JP5859963B2 - 改善されたヒト長ペントラキシン3発現系及びその使用 - Google Patents
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Description
高レベルのヒトPTX3を発現するヒト起源のクローンを、以下のステップ:
a)CMVプロモーターの制御下でのヒトPTX3を有するプラスミド発現カセットの構築;
b)PTX3発現クローンG418耐性の再トランスフェクションから生じる安定なトランスフェクトーマを選択するための、前記プラスミド中へのハイグロマイシン耐性カセットの挿入;
c)発現された組換えタンパク質の同一性及びレベルの検証;
d)組換えhPTX3の生化学的特性化
を含む実験法を用いて得た。
a)組換えヒト長ペントラキシンPTX3タンパク質をすでに発現している組換えヒト細胞を、ヒト長ペントラキシン遺伝子がCMVプロモーターの制御下にある選択可能なプラスミドでトランスフェクションし;
b)トランスフェクションされた組換えヒト細胞を選択し、そして増殖させ;
c)トランスフェクションされた組換えヒト細胞の培地からヒト長ペントラキシンPTX3タンパク質を精製することを含む、組換えヒト長ペントラキシンPTX3タンパク質を産生するためのプロセスである。
a)本質的に配列番号1の配列を有する第1のベクター及び本質的に配列番号2の配列を有する第2のベクターでヒト細胞を一時的にまたは連続して同時トランスフェクションし;
b)二重トランスフェクションされた細胞を選択し、増殖させ;
b)二重トランスフェクションされた細胞の培地からヒト長ペントラキシンPTX3タンパク質を精製することを含む、組換えヒト長ペントラキシンPTX3タンパク質を産生するためのプロセスである。
プラスミドpSC1−PTX3の構築
ヒトユビキチンCプロモーターを、pUB/Bsdプラスミド(Invtrogen、カタログ番号V512−20)から、PCRでの増殖により得る。クローニング法の一部として、制限エンドヌクレアーゼの認識配列を両端で導入する。BsaAI部位を上流増幅プライマーにおいて構築し、EcoRI部位を下流プライマーにおいて構築する。増幅された領域は、pUB/Bsdの配列においてヌクレオチド1941〜3161に対応する。
オリゴヌクレオチドは次のように設計される:
5’pUbC:長さ:26mer(配列番号3)AT ATCACGTG ATC TGG CCT CCG CGC C
3’pUbC:長さ:23mer(配列番号4)GGAATTC GGT CCG GTC TAA CAA A
増幅のプロトコルは次のとおりである:1ng/μlのプラスミドDNA、2mMのMgCl2、0.2mMのdNTP、400nMの各プライマー、1×で供給された緩衝液及び0.04u/mlのTaq DNAポリメラーゼ(Sigma Genosys);温度プロフィール:3分94℃、30回(30秒 94℃、30秒 46℃、2分 72℃)、5分 72℃、将来使用するまで4℃で冷却。
増幅産物(1238bp)をシリカ膜スピンカラム(NucleoSpin, Machery−Nagel GmbH & Co.)により精製し、pGEM−T−Easy ベクター(Promega Cat. n. A1360)中でライゲートし、そして大腸菌(E.coli)宿主株HB2151(Pharmacia Biotech)中に形質転換する。形質転換体を、50mg/lのアンピシリンを追加したLB培地上で増殖させることにより選択する。
アンピシリン耐性コロニーから単離されたプラスミドDNAを、Stul及びSad酵素での制限分析によりチェックする(予想:〜3650及び600bpフラグメント)。
正しい制限パターンを示すプラスミドを全挿入物の配列分析によりさらにチェックし、続いてEcoRI(Sigma−Genosys)及びBsaAI(New England Biolabs)制限酵素で消化する。
ヒトユビキチンCプロモーターを、アガロースゲル分離及びシリカ膜スピンカラム上での溶出により精製する。
プラスミドpSG5(4076bp、Stratagene)を制限酵素EcoRI(Sigma−Genosys)及びBsaAI(New England Biolabs)で切断した;結果として得られたフラグメントは1432及び2644bpの長さである。pSG5の骨格を含む2644bpフラグメントを調製し、アガロースゲル電気泳動及びシリカ膜スピンカラムにより精製した。
ステップ1.1及び1.2で調製されたDNAフラグメントを、T4DNAリガーゼ(Promega)を用いてライゲートし、HB2151大腸菌細胞で形質変換させた。形質転換体を、50mg/lのアンピシリンを追加したLB培地上で増殖させることによって選択した。
