TWI507526B

TWI507526B - 包含嵌合巨細胞病毒啓動子及加強子序列的表現載體

Info

Publication number: TWI507526B
Application number: TW102134171A
Authority: TW
Inventors: Tom Payne; Robert Young; Marc Feary
Original assignee: Lonza Biologics Plc
Priority date: 2012-09-24
Filing date: 2013-09-23
Publication date: 2015-11-11
Also published as: MX371007B; TR201816314T4; HUE026516T2; AU2013320157B2; US20200002721A1; SG11201502243YA; EP2711426A1; PL2711426T3; DK2898077T3; HUE040463T2; JP6162246B2; CN104718296A; EP2898077B1; KR20150042858A; EA033008B1; IL237171A0; US10294491B2; WO2014044845A1; HK1206061A1; EP2711426B1

Description

包含嵌合巨細胞病毒啟動子及加強子序列的表現載體

本發明係關於哺乳動物表現系統，且具體而言關於用於在哺乳動物細胞中異源表現所關注核酸序列之包含嵌合啟動子調節序列之表現構築物。嵌合啟動子調節序列係由以下構成：源自鼠類或人類巨細胞病毒之啟動子序列及源自人類及/或猿猴巨細胞病毒之上游區域及/或加強子序列，前提係該等序列元件係源自至少兩種不同的巨細胞病毒種類。

諸如抗體分子、疫苗、激素及生長因子等用於基礎研究、診斷學及療法中之重組(多)肽及蛋白質係使用眾多種包括原核及真核細胞二者之經遺傳改造之有機體來產生。然而，絕大多數重組肽或蛋白質包括使用原核宿主細胞時無法模擬或再現之轉譯後修飾。出於此原因，哺乳動物基因表現系統已經證實代表較佳選擇。

基於中國倉鼠(Chinese Hamster)卵巢(CHO)細胞之哺乳動物表現系統廣泛用於產生重組蛋白。除淋巴樣細胞系之外，CHO細胞代表容許簡單並有效的高密度懸浮分批培養動物細胞之極少數細胞類型中的一者。此外，使用CHO細胞獲得高產物產量，而淋巴樣細胞在工業規模上更難以培養。鑒於重組產生多肽及蛋白質之成本較高，故最大化每個生物反應器運行之重組蛋白質之產率亦至關重要。對產物產率具有顯著影響之製程參數尤其包括細胞培養條件、欲表現核酸(基因)之拷貝數、該等基因轉錄及相應mRNA轉譯之效率、mRNA之穩定性及諸如此類。

因此，控制基因表現之調節遺傳元件之強度或轉錄活性的改良構成尤其關鍵之要素以增加所產生重組蛋白之產率。甚至在單一細胞層級上轉錄活性之較小增量將最終轉譯成高密度工業規模分批培養之產物產率之顯著改良。

絕大多數哺乳動物基因表現系統採用編碼在源自病毒之啟動子調節序列之控制下欲表現之異源核酸序列之表現載體。該等表現盒中兩種最常用的病毒調節元件係彼等人類巨細胞病毒(hCMV)立即早期基因1及2(IE1及IE2)。然而，與使用hCMV IE1及IE2調節元件相關之缺點在於其高度物種特異性。

美國專利5,866,359揭示，來自該hCMV啟動子之基因表現可藉由在弱啟動子控制下共表現腺病毒E1A蛋白來改良。E1A係可作用於細胞週期調節之多功能轉錄因子且具有獨立的轉錄活化及抑制功能域二者。E1A表現之微調對達成基因反式活化與對細胞週期進展之任何消極影響之間之理想平衡至關重要。然而，E1A表現之過表現可降低細胞合成所關注重組蛋白之能力。

美國專利5,591,639闡述包含以下之載體：欲表現異源核酸序列之上游(5')、人類巨細胞病毒(hCMV-MIE)之主要立即早期基因之加強子、啟動子及完全5'-非轉譯區域(包括內含子A(即第一天然內含子))。然而，若存在此序列(總長度為約2100bp)之前400bp(5'端)，則在COS7及CHO細胞二者中皆觀察到較差基因表現率(Chapman,B.S.等人(1991)Nucl.Acids Res. 19 ,3979-3986)。

鼠類巨細胞病毒(mCMV)之立即早期基因之調節元件的轉錄活性高於hCMV對應部分之轉錄活性而不展現對人類序列所觀察到之高度物種偏好性(Addison,C.L.等人(1987)J.Gen.Virol. 78 ,1653-1661)。

然而，嘗試藉由將鼠類主要立即早期基因之天然第一內含子插入mCMV IE啟動子下游(3')來加強mCMV IE啟動子調節元件(類似於hCMV對應部分)之活性失敗(尤其參照歐洲專利1 525 320 B1)。然而，包含由mCMV IE1之調節元件及人類主要立即早期基因之天然第一內含子構成之嵌合盒的表現載體之傳代產生與使用完整人類序列相當之產物產量(例如，參照WO 2006/111387 A2)。對包含mCMV IE2調節序列之表現載體亦獲得類似基因表現率(尤其參照歐洲專利1 601 776 B1)。

因此，業內仍需要以高產量產生重組多肽或蛋白質之改良哺乳動物基因表現系統。具體而言，業內需要克服上述限制之哺乳動物基因表現系統，即基於mCMV或hCMV啟動子序列但達成高於可用系統之表現率(且因此，達成較高產物產量)的表現系統。

因此，本發明之目標係提供該等基因表現系統、主要適宜表現構築物及相應哺乳動物宿主細胞。

在一態樣中，本發明係關於用於在哺乳動物細胞中異源表現所關注核酸序列之表現載體，該載體包含可操作地連接至欲表現之第一核酸序列之第一嵌合啟動子調節序列，其中該嵌合啟動子調節序列包含：(i)啟動子序列，其源自鼠類巨細胞病毒或人類巨細胞病毒且可操作地連接至欲表現核酸序列之轉錄起始位點；及(ii)上游區域及/或加強子序列，其源自人類及/或猿猴巨細胞病毒，其中該上游區域及/或加強子序列位於鼠類或人類啟動子序列之5'且與其可操作地連接；且其中該嵌合啟動子調節序列包含源自由以下組成之群中之至少兩者之序列元件：鼠類巨細胞病毒、人類巨細胞病毒及猿猴巨細胞病毒。

在具體實施例中，啟動子序列係源自鼠類巨細胞病毒IE1啟動子；及/或上游區域及/或加強子序列係源自人類及/或猿猴巨細胞病毒IE1加強子。

在較佳實施例中，鼠類巨細胞病毒IE1啟動子序列具有核苷酸序列SEQ ID NO：4。

在其他具體實施例中，啟動子序列係源自人類巨細胞病毒IE1啟動子；及/或上游區域及/或加強子序列係源自人類及/或猿猴巨細胞病毒IE1加強子。

在較佳實施例中，人類巨細胞病毒IE1啟動子序列具有核苷酸序列SEQ ID NO：5。

在其他較佳實施例中，上游區域及/或加強子序列包含源自猿猴巨細胞病毒IE1區域之核苷酸序列SEQ ID NO：6。

在尤佳實施例中，嵌合啟動子調節序列包含選自由以下組成之群之核苷酸序列：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13。

在其他具體實施例中，表現載體進一步包含可操作地連接至欲表現之第二核酸序列之第二嵌合啟動子調節序列，其中該第二嵌合啟動子調節序列與第一嵌合啟動子調節序列相同。

在替代性具體實施例中，表現載體進一步包含可操作地連接至欲表現之第二核酸序列之第二嵌合啟動子調節序列，其中該第二嵌合啟動子調節序列與第一嵌合啟動子調節序列不同。

較佳地，欲表現之第一及第二核酸序列編碼不同多肽。在特定實施例中，不同多肽代表二聚或多聚蛋白之亞單位。尤佳地，二聚或多聚蛋白為抗體分子。

在另一態樣中，本發明係關於經如本文上文中所定義之表現載體轉染之哺乳動物宿主細胞。較佳地，宿主細胞為CHO細胞。

在又一態樣中，本發明係關於在哺乳動物宿主細胞中異源表現所關注核酸序列之方法，該方法包含：(i)用如本文上文中所定義之表現載體轉染哺乳動物宿主細胞；及(ii)在容許所關注之核酸序列表現之條件下培養經轉染之哺乳動物宿主細胞。

