CN117534723A - 紫点海葵多肽毒素hc-k及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了紫点海葵多肽毒素HC‑K及其合成方法和应用，涉及多肽毒素技术领域，本发明从已发现的紫点海葵多肽库中筛选出可能具有活性的短肽HC‑K01～HC‑K05进行化学合成和生物活性研究。通过Fmoc固相合成法合成毒素HC‑K01～HC‑K05的线性肽，经氧化折叠合成具有一个二硫键的多肽毒素，将氧化肽经高效液相色谱仪HPLC制备纯化、分析和质谱鉴定。采用DPPH清除自由基实验表明其具有良好的抗氧化活性。
Description
技术领域
本发明涉及多肽毒素技术领域，具体为紫点海葵多肽毒素HC-K及其合成方法和应用。
背景技术
海葵是刺胞动物门，是现存最古老的有毒动物之一，化石和分子数据表明它们的起源在7.5亿年前的埃迪卡拉纪。海葵毒是一种具有药理和生物技术价值的海洋药物资源库，含有功能复杂多样的肽神经毒素。海葵产生的毒液主要用于防御、捕食、种内和种间竞争。与其他有毒动物不同，海葵的毒液一般是不同于其他有毒动物，海葵的毒液通常集中在称为刺囊(一种刺细胞)的结构中，这些刺囊分布在不同的部位，如放射状喉部、触手、柱状体、端突、肠丝，但在触手中含有较高丰度的刺囊。
《中华本草》和《中国药用动物志》记载，海葵具有收敛固涩、燥湿杀虫等功效，中医用来治疗脱肛、痔疮、蛲虫病等。海葵能镇静、止咳、降压、抗凝、抗菌、抗癌、兴奋平滑肌，甚至还有“通乳下奶”作用。民间还常用鲜海葵治疗痔疮、蛲虫病、体癣等，具有较好的疗效。
发明内容
本发明从紫点海葵中筛选出活性多肽序列，并通过氧化折叠合成紫点海葵功能多肽。通过DPPH清除自由基实验阐明该海葵多肽具有一定抗氧化活性。本发明为开发新型海洋药物奠定基础，为人类健康和海洋药物研究提供有力支撑。
本发明方案为：
紫点海葵多肽毒素HC-K，包括紫点海葵多肽毒素HC-K01、HC-K02、HC-K03、HC-K04、HC-K05中至少一种，
其氨基酸序列分别为HC-K01：SFCDDWFEACKDDK；HC-K02：DCEEIDECK；HC-K03：ALCYDIAPDSCK；HC-K04：DDCEAFADEGNCLQK；HC-K05：GACGVAIEPVSCYK。其具有两个半胱氨酸形成一个二硫键。
上述紫点海葵多肽毒素HC-K的合成方法，包括以下步骤：
(1)称取2-cl树脂，先用二氯甲烷浸泡，然后依次用二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤，加入第一个氨基酸、二氯甲烷和N,N-二异丙基乙胺进行反应，再加入甲醇和二氯甲烷反应，用二甲基甲酰胺洗涤，再加入含吡啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤，得到第一个树脂；
(2)在第一个树脂中加入第二个氨基酸和缩合剂，再加入二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基碳二亚胺反应，再加入含哌啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤，得到第二个树脂；
(3)根据所述紫点海葵多肽毒素HC-K的氨基酸序列，重复步骤(2)直到肽链结束，得到线性肽树脂；
(4)向线性肽树脂中加入甲醇进行冲洗并抽干，加入切割液切割，过滤后，加入冰乙醚，离心去除上层液冰乙醚，得到沉淀多肽粗品；
(5)纯化多肽粗品，得纯品线性肽HC-K01～HC-K05；
(6)将步骤(5)的线性肽溶于碳酸氢铵和二甲基亚砜混合溶液中，保持搅拌，形成二硫键；
(7)纯化后得到氧化肽纯品。
进一步的，步骤(1)的具体操作为，称取取代度Sd＝0.2～1.4mmol/g的2-cl树脂，先用二氯甲烷浸泡，然后依次用二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤，按照摩尔体积比例，加入0.6～1.0mmol第一个氨基酸、10～15mL二氯甲烷和1～3mL N,N-二异丙基乙胺进行反应80～100min，再加3～5mL甲醇和8～12mL二氯甲烷封闭反应25～35min，用二甲基甲酰胺洗涤，再加入含吡啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤15～25min，得到第一个树脂；其中，所述含哌啶的二甲基甲酰胺溶液为哌啶质量分数为18～22％的DMF溶液。