アンピシリン耐性コロニーから単離されたプラスミドDNAを、EcoRI及びSacII酵素での制限分析によりチェックした(予想:2670及び1192bpフラグメント)。予想される制限パターンを有するプラスミドDNAを、pSG/Ubとして設計した。
ネオマイシン耐性カセット(NeoR)をpcDNA3プラスミド(5446bp、Invitrogen)から得、これをPCRにより増幅した。クローニング法の一部として、制限エンドヌクレアーゼAflIIIの認識配列を両端で導入した。増幅された領域は、pcDNA3の配列におけるヌクレオチド1788〜3252に相当し、SV40プロモーター及び複製起源、ネオマイシン耐性ORF、及びSV40poliAシグナルを含む。
オリゴヌクレオチドを次のように設計する:
5’NeoR(配列番号5)ATATACATG TCC CCA GGC AGG CAG AA
3’NeoR(配列番号6)ATATACAT GTAT ACA GAC ATG ATA AG
増幅のためのプロトコルは以下のとおりであった:1ng/μlのプラスミドDNA、2mMのMgCl2、0.2mMのdNTP、400nMの各プライマー、1×で供給された緩衝液及び0.04u/μlのTaq DNAポリメラーゼ(Sigma Genosys);温度プロフィール:3分 94℃、30回(30秒 94℃、30秒 46℃、2分 72℃)、5分 72℃、将来使用するまで4℃で冷却。
増幅産物(1484bp)をシリカ膜スピンカラムにより精製し、pGEM−T−Easyベクター(Promega Cat. n. A1360)中にライゲートし、大腸菌宿主株HB2151で形質転換した。
形質転換体を、50mg/lのアンピシリンを追加したLB培地上で増殖させることによって選択する。
アンピシリン耐性コロニーから単離したプラスミドDNAを、SmaI及びSad酵素での制限分析によってチェックする(予想:〜1200及び3300bpフラグメント)。
正しい制限パターンを示すプラスミドを全挿入物の配列分析によりさらにチェックし、続いてAflIII(New England Biolabs)制限酵素で消化した。NeoRカセット(1471bp)をアガロースゲル分離及びシリカ膜スピンカラム上での溶出により精製した。
ステップ1.3で調製されたプラスミドpSG/UbをAflIII消化により直線化し、シリカ膜スピンカラム上で精製した。
ステップ2.1及び2.2で調製されたDNAフラグメントを、T4DNAリガーゼ(Promega)を用いてライゲートし、JM109大腸菌株(New England Biolabs)で形質転換した。形質転換体を、50mg/lのアンピシリンを追加したLB培地上で増殖させることによって選択した。
抗生物質耐性コロニーを、前述のように、5’NeoR及び3’NeoRオリゴヌクレオチドでのPCR増幅により前もって分析し、続いて精製されたプラスミドを制限分析によってチェックした。この目的のために、SmaI(位置602、NeoR配列の内側)及びSacII(位置4142、UbC配列の内側)酵素を使用した。予想される制限パターン(3540及び1793bpフラグメント)を有するプラスミドDNAをpSC1として設計した。
hPTX3(GeneBank受入番号BD131701)配列を、pSG5−PTX3(WO99/32516「長ペントラキシンPTX3を含む医薬組成物」)からBamHI(Roche Applied Science)消化により得た。ヒトPTX3フラグメント(1463bp)をアガロースゲル電気泳動及びシリカ膜スピンカラムにより精製した。
pSC1ベクターをBamHI消化により直線化し、シリカ膜スピンカラム上で精製した。
ステップ3.2及び3.3で調製されたDNAフラグメントを、T4DNAリガーゼ(Roche Applied Science)を用いてライゲートし、JM109大腸菌株で形質転換した。50mg/lのアンピシリンを追加し、PTX3配列に対して相補性の2つのオリゴヌクレオチドでのPCRによりあらかじめスクリーニングしたLB培地上で増殖させることによって、形質転換体を選択した。
オリゴヌクレオチド配列は次のとおりである:
5’PTX(配列番号7)GTGAGAACTCGGATGATT ATGAT
3’PTX(配列番号8)TGAAAC ATACTGAGCTCCTCCAT
10μlの最終体積で、増幅用試薬は次のとおりであった:1μlの沸騰コロニー(50mlの水中1コロニー)、2mMのMgCl2、0.2mMのdNTP、320nMの各プライマー、0.06%のホルムアミド、1×で供給された緩衝液及び0.08u/μlのTaq DNAポリメラーゼ(Sigma Genosys);温度プロフィール:3分 96℃、30回(30秒 94℃、30秒 58℃、2分 72℃)、5分 72℃、将来使用するまで4℃で冷却。
