CN115362963B - 一种紫贻贝腹泻性贝毒质控样品的生产方法及质控样品 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种紫贻贝腹泻性贝毒质控样品的生产方法及质控样品。一种紫贻贝腹泻性贝毒质控样品的生产方法，包括如下步骤：将紫贻贝预处理后置于海水中进行饥饿培养，控制饥饿培养的水温为12‑16℃，对培养体系增氧曝气；持续培养7‑10d；使用产腹泻性贝毒的饵料藻投喂经过饥饿培养的紫贻贝，投喂间隔为每8‑12h投喂1次，每次的投喂量为60‑80mL/枚；维持培养水温为12‑16℃，对培养体系增氧曝气；持续培养7‑14d，培养结束后，将得到的紫贻贝样品经过匀浆处理后，得到紫贻贝腹泻性贝毒质控样品。采用本申请的方法制备的紫贻贝麻痹性贝毒质控样品的毒素含量高且均匀性好，可以满足各实验的检测限和质控等实验要求。
Description
技术领域
本申请涉及海洋生物技术领域，更具体地说，它涉及一种紫贻贝腹泻性贝毒质控样品的生产方法及质控样品。
背景技术
腹泻性贝毒(Diarrhetic Shellfish Poisoning，DSP)属于八大海洋贝类毒素之一，是由有毒赤潮藻类鳍藻属和原甲藻属的一些种类产生的脂溶性多环醚类生物活性物质，根据成分的碳骨架结构可以将其分成三组：①酸性成分：软海绵酸(OA)和其天然衍生物—鳍藻毒素(DTX-3)；②中性成分：聚醚内酯—蛤毒素(PTXI-Vn)；③其它成分：磺化毒物及其衍生物。
腹泻性贝毒可在贝等滤食性动物体内富集和转化，不仅会危害人体健康，导致食用者出现腹泻、呕吐、恶心、腹痛和头疼等症状，而且对海洋环境和食品安全等带来潜在风险；因此对食物中腹泻性贝毒的检测具有重要的意义。
目前腹泻性贝毒的常用检测方法有：小白鼠生物试验法、免疫分析、高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱联用(LC/MS)等。不同的检测方法的准确性不同，引入质控样品有助于验证方法的准确性。质控样品是指将已知量的待测样品加入到生物介质中配制而成，用于质量控制。在检测水产品中腹泻性贝毒浓度时，增加已知浓度的质控样品，可验证样品中腹泻性贝毒的检测结果。
但是，目前尚未有如何制取紫贻贝腹泻性贝毒质控样品的相关报道。
发明内容
为了解决上述问题，本申请提供一种紫贻贝腹泻性贝毒质控样品的生产方法及质控样品。
第一方面，本申请提供了一种紫贻贝腹泻性贝毒质控样的生产方法，采用如下的技术方案：
一种紫贻贝腹泻性贝毒质控样的生产方法，包括如下步骤：
S1、紫贻贝的饥饿培养：
将紫贻贝的贝壳表面清洗并使其排污后，得到预处理的紫贻贝；
将经过预处理的紫贻贝置于海水中进行饥饿培养，使海水没过紫贻贝；控制培养水温为12-16℃，对培养体系增氧曝气；持续培养7-10d，挑捡出死亡贝体，保留存活贝体；
S2、紫贻贝的培养：
使用产腹泻性贝毒的饵料藻投喂经过饥饿培养的紫贻贝，投喂间隔为每8-12h投喂1次，每次的投喂量为60-80mL/枚贝体；维持培养水温为12-16℃，对培养体系增氧曝气；持续培养7-14d，培养结束后，得到紫贻贝样品备用：
S3、紫贻贝质控样品的收集以及后处理：
取紫贻贝样品，取其贝肉后经过匀浆处理后，得到紫贻贝腹泻性贝毒质控样品。
质控样品是指将已知量的待测样品加入到生物介质中配制而成，用于质量控制。质控样品在使用的过程中有两个主要的性能指标的要求：一是要求质控样品的毒素浓度具有很好的均匀性，以满足质控等实验要求；二是质控样品具有较高的毒素含量，可以满足各实验的检测限。通过采用上述技术方案，本申请主要是通过以下方法进行控制：
关于质控样品毒素浓度的均匀性，由于本申请的紫贻贝的原料是直接采购而来的，为了降低不同原料对贝毒含量浓度以及均匀性的影响，本申请对紫贻贝进行饥饿培养，通过饥饿培养7-10d，使其代谢排出体内可能含有的毒素，制得空白样紫贻贝，以降低野生紫贻贝中原有毒素对质控样品毒素浓度的影响；同时经过饥饿培养后，可以保留能够适应人工培养环境且生长性能较为一致的紫贻贝，由此得到的每个紫贻贝的毒素积累能力接近，从而可以提高质控样品毒素的均匀性。
