株ＭＣＦ－７は、ＤＭＥＭ（Hyclon）培地を使用して培養し、マウス由来マクロファージ細胞株であるＪ７７４．１Ａ（American Type Culture Collection, Manassa, VA、米国）、マウス由来樹状細胞株（ＤＣ２．４）、人体由来肝臓癌細胞株Ｈｕｈ７、肺癌細胞株Ａ５４９及び膀胱癌細胞株Ｍｂｔ－２は、ＲＰＭＩ１６４０（Hyclon）培地を使用して培養した。前記２つの培地に、１０％ウシ胎児血清（Invitrogen、米国）、２ｍｍｏｌ／ｍｌＬ－グルタミン、１００μｇ／ｍｌペニシリン及び１００units／ｍｌストレプトマイシンを添加し、３７℃、５％ＣＯ２培養器で培養した。
参考例２．腫瘍動物モデルの製造、及び腫瘍サイズ分析
７週齢になったＣ５７ＢＬ／６めすマウスの右後足皮下組織に、大腸癌ＭＣ３８細胞株（１Ｘ１０６／１００μｌ）を注射し、腫瘍形成を誘導した。熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネは、１Ｘ１０８／１００μｌを、リンパ節近辺皮下に、３日間隔で３回注射した。抗癌効果を比較するために、現在免疫療法に使用されているマイコバクテリウムボビスＢＣＧを陽性対照群として、ＰＢＳを陰性対照群として使用した。また、併用投与効果も確認するために、シスプラチン（５０μｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。形成された腫瘍の大きさは、一週間に２回測定し、幅２Ｘ長さＸ０．５２の公式によって計算された。実験終了後、マウスから腫瘍を分離し、一部は、４％ホルマリン溶液に固定させ、５～１０μｍ厚に切り、パラフィンに保管した。
７週齢になったＣ５７ＢＬ／６めすマウスの右後足皮下組織に、大腸癌ＭＣ３８細胞株（１Ｘ１０６／１００μｌ）を注射し、腫瘍形成を誘導した。熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネは、１Ｘ１０８／１００μｌを、リンパ節近辺皮下に、３日間隔で３回注射した。抗癌効果を比較するために、現在免疫療法に使用されているマイコバクテリウムボビスＢＣＧを陽性対照群として、ＰＢＳを陰性対照群として使用した。また、併用投与効果も確認するために、シスプラチン（５０μｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。形成された腫瘍の大きさは、一週間に２回測定し、幅２Ｘ長さＸ０．５２の公式によって計算された。実験終了後、マウスから腫瘍を分離し、一部は、４％ホルマリン溶液に固定させ、５～１０μｍ厚に切り、パラフィンに保管した。
参考例３．ＴＵＮＥＬアッセイ
腫瘍細胞の死滅細胞死滅を分析するためにＴＵＮＥＬ（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling）分析法でＤＮＡ断片を検出した。切片化された腫瘍組織をキシレンにおいて脱パラフィン化させ、死んだ細胞を、ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (Millipore)で、製造社の指示によって染色した。染色された細胞死滅細胞を、共焦点－Ａ１顕微鏡（NIKON、１３６、日本）下で評価し、蛍光をイメージングソフトウェア（ＮＩＳElements Viewer １３７プログラム）を使用して分析した。
腫瘍細胞の死滅細胞死滅を分析するためにＴＵＮＥＬ（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling）分析法でＤＮＡ断片を検出した。切片化された腫瘍組織をキシレンにおいて脱パラフィン化させ、死んだ細胞を、ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (Millipore)で、製造社の指示によって染色した。染色された細胞死滅細胞を、共焦点－Ａ１顕微鏡（NIKON、１３６、日本）下で評価し、蛍光をイメージングソフトウェア（ＮＩＳElements Viewer １３７プログラム）を使用して分析した。
参考例４．組織学的分析
除去された腫瘍を、１０％中性緩衝ホルマリンに固定させ、パラフィンに保管した。パラフィンに浸漬されたブロックを５μｍ切片に切り、各切片をＨ＆Ｅで染色し、ＣＤ８（１：１００、eBioscience）、グランザイムＢ及びパーフォリン（１：１００、Santa Cruz）に係わるＩＨＣ分析を行った。スライドをAperio Scanscope（Leica Microsystems）でデジタル撮影し、染色された抗原を、HistoQuestソフトウェア（バージョン６．０．１．１１６、TissueGnostics、オーストリア）を使用して定量化した。
除去された腫瘍を、１０％中性緩衝ホルマリンに固定させ、パラフィンに保管した。パラフィンに浸漬されたブロックを５μｍ切片に切り、各切片をＨ＆Ｅで染色し、ＣＤ８（１：１００、eBioscience）、グランザイムＢ及びパーフォリン（１：１００、Santa Cruz）に係わるＩＨＣ分析を行った。スライドをAperio Scanscope（Leica Microsystems）でデジタル撮影し、染色された抗原を、HistoQuestソフトウェア（バージョン６．０．１．１１６、TissueGnostics、オーストリア）を使用して定量化した。
参考例５．リアルタイムＰＣＲを介したｍＲＮＡ発現分析
腫瘍環境での遺伝子発現を分析するために、定量的リアルタイムＰＣＲを行った。Trizol試薬法で、腫瘍組織において総ｍＲＮＡを抽出し、ＰＣＲ機械を使用して定量化した。プライマーは、下記表１に記載されたプライマーを使用した。
腫瘍環境での遺伝子発現を分析するために、定量的リアルタイムＰＣＲを行った。Trizol試薬法で、腫瘍組織において総ｍＲＮＡを抽出し、ＰＣＲ機械を使用して定量化した。プライマーは、下記表１に記載されたプライマーを使用した。
参考例６．細胞毒性分析
Ex vivo分析のために、腫瘍を有するマウスの脾臓細胞を、ＭＣ３８細胞溶解物（１００μｇ／ｍｌ）及びＩＬ－２（５０ｎｇ／ｍｌ）で５日間刺激した。その後、エフェクター細胞を、１０：１及び２０：１のエフェクター：ターゲット（ＥＴ）比率で、ＭＣ３８細胞と４時間共培養した。また、腫瘍細胞に対する免疫細胞の細胞毒性能力を試験した。In vitro分析のために、２４時間及び４８時間、熱殺菌されたマイコバクテリウムパラゴルドネの１ＭＯＩ及び１０ＭＯＩで刺激されたマウス安定大食細胞（Ｊ７７４Ａ．１）及び樹状細胞（ＤＣ２．４）をエフェクター細胞として使用した。それだけではなく、多様な癌細胞株に対する細胞毒性能力を示すか否かということを確認するために、大食細胞を熱殺菌されたマイコバクテリウムパラゴルドネの１ＭＯＩ、５ＭＯＩ及び１０ＭＯＩで２４時間刺激させた後、人体由来の肺癌細胞株（Ａ５４９）、肝臓癌細胞株（ＨｅｐＧ２）、及びマウス由来膀胱癌細胞株（Ｍｂｔ－２）と４時間共培養した。その後、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は、培養上澄み液について、CytoTox96 non-radioactive cytotoxicity assay kit (Promega、米国)を使用して測定した。