PCRスクリーニングに対して陽性であるコロニーから精製されたプラスミドを、SalI制限酵素(Roche Applied Science)で消化して、hPTX3挿入物の配向をチェックした。予想される制限パターン(6619及び177bp)を有するプラスミドを、UbCプロモーター、NeoRカセット及びhPTX3をコードする領域で配列決定し、pSC1−PTX3と同定した。
新規プラスミド(pSC1−PTX3)を次いで、ユビキチンプロモーター制御下に置かれたPTX3 cDNA配列及びSV40プロモーター制御下のネオマイシン耐性遺伝子を有するように構築し;すべての他の特性及びプラスミドマップを図1に示す。
pSC1−PTX3の完全配列は以下のとおりである(配列番号2)。pSC1−hPTX3配列は、第1のEcoRI部位から始まって表示される(図5)。pSG5含有PTX3 cDNA由来の配列に下線を引いている。開始コドン(ATG)及び終止コドンは太字で示す。
pSC1−PTX3(配列番号2)
hPTX3を発現するヒトクローン2F12を、ECACC(European Collection of Cell Cultures, Health Protection Agency, Porton Down, Wiltshire SP4 OJG, UK)に寄託番号08011001でブダペスト条約の規定に従って2008年1月10日に寄託した。実験の詳細を以下に記載する。
トランスフェクション及びサブクローニング
106細胞/mlの293F(Invitrogenカタログ番号R790−07)をトランスフェクション当日に125mlのスピナーフラスコ中、28mlの最終Freestyle培地体積中に播種した。pSC1/PTX3プラスミドを次いで製造業者のプロトコルにしたがって293フェクチン試薬(GIBCO/Invitrogen)に吸着させた。
手短に説明すると、2つの別個の試験管中で、30μgのpSC1−PTX3(環状)又はPvul(直線化)を1mlのOptimem(GIBCO/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中で希釈し、40μlの293フェクチン(Invitrogen)をOptimemで1mlに希釈した。両溶液を5分間室温でインキュベートし、次いで混合し(最終体積2ml)、そして同じ条件で30分間インキュベートした。DNA/脂質カクテルを細胞に添加し、37℃、5%CO2で撹拌しながら(120rpm)インキュベートした。36時間培養した後、培地を選択培地(200mlのFreestyle培地+500μg/mlのG418)に変え、トランスフェクションされた細胞を10個の96ウェルプレート中に200μl/ウェルで蒔いた。15日後、最高のプロデューサー細胞プールをELISAにより決定し、24セル、6ウェル及びT25フラスコ中で増殖させた。
得られた組換え細胞プールを、50%の新しい培地及び50%馴化培地中、96ウェルプレート中1細胞/ウェルでサブクローニングした。
プラスミドpSASSI−hPTX3の構築
多重クローニング部位及びBamHI制限部位の一部が遊離している(loosing)、抗体軽鎖をあらかじめクローニングしたpCEP4プラスミド(Invitrogen cat. n. V044−50)を、制限酵素EcoRV及びClaI(Roche Applied Science)で切断し;消化によって、染色体外複製を可能にするエプスタイン・バーウイルス複製起源(oriP)及び核抗原(EBNA−1遺伝子によりコード化される)を含まないプラスミドを得ることができた。結果として得られたフラグメントは、6910及び4281bpの長さであった。pCEPの骨格を含む6910bpフラグメントをアガロースゲル電気泳動及びシリカ膜スピンカラムにより精製した。ClaIは付着末端を生成するので、T4DNAポリメラーゼ(Roche Applied Science)を用い、以下のプロトコルでフラグメントを埋めた:150ngのClaI/EcoRV精製フラグメント(38μl)、5μlの10×T4DNAポリメラーゼ緩衝液、4μlのdNTPミックス2.5mM、3μlのT4DNAポリメラーゼ(lU/μl)。37℃で15分後、70℃で5分間、次いで氷上で、反応を停止させた。フラグメントをシリカ膜スピンカラム上で精製し、T4DNAリガーゼ(Promega)を用いて、一晩室温でそれ自身にライゲートした。TOP10コンピテント細胞(Invitrogen)をライゲーション混合物で形質転換し、100mg/Lのアンピシリンを追加したLBプレート上で増殖させることによって形質転換体を選択した。
