JP5327984B2 - ビフィズス菌の種 - Google Patents

Description

本発明は、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する細菌と、上記細菌を含むプロバイオティクス（probiotic）組成物、特に食品製品と、胃腸疾患等の疾患の治療における上記細菌の使用とに関する。

ビフィズス菌（すなわち、ビフィドバクテリウム属に属する細菌）は、ヒト及び動物の糞便菌叢の最も重要な集団の１つを構成する。一般的に、これらの細菌が糞便菌叢中に高い割合で存在する場合、良好な健康状態の指標であると考えられる。この理由により、これらは、プロバイオティクス細菌（生きて摂取した場合、腸内菌叢の天然のバランスを改善する有益な微生物）として知られる。既知のビフィズス菌の例は、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（B. adolescentis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（B. animalis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B. breve）、ビフィドバクテリウム・カテヌラツム（B. catenulatum）及びビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）を含み、これらは、有益な技術的効果、官能的（organoleptic）効果及びプロバイオティクス効果を有することが示されている。

ビフィズス菌は、発酵乳（「生きたビフィズス菌（active Bifidus）」を有するヨーグルト）における添加剤として最も一般的に見出されており、したがって、経済的に重要な物品を構成する。乳産業により選ばれた菌株は、製造プロセスに対する耐性、及び食品内での生存のような多数の厳しい要求を満たさなければならない。フランスで最も汎用されている種は、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス（lactis）及びビフィドバクテリウム・アニマリス亜種アニマリスであり、これらは動物起源の亜種であり、決してヒトから単離されない。ビフィズス菌の重要性の観点において、食品産業の要求に最適に適合した特性を有する新種をこの属内で同定する大きな必要性が存在する。例えば、２００４年、或るグループが、ブタの盲腸からビフィドバクテリウム・サイクラエロフィルム（Bifidobacterium psychraerophilum）を同定及び単離した（Simpson, PJ. et al. (2004) Int J Syst Evol Microbiol 54:401-6）。これまでに知られているビフィズス菌は、２０℃と４６℃〜４９．５℃との間の温度でしか増殖することができなかった（Biavati, B. et al., (2000), Annals of Microbiology 50:117-131、Dong et al., (2000) Int J Syst Evol Microbiol 50 Pt 1:119-25）が、ビフィドバクテリウム・サイクラエロフィルムは、４℃〜１０℃で増殖することにより、これまでの全ての種を凌駕する利点を実証した。この細菌がこのような製品の低い貯蔵温度で生存する可能性がより高く、したがって製品保存期限（shelf-life）を延長するので、このことはプロバイオティクス組成物にとって有益である。したがって、特有の利点を有するだけでなくこれまでに同定されたビフィズス菌の種の有益さも保持する、さらなるビフィズス菌の種の同定に対する大きな必要性が存在する。

本発明の第１の態様によれば、ビフィズス菌ＧＣ６１、又はその相同体、子孫若しくは突然変異体が提供される。

ＧＣ６１は、ビフィズス菌の新種を表す。ＧＣ６１、ＧＣ６１群、ビフィズス菌ＧＣ６１及びビフィドバクテリウム・ヴェルコルセンス（Bifidobacterium vercorsense）という用語は、このビフィズス菌の新種を表すために、交換可能な用語として使用される。

本明細書において検討されるＧＣ６１の菌株の例は、ＦＲ４１／２、ＦＲ４９／ｆ／２、ＦＲ１０１／ｈ／８、ＭａｒＶ３／２２、ＦＲ３９／１、ＭａｒＶ４／２、ＭａｒＶ１／５、ＦＲ６６／ｅ／１、ＭａｒＣ１／１３、ＭａｒＦ／３、ＰｉｃＤ／１、ＦＲ７０／ｇ／２及びＦＲ４７／２を含む。ＦＲ４１／２株、ＦＲ４９／ｆ／２株及びＦＲ１０１／ｈ／８株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は配列決定されており、ＦＲ１０１／ｈ／８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に関しては配列番号１と、ＦＲ４１／２の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に関しては配列番号２と、ＦＲ４９／ｆ／２の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に関しては配列番号３と、指定される。

好ましくはビフィズス菌ＧＣ６１又はその相同体は、ＦＲ４１／２、ＦＲ４９／ｆ／２、ＦＲ１０１／ｈ／８、ＭａｒＶ３／２２、ＦＲ３９／１、ＭａｒＶ４／２、ＭａｒＶ１／５、ＦＲ６６／ｅ／１、ＭａｒＣ１／１３、ＭａｒＦ／３、ＰｉｃＤ／１、ＦＲ７０／ｇ／２及びＦＲ４７／２の任意の１つ又は複数から選択される菌株である。

ビフィズス菌ＧＣ６１ ＦＲ４１／２株の寄託は、２００７年１月９日にパリのパスツール研究所のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に対して為され、この寄託にはアクセッション番号ＣＮＣＭＩ−３７１２が与えられた。

ビフィズス菌ＧＣ６１ ＦＲ４９／ｆ／２株の寄託は、２００７年１月９日にパリのパスツール研究所のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に対して為され、この寄託にはアクセッション番号ＣＮＣＭＩ−３７１３が与えられた。

ビフィズス菌ＧＣ６１の相同体が、ビフィズス菌ＧＣ６１（本明細書において以後ＧＣ６１とも称される）と約６０％よりも大きいＤＮＡ配列相同性を有するいずれかのビフィズス菌株を表すと理解されることが分かるであろう。好ましくは、言及される配列相同性は全細菌ゲノムにわたるものである。好ましくは、ＧＣ６１相同体は、ＧＣ６１に対して約７０％よりも大きいＤＮＡ配列相同性を有するものであり、より好ましくは相同性は８０％よりも大きく、好ましくは９０％よりも大きく、より好ましくは約９５％よりも大きく、特に好ましくは約９８％よりも大きく、若しくは約９９％、又は上の値のいずれかの間の任意の範囲である。好ましくはＤＮＡ相同性の程度は、２つ以上の細菌の全ゲノムにわたる相同性の程度を確定するＤＮＡ−ＤＮＡ再会合実験により確定される。ＤＮＡ相同性を確定するために使用され得る方法は実施例で説明されるが、当業者は、任意の他の適切な方法も使用され得ることを理解するだろう。

付加的に又は代替的に、ＧＣ６１に対する相同体は、特定の遺伝子の間の配列相同性の程度を参照することにより規定され得る。例えば、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列がＧＣ６１の１６Ｓ ｒＤＮＡに対して９５．４５％より大きい、好ましくは９７％より大きい、より好ましくは９９％より大きい相同性を有する細菌は、ＧＣ６１相同体として説明され得る。ＧＣ６１の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列は、図１Ａで言及される１６Ｓ ｒＤＮＡコンセンサス配列（配列番号４）であり得るか、又は任意のＧＣ６１株由来の１６Ｓ ｒＤＮＡの配列を有し得る。同様に又は代替的に、ＧＣ６１において、ｈｓｐ６０遺伝子の配列に対して、又はｈｓｐ６０遺伝子由来のコンセンサス配列に対して８７％より大きい、好ましくは９０％より大きい配列相同性を有するｈｓｐ６０遺伝子を有する細菌は、ＧＣ６１相同体として説明され得る。好ましくはｈｓｐ６０遺伝子のコンセンサス配列は、図３において規定された配列である。好ましくはＧＣ６１のＦＲ４１／２株又はＦＲ４９／ｆ／２株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列又はｈｓｐ６０配列は、配列相同性の程度を確定する際に使用される。