关于质控样品的毒素浓度，需要在提高毒素富集量的同时，降低生产成本；本申请通过研究紫贻贝的毒素富集峰值，确定最为适宜的饵料藻投喂量、培养周期以及培养温度，可以在较短的培养周期内，提高毒素的富集量。
可选的，所述S2中，将紫贻贝置于体积为35000-45000cm3的培养容器中进行培养，每1枚紫贻贝所添加的海水量为0.8-1.2L。
可选的，所述培养容器的高度为10-18cm。
培养体系对紫贻贝毒素富集的均匀性也具有较大的影响，本申请经过研究发现，通过采用本申请的上述培养体系，可以保证紫贻贝具有较好的生长性以及毒素富集的均匀性，从而满足紫贻贝质控样品对毒素浓度含量以及毒素均匀性的要求。
可选的，所述S1中的增氧曝气量为300-350L/min，所述S2中的增氧曝气量为60-80L/min。
通过采用上述技术方案，通过对培养容器进行增氧曝气处理，可以提高水中的溶氧量，有利于紫贻贝的生长。在紫贻贝饥饿培养阶段，采用300-350L/min的曝气量，既能提高紫贻贝的存活率，也可以加快紫贻贝对毒素的代谢，以便得到空白样紫贻贝；在紫贻贝的培养阶段，通过控制增氧曝气量为60-80L/min，既能满足增氧的需要，又可以减少培养容器中水的波动，降低因饵料藻分布不均而影响紫贻贝采食的问题，从而可以更好的控制紫贻贝质控样中毒素的均匀性。
可选的，所述S3中，取紫贻贝样品，将其置于-20～-30℃的温度下冷冻3-5h，然后将经过冷冻处理后的紫贻贝样品于室温下解冻至贝口张开，切断紫贻贝的闭壳肌后，取其贝肉经过匀浆处理后，得到紫贻贝腹泻性贝毒质控样品。
通过采用上述技术方案，由于活体贻贝破壳过程中(切断闭壳肌)，容易划破贝肉组织，使活体贻贝产生应激反应，可能造成毒素的流失或降解；因此，本申请在取贝肉前，先将紫贻贝样品经过冷冻处理，而后缓慢解冻后再取贝肉，可以降低紫贻贝的应激反应，以提高毒素含量的均匀性。
可选的，S2中，所述饵料藻的藻种为利玛原甲藻。
通过采用上述技术方案，本申请选用的利玛原甲藻对紫贻贝具有很好的适口性，有利于毒素的富集。
可选的，所述饵料藻采用如下方法制备：
(1)培养：将利玛原甲藻藻种种质接种于海水f/2培养液中，于21.0-23.0℃、光周期12L：12D、光照强度4500-5500lux条件下培养15-20d，藻液细胞密度>6000cells/mL时得到合格藻液备用；
(2)制备：将经过步骤(1)培养的合格藻液经过离心后，去除清液保留藻泥；向藻泥添加海水，混匀为高密度藻液后，得到饵料藻。
通过采用上述技术方案，不同的光照强度、周期以及温度均会影响藻细胞的生长和产毒，本申请在利玛原甲藻的培养阶段，通过控制培养的温度、光周期、光照强度，可以获得生长状态好、产毒效率高的饵料藻；采用该饵料藻饲喂紫贻贝时，有利于紫贻贝体内毒素的富集，从而得到高毒素含量的紫贻贝质控样品。
可选的，所述步骤(2)的离心速度为3000-4000r/min，离心时间为7-10min。
可选的，所述步骤(2)中，藻泥与海水的添加比例为1g：8-15mL。
第二方面，本申请提供一种由紫贻贝腹泻性贝毒质控样品的生产方法生产的紫贻贝腹泻性贝毒质控样品。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
本申请的方法具有生产周期短、成本低的优点；采用本申请的方法制备的紫贻贝麻痹性贝毒质控样品的毒素含量高，基本可以满足各实验的检测限；并且产品具有很好的均匀性，可以满足质控等实验要求。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请作进一步的描述。
除特别说明外，制备例以及实施例中的原料均可通过市售获得。
制备例：饵料藻的制备方法
饵料藻采用如下方法制备：