在較佳實施例中，轉染為穩定轉染。

在又一態樣中，本發明係關於如本文上文中所定義之表現載體之用途，其用於在哺乳動物宿主細胞中異源表現所關注之核酸序列。

自下文之詳細說明將明瞭本發明之其他實施例。

圖1 圖解說明用作「母體載體」之表現載體pRY42(SEQ ID NO：1)，其用於產生如本文所定義之哺乳動物表現載體。pRY42涵蓋兩個用於驅動異源基因表現之調節盒(分別在「mCMV」與「pA」之間)：多個選殖位點位於「Ex2」區域之3'(即「下游」)用於插入欲表現之異源核酸序列。調節盒側接突變體(「F5-mFRT」)及野生型(「wFRT」)翻轉酶識別靶位點。框內起始蛋胺酸密碼子已添加至wFRT位點(「ATG+F」)之5'端。SV40早期啟動子(「SV」)位於ATG+F之5'(「上游」)。異源核酸序列之轉錄係由鼠類巨細胞病毒IE1基因(「mCMV」)之啟動子來驅動，其後為5'UTR，其中外顯子1(「Ex1」)係鼠類(「m」)與人類(「h」)CMV源序列之雜合體，且其中外顯子2(「Ex2」)及內含子A序列(「Int A」)係源自hCMV序列。β-內醯胺酶選擇標記基因表示為「bla」。使用pRY42作為靶載體用於選殖如本文所定義之不同嵌合啟動子調節序列。

圖2 圖解說明編碼小鼠-人類嵌合單株抗體(mAb)cB72.3(Whittle,N.等人(1987)Protein Eng. 1 ,499-505)之輕鏈(「LC」)及重鏈(「HC」)之表現載體pRY57(SEQ ID NO：2)，該等輕鏈與重鏈各自分別位於「Ex2」區域之3'選殖位點與多腺苷酸化位點(「pA」)之間。在其他方面，pRY57與pRY42相同。移除pRY57之LC及HC核酸序列且選殖至pRY42變體中，其中原始mCMV啟動子序列經如本文所定義之不同嵌合啟動子調節序列替代。

圖3 示意性繪示涵蓋於pRY42(頂部)中之原始mCMV啟動子序列(SEQ ID NO：3)以及如本文所定義(分別為SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：11)之5條不同的嵌合啟動子調節序列(構築物「1至5」)，該等嵌合啟動子調節序列包含位於上游區域3'之鼠類CMV(mCMV)啟動子序列及/或源自猿猴(sCMV)及/或人類(hCMV)CMV之加強子元件。此外，顯示如本文所定義(SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13)之另外兩條嵌合啟動子調節序列(構築物「6及7」)，其包含位於上游區域3'之hCMV啟動子序列及/或源自sCMV及/或人類hCMV之加強子元件。本文明確採用之所有mCMV及hCMV啟動子序列皆在其3'端包括額外鳥苷(「G」)核苷酸，其代表轉錄起始位點。

圖4 顯示在穩定CHO系中產生之mAb cB72.3濃度之比較，其中mAb序列之基因表現係在如圖3中所圖解說明之嵌合構築物1至5之控制下。使用補料分批過度生長(FOG)方案，在E250搖瓶培養之50ml生長培養基中生長15天後，藉由蛋白質A HPLC實施測定。對於每一嵌合構築物，n=4，此代表對一式兩份之轉染實施一式兩份補料分批分析，但對於構築物4(其中n=6，對一式三份轉染實施一式兩份FOG分析)及pRY57(原始mCMV，其中n=8)例外，且數據點係來自實驗1及實驗2之組合。

圖5 顯示在穩定CHO系中產生之mAb cB72.3濃度之比較，其中mAb序列之基因表現係在如圖3中所圖解說明之嵌合構築物6至7之控制下。使用分批過度生長(BOG)方案，在E125搖瓶培養之30ml生長培養基中生長7天後，藉由蛋白質A HPLC實施測定。對於mCMV及構築物7，n=6(對一式三份轉染實施一式兩份分批分析)，且對於構築物6，n=4(對一式兩份轉染實施一式兩份分批分析)。

本發明係基於以下出人意料之發現：與僅基於mCMV啟動子序列之現有表現系統相比，包含嵌合(即雜合)啟動子調節序列之哺乳動物表現載體產生顯著改良之基因表現率，該等嵌合(即雜合)啟動子調節序列係由mCMV或hCMV啟動子序列(具體而言，mCMV或hCMV IE1啟動子序列)及hCMV及/或sCMV上游區域及/或加強子序列(具體而言，hCMV IE1及/或sCMV IE1加強子序列)構成，該mCMV或hCMV啟動子序列可操作地連接至欲表現核酸序列之轉錄起始位點，該hCMV及/或sCMV上游區域及/或加強子序列位於mCMV或hCMV啟動子序列之5'且與其可操作地連接，且因此亦使得所產生之重組蛋白之產量顯著較高(最高幾乎增加3倍)。

因此，如本文所定義之哺乳動物表現載體代表尤其在工業規模中產生重組蛋白之優異分子工具。

以說明方式闡述於下文中之本發明可在不存在本文中未特定揭示之任何要素、限制下適宜地實踐。

在本發明說明及申請專利範圍中使用術語「包含」時，其並不排除其他要素或步驟。出於本發明之目的，術語「由......組成」視為術語「包含」之較佳實施例。若在下文中將組定義為包含至少若干數目之實施例，則此亦應理解為揭示較佳僅由該等實施例組成之組。

除非另有明確說明，否則在提及單數名詞使用不定冠詞或定冠詞(例如，「一(a、an)」或「該(the)」)時，此包括該名詞之複數形式。

在本發明之上下文中指示數值之情形下，熟習此項技術者將理解，確保所述特徵之技術效應在精確度之間隔內，此通常涵蓋所給出數值之±10%、且較佳±5%之偏差。

此外，說明及申請專利範圍中之術語第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)及諸如此類用於將類似元件區分開且未必用於闡述先後順序或時間順序。應理解，如此使用之術語在適當情況下可互換，且本文中所闡述之本發明實施例能夠以非本文所闡述或說明之序列操作。

術語之其他定義將在下文使用該等術語之上下文中給出。提供下列術語或定義僅用於幫助理解本發明。該等定義不應理解為具有小於熟習此項技術者所理解之範疇。

換言之，若嵌合啟動子調節序列如本文所定義包含源自由鼠類巨細胞病毒、人類巨細胞病毒及猿猴巨細胞病毒組成之群中之至少兩者之序列元件，則確保所主張之標的物不包括任何僅源自人類巨細胞病毒之構築物。

如本文所使用之術語「表現載體」表示特徵在於存在至少一個「表現盒」之核酸媒劑(質體)。如本文所使用之術語「表現盒」係指能夠容許所關注之核酸序列(即「異源」核酸序列)基因表現之遺傳構築物。此需要該表現盒包含含有轉錄及/或轉譯調節資訊之調節序列元件，且該等調節序列「可操作地連接」至所關注之核酸序列。可操作連接係以能夠使基因表現之方式連接調節序列元件與欲表現之核酸序列之連接。

控制及驅動基因表現所需要之「表現盒」調節區域之確切性質可在物種間變化，但該等區域通常包含啟動子調節序列(即位於所關注核酸序列5'(「上游」)之序列區域)及3'-非轉譯調節序列(即位於所關注核酸序列3'(「下游」)之序列區域)。