ＧＣ６１の相同体は、天然であり得るか、又は例えば遺伝子操作により、人工的に作製され得る。

ＧＣ６１は、伝統的且つ手動のプロセスにより作られるチーズ「Ｌ’ｅｔｏｉｌｅ ｄｕ Ｖｅｒｃｏｒｓ」を作るプロセスの間に生乳から単離された。ＧＣ６１は、チーズ生産プロセスの間中（すなわち生乳からその熟成の終わりまで）存在しており、該プロセス間に統計的に有意に増大する。これらの細菌は、製品の官能性の発生に関与する天然の微生物集団に属する。

過去に単離されたビフィズス菌の種の多くはヒト又は動物の消化管から抽出されているのに対して、ＧＣ６１は食品生産プロセスから単離されているという利点を有し、したがってＧＣ６１は、多くの他のビフィズス菌の種よりも、製造プロセス中に組み込むことが容易であり、また食品及び発酵製品中で安定化させることが容易である。

ＧＣ６１は好冷である（psychotrophic）こと、及び約１２℃もの低温で増殖することができることも見出されている。低温での増殖の重要な利点は、ＧＣ６１細菌がたいていの他のプロバイオティクス細菌組成物よりも低い貯蔵温度で生存する可能性がより高いことであり、したがってその保存期限を延長するだろう。

ＧＣ６１細菌のさらなる利点は、胃の酸性度に、胆汁塩に、及び腸内酵素（ペプシン）に対する、良好な耐性を提供することである。

ＧＣ６１細菌のまたさらなる利点は、空気／酸素に耐性を有すること、すなわち耐気性であることである。

ＧＣ６１細菌、及び特にＦＲ４９／ｆ／２株のまたさらなる利点は、驚くべき免疫調節効果を有することであり、サイトカインＩＬ１０の高レベルの産生と、しかしＩＬ１２の低レベルの産生とをもたらし得る。ＩＬ１０対ＩＬ１２のこの比は、抗炎症性の指標となる。抗炎症性は、マウスにおける大腸炎の実験モデルについてｉｎ ｖｉｖｏでも実証された。

ビフィズス菌ＧＣ６１は、生細胞の形態であり得る。

生細胞に加えて、又はその代替として、ビフィズス菌ＧＣ６１細胞により発現される有益な因子を含有するビフィズス菌ＧＣ６１の殺菌した培養物が、有用であり得る。

ビフィズス菌ＧＣ６１は、生物学的に純粋な培養物の形態であり得る。

ビフィズス菌ＧＣ６１の突然変異体は、遺伝コードにおける保存的又は変性的な変化を有する菌株を含む。突然変異体は、天然のものであるか、又は遺伝子工学により作製され得る。

本発明の第２の態様によれば、本明細書において上で規定されたビフィズス菌ＧＣ６１と、１つ又は複数の許容可能な添加物とを含む組成物が提供される。好ましくは組成物はプロバイオティクス組成物である。

許容可能な添加物は、プロバイオティクス組成物の調製の技術分野における当業者に既知であることが分かるであろう。

許容可能な添加物の例は、スクロース、異性化糖、グルコース、フルクトース、パラチノース、トレハロース、ラクトース及びキシロース等の糖；ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチノール、還元餅状（glutinous）デンプンシロップ及び還元餅状マルトースシロップ等の糖アルコール；脂肪酸のスクロースエステル、脂肪酸のグリセリンエステル、及びレシチン等の乳化剤；カラギーナン、キサンタンガム、グアーガム、ペクチン及びローカストビーンガム等の増粘剤（安定化剤）；クエン酸、乳酸及びリンゴ酸等の酸性化剤；レモン果汁、オレンジ果汁及びベリー果汁等の果汁；ビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ及びビタミンＥ等のビタミン；並びにカルシウム、鉄、マンガン及び亜鉛等のミネラルを含む。

本発明の組成物は、適切には常温及び大気圧で、混合により調製することができ、通常経口投与用に適合され得る。このような組成物は、錠剤、カプセル、口腔用液体調製物、従来の食品製品、粉末、顆粒、ロゼンジ、再構成可能な粉末、又は懸濁物の形態であり得る。

経口投与用の錠剤及びカプセルは、単位用量形態であってもよく、結合剤、充填剤、錠剤用滑剤、崩壊剤、及び許容可能な湿潤剤等の１つ又は複数の従来の添加物を含有してもよい。これらの錠剤は、製薬業務において既知の方法に従い、コーティングされ得る。

口腔用液体調製物は、例えば、水性若しくは油性の懸濁物、溶液、エマルション、シロップ若しくはエリキシルの形態であってもよく、又は使用前に水若しくは別の適切な薬物送達手段（vehicle：ビヒクル）を用いて再構成するための乾燥製品の形態であってもよい。このような液体調製物は、懸濁剤、乳化剤、非水性薬物送達手段（食用油を含み得る）、保存料、及び必要に応じて、従来の香料又は着色料等の従来の添加剤を含有し得る。

好ましい一実施の形態では、本発明の組成物は、従来の食品製品、より好ましくは乳製品（例えば、発酵乳、植物乳、豆乳、バター、チーズ若しくはヨーグルト）又は果汁として構築される。組成物は好ましくは、成体及び／又は乳幼児のヒト用及び／又は動物用の食品又は飲料として構築される。代替的な一実施の形態では組成物は、凍結乾燥又は噴霧乾燥した粉末として構築される。プロバイオティクス効果を示すこと（すなわち腸内菌叢のバランスを維持すること）に加え、ビフィズス菌は、また概して、様々な障害、例えば胃腸疾患、クローン病、大腸炎、潰瘍性大腸炎、炎症性障害、免疫不全症、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、癌（特に胃腸系及び免疫系の）、下痢性疾患、抗生物質関連下痢症、小児下痢症、虫垂炎、自己免疫障害、多発性硬化症、アルツハイマー病、関節リウマチ、セリアック病、糖尿病（diabetes mellitus）、臓器移植拒絶反応、細菌性感染症、ウイルス性感染症、真菌性感染症、歯周疾患、泌尿生殖器疾患、性感染症、ＨＩＶ感染症、ＨＩＶ複製、ＨＩＶ関連下痢症、外科処置（surgical）関連外傷、外科処置誘発性転移性疾患、敗血症、体重減少、食欲不振症、発熱制御（fever control）、悪液質、創傷治癒、潰瘍、腸バリア機能、アレルギー、喘息、呼吸障害、循環障害、冠動脈心疾患、貧血、血液凝固系の障害、腎疾患、中枢神経系の障害、肝疾患、虚血、栄養障害、骨粗鬆症、内分泌障害、表皮障害、乾癬、尋常性ざ瘡及び／又はコレステロール過剰の処置及び／又は予防に有用な可能性があると考えられる。

ＧＣ６１は、組成物中に１グラム当たり約１０⁶ｃｆｕより多く存在し得る。

本発明のさらなる一態様によれば、特に上記の障害の任意の１つ又は複数の処置及び／又は予防における治療物質又は予防物質としての使用のためのビフィズス菌ＧＣ６１が提供される。

本発明は、上記の障害の任意の１つ又は複数の処置及び／又は予防のための薬物の調製におけるビフィズス菌ＧＣ６１の使用をさらに提供する。

さらなる一態様によれば、本発明は、上記の障害の任意の１つ又は複数の処置及び／又は予防における使用のためのビフィズス菌ＧＣ６１を提供する。

またさらなる一態様によれば、本発明は、ヒト又は動物の被験体において上記の障害の任意の１つ又は複数を処置及び／又は予防する方法を提供し、該方法は、該被験体に治療上の有効量のビフィズス菌ＧＣ６１を投与することを含む。

