CN117534723A - 紫点海葵多肽毒素hc-k及其合成方法和应用 - Google Patents
紫点海葵多肽毒素hc-k及其合成方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117534723A CN117534723A CN202311445953.4A CN202311445953A CN117534723A CN 117534723 A CN117534723 A CN 117534723A CN 202311445953 A CN202311445953 A CN 202311445953A CN 117534723 A CN117534723 A CN 117534723A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- resin
- polypeptide
- dimethylformamide
- solution
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 100
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 74
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 54
- 239000003053 toxin Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 title claims abstract description 31
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 title claims description 4
- 241000242759 Actiniaria Species 0.000 title abstract description 26
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 108
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 74
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 40
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 40
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 27
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical group CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 18
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 240000004530 Echinacea purpurea Species 0.000 claims description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 claims description 10
- 235000014134 echinacea Nutrition 0.000 claims description 10
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000002173 cutting fluid Substances 0.000 claims description 7
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 6
- 241001083548 Anemone Species 0.000 claims description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 5
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 1,2-ethanedithiol Chemical compound SCCS VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 4
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 4
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 4
- -1 H 2 O Chemical compound 0.000 claims description 3
- 238000005086 pumping Methods 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 6
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000007760 free radical scavenging Effects 0.000 abstract description 4
- HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N dpph Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1[N]N(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 abstract 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 7
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 4