Ex vivo分析のために、腫瘍を有するマウスの脾臓細胞を、ＭＣ３８細胞溶解物（１００μｇ／ｍｌ）及びＩＬ－２（５０ｎｇ／ｍｌ）で５日間刺激した。その後、エフェクター細胞を、１０：１及び２０：１のエフェクター：ターゲット（ＥＴ）比率で、ＭＣ３８細胞と４時間共培養した。また、腫瘍細胞に対する免疫細胞の細胞毒性能力を試験した。In vitro分析のために、２４時間及び４８時間、熱殺菌されたマイコバクテリウムパラゴルドネの１ＭＯＩ及び１０ＭＯＩで刺激されたマウス安定大食細胞（Ｊ７７４Ａ．１）及び樹状細胞（ＤＣ２．４）をエフェクター細胞として使用した。それだけではなく、多様な癌細胞株に対する細胞毒性能力を示すか否かということを確認するために、大食細胞を熱殺菌されたマイコバクテリウムパラゴルドネの１ＭＯＩ、５ＭＯＩ及び１０ＭＯＩで２４時間刺激させた後、人体由来の肺癌細胞株（Ａ５４９）、肝臓癌細胞株（ＨｅｐＧ２）、及びマウス由来膀胱癌細胞株（Ｍｂｔ－２）と４時間共培養した。その後、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は、培養上澄み液について、CytoTox96 non-radioactive cytotoxicity assay kit (Promega、米国)を使用して測定した。
参考例７．ナチュラルキラー細胞（ＮＫ cells）活性分析
ＹＡＣ－１細胞を使用し、脾臓ＮＫ細胞活性を評価した。具体的には、ＹＡＣ－１細胞をＣＦＳＥ（Thermo）で標識し、エフェクター細胞と共に、ＥＴの比率２０：１において、４時間共培養した。培養上澄み液をＬＤＨ測定に使用し、細胞をＦＡＣＳで分析し、ＣＦＳＥ強度を照射した。
ＹＡＣ－１細胞を使用し、脾臓ＮＫ細胞活性を評価した。具体的には、ＹＡＣ－１細胞をＣＦＳＥ（Thermo）で標識し、エフェクター細胞と共に、ＥＴの比率２０：１において、４時間共培養した。培養上澄み液をＬＤＨ測定に使用し、細胞をＦＡＣＳで分析し、ＣＦＳＥ強度を照射した。
参考例８．サイトカイン及び体液免疫抗体の分析
エフェクター細胞から生成されたサイトカインを評価するために、培養上澄み液を使用し、製造者の指示により、ＥＬＩＳＡキット（eBioscience）を使用し、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１０及びＩＬ－１２を測定した。また、実験群のマウス血清内において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、全体ＩｇＧ（eBioscience）を測定することにより、体液免疫を比較した。サイトカインと抗体との濃度は、Tecan Microplate Reader（Infinite（登録商標）Ｍ１０００ ＰＲＯ、スイス）を使用し、吸光度を測定して分析した。
エフェクター細胞から生成されたサイトカインを評価するために、培養上澄み液を使用し、製造者の指示により、ＥＬＩＳＡキット（eBioscience）を使用し、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１０及びＩＬ－１２を測定した。また、実験群のマウス血清内において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、全体ＩｇＧ（eBioscience）を測定することにより、体液免疫を比較した。サイトカインと抗体との濃度は、Tecan Microplate Reader（Infinite（登録商標）Ｍ１０００ ＰＲＯ、スイス）を使用し、吸光度を測定して分析した。
参考例９．流細胞分析
マウスの脾臓細胞、または腫瘍組織内免疫細胞を、流細胞分析器を通じて評価した。具体的には、分離された腫瘍細胞と脾臓細胞は、いずれもＣＤ３－ＢＣ４２１（１：１００，ＢＤ Pharmingen）、ＣＤ４－ＰＥ－Ｃｙ５（１：１００，ＢＤ Pharmingen）、ＣＤ８－ＡＰＣ－Ｃｙ７（１：１００，eBioscience）、ＮＫ１．１－ＰＥ（１：１００，ＢＤ Pharmingen）で染色した後、細胞を固定させ、細胞内に抗体を浸透させるために、Fixation/Permeabilization kit（eBioscience）で、製造社の指示によって進めた。固定された細胞内ＴＮＦ－αは、抗体－ＴＮＦ－α－ＦＩＴＣ（１：１００，ＢＤ Pharmingen）で染色した。前述のように準備した細胞は、ＢＤ ＬＳＲFortessaＴＭＸ－２０流細胞分析器を使用して評価した。
マウスの脾臓細胞、または腫瘍組織内免疫細胞を、流細胞分析器を通じて評価した。具体的には、分離された腫瘍細胞と脾臓細胞は、いずれもＣＤ３－ＢＣ４２１（１：１００，ＢＤ Pharmingen）、ＣＤ４－ＰＥ－Ｃｙ５（１：１００，ＢＤ Pharmingen）、ＣＤ８－ＡＰＣ－Ｃｙ７（１：１００，eBioscience）、ＮＫ１．１－ＰＥ（１：１００，ＢＤ Pharmingen）で染色した後、細胞を固定させ、細胞内に抗体を浸透させるために、Fixation/Permeabilization kit（eBioscience）で、製造社の指示によって進めた。固定された細胞内ＴＮＦ－αは、抗体－ＴＮＦ－α－ＦＩＴＣ（１：１００，ＢＤ Pharmingen）で染色した。前述のように準備した細胞は、ＢＤ ＬＳＲFortessaＴＭＸ－２０流細胞分析器を使用して評価した。
参考例１０．統計分析
統計的有意性を比較するために、Student’s t-testを行った。データは、平均±ＳＤで示し、graph pad software（Ｐｒｉｓｍ ５、version ５．０１）を使用して分析した。統計的有意性は、次のような別表に表示した：＊ｐ＝０．０５；＊＊ｐ≦＝０．０１；＊＊＊ｐ≦＝０．００１．
統計的有意性を比較するために、Student’s t-testを行った。データは、平均±ＳＤで示し、graph pad software（Ｐｒｉｓｍ ５、version ５．０１）を使用して分析した。統計的有意性は、次のような別表に表示した：＊ｐ＝０．０５；＊＊ｐ≦＝０．０１；＊＊＊ｐ≦＝０．００１．