ビフィズス菌ＧＣ６１は、他の治療用作用物質（例えば、胃腸疾患（例えば下痢症）、癌、コレステロール過剰、アレルギー、感染症、又は上記の障害の任意の１つ又は複数の処置及び／又は予防において有用であることが既知の他の薬物）と組み合わせて使用することができる。

したがって、本発明のさらなる一態様として、ビフィズス菌ＧＣ６１とさらなる治療用作用物質（単数又は複数）との組み合わせを含む組成物が提供される。

上で言及した組合せは便宜上、プロバイオティクス組成物の形態での使用のために表すことができ、したがって、上で規定された組合せを１つ又は複数の添加物と共に含むプロバイオティクス組成物は本発明のさらなる一態様を提供する。このような組合せの個々の成分が、別々の又は組み合わせたプロバイオティクス組成物において連続的に又は同時に、投与され得る。

好ましい一実施の形態では、ビフィズス菌ＧＣ６１は、他のビフィズス菌又は他のプロバイオティクスの細菌、例えばラクトバチルス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・ガリナルム（Lactobacillus gallinarum）、ラクトバチルス・アミロボラス（Lactobacillus amylovorus）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・ケフィル（Lactobacillus kefir）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・クリスパータス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・デルブレッキイ（Lactobacillus delbrueckii）亜種デルブレッキイ、ラクトバチルス・デルブレッキイ亜種ブルガリカス（bulgaricus）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ジアエ（Lactobacillus zeae）及びラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivalius）等のラクトバチルス属に属する細菌；ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）等のストレプトコッカス属に属する細菌；ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）亜種クレモリス（cremoris）及びラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス等のラクトコッカス属に属する細菌；バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属に属する細菌；ビフィドバクテリウム・クルジラクティス（Bifidobacterium crudilactis）等のビフィドバクテリウム属に属する細菌；及び／又はサッカロマイセス・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae）、トルラスポラ・デルブレッキイ（Torulaspora delbrueckii）及びカンジダ・ケフィル（Candida kefyr）等のサッカロマイセス属、トルラスポラ属及び／又はカンジダ属に属する酵母と共に組み合わせられる、及び／又は使用される。

本発明の別の態様によれば、免疫調節性及び／又は抗炎症性のプロバイオティクスとしての使用のための、ビフィズス菌ＧＣ６１、又はその相同体、子孫若しくは突然変異体が提供される。好ましくはその使用は、哺乳動物の被験体においてＩＬ−１０の産生を誘発することである。好ましくはＩＬ−１０は、ＰＢＭＣにより産生される。

本発明のさらなる一態様によれば、哺乳動物の被験体における炎症の処置のための薬物の調製における、ビフィズス菌ＧＣ６１、又はその相同体、子孫若しくは突然変異体の使用が提供される。好ましくは炎症は、胃腸管の炎症である。好ましくは薬物は、大腸炎の処置のためのものである。

本発明のまたさらなる一態様によれば、哺乳動物の被験体における炎症の処置における使用のための、ビフィズス菌ＧＣ６１、又はその相同体、子孫若しくは突然変異体が提供される。好ましくは炎症は、胃腸管の炎症である。好ましくはビフィズス菌ＧＣ６１、又はその相同体、子孫若しくは突然変異体は、大腸炎の処置における使用のためのものである。

本発明の別の態様によれば、哺乳動物の被験体における炎症を処置する方法であって、該哺乳動物の被験体に治療上の有効量のビフィズス菌ＧＣ６１を投与することを含む、方法が提供される。好ましくは炎症は、胃腸管の炎症である。好ましくは方法は、大腸炎の処置のためのものである。

好ましくはビフィズス菌ＧＣ６１、又はその相同体、子孫若しくは突然変異体は、哺乳動物の被験体におけるＩＬ−１０の産生を刺激する。好ましくはビフィズス菌ＧＣ６１、又はその相同体、子孫若しくは突然変異体は、哺乳動物の被験体におけるＩＬ−１２の産生を低減する。好ましくはビフィズス菌ＧＣ６１、又はその相同体、子孫若しくは突然変異体は、哺乳動物の被験体におけるＩＬ−１２の産生を刺激しない。

好ましくは哺乳動物の被験体はヒトである。

本発明の任意の態様で使用されるビフィズス菌ＧＣ６１は、前述した菌株のいずれかであり得る。例えば菌株は、ＦＲ４１／２株又はＦＲ４９／ｆ／２株であり得る。ビフィズス菌ＧＣ６１が、免疫調節性及び／又は抗炎症性のプロバイオティクス／作用物質としての使用のためのもの、及び／又は炎症の処置における使用のためのものである場合には、菌株はＦＲ４９／ｆ／２であり得る。

本発明の一態様又は一実施の形態の任意の及び／又は好ましい全ての特徴は、本明細書において記載される本発明の他の全ての態様又は実施の形態に適用され得ることが理解される。