アンピシリン耐性コロニーから単離されたプラスミドDNAを、pCEPlightΔとして設計した。
ハイグロマイシン耐性カセットをサイトメガロウイルス(CMV)前初期エンハンサー/プロモーターとともにpCEPlightΔから得、これをPCRにより増幅した。クローニング法の一部として、制限エンドヌクレアーゼBamHIの認識部位を、CMVプロモーターの3’末端にアニールするオリゴヌクレオチド中に導入した。
約5500bpの増幅された領域は、CMVプロモーター、TKプロモーターの制御下のハイグロマイシン遺伝子をTK polyAシグナルとともに含んでいた。
オリゴヌクレオチドを次のとおり設計する:
オリゴCMV(配列番号9)5’GAGAACTGTAACGTTGGATCCAGCTGG 3’
オリゴH(配列番号10)5’GTGTACAAAGGATCCAGACATGATAAG 3’
増幅のプロトコルは次のとおりであった:2ngのpCEPlightΔ、200nMの各プライマー、0.2mMのdNTP、1×で供給された緩衝液、1.5μlのDMSO、0.5μlのTaq DNAポリメラーゼ(Phusion)、最終体積50μl;温度プロフィール:1分 98℃、35回(10秒 98℃、30秒 55℃、3分 72℃)、10分 72℃、将来使用するまで4℃で冷却。
増幅産物(〜5500bp)をアガロースゲル電気泳動及びシリカ膜スピンカラムにより精製した。精製されたフラグメントをそれ自体にライゲートし、TOP10コンピテント細胞(Invitrogen)を形質転換するために使用した。アンピシリン耐性コロニーから単離されたプラスミドDNAを制限及び配列分析によりチェックし、pCEPΔBamとして設計した。
hPTX3(GeneBank受入番号BD131701)配列を前記のようにpSC1−PTX3からBamHI(Roche Applied Science)消化によって得た。ヒトPTX3フラグメント(1463bp)をアガロースゲル電気泳動及びシリカ膜スピンカラムにより精製した。
pCEPΔBamベクターをBamHI消化により直線化し、シリカ膜スピンカラム上で精製した。直線化されたpCEPΔBam及びステップ3で調製されたhPTX3遺伝子に対応するDNAフラグメントを、T4DNAリガーゼ(Roche Applied Science)を用いてライゲートし、TOP10大腸菌株を形質転換するために用いた。100mg/Lのアンピシリンを追加し、制限分析によってあらかじめスクリーニングしたLB培地上で増殖させることによって形質転換体を選択し、PTX3フラグメント配向を評価した。
SV40 polyAシグナルをpCEPΔlightプラスミドから得、PCRによってこれを増幅した。クローニング法の一部として、制限エンドヌクレアーゼHindIII及びXholの認識配列をそれぞれフラグメント両端で導入した。
オリゴヌクレオチドを以下のように設計した:
PCEPSVH(配列番号11)5’AAGCTT AGAC ATGAT AAGAT AC ATTG 3’
PCEPSVX(配列番号12)5’CTCGAGAGTCGACCGGTCATGGCTGC 3’
増幅のプロトコルは以下のとおりであった:1ngのpCEPlightΔ、200nMの各プライマー、0.2mMのdNTP、1×で供給された緩衝液、2μlのMgCl2 50mM、0.5μlのTaq DNAポリメラーゼ(Invitrogen)、最終体積50μl;温度プロフィール:1分 94℃、30回(30秒 94℃、1分 55℃、1分 72℃)、15分 72℃、将来使用するまで4℃で冷却。
増幅産物(〜420bp)をアガロースゲル電気泳動及びシリカ膜スピンカラムにより精製した。
SV40 polyAシグナルに対応する精製されたフラグメント及びpCEPΔBam−hPTX3をHindIII/Xhol制限酵素で消化し、T4DNAリガーゼ(Promega)を用いてライゲートした。ライゲーション混合物を使用して、TOP10コンピテント細胞(Invitrogen)を形質転換し、100mg/Lのアンピシリンを含むLBプレート上で増殖させることによって形質転換体を選択した。
アンピシリン耐性コロニーから単離されたプラスミドDNAを制限及び配列分析によりチェックし、プラスミドをpSASSI−hPTX3と命名した。
pSASSI−HPTX3の完全配列は以下のとおりである(配列番号1)。pSASSI−hPTX3配列をBamHI部位から始めて表示する(図1)。hPTX3の配列を小文字で示す。開始コドン(atg)及び終止コドン(taa)を太字で示す。
pSASSI−HPTX3(配列番号1)。
pSASSI−hPTX3トランスフェクションによって生成した組換えMS24PTXクローン