如本文所使用之術語「啟動子」(亦稱為「核心啟動子」)表示本身引導轉錄起始之序列元件(例如，針對轉錄因子及DNA依賴性RNA-聚合酶之結合位點、TATA盒、CAAT序列及5'-封端元件)。只要保留或基本上保留(例如，至少70%、至少80%、至少90%或至少95%之野生型活性(即全長序列之活性))此促進轉錄起始之功能，(天然)野生型啟動子序列之任何截短、突變或其他修飾變體亦在上文定義內。如本文所使用，術語「核心啟動子」係指保留啟動子活性之最短序列。如本文所使用，啟動子序列可操作地連接至欲表現核酸序列之轉錄起始位點。

在具體實施例中，本發明之表現載體包含(作為表現盒之一部分)第一(嵌合)啟動子調節序列(即至少一條該序列)，該啟動子調節序列進而涵蓋源自鼠類巨細胞病毒(mCMV)之(核心)啟動子序列。此mCMV啟動子序列可操作地連接至欲表現之第一核酸序列之轉錄起始位點。通常，可採用任何mCMV啟動子序列。較佳地，採用諸如mCMV IE1及mCMV IE2等mCMV立即早期(IE)基因之啟動子序列(Dorsch-Hasler,K.等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82 ,8325-8329；Messerle,M.等人(1991)J.Virol. 65 ,1638-1643)，且mCMV IE1啟動子尤佳。

該等及其他mCMV啟動子已為業內所熟知且可容易地源自以登錄號U68299.1寄存於NCBI病毒基因組數據庫中之mCMV基因組(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenomesHome ；Bao,Y.等人(2004)J.Virol. 78 ,7291-7298)。

在本發明之特定實施例中，包含於表現載體中之mCMV IE1啟動子序列具有長度為492bp之核酸序列，如SEQ ID NO：3中所顯示：

在較佳實施例中，包含於表現載體中之mCMV IE1啟動子序列具有長度為102bp之核酸序列(亦稱為「核心啟動子」)，如SEQ ID NO：4中所顯示：

SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4二者皆在其各別3'端包括額外鳥苷 (「G」)核苷酸，其代表轉錄起始位點。

在其他具體實施例中，本發明之表現載體包含(作為表現盒之一部分)第一(嵌合)啟動子調節序列(即至少一條該序列)，該啟動子調節序列進而涵蓋源自人類巨細胞病毒(hCMV)之(核心)啟動子序列。此hCMV啟動子序列可操作地連接至欲表現之第一核酸序列之轉錄起始位點。通常，可採用任何hCMV啟動子序列。較佳地，採用諸如mCMV IE1及mCMV IE2等hCMV立即早期(IE)基因之啟動子序列(You,C.Y.等人(1992)Intervirology 34 ,94-104；Klucher,K.M.等人(1993)Mol.Cell.Biol. 13 ,1238-1250)，且hCMV IE1啟動子尤佳。

該等及其他hCMV啟動子已為業內所熟知且可容易地源自以登錄號NC_006273寄存於NCBI病毒基因組數據庫中之hCMV基因組(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenomesHome ；參見上文)。

在較佳實施例中，包含於表現載體中之hCMV IE1啟動子序列具有長度為117bp之核酸序列(亦稱為「核心啟動子」)，如SEQ ID NO：5中所顯示：

SEQ ID NO：5在其3’端包括額外鳥苷(「G」)核苷酸，其代表轉錄起始位點。

此外，表現盒之啟動子調節序列通常包含「加強子」序列。本文所使用之術語「加強子」表示增大、改良或改善核酸序列之轉錄之序列元件，與其對於欲表現核酸序列之位置及取向無關。加強子可加強單一啟動子之轉錄，或同時加強一個以上啟動子之轉錄。只要保留或實質上保留(例如，至少70%、至少80%、至少90%或至少95%之野生型活性(即全長序列之活性))此改良轉錄之功能，(天然)野生型加強子序列之任何截短、突變或以其他方式修飾之變體亦在上文定義內。

本發明之表現載體在其各別第一(嵌合)啟動子調節序列中包含(作為表現盒之一部分)源自人類巨細胞病毒(hCMV)及/或猿猴巨細胞病毒(sCMV)之上游區域(序列)及/或加強子序列。換言之，啟動子調節序列可包含僅源自hCMV之上游區域及/或加強子序列、或僅源自sCMV之上游區域及/或加強子序列、或由源自hCMV及sCMV之序列構成之嵌合上游區域及/或加強子序列。在啟動子調節序列內，上游區域及/或加強子序列係位於mCMV或hCMV(核心)啟動子序列之5'(即「上游」)且可操作地連接至鼠類或人類啟動子序列。通常，加強子序列係以與啟動子序列相同之取向排列。然而，在特定實施例中，上游區域及/或加強子序列係以相對於啟動子序列相反之取向排列。

通常，可採用任何hCMV及/或sCMV序列作為上游區域及/或加強子序列。較佳地，採用hCMV及/或sCMV立即早期(IE)基因之序列，諸如hCMV IE1、hCMV IE2、sCMV IE1及sCMV IE2之序列(Meier,J.L.及Stinski,M.F.(1996)Intervirology 39 ,331-342；Kim,G.Y.等人(2011)Biotechnol.Lett. 33 ,1319-1326)，且hCMV及/或sCMV IE1加強子序列尤佳。

因此，本發明之表現載體包含第一啟動子調節序列，該第一啟動子序列因包含mCMV啟動子序列或hCMV啟動子序列與hCMV及/或sCMV上游區域及/或加強子序列之組合而為嵌合體。在具體實施例中，啟動子序列係源自mCMV IE1啟動子；及/或上游區域及/或加強子序列係源自hCMV及/或sCMV IE1加強子。在其他具體實施例中，啟動子序列係源自mCMV IE1啟動子；及/或上游區域及/或加強子序列係源自hCMV及/或sCMV IE2加強子。在又一些其他具體實施例中，啟動子序列係源自hCMV IE1啟動子；及/或上游區域及/或加強子序列係源自hCMV及/或sCMV IE1加強子。在又一些其他具體實施例中，啟動子序列係源自hCMV IE2啟動子；及/或上游區域及/或加強子序列係源自hCMV及/或sCMV IE2加強子。

該等及其他hCMV及/或sCMV序列已為業內所熟知且可容易地源自分別以登錄號X17403.1及U38308.1寄存於NCBI病毒基因組數據庫中之hCMV及sCMV基因組。

在其他較佳實施例中，上游區域之序列包含長度為452bp之核苷酸序列，如SEQ ID NO：6中所顯示，其係源自sCMV IE1加強子區域。

在該等較佳實施例中之一些中，核酸序列SEQ ID NO：6係源自sCMV IE1區域(例如，參照SEQ ID NO：11)之較長序列元件之組成部分。在該等較佳實施例中之其他一些中，源自sCMV IE1區域之序列元件具有序列SEQ ID NO：6，其係以與源自hCMV IE1區域(例如，參照SEQ ID NO：10)之又一序列元件之組合存在。

根據SEQ ID NO：7之嵌合啟動子調節序列(在本文中亦稱為「構築物1」)具有1074bp之總長度且係由以下構成：582bp hCMV IE1上游及mCMV IE1加強子序列(以斜體顯示)以及492bp mCMV IE1啟動子序列(亦顯示為SEQ ID NO：3)。

根據SEQ ID NO：8之嵌合啟動子調節序列(在本文中亦稱為「構築物2」)具有1128pb之總長度且係由以下構成：包括hCMV IE1上游序列及hCMV IE1加強子序列之1026bp序列(以斜體顯示)以及102bp mCMV IE1「核心」啟動子序列(亦顯示為SEQ ID NO：4)

根據SEQ ID NO：9之嵌合啟動子調節序列(在本文中亦稱為「構築物3」)具有509pb之總長度且係由以下構成：407bp hCMV IE1加強子序列(以斜體顯示)及102bp mCMV IE1「核心」啟動子序列(亦顯示為SEQ ID NO：4)。

根據SEQ ID NO：10之嵌合啟動子調節序列(在本文中亦稱為「構築物4」)具有961pb之總長度且係由以下構成：452bp sCMV IE1上游序列(以粗體顯示；SEQ ID NO：6)、407bp hCMV IE1加強子序列(以斜體顯示)及102bp mCMV IE1「核心」啟動子序列(亦顯示為SEQ ID NO：4)。