进一步的，步骤(2)的具体操作为，按照摩尔体积比例，在第一个树脂中加入1.5～2.0mmol第二个氨基酸和1.5～2.0mmol缩合剂，再加入5～15mL二甲基甲酰胺和1～3mL N,N-二异丙基碳二亚胺反应0.5～1.5h，再加入含哌啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤15～25min，得到第二个树脂；其中，所述含哌啶的二甲基甲酰胺溶液为哌啶质量分数为18～22％的DMF溶液。
进一步的，步骤(4)，所述切割液由质量比94～96：0.9～1.1：1.8～2.2：1.8～2.2的三氟乙酸、H2O、1,2-乙二硫醇和三异丙基硅烷组成。
进一步的，所述切割液含有：95wt％三氟乙酸、1wt％H2O、2wt％1,2-乙二硫醇和2wt％三异丙基硅烷。
进一步的，步骤(6)，所述碳酸氢铵和二甲基亚砜混合溶液由碳酸氢铵溶液和二甲基亚砜按照体积比88～92：8～12混合制得，所述碳酸氢铵溶液的摩尔浓度为0.08～0.12mol/L；所述搅拌为20～25℃搅拌22～28h。
进一步的，步骤(7)和步骤(5)中，所述纯化是利用高效液相色谱法进行纯化，纯化条件为：流动相A为H2O，流动相B为乙腈，流速0.9-1.1mL/min，线性梯度洗脱40-50min，流动相B体积百分占比由5％升至50％。
本发明紫点海葵多肽毒素HC-K01～HC-K05在制备抗氧化剂方面的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明利用高通量转录组从紫点海葵(Heteractis crispa)中发现新的紫点海葵多肽毒素HC-K01～HC-K05，其氨基酸序列分别为HC-K01：SFCDDWFEACKDDK；HC-K02：DCEEIDECK；HC-K03：ALCYDIAPDSCK；HC-K04：DDCEAFADEGNCLQK；HC-K05：GACGVAIEPVSCYK。其具有两个半胱氨酸形成一个二硫键。
2、本发明通过多肽固相合成法(SPPS)合成了线性肽HC-K01～HC-K05，对线性肽进行HPLC纯化，然后利用氧化折叠获得均含有一个二硫键的氧化肽HC-K01～HC-K05。
3、本发明提供紫点海葵(Heteractis crispa)多肽毒素HC-K01～HC-K05的合成方法及其抗氧化作用，该方法合成的紫点海葵多肽毒素HC-K01～HC-K05具有高效抗氧化效果，可较好地应用于制备新型、高效、安全生物抗氧化剂。
附图说明
图1为HPLC分析线性肽HC-K01～HC-K05示意图。
图2为线性肽HC-K01～HC-K05的质谱鉴定示意图。
图3为HPLC分析HC-K01～HC-K05氧化肽示意图。
图4为HC-K01～HC-K05氧化肽的质谱鉴定示意图。
图5为HC-K01～HC-K05氧化肽对DPPH自由基清除率的示意图，注：*表示具有显著性差异(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001)。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员更好的理解本发明技术内容，下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的描述。
本发明中所涉及英文或简写对应中文名称见下表1：
表1中文名称
本发明利用高通量转录组从紫点海葵(Heteractis crispa)中发现多肽毒素HC-K01～HC-K05，其氨基酸序列分别为HC-K01：SFCDDWFEACKDDK；HC-K02：DCEEIDECK；HC-K03：ALCYDIAPDSCK；HC-K04：DDCEAFADEGNCLQK；HC-K05：GACGVAIEPVSCYK。其具有两个半胱氨酸形成一个二硫键。
实验例：紫点海葵多肽毒素HC-K01～HC-K05的合成及其抗氧化试验
1、材料与方法
1.1实验材料