本発明の実施の形態は、ここで、以下の添付図面を参照して例示のみの目的で記載される。

ＧＣ６１の、ＦＲ１０１／ｈ／８株から得られる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列（配列番号１）と、ＦＲ４１／２株から得られる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列（配列番号２）と、ＦＲ４９／ｆ／２株から得られる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列（配列番号３）と（それぞれ１、２及び３と呼ばれる）のアライメントを示す図である。アライメントを、ＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェア及びＥｄｔａｌｎソフトウェアを使用して行った。コンセンサス配列（配列番号４）（アライメントではＣと呼ばれる）は、塩基番号２から塩基番号１４５２まで３菌株間で１００％の相同性を示す。コンセンサスが文字列により示され、該文字列は、或る所定の位置における状況により、その文字が２０％以上の多数代表率（majority representation）を有する場合には「．」を、その文字が４０％以上の多数代表率を有する場合には「：」を、その文字が６０％以上の多数代表率を有する場合には「＋」を、その文字が８０％以上の多数代表率を有する場合には「＊」を、その文字が全ての配列に関して同じである場合にはその文字自体を、含む。 図１Ａ−１の続きである。 図１Ａ−２の続きである。 図１Ａ−３の続きである。 図１Ａ−４の続きである。 図１Ａ−５の続きである。 図１Ａ−６の続きである。 ＦＲ１０１／ｈ／８株、ＦＲ４１／２株及びＦＲ４９／ｆ／２株由来の３つの部分配列に基づく、ビフィドバクテリウム・ヴェルコルセンスにおける１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする１４５２ｂｐのＤＮＡコンセンサス配列を示す。 ＧＣ６１の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に関するコンセンサス配列（この図では１番の配列として示される）と、他の既知のビフィズス菌の種のそれとを比較し、それらの間の％相同性／同一性を示すアライメントを示す図である。比較した異なる種の間のコンセンサスが文字列により示され、該文字列は、或る所定の位置における状況により、その文字が２０％以上の多数代表率を有する場合には「．」を、その文字が４０％以上の多数代表率を有する場合には「：」を、その文字が６０％以上の多数代表率を有する場合には「＋」を、その文字が８０％以上の多数代表率を有する場合には「＊」を、その文字が全ての配列に関して同じである場合にはその文字自体を、含む。このコンセンサス配列は、この図では「Ｃ」と指定される。 図２Ａ−１の続きである。 図２Ａ−２の続きである。 図２Ａ−３の続きである。 図２Ａ−４の続きである。 図２Ａ−５の続きである。 図２Ａ−６の続きである。 図２Ａ−７の続きである。 ＧＣ６１と、系統学的に最も近縁なビフィズス菌の種とのコンセンサスツリーを示す。枝上の数は、１．００のツリーのうち（ツリーは重みづけ（fractional weights）を有するものであった）、そのツリーの中でその枝により分かれる２組への種の分割（partition）が生じた回数を示す。 ＧＣ６１のＦｒ４１／２株、Ｆｒ４９／ｆ／２株及びＦｒ１０１／ｈ／８株から配列決定したｈｓｐ６０遺伝子のコンセンサス配列（配列番号５）を示す。下線を付した塩基はＰＣＲプライマー（配列番号６及び配列番号７）に対応し、強調した塩基はＧＣ６１種に特異的なプローブの配列（配列番号８）に対応する。 ＧＣ６１群の細菌ビフィドバクテリウム・ヴェルコルセンス由来のｈｓｐ６０部分遺伝子配列と、Ｇｅｎｂａｎｋ（ＰｕｂＭｅｄ−ＢＬＡＳＴ）において見出される他のビフィズス菌の種における近縁な配列とのアライメントを示す図である。ビフィドバクテリウム・ヴェルコルセンス由来の部分ｈｓｐ６０遺伝子配列は、図３で言及したｈｓｐ６０遺伝子のコンセンサス配列と同一である。 図４中の細菌の名称は以下の通り。ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラツム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)ビフィドバクテリウム・カテヌラツム(Bifidobacterium catenulatum)ビフィドバクテリウム・デンティウム(Bifidobacterium dentium)ビフィドバクテリウム・メリシカム(Bifidobacterium merycicum)ビフィドバクテリウム・アンギュラツム((Bifidobacterium angulatum) ＤＳＭ ２００９８ビフィドバクテリウム・プロラム(Bifidobacterium pullorum)ビフィドバクテリウム・ガリナルム(Bifidobacterium gallinarum)ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)ビフィドバクテリウム・ルミナンティウム(Bifidobacterium ruminantium)ビフィドバクテリウム・ロンガム次亜種インファンティス(Bifidobacterium longum bv. infants)ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)ビフィドバクテリウム・ロンガム次亜種スイス(Bifidobacterium longum bv. Suis)ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve) ＤＳＭ ２０２１３ビフィドバクテリウム・シュードロンガム亜種グロボーサム(Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum)ビフィドバクテリウム・クニクリ(Bifidobacterium cuniculi)ビフィドバクテリウム・コエリナム(Bifidobacterium cheorinum)ビフィドバクテリウム・サーマシドフィルム(Bifidobacterium thermacidophilum)ビフィドバクテリウム・ボウム(Bifidobacterium boum)ビフィドバクテリウム・サーモフィルム(Bifidobacterium thermophilum)ビフィドバクテリウム・マグヌム(Bifidobacterium magnum)ビフィドバクテリウム・ガリクム(gallium)ビフィドバクテリウム・インディカム(Bifidobacterium indicum)ビフィドバクテリウム・アステロイデス(Bifidobacterium asteroides)ビフィドバクテリウム・コリネフォルメ(Bifidobacterium coryneform)ビフィドバクテリウム・サイクラエロフィルム(Bifidobacterium psychraerophilum)ビフィドバクテリウム・ミニマム(Bifidobacterium minimum)ビフィドバクテリウム・ツルミエンス(Bifidobacterium tsurumiense)ビフィドバクテリウム・アニマリス(Bifidobacterium animalis)ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス(Bifidobacterium adolescentis)ビフィドバクテリウム・クルジラクティス(Bifidobacterium crudilactis)ビフィドバクテリウム・ヴェルコルセンス(Bifidobacterium vercorsense) 図４−１の続きである。 図４−２の続きである。 様々な細菌単離株で刺激した場合の、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮγ、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２に及ぼす効果を研究するために使用した実験手順を示す図である。 ＦＲ４９／ｆ／２（菌株Ｃ）、ＦＲ１０１／Ｈ／８（菌株Ｆ）、ＦＲ３９／１（菌株Ｉ）、ＦＲ４１／２（菌株Ｍ）及びＦＲ６６／Ｅ／１（菌株Ｎ）を含む様々な細菌単離株で刺激した場合の、末梢血単核球におけるＩＦＮγ、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２のレベルに及ぼす効果を示す図である。図６Ａは、ＩＦＮγの誘導を示す。Ｓｏｕｃｈｅ＝菌株、Ｔｅｍｏｉｎ＝対照。 ＦＲ４９／ｆ／２（菌株Ｃ）、ＦＲ１０１／Ｈ／８（菌株Ｆ）、ＦＲ３９／１（菌株Ｉ）、ＦＲ４１／２（菌株Ｍ）及びＦＲ６６／Ｅ／１（菌株Ｎ）を含む様々な細菌単離株で刺激した場合の、末梢血単核球におけるＩＦＮγ、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２のレベルに及ぼす効果を示す図である。図６Ｂは、ＩＬ−１２の誘導を示す。Ｓｏｕｃｈｅ＝菌株、Ｔｅｍｏｉｎ＝対照。 ＦＲ４９／ｆ／２（菌株Ｃ）、ＦＲ１０１／Ｈ／８（菌株Ｆ）、ＦＲ３９／１（菌株Ｉ）、ＦＲ４１／２（菌株Ｍ）及びＦＲ６６／Ｅ／１（菌株Ｎ）を含む様々な細菌単離株で刺激した場合の、末梢血単核球におけるＩＦＮγ、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２のレベルに及ぼす効果を示す図である。図６Ｃは、ＩＬ−１０の誘導を示す。Ｓｏｕｃｈｅ＝菌株、Ｔｅｍｏｉｎ＝対照。 ＦＲ４９／ｆ／２（菌株Ｃ）、ＦＲ１０１／Ｈ／８（菌株Ｆ）、ＦＲ３９／１（菌株Ｉ）、ＦＲ４１／２（菌株Ｍ）及びＦＲ６６／Ｅ／１（菌株Ｎ）を含む様々な細菌単離株で刺激した場合の、末梢血単核球におけるＩＦＮγ、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２のレベルに及ぼす効果を示す図である。図６Ｄは、ＩＬ−１０／ＩＬ−１２の値を示す。Ｓｏｕｃｈｅ＝菌株、Ｔｅｍｏｉｎ＝対照。 急性大腸炎のＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）誘発に関する標準的な細菌介入研究のデザインを示す図である。 急性大腸炎のＴＮＢＳ誘発の研究の結果を示す図である。図８Ａは、様々な菌株に関するＷａｌｌａｃｅスコアを示す。ＴＥＭＯＩＮ＝対照、Ｂｉｆｉｄｅ ｔｅｍｏｉｎ＝対照ビフィズス菌。 急性大腸炎のＴＮＢＳ誘発の研究の結果を示す図である。図８Ｂは、様々な菌株に関するＭＰＯの量（dosage）を示す。ＴＥＭＯＩＮ＝対照、Ｂｉｆｉｄｅ ｔｅｍｏｉｎ＝対照ビフィズス菌。 急性大腸炎のＴＮＢＳ誘発の研究の結果を示す図である。図８Ｃは、菌株による相対的保護率を示す。ＴＥＭＯＩＮ＝対照、Ｂｉｆｉｄｅ ｔｅｍｏｉｎ＝対照ビフィズス菌。