根據SEQ ID NO：11之嵌合啟動子調節序列(在本文中亦稱為「構築物5」)具有909bp之總長度且係由以下構成：包括sCMV IE1上游區域及sCMV IE1加強子序列之元件之807bp序列(以粗體顯示；SEQ ID NO：6加下劃線)以及102bp mCMV IE1「核心」啟動子序列(顯示為SEQ ID NO：4)。

根據SEQ ID NO：12之嵌合啟動子調節序列(在本文中亦稱為「構築物6」)具有976bp之總長度且係由以下構成：452bp sCMV IE1上游區域(以粗體顯示)、407bp hCMV IE1加強子序列(以斜體顯示)及117bp hCMV「核心」啟動子序列(顯示為SEQ ID NO：5)。

根據SEQ ID NO：13之嵌合啟動子調節序列(在本文中亦稱為「構築物7」)具有924bp之總長度且係由以下構成：807bp sCMV IE1上游區域及加強子序列(以粗體顯示；「構築物4」中亦包括之部分加下劃線)及117bp hCMV「核心」啟動子(顯示為SEO ID NO：5)。

在特定實施例中，嵌合啟動子調節序列係由hCMV及/或sCMV IE2上游區域及/或加強子序列及mCMV IE2啟動子序列構成。在其他特定實施例中，嵌合啟動子調節序列係由hCMV及/或sCMV IE2上游區域及/或加強子序列及hCMV IE2啟動子序列構成。在又一些其他特定實施例中，嵌合啟動子調節序列係由hCMV及/或sCMV IE1上游區域及/或加強子序列及mCMV IE2啟動子序列組成。在又一些其他特定實施例中，嵌合啟動子調節序列係由hCMV及/或sCMV IE1上游區域及/或加強子序列及hCMV IE2啟動子序列構成。在又一些其他特定實施例中，嵌合啟動子調節序列係由hCMV及/或sCMV IE2上游區域及/或加強子序列及mCMV IE1啟動子序列構成。在又一些其他特定實施例中，嵌合啟動子調節序列係由hCMV及/或sCMV IE2上游區域及/或加強子序列及hCMV IE1啟動子序列構成。

如本文所定義之「表現盒」之3'-調節序列通常涵蓋參與轉錄終止、多腺苷酸化或諸如此類之調節元件。然而，若該等終止序列在具體宿主細胞中並不發揮令人滿意的功能，則其可經此細胞中之功能性信號取代。

包含於該「表現盒」中之其他調節元件尤其包括內部核糖體進入位點(IRES；容許「多順反子」核酸序列表現)以及用於將天然多肽靶向宿主細胞之特定區室之轉譯信號序列。適用於CHO細胞之實例性信號序列揭示於例如WO 2008/148519 A2中。熟習此項技術者亦充分瞭解所有該等調節元件以及如何選擇適用於在具體細胞環境中表現核酸序列之該等元件。

本發明之表現載體可為例如質體、黏質體、噬菌粒、人工染色體或遺傳工程中常用之另一媒劑。

除一或多個涵蓋上文所闡述之調節序列之「表現盒」外，該等表現載體通常包括一或多個多選殖位點以幫助插入及/或移除核酸序列。該等多選殖位點可位於上文所闡述之表現盒之上游及下游，從而容許替代整個盒。多選殖位點亦可位於啟動子調節序列下游及3'-調節序列上游之該表現盒內，從而容許插入或替代欲表現之核酸序列。為穩定轉染(參照下文)，表現載體可進一步包含位點特異性整合酶或重組酶之識別序列以幫助宿主細胞基因組之重組及穩定整合。

此外，如本文所定義之表現載體通常包含至少一個複製起點以及源自與所採用宿主細胞相容之物種的控制序列，以確保表現載體之自主複製/附加型維持(具體而言，用於瞬時轉染中；參照下文)。哺乳動物中之實例性複製起點包括SV40及/或EBV複製起點。包含一個以上複製起點之專門設計的表現載體(即穿梭載體)容許在不同宿主之間(例如在細菌與動物細胞之間)穿梭。適用於原核細胞之複製起點包括例如ColE1及M13複製起點。

此外，如本文所定義之表現載體可包含一或多個賦予經轉染細胞可選擇表型之選擇標記。適宜選擇標記尤其包括潮黴素B磷酸酶基因、胸苷激酶基因、鳥胺酸去羧酶基因、二氫葉酸還原酶基因及麩醯胺酸合酶基因。較佳地，採用麩醯胺酸合酶(GS)基因(Cockett,D.K.等人(1990)Bio/Technology 8 ,662-667；Bebbington,C.R.等人(1992)Bio/Technology 10 ：169-175)。

多種可用於設計及/或修飾重組表現載體之方法為業內所公認(例如，參見Sambrook,J.及Russel,D.W.(2001),Molecular cloning：A laboratory manual(3rd Ed.) Cold Spring Harbor,NY,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel,F.M.等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology ,Wiley & Sons,Hoboken,NJ,USA)。眾多種適宜哺乳動物表現載體亦可自市面購得且為熟習此項技術者所熟知，該熟習此項技術者亦能夠確定何種載體適用於在給出環境中表現所關注之核酸分子。該等載體之實例尤其包括pcDNA3、pFRT、pTARGET、 pSV2-dhfr以及本文下文中所闡述之載體pRY42(SEQ ID NO：1)及pRY57(SEQ ID NO：2)之衍生物。

藉由採用本發明之表現載體表現之核酸序列可為單順反子(即編碼包括融合蛋白在內之單一多肽或蛋白質)或多順反子(即編碼兩種或更多種個別多肽或蛋白質)。

在具體實施例中，表現載體包含可操作地連接至欲表現之(第一)核酸序列之單一(即第一)嵌合啟動子調節序列。

在其他具體實施例中，表現載體進一步包含可操作地連接至欲表現之第二核酸序列之第二嵌合啟動子調節序列，其中該第二嵌合啟動子調節序列與第一嵌合啟動子調節序列相同。例如，第一及第二嵌合啟動子調節序列係由hCMV/sCMV IE1上游區域及/或加強子序列以及mCMV IE1或hCMV IE1啟動子序列構成。

在替代性具體實施例中，表現載體進一步包含可操作地連接至欲表現之第二核酸序列之第二嵌合啟動子調節序列，其中該第二嵌合啟動子調節序列與第一嵌合啟動子調節序列不同。例如，第一嵌合啟動子調節序列係由hCMV及/或sCMV IE2上游區域及/或加強子序列以及mCMV IE2或hCMV IE2啟動子序列構成，而第二嵌合啟動子調節序列係由hCMV及/或sCMV IE1上游區域及/或加強子序列以及mCMV IE1或hCMV IE1啟動子序列組成。

在特定實施例中，表現載體包含可操作地連接至欲表現之第三核酸序列之第三嵌合啟動子調節序列，其中該第三嵌合啟動子調節序列可與第一及/或第二啟動子調節序列相同或可與第一及第二嵌合啟動子調節序列二者不同。在又一些特定實施例中，表現載體包含三條以上之嵌合啟動子調節序列。

藉由採用本發明之表現載體表現之核酸序列可編碼任何所關注之多肽或蛋白質，具體而言具有診斷或治療應用之多肽或蛋白質，例如尤其生長因子、細胞介素(干擾素、介白素)、激素、酪胺酸激酶、受體(GPCRs)、整合素、轉錄因子、凝血因子、單鏈抗體、抗體片段或抗體樣分子(anticalin)及諸如此類。

在如本文所定義之表現載體包含兩條嵌合啟動子調節序列(作為表現盒之一部分)之情形下，欲表現之第一及第二核酸序列編碼不同多肽(或蛋白質)。在特定實施例中，不同多肽代表諸如尤其以下等二聚或多聚蛋白之亞單位：同聚或雜聚受體分子、肽激素、DNA/RNA聚合酶、血紅素、疫苗及諸如此類。