実施例１．熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネの製造
マイコバクテリウムパラゴルドネ（ＫＣＴＣ １２６２８ＢＰ）の熱処理非活性化（死菌）は、下記のように製造し、対照群として、マイコバクテリウムボビスＢＣＧを製造した。
マイコバクテリウムパラゴルドネ（ＫＣＴＣ １２６２８ＢＰ）の熱処理非活性化（死菌）は、下記のように製造し、対照群として、マイコバクテリウムボビスＢＣＧを製造した。
まず、マイコバクテリウムパラゴルドネを、１０％アルブミン・デキストロース・カタラーゼ（ＡＤＣ）、２．４％グリセロール及び０．２％ツイン８０を含む７Ｈ９液体培地に接種した。その後、マイコバクテリウムパラゴルドネは、３０℃で、及びマイコバクテリウムボビスＢＣＧは、３７℃で定常期まで培養した。定常期の菌株は、吸光度測定を容易にするために、１％ツイン８０溶液で再浮遊させ、粒子が生じないように、インシュリン注射器に通過させた。その後、すでに確認した特定吸光度によるＣＦＵ（colony-forming unit）を参照し、菌株を１Ｘ１０８ＣＦＵ（ＯＤ６００１．０＝１Ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ）に合わせ、高圧蒸気滅菌器を介して、１２１℃で１．５気圧で１５分間滅菌させた。高圧蒸気滅菌による溶液損失は、溶液内菌株の濃度に影響を及ぼしうるために、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、マイコバクテリウムのペレットを得て、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ：phosphate-based saline）で再浮遊させて誤差範囲を縮めた。そのように準備した熱処理非活性されたマイコバクテリウムパラゴルド及びマイコバクテリウムボビスＢＣＧをその後実験において使用した。
実施例２．腫瘍形成以前に注射したマイコバクテリウムパラゴルドネの癌発生遅延効果
腫瘍形成前、マイコバクテリウムパラゴルドネの癌発生遅延効果を確認するために、図１Ａに記載されているように実験を行った。
腫瘍形成前、マイコバクテリウムパラゴルドネの癌発生遅延効果を確認するために、図１Ａに記載されているように実験を行った。
具体的には、前記参考例２に記載されているように、ＭＣ３８細胞株をマウスに皮下注射し、腫瘍が形成される以前である細胞株注射３日後、前記実施例１で製造した熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネをリンパ節近辺皮下に、１Ｘ１０８／１００μｌ濃度で注射し、一週間間隔で、２回追加して注射し、抗癌効果を観察した。また、参考例２に記載されているように、マイコバクテリウムパラゴルドネと同一濃度のマイコバクテリウムボビスＢＣＧを陽性対照群として、熱処理非活性化マイコバクテリウムを浮遊させた溶液ＰＢＳを陰性対照群として使用し、前記結果は、図１に示した。
図１Ａは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの動物モデルへの投与計画を図式化して示した図である。
図１Ｂは、腫瘍形成前における、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与による癌発生頻度を示したグラフである；Ｍｐｇ：マイコバクテリウムパラゴルドネ；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図１Ｃは、腫瘍形成前における、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与による腫瘍サイズ変化を示したグラフである；Ｍｐｇ：マイコバクテリウムパラゴルドネ；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図１Ｄは、腫瘍形成前における、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与による生存率を示したグラフである；Ｍｐｇ：マイコバクテリウムパラゴルドネ；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図１Ｅは、腫瘍形成前における、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与による腫瘍サイズ変化を示した図である；Ｍｐｇ：マイコバクテリウムパラゴルドネ；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図１に示されているように、腫瘍形成前に注射した熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネは、腫瘍発生を３０～５０％低減させた。しかし、現在抗癌免疫療法に適用されているマイコバクテリウムボビスＢＣＧを投与したときには、全てのマウスにおいて、腫瘍が発生した。また、熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネは、腫瘍形成だけではなく、癌発生も遅延させ、それにより、マウスの生存率を７０％以上上昇させた。そのようなマイコバクテリウムパラゴルドネによる抗癌効果は、マイコバクテリウムボビスＢＣＧと比較したとき、統計学的に有意な結果であるということを確認した。また、実験終了後、マウスから摘出した癌の大きさを肉眼で観察したとき、熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネの投与により、顕著に小サイズの腫瘍が確認された。
そのような結果は、マイコバクテリウムパラゴルドネが、外科手術後、治療剤として使用されているマイコバクテリウムボビスＢＣＧを代替することができる効果的な治療剤であるということを意味する。それだけではなく、腫瘍切除後、潜在的に腫瘍細胞になりうる周辺組織にマイコバクテリウムパラゴルドネを注射する場合、腫瘍再発を低減させる可能性があるということが分かった。
実施例３．腫瘍形成後に注射したマイコバクテリウムパラゴルドネの抗癌効果
腫瘍形成後、マイコバクテリウムパラゴルドネの抗癌効果を確認するために、図２Ａに記載されているように実験を行った。
腫瘍形成後、マイコバクテリウムパラゴルドネの抗癌効果を確認するために、図２Ａに記載されているように実験を行った。
具体的には、前記参考例２に記載されているように、ＭＣ３８細胞株をマウスに皮下注射し、一週間後、全てのマウスで腫瘍が形成されたことを確認した後、前記実施例３と同一方法で、マイコバクテリウムパラゴルドネの抗癌効果を確認した。前記結果は、図２に示した。