106細胞/mlの293F/PTX3/2F12を、トランスフェクション当日に、125mlのスピナーフラスコ中、28mlの最終Freestyle培地体積中に播種した。pSASSI−hPTX3プラスミドを次いで、製造業者のプロトコルにしたがって、293フェクチン試薬(GIBCO/Invitrogen)に吸着させた。
手短に説明すると、30μgのpSASSI−hPTX3 Nrul(直線化)を1mlのOptimem(GIBCO/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中で希釈し、40μlの293フェクチン(Invitrogen)をOptimemで1mlに希釈した。両溶液を5分間室温でインキュベートし、次いで混合し(最終体積2ml)、そして同じ条件で30分間インキュベートした。DNA/脂質カクテルを細胞に添加し、37℃、5%CO2で撹拌しながら(120rpm)インキュベートした。36時間培養した後、培地を選択培地(200mlのFreestyle培地+200μg/mlのハイグロマイシン)に変え、トランスフェクションされた細胞を10個の96ウェルプレート中に200μl/ウェルで蒔いた。15日後、最高のプロデューサー細胞プールをELISAにより決定し、24ウェル、6ウェル及びT25フラスコ中で増幅させた。
得られた組換え細胞プールを、96ウェルプレート中、50%の新しい培地及び50%の馴化培地中、1細胞/ウェルでサブクローニングした。
精製されたPTX3又は培地上清中に分泌されたPTX3を、サンドイッチELISAを用いて滴定した。PTX3を検出するために、96ウェルNunc Maxisorbマイクロタイタープレート(Nunc, Roskilde, Denmark)を一晩4℃にて、15mMの炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)中、700ng/mlのラットモノクローナル抗体MNB4抗ヒトPTX3(Alexis(商標)Biochemicals, Lausen, Switzerland)でコーティングした。ウェルをPBS及び0.05%のTween−20(PBS−Tw、洗浄液)で洗浄し、5%粉乳を含む300μlのPBS−Twで、2時間、室温にてブロックした。
細胞上清又は精製された組換えヒトPTX3をウェルに添加し、洗浄液及び1%のBSAで希釈した。0〜100ng/mlの範囲のCHO細胞由来の精製された組換えヒトPTX3で作製された標準曲線を定量化に利用した。37℃で1時間インキュベーションした後、結合したPTX3を、ビオチン複合ポリクローナルウサギ抗PTX3抗体を用いて検出し、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ(Sigma−Aldrich, USA)に共役させたストレプトアビジンとともにインキュベートした。最終的に、発色させるために、2,2’−アジノ−ビス3−エチルベンズチアゾリン−6−スルホン酸(Sigma Chemical Co. USA)を添加し、Microplate Reader Model 3550 EIA(Bio−Rad, Hercules, CA, USA)を用いて405nmでの光学密度を評価した。
クローン293F/PTX3/2F12及びMS24PTXの増殖、生存率及び生産性の比較
1リットルのスピナーフラスコ中で、500mlのFreeStyle293培地中1,000,000細胞/ml(生存率≧90%)の密度で2つのクローン由来の細胞を播種した。細胞が死に始めるまで約1週間、増殖、生存率及び生産性をモニタリングした。
図2は、同じ播種及び増殖条件での、MS24PTX(パネルA)及び293F/PTX3/2F12(パネルB)クローンの増殖、生存率及び生産性を示す。図に示されるように、PTX3発現クローン293F/PTX3/2F12を、PTX3がCMVプロモーターの制御下にある新規プラスミド(MS24PTXクローン)で再トランスフェクションして、本発明者等はPTX3生産性において約4倍の増加を得ることができた。
MS24PTXクローンからの組換えヒトPTX3の精製
スピナーフラスコ中で増殖させた、MS24PTXクローンからの培養上清を、Q−SepharoseTM Fast Flow(GE Healthcare, UK)充填カラム上にロードした。非線形勾配を用いて残留物質を溶出させた。PTX3含有フラクションをセラミックハイドロキシアパタイト(BioRad, Hercules, CA, USA)充填カラムに直接かけた。リン酸塩濃度を非線形的に増大させることによって、残留物質を溶出させた。PTX3含有フラクションを濃縮し、緩衝液を限外ろ過膜(Pellicon−Biomax 100, Millipore)上で変更し、次いでBiosep SEC S4000(Phenomenex)上サイズ排除クロマトグラフィー及びSDS−PAGEにより特性化した(図3)。