在尤佳實施例中，二聚或多聚蛋白係包含輕鏈作為第一亞單位及重鏈作為第二亞單位之「典型」抗體分子。抗體分子可係天然或經遺傳改造之抗體、其全長抗體或截短變體(例如Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂ 片段)。IgG免疫球蛋白抗體尤佳。端視特定應用，抗體分子可為嵌合(例如，鼠類/人類)、人類化或完整人類抗體分子。

在採用包含兩條嵌合啟動子調節序列之表現載體之其他實施例中，欲表現之第一及第二核酸序列編碼用於監測例如靶蛋白之細胞定位或功能活性之欲分析的「靶蛋白質」及相應報導蛋白(例如綠色螢光蛋白、螢光素酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶及辣根過氧化物酶)。

在使用兩條(或更多條)展現不同基因表現率之嵌合啟動子調節序列時，可產生相應所關注蛋白質之一定莫耳比。

在另一態樣中，本發明係關於經如本文上文中所定義之表現載體轉染之哺乳動物宿主細胞。

適宜宿主細胞包括任何類型之哺乳動物細胞，該等細胞具有人類或非人類起點。非人類起點之哺乳動物細胞尤其包括源自以下動物之細胞：小鼠、大鼠、倉鼠、兔、貓、狗、豬、牛、馬或猴。

適宜哺乳動物宿主細胞包括永生細胞系，例如人類Hela、MRC5 纖維母細胞、983M黑素瘤、HEK293、H9、MCF7及Jurkat細胞；MDCK犬類腎細胞；自史泊格-多利大鼠(Sprague-Dawley rat)分離之RF培養之大鼠肺纖維母細胞；鼠類NIH3T3、C127、P815肥胖細胞瘤、MT1A2乳腺癌及L細胞；猿猴COS1及COS7細胞、鵪鶉QC1-3細胞；及中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或細胞系。

在較佳實施例中，所採用之宿主細胞係CHO細胞或CHO細胞系。

適宜CHO細胞系尤其包括CHO Kl(Tjio,J.T.及Puck,T.T.(1958)J.Exp.Med. 108 ,945-955)、CHO pro3-、CHO DG44、CHO P12、dhfr-陰性DUK-B11(Urlaub,G.及Chasin L.A.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77 ,4216-4220)及尤其CHOK1SV(Lonza有限公司，Basel,Switzerland)。CHOK1SV係利用麩醯胺酸合成酶(GS)基因表現系統之適應不含蛋白質之CHOK1懸浮衍生物：陽性轉染子係在不含蛋胺酸磺醯亞胺及麩醯胺酸培養基之雙重選擇下獲得。

所有該等宿主細胞或細胞系可獲自諸如美國典型菌株保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas,VA,USA)或德國微生物及細胞保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，Braunschweig,Germany)等存儲機構以及各種商業供應商。初哺乳動物細胞，即直接獲自生物體(在任何發生階段，尤其包括胚母細胞、胚胎、幼生階段及成年)之細胞，亦在本發明內。適宜初細胞之實例包含心肌細胞、初肝細胞、纖維母細胞、神經元細胞以及幹細胞。源自初細胞之永生穩定細胞系亦在本發明內。

在一些實施例中，本發明之宿主細胞構成多細胞生物體之一部分。換言之，本發明亦關於包含至少一種如本文所定義之宿主細胞之轉基因哺乳動物生物體。

在本發明內，所引入之表現載體可在宿主細胞中作為獨立的遺傳單元(即以游離基因體(episomally))繁殖並維持(在本文中亦稱為「瞬時轉染」)或載體片段可穩定整合至宿主細胞基因組中(在本文中亦稱為「穩定轉染」)。該重組可藉由非同源重組發生在基因組之隨機位置或藉由同源重組或經由位點特異性整合酶發生在基因組之特定位置。較佳地，載體片段(包括欲表現之異源核酸序列)在宿主細胞基因組中整合為單一拷貝。

為將如本文所定義之表現載體引入哺乳動物宿主細胞中，可採用任何適用於所用特定細胞類型之轉染技術。許多轉染方法已確立於業內，尤其包括電穿孔、磷酸鈣共沈澱、化學轉染(例如，環糊精、DEAE-葡聚糖、聚乙烯亞胺)、脂質體轉染(lipofection)、磁性轉染(magnetofection)及「基因槍」(參見例如Sambrook,J.，及Russel,D.W.(2001)，參見上文；Ausubel,F.M.等人(2001)，參見上文)。

換言之，本發明亦關於用於在經如本文所定義之表現載體轉染之哺乳動物宿主細胞中重組(即異源)產生所關注多肽或蛋白質之製程，該表現載體包含編碼該等多肽或蛋白質之相應核酸序列。轉染可使用單一表現載體或使用兩個或更多個不同的表現載體以共轉染方式來實施。

如上文已概述，可使用眾多種方法來瞬時或穩定轉染哺乳動物宿主細胞。在較佳實施例中，轉染係穩定轉染以建立連續表現編碼所關注多肽或蛋白質之異源核酸序列之細胞或細胞系。

在一些實施例中，該方法進一步包含收穫(並視情況純化)所產生之重組多肽或蛋白質之步驟。端視該等多肽或蛋白質之性質，其可分泌至細胞培養物上清液中、整合於宿主細胞膜中或保留在細胞內區室中。

通常，若採用單細胞哺乳動物宿主細胞，則熟習此項技術者可恢復至容許所關注之核酸序列表現之多個細胞培養條件。方便地，所產生之多肽或蛋白質係自所培養細胞之培養基、溶解產物或提取物收穫(並視情況純化)或藉由已建立之技術自(生物)膜分離，該等技術係例如尤其用鹽或有機溶劑分級分離沈澱、離子交換層析、凝膠層析、粒徑排阻層析、HPLC、親和層析(例如，參見Sambrook,J.，及Russel,D.W.(2001)，參見上文)。在宿主細胞為多細胞有機體之一部分之情形下，一小部分該等細胞可用作用於分離本發明之肽之來源。

適用於上文所闡述宿主細胞之培養基及條件為業內所熟知(例如，參照Fresney,R.I.(2000)Culture of Animal cells.A manual (第4版) Wiley-Liss,New York)。端視所採用宿主細胞之特定生長需要，可在例如RPMI 1640培養基、Ham's F12培養基或DMEM(達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium))中實施哺乳動物細胞培養。另一選擇為，可使用血清濃度減少之生長培養基，例如OptiMEM。培養基可視情況補充有10%(v/v)FCS(胎牛血清)、各種生長因子、胺基酸、抗生素及其他添加劑，專門適用於CHO細胞之細胞培養基闡述於例如EP 0 481 791 B1及EP 1 525 320 B1中。可在37℃下在5% CO₂ 、水飽和氣氛中培育經轉染之哺乳動物宿主細胞。各別生長培養基、套組及試劑可自多個供應商購得。

在又一態樣中，本發明係關於如本文上文中所定義之表現載體之用途，其用於在哺乳動物宿主細胞中異源表現所關注之核酸序列。較佳地，所關注之核酸序列可編碼欲用於診斷或治療應用之多肽或蛋白質。

在較佳實施例中，表現載體係用於兩條或更多條在單獨嵌合啟動子調節序列之控制下插入表現載體中之所關注核酸序列之共表現。例如，表現載體可用於表現所關注基因以及用於監測所關注基因之細胞靶向及/或功能之報導基因。

尤佳地，表現載體係用於兩條或更多條所關注核酸序列之共表現，該兩條或更多條所關注之核酸序列編碼二聚或多聚蛋白之亞單位，例如抗體分子之輕鏈及重鏈或疫苗之亞單位。鑒於採用不同嵌合啟動子調節序列獲得不同基因表現率，可使用如本文所定義之表現載體來表現呈具體(莫耳)比之兩條或更多條所關注之核酸序列。