ビフィズス菌ＧＣ６１の表現型の特徴
ビフィズス菌ＧＣ６１は、数的分析（非加重平均連結及びＨａｒｔｉｇａｎ’ｓクラスタリング法に基づく分類）により、表現型として特徴づけられ、同定されている。ビフィドバクテリウム属の別の種に属し、ＧＣ６１群の特徴を有する他の基準株又は参考株は同定されていない。

ＧＣ６１群を、系統学的に最も近縁な種であると考えられるビフィドバクテリウム・クルジラクティス（Delcenserie V., et al. Systematic and Applied Microbiology (2007) 30, 381-389）及びビフィドバクテリウム・サイクラエロフィルム等の他の種と識別する生化学的特徴を、表１に示す。表１は、ＧＣ６１（１３株）、ビフィドバクテリウム・クルジラクティス（１０株）、ビフィドバクテリウム・クルジラクティスＬＭＧ ２３６０９Ｔ及びビフィドバクテリウム・サイクラエロフィルムＬＭＧ ２１７７５Ｔの間の識別性の表現型特徴を示す。

ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション
ＧＣ６１株と、他のビフィズス菌の種、及びエリスカルドビア・アエリフィラ（Aeriscardovia aeriphila）との全細菌ゲノムにわたるＤＮＡ−ＤＮＡ再会合レベルは、３％〜２８％である（表２に例示するように）。ＧＣ６１群（ＧＣ６１ ＦＲ４９／ｆ／２株、ＭａｒＶ３／２２株、ＦＲ３９／１株、ＭａｒＶ４／２株、ＦＲ１０１／ｈ／８株、ＭａｒＶ１／５株、ＦＲ６６／ｅ／１株、ＭａｒＣ１／１３株、ＭａｒＦ／３株、ＰｉｃＤ／１株、ＦＲ７０／ｇ／２株及びＦＲ４７／２株を、ＧＣ６１ ＦＲ４１／２株と比較した）内で、８０％〜１００％のＤＮＡ−ＤＮＡ再会合レベルが観察される。

ＤＮＡ−ＤＮＡ再会合レベルを、ハイブリダイゼーション温度をわずかに変更した（Gavini et al. Ecology in Health and Disease (2001) 12 40-45）、De Ley et al（J Biochem (1970) 12 133-142）により説明された再生速度を確定するための分光光度法を使用して確定した。確定は、温度制御器（Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ、Varian）を備えるＣａｒｙ １００分光光度計（Varian）を使用して、６３．７℃（ＦＲ４１／２株のＧ＋Ｃ含有量により、Ｔ_m−２５℃）で行った。

表２の説明：ａ、国際的なコレクション基準株は以下に由来する：ＡＴＣＣ、アメリカ培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）（Rockville, Maryland, USA）；ＣＣＵＧ、Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｏｅｔｅｂｏｒｇ（Sweden）；ＤＳＭＺ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（Goettingen, Germany）；ＬＭＧ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ ｖｏｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｇｅｎｔ（Belgium）；ＮＣＦＢ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ（Shinfield, Reading, Berks, England）；ＮＣＴＣ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Central Public Health Laboratory, London, England）；ＲＵ、ＳＵ及びＭＢ、Ｂ．Ｂｉａｖａｔｉ（Bologna, Italy）；ｂ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＤＳＭ ２００８２と１００％のＤＮＡ類似性を有する、ヒト糞便から単離された菌株；ＮＴ、試験せず。

１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列決定
ＧＣ６１群のＦＲ４１／２株、ＦＲ４９／ｆ／２株及びＦＲ１０１／ｈ／８株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、配列決定した（図１Ａ）。ＢＬＡＳＴ分析を使用することにより、ＧＣ６１のＦＲ４１／２株、ＦＲ４９／ｆ／２株及びＦＲ１０１／ｈ／８株由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に関するコンセンサス配列（図１Ｂを参照されたい）と、他のビフィズス菌の種由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列との間の配列同一性の百分率を確定した（図２Ａ）。結果を、表３に要約する。

ｈｓｐ６０配列決定
ｈｓｐ６０遺伝子を、ＧＣ６１群のＦＲ４１／２株、ＦＲ４９／ｆ／２株及びＦＲ１０１／ｈ／８株から増幅し、配列決定した。配列を比較し、図３に示すコンセンサス配列を同定した。このコンセンサス配列は、ｈｓｐ６０遺伝子の部分配列を反映する。コンセンサス配列を使用して、ＧＣ６１株に対する特異的なＰＣＲプライマーと特異的なプローブとを選択した（図３）。プライマー及び／又はプローブにより、リアルタイムＰＣＲを使用してＧＣ６１株を検出することが可能になる。

ＢＬＡＳＴ分析を使用して、図３のｈｓｐ６０遺伝子コンセンサス配列との顕著なアライメントを生成した他のビフィズス菌の種を同定した。

表４及び図４は、ＧＣ６１群の細菌ビフィドバクテリウム・ヴェルコルセンス由来のｈｓｐ６０遺伝子の部分遺伝子配列（２１２ｐｂ）（図３を参照されたい）と、様々なビフィズス菌の種由来の対応する遺伝子との間の相同性／同一性（％）を示す（図４を参照されたい）。

ＰＣＲによるＧＣ６１の特異的検出
リアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）アッセイを、特異的にＧＣ６１群を検出するために開発した。

Ｐｒｏｍｅｇａ（商標）のＷｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キットを使用して、ＤＮＡを調製した。１ｍｌの細菌培養物を、１３０００×ｇで２分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを４８０μｌのＥＤＴＡ、６０μｌのリゾチーム（lysosyme）、及び１２０μｌの細胞溶解溶液中に再懸濁し、３７℃で４５分間インキュベートした。遠心分離後、６００μｌの核溶解溶液をペレットに添加し、その後８０℃で５分間インキュベートした。冷却時に、２００μｌのタンパク質溶解溶液を添加し、その後ボルテックス処理した。得られた懸濁物をその後５分間氷上でインキュベートし、１３０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を６００μｌのイソプロパノールの入った清潔な管に移し、管をその後遠心分離した。上清をデカンテーションし、６００μｌの７０％エタノールを添加し、管を遠心分離した。エタノールを吸引し、ペレットを１０分間風乾した。最終的に、ＤＮＡペレットを、１００μｌの再水和溶液中で、４℃で終夜再水和した。

増幅反応混合物は、１０ｎｇ〜５０ｎｇのＤＮＡ、１２．５μｌのＴａｑＭａｎ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Applied Biosystems, USA）、９００ｎＭの各プライマー、２００ｎＭの蛍光発生プローブを、総容積２５μｌ中に含有していた。使用したプライマーは、５’ＴＣＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣＧＴＣＡＡ ３’（配列番号６）及び５’−ＣＧＡＴＣＴＧＣＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＣＣ−３’（配列番号７）であった。プローブ配列は、５’−ＴＣＧＴＣＧＣＣＴＣＧＧＣ−３'（配列番号８）であった。対照として、ＤＮＡ試料を含まない反応混合物を調製した。プライマー及びプローブの配列を、図３に示す。

増幅のために、サーマルサイクラーを以下のようにプログラムした：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、その後４０サイクルの二温度ＰＣＲ（９５℃で１５秒間、及び６０℃で６０秒間）。検出をＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７０００配列検出システム（Applied Biosystems, Foster city, USA）で実施した。試料に関するＰＣＲ結果を、デルタＲｎ（deltaRn）（相対感度）蛍光シグナルとして表した。