図２Ａは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの動物モデルへの投与計画を図式化して示した図である。
図２Ｂは、腫瘍形成後における、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与による腫瘍サイズ変化を示したグラフである；Ｍｐｇ：マイコバクテリウムパラゴルドネ；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図２Ｃは、腫瘍形成後における、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与による生存率を示したグラフである；Ｍｐｇ：マイコバクテリウムパラゴルドネ；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図２Ｄは、腫瘍形成後における、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与による腫瘍サイズ変化を示した図である；Ｍｐｇ：マイコバクテリウムパラゴルドネ；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図２Ｅは、腫瘍形成後における、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与による、２４日目における腫瘍重量を示した図である；Ｍｐｇ：マイコバクテリウムパラゴルドネ；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図２に示されているように、熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネは、腫瘍の成長速度を遅延させ、それにより、マウスの生存率を７０％以上上昇させ、そのような抗癌効果は、陽性対照群であるマイコバクテリウムボビスＢＣＧより、統計学的に有意な結果であるということが分かった。また、実験終了後、マウスから摘出した癌の大きさは、陰性または陽性の対照群と比較したとき、熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネの注射によって小さくなったことを肉眼で観察することができた。それだけではなく、陰性あるいは陽性の対照群を利用した治療より、熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネの治療を介して、腫瘍重量が有意に減ったことを確認した。
そのような結果は、すでに進行中の癌疾患についても、マイコバクテリウムパラゴルドネが効果的な治療剤として使用可能であるだけではなく、既存に、膀胱癌初期にだけ使用可能であったマイコバクテリウムボビスＢＣＧを代替することができる治療剤であるということを意味する。
実施例４．マイコバクテリウムパラゴルドネの抗癌ワクチン活性分析
マイコバクテリウムパラゴルドネにより、腫瘍細胞の細胞死滅が誘導されるか否かということを確認した。
マイコバクテリウムパラゴルドネにより、腫瘍細胞の細胞死滅が誘導されるか否かということを確認した。
具体的には、前記参考例３に記載されているように、ＴＵＮＥＬアッセイを行い、その結果を、図３Ａ及び図３Ｂに示した。また、前記参考例４に記載されているように、Ｂｃｌ－２及びパーフォリンの発現を分析し、その結果を、それぞれ図３Ｃ及び図３Ｄに示した。また、前記参考例４に記載されているように、パーフォリン及びグランザイムに対するＩＨＣ分析を行い、その結果を図３Ｅに示した。
図３Ａは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与による腫瘍細胞の死滅を、ＴＵＮＥＬ分析法で確認した結果（左側パネル）である；Ｍｐｇ：マイコバクテリウムパラゴルドネ；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図３Ｂは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与による腫瘍細胞の死滅を、ＴＵＮＥＬ分析法で確認した結果を定量化して示したグラフである；Ｍｐｇ：マイコバクテリウムパラゴルドネ；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図３Ｃは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与によるＢｃｌ－２の発現抑制を示したグラフである；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図３Ｄは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与によるパーフォリンの発現増大を示したグラフである；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図３Ｅは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与によるパーフォリン及びグランザイムの発現を、ＩＨＣ分析法で確認した図である；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図３に示されているように、陽性対照群である熱処理非活性化マイコバクテリウムボビスＢＣＧに比べ、マイコバクテリウムパラゴルドネを介した治療において、高レベルの腫瘍細胞の細胞死滅を確認することができた。また、そのような蛍光イメージを数値化させて比較したとき、熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネにより、顕著に高い細胞死滅が統計学的に有意であることを確認することができた。細胞死滅を妨害する遺伝子Ｂｃｌ－２と、細胞毒性タンパク質であるパーフォリン及びグランザイムとの発現程度を比較分析した結果、熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネの投与により、それぞれ低減（Ｂｃｌ－２）するか、あるいは及び増大（パーフォリン及びグランザイム）することが分かった。
腫瘍細胞の細胞死滅は、癌細胞の成長を阻害させるために、癌疾患進行を防ぎ、他臓器への転移を最小化させることができる。そのような細胞死滅は、癌治療において重要であるにもかかわらず、商用化されているマイコバクテリウムボビス治療においては、観察されていない一方、マイコバクテリウムパラゴルドネを介した治療においては、腫瘍細胞の細胞死滅を顕著に誘導する活性があるということを確認することができた。従って、マイコバクテリウムパラゴルドネは、癌の進行及び転移を防ぎ、疾病の予後を好転させるところにも有用に使用される。