在特定實施例中，使用如本文所定義之表現載體作為用於基因療法之藥劑(或作為藥劑之部分或套組之部分)。

本發明進一步藉由圖及以下實例進行闡述，該等圖及實例僅出於圖解說明本發明特定實施例之目的，且不應理解為以任何方式限制本發明之範疇。

實例 基本原理：

如申請專利範圍中所指定，7條不同嵌合啟動子調節序列係基於來自鼠類、人類及猿猴巨細胞病毒(mCMV、hCMV及sCMV)基因組之序列產生(參見表1 ，圖3 )。分析該等構築物在控制在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中異源基因表現單株抗體之輕鏈及重鏈(LC及HC)中之功效。

實例1：載體構築

使用基因合成來產生本文所採用之7種不同嵌合啟動子調節構築物(即構築物「1-7」)。提供構築物待用於選殖至「空」靶載體pRY42(參照圖1 ，SEQ ID NO：1)中，以替代其中所含有之原始鼠類巨細胞病毒(mCMV)啟動子(SEQ ID NO：3)。母體載體pRY42包含兩種表現盒，其各自處在啟動子調節序列(最初源自mCMV)之控制下。

嵌合構築物(參照表1 ，圖3 ，SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：13)經合成以包括在5'及3'端側接啟動子調節序列之額外DNA序列，從而容許納入內切酶限制位點(即亦存在於pRY42中)以幫助核酸片段交換。

包含嵌合構築物1-7之新載體各自係根據表2 中所說明之方案藉由四元連接反應來構築。將用於表現抗體輕鏈核酸序列之嵌合啟動子調節序列插入pRY42之突變FRT(翻轉酶識別靶)位點(F5-mFRT)之3'(即「下游」)，然後插入鏈間片段及用於表現抗體重鏈核酸序列之嵌合啟動子調節序列。

連接反應係根據製造商之說明使用快速DNA連接套組(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)來實施。將所得質體載體轉化至大腸桿菌(E.coli )DH5α勝任細胞(Invitrogen/Life Technologies GmbH；Darmstadt,Germany)中。將樣品平鋪於補充有50μg/ml胺苄青黴素之Luria-Bertani(LB)瓊脂上且在37℃下培育過夜。使用單一菌落接種含有200ml LB液體培養基加50μg/ml胺苄青黴素之500ml搖瓶。在振盪培育器中在37℃下以200rpm將燒瓶培育過夜。根據製造商說明書使用Nucleobond Maxi套組(Macherey-Nagel GmbH,Düren,Germany)使用所得培養物來製備質體DNA。藉由診斷性限制消化來驗證所產生之質體。

在後續步驟中，將IgG4單株抗體cB72.3之LC及HC(Whittle,N.等人(1987)Protein Eng. 1 ,499-505)選殖至包含嵌合構築物1-7之7個載體中之每一者中。編碼該等抗體鏈之核酸序列係源自載體pRY57(圖2 ，SEQ ID NO：2)作為EcoRI/HindIII(LC)及BamHI/NruI(HC)限制片段且使用相同限制內切酶依序選殖至每一啟動子構築物之載體中。使用如上文所闡述之方法。分別藉由啟動子區域之診斷限制消化及DNA測序來驗證所得質體載體。

實例2：轉染及細胞系構築

所有實驗皆使用源自適應懸浮物之中國倉鼠卵巢細胞系CHOK1SV之細胞系(Lonza有限公司，Basel,Switzerland)。在此細胞系中，核酸表現構築物係在宿主細胞之特定基因座處且以所定義之拷貝數藉助位點特異性整合(SSI)系統插入。

對於整合之陽性選擇係藉由存在於SSI位點處之潮黴素B抗性盒之功能恢復來完成。將表現構築物整合至宿主基因組中亦移除胸苷激酶基因之拷貝，此將前藥更昔洛韋(ganciclovir)轉變成毒性磷酸化核苷酸類似物。因此，在細胞系構築期間添加潮黴素B及更昔洛韋分別為靶基因座處之整合提供陽性及陰性選擇壓力。

使來自冷藏保存之小瓶之宿主細胞系復活且繼代培養。在CD-CHO培養基(Invitrogen/Life Technologies GmbH；Darmstadt,Germany)中實施所有細胞培養。在轉染前48h，將細胞以0.3×10⁶ 個細胞/ml之最終濃度接種於30ml CD-CHO培養基中。

在轉染當天，使1.2×10⁷ 個細胞沈澱且於1ml CD-CHO中重懸，然後使用電穿孔在0.4cm Bio-Rad GenePulser Xcell試管(單一脈衝為300V/900μF，時間常數為12-16毫秒)中實施45μg pOG44質體(Invitrogen/Life Technologies GmbH；Darmstadt,Germany)與各自5μg靶載體(分別包含嵌合構築物1-7)之共轉染。pOG44質體涵蓋幫助在存在於靶座處之FRT位點處重組所需要之酵母菌FLP重組酶(翻轉酶)之表現盒。所有轉染實驗皆至少以一式兩份來實施。

將電穿孔樣品各自轉移至存於T75燒瓶中之20ml CD-CHO培養基(BD Biosciences,Heidelberg,Germany)且在36.5℃下以靜態模式在加濕培育器(存於空氣中之5%(v/v)CO₂ )中培育。使轉染後48h之細胞沈澱(150×g,5min)且於含有200μg/ml潮黴素B(陽性選擇)之20ml CD-CHO培養基中重懸。將培養物維持在靜態模式中且72h後用含有200μg/ml潮黴素B之新鮮CD-CHO替換培養基。

隨後，每72h測定活細胞濃度且用含有200μg/ml潮黴素B及3μM更昔洛韋(陰性選擇)之20ml新鮮CD-CHO替換培養基。一旦T75燒瓶中之培養物達到9×10⁶ 個細胞/ml之總細胞濃度，即將培養物調節至含有200μg/ml潮黴素B及3μM更昔洛韋之30ml CD-CHO之最終體積。然後將各自稀釋之培養物轉移至E125搖瓶。

實例3：用於測定藉由使用「啟動子構築物1-5」產生之單株抗體濃度之補料分批過度生長(FOG)懸浮培養物.

如國際專利公開案WO 2008/148519 A2中所闡述實施補料分批過度生長(FOG)搖瓶分析。用於所給出之經轉染細胞懸浮培養物之所有FOG實驗皆至少以一式兩份實施。

簡言之，經轉染細胞以2×10⁵ 個細胞/ml之濃度接種於各自含有50ml CM42/SPE生長培養基(Lonza有限公司，Basel,Switzerland)之250ml搖瓶中，且在37℃下在加濕軌道式振盪培育器(存於空氣中之 5%(v/v)CO₂ )中以140rpm培育。在培養第3天開始，用由胺基酸與痕量元素之混合物組成之進料進給細胞。使用Cedex自動化細胞存活率分析器(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)來測定日存活率及活細胞濃度。在培養第15天(收穫「過度生長」培養物)藉由蛋白質A-HPLC來測定培養基中之抗體濃度。

實例4：藉助蛋白質A-HPLC對產生之單株抗體濃度之測定(使用「啟動子構築物1-5」)

藉由蛋白質A-高效液相層析(HPLC)來測定cB72.3 IgG4單株抗體(mAb)之濃度，該單株抗體係藉由具有在不同嵌合構築物1-5控制下之LC/HC基因表現盒之各別細胞系產生且分泌至細胞培養基。將不含細胞之上清液(通過0.22μm過濾器單元)裝載至連接至Agilent 1200 HPLC之POROS蛋白質A螢光檢測管柱(applied Biosystems公司，Foster City,Ca,USA)上。洗滌該管柱且藉由降低溶劑之pH來溶析結合的mAb。

藉由與用經MabSelect SuRe(GE Healthcare GmbH,Freiburg,Germany)純化之cB72.3 IgG4之連續稀釋液產生的標準曲線(標準曲線之範圍：1025ng/μl至200ng/μl)比較來測定mAb之濃度。

以上實驗之結果分別匯總於表3 及圖4 中：對於本文所採用之每一嵌合構築物，n=4，此代表對一式兩份轉染實施一式兩份FOG分析，但對於構築物4(n=6，對一式三份轉染實施一式兩份FOG分析)及pRY57(原始mCMV，n=8)例外，且數據點係來自實驗1及實驗2之組合。如先前所闡述實施細胞培養參數之計算(Porter等人(2010)Biotechnol.Progr. 26 ,1446-1454)。