少なくとも１．０の相対蛍光（Ｒｎレベル）値に関してＣｔ値が３５より低い場合、試料を陽性であるとみなした。

行ったＰＣＲ実験では、全てのＧＣ６１群の単離株が陽性であり、試験した他の全てのビフィズス菌の種（アニマリス、サーモフィルム、コエリナム、グロボーサム、シュードロンガム、メリシカム、ルミナツム（ruminatum）、ミニマム、クニクリ、アドレスセンティス、ビフィダム、ブレーベ、デンティウム、ロンガム、シュードカテヌラツム及びクルジラクティス）はこのアッセイでは陰性であった。

ＧＣ６１株の胃腸耐性
ビフィズス菌ＧＣ６１群由来のＦＲ／４９／ｆ／２株及びＦＲ／４１／２株を、本研究のこの部で試験した。

使用した材料は以下を含む：
ＭＲＳ：Ｍａｎ Ｒｏｇｏｓａ Ｓｈａｒｐｅ培地（Oxoid GmbH, Wesel, Allemagne）、
胃液：ＨＣｌでｐＨ２及びｐＨ３に調整した、ペプシン（０．３％（ｗ／ｖ））（Ｐ７０００ Sigma）のＮａＣｌ−水（０．５％（ｗ／ｖ））溶液。
膵液：ＮａＯＨでｐＨ８に調整した、パンクレアチン（pancreatine）ＵＳＰ（１ｇｒ／ｌ）（Ｐ１５００ Sigma）のＮａＣｌ−水（０．５％（ｗ／ｖ））溶液。
胆汁塩：０．３％、０．５％及び１％（ｗ／ｖ）の胆汁（ＬＰ００５５、Oxoid）を有するＭＲＳ培地。
緩衝溶液：Ｋ₂ＨＰＯ₄ ５０ｍＭ。

ｐＨ２及びｐＨ３での研究 − ＧＣ６１の２菌株（ＦＲ／４９／ｆ／２及びＦＲ／４１／２）をＭＲＳブロス中に接種し、３７℃で３６時間嫌気的にインキュベートした。遠心分離後、細菌を、ｐＨ２又はｐＨ３に調整した０．５％ＮａＣｌ溶液中に再懸濁した。懸濁物を３７℃で嫌気的にインキュベートし、試料を１時間ごとに５時間採取した。スパイラルプレータを使用して、試料をＭＲＳ寒天培地（Don Whitley Scientific LTD., Shipley, West Yorkshire, UK）上に塗布した（plated）。コロニー数を計測する前に、プレートを３７℃で７２時間インキュベートした。全ての操作を嫌気キャビネット内で行った。操作は三連で行った。

ｐＨ２及びｐＨ３での胃液中での研究 − ２菌株（ＦＲ／４９／ｆ／２及びＦＲ／４１／２）をＭＲＳブロス中に接種し、３７℃で３６時間嫌気的にインキュベートした。遠心分離後、細菌を、ｐＨ２又はｐＨ３に調整した胃液溶液中に再懸濁した。懸濁物を３７℃で嫌気的にインキュベートし、試料を１時間ごとに５時間採取した。スパイラルプレータを使用して、試料をＭＲＳ寒天培地（Don Whitley Scientific LTD., Shipley, West Yorkshire, UK）上に塗布した。コロニー数を計測する前に、プレートを３７℃で７２時間インキュベートした。全ての操作を嫌気キャビネット内で行った。操作は三連で行った。

ｐＨ８での膵液中での研究 − ２菌株（ＦＲ／４９／ｆ／２及びＦＲ／４１／２）をＭＲＳブロス中に接種し、３７℃で３６時間嫌気的にインキュベートした。遠心分離後、細菌を、ｐＨ８に調整した膵液溶液中に再懸濁した。懸濁物を３７℃で嫌気的にインキュベートし、試料を１時間ごとに５時間採取した。スパイラルプレータを使用して、試料をＭＲＳ寒天培地（Don Whitley Scientific LTD., Shipley, West Yorkshire, UK）上に塗布した。コロニー数を計測する前に、プレートを３７℃で７２時間インキュベートした。全ての操作を嫌気キャビネット内で行った。操作は三連で行った。

胆汁塩を有するＭＲＳ培地中での研究 − ２菌株（ＦＲ／４９／ｆ／２及びＦＲ／４１／２）をＭＲＳブロス中に接種し、３７℃で３６時間嫌気的にインキュベートした。遠心分離後、細菌を、０．３％、０．５％及び１％の胆汁塩を有するＭＲＳ培地中に再懸濁した。懸濁物を３７℃で嫌気的にインキュベートし、実験開始時及び４８時間後に試料を採取した。スパイラルプレータを使用して、試料をＭＲＳ寒天培地（Don Whitley Scientific LTD., Shipley, West Yorkshire, UK）上に塗布した。コロニー数を計測する前に、プレートを３７℃で７２時間インキュベートした。全ての操作を嫌気キャビネット内で行った。操作は三連で行った。

結果
幾つかの単離株（Ｆｒ４１／２及びＦｒ４９／ｆ／２）の胃腸条件に対する耐性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。表５及び表６に示した結果（ｌｏｇ１０ ｃｆｕの変化）は、ＧＣ６１のプロバイオティクスとしての使用の可能性を確認する。

表５は、嫌気キャビネット中での３７℃、５時間後におけるＧＣ６１のＦｒ４９／ｆ／２株及びＦｒ４１／２株の、ｐＨ２及びｐＨ３のペプシン溶液と、ｐＨ８の膵酵素とに対する耐性を示す。結果は、インキュベーション期間後におけるｌｏｇ１０の低減で表される。良好な耐性がｐＨ３で、及び膵酵素で観察された（１未満のｌｏｇ１０ ｃｆｕの低減）。

表６は、嫌気キャビネット中での３７℃、４８時間後におけるＦｒ４９／ｆ／２株及びＦｒ４１／２株の、ＭＲＳ培地中の胆汁塩に対する耐性を示す。結果は、インキュベーション期間後におけるｌｏｇ１０の低減又は増大（growth）で表される。低い数の低減が、ｐＨ３で、及び０．３％の胆汁塩で観察された（２未満のｌｏｇ１０ ｃｆｕの低減）。

胃腸免疫の調節
ＧＣ６１群の幾つかの単離株が、サイトカインレベルを調節することによる興味深い免疫調節効果を有することも確定された。

ＩＬ−１０は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球及びマクロファージにより産生されるサイトカインである。ＩＬ−１０は、抗体分泌細胞へのＢ細胞の増殖及び分化を増強する。ＩＬ−１０は、主に抗炎症性活性を示し、慢性炎症性疾患で見られる結合組織破壊の重要な負の調節因子であり得る。

ＩＬ−１２は、炎症性カスケード反応の初期に、主に抗原提示細胞（マクロファージ等）により産生されるサイトカインである。ＩＬ−１２はＩＦＮγ産生の強力な誘導因子であり、ナチュラルキラー細胞の活性化因子である。ｉｎ ｖｉｖｏでのＩＬ−１２の阻害は、多発性硬化症等の炎症性障害の処置において何らかの治療的価値を有し得る。

