WO2022137644A1 - 細菌、ｉｌ１０遺伝子発現亢進剤、免疫応答制御亢進剤、及び製剤 - Google Patents

細菌、ｉｌ１０遺伝子発現亢進剤、免疫応答制御亢進剤、及び製剤 Download PDF

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WO2022137644A1
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preparation
lactobacillus
bacterium
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英俊 本多
良子 河津
太郎 渕上
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株式会社バイオジェノミクス
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present disclosure relates to a bacterium belonging to Lactobacillus choreohominis, an interleukin 10 (hereinafter also referred to as "IL10") gene expression enhancer using the bacterium, and a preparation of an external skin preparation and an oral preparation using the bacterium.
  • IL10 interleukin 10
  • the present inventors speculate that the birth canal of a pregnant woman has a healing power that can immediately repair the wound, and that this may be caused by the intestinal flora in the pregnant woman. I did a study of. The present invention was born as a result of such research.
  • One aspect of the present disclosure is a bacterium that is a Döderlein's bacillus that enhances IL10 gene expression. Since the embodiment is a bacterium that is a Daederlein bacillus that enhances the expression of the IL10 gene, it is a bacterium that can be obtained from the human birth canal that can enhance the expression of the IL10 gene.
  • One aspect of the present disclosure is a DL81 strain (bacteria) belonging to the Lactobacillus coleohominis species internationally deposited under the accession number: NITE BP-03295 in which the Döderlein's bacillus enhances IL10 gene expression. ..
  • the Döderlein's bacillus is a DL81 strain (bacteria) belonging to the Lactobacillus coleohominis species internationally deposited as the accession number: NITE BP-03295 that enhances IL10 gene expression.
  • Bacteria belonging to the Lactobacillus choreohominis species that can be obtained from the human birth canal can enhance the expression of the IL10 gene.
  • One aspect of the present disclosure is a bacterium consisting of a combination of Lactobacillus crispatus , Lactobacillus jensenii , and Lactobacillus coleohominis that enhance IL10 gene expression.
  • the above aspect was a bacterium consisting of a combination of Lactobacillus crispatus , Lactobacillus jensenii , and Lactobacillus coleohominis that enhances IL10 gene expression, it can be obtained from the human birth canal.
  • a bacterial group consisting of a combination of strains belonging to at least one of Lactobacillus crispatus , Lactobacillus jensenii , and Lactobacillus coleohominis expresses the IL10 gene. It can be increased more than twice.
  • One aspect of the present disclosure is an IL10 gene expression enhancer containing the culture supernatant of the above bacteria as a main component.
  • IL10 gene expression enhancer containing the culture supernatant of the bacterium as a main component
  • IL10 gene expression prevents diseases caused by inflammatory diseases, autoimmune diseases, viral infections, tumors, etc., or Can be treated.
  • One aspect of the present disclosure is an IL10 gene expression enhancer containing the above-mentioned bacteria as an active ingredient.
  • the embodiment is an IL10 gene expression enhancer containing the bacteria as an active ingredient, it is possible to prevent or treat diseases caused by inflammatory diseases, autoimmune diseases, viral infections, tumors, etc. by IL10 gene expression. can.
  • One aspect of the present disclosure is an immune response control enhancer containing the culture supernatant of the above bacteria as a main component.
  • the embodiment is an immune response control enhancer containing the culture supernatant of the bacterium as a main component, both innate immunity and anti-inflammatory action can be enhanced. That is, in the above aspect, both the immunity to resist infection and the immunity to suppress inflammation caused by hyperimmunity can be enhanced.
  • One aspect of the present disclosure is an immune response control enhancer containing the above-mentioned bacteria as an active ingredient.
  • both innate immunity and anti-inflammatory action can be enhanced. That is, in the above aspect, both the immunity to resist infection and the immunity to suppress inflammation caused by hyperimmunity can be enhanced.
  • One aspect of the present disclosure is a preparation containing any of the above-mentioned bacteria or any of the above-mentioned IL10 gene expression enhancer as an active ingredient.
  • the above-mentioned embodiment is a preparation containing any of the above-mentioned bacteria or any of the above-mentioned IL10 gene expression enhancer as an active ingredient, it can be used as an anti-inflammatory agent.
  • the above-mentioned preparation can be used for pharmaceutical preparations, cosmetics, foods, beverages and the like.
  • One aspect of the present disclosure is a preparation containing any of the above-mentioned bacteria or any of the above-mentioned immune response control enhancer as an active ingredient.
  • the above-mentioned embodiment is a preparation containing any of the above-mentioned bacteria or any of the above-mentioned immune response control enhancer as an active ingredient, it can be used for further activating immune response control.
  • the above-mentioned preparation can be used for pharmaceutical preparations, foods, beverages and the like.
  • One aspect of the present disclosure is an external skin preparation containing the bacterium or the IL10 gene expression enhancer as an active ingredient.
  • the embodiment is a skin external preparation containing the bacterium or the IL10 gene expression enhancer as an active ingredient, it can be used as an anti-inflammatory agent. Further, more specifically, the above-mentioned aspect can be used as a care product in a delicate zone (female genital area), a postpartum care product, a gel product such as a skin care product, a cream product, a cosmetic liquid, or the like.
  • One aspect of the present disclosure is an external skin preparation containing the above-mentioned bacteria or the above-mentioned immune response control enhancing agent as an active ingredient.
  • the embodiment is a skin external preparation containing the bacterium or the immune response control enhancer as an active ingredient, it can be used for further activating immune response control. Further, the above aspect can be more specifically used as a gel product, a cream product, a liquid product or the like to be applied to an inflamed portion.
  • One aspect of the present disclosure is an oral preparation containing the above-mentioned bacteria or the above-mentioned IL10 gene expression enhancer as an active ingredient.
  • the embodiment is an oral preparation containing the bacterium or the IL10 gene expression enhancer as an active ingredient, it can be used as an anti-inflammatory agent. Further, more specifically, the above-mentioned embodiment can be used as tablets, powders, capsules, syrups, drinks and the like which are pharmaceuticals, foods, beverages and the like.
  • One aspect of the present disclosure is an oral preparation containing the above-mentioned bacteria or the above-mentioned immune response control enhancing agent as an active ingredient.
  • the embodiment is an oral preparation containing the bacterium or the immune response control enhancer as an active ingredient, it can be used for further activating immune response control. Further, more specifically, the above-mentioned embodiment can be used as tablets, powders, capsules, syrups, drinks and the like which are pharmaceuticals, foods, beverages and the like.
  • the expression of the IL10 gene can be enhanced. Further, according to the above aspect, the immune response control can be enhanced.
  • the gene expression level by the DL81 supernatant is shown, and the fraction (A) shows the CCR7 gene expression level, and the fraction (B) shows the CXCL2 gene expression level.
  • the expression level of Batf gene by DL81 supernatant is shown.
  • the gene expression level by the DL81 supernatant is shown, and the fraction (A) shows the CXCR4 gene expression level, and the fraction (B) shows the CCL22 gene expression level.
  • IL10 interleukin 10
  • IL10 interleukin 10
  • the embodiments exemplified below include a bacterium that enhances the gene expression of IL10, a supernatant obtained from the bacterium, a mixed solution containing the bacterium, and an IL10 gene expression enhancer using these. And the preparations such as external skin preparations and oral preparations using these.
  • the bacterium that enhances IL10 gene expression includes a bacterium belonging to the Lactobacillus coleohominis species, and DL81 strain is more preferable.
  • This DL81 strain was sent to the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary Center (2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture) with a trust number: NITE BP-03295 (domestic trust date: September 30, 2020). Japan, the date of receipt of the request for transfer to the international deposit under the Budapest Treaty: March 25, 2021) has been deposited internationally.
  • the 16S rRNA base sequence of this strain is shown in the sequence listing as SEQ ID NO: 1.
  • the species was identified by performing a homology search on the base sequence of the 16S rRNA gene with the sequence on the database, and the homology value was 98% or more. I understood.
  • the mycological characteristics of the DL81 strain are the same as those of Lactobacillus choreohominis.
  • the cells of the DL81 strain can be cultivated by a normal lactic acid bacterium culture method, and the cells and supernatant separated and purified by means such as centrifugation from the culture can be used.
  • the cells of the DL81 strain or the supernatant prepared from the cells are appropriately mixed with excipients, disintegrants, binders, stabilizers, wetting agents and the like to form tablets, granules, powders, capsules and solutions. It can be prepared as a preparation such as an external preparation for skin or an oral preparation as an agent, an emulsion, a cream or the like.
  • these preparations are used not only for the case of insufficient production of IL10 but also for the prevention or treatment of diseases caused by inflammatory diseases, autoimmune diseases, viral infections, tumors, etc., which do not correspond to such cases. be able to.
  • the collected liquid collected from the birth canal of a healthy pregnant woman was anaerobically cultured on BL agar medium (37 ° C. for 2 days), and the formed representative colonies were transferred to an MRS liquid medium for lactic acid bacilli and further anaerobically cultured (37 ° C.). After 2 days), glycerol was stocked at ⁇ 80 ° C. DNA was extracted from the bacteria stocked in this way and used for sequence analysis.
  • the colonies formed from each stocked strain are scraped off with a pipette tip, suspended in 50 ⁇ L of dH 2 O, 50 ⁇ L of 100 mM NaOH is added, mixed, and then left at 95 ° C. for 15 minutes. did. Then, 11 ⁇ L of 1M Tris-HCl (pH 7.0) was added, and after centrifugation, the supernatant was collected and used as a DNA solution.
  • a PCR amplification product to be used for sequence analysis was obtained using a Bacteria 16S rDNA PCR Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) according to the manufacturer's protocol.
  • PCR amplification product was subjected to agarose gel electrophoresis (100V, 30 minutes) to confirm that the desired amplification product was obtained, and then the manufacturer's protocol was followed by QIAquick PCR Purificatiuon Kit (manufactured by QIAGEN). , The PCR amplification product was purified from the PCR reaction solution.
  • the nucleotide sequence obtained from the sequence analysis of the PCR amplification product is edited using the sequence editing software AqE, and the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene of each colony is subjected to homology search with the sequence on the database to identify the species. did.
  • sequence editing software AqE There are two databases, NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) and DDBJ (http://blast.ddbj.nig.ac.jp/top-j.hyml). Two databases were used.