根據圖4 顯而易見，在培養物收穫當天(即第15天)，使用第2-5號嵌合構築物中之任一者產生高於使用原始mCMV啟動子序列(即載體pRY57)之抗體濃度。雖然結果並未達到統計學顯著性，但使用1號嵌合構築物亦獲得高於使用mCMV啟動子(1.31倍)之抗體濃度。

使用4號嵌合構築物獲得最佳結果，其基因表現係mCMV啟動子之約2.88倍，其次為(以遞減順序)5號嵌合構築物(約2.54倍)、2號嵌合構築物(約1.80倍)及3號嵌合構築物(約1.45倍)。

備註： Max.-最大活細胞濃度(10⁶ 個細胞/ml)；μ-比生長速率(1/h)；IVC-活細胞濃度之時間積分(10⁶ 個細胞．h/ml)；ρ_P -mAb之比產率(pg/細胞．h)；且[mAb]-收穫時產生之mAb之濃度(mg/l)。

以上數據顯示，使用包含sCMV及/或hCMV上游區域及/或加強子元件以及mCMV啟動子元件之嵌合啟動子調節序列代表用於獲得高度有效之哺乳動物細胞異源基因表現系統之優異遺傳工具。

實例5：用於測定藉由使用「啟動子構築物6-7」產生之單株抗體濃度之分批過度生長(BOG)懸浮培養物

分批培養物係在含有30mL CD-CHO之通氣的E125燒瓶以懸浮模式實施(Kühner 4層培育器，36.5℃，存於空氣中之5% CO₂ (v/v)及85%濕度(v/v))。簡言之，以2×10⁵ 個細胞/ml之濃度接種經轉染之細胞且在整個培養期間監測活細胞濃度。在培養第7天(高培養物存活率)採集培養基樣品以使用蛋白質A HPLC測定培養基中cB72.3之濃度。用於所給出之經轉染細胞懸浮培養物之所有BOG實驗皆至少以一式兩份實施。

實例6：藉助蛋白質A-HPLC對產生之單株抗體濃度之測定(使用「啟動子構築物6-7」)

藉由蛋白質A-高效液相層析(HPLC)來測定cB72.3 IgG4單株抗體(mAb)之濃度，該單株抗體係藉由具有在不同嵌合構築物6-7控制下之LC/HC基因表現盒之各別細胞系產生且分泌至細胞培養基。將不含細胞之上清液(通過0.22μm過濾器單元)裝載至連接至Agilent 1100 HPLC之POROS蛋白質A螢光檢測管柱(applied Biosystems公司，Foster City,Ca,USA)上。洗滌該管柱且藉由降低溶劑之pH來溶析結合的mAb。

藉由比較經MabSelect SuRe(GE Healthcare GmbH,Freiburg,Germany)純化之cB72.3 IgG4之連續稀釋液產生的標準曲線來測定mAb之濃度(標準曲線之範圍：1025ng/μl至64ng/μl)。

以上實驗之結果匯總於圖5 中：對於mCMV及構築物7，n=6(對於一式三份轉染實施一式兩份分批分析)，且對於構築物6，n=4(對於一式兩份轉染實施一式兩份分批分析)。

根據圖5 顯而易見，在培養第7天，使用嵌合構築物6及7中之任一者產生高於使用原始mCMV啟動子序列(即載體pRY57)之抗體濃度。

使用嵌合啟動子構築物6獲得最佳結果，其mAb產率係mCMV啟動子之約2.27倍。

以上數據顯示，使用包含sCMV及/或hCMV上游區域及/或加強子元件以及hCMV核心啟動子元件之嵌合啟動子調節序列代表用於獲得高度有效之哺乳動物細胞異源基因表現系統之優異遺傳工具。

可在不存在本文中未特定揭示之任何要素、限制下適宜地實踐以說明方式闡述於本文中之本發明。因此，例如，術語「包含」、「包括」、「含有」等應以擴展方式理解且無限制性。此外，本文中所採用之術語及表述係用作描述性而非限制性術語，且並非意欲藉由使用該等術語及表述來排除所顯示及所闡述特徵或其部分之任何等效形式，但應意識到在所主張之本發明之範疇內可存在各種修改形式。因此，應理解，儘管已藉由實施例及可選特徵來特定地揭示本發明，但彼等熟習此項技術者可採取其中所體現之本發明之修改及變化形式，且該等修改及變化形式視為在本發明之範疇內。

本文已廣泛且一般地闡述本發明。一般揭示內容內之較狹窄種類及亞類分組中之每一者亦形成本發明之一部分。此包括本發明之一般描述，前提或負向限制係移除來自該類別之任何標的物，無論本文中是否明確列舉所排除內容。

其他實施例在以下申請專利範圍內。此外，若以馬庫西群組(Markush group)形式闡述本發明之特徵或態樣，則彼等熟習此項技術者將意識到，亦藉此以馬庫西群組中任何個別成員或成員亞組之形式來闡述本發明。

<110> 英商龍沙生物學公司

<120> 包含嵌合巨細胞病毒啟動子及加強子序列的表現載體

<130> 827-1 TW

<140> not assigned yet

<141> 2013-09-23

<150> EP12185728.8

<151> 2012-09-24

<160> 15

<170> BiSSAP Version 1.1

<210> 1

<211> 5908

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 質粒載體pRY42

<220>

<221> polyA_signal

<222> (7)...(245)

<223> SV40聚A信號

<220>

<221> promoter

<222> (266)...(756)

<223> mCMV-MIE(IE1)啟動子片段

<220>

<221> 5'UTR

<222> (758)...(791)

<223> mCMV-MIE(IE1)5’UTR外顯子1之一部分

<220>

<221> 5'UTR

<222> (803)...(884)

<223> hCMV-MIE(IE1)5’UTR外顯子1之一部分

<220>

<221> intron

<222> (885)...(1711)

<223> hCMV-MIE(IE1)內含子A

<220>

<221> 5'UTR

<222> (1712)...(1729)

<223> hCMV-MIE(IE1)5’UTR外顯子2

<220>

<221> polyA_signal

<222> (1767)...(2005)

<223> SV40聚A信號

<220>

<221> promoter

<222> (2019)...(2345)

<223> SV40早期啟動子，源自pFRT/lacZeo(Invitrogen)

<220>

<221> source

<222> (2350)...(2354)

<223> 含有ATG位點之序列，發現於pFRT/lacZeo(Invitrogen)之野生型FRT之上游

<220>

<221> misc_recomb

<222> (2355)...(2402)

<223> 野生型翻轉酶識別靶(FRT)位點，源自pcDNA5-Frt(Invitrogen)

<220>

<221> source

<222> (3183)...(4043)

<223> β-內醯胺酶基因之反向補體CDS

<220>

<221> misc_recomb

<222> (4319)...(4366)

<223> 突變體翻轉酶識別靶(FRT)位點

<220>

<221> promoter

<222> (4410)...(4900)

<223> mCMV-MIE(IE1)啟動子片段

<220>

<221> 5'UTR

<222> (4902)...(4935)

<223> mCMV-MIE(IE1)5’UTR外顯子1之一部分

<220>

<221> 5'UTR

<222> (4947)...(5028)

<223> hCMV-MIE(IE1)5’UTR外顯子1之一部分

<220>

<221> intron

<222> (5029)...(5855)

<223> hCMV-MIE(IE1)內含子A

<220>

<221> 5'UTR

<222> (5856)...(5873)

<223> hCMV-MIE(IE1)5’UTR外顯子2

<400> 1

<210> 2

<211> 7948

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 質粒載體pRY57

<220>

<221> CDS

<222> (67)...(713)

<223> 基因優化之cB72.3 κ輕鏈

<220>

<221> polyA_signal

<222> (720)...(598)

<223> SV40聚A信號

<220>

<221> promoter

<222> (979)...(1470)

<223> mCMV-MIE(IE1)啟動子片段

<220>

<221> 5'UTR

<222> (1471)...(1504)