ＩＦＮγは、主に活性化Ｔリンパ球の産物であり、他のサイトカインと協働し、単球、マクロファージ、好中球及び内皮細胞のより強力な刺激をもたらす。

ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＩＦＮγの産生に及ぼすＧＣ６１の効果を試験するために、健康なドナー（ｎ＝５）から密度勾配遠心分離により末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。単離した末梢血単核球をその後、ＧＣ６１のプロバイオティクス細菌単離株ＦＲ４９／ｆ／２、ＦＲ１０１／ｈ／８、ＦＲ３９／１、ＦＲ４１／２及びＦＲ６６／ｅ／１を含む細菌単離株で、７２時間の期間３７℃で刺激した。上清をその後収集し、遠心分離し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＩＦＮγのレベルに関してアッセイした。

方法
ＦＲ４９／ｆ／２、ＦＲ１０１／ｈ／８、ＦＲ３９／１、ＦＲ４１／２及びＦＲ６６／ｅ／１を含むビフィズス菌の菌株を、ガスパック（GENbag Biomerieux）を備える嫌気ジャーにおいて、システイン（Sigma、０．５ｇ／ｌ）を添加したＭＲＳ培地（Difco）中で培養した。全ての菌株が純粋であることが見出された。

これらの純粋な菌株の継代培養物を全てのさらなる実験において使用し、予備及び品質制御のために−８０℃でグリセロール培養物として保存した。

ＰＢＭＣの調製
図５に例示したように、健康な被験体から得た新たなヒト血液を、ＰＢＳ−Ｃａ（GIBCO）（図６における試験管Ａ）で１：２の比で希釈し、Ｆｉｃｏｌｌグラジエント（GIBCO）で精製した。２０℃で３０分間、４００×ｇでの遠心分離後、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）が血清中に間期環状層（interphase ring layer）を形成した（図５における試験管Ｂ）。ＰＢＭＣを慎重に吸引し、ＰＢＳ−Ｃａを使用して最終体積５０ｍｌに懸濁し、２０℃で１０分間、３５０×ｇでの遠心分離工程を用いて同じ緩衝液中で３回洗浄した。

ＰＢＭＣをその後、１０％（ｗ／ｖ）のウシ胎児血清（５６℃で３０分間不活性化させた）、１％（ｗ／ｖ）のＬ−グルタミン（GIBCO）、及びゲンタマイシン（１５０μｇ／ｍｌ）（GIBCO）を添加した完全ＲＰＭＩ培地（GIBCO）を使用して再懸濁した。ＰＢＭＣを、顕微鏡下で計測し、１ｍｌ当たり２×１０⁶個の細胞の濃度に調整し、２４ウェルの組織培養プレート（Corning, Inc．）中に分注した（１ｍｌの一定分量で）。

細菌調製
乳酸桿菌（Lactobacillus）又はビフィズス菌の培養物を終夜増殖させ、その後、２×１０⁹ｃｆｕ／ｍｌの濃度でＰＢＳ中に再懸濁する前に、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で２回洗浄した。表７は、ＧＣ６１単離株ＦＲ４９／ｆ／２（＝菌株Ｃ）、ＦＲ１０１／ｈ／８ （＝菌株Ｆ）、ＦＲ３９／１（＝菌株Ｉ）、ＦＲ４１／２（＝菌株Ｍ）及びＦＲ６６／Ｅ／１（＝菌株Ｎ）を含む研究した細菌株を詳述する。ＧＣ６１株（菌株Ａ〜菌株Ｐ）と共に、他のビフィズス菌の種の菌株（菌株Ｑ〜菌株Ｚ）も研究した。

ＰＢＭＣのインキュベーション
１０μｌの細菌懸濁物を、その後ＰＢＭＣの入ったウェル中に移した。プレートをその後、５％ＣＯ₂／９５％空気雰囲気中において３７℃でインキュベートした。２４時間のインキュベーション後、上清を吸引し、２０００ｒｐｍで遠心分離（エッペンドルフモデル）し、上清を除去し−２０℃で保存した。対照（Ｔｅｍｏｉｎ）として、細菌懸濁物の代わりに細菌を含まない緩衝液を使用して、手順を行った。

サイトカインの定量
炎症促進性／Ｔｈ１サイトカインＩＦＮγのレベル、ＩＬ−１２のレベル、及び抗炎症性調節サイトカインＩＬ−１０のレベルを、処理したＰＭＢＣから除去した上清中において確定した。

サイトカイン発現レベルを、ＥＬＩＳＡにより確定した。ＥＬＩＳＡプレートを、１つ又は複数の特異的抗サイトカイン抗体で（終夜の手順で）コーティングし、抗体をＰＢＳ／ＢＳＡ１％でブロッキングした。

サイトカインを、ストレプトアビジン反応を使用して検出及び定量した。ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）の入ったPharmingenの市販のキットを、製造業者の取扱説明書に従って使用した。

結果
サイトカイン分析の結果を、図６Ａ〜図６Ｄに示す。各データ点は、各々異なるドナーからの５つの血液試料の分析の平均である。

図６Ｃから分かるように、ＦＲ４９／ｆ／２株（菌株Ｃ）、ＦＲ３９／１株（菌株Ｉ）、ＦＲ４１／２株（菌株Ｍ）及びＦＲ６６／Ｅ／１株（菌株Ｎ）は全てが、末梢血単核球との同時インキュベーション（co-incubation）後、ＩＬ−１０の産生を有意に誘発した。ＦＲ１０１／Ｈ／８株（菌株Ｆ）は、対照と比較してＩＬ−１０レベルを有意に変化させなかった。

図６Ｂから分かるように、ＦＲ４９／ｆ／２株（菌株Ｃ）は、ＩＬ−１２産生の刺激を誘発せず、高レベルのＩＬ−１０／ＩＬ−１２係数により示されるように（図６Ｄ）、興味深い抗炎症効果を示した。ＦＲ４９／ｆ／２に関して観察されたレベルは、以前に試験した最良のビフィズス菌の種と同程度に高い。

ＦＲ４９／ｆ／２株を除く試験した全ての菌株が、ＩＦＮγ産生を誘発した。

結論として、ＦＲ４９／ｆ／２株は、抗炎症性プロバイオティクスの用途における使用のための良好なプロファイルを有する。

大腸炎のモデルにおける、免疫調節能に関するＦＲ４９／ｆ／２株（菌株Ｃ）及びＦＲ６６／ａ／１株（菌株Ｐ）の評価
ＧＣ６１群からの菌株Ｃ（ＦＲ４９／ｆ／２）と、ＧＣ６１でない群１からの菌株Ｐ（ＦＲ６６／ａ／１）とが、ＰＢＭＣ試験において反対の特性を示し（図６）、大腸炎の動物モデルにおける免疫調節能を評価するためにさらに研究された。

菌株Ｖ（Ｃ６−２０）及び菌株Ｘ（Ｃ９−５）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの研究で高いＩＬ−１０／ＩＬ−１２比を有するので、陽性対照として使用した。

化学試薬
化学薬品及び試薬は、他に記載がなければ、Sigma-Aldrich Chemical（France）から購入した。

動物
フランス政府の指針（８６／６０９／ＣＥＥ番）に従い、認可を受けた施設（Ａ５９１０７番、パスツール研究所の動物施設（Lille, France））において動物実験を行った。母乳で育てられ、特定病原体を除去した（ＳＰＦ）条件下で維持された、均質な菌叢を有する通常の成体の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウス（７／８週齢）（Felasa, 1994 - （Federation of European Laboratory Animal Science Associations）. Laboratory Animals, 28: 1-12）を、Iffa Credo（Saint-Germain sur l'Arbresle, France）から購入した。マウスを集団で収容し（１ケージ当たり８匹〜１０匹）、ＳＰＦ条件下で、柵（barrier）の後方にフィルタトップフードを設けた状態で維持した。マウスは水道水及びげっ歯類用食餌に自由に接近することができ、任意の介入の前に少なくとも１週間順応させられた。１０匹のマウスの群を、各実験群に関して使用した。

細菌培養物の調製、及びマウスへの投与
調査した菌株を、ＰＢＭＣ方法において上で説明したように増殖させた１日の投与当たり、１０⁸個の細菌を使用した。

急性大腸炎のＴＮＢＳ誘発、及び研究デザイン
標準的な細菌介入研究のデザインを、図７に示す。簡潔には、大腸炎の誘発前−５日から、０日目の大腸炎の誘発後＋１日まで、細菌懸濁物をマウスに与えた。死亡率、肉眼による炎症スコア、体重及びＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ活性）を大腸炎の誘発の４８時間後に評価した。マウスを、０．９％のＮａＣｌ中に溶解した３ｍｇのケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ １０００；Merial Lyon, France）、４６．７μｇのジアゼパム（Ｖａｌｉｕｍ、Roche Diagnostics）、及び１５μｇのアトロピン（Aguettant Laboratory, Lyon, France）で麻酔した。体重１ｋｇ当たり１２０ｍｇの用量のＴＮＢＳ（Fluka, France）を、０．９％ＮａＣｌ／エタノール（５０／５０（ｖ／ｖ））中に溶解し、５０μｌを、３．５Ｆカテーテル（ＥＯ ３４１６−１、Biotrol, Chelles, France）を使用して、肛門の近位４ｃｍで直腸内に投与した。「陰性対照」マウスには５０％エタノールのみを投与した（「エタノールマウス」）。「陽性対照」マウス（「ＴＮＢＳ対照」又は「ＴＮＢＳ処理」マウスとも称される）には、或る量のビフィズス菌を付加的に投与した「処理」マウスと比較して、ＮａＨＣＯ₃緩衝液のみを与えた。動物を、ＴＮＢＳ投与の２日後に頸椎脱臼により屠殺した。マウスについて、ＴＮＢＳ投与前及び屠殺時に体重を測定した。

肉眼による大腸炎の評価
大腸を切り出して脂肪及び腸間膜がない状態としてから取り出し慎重に開きＰＢＳで洗浄した。Ｗａｌｌａｃｅ基準（Wallace et al. 1989, Gastroenterology.96(l):29-36、表９に要約した）に従い、大腸の損傷及び炎症を、評価した。肉眼によるスコア付け（スコアは０〜１０の範囲である）のためのこれらの基準は、ラット及びマウスの研究の両方で十分に確立されており、（ｉ）炎症の強度、（ｉｉ）大腸粘膜の肥厚化、及び（ｉｉｉ）潰瘍の範囲を反映する（表９）。

ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性
多形核好中球一次（primary）顆粒のマーカーである酵素ＭＰＯの活性を、Bradley et al（1982. J Invest Dermatol. 78(3):206-9）に従い、近位の大腸組織において確定した。屠殺直後に、大腸試料（１ｃｍ長）を盲腸結腸（ceco-colonic）接合部から３ｃｍで採取した。試料をリン酸カリウム緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．０）中に懸濁し、ポリトロンを使用して氷中で均質化した。３サイクルの凍結及び融解を行った。懸濁物を、１００００×ｇで、４℃で１５分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットをヘキサデシルトリメチルアンモニウム臭化物緩衝液（５０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中のＨＴＡＢ０．５％（ｗ／ｖ））、多形核好中球一次（primary）顆粒からＭＰＯの放出を誘導する洗浄剤中に再懸濁した。これらの懸濁物を氷上で超音波処理し、再び４℃で１５分間遠心分離した。得られた上清を、０．１６７ｍｇ／ｍｌのＯ−ジアニシジン二塩酸塩と、０．０００５％の過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）とを含有するリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に希釈した。ヒト好中球由来のＭＰＯ（０．１Ｕ／１００ｍｌ、Sigma）を、標準として使用した。５分及び１０分にわたり、４５０ｎｍでの吸光度の変化を、マイクロプレート分光光度計（ＥＬＸ８０８、Bio-Tek Instrument, CA）を用いて記録した。１単位のＭＰＯ活性を、２５℃で１分当たり１ｍｌ当たり１ｍｍｏｌの過酸化水素を分解するＭＰＯの量と定義する。結果を、平均±ＳＥＭとして示す。

結果
細菌株により与えられる保護の程度を、本明細書においては、非処理マウス（ＴＮＢＳ対照群）の平均スコアに対する処理マウスの肉眼で認められる炎症の平均の低減率（％）を表す「％相対的保護率」と表現する。％相対的保護率は、以下で詳述するように算出する。

％相対的保護率＝１００×（平均Ｗａｌｌａｃｅスコア「陽性対照」群−平均Ｗａｌｌａｃｅスコア「処理」群）／平均Ｗａｌｌａｃｅスコア「陽性対照」群

この算出は、実験内及び実験間でのマウスの群の比較を可能にする。

この「相対的保護率」を各「陽性対照」群の平均大腸炎レベルに適用すると、独立の実験間における避けられないＷａｌｌａｃｅスコアの変動の排除も可能となる。

図８Ａ〜図８Ｃ及び表１０は、１０匹のマウスの６つの異なる群を分析したときに得られる結果を示す。
群１：１０匹のＴＮＢＳ処理マウス（細菌なし）
群２：１０匹のＴＮＢＳ処理マウス（＋Ｆｒ４９／ｆ／２株）
群３：１０匹のＴＮＢＳ処理マウス（＋Ｆｒ６６／ａ／１株）
群４：１０匹のＴＮＢＳ処理マウス（＋Ｃ６−２０株）
群５：１０匹のＴＮＢＳ処理マウス（＋Ｃ９−５株）
群６：１０匹のＴＮＢＳ処理マウス（−対照ビフィズス菌株）

ＩＬ−１０／ＩＬ−１２比から予想されるように、菌株Ｃ（ＦＲ４９／ｆ／２）は大腸炎モデルにおいて十分に保護を与えた。

別のＧＣ６１群でないビフィズス菌である菌株Ｐ（ＦＲ６６／ａ／１）も、幾らかの保護を示した。

示されたデータは、ＧＣ６１群の幾つかの単離株、特にＦＲ４９／ｆ／２株が抗炎症性を有することを実証し、それらを免疫調節性作用物質として使用することができるという主張を支持する。

Claims (6)

1. ２００７年１月９日にアクセッション番号ＣＮＣＭＩ−３７１３でＣＮＣＭに寄託されたビフィズス菌ＧＣ６１又はその子孫。
2. 請求項１に記載のビフィズス菌ＧＣ６１又はその子孫と、１つ又は複数の許容可能な添加物とを含むプロバイオティクス組成物。
3. 前記組成物が食品製品である、請求項２に記載のプロバイオティクス組成物。
4. 前記食品製品が発酵乳、植物乳、豆乳、バター、チーズ及びヨーグルトから選択される乳製品である、請求項３に規定されるようなプロバイオティクス組成物。
5. 免疫調節性及び／又は抗炎症性のプロバイオティクス若しくは薬物の調製における、請求項１に記載のビフィズス菌ＧＣ６１又はその子孫の使用。
6. 哺乳動物の被験体における炎症の処置のための薬物の調製における、請求項１に記載のビフィズス菌ＧＣ６１又はその子孫の使用。

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