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 4
- 241000746758 Heteractis crispa Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxybenzothiazole Chemical compound C1=CC=C2SC(O)=NC2=C1 YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 206010014881 enterobiasis Diseases 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 208000014617 hemorrhoid Diseases 0.000 description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 2
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 2
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010005913 Body tinea Diseases 0.000 description 1
- 241001260012 Bursa Species 0.000 description 1
- KCNGGGRYSBHKIO-UHFFFAOYSA-N CC[S+]1SC=CC1 Chemical compound CC[S+]1SC=CC1 KCNGGGRYSBHKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 1
- 230000002292 Radical scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 206010038084 Rectocele Diseases 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002474 Tinea Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 235000019606 astringent taste Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- MGJZITXUQXWAKY-UHFFFAOYSA-N diphenyl-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1N=[N+](C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 MGJZITXUQXWAKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 201000003875 tinea corporis Diseases 0.000 description 1
- 230000002936 tranquilizing effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004457 water analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
- A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了紫点海葵多肽毒素HC‑K及其合成方法和应用,涉及多肽毒素技术领域,本发明从已发现的紫点海葵多肽库中筛选出可能具有活性的短肽HC‑K01~HC‑K05进行化学合成和生物活性研究。通过Fmoc固相合成法合成毒素HC‑K01~HC‑K05的线性肽,经氧化折叠合成具有一个二硫键的多肽毒素,将氧化肽经高效液相色谱仪HPLC制备纯化、分析和质谱鉴定。采用DPPH清除自由基实验表明其具有良好的抗氧化活性。
Description
技术领域
本发明涉及多肽毒素技术领域,具体为紫点海葵多肽毒素HC-K及其合成方法和应用。
背景技术
海葵是刺胞动物门,是现存最古老的有毒动物之一,化石和分子数据表明它们的起源在7.5亿年前的埃迪卡拉纪。海葵毒是一种具有药理和生物技术价值的海洋药物资源库,含有功能复杂多样的肽神经毒素。海葵产生的毒液主要用于防御、捕食、种内和种间竞争。与其他有毒动物不同,海葵的毒液一般是不同于其他有毒动物,海葵的毒液通常集中在称为刺囊(一种刺细胞)的结构中,这些刺囊分布在不同的部位,如放射状喉部、触手、柱状体、端突、肠丝,但在触手中含有较高丰度的刺囊。
《中华本草》和《中国药用动物志》记载,海葵具有收敛固涩、燥湿杀虫等功效,中医用来治疗脱肛、痔疮、蛲虫病等。海葵能镇静、止咳、降压、抗凝、抗菌、抗癌、兴奋平滑肌,甚至还有“通乳下奶”作用。民间还常用鲜海葵治疗痔疮、蛲虫病、体癣等,具有较好的疗效。
发明内容
本发明从紫点海葵中筛选出活性多肽序列,并通过氧化折叠合成紫点海葵功能多肽。通过DPPH清除自由基实验阐明该海葵多肽具有一定抗氧化活性。本发明为开发新型海洋药物奠定基础,为人类健康和海洋药物研究提供有力支撑。
本发明方案为:
紫点海葵多肽毒素HC-K,包括紫点海葵多肽毒素HC-K01、HC-K02、HC-K03、HC-K04、HC-K05中至少一种,
其氨基酸序列分别为HC-K01:SFCDDWFEACKDDK;HC-K02:DCEEIDECK;HC-K03:ALCYDIAPDSCK;HC-K04:DDCEAFADEGNCLQK;HC-K05:GACGVAIEPVSCYK。其具有两个半胱氨酸形成一个二硫键。
上述紫点海葵多肽毒素HC-K的合成方法,包括以下步骤:
(1)称取2-cl树脂,先用二氯甲烷浸泡,然后依次用二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤,加入第一个氨基酸、二氯甲烷和N,N-二异丙基乙胺进行反应,再加入甲醇和二氯甲烷反应,用二甲基甲酰胺洗涤,再加入含吡啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤,得到第一个树脂;
(2)在第一个树脂中加入第二个氨基酸和缩合剂,再加入二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基碳二亚胺反应,再加入含哌啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤,得到第二个树脂;
(3)根据所述紫点海葵多肽毒素HC-K的氨基酸序列,重复步骤(2)直到肽链结束,得到线性肽树脂;
(4)向线性肽树脂中加入甲醇进行冲洗并抽干,加入切割液切割,过滤后,加入冰乙醚,离心去除上层液冰乙醚,得到沉淀多肽粗品;
(5)纯化多肽粗品,得纯品线性肽HC-K01~HC-K05;
(6)将步骤(5)的线性肽溶于碳酸氢铵和二甲基亚砜混合溶液中,保持搅拌,形成二硫键;
(7)纯化后得到氧化肽纯品。
进一步的,步骤(1)的具体操作为,称取取代度Sd=0.2~1.4mmol/g的2-cl树脂,先用二氯甲烷浸泡,然后依次用二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤,按照摩尔体积比例,加入0.6~1.0mmol第一个氨基酸、10~15mL二氯甲烷和1~3mL N,N-二异丙基乙胺进行反应80~100min,再加3~5mL甲醇和8~12mL二氯甲烷封闭反应25~35min,用二甲基甲酰胺洗涤,再加入含吡啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤15~25min,得到第一个树脂;其中,所述含哌啶的二甲基甲酰胺溶液为哌啶质量分数为18~22%的DMF溶液。
进一步的,步骤(2)的具体操作为,按照摩尔体积比例,在第一个树脂中加入1.5~2.0mmol第二个氨基酸和1.5~2.0mmol缩合剂,再加入5~15mL二甲基甲酰胺和1~3mL N,N-二异丙基碳二亚胺反应0.5~1.5h,再加入含哌啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤15~25min,得到第二个树脂;其中,所述含哌啶的二甲基甲酰胺溶液为哌啶质量分数为18~22%的DMF溶液。
进一步的,步骤(4),所述切割液由质量比94~96:0.9~1.1:1.8~2.2:1.8~2.2的三氟乙酸、H2O、1,2-乙二硫醇和三异丙基硅烷组成。
进一步的,所述切割液含有:95wt%三氟乙酸、1wt%H2O、2wt%1,2-乙二硫醇和2wt%三异丙基硅烷。
进一步的,步骤(6),所述碳酸氢铵和二甲基亚砜混合溶液由碳酸氢铵溶液和二甲基亚砜按照体积比88~92:8~12混合制得,所述碳酸氢铵溶液的摩尔浓度为0.08~0.12mol/L;所述搅拌为20~25℃搅拌22~28h。
进一步的,步骤(7)和步骤(5)中,所述纯化是利用高效液相色谱法进行纯化,纯化条件为:流动相A为H2O,流动相B为乙腈,流速0.9-1.1mL/min,线性梯度洗脱40-50min,流动相B体积百分占比由5%升至50%。
本发明紫点海葵多肽毒素HC-K01~HC-K05在制备抗氧化剂方面的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
1、本发明利用高通量转录组从紫点海葵(Heteractis crispa)中发现新的紫点海葵多肽毒素HC-K01~HC-K05,其氨基酸序列分别为HC-K01:SFCDDWFEACKDDK;HC-K02:DCEEIDECK;HC-K03:ALCYDIAPDSCK;HC-K04:DDCEAFADEGNCLQK;HC-K05:GACGVAIEPVSCYK。其具有两个半胱氨酸形成一个二硫键。
2、本发明通过多肽固相合成法(SPPS)合成了线性肽HC-K01~HC-K05,对线性肽进行HPLC纯化,然后利用氧化折叠获得均含有一个二硫键的氧化肽HC-K01~HC-K05。
3、本发明提供紫点海葵(Heteractis crispa)多肽毒素HC-K01~HC-K05的合成方法及其抗氧化作用,该方法合成的紫点海葵多肽毒素HC-K01~HC-K05具有高效抗氧化效果,可较好地应用于制备新型、高效、安全生物抗氧化剂。
附图说明
图1为HPLC分析线性肽HC-K01~HC-K05示意图。
图2为线性肽HC-K01~HC-K05的质谱鉴定示意图。
图3为HPLC分析HC-K01~HC-K05氧化肽示意图。
图4为HC-K01~HC-K05氧化肽的质谱鉴定示意图。
图5为HC-K01~HC-K05氧化肽对DPPH自由基清除率的示意图,注:*表示具有显著性差异(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001)。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员更好的理解本发明技术内容,下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的描述。
本发明中所涉及英文或简写对应中文名称见下表1:
表1中文名称
本发明利用高通量转录组从紫点海葵(Heteractis crispa)中发现多肽毒素HC-K01~HC-K05,其氨基酸序列分别为HC-K01:SFCDDWFEACKDDK;HC-K02:DCEEIDECK;HC-K03:ALCYDIAPDSCK;HC-K04:DDCEAFADEGNCLQK;HC-K05:GACGVAIEPVSCYK。其具有两个半胱氨酸形成一个二硫键。
实验例:紫点海葵多肽毒素HC-K01~HC-K05的合成及其抗氧化试验
1、材料与方法
1.1实验材料