色谱级三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)和色谱级乙腈(Acetonitrile，ACN)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；water分析型C18柱(5μm，4.6mm×250mm)购自美国Waters公司；依利特制备型C18柱(10μm，10mm×250mm)购自大连依利特分析仪器有限公司。
1.2实验仪器
CEM全自动微波多肽合成仪(LibertyBlue，美国)；反相高效液相色谱(ThermoFisher，德国)；三重四极杆液相色谱质谱联用仪(岛津，日本)；台式冻干机(赛飞，中国)；智能热板仪(正华，中国)。
1.3实验方法
1.3.1紫点海葵多肽毒素HC-K01～HC-K05的合成方法
步骤如下：
(1)称取树脂(取代度Sd＝0.8mmol/g的2-cl树脂)，先用DCM(二氯甲烷)浸泡，然后依次用DMF(二甲基甲酰胺)和DCM洗涤，加入0.8mmol第一个氨基酸、12.5mL DCM和2mL DIEA(N,N-二异丙基乙胺)进行反应90min，后再加4mL甲醇和10mL DCM，封闭反应30min，用DMF洗涤，再加入哌啶质量分数为20％的DMF溶液洗涤20min，得到第一个树脂；
(2)在一个树脂中加入1.8mmol第二个氨基酸和1.8mmol缩合剂(HOBT)，加入10mLDMF，再加入2mL DIC(N,N-二异丙基碳二亚胺)反应1h，再加入含哌啶质量分数为20％的DMF溶液洗涤10min，得到第二个树脂；
(3)根据HC-K01～HC-K05的氨基酸序列，重复步骤(2)直到肽链结束，得到线性肽树脂；
(4)向线性肽树脂中加入甲醇进行冲洗并抽干，加入切割液(95wt％TFA、1wt％H2O、2wt％EDT和2wt％TIS)切割，过滤后，加入冰乙醚，4℃、12000r/min、5min离心3次后去除上层液冰乙醚，得到沉淀多肽粗品；
(5)用HPLC分离纯化多肽粗品，得到多肽纯品，即纯品线性肽HC-K01～HC-K05；HPLC条件与步骤(7)相同。
(6)将步骤(5)的线性肽溶于0.1M碳酸氢铵和二甲基亚砜混合溶液(v:v＝9：1)中，室温保持搅拌24h，形成一个二硫键；
(7)用HPLC分离纯化，流动相A为H2O，流动相B为ACN(乙腈)，流速1mL/min，5％-50％(B相体积)45min线性梯度洗脱，检测波长220nm，然后MS鉴定，冷冻干燥后得到多肽纯品，即HC-K01～HC-K05；
进一步说明，在本发明的其他实施例中，紫点海葵多肽毒素HC-K01～HC-K05的合成方法可以在以下范围内实施，均能获得相似结果。所述合成方法包括如下步骤：
(1)称取树脂(取代度Sd＝0.2～1.4mmol/g的2-cl树脂)，先用DCM(二氯甲烷)浸泡，然后依次用DMF(二甲基甲酰胺)和DCM洗涤，加入0.6～1.0mmol第一个氨基酸、10～15mLDCM和1～3mL DIEA(N,N-二异丙基乙胺)进行反应80～100min，后再加3～5mL甲醇和8～12mL DCM，封闭反应25～35min，用DMF洗涤，再加入哌啶质量分数为18～22％的DMF溶液洗涤15～25min，得到第一个树脂；
(2)在第一个树脂中加入1.5～2.0mmol第二个氨基酸和1.5～2.0mmol缩合剂(HOBT)，加入5～15mL DMF，再加入1～3mL DIC(N,N-二异丙基碳二亚胺)反应0.5～1.5h，再加入含哌啶质量分数为18～22％的DMF溶液洗涤15～25min，得到第二个树脂；
(3)根据HC-K01～HC-K05的氨基酸序列，重复步骤(2)直到肽链结束，得到线性肽树脂；
(4)向线性肽树脂中加入甲醇进行冲洗并抽干，加入切割液(由质量比94～96：0.9～1.1：1.8～2.2：1.8～2.2的三氟乙酸、H2O、1,2-乙二硫醇和三异丙基硅烷组成)切割，过滤后，加入冰乙醚，4℃、12000r/min、5min离心3次后去除上层液冰乙醚，得到沉淀多肽粗品；
(5)用HPLC分离纯化多肽粗品，得到多肽纯品，即纯品线性肽HC-K01～HC-K05；HPLC条件与步骤(7)相同。
(6)将步骤(5)的线性肽溶于由碳酸氢铵溶液(0.08～0.12M)和二甲基亚砜按照体积比88～92：8～12混合所制溶液中，在20～25℃温度条件搅拌22～28h，形成一个二硫键；
(7)用HPLC分离纯化，流动相A为H2O，流动相B为ACN(乙腈)，流速5mL/min，5％-50％(B相体积)45min线性梯度洗脱，检测波长220nm，然后MS鉴定，冷冻干燥后得到多肽纯品；
1.3.2DPPH清除自由基实验
取紫点海葵多肽HC-K01～HC-K05的氧化肽纯品冻干粉末用纯水溶解，稀释成1mg/mL，2mg/mL，3mg/mL，4mg/mL和5mg/mL五组浓度梯度，进行3次平行实验。DPPH自由基清除能力试剂盒中的工作液粉剂临用前将粉剂甩落瓶底后加入19mL无水乙醇充分溶解，制备成工作液。空白管中加150μL的80％甲醇和150μL的工作液混匀，对照管中加150μL多肽溶液和150μL 80％甲醇混匀，测定管中加150μL多肽溶液和150μL的工作液混匀，每一个浓度都需要对应的测定管和对照管。混匀后用锡纸包裹，置于暗处避光反应30分钟，12000rpm、室温条件下离心5min。提前预热酶标仪30min，检测波长设置为517nm，用移液枪分别吸取离心完的上清液200μL到96孔板中，测定各管的吸光度值。
1.3.3数据处理
数据均采用软件GraphPad Prism8进行统计和处理，对照组和实验组间的数据采用t检验分析，*表示差异显著(p<0.05)，**表示差异极显著(p<0.01)，***表示差异极显著(p<0.001)，****表示差异极显著(p<0.0001)。
2结果
2.1多肽的合成和氧化折叠
采用多肽固相合成法(SPPS)合成了紫点海葵线性肽HC-K01～HC-K05，对线性肽进行HPLC纯化，质谱图见图2。利用空气氧化法对合成的线性肽进行一步法氧化折叠，并对氧化折叠终产物进行HPLC纯化和质谱鉴定。氧化后的氧化肽HC-K01～HC-K05的分子量(见图4)与线性肽HC-K01～HC-K05相比，均相差约2Da，证明正确形成二硫键。
2.2氧化肽的分离纯化
采用分析型HPLC对线性肽HC-K01～HC-K05进行分析，结果如图1所示，线性肽HC-K01～HC-K05的洗脱时间分别为27.213min、13.513min、21.628min、19.309min和22.616min。采用制备型HPLC对氧化后的HC-K01～HC-K05进行分离纯化，纯化后再利用分析型HPLC进行分析，结果如图3所示，氧化后的氧化肽HC-K01～HC-K05的洗脱时间分别为27.954min、12.920min、21.366min、18.316min和22.336min。
本发明利用空气氧化法对合成的线性肽HC-K01～HC-K05样品进行氧化折叠，并对氧化折叠终产物进行HPLC纯化和质谱鉴定，获得紫点海葵多肽毒素HC-K01～HC-K05，即氧化肽HC-K01～HC-K05，其氨基酸序列分别为HC-K01：SFCDDWFEACKDDK；HC-K02：DCEEIDECK；HC-K03：ALCYDIAPDSCK；HC-K04：DDCEAFADEGNCLQK；HC-K05：GACGVAIEPVSCYK。其具有两个半胱氨酸形成一个二硫键。
2.3DPPH清除自由基实验
实验结果如图5所示，根据五种紫点海葵多肽氧化肽HC-K01～HC-K05样品浓度的不断升高，DPPH自由基清除率也呈不断上升的趋势，清除率与五种海葵多肽的浓度均成正相关且与空白组存在显著性差异，说明五种海葵多肽均有显著的抗氧化能力。其中，相同浓度下HC-K02与HC-K05的抗氧化能力相对较弱，在5mg/mL的浓度下清除率只有42.81％和36.20％，而HC-K03表现出的抗氧化能力相对优秀，在5mg/mL的浓度下清除率已经达到81.33％，HC-K01和HC-K04的抗氧化能力也表现得较为显著，在5mg/mL的浓度下清除率也达到了64.70％和60.03％。
以上所述仅为本发明的部分实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.紫点海葵多肽毒素HC-K，其特征在于，包括紫点海葵多肽毒素HC-K01、HC-K02、HC-K03、HC-K04、HC-K05中至少一种，
其氨基酸序列分别为：
HC-K01：SFCDDWFEACKDDK；
HC-K02：DCEEIDECK；
HC-K03：ALCYDIAPDSCK；
HC-K04：DDCEAFADEGNCLQK；
HC-K05：GACGVAIEPVSCYK。
2.根据权利要求1所述的紫点海葵多肽毒素HC-K，其特征在于，所述紫点海葵多肽毒素HC-K具有两个半胱氨酸形成一个二硫键。