(1)培养：将利玛原甲藻(P.lima001藻株)藻种种质接种于海水f/2培养液中，于22.0℃、光周期12L：12D、光照强度5000lux条件下培养16d，使藻液细胞密度达到6000cells/mL，得到合格藻液备用。
(2)制备：将经过步骤(1)培养的合格藻液在3500r/min的条件下离心8min，去除清液保留藻泥；向藻泥添加抽滤海水(抽滤海水是由天然海水使用0.45μm微孔滤膜抽滤获得)，藻泥与抽滤海水的添加比例为1g：10mL，以漩涡混匀器将藻泥重悬成高密度藻液后，得到饵料藻。
实施例
一种紫贻贝腹泻性贝毒质控样品的生产方法，包括如下步骤：
S1、紫贻贝的饥饿培养：
S11、筛选：紫贻贝采购于海鲜市场，选取贝壳长度5-7cm的健康贝体作为生产材料；
S12、清洗：使用抽滤海水清刷贝壳表面污物，将清刷后的贝体于抽滤海水中浸泡3h，控制水温条件为16℃，使其排出体内部分污物，得到预处理的紫贻贝；
S13、饥饿培养：将经过预处理的紫贻贝分散置于培养水槽(尺寸为50cm×40cm×18cm)中，添加抽滤海水至水面没过贝体5cm，贝体与海水的添加量的比例为1(枚):1(L)；培养过程中须控制水温条件为16℃，并以水族增氧泵对培养体系持续进行增氧曝气，曝气量为320L/min；每日8点全量更换培养水体，并以新鲜抽滤海水等量补充换水量；饥饿培养持续7d，每日捡出死亡贝体，保留存活贝体。
S2、紫贻贝的培养：
培养水槽(尺寸为50cm×40cm×18cm)中加入天然海水，单槽放置20枚经过S1饥饿培养的紫贻贝，每日上午8点全量更换水体；每日分别在上午9点和下午5点各投喂一次由制备例制得的饵料藻，每次每个培养水槽中的投喂量为1500mL；培养过程中的水温为16℃，并以水族增氧泵对培养体系持续进行增氧曝气，曝气量为70L/min；培养周期为12d，培养结束后，保留活体紫贻贝样品备用。
S3、紫贻贝质控样品的收集以及处理：
将紫贻贝样品用自来水冲刷其表面污物，沥干水分后置于-20℃的温度下冷冻4h；然后将冷冻处理后的紫贻贝样品于室温环境缓慢解冻至贝口微微张开，使用解剖刀切断紫贻贝的闭壳肌，完整取出贝肉，切掉足丝；使用蒸馏水冲洗贝肉表面冰屑以及污物，将贝肉置于4℃的环境下用脱脂棉纱布吸干水分。将经过上述处理的贝肉使用高速均质器进行匀浆，以20000r/min的速度高速均质1min，停止30s，重复操作5次，得到紫贻贝腹泻性贝毒组织匀浆质控样品。
S4、检测定值：
取经过S3处理得到的质控样品，对样品中的毒素含量以及均匀性进行测定，其测定方法为：
(1)取样数量：N＝M/2.0g×5％，式中，N代表取样数量，M代表样本质量(g)；取样数量取整数。
(2)取样时，应保证在样品的上、中、下不同位置均有取样。
检测取出的样品毒素情况，主要检测毒素为OA/DTX1/DTX2，具体方法参照国标《食品安全国家标准贝类中腹泻性贝类毒素的测定》(GB 5009.212-2016)中的液相色谱-串联质谱法进行。
性能检测实验
采用实施例的方法，在经过饥饿培养的紫贻贝60枚，分装于3个培养槽中进行培养；培养完成后，收获活体紫贻贝58枚，得到紫贻贝贝肉365g。对质控样品取样10个，参照GB5009.212-2016中的方法进行腹泻性贝毒检测，检测结果见表1。
表1 质控样毒素含量测试表
| 样本 | OA(ppb) | DTX1(ppb) | DTX2(PPb) |
| 1 | 51.83 | 48.87 | 未检出 |
| 2 | 51.34 | 49.05 | 未检出 |
| 3 | 51.27 | 49.15 | 未检出 |
| 4 | 51.58 | 49.01 | 未检出 |
| 5 | 51.74 | 48.93 | 未检出 |
| 6 | 51.42 | 49.09 | 未检出 |
| 7 | 51.66 | 49.20 | 未检出 |
| 8 | 51.82 | 48.97 | 未检出 |