色谱级三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)和色谱级乙腈(Acetonitrile,ACN)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;water分析型C18柱(5μm,4.6mm×250mm)购自美国Waters公司;依利特制备型C18柱(10μm,10mm×250mm)购自大连依利特分析仪器有限公司。
1.2实验仪器
CEM全自动微波多肽合成仪(LibertyBlue,美国);反相高效液相色谱(ThermoFisher,德国);三重四极杆液相色谱质谱联用仪(岛津,日本);台式冻干机(赛飞,中国);智能热板仪(正华,中国)。
1.3实验方法
1.3.1紫点海葵多肽毒素HC-K01~HC-K05的合成方法
步骤如下:
(1)称取树脂(取代度Sd=0.8mmol/g的2-cl树脂),先用DCM(二氯甲烷)浸泡,然后依次用DMF(二甲基甲酰胺)和DCM洗涤,加入0.8mmol第一个氨基酸、12.5mL DCM和2mL DIEA(N,N-二异丙基乙胺)进行反应90min,后再加4mL甲醇和10mL DCM,封闭反应30min,用DMF洗涤,再加入哌啶质量分数为20%的DMF溶液洗涤20min,得到第一个树脂;
(2)在一个树脂中加入1.8mmol第二个氨基酸和1.8mmol缩合剂(HOBT),加入10mLDMF,再加入2mL DIC(N,N-二异丙基碳二亚胺)反应1h,再加入含哌啶质量分数为20%的DMF溶液洗涤10min,得到第二个树脂;
(3)根据HC-K01~HC-K05的氨基酸序列,重复步骤(2)直到肽链结束,得到线性肽树脂;
(4)向线性肽树脂中加入甲醇进行冲洗并抽干,加入切割液(95wt%TFA、1wt%H2O、2wt%EDT和2wt%TIS)切割,过滤后,加入冰乙醚,4℃、12000r/min、5min离心3次后去除上层液冰乙醚,得到沉淀多肽粗品;
(5)用HPLC分离纯化多肽粗品,得到多肽纯品,即纯品线性肽HC-K01~HC-K05;HPLC条件与步骤(7)相同。
(6)将步骤(5)的线性肽溶于0.1M碳酸氢铵和二甲基亚砜混合溶液(v:v=9:1)中,室温保持搅拌24h,形成一个二硫键;
(7)用HPLC分离纯化,流动相A为H2O,流动相B为ACN(乙腈),流速1mL/min,5%-50%(B相体积)45min线性梯度洗脱,检测波长220nm,然后MS鉴定,冷冻干燥后得到多肽纯品,即HC-K01~HC-K05;
进一步说明,在本发明的其他实施例中,紫点海葵多肽毒素HC-K01~HC-K05的合成方法可以在以下范围内实施,均能获得相似结果。所述合成方法包括如下步骤:
(1)称取树脂(取代度Sd=0.2~1.4mmol/g的2-cl树脂),先用DCM(二氯甲烷)浸泡,然后依次用DMF(二甲基甲酰胺)和DCM洗涤,加入0.6~1.0mmol第一个氨基酸、10~15mLDCM和1~3mL DIEA(N,N-二异丙基乙胺)进行反应80~100min,后再加3~5mL甲醇和8~12mL DCM,封闭反应25~35min,用DMF洗涤,再加入哌啶质量分数为18~22%的DMF溶液洗涤15~25min,得到第一个树脂;
(2)在第一个树脂中加入1.5~2.0mmol第二个氨基酸和1.5~2.0mmol缩合剂(HOBT),加入5~15mL DMF,再加入1~3mL DIC(N,N-二异丙基碳二亚胺)反应0.5~1.5h,再加入含哌啶质量分数为18~22%的DMF溶液洗涤15~25min,得到第二个树脂;
(3)根据HC-K01~HC-K05的氨基酸序列,重复步骤(2)直到肽链结束,得到线性肽树脂;
(4)向线性肽树脂中加入甲醇进行冲洗并抽干,加入切割液(由质量比94~96:0.9~1.1:1.8~2.2:1.8~2.2的三氟乙酸、H2O、1,2-乙二硫醇和三异丙基硅烷组成)切割,过滤后,加入冰乙醚,4℃、12000r/min、5min离心3次后去除上层液冰乙醚,得到沉淀多肽粗品;
(5)用HPLC分离纯化多肽粗品,得到多肽纯品,即纯品线性肽HC-K01~HC-K05;HPLC条件与步骤(7)相同。
(6)将步骤(5)的线性肽溶于由碳酸氢铵溶液(0.08~0.12M)和二甲基亚砜按照体积比88~92:8~12混合所制溶液中,在20~25℃温度条件搅拌22~28h,形成一个二硫键;
(7)用HPLC分离纯化,流动相A为H2O,流动相B为ACN(乙腈),流速5mL/min,5%-50%(B相体积)45min线性梯度洗脱,检测波长220nm,然后MS鉴定,冷冻干燥后得到多肽纯品;
1.3.2DPPH清除自由基实验
取紫点海葵多肽HC-K01~HC-K05的氧化肽纯品冻干粉末用纯水溶解,稀释成1mg/mL,2mg/mL,3mg/mL,4mg/mL和5mg/mL五组浓度梯度,进行3次平行实验。DPPH自由基清除能力试剂盒中的工作液粉剂临用前将粉剂甩落瓶底后加入19mL无水乙醇充分溶解,制备成工作液。空白管中加150μL的80%甲醇和150μL的工作液混匀,对照管中加150μL多肽溶液和150μL 80%甲醇混匀,测定管中加150μL多肽溶液和150μL的工作液混匀,每一个浓度都需要对应的测定管和对照管。混匀后用锡纸包裹,置于暗处避光反应30分钟,12000rpm、室温条件下离心5min。提前预热酶标仪30min,检测波长设置为517nm,用移液枪分别吸取离心完的上清液200μL到96孔板中,测定各管的吸光度值。
1.3.3数据处理
数据均采用软件GraphPad Prism8进行统计和处理,对照组和实验组间的数据采用t检验分析,*表示差异显著(p<0.05),**表示差异极显著(p<0.01),***表示差异极显著(p<0.001),****表示差异极显著(p<0.0001)。
2结果
2.1多肽的合成和氧化折叠
采用多肽固相合成法(SPPS)合成了紫点海葵线性肽HC-K01~HC-K05,对线性肽进行HPLC纯化,质谱图见图2。利用空气氧化法对合成的线性肽进行一步法氧化折叠,并对氧化折叠终产物进行HPLC纯化和质谱鉴定。氧化后的氧化肽HC-K01~HC-K05的分子量(见图4)与线性肽HC-K01~HC-K05相比,均相差约2Da,证明正确形成二硫键。
2.2氧化肽的分离纯化