<223> mCMV-MIE(IE1)5’UTR外顯子1之一部分

<220>

<221> 5'UTR

<222> (1516)...(1601)

<223> hCMV-MIE(IE1)5’UTR外顯子1之一部分

<220>

<221> intron

<222> (1598)...(2424)

<223> hCMV-MIE(IE1)內含子A

<220>

<221> 5'UTR

<222> (2425)...(2441)

<223> hCMV-MIE(IE1)5’UTR外顯子2

<220>

<221> CDS

<222> (2508)...(3836)

<223> 基因優化之cB72.3 γ-4重鏈

<220>

<221> polyA_signal

<222> (3843)...(4081)

<223> SV40聚A信號

<220>

<221> promoter

<222> (4095)...(4421)

<223> SV40早期啟動子，源自pFRT/lacZeo(Invitrogen)

<220>

<221> source

<222> (4426)...(4430)

<220>

<221> misc_recomb

<222> (4431)...(4478)

<223> 野生型翻轉酶識別靶(FRT)位點，源自pcDNA5-Frt(Invitrogen)

<220>

<221> source

<222> (5259)...(6119)

<223> β-內醯胺酶基因之反向補體CDS

<220>

<221> misc_recomb

<222> (6395)...(6442)

<223> 突變體翻轉酶識別靶(FRT)位點

<220>

<221> promoter

<222> (6486)...(6977)

<223> mCMV-MIE(IE1)啟動子片段

<220>

<221> 5'UTR

<222> (6978)...(7011)

<223> mCMV-MIE(IE1)5’UTR外顯子1之一部分

<220>

<221> 5'UTR

<222> (7023)...(7108)

<223> hCMV-MIE(IE1)5’UTR外顯子1之一部分

<220>

<221> intron

<222> (7105)...(7931)

<223> hCMV-MIE(IE1)內含子A

<220>

<221> 5'UTR

<222> (7932)...(7948)

<223> hCMV-MIE(IE1)5’UTR外顯子2

<400> 2

<210> 3

<211> 492

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mCMV IE1啟動子序列之片段

<400> 3

<210> 4

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mCMV IE1啟動子序列之片段(“核心啟動子”)

<400> 4

<210> 5

<211> 117

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hCMV IE1啟動子序列之片段(“核心啟動子”)

<400> 5

<210> 6

<211> 452

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sCMV IE1加強子序列之片段

<400> 6

<210> 7

<211> 1074

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<220> 嵌合5’-非轉譯調節序列(“構築物1”)

<221> enhancer

<222> (1)...(582)

<223>

<220> hCMV IE1及mCMV IE1加強子序列之片段

<221> promoter

<222> (583)...(1074)

<223> mCMV IE1啟動子序列之片段

<400> 7

<210> 8

<211> 1128

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<220> 嵌合5’-非轉譯調節序列(“構築物2”)

<221> enhancer

<222> (1)...(1026)

<223>

<220> hCMV IE1加強子序列之片段

<221> promoter

<222> (1027)...(1128)

<223> mCMV IE1啟動子序列之片段(“核心啟動子”)

<400> 8

<210> 9

<211> 509

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合5’-非轉譯調節序列(“構築物3”)

<220>

<221> enhancer

<222> (1)...(407)

<223>

<220> hCMV IE1加強子序列之片段

<221> promoter

<222> (408)...(509)

<223> mCMV IE1啟動子序列之片段(“核心啟動子”)

<400> 9

<210> 10

<211> 961

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<220> 嵌合5’-非轉譯調節序列(“構築物4”)

<221> enhancer

<222> (1)...(452)

<223>

<220> sCMV IE1加強子序列之片段

<221> enhancer

<222> (453)...(859)

<223>

<220> hCMV IE1加強子序列之片段

<221> promoter

<222> (860)...(961)

<223> mCMV IE1啟動子序列之片段(“核心啟動子”)

<400> 10

<210> 11

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合5’-非轉譯調節序列(“構築物5”)

<220>

<221> enhancer

<222> (1)...(807)

<223> sCMV IE1加強子序列之片段

<220>

<221> promoter

<222> (808)...(909)

<223> mCMV IE1啟動子序列之片段(“核心啟動子”)

<400> 11

<210> 12

<211> 976

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<220> 嵌合5’-非轉譯調節序列(“構築物6”)

<221> enhancer

<222> (1)...(452)

<223>

<220> sCMV IE1加強子序列之片段

<221> enhancer

<222> (453)...(859)

<223> hCMV IE1加強子序列之片段

<220>

<221> promoter

<222> (860)...(976)

<223> hCMV IE1啟動子序列之片段(“核心啟動子”)

<400> 12

<210> 13

<211> 924

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合5’-非轉譯調節序列(“構築物7”)

<220>

<221> enhancer

<222> (1)...(807)

<223> sCMV IE1加強子序列之片段

<220>

<221> promoter

<222> (808)...(924)

<223> hCMV IE1啟動子序列之片段(“核心啟動子”)

<400> 13

<210> 14

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 優化之cB72.3 κ輕鏈

<400> 14

<210> 15

<211> 434

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 優化之cB72.3 γ-4重鏈

<400> 15

Claims

一種表現載體，其用於在哺乳動物細胞中異源表現所關注之核酸序列，該載體包含第一嵌合啟動子調節序列可操作地連接至欲表現之第一核酸序列，其中該嵌合啟動子調節序列包含：(i)啟動子序列，其選自由SEQ ID NO：4之核苷酸序列組成之鼠類巨細胞病毒IE1啟動子或由SEQ ID NO：5之核苷酸序列組成之人類巨細胞病毒IE1啟動子且可操作地連接至該欲表現核酸序列之轉錄起始位點；及(ii)加強子序列，其來自人類及/或猿猴巨細胞病毒IE1區域，該加強子序列位於鼠類或人類啟動子序列之5'且可操作地連接，且其中該嵌合啟動子調節序列包含序列元件來自由以下組成之群中之至少兩者：鼠類巨細胞病毒、人類巨細胞病毒及猿猴巨細胞病毒。
如請求項1之表現載體，其中該加強子序列包含來自猿猴巨細胞病毒IE1區域之核苷酸序列SEQ ID NO：6。
如請求項1之表現載體，其中嵌合啟動子調節序列包含選自由以下組成之群之核苷酸序列：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13。
如請求項1至3中任一項之表現載體，其進一步包含第二嵌合啟動子調節序列可操作地連接至欲表現之第二核酸序列，其中該第二嵌合啟動子調節序列與該第一嵌合啟動子調節序列相同。
如請求項4之表現載體，其中該等欲表現之第一及第二核酸序列編碼不同多肽。
如請求項5之表現載體，其中該等不同多肽代表二聚或多聚蛋白之亞單位。
如請求項6之表現載體，其中二聚或多聚蛋白係抗體分子。
如請求項1至3中任一項之表現載體，其進一步包含第二嵌合啟動子調節序列可操作地連接至欲表現之第二核酸序列，其中該第二嵌合啟動子調節序列與該第一嵌合啟動子調節序列不同。
如請求項8之表現載體，其中該等欲表現之第一及第二核酸序列編碼不同多肽。
如請求項9之表現載體，其中該等不同多肽代表二聚或多聚蛋白之亞單位。
如請求項10之表現載體，其中二聚或多聚蛋白係抗體分子。
一種哺乳動物宿主細胞，其經如請求項1至11中任一項之表現載體轉染。
如請求項12之哺乳動物宿主細胞，其中該宿主細胞係CHO細胞。
一種用於在哺乳動物宿主細胞中異源表現所關注核酸序列之方法，其包含：(i)用如請求項1至11中任一項之表現載體轉染該哺乳動物宿主細胞；及(ii)該經轉染之哺乳動物宿主細胞在容許表現該所關注之核酸序列之條件下培養。
如請求項14之方法，其中該轉染係穩定轉染。
一種如請求項1至11中任一項之表現載體之用途，其用於在哺乳動物宿主細胞中異源表現所關注之核酸序列。