3.权利要求1所述的紫点海葵多肽毒素HC-K的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取2-cl树脂，先用二氯甲烷浸泡，然后依次用二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤，加入第一个氨基酸、二氯甲烷和N,N-二异丙基乙胺进行反应，再加入甲醇和二氯甲烷反应，用二甲基甲酰胺洗涤，再加入含吡啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤，得到第一个树脂；
(2)在第一个树脂中加入第二个氨基酸和缩合剂，再加入二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基碳二亚胺反应，再加入含哌啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤，得到第二个树脂；
(3)根据所述紫点海葵多肽毒素HC-K的氨基酸序列，重复步骤(2)直到肽链结束，得到线性肽树脂；
(4)向线性肽树脂中加入甲醇进行冲洗并抽干，加入切割液切割，过滤后，加入冰乙醚，离心去除上层液冰乙醚，得到沉淀多肽粗品；
(5)纯化多肽粗品，得纯品线性肽HC-K；
(6)将步骤(5)的线性肽溶于碳酸氢铵和二甲基亚砜混合溶液中，保持搅拌，形成二硫键；
(7)纯化后得到氧化肽纯品。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，步骤(1)的具体操作为，称取取代度Sd＝0.2～1.4mmol/g的2-cl树脂，先用二氯甲烷浸泡，然后依次用二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤，按照摩尔体积比例，加入0.6～1.0mmol第一个氨基酸、10～15mL二氯甲烷和1～3mLN,N-二异丙基乙胺进行反应80～100min，再加3～5mL甲醇和8～12mL二氯甲烷封闭反应25～35min，用二甲基甲酰胺洗涤，再加入含吡啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤15～25min，得到第一个树脂；其中，所述含哌啶的二甲基甲酰胺溶液为哌啶质量分数为18～22％的DMF溶液。
5.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，步骤(2)的具体操作为，按照摩尔体积比例，在第一个树脂中加入1.5～2.0mmol第二个氨基酸和1.5～2.0mmol缩合剂，再加入5～15mL二甲基甲酰胺和1～3mL N,N-二异丙基碳二亚胺反应0.5～1.5h，再加入含哌啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤15～25min，得到第二个树脂；其中，所述含哌啶的二甲基甲酰胺溶液为哌啶质量分数为18～22％的DMF溶液。
6.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，步骤(4)，所述切割液由质量比94～96：0.9～1.1：1.8～2.2：1.8～2.2的三氟乙酸、H2O、1,2-乙二硫醇和三异丙基硅烷组成。
7.根据权利要求6所述的合成方法，其特征在于，所述切割液含有：95wt％三氟乙酸、1wt％H2O、2wt％1,2-乙二硫醇和2wt％三异丙基硅烷。
8.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，步骤(6)，所述碳酸氢铵和二甲基亚砜混合溶液由碳酸氢铵溶液和二甲基亚砜按照体积比88～92：8～12混合制得，所述碳酸氢铵溶液的摩尔浓度为0.08～0.12mol/L；所述搅拌为20～25℃搅拌22～28h。
9.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，步骤(5)和步骤(7)中，所述纯化是利用高效液相色谱法进行纯化，纯化条件为：流动相A为H2O，流动相B为乙腈，流速0.9-1.1mL/min，线性梯度洗脱40-50min，流动相B体积百分占比由5％升至50％。
10.权利要求1所述的紫点海葵多肽毒素HC-K在制备抗氧化剂方面的应用。
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