采用分析型HPLC对线性肽HC-K01~HC-K05进行分析,结果如图1所示,线性肽HC-K01~HC-K05的洗脱时间分别为27.213min、13.513min、21.628min、19.309min和22.616min。采用制备型HPLC对氧化后的HC-K01~HC-K05进行分离纯化,纯化后再利用分析型HPLC进行分析,结果如图3所示,氧化后的氧化肽HC-K01~HC-K05的洗脱时间分别为27.954min、12.920min、21.366min、18.316min和22.336min。
本发明利用空气氧化法对合成的线性肽HC-K01~HC-K05样品进行氧化折叠,并对氧化折叠终产物进行HPLC纯化和质谱鉴定,获得紫点海葵多肽毒素HC-K01~HC-K05,即氧化肽HC-K01~HC-K05,其氨基酸序列分别为HC-K01:SFCDDWFEACKDDK;HC-K02:DCEEIDECK;HC-K03:ALCYDIAPDSCK;HC-K04:DDCEAFADEGNCLQK;HC-K05:GACGVAIEPVSCYK。其具有两个半胱氨酸形成一个二硫键。
2.3DPPH清除自由基实验
实验结果如图5所示,根据五种紫点海葵多肽氧化肽HC-K01~HC-K05样品浓度的不断升高,DPPH自由基清除率也呈不断上升的趋势,清除率与五种海葵多肽的浓度均成正相关且与空白组存在显著性差异,说明五种海葵多肽均有显著的抗氧化能力。其中,相同浓度下HC-K02与HC-K05的抗氧化能力相对较弱,在5mg/mL的浓度下清除率只有42.81%和36.20%,而HC-K03表现出的抗氧化能力相对优秀,在5mg/mL的浓度下清除率已经达到81.33%,HC-K01和HC-K04的抗氧化能力也表现得较为显著,在5mg/mL的浓度下清除率也达到了64.70%和60.03%。
以上所述仅为本发明的部分实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均落入本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.紫点海葵多肽毒素HC-K,其特征在于,包括紫点海葵多肽毒素HC-K01、HC-K02、HC-K03、HC-K04、HC-K05中至少一种,
其氨基酸序列分别为:
HC-K01:SFCDDWFEACKDDK;
HC-K02:DCEEIDECK;
HC-K03:ALCYDIAPDSCK;
HC-K04:DDCEAFADEGNCLQK;
HC-K05:GACGVAIEPVSCYK。
2.根据权利要求1所述的紫点海葵多肽毒素HC-K,其特征在于,所述紫点海葵多肽毒素HC-K具有两个半胱氨酸形成一个二硫键。
3.权利要求1所述的紫点海葵多肽毒素HC-K的合成方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)称取2-cl树脂,先用二氯甲烷浸泡,然后依次用二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤,加入第一个氨基酸、二氯甲烷和N,N-二异丙基乙胺进行反应,再加入甲醇和二氯甲烷反应,用二甲基甲酰胺洗涤,再加入含吡啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤,得到第一个树脂;
(2)在第一个树脂中加入第二个氨基酸和缩合剂,再加入二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基碳二亚胺反应,再加入含哌啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤,得到第二个树脂;
(3)根据所述紫点海葵多肽毒素HC-K的氨基酸序列,重复步骤(2)直到肽链结束,得到线性肽树脂;
(4)向线性肽树脂中加入甲醇进行冲洗并抽干,加入切割液切割,过滤后,加入冰乙醚,离心去除上层液冰乙醚,得到沉淀多肽粗品;
(5)纯化多肽粗品,得纯品线性肽HC-K;
(6)将步骤(5)的线性肽溶于碳酸氢铵和二甲基亚砜混合溶液中,保持搅拌,形成二硫键;
(7)纯化后得到氧化肽纯品。
4.根据权利要求3所述的合成方法,其特征在于,步骤(1)的具体操作为,称取取代度Sd=0.2~1.4mmol/g的2-cl树脂,先用二氯甲烷浸泡,然后依次用二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤,按照摩尔体积比例,加入0.6~1.0mmol第一个氨基酸、10~15mL二氯甲烷和1~3mLN,N-二异丙基乙胺进行反应80~100min,再加3~5mL甲醇和8~12mL二氯甲烷封闭反应25~35min,用二甲基甲酰胺洗涤,再加入含吡啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤15~25min,得到第一个树脂;其中,所述含哌啶的二甲基甲酰胺溶液为哌啶质量分数为18~22%的DMF溶液。
5.根据权利要求3所述的合成方法,其特征在于,步骤(2)的具体操作为,按照摩尔体积比例,在第一个树脂中加入1.5~2.0mmol第二个氨基酸和1.5~2.0mmol缩合剂,再加入5~15mL二甲基甲酰胺和1~3mL N,N-二异丙基碳二亚胺反应0.5~1.5h,再加入含哌啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤15~25min,得到第二个树脂;其中,所述含哌啶的二甲基甲酰胺溶液为哌啶质量分数为18~22%的DMF溶液。
6.根据权利要求3所述的合成方法,其特征在于,步骤(4),所述切割液由质量比94~96:0.9~1.1:1.8~2.2:1.8~2.2的三氟乙酸、H2O、1,2-乙二硫醇和三异丙基硅烷组成。
7.根据权利要求6所述的合成方法,其特征在于,所述切割液含有:95wt%三氟乙酸、1wt%H2O、2wt%1,2-乙二硫醇和2wt%三异丙基硅烷。
8.根据权利要求3所述的合成方法,其特征在于,步骤(6),所述碳酸氢铵和二甲基亚砜混合溶液由碳酸氢铵溶液和二甲基亚砜按照体积比88~92:8~12混合制得,所述碳酸氢铵溶液的摩尔浓度为0.08~0.12mol/L;所述搅拌为20~25℃搅拌22~28h。