| 9 | 51.50 | 49.21 | 未检出 |
| 10 | 51.20 | 49.05 | 未检出 |
分别对表1中的OA、DTX1两组数据进行单因素方差分析得：P(OA)＝0.04，P(DTX1)＝0.01，即：样本均匀性良好，符合质量要求。
对比验证实验
质控样品在使用的过程中需要有两个主要的性能指标的要求：一是要求质控样品的毒素浓度具有很好的均匀性，以满足质控等实验要求；二是质控样品具有较高的毒素含量，可以满足各实验的检测限。本申请主要通过以下几个方面进行控制：饵料投喂量、培养周期、培养体系、培养温度。
1.饵料投喂实验
将紫贻贝采用实施例中的S1的方法进行饥饿培养后，选取存活的贝体进行如下实验：
培养水槽(尺寸为50cm×40cm×18cm)中加入天然海水，单槽放置20枚经过实施例S1饥饿培养的紫贻贝，设置培养温度为16℃，每日上午8点全量更换水体。饲养条件如下：
(1)每日分别在上午9点和下午5点各投喂一次由制备例制得的饵料藻；
(2)单次投喂梯度设置为500mL、1000mL、1500mL、2000mL、2500mL；
(3)每日17点记录如下数据：饵料残留情况(cells/mL)、紫贻贝存活情况(枚)、水体浑浊情况(浑浊/清澈)；将实验数据记录于表2；
(4)实验周期3天。
表2 饵料投喂量实验数据表
根据表2数据可以看出，在饵料投喂量为500mL、1000mL的情况下，存在饵料无残留，说明可能存在饵料不足的问题，紫贻贝可能处于饥饿状态，不能达到毒素富集的最高效率。当饵料投喂量在2000mL以上时，会引起水体浑浊，造成紫贻贝死亡。因此，在投喂量为1500mL左右时，可以达到较高的毒素富集效率。
2.培养周期实验
将紫贻贝采用实施例中的S1的方法进行饥饿培养后，选取存活的贝体进行如下实验：
培养水槽(尺寸为50cm×40cm×18cm)中加入天然海水，单槽放置20枚经过实施例S1饥饿培养的紫贻贝，设置培养温度为16℃，每日上午8点全量更换水体。饲养条件如下：
(1)每日分别在上午9点和下午5点各投喂一次由制备例制得的饵料藻；
(2)单次投喂量为1500mL；
(3)实验周期为21天；
(4)在实验的第3、6、9、12、15、18、21天，随机选取2枚紫贻贝，检测毒素情况，检测方法参照《食品安全国家标准贝类中腹泻性贝类毒素的测定》(GB 5009.212-2016)中的液相色谱-串联质谱法进行，将检测结果记录于表3。
表3 培养周期实验数据表
| 3day | 6day | 9day | 12day | 15day | 18day | 21day | |
| OA(ppb) | 0 | 15.35 | 27.42 | 43.82 | 38.59 | 39.34 | 40.11 |
| DTX1(ppb) | 0 | 13.94 | 21.51 | 35.58 | 35.61 | 36.71 | 37.52 |
| DTX2(ppb) | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 |
根据表3数据可以看出，在3-12d，随着培养周期的延长，毒素富集量显著增加；在培养周期大于12d时，毒素富集速度减缓，毒素富集量缓慢增加；因此，从生产成本考虑，在培养周期为12d时，既能达到较好的毒素富集效果，满足质量要求，又能控制生产成本。
3.培养体系
(1)培养体系以及曝气量的大小对样品毒素浓度的均匀性具有较大的影响，本申请通过对不同规格的容器以及不同的曝气量进行测试，分别采用10L的圆形桶、36L塑料方槽、60L塑料方槽作为培养容器；装水后，加入饵料藻并开启曝气，控制曝气量为70L/min，曝气1min后，在容器的不同位置随机取样，检测饵料藻密度的均匀性。
确定当培养容器为50cm×40cm×18cm的36L方槽，并保持曝气量为70L/min，可以保证饵料藻在培养水槽中保持均匀分布，可避免紫贻贝出现摄食不均匀性的情况，有利于保持质控样毒素浓度的均匀性。