h−PTX3のFGF2に対する結合
精製された組換えhPTX3のFGF2に対する結合を、ELISAシステムで評価した。96−ウェルプレート(Falcon 3912)をPBS中2μg/mlのFGF2(Calbiochem)でコーティングし、一晩4℃でインキュベートした。ウェルをPBS及び0.1%のTriton X−100(PBS−Tr、洗浄液)で洗浄し、3%BSAを含む200μlのPBS−Tr(PBS−Bブロッキング及び希釈液)で2時間室温にてブロックした。洗浄後、0〜120ng/mlの範囲のPTX3濃度でPBS−B中で希釈した100μlの試料を添加して結合を実施し、プレートを37℃で1時間インキュベートした。洗浄後、プレートを100μl/ウェルの100ng/mlのウサギ抗PTX3ポリクローナル抗体(37℃で1時間)とともにインキュベートし、再度洗浄し、そして100μlのホースラディッシュペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗ウサギIgG(PBS−B中1:1000;37℃で1時間)とともにインキュベートした。洗浄後、100μlの発色性基質3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)(sigma−Aldrich)を添加し、10〜15分後、100μlのHCl(1M)を添加して反応を停止させ、Microplate Reader Model 3550 EIA(Bio−Rad, Hercules, CA, USA)を用いて吸収を測定した(図4)。
Claims (8)
- ヒト長ペントラキシンPTX3タンパク質をすでに発現できる組換えヒト宿主細胞を形質転換するための、有効なプロモーターの制御下でヒト長ペントラキシンPTX3タンパク質をコードするヌクレオチド配列及び選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列を含み、配列番号1の配列を有する真核生物発現ベクターの使用であって、組換えヒト宿主細胞が、ECACCに第08011001号で寄託されている組換え293F/PTX3/2F12クローンである、使用。
- ベクターが直線化されている、請求項1記載のベクターの使用。
- 請求項1に記載のベクターを使用してさらに形質転換されたECACCに第08011001号で寄託されている組換え293F/PTX3/2F12クローンである、ヒト長ペントラキシンPTX3タンパク質を発現できる形質転換された組換えヒト細胞。
- Health Protection Agency, Culture Collections Centre For Emergency Preparedness and Response Salisbury UKに第09072902号で寄託されている組換えMS24PTXクローンである、請求項3記載の形質転換された組換えヒト細胞。
- ヒト長ペントラキシンPTX3タンパク質の産生のための、請求項3または請求項4に記載の形質転換された組換えヒト細胞の使用。
- ヒト長ペントラキシンPTX3タンパク質を産生するための方法であって:
a)組換えヒト長ペントラキシンPTX3タンパク質をすでに発現している組換えヒト細胞を、ヒト長ペントラキシン遺伝子がCMVプロモーターの制御下にあるプラスミドでトランスフェクションし;
b)トランスフェクションされた組換えヒト細胞を選択し、そして増殖させ;
c)ヒト長ペントラキシンPTX3タンパク質をトランスフェクションされた組換えヒト細胞の培地から精製することを含み、
組換えヒト長ペントラキシンPTX3タンパク質をすでに発現している組換えヒト細胞が、ECACCに第08011001号で寄託されている組換え293F/PTX3/2F12クローンである、方法。 - トランスフェクションされた組換えヒト細胞が、Health Protection Agency, Culture Collections Centre For Emergency Preparedness and Response Salisbury UKに第09072902号で寄託されているMS24PTXクローンである、請求項6記載の方法。
- 精製ステップが少なくとも1つの以下のステップ:アニオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーを含む、請求項6または請求項7に記載の方法。
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