実施例５．マイコバクテリウムパラゴルドネの腫瘍環境での増大された炎症誘導活性分析
マイコバクテリウムパラゴルドネの腫瘍環境での増大された炎症活性を分析した。
マイコバクテリウムパラゴルドネの腫瘍環境での増大された炎症活性を分析した。
具体的には、前記参考例４に記載されているように、Ｈ＆Ｅ染色を行い、その結果を図４Ａに示した。また、前記参考例５に記載されているように、ＩＬ－１０及びＦｏｘＰ３の発現を分析し、その結果を図４Ｂに示した。また、前記参考例４に記載されているように、ＣＤ８Ｔ細胞に対するＩＨＣ分析を行い、その結果を図４Ｃに示した。それだけではなく、細胞毒性を引き起こすＴＮＦ－αを分泌するＣＤ４，ＣＤ８ Ｔ細胞と、ナチュラルキラー細胞とを図４Ｄに示した。
図４Ａは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与による腫瘍細胞の死滅を、Ｈ＆Ｅ染色で確認した図である；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図４Ｂは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与によるＩＬ－１０及びＦｏｘＰ３の発現を定量的リアルタイムＰＣＲで確認したグラフである；Ｍｐｇ：マイコバクテリウムパラゴルドネ；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図４Ｃは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与によるＣＤ８Ｔ細胞の比率を、ＩＨＣ分析法で確認した図である；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図４Ｄは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与による、ＴＮＦ－αを分泌するＣＤ８Ｔ細胞の比率を、流細胞分析法で確認した図である；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図４Ｅは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの刺激により、腫瘍内ＴＮＦ－αを発現するＣＤ４，ＣＤ８ Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞の比率を、流細胞分析法で確認した図である；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図４Ａに示されているように、陰性対照群ＰＢＳと、陽性対照群熱処理非活性化マイコバクテリウムボビスＢＣＧとを注射したマウスの腫瘍組織内細胞は、核が大きくて緩やかであり、いくつかの核を有した腫瘍細胞の特性と確認された。それに反し、熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネを投与したマウスにおいては、細胞の大きさが比較的小さく、核が凝縮された形態を有した正常細胞の区画が明らかに分けられていることが分かった。そのような結果は、マイコバクテリウムパラゴルド治療により、免疫細胞が腫瘍組織に移動してきたことを意味する。
また、図４Ｂに示されているように、免疫抑制反応に関与するサイトカインＩＬ－１０と、免疫調節細胞の調節Ｔ細胞のマーカーＦｏｘＰ３とを合成する遺伝子の転写発現を確認した結果、免疫細胞の腫瘍組織内浸透により、腫瘍細胞が誘導する免疫抑制反応が、熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネによって改善されることを確認した。
また、図４Ｃに示されているように、熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネの投与は、腫瘍を除去するための細胞毒性Ｔ細胞（ＣＤ８Ｔ細胞）の比率が上昇したことを、ＩＨＣ分析を介して確認した。それは、単に細胞毒性Ｔ細胞の比率だけが上昇したのではなく、細胞毒性を引き起こすＴＮＦ－αを発現するＣＤ４，ＣＤ８ Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞の比率がいずれも上昇することを、図４Ｄに示されているように流細胞分析法で確認した。
そのような結果は、陽性対照群であるマイコバクテリウムボビスＢＣＧは、免疫低下と係わる２つの遺伝子の発現を抑制させるのに比べ、一具体例によるマイコバクテリウムパラゴルドネは、商用化されているマイコバクテリウムボビスＢＣＧより、さらに効果的に癌周辺微細環境の免疫低下を抑制し、腫瘍を除去する免疫細胞が増加することを意味する。
実施例６．マイコバクテリウムパラゴルドネの、ナチュラルキラー細胞媒介またはＴ細胞媒介の細胞毒性活性分析
癌細胞を除去することができる細胞毒性反応は、主に、ナチュラルキラー細胞及び細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって媒介される。それにより、前記実施例５において、熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネの刺激が、Ｔ細胞媒介またはＮＫ細胞媒介によって増大された腫瘍細胞死滅を誘導するか否かということを確認した。
癌細胞を除去することができる細胞毒性反応は、主に、ナチュラルキラー細胞及び細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって媒介される。それにより、前記実施例５において、熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネの刺激が、Ｔ細胞媒介またはＮＫ細胞媒介によって増大された腫瘍細胞死滅を誘導するか否かということを確認した。
具体的には、前記参考例６に記載されているように、細胞媒介細胞毒性を分析し、その結果を図４Ｅに示した。また、前記参考例７に記載されているよう、にナチュラルキラー細胞活性を分析し、その結果を図４Ｆ及び図４Ｇに示した。
図４Ｅは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与による細胞媒介毒性を確認したグラフである；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図４Ｆは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与によるＮＫ細胞毒性を確認したグラフである；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図４Ｇは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与によるＮＫ細胞毒性を、流細胞分析で確認したグラフである；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図４Ｅに示されているように、マイコバクテリウムボビスＢＣＧは、対照群に比べて増大されたＣＴＬ反応を起こすが、一具体例によるマイコバクテリウムパラゴルドネの投与は、マイコバクテリウムボビスＢＣＧに比べ、顕著に増大されたＣＴＬ反応を誘導することが分かった。そのような結果は、マイコバクテリウムパラゴルドネが、マイコバクテリウムボビズに比べ、増大された抗原特異的ＣＴＬ誘導能を有するということを意味する。
また、図４Ｆに示されているように、マイコバクテリウムパラゴルドネによるＮＫ細胞媒介腫瘍細胞死滅を分析した結果、陰性対照群または陽性対照群対比で、顕著に増大された、ＹＡＣ－１細胞に対するＮＫ細胞媒介細胞毒性を有するということが分かった。
また、図４Ｇに示されているように、ＣＦＳＥ標識されたＹＡＣ－１細胞に対する流細胞分析において、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与は、約２０％の細胞毒性を有し、それは、他の陰性または陽性の対照群に比べ、２倍以上上昇した数値であるということが分かった。
そのような結果は、マイコバクテリウムパラゴルドネが、マイコバクテリウムボビスよりも、顕著に増大された、ＣＴＬ媒介またはＮＫ細胞媒介の細胞毒性活性を有し、癌治療剤としても有用に使用されるということを意味する。
実施例７．マイコバクテリウムパラゴルドネを刺激させた脾臓細胞及びナチュラルキラー細胞と、抗原提示細胞である大食細胞または樹状細胞とから分泌される炎症性サイトカイン分析
抗原提示細胞である大食細胞及び樹状細胞、並びに多様な免疫細胞を含む脾臓細胞及びナチュラルキラー細胞は、外部刺激によって活性化され、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＩＬ－１２のようなサイトカインを分泌して適応免疫を誘導し、過度な免疫反応を制限するために、ＩＬ－１０のようなサイトカインを分泌して反応を調節する。それにより、前述の参考例５及び参考例６を参照し、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１０及びＩＬ－１２の発現及び細胞毒性活性を分析し、マウス脾臓細胞及び腫瘍内免疫細胞の比率を図５に示した。
抗原提示細胞である大食細胞及び樹状細胞、並びに多様な免疫細胞を含む脾臓細胞及びナチュラルキラー細胞は、外部刺激によって活性化され、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＩＬ－１２のようなサイトカインを分泌して適応免疫を誘導し、過度な免疫反応を制限するために、ＩＬ－１０のようなサイトカインを分泌して反応を調節する。それにより、前述の参考例５及び参考例６を参照し、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１０及びＩＬ－１２の発現及び細胞毒性活性を分析し、マウス脾臓細胞及び腫瘍内免疫細胞の比率を図５に示した。
図５Ａは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの刺激による、脾臓細胞からの多様な炎症性サイトカイン生産を示した図である；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図５Ｂは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネを脾臓細胞に刺激させた後、ＭＣ３８腫瘍細胞抗原に再刺激されて分泌される炎症性サイトカインの生産を示した図である；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図５Ｃは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの刺激による、脾臓細胞内ナチュラルキラー細胞からの炎症性サイトカイン生産を示した図である；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図５Ｄは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの処理による、大食細胞（Ｊ７７４Ａ．１）及び樹状細胞（ＤＣ．２４）でのＩＬ－１２及びＩＬ－１０の分泌量を示したグラフである；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図５Ｅは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの刺激による、血清内ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａそして全体ＩｇＧの比率を確認した図である；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図５Ｆは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの刺激による、脾臓細胞内ＴＮＦ－αを発現するＣＤ８Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞の比率を、流細胞分析法で確認した図である；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図５Ａないし図５Ｃに示されているように、免疫を誘導するサイトカインＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＩＬ－１２は、陰性または陽性の対照群と比較したとき、熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネを刺激させた脾臓細胞において、高く分泌されるということを確認することができた。そのうち、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γは、脾臓細胞内ナチュラルキラー細胞においても、高く分泌されるということを観察した。
また、図５Ｄに示されているように、免疫を誘導するサイトカインＩＬ－１２は、陰性または陽性の対照群と比較したとき、少ないＭＯＩの熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドの刺激によっても高く分泌されることを、大食細胞及び樹状細胞において、いずれも観察することができた。それに反し、免疫反応を抑制するサイトカインＩＬ－１０の場合、大食細胞及び樹状細胞において、いずれも陽性対照群より熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネの刺激によって低減するということが分かった。それは、既存に、抗癌免疫療法に使用されているマイコバクテリウムボビスＢＣＧより、マイコバクテリウムパラゴルドネにより、免疫誘導がさらに効果的に起こり、誘導された免疫反応による抗癌効果が増大されるということを意味する。また、マウスの大食細胞及び樹状細胞は、いずれも熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネの刺激により、腫瘍細胞毒性が増大され、そのような効果は、既存に商用化されたマイコバクテリウムボビスＢＣＧよりも効果的であるということを確認した。それだけではなく、図５Ｅに示されているように、マウスの血清内ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ、全体ＩｇＧを測定し、体液免疫反応を比較した結果、既存に商用化されたマイコバクテリウムボビスＢＣＧの場合、増大された免疫反応を低くするためのＩｇＧ１が顕著に高くなったことを確認することができた。それに反し、熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネを刺激させたマウスの血清内において、ＩＦＮ－γを増加させ、Ｔｈ１反応を誘導するＩｇＧ２ａの量が陽性対照群と陰性対照群とに比べ、顕著に増加したことを確認した。
それを介して、マイコバクテリウムパラゴルドネの刺激が、免疫反応を向上させるサイトカイン分泌及び体液免疫を誘導するだけではなく、腫瘍細胞を攻撃して退治するように免疫細胞を活性化させ、抗癌効果を極大化させることができるということが分かった。
実施例８．多様な癌細胞株に対するマイコバクテリウムパラゴルドネの細胞毒性活性分析
前記実施例７において、熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネの刺激が、大食細胞及び樹状細胞を介した増大された腫瘍細胞死滅を誘導するか否かということを確認した。
前記実施例７において、熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネの刺激が、大食細胞及び樹状細胞を介した増大された腫瘍細胞死滅を誘導するか否かということを確認した。
マイコバクテリウムパラゴルドネが免疫細胞を誘導するだけではなく、直接腫瘍細胞に対する細胞毒性能も示すか否かということか確認するために、多様な癌細胞株での細胞毒性が分析した。
具体的には、マウス由来大腸癌細胞株ＭＣ３８、人体由来の肺癌細胞株Ａ５４９、肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２、肺癌細胞株Ａ５４９、マウス由来膀胱癌細胞株Ｍｂｔ－２を使用し、前記実施例１で製造した熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドの１，１０，２０ＭＯＩを２４，４８時間処理した後、参考例６に記載されているように、細胞毒性を行った。前記結果は、図６に示した。
図６Ａは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの処理による、大食細胞（Ｊ７７４Ａ．１）のＭＣ３８大腸癌細胞に対する細胞毒性を示したグラフである；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図６Ｂは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの処理による、樹状細胞（ＤＣ．２４）のＭＣ３８大腸癌細胞に対する細胞毒性を細胞毒性を示したグラフである；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図６Ｃは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの処理による、大食細胞（Ｊ７７４Ａ．１）のＡ５４９肺癌細胞株に対する細胞毒性を示したグラフである；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図６Ｄは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの処理による、大食細胞（Ｊ７７４Ａ．１）のＨｅｐＧ２肝臓癌細胞株に対する細胞毒性を示したグラフである；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図６Ｅは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの処理による、大食細胞（Ｊ７７４Ａ．１）のＭｂｔ－２膀胱癌細胞株に対する細胞毒性を示したグラフである；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図６Ｆは、一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの処理による、マウス脾臓細胞の細胞培養液がマウス由来ＭＣ３８大腸癌細胞株に対する細胞毒性を示すというグラフである；ＢＣＧ：マイコバクテリウムボビスＢＣＧ；ＰＢＳ：陰性対照群。
図６Ａないし図６Ｅに示されているように、熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネの刺激は、マウス実験で示されたＭＣ３８細胞に対する細胞毒性を示すだけではなく、多様な癌細胞株に対して細胞毒性を示すということを確認した。それは、熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネの抗癌効果が、単にマウス由来大腸癌細胞株ＭＣ３８だけではなく、膀胱癌細胞株Ｍｂｔ－２、人体由来の肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２及び肺癌細胞株Ａ５４９に対する抗癌効果も含むということを意味し、多様な癌細胞株に適用可能であるというを示唆する。それだけではなく、図６Ｆに示されているように、熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネを刺激させた脾臓細胞の培養液においても、ＭＣ３８細胞に対する細胞毒性を示すことにより、培養液内の物質も、抗癌効果を示すということを確認した。
実施例９．マイコバクテリウムパラゴルドの抗癌剤との併用療法
マイコバクテリウムパラゴルドネの抗癌効果を極大化させるために、抗癌剤との併用療法について、図７Ａに記載されているように実験を行った。
マイコバクテリウムパラゴルドネの抗癌効果を極大化させるために、抗癌剤との併用療法について、図７Ａに記載されているように実験を行った。
具体的には、前記参考例２に記載されているように、ＭＣ３８細胞株をマウスに皮下注射して腫瘍を形成した後、前記参考例２に記載されているように、前記実施例１で製造した熱処理非活性化マイコバクテリウムパラゴルドネを、リンパ節近辺皮下に、１Ｘ１０８／１００μｌの濃度で注射し、一週間間隔で３回追加して注射して抗癌効果を観察した。併用投与効果を確認するために、熱処理非活性化マイコバクテリウムの投与と共に、シスプラチン（５０μｇ／ｋｇ）を１週間間隔で３回に腹腔内投与した。
その後、腫瘍の大きさ及び生存率を、前記実施例２と同一に確認し、その結果を図７に示した。
図７Ａは、併用投与効果を確認するための一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの動物モデルへの投与計画を図式化して示した図である。
図７Ｂは、併用投与効果を確認するための一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与による腫瘍サイズ変化を示したグラフである；Ｍｐｇ：マイコバクテリウムパラゴルドネ；Ｃｉｓ＋Ｍｐｇ：シスプラチン＋マイコバクテリウムパラゴルドネ；シスプラチン；ＰＢＳ：陰性対照群。
図７Ｃは、併用投与効果を確認するための一具体例による、マイコバクテリウムパラゴルドネの投与による生存率を示したグラフである；Ｍｐｇ：マイコバクテリウムパラゴルドネ；Ｃｉｓ＋Ｍｐｇ：シスプラチン＋マイコバクテリウムパラゴルドネ；シスプラチン；ＰＢＳ：陰性対照群。
図７に示されているように、抗癌剤単独投与より、マイコバクテリウムパラゴルドネの併用投与時、抗癌効果が相乗的に上昇するするということが分かった。
本願で使用したマイコバクテリウムパラゴルドネは、免疫反応を誘導させる特性のために、多種の癌に作用可能であるという長所がある。該実施例と共に、併用投与時、抗癌効果が極大化されることから、特定癌に作用する特定抗癌剤との併用投与は、多種の癌に効果的な治療剤として使用されうると期待される。
以上、本願の例示的な実施例について詳細に説明したが、本願の権利範囲は、それらに限定されるものではなく、特許請求の範囲で定義している本願の基本概念を利用した当業者の、多くの変形及び改良形態も、本願の権利範囲に属するものである。
本発明で使用される全ての技術用語は、異なって定義されない以上、本発明の関連分野において、当業者が一般的に理解するような意味で使用される。本明細書に参考文献として記載される全ての刊行物の内容は、本発明に導入される。
Claims (15)
- マイコバクテリウムパラゴルドネ又はその溶解物を有効成分として含む癌の予防用または治療用である薬学的組成物。
- 前記マイコバクテリウムパラゴルドネは、生菌または死菌である、請求項１に記載の薬学的組成物。
- 前記死菌は、熱処理によるマイコバクテリウムパラゴルドの死菌である、請求項２に記載の薬学的組成物。
- 前記マイコバクテリウムパラゴルドネは、寄託番号ＫＣＴＣ １２６２８ＢＰのマイコバクテリウムパラゴルドの菌株である、請求項１に記載の薬学的組成物。
- 前記癌は、肺癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、大腸癌、脳癌、乳癌、甲状腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、卵巣癌、黒色腫、頭頸部癌、皮膚癌、前立腺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝細胞癌、及び子宮頸部癌からなる群から選択されたいずれか一つである、請求項１に記載の薬学的組成物。
- 前記マイコバクテリウムパラゴルドネ又はその溶解物は、抗癌剤と併用投与されるものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
- 前記マイコバクテリウムパラゴルドネは、ＩＬ（interleukin）－１０の発現または活性を抑制するか、あるいはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２またはＩＬ－１２の発現または活性を増大させるものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
- 前記マイコバクテリウムパラゴルドネは、ナチュラルキラー細胞媒介またはＴ細胞媒介の癌細胞毒性を有するものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
- 前記マイコバクテリウムパラゴルドネは、大食細胞または樹状細胞の癌細胞毒性を増大させるか、あるいはまたは体液免疫反応を誘導するものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
- マイコバクテリウムパラゴルドネ又はその溶解物を有効成分として含む癌の免疫治療用ワクチン組成物。
- 前記マイコバクテリウムパラゴルドネは、生菌または死菌である、請求項１０に記載のワクチン組成物。
- 前記癌は、肺癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、大腸癌、脳癌、乳癌、甲状腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、卵巣癌、黒色腫、頭頸部癌、皮膚癌、前立腺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝細胞癌、及び子宮頸部癌からなる群から選択されたいずれか一つである、請求項１０に記載のワクチン組成物。
- 前記マイコバクテリウムパラゴルドネ又はその溶解物は、抗癌剤と併用投与されるものである、請求項１０に記載のワクチン組成物。
- アジュバントを追加して含むものである、請求項１０に記載のワクチン組成物。
- マイコバクテリウムパラゴルドネ又はその溶解物を有効成分として含む免疫調節を介した癌の予防または改善用健康機能食品組成物。
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