4.培养温度
利玛原甲藻具有广温性(5-30℃)，其最佳生长温度为25℃，但是温度升高会抑制藻细胞的产毒能力。本申请通过控制培养温度为16℃，可以使得利玛原甲藻具有较高的产毒能力。
综上所述，通过对饵料投喂量、培养周期、培养体系、培养温度进行控制，并在紫贻贝培养前经过饥饿培养，可以得到毒素含量高、毒素浓度均匀的质控样，并且本申请的生产方法操作简便、时间周期短、产品质量稳定。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种紫贻贝腹泻性贝毒质控样品的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、紫贻贝的饥饿培养：
将紫贻贝的贝壳表面清洗并使其排污后，得到预处理的紫贻贝；
将经过预处理的紫贻贝置于海水中进行饥饿培养，使海水没过紫贻贝；控制培养水温为12-16℃，对培养体系增氧曝气；持续培养7-10d，挑捡出死亡贝体，保留存活贝体；
S2、紫贻贝的培养：
使用产腹泻性贝毒的饵料藻投喂经过饥饿培养的紫贻贝，投喂间隔为每8-12h投喂1次，每次的投喂量为60-80mL/枚贝体；维持培养水温为12-16℃，对培养体系增氧曝气；持续培养7-14d，培养结束后，得到紫贻贝样品备用：
S3、紫贻贝质控样品的收集以及后处理：
取紫贻贝样品，取其贝肉后经过匀浆处理后，得到紫贻贝腹泻性贝毒质控样品。
2.根据权利要求1所述的一种紫贻贝腹泻性贝毒质控样品的生产方法，其特征在于，所述S2中，将紫贻贝置于体积为35000-45000cm3的培养容器中进行培养，每1枚紫贻贝所添加的海水量为0.8-1.2L。
3.根据权利要求2所述的一种紫贻贝腹泻性贝毒质控样品的生产方法，其特征在于，所述培养容器的高度为10-18cm。
4.根据权利要求1所述的一种紫贻贝腹泻性贝毒质控样品的生产方法，其特征在于，所述S1中的增氧曝气量为300-350L/min，所述S2中的增氧曝气量为60-80L/min。
5.根据权利要求1所述的一种紫贻贝腹泻性贝毒质控样品的生产方法，其特征在于，所述S3中，取紫贻贝样品，将其置于-20～-30℃的温度下冷冻3-5h，然后将经过冷冻处理后的紫贻贝样品于室温下解冻至贝口张开，切断紫贻贝的闭壳肌后，取其贝肉经过匀浆处理后，得到紫贻贝腹泻性贝毒质控样品。
6.根据权利要求1所述的一种紫贻贝腹泻性贝毒质控样品的生产方法，其特征在于，S2中，所述饵料藻的藻种为利玛原甲藻。
7.根据权利要求6所述的一种紫贻贝腹泻性贝毒质控样品的生产方法，其特征在于，所述饵料藻采用如下方法制备：
(1)培养：将利玛原甲藻藻种种质接种于海水f/2培养液中，于21.0-23.0℃、光周期12L：12D、光照强度4500-5500lux条件下培养15-20d，藻液细胞密度>6000cells/mL时得到合格藻液备用；
(2)制备：将经过步骤(1)培养的合格藻液经过离心后，去除清液保留藻泥；向藻泥添加海水，混匀为高密度藻液后，得到饵料藻。
8.根据权利要求7所述的一种紫贻贝腹泻性贝毒质控样品的生产方法，其特征在于，所述步骤(2)的离心速度为3000-4000r/min，离心时间为7-10min。
9.根据权利要求7所述的一种紫贻贝腹泻性贝毒质控样品的生产方法，其特征在于，所述步骤(2)中，藻泥与海水的添加比例为1g：8-15mL。
10.一种紫贻贝腹泻性贝毒质控样品，其特征在于，由权利要求1-9任意一项所述的紫贻贝腹泻性贝毒质控样品的生产方法制得。
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2022
- 2022-09-09 CN CN202211094659.9A patent/CN115362963B/zh active Active
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