9.根据权利要求3所述的合成方法,其特征在于,步骤(5)和步骤(7)中,所述纯化是利用高效液相色谱法进行纯化,纯化条件为:流动相A为H2O,流动相B为乙腈,流速0.9-1.1mL/min,线性梯度洗脱40-50min,流动相B体积百分占比由5%升至50%。
10.权利要求1所述的紫点海葵多肽毒素HC-K在制备抗氧化剂方面的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311445953.4A CN117534723A (zh) | 2023-11-01 | 2023-11-01 | 紫点海葵多肽毒素hc-k及其合成方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311445953.4A CN117534723A (zh) | 2023-11-01 | 2023-11-01 | 紫点海葵多肽毒素hc-k及其合成方法和应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117534723A true CN117534723A (zh) | 2024-02-09 |
Family
ID=89787193
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311445953.4A Pending CN117534723A (zh) | 2023-11-01 | 2023-11-01 | 紫点海葵多肽毒素hc-k及其合成方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117534723A (zh) |
-
2023
- 2023-11-01 CN CN202311445953.4A patent/CN117534723A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107163128B (zh) | κ-酪蛋白来源生物活性肽的制备和应用 | |
CN108456244B (zh) | 玉米抗氧化活性肽及其制备方法 | |
EP0124984A1 (en) | Marine organism extracts and their preparation | |
CN107383171A (zh) | 一种通过二次环化固相合成普卡那肽的方法 | |
CN103739693B (zh) | 一种具有抗氧化活性的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列及其应用 | |
Chen et al. | Purification and characterization of an antibacterial and anti-inflammatory polypeptide from Arca subcrenata | |
CN114262370B (zh) | 一种紫点海葵多肽毒素Hc-GQ及其制备方法和应用 | |
Dias et al. | Interaction study between wheat-derived peptides and procyanidin B3 by mass spectrometry | |
CN111777696B (zh) | 一种特异性可逆富集新生蛋白质的方法 | |
CN111471086B (zh) | 芝麻多肽及其制备方法和应用 | |
CN110105431B (zh) | 一种芝麻多肽及其提取方法和在制备抗氧化和/或降血压药物中的应用 | |
CN116217694A (zh) | 一种套膜海葵多肽毒素Ed79-WR及其制备方法和应用 | |
CN117534723A (zh) | 紫点海葵多肽毒素hc-k及其合成方法和应用 | |
CN109354607A (zh) | 一种普利卡那肽的固相片段合成方法 | |
CN117820422A (zh) | 地非法林的制备方法 | |
Abiko et al. | Identification and synthesis of a tripeptide in ECUM fluid of an upemic patient | |
CN108998427B (zh) | 一种酚氧化酶活性蛋白的制备方法 | |
Manning et al. | The deamino derivatives of [4-threonine]-oxytocin and [4-threonine]-mesotocin; Analogs possessing a surprising spectrum of diminished pharmacological activities | |
Lindeberg et al. | Purification of synthetic peptides Immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) | |
CN103421092B (zh) | 一种阿托西班的纯化方法 | |
CN114990181B (zh) | 一种抗衰老的大豆肽及其制备方法和应用 | |
Ste. Marie et al. | 2, 2′‐Dipyridyl diselenide: A chemoselective tool for cysteine deprotection and disulfide bond formation | |
CN113735953A (zh) | 一种海葵多肽毒素Ap-GT及其制备方法和应用 | |
CN111825754A (zh) | 一种从芝麻蛋白中获得的具有降血压与降血糖活性的多肽 | |
CN108314707B (zh) | 抗肿瘤活性肽及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |