KR100423022B1 - 쥐 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 유전자의인핸서/프로모터 및 사람 베타글로빈 인트론을 포함하는포유동물용 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 세포 및이 세포를 이용한 이종단백질의 생산 방법 - Google Patents

쥐 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 유전자의인핸서/프로모터 및 사람 베타글로빈 인트론을 포함하는포유동물용 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 세포 및이 세포를 이용한 이종단백질의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 발현율이 우수한 포유동물용 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 세포 및 이 세포를 이용한 이종단백질의 생산 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 발현벡터는 쥐 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기(immediate early) 유전자의 인해서/프로모터 및 그 하류에 사람 베타글로빈 유전자의 두 번째 인트론을 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

쥐 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 유전자의 인핸서/프로모터 및 사람 베타글로빈 인트론을 포함하는 포유동물용 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 세포 및 이 세포를 이용한 이종단백질의 생산 방법{EXPRESSION VECTOR FOR MAMMAL COMPRISING MURINE CYTOMEGALOVIRUS IMMEDIATE EARLY GENE ENHANCER/PROMOTER AND HUMAN BETA GLOBIN INTRON, CELL TRANSFORMED THEREWITH AND METHOD FOR PRODUCING HETEROLOGOUS PROTEIN USING SAID CELL}
본 발명은 발현율이 우수한 포유동물용 발현벡터, 이 발현벡터로 형질감염된 세포 및 이 세포를 이용한 이종단백질의 생산 방법에 관한 것이다.
동물용 발현벡터는 이종단백질의 대량생산 뿐만 아니라 최근 각광을 받고 있는 유전자 치료에도 유용하게 사용될 수 있어 그 중요성이 급증하는 추세이다. 이에 따라 동물세포에서 이종유전자를 고효율로 지속적으로 발현하는 발현벡터를 개발하기 위한 연구가 계속되고 있다.
현재 강력하고 안정적인 발현을 유도할 목적으로 진핵세포에서 강한 전사활성을 가지는 프로모터가 도입된 발현벡터들이 개발된 바 있다. 이러한 프로모터로는 사람 사이토메갈로바이러스(human cytomegalovirus, HCMV) 즉시 초기(immediate early, IE) 유전자 프로모터가 잘 알려져 있으며, 이외에 시미안바이러스 40 IE 유전자 프로모터, 라우스 육종바이러스(RSV) 유전자 프로모터, 사람 EF1-α 유전자의 프로모터 등도 사용되고 있다. 최근 사람 유비퀴틴(ubiquitin) 유전자 프로모터가 다양한 세포에서 균일한 발현을 유도하도록 개발되었다.
최근 쥐 사이토메갈로바이러스(murine cytomegalovirus, MCMV) IE 유전자의프로모터가 특정 세포에서 HCMV IE 유전자의 프로모터에 비해 수 배 내지 수십 배 높은 발현을 유도하며(Lafemina R et al,J Gen Virol., 69, 355-374 (1988)), 다양한 세포에서 균일하게 안정적인 발현을 유도함이 보고된 바 있다(Aiba-Masago S et al.,Am J Pathol.154, 735-743 (1999)). 특히, MCMV 주 즉시 초기 프로모터(major immediate-early promoter, MIEP) 부위에서 상류 영역이 제거된 것이 영장류와 마우스 세포에서 매우 강력한 발현을 유도함이 보고되었다(Kim and Risser,J. Virol.67, 239-248 (1993); 및 Kim,Biochem. Biophys. Res. Comm.,203, 1152-1159 (1994)).
한편 인트론도 높은 발현을 유도함이 보고된 후(Buchman A and Berg P Mol,Mol Cell Biol,8, 4395-4405 (1988); Choi T et al,Mol Cell Biol, 11, 3070-3074 (1991); 및 Palmiter R D et al.,Proc Natl Acad Sci USA,88, 478-482 (1991)), 안정적이고 강력한 발현을 유도할 목적으로 이종 인트론을 도입한 발현벡터들이 개발된 바 있다.
그러나 이들 발현벡터는 그 발현율이 만족할만하지 못하여, 보다 높은 발현율을 가지는 발현벡터가 절실히 요구되고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 동물세포에서 이종유전자를 강력하고 안정하게 발현하는 포유동물용 발현벡터를 제공하는 데 있다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포를 이용한 이종단백질의 생산 방법을 제공하는 데 있다.
도 1은 발현벡터 pMYK의 제작 과정의 모식도이다.
도 2는 발현벡터 pMYK/Glo-I의 제작 과정의 모식도이다.
도 3은 발현벡터 pMYK/Glo-I/luc의 제작 과정의 모식도이다.
도 4는 발현벡터 pMYK(del)의 제작 과정의 모식도이다.
도 5는 발현벡터 pHYK/luc와 pMYK/luc로부터 발현된 루시퍼라아제 수준을 나타내는 그래프이다.
도 6은 발현벡터 pMYK/luc와 pMYK/Glo-I/luc로부터 발현된 루시퍼라아제 수준을 나타내는 그래프이다.
도 7은 발현벡터 pHYK/luc와 pMYK/Glo-I/luc로부터 발현된 루시퍼라아제 수준을 나타내는 그래프이다.
도 8은 발현벡터 pHYK/Glo-I/luc와 pMYK/Glo-I/luc로부터 발현된 루시퍼라아제 수준을 나타내는 그래프이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 쥐 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 유전자의 인핸서/프로모터 및 그 하류에 사람 베타글로빈 유전자의 두 번째 인트론을 포함하는 포유동물용 발현벡터를 제공한다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 쥐 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 유전자의 인핸서/프로모터, 사람 베타글로빈 유전자의 두 번째 인트론 및 그 하류에 이종단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 포유동물용 발현벡터로 형질전환된 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는 이종단백질의 생산 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 발현벡터에 사용되는 쥐 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 유전자의 인핸서/프로모터(PMCMV)는 진뱅크(GenBank) 등록번호 제 M11788 호에 공지되어 있으며, 이 중 상류의 890 bp 영역이 제거된 서열번호: 1의 염기서열을 가지는 것이 바람직하다.
본 발명의 발현벡터에 사용되는 사람 베타글로빈 유전자의 두 번째 인트론(Glo-I)은 진뱅크 등록번호 제 V00499 호에 공지되어 있으며, 예를 들어 서열번호: 2의 염기서열을 가지는 것이다. Glo-I은 PMCMV의 하류에 위치하며, 이러한 PMCMV및 그 하류의 Glo-I를 포함하는 영역은 예를 들어 서열번호: 3의 염기서열을 가진다.
특히 상기 PMCMV및 그 하류의 Glo-I 영역은 강력하고 안정하게 발현을 유도하는데, 특히 기존의 사람 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 유전자 프로모터(PHCMV) 보다 약 5.3 배 이상 높은 발현 효율을 보이며 또한 PMCMV및 Glo-I 각각으로부터의 발현 효율의 총합 이상의 탁월한 발현 효율을 가진다.
본 발명의 발현벡터에는 필요에 따라 이종유전자의 클로닝을 용이하게 할 목적으로 다클로닝 부위(multi cloning site)를 Glo-I 하류에 추가로 포함할 수 있다.
상기 PMCMV, Glo-I 및 다클로닝 부위는 각각 쥐 사이토메갈로바이러스, 사람 조직 및 벡터로부터 분리하거나 공지의 DNA 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다.
본 발명의 발현벡터에는 PMCMV, Glo-I 및 다클로닝 부위 외에도 필요에 따라 대장균에서 복제와 선별을 위한 항생제 내성 유전자 및 폴리(A) 아데닐화 신호 부위 등을 포함할 수 있으며, 영구적인 발현을 위해 네오마이신 또는 지오신 내성 유전자와 같은 선별 표지 유전자를 포함할 수도 있다.
또한 본 발명에서는 상기 발현벡터의 Glo-I 부위 하류 또는 다클로닝 부위에 목적하는 이종유전자를 포함할 수 있다. 이러한 재조합 발현벡터는 목적하는 이종유전자를 공지된 클로닝 방법에 따라 상기 발현벡터에 삽입하여 얻을 수 있다.
이 발현벡터를 적절한 미생물 또는 동물 세포에 도입하여 형질전환 세포를 얻을 수 있다. 본 발명자들은 도 2의 구조를 갖는 발현벡터 pMYK/Glo-I를 대장균 DH5@에 도입하여 DH5@/MYK/Glo-i로 명명된 형질전환 대장균를 얻었으며, 이를 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2000년 9월 20일자 기탁번호 제 KCTC 0864BP 호로 기탁하였다.
이렇게 제조된 본 발명의 세포는 상기 발현벡터를 증폭하며, 특히 동물 세포는 이종유전자를 고효율로 지속적으로 발현한다. 따라서 본 발명의 동물 세포를 배양함으로써 이종단백질을 고효율로 생산할 수 있다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 사람 사이토메갈로바이러스 IE 유전자의 인핸서/프로모터(PHCMV)를 포함하는 벡터의 제작
시판되는 클로닝 벡터 pCRIIITM(Invitrogen, 미국)를 EcoRI으로 절단한 후 자가 연결하여 발현벡터 pHYK를 제작하였다. 이 발현벡터는 PHCMV하류에 다클로닝부위, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리(A) 아데닐화 신호부위(pA)를 포함하며, SV40 프로모터(PSV40)와 이의 복제 원점, 네오마이신 내성 유전자(neo r) 및 ColE1 복제 원점, 및 암피실린 내성 유전자를 포함한다.
제조예 2: 루시퍼라아제 유전자를 포함하는 벡터의 제작
벡터 pGL2/basic(Promega, 미국)을 HindIII와 SalI으로 절단하여, 루시퍼라아제 유전자의 ATG 개시 코돈과 종결 코돈이 포함된 약 2.7 kb 크기의 절편을 얻은 후, 이 절편을 벡터 pBluescript/KS(+) (Stratagene, 미국)의 HindIII/SalI 부위에 클로닝하여 루시퍼라아제 유전자를 포함하는 벡터 pKS/luc을 제작하였다.
실시예 1: 동물용 발현벡터의 제작
쥐 사이토메갈로바이러스(MCMV) IE 유전자의 인핸서/프로모터(PMCMV), 사람 베타 글로빈 유전자의 두번째 인트론(Glo-I) 및 다클로닝 부위를 차례로 포함하는 동물용 발현벡터를 다음과 같이 제작하였다.
(단계 1) PMCMV를 포함하는 발현벡터의 제작
벡터 pUCMV18(Yeon-Soo Kim and Rex Risser,J Virol,67, p239-248 (1993))를 ScaI 및 HindIII로 절단하여 PMCMV를 포함하는 995 kb 절편을 얻은 후 이 절편을 제조예 1에서 얻은 벡터 pHYK의 ScaI/HindIII 부위에 삽입하여 약 4.5 kb 크기의 발현벡터 pMYK를 제작하였다. 이 발현벡터는 pHYK 발현벡터에서 유래하는 BGH pA, PSV40와 SV40 복제 원점,neo r, ColE1 복제 원점 및 암피실린 내성 유전자를 가진다.도 1은 발현벡터 pMYK의 제작 과정의 모식도이다.
(단계 2) PMCMV하류에 Glo-I의 삽입
벡터 pGEM-T/Easy/beta-globin intron(이화여자대학교 의과대학 한 평림 박사로부터 얻음)을 EcoRI으로 절단하여 Glo-I를 포함하는 약 1.0 kb 길이의 절편을 얻은 후 이 절편을 단계 1에서 얻은 발현벡터 pMYK의 EcoRI 부위에 삽입하여 발현벡터 pMYK/Glo-I를 제조하였다.
이렇게 얻어진 PMCMV및 그 하류의 Glo-I를 포함하는 영역은 서열번호: 3의 염기서열을 가지며, 여기에서 뉴클레오티드 1 내지 660 번 영역은 PMCMV부위로 특히 583 내지 588 번 영역은 TATA 시그널이며, 716 내지 1657 번 영역은 Glo-I이다. 발현벡터 pMYK/Glo-I은 서열번호: 3의 염기서열 하류에 이종유전자 삽입을 위한 다클로닝 부위 영역이 존재한다.
도 2는 발현벡터 pMYK/Glo-I의 제작 과정의 모식도이다.
얻어진 발현벡터 pMYK/Glo-I를 대장균 DH5@에 도입하여 형질전환시킨 DH5@/MYK/Glo-i로 명명된 대장균을 생명공학연구소 부설 유전자은행에 2000년 9월 20일자 기탁번호 제 KCTC 0864BP 호로 기탁하였다.
(단계 3) 루시퍼라아제 유전자의 삽입
제조예 2에서 얻은 발현벡터 pKS/luc를 SmaI 및 HpaI으로 절단하여 루시퍼라아제 유전자를 포함하는 2.7kb 크기의 절편을 얻은 후 이 절편을 단계 2에서 얻은 발현벡터 pMYK/Glo-I의EcoRV부위에 삽입하여 발현벡터 pMYK/Glo-I/luc를 제작하였다.
도 3은 발현벡터 pMYK/Glo-I/luc의 제작 과정의 모식도이다.
실시예 2: 동물용 발현벡터의 제작
인체에 도입될 경우 발현되어 면역 반응과 같은 부작용을 유발할 우려가 있는 PSV40, SV40 복제원점 및neo r을 제거하기 위해, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 발현벡터 pMYK를 Bsu36I로 절단하여 PSV40, SV40 복제원점 및neo r이 포함된 약 2 kb 영역을 제거한 후 자가 연결하여 3.0 kb 크기의 벡터 pMYK(del)를 제작한 다음 이 벡터를 사용하여 실시예 1의 단계 2에서와 동일한 방법으로 실시하여 발현벡터 pMYK(del)/Glo-I를 제작하였다.
도 4는 발현벡터 pMYK(del)의 제작 과정의 모식도이다.
비교예 1
발현벡터 pMYK/Glo-I 대신에 제조예 1에서 얻은 벡터 pHYK를 사용한다는 점을 제외하고는 실시예 1의 단계 3에서와 동일한 방법으로 실시하여 발현벡터 pHYK/luc를 제작하였다.
비교예 2
발현벡터 pMYK/Glo-I 대신에 실시예 1의 단계 1에서 얻은 벡터 pMYK를 사용한다는 점을 제외하고는 실시예 1의 단계 3에서와 동일한 방법으로 실시하여 발현벡터 pMYK/luc를 제조하였다.
비교예 3
벡터 pMYK 대신에 제조예 1에서 얻은 벡터 pHYK를 사용한다는 점을 제외하고는 실시예 1의 단계 2에서와 동일한 방법으로 실시하여 발현벡터 pHYK/Glo-I을 제작한 후, 이 벡터를 사용하여 실시예 1의 단계 3에서와 동일한 방법으로 실시하여 발현벡터 pHYK/Glo-I/luc를 제작하였다.
실시예 3: 형질감염된 세포주의 제조
실시예 1의 단계 3, 비교예 1, 2 및 3에서 얻은 발현벡터 pMYK/Glo-I/luc, pHYK/luc, pMYK/luc 및 pHYK/Glo-I/luc를 각각 사람 세포주 293, HT1080, HeLa 및 U937(ATCC CRL-1573, CCL-121, CCL-2 및 CRL-1593)과 설치류 세포주 NIH3T3, CHO, Neuro2a(ATCC CRL-1658, CCL-61 및 CCL-131)에 전기적 형질도입 방법 (electroporation)에 따라 다음과 같이 형질감염시켰다. 즉, 1.5 x 106개 세포를 250 ㎕의 RPMI 배지에 현탁하고 여기에 발현벡터 DNA 2 ㎍를 가한 후 260 V, 1050 ㎌의 전기 충격을 주어, 발현벡터 DNA를 세포에 형질도입하였다.
시험예: 발현벡터의 발현율 조사
발현벡터의 발현율을 조사하기 위해, 실시예 3에서 발현벡터 pMYK/Glo-I/luc, pHYK/luc, pMYK/luc 또는 pHYK/Glo-I/luc로 형질감염시킨 세포주를 각각 미리 준비한 3 ㎖의 DMEM 배지에 가하고 6 시간 동안 방치하여 세포가 배양 플레이트에 정착하게 하였다. 이어서 세포를 인산완충용액(PBS)으로 2 회 세척한 후 3 ㎖의 DMEM 배지를 가하고 48 시간 동안 배양하였다. 세포를 수확하여 루시퍼라아제 발광측정 키트 (Promega, 미국)를 사용하여 루시퍼라아제 역가를 측정하였다. 이때 사용된 키트는 이중 루시퍼라아제 발광측정 키트로서, 본원에 사용된 개똥벌레(Firefly) 루시퍼라아제와 기질특이성이 다른 레닐라(Renilla) 루시퍼라아제를 동시에 형질감염시켜 형질전환 효율(transfection efficiency)를 동일화할 수 있다. 본 발명자들은 모든 개똥벌레 루시퍼라아제 발현 수준치를 2 ㎍의 레닐라 루시퍼라아제 발현벡터를 형질감염시켜 얻은 발현 수준치로 나누어 비교발광도 값을 얻었으며, 동일 세포주로 3 회 독립적인 시험을 실시하여 측정된 비교발광도의 평균값을 사용하였다.
(1) PHCMV와 PMCMV의 발현율 비교
다양한 세포주에서 PHCMV와 PMCMV의 발현율을 비교하기 위해, 발현벡터 pHYK/luc와 pMYK/luc로 형질감염된 세포주의 루시퍼라아제 역가를 비교하였다. 이때 루시퍼라아제 역가는 발현벡터 pHYK/luc로부터 발현된 루시퍼라아제의 비교발광도를 1로 하였을 때 발현벡터 pMYK/luc로부터 발현된 루시퍼라아제의 비교발광도의 상대비율로 나타내었으며, 그 결과는 표 1 및 도 5와 같다.
다양한 세포주에서 발현벡터 pHYK/luc와 pMYK/luc의 루시퍼라아제 발현 수준 비교
293 HT1080 HeLa CHO NIH3T3 Neuro2a
pHYK/luc 1 1 1 1 1 1
pMYK/luc 9.32±1.49 4.6±1.76 0.67±0.31 0.94±0.27 6.71±4.17 7.87±0.91
표 1 및 도 5에서 보듯이, HeLa를 제외한 모든 세포주에서 발현벡터pMYK/luc로부터 발현된 루시퍼라아제 수준이 발현벡터 pHYK/luc의 경우와 비슷하거나 높게 나타났다. 이 결과로부터, PMCMV가 PHCMV보다 이종유전자의 발현을 더욱 강력하고 안정적으로 유도함을 알 수 있다.
(2) PMCMV및 그 하류의 Glo-I 부위의 발현율
PMCMV하류의 Glo-I가 유전자의 발현율에 미치는 영향를 조사하기 위해, 발현벡터 pMYK/luc 및 pMYK/Glo-I/luc로 형질감염된 세포주의 루시퍼라아제 역가를 비교하였다. 이때 루시퍼라아제 역가는 발현벡터 pMYK/luc로부터 발현된 루시퍼라아제의 비교발광도를 1로 하였을 때 발현벡터 pMYK/Glo-I/luc로부터 발현된 루시퍼라아제의 비교발광도의 상대비율로 나타내었으며, 그 결과는 표 2 및 도 6과 같다.
다양한 세포주에서 발현벡터 pMYK/luc와 pMYK/Glo-I/luc의 루시퍼라아제 발현 수준 비교
293 HT1080 HeLa U937 CHO NIH3T3 Neuro2a
pMYK/luc 1 1 1 1 1 1 1
pMYK/Glo-I/luc 1.60±0.78 1.74±0.11 11.7±6.45 11.2±4.65 6.24±1.99 0.97±0.06 1.4±0.19
표 2 및 도 6에서 보듯이, 모든 세포주에서 발현벡터 pMYK/Glo-I/luc로부터 발현된 루시퍼라아제 수준이 발현벡터 pMYK/luc의 경우보다 높게 나타났다. 이 결과로부터 PMCMV하류의 Glo-I가 PMCMV보다 이종유전자의 발현을 더욱 안정적으로 향상시킴을 알 수 있다.
(3) PHCMV와 PMCMV하류의 Glo-I 부위의 발현율 비교
현재 가장 널리 사용되고 있는 PHCMV와 본 발명에 따른 PMCMV하류의 Glo-I 부위의 발현율을 비교하기 위해, 발현벡터 pHYK/luc 및 pMYK/Glo-I/luc로 형질전환된 세포주의 루시퍼라아제 역가를 비교하였다. 이때 루시퍼라아제 역가는 발현벡터 pHYK/luc로부터 발현된 루시퍼라아제의 비교발광도를 1로 하였을 때 발현벡터 pMYK/Glo-I/luc로부터 발현된 루시퍼라아제의 비교발광도의 상대비율로 나타내었으며, 그 결과는 표 3 및 도 7과 같다.
다양한 세포주에서 발현벡터 pHYK/luc와 pMYK/Glo-I/luc의 루시퍼라아제 발현 수준 비교
293 HT1080 HeLa CHO NIH3T3 Neuro2a
pHYK/luc 1 1 1 1 1 1
pMYK/Glo-I/luc 11.71±5.85 5.47±1.86 8.16±3.53 5.34±0.21 6.28±3.68 11.02±1.34
표 3 및 도 7에서 보듯이, 모든 세포주에서 발현벡터 pMYK/Glo-I/luc로부터 발현된 루시퍼라아제 수준이 발현벡터 pHYK/luc의 경우보다 5.3 내지 11.7 배 높게 나타났다. 이 결과로부터 PMCMV및 그 하류의 Glo-I 부위가 기존의 PHCMV보다 이종유전자의 발현을 더욱 향상시킴을 알 수 있다.
(4) PHCMV및 그 하류의 Glo-I 부위와 PMCMV및 그 하류의 Glo-I 부위의 발현율 비교
기존 PHCMV의 하류에 삽입된 Glo-I 부위와 본 발명에 따른 PMCMV하류의 Glo-I부위의 발현율을 비교하기 위해, 발현벡터 pHYK/Glo-I/luc 및 pMYK/Glo-I/luc로 형질감염된 세포주에서 루시퍼라아제 역가를 조사하였다. 이때 루시퍼라아제 역가는 발현벡터 pHYK/Glo-I/luc로부터 발현된 루시퍼라아제의 비교발광도를 1로 하였을 때 발현벡터 pMYK/Glo-I/luc로부터 발현된 루시퍼라아제의 비교발광도의 상대비율로 나타내었으며, 그 결과는 표 4 및 도 8과 같다.
다양한 세포주에서 발현벡터 pHYK/Glo-I/luc와 pMYK/Glo-I/luc의 루시퍼라아제 발현 수준 비교
293 HT1080 HeLa U937 CHO NIH3T3 Neuro2a
pHYK/Glo-I/luc 1 1 1 1 1 1 1
pMYK/Glo-I/luc 1.33±0.09 1.57±0.22 2.55±0.06 4.83±0.85 4.49±0.86 1.61±0.37 2.24±0.27
표 4 및 도 8에서 보듯이, 모든 세포주에서 발현벡터 pMYK/Glo-I/luc로부터 발현된 루시퍼라아제 수준이 발현벡터 pHYK/Glo-I/luc의 경우보다 1.33 내지 4.83배 높게 나타났다. 이 결과로부터 PMCMV및 그 하류의 Glo-I 부위는 PHCMV및 그 하류의 Glo-I 부위보다 이종유전자의 발현을 더욱 증가시킴을 알 수 있다.
본 발명의 발현벡터는 PMCMV하류의 Glo-I 부위를 포함함으로써 동물 세포에서 그 하류의 이종유전자의 발현을 강력하고 안정하게 유도하므로, 탁월한 동물용발현벡터로 사용될 수 있다. 또한 이 발현벡터는 네이키드(naked) DNA 유전자 치료요법 및 DNA 백신요법에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (9)

  1. 5'-> 3'의 방향으로 서열번호: 1의 쥐 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기(immediate early) 유전자의 인핸서/프로모터, 서열번호: 2의 사람 베타글로빈 유전자의 두 번째 인트론 및 이종유전자를 삽입하기 위한 제한효소 자리를 차례로 포함하는, 포유동물용 발현벡터.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    서열번호: 3의 염기서열을 포함하는 발현벡터.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 제한효소 자리는 다클로닝 부위인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  5. 제 4 항에 있어서,
    도 2의 구조를 가지는 발현벡터 pMYK/Glo-I.
  6. 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 발현벡터로 형질전환된 세포.
  7. 제 6 항에 있어서,
    미생물 또는 동물 세포인 형질전환된 세포.
  8. 제 6 항에 있어서,
    대장균 DH5@/MYK/Glo-i(제 KCTC-0864BP 호).
  9. 제 1 항의 발현벡터로 형질전환된 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는 이종단백질의 생산 방법.
KR10-2000-0070503A 2000-11-24 2000-11-24 쥐 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 유전자의인핸서/프로모터 및 사람 베타글로빈 인트론을 포함하는포유동물용 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 세포 및이 세포를 이용한 이종단백질의 생산 방법 KR100423022B1 (ko)

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