  • Lactobacillus crispatus Lactobacillus jensenii , Lactobacillus vaginalis , Lactobacillus faecalis, Lactobacillus faecalis , Lactobacillus faecalis, Lactobacillus faecalis, Lactobacillus faecalis -Plantarum ( Lactobacillus plantarum ), Lactobacillus rhamnosus , Lactobacillus coleohominis , and other unidentified bacteria belonging to the genus Lactobacillus were found.
  • the table below shows the sequence information of the primers used for the identification of the strain by PCR and the gene expression analysis by real-time PCR referred to in the following experiment.
  • reference a is Hepatitis B Virus Surface Antigen Selectively Inhibits TLR2 Ligand-Induced IL-12 Production in Monocytes / Macrophages by Interfering with JNK Activation
  • references b to d are published by OriGene. It is an array.
  • the THP-1 cell which is a cell line derived from human monocytes, is a cell line widely used in research in the field of immunity, and is known to induce macrophage-like differentiation by drug treatment.
  • THP-1 cells Since macrophage-like cells induced to differentiate from THP-1 cells show traits having both M1 type and M2 type characteristics, THP-1 cells are also used here, with a PMA concentration of 200 nM and a treatment time of 3 days. Macrophage-like cells induced to differentiate under the above conditions were used.
  • the five strains of Bifidobacterium genus used for comparison are Bifidobacterium longum JCM 1217 , Bifidobacterium bifidum JCM 1255 , Bifidobacterium adolescentis JCM 1275 , Bifidobacterium breve JCM 1192 , and Bifidobacterium longum subsp. Infantis JCM 1210, respectively.
  • the 11 strains of the genus Lactobacillus to be compared are Lactobacillus acidophilus JCM 2124 , Lactobacillus casei JCM 1134 , Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus JCM 20398 , Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei JCM 8130 , Lactobacillus . brevis JCM 1059 , Lactobacillus helveticus JCM 1120 , Lactobacillus plantarum JCM 11125 , Lactobacillus salivarius JCM 1040 , Lactobacillus rhamnosus JCM 1136 .
  • each of the above strains was anaerobically cultured in MRS liquid medium (37 ° C. for 2 days), the obtained culture solution was centrifuged (10,000 g, 5 minutes, room temperature), and the supernatant was collected. Then, the supernatant was clarified by removing bacterial cells and hybrids with a 0.22 ⁇ m syringe filter. Next, the clarified supernatant is ultra-filtered with Amicon-Ultra 0.5 3K (manufactured by Millipore) and concentrated 5 times, and the concentration is concentrated so that the concentrate is diluted 25 times. The solution was added to the culture solution of macrophage-like cells and left for 24 hours.
  • TOYOBO ReverseTra Ace qPCR RT Master Mix
  • the gene expression level was corrected using beta-actin as a reference gene, and the relative value calculated from the control gene expression level by the ⁇ Ct method was obtained and shown in the graph shown in FIG.
  • the vertical axis shows the relative value of the gene expression level of each strain.
  • MRS the control of the medium only
  • Bifidobacterium is the genus Bifidobacterium
  • Lactobacillus is the genus Lactobacillus
  • DL the bacterium peculiar to the birth canal (above).
  • 64 strains and the dots in the graph indicate the relative value of the gene expression level of each strain.
  • the bars in the graph show the average value of the relative values of the gene expression levels of the strains of each type.
  • the average value of the bacteria peculiar to the birth canal of the above 64 strains collected from the birth canal was compared with the average value of 5 strains of Bifidobacterium for comparison and the average value of 11 strains of Lactobacillus. It was found to significantly increase the expression of the IL10 gene. It was also found that among the 64 strains, there are many strains that increase the IL10 gene expression level by 10 times or more. Therefore, some of the bacteria peculiar to the birth canal enhance IL10 production from macrophages.
  • the display method of FIG. 2 is the same as that of FIG. 1, and the dots in the graph indicate the relative value of the TNFalpha gene expression level of each strain. In addition, the average value of the TNFalpha gene expression level of each strain is shown by a bar.
  • TNFalpha which is an inflammatory cytokine
  • TNFalpha is an inflammatory cytokine
  • the TNFalpha gene expression level was set on the vertical axis and the IL10 gene expression level was set on the horizontal axis, and the expression levels of both genes of each strain were plotted to draw an approximate curve, and the R2 value was calculated.
  • the result is shown in FIG.
  • the R2 value was very low at 0.011, and no correlation was observed between the expression levels of both genes.
  • the IL10 gene expression-enhancing effect of the 64 strains was not paraclinically increased by the increase in the TNFalpha gene expression level, but the IL10 gene expression by the macrophages was enhanced by the supernatant treatment of the 64 strains. it is conceivable that.
  • Each strain was anaerobically cultured in MRS liquid medium (37 ° C. for 2 days), and the number of bacteria was quantified by OD600. Further, the obtained culture solution was centrifuged (10,000 g, 5 minutes at room temperature), the supernatant was collected, and the cells and hybrids were removed with a 0.22 ⁇ m syringe filter to clarify the supernatant. Next, the clarified supernatant is ultra-filtered with Amicon-Ultra 0.5 3K (manufactured by Millipore) and concentrated 5 times, and the concentrate is concentrated 25 times so that the concentration is diluted 25 times. Was added to the culture medium of macrophage-like cells and left for 24 hours.
  • TOYOBO ReverseTra Ace qPCR RT Master Mix
  • the vertical axis of FIG. 4 shows the relative value of the gene expression level of each strain. Further, the horizontal axis shows the strain isolated from the birth canal, where "Ctrl" is the untreated condition and "MRS" is the condition treated with the MRS medium.
  • 13 strains shown in FIG. 4 other than DL72 and DL81 are as follows.
  • DL62, DL70, DL73, DL74, DL102, DL104 and DL106 were Lactobacillus crispatus
  • DL61, DL66, DL76, DL83 and DL154 were Lactobacillus gensenii, and DL77 could not be identified.
  • IL10 gene expression depends on the number of bacteria or other gene expression (TNFalpha or IL1beta) in the above 15 strains in which the degree of IL10 gene expression is increased 10 times or more. We examined these correlations.
  • FIG. 5 shows a graph in which the vertical axis represents the IL10 gene expression level and the horizontal axis represents the OD600 value.
  • FIG. 6 shows a graph in which the vertical axis represents the IL10 gene expression level and the horizontal axis represents the IL1beta gene expression level.
  • FIG. 7 shows a graph in which the vertical axis represents the IL10 gene expression level and the horizontal axis represents the TNFalpha gene expression level. In these graphs, each value was plotted to draw an approximate curve, and the R2 value was obtained.
  • the R2 value with the OD600 value was 0.37
  • the R2 value with the IL1beta gene expression level was 0.63
  • the R2 value with the TNFalpha gene expression level was 0.44. It was found that the correlation with the expression level was low.
  • the graph includes the condition that only the control and the MRS medium are used. From these results, there is no correlation between the effect on the IL10 gene expression level and the inflammatory cytokines that induce IL10 production such as IL1beta and TNFalpha. From this, it was found that the supernatant of the strain peculiar to the birth canal contains a metabolite that enhances IL10 production from macrophages.
  • the culture time of the DL81 strain and the expression variation of the IL10 gene were examined in order to obtain a supernatant showing a more enhancing effect.
  • TOYOBO ReverseTra Ace qPCR RT Master Mix
  • FIG. 8 shows the relationship between the culture time of the DL81 strain (24 hours, 48 hours, 72 hours) and the IL10 gene expression level
  • FIG. 9 shows the culture time of the DL81 strain (24 hours, 48 hours, 72 hours). The relationship between and the expression level of the TNFalpha gene was shown.
  • the IL10 gene expression in macrophage-like cells is enhanced by the culture supernatant treatment of DL81, it was examined whether the DL81 cell itself also has an IL10 gene expression enhancing effect. This is because the species to which DL81 belongs has abundant basic knowledge and reports, and its detailed properties are clear. Therefore, if the effect can be confirmed, it is also effective to use the cells themselves. Using Lactobacillus brevis JCM 1059 and Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei JCM 8130 as comparison targets, the IL10 gene expression-enhancing effect of DL81 cells was examined.
  • real-time PCR was performed with CFX ConnectTM Real-Time PCR Detection System (manufactured by Bio-Rad) using THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (manufactured by TOYOBO).
  • the reaction conditions for real-time PCR were initial denaturation at 98 ° C. for 1 minute, followed by 40 cycles of reaction at 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 30 seconds.
  • the gene expression level was corrected using beta-actin as a reference gene, the relative value calculated from the control gene expression level was obtained by the ⁇ Ct method, and the value was logarithically converted for comparative study.
  • the vertical axis represents the relative value of the IL10 gene expression level
  • the horizontal axis represents Lactobacillus brevis JCM 1059 as “LB”, Lactobacillus paracasei subsp.
  • Paracasei JCM 8130 as “LPP”, DL72 as “DL72”, and DL81. Is indicated by "DL81". From these results, all strains of DL81, DL72, Lactobacillus brevis JCM 1059 , and Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei JCM 8130 strongly enhanced IL10 gene expression, but Lactobacillus brevis JCM 1059 and Lactobacillus paracasei subsp.
  • Paracasei JCM 130 was found to have no effect of enhancing IL10 gene expression under the condition of 100-fold dilution, whereas DL81 and DL72 maintained the effect of enhancing IL10 gene expression even under the condition of 100-fold dilution. From this, it was confirmed that the cells of DL81 and DL72 also have an action of enhancing IL10 gene expression, and the action is higher than that of other lactic acid bacteria. Furthermore, DL81 was found to maintain the IL10 gene expression-enhancing effect even under the condition of 1000-fold dilution, and the result was that the IL10 gene expression-enhancing effect was significantly maintained even at a low concentration.
  • DL72, DL81, Lactobacillus brevis JCM 1059 (“LB”), Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei JCM 8130 (“LPP”) were each anaerobically cultured (37 ° C.) in MRS liquid medium for 72 hours, and the obtained culture was obtained.
  • the solution was centrifuged (10000 g, 5 minutes, room temperature), and after collecting the supernatant, cells and contaminants were removed with a 0.22 ⁇ m syringe filter to clarify the supernatant.
  • the clarified supernatant is ultra-filtered with Amicon-Ultra 0.5 3K (manufactured by Millipore) and concentrated 5 times, and the concentrate is concentrated 25 times so that the concentration is diluted 25 times.
  • TOYOBO ReverseTra Ace qPCR RT Master Mix
  • the gene expression level was corrected using beta-actin as a reference gene, the relative value calculated from the control gene expression level was obtained by the ⁇ Ct method, and the value was logarithically converted for comparative study.
  • the significance test with the MRS medium treatment conditions was performed by t-test, and when the p-value was 0.05 or less, it was determined that there was a significant difference.
  • the horizontal axis shows the experimental target strains Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei JCM 8130 (“LPP”), Lactobacillus brevis JCM 1059 (“LB”), DL72, and DL81, but “Ctrl” is an untreated condition.
  • MRS refers to the condition treated with MRS medium. From this, it is considered that DL72 and DL81 have a higher IL10 gene expression-enhancing effect than other lactic acid bacteria and have a high anti-inflammatory effect, and in particular, DL81 has a higher IL10 gene expression-enhancing effect than DL72. It is thought that it is.
  • the IL10 gene expression in the culture supernatant treatment of DL81 was also evaluated at the protein level.
  • Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei JCM 8130 (“LPP”), Lactobacillus brevis JCM 1059 (“LB”), DL72, and DL81 were anaerobically cultured in MRS liquid medium (37 ° C, 72 hours), and the obtained culture solution was used. After centrifuging (10000 g, 5 minutes, room temperature) and collecting the supernatant, cells and hybrids were removed with a 0.22 ⁇ m syringe filter for clarification. Next, the clarified supernatant is ultra-filtered with Amicon-Ultra 0.5 3K (manufactured by Millipore) and concentrated 5 times, and the concentrate is concentrated 25 times so that the concentration is diluted 25 times.
  • the vertical axis shows the relative value based on the amount of IL10 under the untreated condition, and the horizontal axis shows the experimental target strain Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei JCM 8130 (“LPP”), Lactobacillus brevis JCM 1059 . (“LB”), DL72, DL81 are shown, where “MRS” refers to those treated with MRS medium.
  • CCR7 and CXCL2 which are marker genes of M1 macrophages that control biological defense, are important in natural immunity.
  • Batf2 a transcription factor that promotes the expression of IL12, which has a role to play
  • CXCR4 and CCL22 which are marker genes for M2 macrophages that act anti-inflammatory.
  • Each of DL72 and DL81 was anaerobically cultured (37 ° C.) in MRS liquid medium for 72 hours, the obtained culture solution was centrifuged (10000 g, 5 minutes, room temperature), and after collecting the supernatant, a 0.22 ⁇ m syringe filter was used. The cells and hybrids were removed and clarified. Next, the clarified supernatant is ultra-filtered with Amicon-Ultra 0.5 3K (manufactured by Millipore) and concentrated 5 times, and the concentrated solution is diluted 25 times. Was added to the culture medium of macrophage-like cells and left for 24 hours.
  • TOYOBO ReverseTra Ace qPCR RT Master Mix
  • the gene expression level was corrected using beta-actin as a reference gene, the relative value calculated from the control gene expression level was obtained by the ⁇ Ct method, and the value was logarithically converted for comparative study.
  • Table 3 shows the sequence information of the primers used for the gene expression analysis by the above real-time PCR.
  • remark e in Table 3 indicates that each primer sequence of CCR7 or CXCR4 is a public sequence of OriGene
  • remark f indicates that the primer sequence of Batf2 is Decrease in invasion of HTR-8 / SVneotrophoblastic cells.
  • interferon gamma involves cross-communication of STAT1 and BATF2 that registers the expression of JUN. (S.Verma et al., Cell Adhesion & Migration, 2018).
  • primers mounted on PrimerArray Cytokine-cytokine receptor interaction (Human) of Takara Bio Inc. were used, but their sequence information has not been disclosed.
  • Soymilk-like medium (0.6% glucose, 0.5% yeast extract, defatted powdered milk) so that the inoculation weight is 0.1 wt% of the medium weight in the bacterial solution obtained by thawing the frozen DL81 bacteria.
  • the mixture was added to 8%, 7.7% soybean flour, 0.01% antifoaming agent, and residual water (each weight%) and cultured for 72 hours to adjust the pH to 4.5 to 5.5. Then, the obtained culture solution was centrifuged, the supernatant was collected, clarified, and further filtered to produce a 5-fold concentrated solution, which was used as the DL81 culture supernatant stock solution for producing various subsequent formulations.
  • the DL81 culture supernatant stock solution is added to a diluted solution containing 80 wt% distilled water, 10 wt% alcohol, and several wt% glycerin mixed with a fragrance, an emulsifier, and a preservative.
  • a lotion-like preparation was obtained so that the content was 4 wt%. Further, the content of glycerin was replaced with distilled water to obtain a liquid preparation.
  • This lotion-like preparation or liquid preparation can be applied as a care preparation for the skin and around the delicate zone by using it as it is as a lotion or a lotion.
  • the DL81 culture supernatant stock solution is added to a diluted solution containing 95 wt% soymilk, sweetener, sugar, etc., and the DL81 culture supernatant stock solution is 4 wt% of the total amount to obtain a drink. rice field.
  • This drink can be applied as a beverage to activate the body's immunity and improve the effect of protecting the body from the invasion of foreign enemies and foreign substances.
  • the DL81 culture supernatant stock solution is added to a cream containing petrolatum, olive oil, ethanol, and pigments with fragrances, emulsifiers, and preservatives so that the total amount of the DL81 culture supernatant stock solution is 4 wt%.
  • This cream-like preparation can be applied as a cream product as it is, as a care preparation for the skin and around the delicate zone. It can also be applied as an anti-inflammatory agent to be applied to an inflamed site.
  • the DL81 culture supernatant stock solution was added to starch and starch paste, and the mixture was molded so that the DL81 culture supernatant stock solution was 4 wt% of the total amount to obtain tablets.
  • This tablet can be applied as an oral preparation, a care preparation for skin diseases such as atopy, an anti-inflammatory preparation for trauma and digestive organs, and as an immunostimulatory agent for enhancing both anti-infection and anti-allergic immunity.
  • the above liquid preparation, lotion-like preparation, and cream preparation can be applied as a postpartum vaginal care preparation as an insertion agent into the vagina by encapsulating them in capsules. Further, it can be applied as an oral preparation, a care preparation for skin diseases such as atopy, an anti-inflammatory preparation for trauma and the digestive tract, and as an immunostimulatory agent for enhancing both anti-infection and anti-allergic immunity.
  • the bacterial solution obtained by thawing the cryopreserved DL81 bacteria was added to the MRS liquid medium so that the inoculation weight was 0.1 wt% of the medium weight and cultured for 72 hours, and the OD600 was adjusted to 4.5 to 5.0. did. Then, the obtained culture solution was centrifuged, the supernatant was discarded, and bacterial cell pellets were obtained. Then, the cell pellet was diluted with PBS to obtain a DL81 cell-containing solution for producing various subsequent preparations.
  • the DL81 cell-containing liquid contains live DL81 bacteria.
  • the DL81 cell-containing solution is added to a diluted solution containing 80 wt% distilled water, 10 wt% alcohol, and several wt% glycerin containing a fragrance, an emulsifier, and an antiseptic.
  • a lotion-like preparation was obtained so as to contain 1 ⁇ 10 8 to 5 ⁇ 10 9 pieces. Further, the content of glycerin was replaced with distilled water to obtain a liquid preparation.
  • This lotion-like preparation or liquid preparation can be applied as a care preparation for the skin and around the delicate zone by using it as a lotion or a lotion as it is.
  • the DL81 culture supernatant stock solution is added to a diluted solution containing 95 wt% soymilk, sweetener, sugar, etc., and the DL81 culture supernatant stock solution is 4 wt% of the total amount to obtain a drink. rice field.
  • This drink can be applied as a beverage to activate the body's immunity and improve the effect of protecting the body from the invasion of foreign enemies and foreign substances.
  • the DL81 cell-containing liquid is added to a cream containing petrolatum, olive oil, ethanol, and a pigment mixed with a fragrance, an emulsifier, and a preservative.
  • a creamy preparation was obtained so as to contain 9 pieces.
  • This cream-like preparation can be applied as a cream product as it is, as a care preparation for the skin and around the delicate zone. It can also be applied as an anti-inflammatory agent to be applied to an inflamed site.
  • the DL81 cell-containing liquid was added to starch and starch paste, and the mixture was molded so that 1 ⁇ 10 8 to 5 ⁇ 10 9 DL81 cells were contained in a total amount of 1 g to obtain a tablet.
  • This tablet can be applied as an oral preparation, a care preparation for skin diseases such as atopy, an anti-inflammatory preparation for trauma and digestive organs, and as an immunostimulatory agent for enhancing both anti-infection and anti-allergic immunity.
  • the above liquid preparation, lotion-like preparation, and cream preparation can be applied as a postpartum vaginal care preparation as an insertion agent into the vagina by encapsulating them in capsules. Further, it can be applied as an oral preparation, a care preparation for skin diseases such as atopy, an anti-inflammatory preparation for trauma and the inside of digestive organs, and an immunostimulatory agent for enhancing both anti-infection and anti-allergic immunity.
  • Liquid preparations Liquid preparations, lotion-like preparations, tablets, etc. Manufactured a capsule. More specifically, the contribution ratios of the DL81 culture supernatant stock solution and the DL81 cell-containing solution were determined, and the amount of each active ingredient was determined and blended according to the contribution ratio.

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Abstract

産道内菌叢から有益な細菌を見出し提供すること。 【解決手段】本開示の一態様は、ＩＬ１０遺伝子発現を亢進させる受託番号：NITE BP-03295として国際寄託されたラクトバチルス・コレオホミニス（Lactobacillus coleohominis）種に属するＤＬ８１菌株である細菌である。

Description

細菌、ＩＬ１０遺伝子発現亢進剤、免疫応答制御亢進剤、及び製剤
　本開示は、ラクトバチルス・コレオホミニスに属する細菌並びにその細菌を用いたインターロイキン１０（以下「ＩＬ１０」ともいう）遺伝子発現亢進剤並びにその細菌を用いた皮膚外用剤及び経口剤等の製剤に関する。
　妊婦による出産は自然の理であり病気ではなく、出産の際に産道が傷つくことがあっても直ぐに修復される。このように妊婦の産道には出産時に特異な機能を備えていると考えられるが、産道の疾患に関する研究及び情報はあるものの、健常人、とりわけ妊婦の産道に着目した研究及び情報はなかなか見つけることができなかった。産道炎症に関する商品、又は産道にも適用できる粘膜の治療薬が知られている。例えば、膣等の粘膜へも適用可能な治療薬に関する技術は特表２０１４－５１００９０号公報（特許文献１）に記載されている。
特表２０１４－５１００９０号公報
　しかしながら、上記のように妊婦の産道には傷を直ぐに修復できるような治癒力があり、これは妊婦における産道内菌叢によってもたらされるものではないかと本発明者らは推測し、産道内菌叢の研究を行った。本発明はこうした研究の成果として生まれたものである。
　本開示の一態様は、ＩＬ１０遺伝子発現を亢進させるデーデルライン桿菌である細菌である。前記態様は、ＩＬ１０遺伝子発現を亢進させるデーデルライン桿菌である細菌であるため、ＩＬ１０遺伝子の発現を亢進させることができるヒトの産道から取得できる細菌である。
　本開示の一態様は、前記デーデルライン桿菌が、ＩＬ１０遺伝子発現を亢進させる受託番号：NITE BP-03295として国際寄託されたラクトバチルス・コレオホミニス（Lactobacillus coleohominis)種に属するＤＬ８１菌株（細菌）である。
　前記態様によれば、前記デーデルライン桿菌が、ＩＬ１０遺伝子発現を亢進させる受託番号：NITE BP-03295として国際寄託されたラクトバチルス・コレオホミニス（Lactobacillus coleohominis)種に属するＤＬ８１菌株（細菌）であるため、ヒトの産道から取得できるラクトバチルス・コレオホミニス種に属する細菌が、ＩＬ１０遺伝子の発現を亢進させることができる。
　本開示の一態様は、ＩＬ１０遺伝子発現を亢進させるラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・ジェンセニイ(Lactobacillus jensenii)、ラクトバチルス・コレオホミニス(Lactobacillus coleohominis)の組合せからなる細菌である。
　前記態様は、ＩＬ１０遺伝子発現を亢進させるラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・ジェンセニイ(Lactobacillus jensenii)、ラクトバチルス・コレオホミニス(Lactobacillus coleohominis)の組合せからなる細菌としたため、ヒトの産道から取得できるラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・ジェンセニイ(Lactobacillus jensenii)、及びラクトバチルス・コレオホミニス(Lactobacillus coleohominis)の少なくとも何れかの種に属する菌株の組合せからなる細菌群が、ＩＬ１０遺伝子の発現を１０倍以上亢進させることができる。
　本開示の一態様は、上記細菌の培養上清を主成分として含有するＩＬ１０遺伝子発現亢進剤である。
　前記態様は、上記細菌の培養上清を主成分として含有するＩＬ１０遺伝子発現亢進剤であるため、ＩＬ１０遺伝子発現により、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染、腫瘍等による疾患を予防し、又は治療することができる。
　本開示の一態様は、上記細菌を有効成分として含有するＩＬ１０遺伝子発現亢進剤である。
　前記態様は、上記細菌を有効成分として含有するＩＬ１０遺伝子発現亢進剤であるため、ＩＬ１０遺伝子発現により、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染、腫瘍等による疾患を予防し、又は治療することができる。
　本開示の一態様は、上記細菌の培養上清を主成分として含有する免疫応答制御亢進剤である。
　前記態様は、上記細菌の培養上清を主成分として含有する免疫応答制御亢進剤であるため、自然免疫と抗炎症作用をともに亢進させることができる。即ち、前記態様では、感染に抵抗する免疫力と、過剰免疫で生じる炎症を抑える免疫力の双方を高めることができる。
　本開示の一態様は、上記細菌を有効成分として含有する免疫応答制御亢進剤である。
　前記態様は、上記細菌を有効成分として含有する免疫応答制御亢進剤としたため、自然免疫と抗炎症作用をともに亢進させることができる。即ち、前記態様では、感染に抵抗する免疫力と、過剰免疫で生じる炎症を抑える免疫力の双方を高めることができる。
　本開示の一態様は、上記何れかの細菌又は上記何れかのＩＬ１０遺伝子発現亢進剤を有効成分として含有する製剤である。
　前記態様は、上記何れかの細菌又は上記何れかのＩＬ１０遺伝子発現亢進剤を有効成分として含有する製剤であるため、抗炎症作用剤として利用することができる。例えば前記製剤は、医薬製剤、化粧品、食品、飲料等に利用できる。
　本開示の一態様は、上記何れかの細菌又は上記何れかの免疫応答制御亢進剤を有効成分として含有する製剤である。
　前記態様は、上記何れかの細菌又は上記何れかの免疫応答制御亢進剤を有効成分として含有する製剤であるため、免疫応答制御をより賦活化させる用途に利用することができる。例えば前記製剤は、医薬製剤、食品、飲料等に利用できる。
　本開示の一態様は、上記細菌又は上記ＩＬ１０遺伝子発現亢進剤を有効成分として含有する皮膚外用剤である。
　前記態様は、上記細菌又は上記ＩＬ１０遺伝子発現亢進剤を有効成分として含有する皮膚外用剤であるため、抗炎症作用剤として利用することができる。さらに前記態様は、より具体的にはデリケートゾーン（female genital area）のケア製品、産後のケア製品、又はスキンケア製品等のジェル製品、クリーム製品、化粧液等として利用することができる。
　本開示の一態様は、上記細菌又は上記免疫応答制御亢進剤を有効成分として含有する皮膚外用剤である。
　前記態様は、上記細菌又は上記免疫応答制御亢進剤を有効成分として含有する皮膚外用剤であるため、免疫応答制御をより賦活化させる用途に利用することができる。さらに前記態様は、より具体的には炎症を生じた箇所へ塗布するジェル製品、クリーム製品、液状製品等として利用することができる。
　本開示の一態様は、上記細菌又は上記ＩＬ１０遺伝子発現亢進剤を有効成分として含有する経口剤である。
　前記態様は、上記細菌又は上記ＩＬ１０遺伝子発現亢進剤を有効成分として含有する経口剤であるため、抗炎症作用剤として利用することができる。さらに前記態様は、より具体的には医薬品、食品、飲料等となる錠剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、ドリンク剤等として利用することができる。
　本開示の一態様は、上記細菌又は上記免疫応答制御亢進剤を有効成分として含有する経口剤である。
　前記態様は、上記細菌又は上記免疫応答制御亢進剤を有効成分として含有する経口剤であるため、免疫応答制御をより賦活化させる用途に利用することができる。さらに前記態様は、より具体的には医薬品、食品、飲料等となる錠剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、ドリンク剤等として利用することができる。
　前記態様によれば、ＩＬ１０遺伝子の発現を亢進させることができる。また、前記態様によれば、免疫応答制御を亢進させることができる。
各菌種の菌株ごとにＩＬ１０遺伝子発現量を比較して示す図である。 各菌種の菌株ごとにＴＮＦａｌｐｈａ遺伝子発現量を比較して示す図である。 ＤＬ菌のＴＮＦａｌｐｈａ遺伝子発現量とＩＬ１０遺伝子発現量の相関を示す図である。 ＤＬ菌の菌株ごとにＩＬ１０遺伝子発現量を比較して示す図である。 ＤＬ菌１６菌株に基づくＯＤ６００値とＩＬ１０遺伝子発現量の相関を示す図である。 ＤＬ菌１６菌株に基づくＩＬ１ｂｅｔａ遺伝子発現量とＩＬ１０遺伝子発現量の相関を示す図である。 ＤＬ菌１６菌株に基づくＴＮＦａｌｐｈａ遺伝子発現量とＩＬ１０遺伝子発現量の相関を示す図である。 ＤＬ８１の培養時間とＩＬ１０遺伝子発現量との関係を示す図である。 ＤＬ８１の培養時間とＴＮＦａｌｐｈａ遺伝子発現量との関係を示す図である。 ＤＬ８１と他の菌株のＩＬ１０遺伝子発現量の相対値を示す図である。 ＤＬ８１と他の菌株のＩＬ１０遺伝子発現量を示す図である。 ＤＬ８１のＩＬ１０産生量の倍率変化（Fold-change）を示す図である。 ＤＬ８１上清による遺伝子発現量を示し、分図（Ａ）は、ＣＣＲ７遺伝子発現量を、分図（Ｂ）はＣＸＣＬ２遺伝子発現量をそれぞれ示す。 ＤＬ８１上清によるＢａｔｆ遺伝子発現量を示す。 ＤＬ８１上清による遺伝子発現量を示し、分図（Ａ）は、ＣＸＣＲ４遺伝子発現量を、分図（Ｂ）はＣＣＬ２２遺伝子発現量をそれぞれ示す。
　抗炎症サイトカインであるインターロイキン１０（以下「ＩＬ１０」という）の遺伝子発現を亢進する実施形態について詳しく説明する。以下に例示する実施形態は、より具体的には、ＩＬ１０の遺伝子発現を亢進する細菌と、この細菌から得られる上清と、この細菌を含む混合液と、これらを用いたＩＬ１０遺伝子発現亢進剤と、これらを用いた皮膚外用剤及び経口剤等の製剤である。
　好適な実施形態において、ＩＬ１０遺伝子発現を亢進する細菌にはラクトバチルス・コレオホミニス（Lactobacillus coleohominis）種に属する細菌が挙げられ、特にＤＬ８１株がより好適に挙げられる。このＤＬ８１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に、受託番号：NITE BP-03295（国内受託日：2020年9月30日、ブダペスト条約に基づく国際寄託への移管請求の受領日：2021年3月25日）として国際寄託されている。また、この菌株の１６Ｓ　ｒＲＮＡ塩基配列を配列番号１として配列表に示す。
　ＤＬ８１株については、その１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列をデータベース上の配列と相同性検索を行って種を同定したところ、相同値が９８％以上であったラクトバチルス・コレオホミニス種に属する菌株であることがわかった。なお、ＤＬ８１株の菌学的特徴は、ラクトバチルス・コレオホミニスの菌学的特徴と同じである。
　ＤＬ８１株の菌体は、通常の乳酸菌培養の手法によって培養することができ、培養物からの遠心分離等の手段によって分離、精製した菌体及び上清を利用することができる。
　ＤＬ８１株の菌体、又は菌体から調製した上清は、賦形剤、崩壊剤、結合剤、安定化剤、湿潤剤等と適宜混合して、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、溶液剤、乳剤、クリーム等として、皮膚外用剤や経口剤等の製剤として調製することができる。
　そしてこれらの製剤は、抗炎症作用剤として、ＩＬ１０の産生不足による場合のみならず、そうした場合に該当しない炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染、腫瘍等による疾患を予防し、又は治療に用いることができる。
　実験１：＜産道内に特有の細菌の取得＞
　健常妊婦の産道内から採取した採取液をＢＬ寒天培地にて嫌気培養（３７℃、２日間）し、形成された代表的なコロニーを乳酸桿菌用のＭＲＳ液体培地に移してさらに嫌気培養（３７℃、２日間）した後、－８０℃下でグリセロールストックした。このようにしてストックした細菌からＤＮＡを抽出し、シーケンス解析に供した。
　より具体的には、ストックしていた各菌株から形成されるコロニーをピペットチップで掻き取り、ｄＨ２Ｏ　５０μＬに懸濁し、１００ｍＭのＮａＯＨを５０μＬ添加して、混合後、９５℃で１５分間放置した。その後、１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を１１μＬ添加し、遠心後、上清を回収してＤＮＡ液とした。得られたＤＮＡ液をテンプレートに、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　１６Ｓ　ｒＤＮＡ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、メーカーのプロトコールに従って、シーケンス解析に供するＰＣＲ増幅産物を得た。
　ＰＣＲ増幅産物の一部をアガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、３０分間）に供し、目的とする増幅産物が得られているのかを確認した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｕｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）によってメーカーのプロトコール従って、ＰＣＲ反応液からＰＣＲ増幅産物の精製を行なった。
　ＰＣＲ増幅産物のシーケンス解析から得られた塩基配列を、配列編集ソフトのＡｑＥを用いて編集を行い、各コロニーの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列をデータベース上の配列と相同性検索を行って種を同定した。データベースとしては、ＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)とＤＤＢＪ(http://blast.ddbj.nig.ac.jp/top-j.hyml)の２つのデータベースを用いた。結果として、ラクトバチルス・クリスパタス(Lactobacillus crispatus)、ラクトバチルス・ジェンセニイ(Lactobacillus jensenii)、ラクトバチルス・ヴァギナリス(Lactobacillus vaginalis)、ラクトバチルス・フェカリス(Lactobacillus faecalis)、ラクトバチルス・ガセリ(Lactobacillus gasseri)、ラクトバチルス・プランタラム (Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・コレオホミニス(Lactobacillus coleohominis)、その他未同定のラクトバチルス属に属する細菌が認められた。
　ＰＣＲによる菌株の同定と、以下の実験で言及するリアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現解析とに用いたプライマーの配列情報を、以下の表に示す。なお表中、参考文献ａは、Hepatitis B Virus Surface Antigen Selectively Inhibits TLR2 Ligand-Induced IL-12 Production in Monocytes/ Macrophages by Interfering with JNK Activationであり、参考文献ｂ～ｄは、ＯｒｉＧｅｎｅ社で公開している配列である。また、各プライマーの特異性はNCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)によって解析して確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実験２：＜ＩＬ１０遺伝子発現＞
　産道内に特有な細菌の代謝産物における抗炎症サイトカインＩＬ１０遺伝子の発現に対する作用を検討した。
　産道内から取得した上記菌株のうち、産道内に特有の細菌であるデーデルライン桿菌（ＤＬ菌）６４菌株と、比較対象としてプロバイオティクスで有用とされるビフィドバクテリウム属５菌株、及びラクトバチルス属の１１菌株について、マクロファージ様細胞を標的にＩＬ１０遺伝子発現量への影響を調べた。なお、ヒト単球由来の細胞株であるＴＨＰ－１細胞は広く免疫分野の研究で用いられている細胞株であり、薬剤処理によってマクロファージ様に分化誘導することが知られている。ＴＨＰ－１細胞から分化誘導させたマクロファージ様細胞は、Ｍ１型とＭ２型の特徴を併せ持った形質を示すことから、ここでもＴＨＰ－１細胞を用い、ＰＭＡ濃度を２００ｎＭ、処理時間を３日間とした条件で分化誘導させたマクロファージ様細胞を用いた。
　比較対象に用いたビフィドバクテリウム属の５菌株はそれぞれ、Bifidobacterium longum JCM 1217、Bifidobacterium bifidum JCM 1255、Bifidobacterium adolescentis JCM 1275、Bifidobacterium breve JCM 1192、Bifidobacterium longum subsp. infantis JCM1210である。
　また、比較対象のラクトバチルス属の１１菌株は、Lactobacillus acidophilus JCM 2124、Lactobacillus casei JCM 1134、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus JCM 20398、Lactobacillus paracasei subsp. paracasei JCM 8130、Lactobacillus delbrueckii JCM 1012、Lactobacillus gasseri JCM 5344、Lactobacillus brevis JCM 1059、Lactobacillus helveticus JCM 1120、Lactobacillus plantarum JCM 11125、Lactobacillus salivarius JCM 1040、Lactobacillus rhamnosus JCM 1136である。
　上記菌株について、それぞれＭＲＳ液体培地にて嫌気培養（３７℃、２日間）し、得られた培養液を遠心（１０、０００ｇ、５分間、室温）し、上清を回収した。その後、上清は、０．２２μｍシリンジフィルターで菌体や交雑物の除去を行い清澄化させた。次に、清澄化した上清は、Ａｍｉｃｏｎ－Ｕｌｔｒａ　０．５　３Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）によって限外濾過して５倍濃縮させ、その濃縮液が２５倍希釈される濃度になるように、その濃縮液をマクロファージ様細胞の培養液へ添加して２４時間放置した。
　上清濃縮液を処理したマクロファージ様細胞から、ＩＳＯＧＥＮ　ＩＩ（日本ジーン社製）によってＲＮＡを抽出し、ＡｃｃｕＲＴ　ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ　Ｒｅｍｏｖａｌ　Ｋｉｔ（ａｂｍ社製）でゲノムＤＮＡを除去した後、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　ｑＰＣＲ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社製）で逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。これをテンプレートにＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、ＣＦＸ　ＣｏｎｎｅｃｔＴＭ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）でリアルタイムＰＣＲを実施した。リアルタイムＰＣＲの反応条件は、９８℃・１分間で初期変性させた後、９５℃・１５秒、６０℃・３０秒を４０サイクル反応させた。遺伝子発現の定量は、リファレンス遺伝子としてｂｅｔａ－ａｃｔｉｎを用いて遺伝子発現量を補正し、ΔΔＣｔ法によってコントロールの遺伝子発現量から算出した相対値を求め、図１で示すグラフに表した。
　図１において、縦軸に各菌株の遺伝子発現量の相対値を示す。横軸については、「ＭＲＳ」が培地のみのコントロールであり、「Bifidobacterium」がビフィドバクテリウム属であり、「Lactobacillus」がラクトバチルス属であり、「ＤＬ」が産道内に特有の細菌（上記６４菌株）であって、グラフ中のドットが各菌株の遺伝子発現量の相対値を示す。また、グラフ中のバーは、各種ごとの菌株の遺伝子発現量の相対値の平均値を示した。その結果、産道内から採取した上記６４菌株の産道内特有の細菌の平均値は、比較のためのビフィドバクテリウム属５菌株の平均値、及びラクトバチルス属１１菌株の平均値と比較してＩＬ１０遺伝子の発現を有意に上昇させることが見出された。また、６４菌株の中にはＩＬ１０遺伝子発現量を１０倍以上に上昇させる菌株が多く存在していることもわかった。こうしたことから、産道内に特有の細菌のいくつかは、マクロファージからのＩＬ１０産生を亢進させる。
　実験３：＜ＴＮＦａｌｐｈａ遺伝子発現＞
　産道内に特有な細菌の代謝産物におけるＴＮＦａｌｐｈａ遺伝子の発現に対する作用を検討した。
　ＩＬ１０遺伝子の発現に対する実験と同様に、上記産道内に特有の６４菌株と、比較対象としてプロバイオティクスで有用とされるビフィドバクテリウム属５菌株、及びラクトバチルス属の１１菌株を用い、マクロファージ様細胞を標的に炎症性サイトカインであるＴＮＦａｌｐｈａの遺伝子発現量への影響を上記と同様にして調べた。その結果を図２で示すグラフに表した。
　図２の表示の方法も図１と同様であり、グラフ中のドットは、各菌株のＴＮＦａｌｐｈａ遺伝子発現量の相対値を示す。また、各種ごとの菌株のＴＮＦａｌｐｈａ遺伝子発現量の平均値をバーで示した。
　炎症性サイトカインであるＴＮＦａｌｐｈａの遺伝子発現については、ビフィドバクテリウム属５菌株、及びラクトバチルス属１１菌株と比較して、産道内特有の細菌６４種について、有意な差異は見られなかった。しかしながら、前記６４種のうちのいくつかの菌株については、コントロールと比較してＴＮＦａｌｐｈａの遺伝子発現を１０倍程度上昇させる菌株も認められたことから、ＴＮＦａｌｐｈａの遺伝子発現上昇によってパラクライン的にＩＬ１０遺伝子発現が引き起こされた可能性も考えられた。
　実験４：＜ＩＬ１０遺伝子発現とＴＮＦａｌｐｈａ遺伝子発現の相関＞
　産道内から取得した６４菌株によるＩＬ１０遺伝子発現量とＴＮＦａｌｐｈａ遺伝子発現量との相関を調べた。縦軸にＴＮＦａｌｐｈａ遺伝子発現量を、横軸にＩＬ１０遺伝子発現量に設定して、各菌株の両遺伝子発現量をプロットして近似曲線を描写し、Ｒ２値を算出した。その結果を図３で示す。Ｒ２値は０．０１１と非常に低く、両遺伝子発現量に相関関係は認められなかった。従って上記６４菌株に関するＩＬ１０遺伝子発現亢進作用について、ＴＮＦａｌｐｈａ遺伝子発現量上昇によってパラクライン的にＩＬ１０遺伝子発現量が上昇したものではなく、上記６４菌株の上清処理によってマクロファージによるＩＬ１０遺伝子発現が亢進したものと考えられる。
　実験５：＜ＩＬ１０遺伝子の発現を上昇させる菌株の探索＞
　上記実験２において、産道内特有の６４菌株の中には、その上清処理において１０倍以上にＩＬ１０遺伝子発現を上昇させた菌株もみつかったことから、その１０倍以上にＩＬ１０遺伝子発現を上昇させた１５株を対象にして、菌個体レベルでＩＬ１０遺伝子発現を亢進させる代謝産物を菌数に依存せずにより多く産生する有用な菌株の探索を行った。
　各菌株をそれぞれＭＲＳ液体培地にて嫌気培養（３７℃、２日間）し、ＯＤ６００による菌数定量を行った。また、得られた培養液を遠心（１０、０００ｇ、５分間、室温）し、上清を回収後、０．２２μｍシリンジフィルターで菌体や交雑物の除去を行い清澄化させた。次に、清澄化した上清はＡｍｉｃｏｎ－Ｕｌｔｒａ　０．５　３Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）によって限外濾過して５倍濃縮し、その濃縮液が２５倍希釈される濃度になるように、その濃縮液をマクロファージ様細胞の培養液へ添加して２４時間放置した。上清濃縮液を処理したマクロファージ様細胞から、ＩＳＯＧＥＮ　ＩＩ（日本ジーン社製）によってＲＮＡを抽出し、ＡｃｃｕＲＴ　ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ　Ｒｅｍｏｖａｌ　Ｋｉｔ（ａｂｍ社製）でゲノムＤＮＡを除去した後、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　ｑＰＣＲ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社製）で逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。これをテンプレートにＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、ＣＦＸ　ＣｏｎｎｅｃｔＴＭ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）でリアルタイムＰＣＲを実施した。リアルタイムＰＣＲの反応条件は、９８℃・１分間で初期変性させた後、９５℃・１５秒、６０℃・３０秒を４０サイクル反応させた。遺伝子発現の定量は、リファレンス遺伝子としてｂｅｔａ－ａｃｔｉｎを用いて遺伝子発現量を補正し、ΔΔＣｔ法によってコントロールの遺伝子発現量から算出した相対値を求め、図４で示すグラフに表した。なお、図４の縦軸には各菌株の遺伝子発現量の相対値を示す。また、横軸には産道から単離した株を示すが、「Ｃｔｒｌ」は未処理の条件であり、「ＭＲＳ」は、ＭＲＳ培地で処理した条件でのものを示す。
　図４で示すように、ＤＬ７２とＤＬ８１として示した菌株においては、ＩＬ１０遺伝子発現に対する優れた亢進性が認められた。上記シーケンス解析及びＰＣＲによれば、相同値が９８％以上となり、ＤＬ７２は、ラクトバチルス・クリスパタスであり、これをＤＬ７２と名付けたものである。また、ＤＬ８１は、ラクトバチルス・コレオホミニス(Lactobacillus coleohominis)であり、これをＤＬ８１と名付けたものである。
　また、全１５菌株のうち、ＤＬ７２とＤＬ８１以外の図４で示す１３菌株は、次のとおりである。ＤＬ６２、ＤＬ７０、ＤＬ７３、ＤＬ７４、ＤＬ１０２、ＤＬ１０４及びＤＬ１０６は、ラクトバチルス・クリスパタスであり、ＤＬ６１、ＤＬ６６、ＤＬ７６、ＤＬ８３及びＤＬ１５４は、ラクトバチルス・ジェンセニイであり、ＤＬ７７は、同定できなかった。
　実験６：＜ＩＬ１０遺伝子発現を亢進する産道内特有１５菌株に基づくＩＬ１０遺伝子発現と他の因子との相関＞
　ＩＬ１０遺伝子発現の程度を１０倍以上に上昇させた上記１５株において、ＩＬ１０遺伝子発現上昇が細菌数に依存したものか、また他の遺伝子発現（ＴＮＦａｌｐｈａ又はＩＬ１ｂｅｔａ）に依存したものかを確認するために、これらの相関について検討した。
　図５には、縦軸をＩＬ１０遺伝子発現量、横軸をＯＤ６００値としたグラフを示す。図６には、縦軸をＩＬ１０遺伝子発現量、横軸をＩＬ１ｂｅｔａ遺伝子発現量としたグラフを示す。そして、図７には、縦軸をＩＬ１０遺伝子発現量、横軸をＴＮＦａｌｐｈａ遺伝子発現量としたグラフを示す。これらのグラフにおいて、各値をプロットして近似曲線を描写し、Ｒ２値を求めた。その結果、ＯＤ６００値とのＲ２値は０．３７、ＩＬ１ｂｅｔａ遺伝子発現量とのＲ２値は０．６３、ＴＮＦａｌｐｈａ遺伝子発現量とのＲ２値は０．４４であり、どの因子もＩＬ１０遺伝子発現量との相関性は低いことがわかった。なお、図６及び図７では、２遺伝子間の発現での相関性を比べているため、コントロールとＭＲＳ培地のみとした条件も加えたグラフとしている。これらの結果から、菌数ではなく各菌株の代謝産生量の違いによってＩＬ１０遺伝子発現量への作用が異なること、そして、ＩＬ１ｂｅｔａやＴＮＦａｌｐｈａといったＩＬ１０産生を誘導する炎症性サイトカインとの相関も見られないことから、産道内特有の菌株の上清には、マクロファージからのＩＬ１０産生を亢進させる代謝産物が含まれていることがわかった。
　実験７：＜ＤＬ８１の培養時間とＩＬ１０遺伝子発現との関係＞
　ＤＬ８１の培養上清処理によってマクロファージ様細胞におけるＩＬ１０遺伝子発現が亢進されることから、より亢進作用を示す上清を得るために、ＤＬ８１菌株の培養時間とＩＬ１０遺伝子の発現変動を検討した。
　ＭＲＳ液体培地にて嫌気培養（３７℃）で２４、４８、７２時間培養し、得られた培養液を遠心（１０、０００ｇ、５分間、室温）し、上清を回収後、０．２２μｍシリンジフィルターで菌体や交雑物の除去を行い清澄化させた。次に、清澄化した上清はＡｍｉｃｏｎ－Ｕｌｔｒａ　０．５　３Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）によって限外濾過して５倍濃縮させ、その濃縮液が２５倍希釈される濃度になるように、その濃縮液をマクロファージ様細胞の培養液へ添加して２４時間放置した。上清濃縮液を処理したマクロファージ様細胞から、ＩＳＯＧＥＮ　ＩＩ（日本ジーン社製）によってＲＮＡを抽出し、ＡｃｃｕＲＴ　ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ　Ｒｅｍｏｖａｌ　Ｋｉｔ（ａｂｍ社製）でゲノムＤＮＡを除去した後、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　ｑＰＣＲ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社製）で逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。これをテンプレートにＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、ＣＦＸ　ＣｏｎｎｅｃｔＴＭ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）でリアルタイムＰＣＲを実施した。リアルタイムＰＣＲの反応条件は、９８℃・１分間で初期変性させた後、９５℃・１５秒、６０℃・３０秒を４０サイクル反応させた。遺伝子発現の定量は、リファレンス遺伝子としてｂｅｔａ－ａｃｔｉｎを用いて遺伝子発現量を補正し、ΔΔＣｔ法によってコントロールの遺伝子発現量から算出した相対値を求めた。そして、図８にはＤＬ８１菌株の培養時間（２４時間、４８時間、７２時間）とＩＬ１０遺伝子発現量との関係を、図９にはＤＬ８１菌株の培養時間（２４時間、４８時間、７２時間）とＴＮＦａｌｐｈａ遺伝子発現量との関係をそれぞれ示した。
　その結果、図８で示すように、培養時間に依存的にＩＬ１０遺伝子発現量は有意に増加したのに対し、図９で示すように、ＴＮＦａｌｐｈａについては培養時間に対して大きな差異は認められなかった。これらの結果から、ＩＬ１０遺伝子発現上昇をさせる代謝産物は培養時間によって依存することが示唆された。
　実験８：＜ＤＬ８１の菌体からのＩＬ１０遺伝子発現＞
　ＤＬ８１の培養上清処理によってマクロファージ様細胞におけるＩＬ１０遺伝子発現が亢進されることから、ＤＬ８１菌体そのものにもＩＬ１０遺伝子発現亢進作用を有するのかについて検討を行なった。ＤＬ８１が属する種は、基礎的な知見や報告が豊富にあり、詳細な性状が明確であるため、効果が確認できれば菌体自体での使用も有効であるからである。比較対象としてLactobacillus brevis JCM 1059とLactobacillus paracasei subsp. paracasei JCM 8130を用いて、ＤＬ８１の菌体によるＩＬ１０遺伝子発現亢進作用の検討を実施した。
　ＭＲＳ液体培地にて７２時間、嫌気培養（３７℃）し、得られた培養液を遠心（１００００ｇ、５分間、室温）後、上清を廃棄し、ＰＢＳを加えて遠心して上清を除去することで菌体ペレットを得た。得られた菌体ペレットをＰＢＳで懸濁して菌体液を作製した。この菌体液の一部を測り取り、ＯＤ６００値が０．９～１．２の各菌体ペレットを準備し、細胞用培養液（ＲＰＭＩ　１６４０、２ｍＭ　Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１０％　Ｆｏｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ）で懸濁し、これを基準とした３段階の１０倍希釈系列を調製してマクロファージ様細胞に添加処理を行なった。２４時間後、マクロファージ様細胞から、ＩＳＯＧＥＮ　ＩＩ（日本ジーン社製）によってＲＮＡを抽出し、ＡｃｃｕＲＴ　ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ　Ｒｅｍｏｖａｌ　Ｋｉｔ（ａｂｍ社製）でゲノムＤＮＡを除去した後、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　ｑＰＣＲ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社製）で逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。
　これをテンプレートにＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、ＣＦＸ　ＣｏｎｎｅｃｔＴＭ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）でリアルタイムＰＣＲを実施した。リアルタイムＰＣＲの反応条件は、９８℃・１分間で初期変性させた後、９５℃・１５秒、６０℃・３０秒を４０サイクル反応させた。遺伝子発現の定量は、リファレンス遺伝子としてｂｅｔａ－ａｃｔｉｎを用いて遺伝子発現量を補正し、ΔΔＣｔ法によってコントロールの遺伝子発現量から算出した相対値を求め、その値を対数変換し比較検討を行なった。
　これらの結果を図１０に示す。図１０では縦軸にＩＬ１０遺伝子発現量の相対値を、横軸にはLactobacillus brevis JCM 1059 を「ＬＢ」で、Lactobacillus paracasei subsp. paracasei JCM 8130 を「ＬＰＰ」で、ＤＬ７２を「ＤＬ７２」で、ＤＬ８１を「ＤＬ８１」で示している。これらの結果から、ＤＬ８１、ＤＬ７２、Lactobacillus brevis JCM 1059、及びLactobacillus paracasei subsp. paracasei JCM 8130の何れの菌株もＩＬ１０遺伝子発現を強く亢進させたが、Lactobacillus brevis JCM 1059とLactobacillus paracasei subsp. paracasei JCM 8130については、１００倍に希釈した条件からＩＬ１０遺伝子発現亢進の作用がなくなるのに対し、ＤＬ８１やＤＬ７２では、１００倍希釈された条件でもＩＬ１０遺伝子発現亢進の作用を維持していることが認められた。このことから、ＤＬ８１やＤＬ７２の菌体にもＩＬ１０遺伝子発現を亢進させる作用を有しており、その作用は他の乳酸菌よりも高いことが認められた。さらにＤＬ８１では、１０００倍希釈された条件でもＩＬ１０遺伝子発現亢進作用を維持していることが認められ、低濃度でも有意にＩＬ１０遺伝子発現亢進作用を維持する結果となった。
　実験９：＜ＤＬ８１とラクトバチルス２株の培養上清によるＩＬ１０遺伝子発現亢進の比較＞
　ＤＬ８１の培養上清処理によってマクロファージ様細胞におけるＩＬ１０遺伝子発現が亢進されたことから、抗炎症作用が知られているLactobacillus brevisとLactobacillus paracasei subsp. paracaseiを比較対象にＤＬ８１によるＩＬ１０遺伝子発現亢進の優位性を検討した。
　ＤＬ７２、ＤＬ８１、Lactobacillus brevis JCM 1059（「ＬＢ」）、Lactobacillus paracasei subsp. paracasei JCM 8130（「ＬＰＰ」）のそれぞれを、ＭＲＳ液体培地にて７２時間、嫌気培養（３７℃）し、得られた培養液を遠心（１００００ｇ、５分間、室温）し、上清を回収後、０．２２μｍシリンジフィルターで菌体や交雑物の除去を行い清澄化させた。次に、清澄化した上清はＡｍｉｃｏｎ－Ｕｌｔｒａ　０．５　３Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）によって限外濾過して５倍濃縮させ、その濃縮液が２５倍希釈される濃度になるように、その濃縮液をマクロファージ様細胞の培養液へ添加して２４時間放置した。
　上清濃縮液を処理したマクロファージ様細胞から、ＩＳＯＧＥＮ　ＩＩ（日本ジーン社製）によってＲＮＡを抽出し、ＡｃｃｕＲＴ　ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ　Ｒｅｍｏｖａｌ　Ｋｉｔ（ａｂｍ社製）でゲノムＤＮＡを除去した後、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　ｑＰＣＲ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社製）で逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。これをテンプレートにＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、ＣＦＸ　ＣｏｎｎｅｃｔＴＭ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）でリアルタイムＰＣＲを実施した。リアルタイムＰＣＲの反応条件は、９８℃・１分間で初期変性させた後、９５℃・１５秒、６０℃・３０秒を４０サイクル反応させた。遺伝子発現の定量は、リファレンス遺伝子としてｂｅｔａ－ａｃｔｉｎを用いて遺伝子発現量を補正し、ΔΔＣｔ法によってコントロールの遺伝子発現量から算出した相対値を求め、その値を対数変換し比較検討を行った。また、ＭＲＳ培地処理条件との有意差検定はｔ検定によって行い、ｐ値が０．０５以下の場合を有意差があるとして判定した。
　その結果、Lactobacillus brevis JCM 1059（「ＬＢ」）及びLactobacillus paracasei subsp. paracasei JCM 8130（「ＬＰＰ」）のどちらの培養上清もＩＬ１０遺伝子発現を亢進させる傾向は見られたものの、ＭＲＳ培地処理条件との間に有意差は認められなかったのに対し、ＤＬ７２やＤＬ８１では、ＭＲＳ培地処理条件に対して有意差が認められ、ＩＬ１０遺伝子発現の亢進作用がLactobacillus brevis JCM 1059（「ＬＢ」）及びLactobacillus paracasei subsp. paracasei JCM 8130（「ＬＰＰ」）よりも高いことが示された。その結果を図１１に示す。なお、図１１では縦軸には各菌株の遺伝子発現量の相対値を示す。また、横軸には実験対象株であるLactobacillus paracasei subsp. paracasei JCM 8130（「ＬＰＰ」）、Lactobacillus brevis JCM 1059（「ＬＢ」）、ＤＬ７２、及びＤＬ８１を示すが、「Ｃｔｒｌ」は未処理の条件であり、「ＭＲＳ」は、ＭＲＳ培地で処理した条件でのものを示す。このことから、ＤＬ７２やＤＬ８１は、他の乳酸菌よりも優位にＩＬ１０遺伝子発現を亢進させ、高い抗炎症作用を有するものと考えられ、特にＤＬ８１はＤＬ７２よりもさらに高いＩＬ１０遺伝子発現亢進作用を有していると考えられる。
　実験１０：＜ＤＬ８１培養上清によるタンパク質レベルでのＩＬ１０遺伝子発現亢進＞
　ＤＬ８１の培養上清処理におけるＩＬ１０遺伝子発現に関して、タンパク質レベルでの評価も行った。
　Lactobacillus paracasei subsp. paracasei JCM 8130（「ＬＰＰ」）、Lactobacillus brevis JCM 1059（「ＬＢ」）、ＤＬ７２、及びＤＬ８１をＭＲＳ液体培地にて嫌気培養（３７℃、７２時間）し、得られた培養液を遠心（１００００ｇ、５分間、室温）し、上清を回収後、０．２２μｍシリンジフィルターで菌体や交雑物の除去を行い清澄化した。次に、清澄化した上清はＡｍｉｃｏｎ－Ｕｌｔｒａ　０．５　３Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）によって限外濾過して５倍濃縮させ、その濃縮液が２５倍希釈される濃度になるように、その濃縮液をマクロファージ様細胞の培養液へ添加して２４時間放置した。なお、ネガティブコントロールとしてＭＲＳ液体培地のみの条件を設定し、同様にマクロファージ様細胞へ添加した（「ＭＲＳ」）。２４時間後、マクロファージ様細胞の培養液を回収し、培養液中に分泌されたＩＬ１０量を定量した。ＩＬ１０の定量は、Ｈｕｍａｎ　ＰｒｏＱｕａｎｔｕｍ　ＩＬ１０　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）によって、メーカーのプロトコールに従って定量解析を行った。未処理条件のＩＬ１０量を基準として相対値を求め、それをグラフ（図１２）に表して比較検討した。その結果、ｑＰＣＲによる遺伝子発現解析による結果と同様に、ＤＬ８１の上清処理によって細胞外に分泌されたＩＬ１０の量が最も有意に増加していることが観察され、タンパク質レベルでもＤＬ８１によってＩＬ１０が増加していることが認められ、ＤＬ８１によるＩＬ１０発現亢進を強く支持した。なお図１２では縦軸には未処理条件のＩＬ１０の量を基準とした相対値を示し、横軸には実験対象株であるLactobacillus paracasei subsp. paracasei JCM 8130（「ＬＰＰ」）、Lactobacillus brevis JCM 1059（「ＬＢ」）、ＤＬ７２、ＤＬ８１を示すが、「ＭＲＳ」は、ＭＲＳ培地で処理した条件でのものを示す。
　実験１１：＜ＤＬ８１培養上清による免疫応答制御の亢進＞
　ＤＬ７２培養上清やＤＬ８１培養上清が抗炎症作用だけでなく自然免疫に対しても作用するかを検証するために、生体防御を司るＭ１マクロファージのマーカー遺伝子であるＣＣＲ７とＣＸＣＬ２、自然免疫において重要な役割を持つＩＬ１２の発現を促進する転写因子のＢａｔｆ２、そして、抗炎症的に働くＭ２マクロファージのマーカー遺伝子であるＣＸＣＲ４、ＣＣＬ２２の遺伝子発現解析を行なった。
　ＤＬ７２、ＤＬ８１のそれぞれをＭＲＳ液体培地にて７２時間、嫌気培養（３７℃）し、得られた培養液を遠心（１００００ｇ、５分間、室温）し、上清を回収後、０．２２μｍシリンジフィルターで菌体や交雑物の除去を行い清澄化させた。次に、清澄化した上清はＡｍｉｃｏｎ－Ｕｌｔｒａ　０．５　３Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）によって限外濾過して５倍濃縮させ、その濃縮液が２５倍希釈される濃度になるように、その濃縮液をマクロファージ様細胞の培養液へ添加して２４時間放置した。
　上清濃縮液を処理したマクロファージ様細胞から、ＩＳＯＧＥＮ　ＩＩ（日本ジーン社製）によってＲＮＡを抽出し、ＡｃｃｕＲＴ　ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ　Ｒｅｍｏｖａｌ　Ｋｉｔ（ａｂｍ社製）でゲノムＤＮＡを除去した後、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　ｑＰＣＲ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社製）で逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。これをテンプレートにＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、ＣＦＸ　ＣｏｎｎｅｃｔＴＭ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）でリアルタイムＰＣＲを実施した。リアルタイムＰＣＲの反応条件は、９８℃・１分間で初期変性させた後、９５℃・１５秒、６０℃・３０秒を４０サイクル反応させた。遺伝子発現の定量は、リファレンス遺伝子としてｂｅｔａ－ａｃｔｉｎを用いて遺伝子発現量を補正し、ΔΔＣｔ法によってコントロールの遺伝子発現量から算出した相対値を求め、その値を対数変換し比較検討を行なった。
　上記リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現解析に用いたプライマーの配列情報を以下の表３に示す。なお表３中の備考ｅは、ＣＣＲ７又はＣＸＣＲ４のそれぞれのプライマー配列がＯｒｉＧｅｎｅ社の公開配列であることを示し、備考ｆは、Ｂａｔｆ２のプライマー配列が、Decrease in invasion of HTR-8/SVneo trophoblastic cells by interferon gamma involves cross-communication of STAT1 and BATF2 that regulates the expression of JUN. (S.Verma et al., Cell Adhesion & Migration, 2018)からの引用であることを示す。また、ＣＸＣＬ２とＣＣＬ２２は、タカラバイオ社のPrimerArray Cytokine-cytokine receptor interaction (Human)に搭載さているプライマーを用いたが、その配列情報は未公開である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　これらの結果を図１３～図１５に示す。これらの図から明らかなように、ＤＬ８１培養上清は、Ｍ１及びＭ２マーカー遺伝子がともに有意に発現上昇することが認められ、その程度はＤＬ７２培養上清よりも大きく、ＤＬ８１培養上清は自然免疫と抗炎症作用をともに亢進させることが示された。よって、ＤＬ８１培養上清は、マクロファージを介した免疫応答制御を亢進させる作用を有することがわかった。従って、ウイルスや細菌への感染に抵抗する免疫力と、炎症が過剰に起こりアレルギーや自己免疫疾患を発症することを防ぐ免疫力の双方を亢進する免疫応答制御亢進剤（又は「免疫賦活化剤」ともいう）として利用できる。
　実験１２：＜ＤＬ８１培養上清原液の製造＞
　凍結保管したＤＬ８１菌を解凍して得た菌液を植菌重量が培地重量の０．１ｗｔ％となるように豆乳様培地（グルコース０．６％、酵母エキス０．５％、脱脂粉乳２．８％、大豆粉７．７％、消泡剤０．０１％、残部水（各重量％））に加えて７２時間培養し、ｐＨ４．５～５．５とした。そして得られた培養液を遠心し、上清を回収後、清澄化し、さらに限外濾過して５倍濃縮液を製造し、その後の各種製剤を製造するためのＤＬ８１培養上清原液とした。
　実験１３：＜ＤＬ８１培養上清原液からの各種製剤の製造＞
　１－１．液状製剤又はローション状製剤の製造（１）
　８０ｗｔ％の蒸留水、１０ｗｔ％のアルコール、数ｗｔ％のグリセリンに香料、乳化剤、防腐剤を配合した希釈液に、上記ＤＬ８１培養上清原液を加えて、その合計量のうちＤＬ８１培養上清原液が４ｗｔ％となるようにしてローション状製剤を得た。また、グリセリンの含量を蒸留水で代替して液状製剤を得た。
　このローション状製剤又は液状製剤は、そのままローション又は化粧水として用いることで、肌用、デリケートゾーン周辺用のケア製剤として適用できる。
　１－２．液状製剤又はローション状製剤の製造（２）
　９５ｗｔ％の豆乳に、甘味料、砂糖等を配合した希釈液に、上記ＤＬ８１培養上清原液を加えて、その合計量のうちＤＬ８１培養上清原液が４ｗｔ％となるようにしてドリンク剤を得た。
　このドリンク剤を飲料として、身体の免疫を活発にし、外敵や異物の侵入から身を守る作用を向上させる免疫賦活化剤として適用できる。
　２．クリーム製剤の製造
　ワセリン、オリーブオイル、エタノール、顔料に香料、乳化剤、防腐剤を配合したクリームに、上記ＤＬ８１培養上清原液を加えて、その合計量のうちＤＬ８１培養上清原液が４ｗｔ％となるようにしてクリーム状製剤を得た。このクリーム状製剤は、そのままクリーム製品として、肌用、デリケートゾーン周辺用のケア製剤として適用できる。また、炎症部位に塗布する抗炎症剤として適用できる。
　３．錠剤の製造
　デンプン及びデンプン糊に上記ＤＬ８１培養上清原液を加えて、その合計量のうちＤＬ８１培養上清原液が４ｗｔ％となるようにし成形し錠剤を得た。この錠剤は経口剤として、アトピー等の皮膚病に対するケア製剤、外傷や消化器官内等に対する抗炎症製剤として、また抗感染と抗アレルギーの両方の免疫力を高める免疫賦活化剤として適用できる。
　４．カプセル剤の製造
　上記液状製剤、ローション状製剤、クリーム製剤は、カプセルに詰めてカプセル化することで、膣内への挿入剤として産後の膣ケア製剤として適用できる。また、経口剤として、アトピー等の皮膚病に対するケア製剤、外傷や消化器内等に対する抗炎症製剤として、また抗感染と抗アレルギーの両方の免疫力を高める免疫賦活化剤として適用できる。
　実験１４：＜ＤＬ８１菌体含有液の製造＞
　凍結保管したＤＬ８１菌を解凍して得た菌液を植菌重量が培地重量の０．１ｗｔ％となるようにＭＲＳ液体培地に加えて７２時間培養し、ＯＤ６００を４．５～５．０とした。
そして得られた培養液を遠心し、上清を廃棄し、菌体ペレットを得た。そして、この菌体ペレットをＰＢＳで希釈して、その後の各種製剤を製造するためのＤＬ８１菌体含有液とした。このＤＬ８１菌体含有液中には、ＤＬ８１の生菌が含まれる。
　実験１５：＜ＤＬ８１菌体含有液からの各種製剤の製造＞
　１－１．液状製剤又はローション状製剤の製造（１）
　８０ｗｔ％の蒸留水、１０ｗｔ％のアルコール、数ｗｔ％のグリセリンに香料、乳化剤、防腐剤を配合した希釈液に、上記ＤＬ８１菌体含有液を加えて、その合計量１ｇのうちＤＬ８１の菌体が１×１０８～５×１０９個含まれるようにしてローション状製剤を得た。また、グリセリンの含量を蒸留水で代替して液状製剤を得た。
　このローション状製剤又は液状製剤は、そのままローション又は化粧水として用いることで、肌用、デリケートゾーン周辺用のケア製剤として適用できる。
　１－２．液状製剤又はローション状製剤の製造（２）
　９５ｗｔ％の豆乳に、甘味料、砂糖等を配合した希釈液に、上記ＤＬ８１培養上清原液を加えて、その合計量のうちＤＬ８１培養上清原液が４ｗｔ％となるようにしてドリンク剤を得た。
　このドリンク剤を飲料として、身体の免疫を活発にし、外敵や異物の侵入から身を守る作用を向上させる免疫賦活化剤として適用できる。
　２．クリーム製剤の製造
　ワセリン、オリーブオイル、エタノール、顔料に香料、乳化剤、防腐剤を配合したクリームに、上記ＤＬ８１菌体含有液を加えて、その合計量１ｇのうちＤＬ８１の菌体が１×１０８～５×１０９個含まれるようにしてクリーム状製剤を得た。このクリーム状製剤は、そのままクリーム製品として、肌用、デリケートゾーン周辺用のケア製剤として適用できる。また、炎症部位に塗布する抗炎症剤として適用できる。
　３．錠剤の製造
　デンプン及びデンプン糊に上記ＤＬ８１菌体含有液を加えて、その合計量１ｇのうちＤＬ８１の菌体が１×１０８～５×１０９個含まれるようにして成形し錠剤を得た。この錠剤は経口剤として、アトピー等の皮膚病に対するケア製剤、外傷や消化器官内等に対する抗炎症製剤として、また抗感染と抗アレルギーの両方の免疫力を高める免疫賦活化剤として適用できる。
　４．カプセル剤の製造
　上記液状製剤、ローション状製剤、クリーム製剤は、カプセルに詰めてカプセル化することで、膣内への挿入剤として産後の膣ケア製剤として適用できる。また、経口剤として、アトピー等の皮膚病に対するケア製剤、外傷や消化器官内等に対する抗炎症製剤として、また抗感染と抗アレルギーの両方の免疫力を高める免疫賦活化剤として適用できる。
　実験１６：＜ＤＬ８１培養上清原液及びＤＬ８１菌体含有液からの各種製剤の製造＞
　上記ＤＬ８１培養上清原液及び上記ＤＬ８１菌体含有液を適当量混合し、上記有効量を含むようにした以外は、上記各種製剤の製造方法と同様にして、液状製剤、ローション状製剤、錠剤、カプセル剤を製造した。より具体的には、ＤＬ８１培養上清原液と上記ＤＬ８１菌体含有液の寄与割合を決定し、その寄与割合に応じてそれぞれの有効成分量を決定して配合するように調製した。
　実験１７：＜ＤＬ８１以外の菌株からの各種製剤の製造＞
　上記実験５で示す１５株のうち、種が特定されなかった１株と、ＤＬ８１株を除く１３菌株についても、上記ＤＬ８１培養上清原液の製造方法や、上記ＤＬ８１菌体含有液の製造方法と同様にして、これらの何れか一株、及びＤＬ８１菌株を含めた何れかの複数株の培養上清原液や、菌体含有液を製造した。また、上記製剤の製造方法と同様にして、これらの培養上清原液や、菌体含有液を含む製剤を製造した。

Claims (11)

  1. 　ＩＬ１０遺伝子発現を亢進させるデーデルライン桿菌である細菌。
  2. 　前記デーデルライン桿菌が、ＩＬ１０遺伝子発現を亢進させる受託番号：NITE BP-03295として国際寄託されたラクトバチルス・コレオホミニス（Lactobacillus coleohominis）種に属するＤＬ８１菌株である請求項１記載の細菌。
  3. 　ＩＬ１０遺伝子発現を亢進させるラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・ジェンセニイ(Lactobacillus jensenii)、ラクトバチルス・コレオホミニス(Lactobacillus coleohominis)の組合せからなる請求項１記載の細菌。
  4. 　請求項１～請求項３何れか１項記載の細菌の培養上清を主成分として含有するＩＬ１０遺伝子発現亢進剤。
  5. 　請求項１～請求項３何れか１項記載の細菌を有効成分として含有するＩＬ１０遺伝子発現亢進剤。
  6. 　請求項１～請求項３何れか１項記載の細菌又は請求項４若しくは請求項５記載のＩＬ１０遺伝子発現亢進剤を有効成分として含有する製剤。
  7. 　請求項１～請求項３何れか１項記載の細菌の培養上清を主成分として含有する免疫応答制御亢進剤。
  8. 　請求項１～請求項３何れか１項記載の細菌を有効成分として含有する免疫応答制御亢進剤。
  9. 　請求項１～請求項３何れか１項記載の細菌又は請求項７若しくは請求項８記載の免疫応答制御亢進剤を有効成分として含有する製剤。
  10. 　皮膚外用剤である請求項６又は請求項９記載の製剤。
  11. 　経口剤である請求項６又は請求項９記載の製剤。
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MARYAM YEGANEGI, CHIASHAN G. LEUNG, ANDREW MARTINS, ANDREW MARTINS , SUNG O. KIM, GREGOR REID, JOHN R.G. CHALLIS, ALAN D. BOCKING: "Lactobacillus rhamnosus GR-1-Induced IL-10 Production in Human Placental Trophoblast Cells Involves Activation of JAK/STAT and MAPK Pathways", REPRODUCTIVE SCIENCES, vol. 17, no. 11, 1 November 2010 (2010-11-01), US , pages 1043 - 4051, XP009537793, ISSN: 1933-7191, DOI: 10.1177/1933719110377237 *
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