BR112015005604B1 - Vetores de expressão compreendendo sequências de potencializador e promotor de citomegalovírus quimérico - Google Patents

Abstract

VETORES DE EXPRESSÃO COMPREENDENDO SEQUÊNCIAS DE POTENCIALIZADOR E PROMOTOR DE CITOMEGALOVÍRUS QUIMÉRICO A presente invenção refere-se a vetores de expressão para a expressão heteróloga de uma sequência de ácidos nucleicos de interesse em células de mamíferos, os vetores compreendendo uma sequência reguladora de promotor quimérico sendo operativamente ligada a uma sequência de ácidos nucleicos a ser expressa, em que a sequência reguladora de promotor quimérico compreende uma sequência de promotor de citomegalovírus derivada de citome-galovírus de murino ou de citomegalovírus de humano e sendo operativamente ligada ao sítio de início da transcrição da sequência de ácidos nucleicos a ser expressa; e uma região a montante do citomegalovírus e/ou sequência de potencializador derivada de citomegalovírus de humano e/ou de símio, em que a sequência de potencializador e/ou região a motante está localizada a 5' de, e operativamente ligada à, sequência de promotor de murino ou de humano, e em que a sequência reguladora de promotor quimérico compreende elementos de sequência sendo derivados a partir de pelo menos dois do grupo que consiste em citomegalovírus de murino, citomegalovírus de humano e citomegalovírus de símio. Em modalidades particulares, a sequência reguladora de promotor quimérico compreende elementos de sequência derivados (...).

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001]A presente invenção refere-se a sistemas de expressão de mamíferos, e em particular a construtos de expressão que compreendem sequências reguladoras de promotores quiméricos para a expressão heteróloga de uma sequência de ácidos nucleicos de interesse em células de mamíferos. As sequências reguladoras de promotor quimérico são compostas de uma sequência de promotor derivada a partir de citomegalovírus de humano ou de murino e uma sequência de potencializador e/ou região a motante derivada de citomegalovírus de humano e/ou de símio, desde que os elementos de sequência sejam derivados a partir de pelo menos duas espé-cies diferentes de citomegalovírus.

ANTECEDENTES

[002]Os (poli)peptídeos e as proteínas recombinantes para aplicações em pes-quisa básica, diagnóstico e terapia, tais como moléculas de anticorpos, vacinas, hormônios e fatores de crescimento, são produzidos com o uso de uma ampla varie-dade de organismos geneticamente modificados que incluem ambas as células pro- carióticas e eucarióticas. No entanto, a grande maioria dos peptídeos ou proteínas recombinantes inclui modificações pós-translacionais que não podem ser mimetiza- das ou produzidas quando se usam células hospedeiras procarióticas. Por esta ra-zão, os sistemas de expressão de genes de mamíferos acabou por representar uma escolha preferencial.

[003]Os sistemas de expressão de mamíferos baseados em células de ovário de hamster chinês (CHO) são amplamente usados na produção de proteína recombi- nante. Além das linhagens de células linfóides, as células de CHO representam um dos poucos tipos de células que permitem a cultura de células de animais em lotes de suspensão de alta densidade simples e eficiente. Além disso, o uso de células de CHO resulta em altos rendimentos de produto, enquanto que as células linfóides são mais difíceis de cultivar em escala industrial. Em vista dos custos consideráveis para a produção recombinante de polipeptídeos e proteínas, é também da maior impor-tância a maximização do rendimento de proteína recombinante por corrida de biorea- tor. Os parâmetros do processo que têm um impacto considerável no rendimento de produto incluem, inter alia, as condições de cultura celular, o número de cópias de ácidos nucleicos (genes) a serem expressos, a eficiência com que estes genes são transcritos e dos mRNAs correspondentes que são traduzidos, da estabilidade do mRNA, e semelhantes.

[004]Deste modo, as melhorias da força ou atividade de transcrição dos elementos genéticos de regulação que controlam a expressão de genes constituem um fator particularmente crítico, a fim de aumentar o rendimento da proteína recombinante produzida. Mesmo pequenos aumentos incrementais na atividade de transcrição ao nível de uma única célula irão finalmente se transformar em melhorias consideráveis no rendimento do produto em cultura de lotes de escala industrial de alta densidade.

[005]A grande maioria dos sistemas de expressão de genes de mamíferos em-prega vetores de expressão que codificam as sequências de ácidos nucleicos hete- rólogas a serem expressas sob o controle de sequências reguladoras de promotores derivados de vírus. Dois dos elementos de regulação virais mais frequentemente usados nestes cassetes de expressão são os dos genes 1 e 2 precoces imediatos de citomegalovírus de humano (hCMV) (IE1 e IE2). No entanto, uma desvantagem associada com o uso de elementos de regulação de hCMV IE1 e IE2 é a sua especi-ficidade de espécies pronunciadas.

[006]A patente US 5.866.359 divulga que a expressão do gene a partir de tal promotor de hCMV pode ser melhorada pela co-expressão da proteína EIA adenovi-ral sob o controle de um promotor fraco. EIA é um fator de transcrição multifuncional que pode agir sobre a regulação do ciclo celular e tem ambos os domínios funcionais de ativação e repressão da transcrição independentes. O ajuste fino de expressão de EIA é crucial para atingir o equilíbrio ideal entre a transativação de gene e qualquer impacto negativo na progressão do ciclo celular. No entanto, a superexpressão da expressão de EIA poderia reduzir a capacidade da célula para sintetizar a proteína recombinante de interesse.

[007]A patente US 5.591.639 descreve vetores compreendendo, a montante (5') de uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga a ser expressa, o potencializador, o promotor e a região 5' não traduzida completa do gene precoce imediato principal do citomegalovírus de humano (hCMV-MIE ), incluindo o íntron A (ou seja, o primeiro íntron natural). No entanto, se os primeiros 400 pb (extremidade 5’ ) desta sequência (comprimento completo de cerca de 2100 pb) estavam presentes, as fracas taxas de expressão de gene foram observadas tanto em células de COS7 quanto em células de CHO (Chapman, B.S. et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19, 3979-3986).

[008]A atividade de transcrição dos elementos de regulação dos genes precoces imediatos do citomegalovírus de murino (mCMV) é maior do que a das contrapartes de hCMV, sem exibir a preferência de espécies pronunciada observada para as se-quências de humanos (Addison, C.L. et al. (1987) J. Gen. Virol. 78, 1653-1661).

[009]No entanto, as tentativas para potencializar a atividade dos elementos de re-gulação do promotor IE de mCMV, analogamente as contrapartes de hCMV, através da inserção do primeiro íntron natural do gene precoce imediato principal de murina a jusante (3’ ) do promotor IE de mCMV não teve sucesso (cf., inter alia patente EP 1 525 320 B1). No entanto, a geração de vetores de expressão que compreendem um cassete quimérico constituído pelos elementos de regulação do IE1 de mCMV e do primeiro íntron natural do gene precoce imediato principal de humano resultou em rendimentos de produto comparáveis com o uso das sequências totalmente huma-nas (cf., por exemplo, WO 2006/111387 A2). As taxas de expressão de genes simila-res foram também obtidas para vetores de expressão compreendendo as sequên- cias reguladoras de IE2 de mCMV (cf., inter alia, a patente EP 1 601 776 B1).

[010]Assim, continua a existir uma necessidade de sistemas de expressão de ge-nes de mamíferos melhorardos, resultando em altos rendimentos dos polipeptídeos ou proteínas recombinantes produzidas. Em particular, existe uma necessidade para sistemas de expressão de genes de mamífero que ultrapassem as limitações menci-onadas acima, isto é, os sistemas de expressão baseados nas sequências de pro-motor de mCMV ou hCMV, mas conseguir taxas de expressão mais altas (e assim, os rendimentos do produto) do que com o sistema disponível.

[011]Como consequência, é um objeto da presente invenção fornecer tais siste-mas de expressão de genes, principalmente construtos de expressão adequados e células hospedeiras de mamífero correspondentes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[012]Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor de expressão para a expressão heteróloga de uma sequência de ácidos nucleicos de interesse em células de mamíferos, o vetor compreendendo uma primeira sequência reguladora de promotor quimérico sendo operativamente ligada a uma primeira sequência de ácidos nucleicos a ser expressa, em que a sequência reguladora de promotor quimé-rico compreende:

[013](I) uma sequência de promotor sendo derivada do citomegalovírus de murino ou do citomegalovírus de humano e sendo operativamente ligada ao sítio de partida de transcrição da sequência de ácidos nucleicos a ser expressa; e

[014](ii) uma sequência de potencializador e/ou região a motante sendo derivada de citomegalovírus de humano e/ou símio, em que a sequência de potencializador e/ou região a motante está localizada 5’ de, e operativamente ligada à, sequência de promotor de humano ou de murino; e em que a sequência reguladora de promotor quimérico compreende elementos da sequência sendo derivados a partir de pelo menos dois do grupo que consiste em citomegalovírus de murino, citomegalovírus de humano e citomegalovírus de símio.

[015]Em modalidades particulares, a sequência de promotor é derivada a partir do promotor IE1 de citomegalovírus de murino; e/ou a sequência de potencializador e/ou região a montante é derivada do potencializador IE1 de citomegalovírus de hu-mano e/ou de símio.

[016]Em modalidades preferenciais, a sequência de promotor IE1 do citomegalo- vírus de murino tem a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4.

[017]Em outras modalidades particulares, a sequência de promotor é derivada do do promotor IE1 do citomegalovírus de humano; e/ou a sequência de potencializador e/ou região a montante é derivada do potencializador IE1 de citomegalovírus de hu-mano e/ou símio.

[018]Em modalidades preferenciais, a sequência de promotor IE1 de citomegalo- vírus de humano tem a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5.

[019]Em outras modalidades preferenciais, a sequência de potencializador e/ou região a montante compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 6 sendo derivada da região IE1 de citomegalovírus de símio.

[020]Em modalidades particularmente preferenciais, a sequência reguladora de promotor quimérico compreende uma sequência de nucleotídeos que é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, e SEQ ID NO: 13.

[021]Em outras modalidades particulares, o vetor de expressão compreende ainda uma segunda sequência reguladora de promotor quimérico que é operativamente ligada a uma segunda sequência de ácidos nucleicos a ser expressa, em que a se-gunda sequência reguladora de promotor quimérico é idêntica à primeira sequência reguladora de promotor quimérico.

[022]Em modalidades particulares alternativas, o vetor de expressão compreende ainda uma segunda sequência reguladora de promotor quimérico sendo operativa- mente ligada a uma segunda sequência de ácidos nucleicos a ser expressa, em que a segunda sequência reguladora de promotor quimérico é diferente da primeira se-quência reguladora de promotor quimérico.

[023]De preferência, as primeira e segunda sequências de ácidos nucleicos a se-rem expressas codificam diferentes polipeptídeos. Em modalidades específicas, os diferentes polipeptídeos representam subunidades de uma proteína dimérica ou mul- timérica. De particular preferência, a proteína dimérica ou multimérica é uma molécu-la de anticorpo.

[024]Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula hospedei-ra de mamífero transfectada com um vetor de expressão como definido aqui acima. De preferência, a célula hospedeira é uma célula de CHO.

[025]Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a expressão heteróloga de uma sequência de ácidos nucleicos de interesse em uma célula hospedeira de mamífero, compreendendo:

[026](I) transfecção da célula hospedeira de mamífero com um vetor de expressão como definido aqui acima; e

[027](ii) cultivar a célula hospedeira de mamífero transfectada em condições que permitam a expressão da sequência de ácidos nucleicos de interesse.

[028]Em modalidades preferenciais, a transfecção é transfecção estável.

[029]Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de um vetor de expressão como definido no presente documento acima para a expressão heterólo- ga de uma sequência de ácidos nucleicos de interesse em uma célula hospedeira de mamífero.

[030]Outras modalidades da presente invenção serão evidentes a partir da des-crição detalhada a seguir.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[031]A Figura 1 ilustra o vetor de expressão pRY42 (SEQ ID NO: 1) usado como "vetor de origem" para gerar os vetores de expressão de mamífero, tal como definido no presente documento. pRY42 engloba dois cassetes reguladores para dirigir a ex-pressão do gene heterólogo (entre "mCMV" e "pA", respectivamente): Múltiplos sítios de clonagem localizados a 3’ (isto é, "a jusante") das regiões de "EX2", para inserção de sequências de ácidos nucleicos heterólogos a serem expressas. Os cassetes reguladores são flanqueados pelos sítios alvos de reconhecimento de flipase ("F5- mFRT") mutante e do tipo selvagem ("wFRT"). Um códon de metionina de iniciação na estrutura foi adicionado à extremidade 5’ do sítio wFRT ("ATG+F"). Um promotor precoce de SV40 ("SV") é localizado a 5' ("a montante") de ATG+F. A transcrição de sequências heterólogas de ácidos nucleicos é conduzida pelo promotor do gene IE1 do citomegalovírus de murino ("mCMV"), que é seguido pela UTR 5’, onde o éxon 1 ("Ex1") é um híbrido de sequências derivadas de CMV de murino ("m") e de humano ("h"), e em que a sequência A de íntron A ("Int A") e éxon 2 ("Ex2") são derivadas a partir da sequência de hCMV. O gene marcador de seleção de -lactamase é deno-tado como "bla". pRY42 é usado como um vetor alvo para a clonagem das diferentes sequências reguladoras de promotor quimérico tal como definido no presente docu-mento.

[032]A Figura 2 ilustra vetor de expressão pRY57 (SEQ ID NO: 2) codificando as cadeias leve ("LC") e pesada ("HC") do anticorpo monoclonal quimérico de camun-dongo - humano (mAb) cB72.3 (Whittle, N. et al. (1987) Protein Eng. 1, 499-505), cada uma localizada entre os sítios de clonagem 3’ das regiões de "EX2", e os sítios de poliadenilação ("pA"), respectivamente. Caso contrário, pRY57 é idêntico ao pRY42. As sequências de ácidos nucleicos de LC e HC de pRY57 foram removidas e clonadas em pRY42 variantes em que a sequência de promotor precoce de mCMV original foi substituída com as diferentes sequências reguladoras de promotor quimé-rico tal como definidas no presente documento.

[033]A Figura 3 representa esquematicamente a sequência original do promotor de mCMV (SEQ ID NO: 3) englobada no pRY42 (em cima) bem como cinco sequências reguladoras de promotor quimérico diferente (construtos "1 a 5"), como definido no presente documento (SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 11, respectivamente), que compreendem sequências de promotor de CMV de murino (mCMV) localizadas em 3’ da região a montante e/ou elementos potencializadores sendo derivados de CMV de símio (sCMV) e/ou de humano (hCMV). Além disso, duas sequências reguladoras adicionais de promotor quimérico (construtos "6 e 7"), como definido no presente documento (SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13) são mostradas, as quais compreendem as sequências de promotor de hCMV localizadas em 3’ da região a montante e/ou elementos potencializadores sendo derivados de sCMV e/ou hCMV humano. Todas as sequências do promotor de mCMV e de hCMV especificamente empregadas no presente documento incluem na suas extremidades-3' um nucleotídeo gua- nosina adicional ("G"), que representa o sítio de partida de transcrição.

[034]A Figura 4 mostra uma comparação das concentrações de mAb cB72.3 pro-duzido em linhagens de CHO estáveis, onde a expressão do gene das sequências de mAb estava sob o controle dos construtos quiméricos de 1 a 5, como ilustrado na Figura 3. A determinação foi realizada por HPLC de Proteína A depois de 15 dias de crescimento em 50 ml de meio de crescimento na cultura de frasco agitado E250 usando um protocolo de supercrescimento de batelada alimentada (FOG). Para cada um dos construtos quiméricos, n = 4, representando analises de batelada alimentada duplicada para transfecções duplicadas, com a exceção do construto 4, em que n = 6 (analise de FOG duplicada para transfecções triplicadas) e pRY57 (mCMV original), onde n = 8, com pontos de dados dos experimentos 1 e 2 sendo combinados.

[035]A Figura 5 mostra uma comparação das concentrações de mAb cB72.3 pro-duzidos em linhagens de CHO estáveis, onde a expressão do gene das sequências de mAb estava sob o controle dos construtos quiméricos 6 e 7, tal como ilustrado na Figura 3. A determinação foi realizada por HPLC de Proteína A depois de 7 dias de crescimento em 30 ml de meio de crescimento em um frasco de cultura agitadod e E125 usando um protocolo supercrescimento de batelada (BOG). Para mCMV e o construto 7, n = 6 (análise de batelada duplicada para transfections triplicadas), e para a construto 6, n = 4 (análise de batelada duplicada para transfections duplica-das).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[036]A presente invenção baseia-se na verificação inesperada de que os vetores de expressão de mamíferos que compreendem sequências reguladoras de promoto-res quiméricos (isto é, híbridos) sendo compostas por uma sequência de promotor de hCMV ou de mCMV (em particular, uma sequência de promotor IE1 de hCMV ou mCMV) em ligação operável para o sítio de partida de transcrição da sequência de ácidos nucleicos a ser expressa e uma sequência de potencializador e/ou região a motante de hCMV e/ou de sCMV (em particular, uma sequência de potencializador IE1 de hCMV e/ou IE1 de sCMV) sendo localizada a 5’ de, e ligada operativamente à, sequência de promotor de hCMV ou mCMV resultou em uma melhoria significativa das taxas de expressão do gene, em comparação com os sistemas de expressão existentes apenas com base em sequências de promotor de mCMV e, portanto, também com rendimentos muito mais elevados (até um aumento de quase 3 vezes) das proteínas recombinantes produzidas.

[037]Como consequência, os vetores de expressão de mamífero, tais como defi-nidos no presente documento representam ferramentas moleculares superiores para a produção de proteínas recombinantes, particularmente em uma escala industrial.

[038]A presente invenção ilustrativamente descrita a seguir pode ser adequada-mente praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limi-tações, não especificamente aqui divulgados.

[039]Quando o termo "compreendendo" é usado na presente descrição e nas rei-vindicações, ele não exclui outros elementos ou etapas. Para os fins da presente invenção, o termo "consistindo em" é considerado como sendo uma modalidade pre-ferencial do termo "compreendendo". Se a seguir um grupo é definido como com-preendendo, pelo menos, um certo número de modalidades, esta deve também ser entendida para divulgar um grupo, que consiste, de preferência, em apenas uma destas modalidades.

[040]Quando um artigo indefinido ou definido é usado para se referir a um subs-tantivo singular, por exemplo, "um", "uma" ou "o, a", este inclui um plural daquele nome a menos que especificamente indicado de outra forma.

[041]No caso, os valores numéricos são indicados no contexto da presente inven-ção, o versado na técnica entenderá que o efeito técnico do recurso em questão é assegurado dentro de um intervalo de precisão, que compreende tipicamente um desvio do valor numérico dado de ± 10% e, de preferência, de ± 5%.

[042]Além disso, os termos primeiro, segundo, terceiro, (a), (b), (c), e semelhantes, na descrição e nas reivindicações, são usados para distinguir entre elementos semelhantes e não necessariamente para descrever uma ordem sequencial ou cro-nológica. Deve ser entendido que os termos assim usados são intercambiáveis sob circunstâncias apropriadas e que as modalidades da invenção aqui descritas são capazes de operar em sequências diferentes das descritas ou ilustradas no presente documento.

[043]Outras definições de termo serão apresentadas a seguir no contexto dos quais os termos são usados. Os termos ou definições a seguir são fornecidos ape-nas para auxiliar na compreensão da invenção. Estas definições não devem ser in-terpretadas de forma a ter um escopo menor do que o compreendido por uma pessoa com conhecimentos correntes na técnica.

[044]Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor de expressão para a expressão heteróloga de uma sequência de ácidos nucleicos de interesse em células de mamíferos, o vetor compreendendo uma primeira sequência reguladora de promotor quimérico sendo operativamente ligada a uma primeira sequência de ácidos nucleicos a ser expressa, em que a sequência reguladora de promotor quimé-rico compreende:

[045](I) uma sequência de promotor sendo derivada do citomegalovírus de murino ou do citomegalovírus de humano e sendo operativamente ligada ao sítio de partida de transcrição da sequência de ácidos nucleicos a ser expressa; e

[046](ii) uma sequência de potencializador e/ou região a motante sendo derivada de citomegalovírus de humano e/ou de símio, em que a sequência de potencializa- dor e/ou região a montante está localizada 5’ de, e operativamente ligada à, sequên-cia de promotor de humano ou de murino, e em que o sequência reguladora de pro-motor quimérico compreende elementos da sequência sendo derivados a partir de pelo menos dois do grupo que consiste em citomegalovírus de murino, citomegaloví- rus de humano e citomegalovírus de símio

[047]Em outras palavras, a provisão de que a sequência reguladora de promotor quimérico, tal como aqui definida, compreende elementos de sequência sendo deri-vados a partir de pelo menos dois do grupo que consiste em citomegalovírus de mu- rino, citomegalovírus de humano e citomegalovírus de símio assegura que a matéria em questão reivindicada não inclui quaisquer construtos apenas derivados de cito- megalovírus de humano.

[048]O termo "vetor de expressão", tal como usado no presente documento, de-signa um veículo de ácido nucleico (plasmídeo) que é caracterizado pela presença de pelo menos um "cassete de expressão". O termo "cassete de expressão", tal como usado no presente documento, refere-se a um construto genético que é capaz de permitir a expressão de genes de uma sequência de ácidos nucleicos de interesse (ou seja, uma sequência "heteróloga" de ácidos nucleicos). Isto requer que tal cassete de expressão compreenda elementos de sequências reguladoras que con-tenham informações sobre a regulação da transcrição e/ou tradução, e que tais se- quências reguladoras estejam "operativamente ligadas" à sequência de ácidos nu- cleicos de interesse. Uma ligação operacional é uma ligação em que os elementos das sequências reguladoras e das sequência de ácidos nucleicos a serem expres-sos estão conectados de um modo que permita a expressão do gene.

[049]A natureza precisa das regiões reguladoras de um "cassete de expressão" que são necessárias para controlar e dirigir a expressão do gene pode variar entre espécies, mas, em geral, estas regiões reguladoras compreendem sequências de promotor (ou seja, uma região da sequência localizada a 5’ (a "jusante") da sequên-cia de ácidos nucleicos de interesse) e as sequências reguladoras não traduzida 3’ (ou seja, uma região da sequência localizada a 3' ("a jusante") da sequência de áci-dos nucleicos de interesse).

[050]O termo "promotor", (também referido como "promotor do núcleo") tal como usado no presente documento, indica elementos de sequência que por si sós diri-gem a iniciação da transcrição (por exemplo, sítios de ligação para fatores de trans-crição e polimerase de DNA dependente de RNA, TATA box, sequências de CAAT, e elementos nivelamento 5'). Contanto que esta funcionalidade de promover a inicia-ção da transcrição seja retida ou substancialmente retida (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% da atividade do tipo selvagem, isto é, a atividade de uma sequência de comprimento completo), quais-quer variantes truncadas, mutadas ou, de outra forma, modificadas de uma sequên-cia de promotor de tipo selvagem (de ocorrência natural) estão também dentro da definição acima. Tal como usado no presente documento, o termo " promotor de nú-cleo" refere-se a uma sequência de comprimento mínimo que retém a atividade do promotor. Tal como usado no presente documento, a sequência de promotor está operativamente ligada ao sítio de partida de transcrição da sequência de ácidos nu- cleicos a ser expressa.

[051]Em modalidades particulares, os vetores de expressão da presente invenção compreendem (como parte de um cassete de expressão) uma primeira sequência reguladora de promotor (quimérico) (ou seja, pelo menos, uma tal sequência), a qual, por sua vez, engloba uma sequência de promotor (núcleo) sendo derivada de citomegalovírus de murino (mCMV). Esta sequência de promotor de mCMV está ligada operativamente ao sítio de partida de transcrição de uma primeira sequência de ácidos nucleicos a ser expressa. Geralmente, qualquer sequência de promotor de mCMV pode ser usada. De preferência, as sequências de promotores de genes precoces imediatos (IE) de mCMV, tais como IE1 de mCMV e IE2 de mCMV (Dorsch- Hasler, K. et al (1985) Proc Natl Acad Sci EUA 82, 8325-8329;.Messerle, M. et al. (1991) J. Virol. 65, 1638-1643), são empregadas, com o promotor IE1 de mCMV sendo particularmente preferencial.

[052]Estes e outros promotores de mCMV são bem conhecidos na técnica e po-dem ser facilmente derivados a partir do genoma de mCMV depositado no banco de dados de Genomas Virais NCBI sob o n°. de acessão U68299.1 (http: //www.ncbi.nlm.nih.qov/qenomes/GenomesHome; Bao, Y. et al. (2004) J. Virol 78, 7291 -7298.).

[053]Em uma modalidade específica da presente invenção, a sequência de pro-motor IE1 de mCMV compreendida no vetor de expressão tem uma sequência de ácidos nucleicos de 492 pb de comprimento, como mostrado na SEQ ID NO: 3: 1 tactgagtca ttagggactt tccaatgggt tttgcccagt acataaggtc 51 aataggggtg aatcaacagg aaagtcccat tggagccaag tacactgagt 101 caatagggac tttccattgg gttttgccca gtacaaaagg tcaatagggg 151 gtgagtcaat gggtttttcc cattattggc acgtacataa ggtcaatagg 201 ggtgagtcat tgggtttttc cagccaattt aattaaaacg ccatgtactt 251 tcccaccatt gacgtcaatg ggctattgaa actaatgcaa cgtgaccttt 301 aaacggtact ttcccatagc tgattaatgg gaaagtaccg ttctcgagcc 351 aatacacgtc aatgggaagt gaaagggcag ccaaaacgta acaccgcccc 401 ggttttcccc tggaaattcc atattggcac gcattctatt ggctgagctg 451 cgttctacgt gggtataaga ggcgcgacca gcgtcggtac cg

[054]Em uma modalidade preferencial, a sequência de promotor IE1 de mCMV compreendido no vetor de expressão tem uma sequência de ácidos nucleicos de 102 pb de comprimento (também referida como "promotor de núcleo") como mostrado na SEQ ID NO: 4: 1 acaccgcccc ggttttcccc tggaaattcc atattggcac gcattctatt 51 ggctgagctg cgttctacgt gggtataaga ggcgcgacca gcgtcggtac 101 cg

[055]Ambas as SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 incluem em suas respectivas ex-tremidades 3' um nucleotídeo de guanosina ("G") adicional, que representa o sítio de partida de transcrição.

[056]Em outras modalidades particulares, os vetores de expressão da presente invenção compreendem (como parte de um cassete de expressão) uma primeira sequência reguladora de promotor (quimérico) (ou seja, pelo menos, uma tal se-quência), que, por sua vez, engloba uma sequência de promotor (núcleo) sendo de-rivada de citomegalovírus de humano (hCMV). Esta sequência de promotor de hCMV está ligada operativamente ao sítio de partida de transcrição de uma primeira sequência de ácidos nucleicos a ser expressa. Geralmente, qualquer sequência de promotor de hCMV pode ser empregue. De preferência, as sequências de promotor de genes precoces imediatos (IE) de hCMV, tais como IE1 de hCMV e IE2 de hCMV (You, C.Y. et al (1992) Intervirology 34, 94-104; Klucher, K.M. et al. (1993) Mol Cell Biol. 13., 1238-1250), são empregadas, com o promotor IE1 de hCMV sendo particu-larmente preferencial.

[057]Estes e outros promotores de hCMV são bem conhecidos na técnica e po-dem ser facilmente derivados a partir do genoma de hCMV depositado no banco de dados de Genomas Virais NCBI sob o n°. de acessão. NC_006273 (http: //www.ncbi.nlm.nih.qov/qenomes/GenomesHome; supra).

[058]Em uma modalidade preferencial, a sequência de promotor IE1 de hCMV compreendida no vetor de expressão tem uma sequência de ácidos nucleicos de 117 pb de comprimento (também referida como "promotor de núcleo") como mostrado na SEQ ID NO: 5: 1 gcaccaaaat caaegggact ttccaaaatg tegtaacaac tccgccccat 51 tgacgcaaat gggeggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga 101 gctcgtttag tgaaccg

[059]A SEQ ID NO: 5 inclui, na sua extremidade 3’ um nucleotídeo de guanosina (“G”) adicional, que representa o sítio de partida de transcrição.

[060]Além disso, as sequências reguladoras do promotor de um cassete de ex-pressão compreendem geralmente uma sequência de "potencializador". O termo "potencializador", tal como usado no presente documento, indica elementos de se-quência que aumentam, melhoram ou aprimoram a transcrição de uma sequência de ácidos nucleicos, independentemente da sua localização e orientação em relação à sequência de ácidos nucleicos a ser expressa. Um potencializador pode potenciali-zar a transcrição de um único promotor ou simultaneamente a partir de mais do que um promotor. Contanto que esta funcionalidade de melhorar a transcrição seja retida ou substancialmente retida (por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% da atividade do tipo selvagem, isto é, atividade de uma sequência de comprimento completo), quaisquer variantes truncadas, mutadas ou, de outra forma, modificadas de uma sequência de potencializador (de ocorrência natural) do tipo selvagem também estão dentro da definição acima.

[061]Os vetores de expressão da presente invenção compreendem (como parte de um cassete de expressão) na sua respectiva primeira sequência reguladora de promotor (quimérico), uma região a montante (sequência) e/ou sequência de poten- cializador sendo derivada de citomegalovírus de humano (hCMV) e/ou citomegaloví- rus de símio (sCMV). Em outras palavras, a sequência reguladora de promotor pode compreender uma sequência de potencializador e/ou região a motante sendo exclu-sivamente derivads de hCMV ou uma sequência de potencializador e/ou região a motante sendo exclusivamente derivads de sCMV ou uma sequência de potenciali- zador e/ou região a motante quimérica composta por sequências derivadas de hCMV e sCMV. Dentro da sequência reguladora do promotor, as sequências de po- tencializador e/ou da região a montante estão localizadas a 5’ (isto é, "a montante") das sequências de promotor de mCMV e hCMV (núcleo) e estão em ligação operá- vel com a sequência de promotor de humano ou de murino. Tipicamente, as se-quências de potencializador são dispostas na mesma orientação que as sequências de promotor. No entanto, em modalidades específicas, as sequências de potenciali- zador e/ou da região a montante estão dispostas em orientação inversa em relação às sequências de promotor.

[062]Geralmente, quaisquer sequências de hCMV e/ou sCMV podem ser empre-gues como a sequência de potencializador e/ou região a motante. De preferência, as sequências dos genes precoces imediatos (IE) de sCMV e/ou hCMV, como IE1 de hCMV, IE2 de hCMV, IE1 de sCMV e IE2 de sCMV (Meier, J.L. e Stinski, M.F. (1996) Intervirology 39, 331 -342; Kim, G.Y. et al. (2011) Biotechnol. Lett. 33, 1319-1326), são empregados, com as sequências de potencializador IE1 de hCMV e/ou sCMV sendo particularmente preferenciais.

[063]Assim, os vetores de expressão da presente invenção compreendem uma primeira sequência reguladora de promotor que é quimérica pelo fato de que com-preende sequências de promotor de mCMV ou sequências de promotor de hCMV em combinação com sequências de potencializador e/ou região a montante de hCMV e/ou sCMV. Em modalidades particulares, a sequência de promotor é derivada a partir do promotor IE1 de mCMV; e/ou a sequência de potencializador e/ou região a montante é derivada do potencializador IE1 de hCMV e/ou sCMV. Em outras modalidades particulares, a sequência de promotor é derivada do promotor IE1 de mCMV; e/ou a sequência de potencializador e/ou região a montante é derivada do potencializador IE2 de hCMV e/ou sCMV. Em ainda outras modalidades particulares, a sequência de promotor é derivada a partir do promotor IE1 de hCMV; e/ou a se-quência de potencializador e/ou região a montante é derivada do potencializador IE1 de hCMV e/ou sCMV. Em ainda outras modalidades particulares, a sequência de promotor é derivada a partir do promotor IE2 de hCMV; e/ou a sequência de poten- cializador e/ou região a montante é derivada do potencializador IE2 de hCMV e/ou sCMV.

[064]Estas e outras sequências de hCMV e/ou sCMV são bem conhecidas na técnica e podem ser facilmente derivadas a partir dos genomas de hCMV e sCMV depositados no banco de dados de Genomas Virais de NCBI sob os n°s. de acessão X17403.1 e U38308.1, respectivamente

[065]Em outras modalidades preferenciais, a sequência da região a montante compreende a sequência de nucleotídeos de 452 pb de comprimento, como mostra-do na SEQ ID NO: 6, sendo derivada da região do potencializador IE1 de sCMV. 1 gaccatagcc aattcaatat ggcgtatatg gactcatgcc aattcaatat 51 ggtggatctg gacctgtgcc aattcaatat ggcgtatatg gactcgtgcc 101 aattcaatat ggtggatctg gaccccagcc aattcaatat ggcggacttg 151 gcaccatgcc aattcaatat ggcggacctg gcactgtgcc aactggggag 201 gggtctactt ggcacggtgc caagtttgag gaggggtctt ggccctgtgc 251 caagtccgcc atattgaatt ggcatggtgc caataatggc ggccatattg 301 gctatatgcc aggatcaata tataggcaat atccaatatg gccctatgcc 351 aatatggcta ttggccaggt teaatactat gtattggccc tatgecatat 401 agtattccat atatgggttt tectattgac gtagatagee cctcccaatg 451 gg

[066]Em algumas destas modalidades preferenciais, a sequência de ácidos nu- cleicos de SEQ ID NO: 6 é uma parte integral de um elemento de sequência mais longa sendo derivado da região de IE1 de sCMV (cf., por exemplo, SEQ ID NO: 11). Em algumas outras dessas modalidades preferenciais, o elemento da sequência sendo derivado da região de IE1 de sCMV tem a sequência de SEQ ID NO: 6, que está presente em combinação com um elemento de sequência adicional sendo derivado da região de IE1 de hCMV (cf., por exemplo, SEQ ID NO: 10).

[067]Em modalidades particularmente preferenciais, a sequência reguladora de promotor quimérico compreende uma sequência de nucleotídeos que é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, e SEQ ID NO: 13.

[068]A sequência reguladora do promotor quimérico de acordo com a SEQ ID NO: 7 (aqui também referida como "construto 1") tem um comprimento completo de 1074 pb e é composta de um 582 bp da sequência de potencializador IE1 de mCMV e a montante de IE1 de hCMV (mostrada em itálico) e 492 pb da sequência de promotor IE1 de mCMV (também mostrada como SEQ ID NO: 3). 1 ctgcagtgaa taataaaatg tgtgtttgtc cgaaatacgc gttttgagat 51 ttctgtcgcc gactaaattc atgtcgcgcg atagtggtgt ttatcgccga 101 tagagatggc gatattggaa aaatcgatat ttgaaaatat ggcatattga 151 aaatgtcgcc gatgtgagtt tctgtgtaac tgatatcgcc atttttccaa 201 aagtgatttt tgggcatacg cgatatctgg cgatagcgct tatatcgttt 251 acgggggatg gcgatagacg actttggtga cttgggcgat tctgtgtgtc 301 gcaaatatcg cagtttcgat ataggtgaca gacgatatga ggctatatcg 351 ccgatagagg cgacatcaag ctggcacatg gccaatgcat atcgatctat 401 acattgaatc aatattggcc attagccata ttattcattg gttatatagc 451 ataaatcaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat ccatatcata 501 atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa cattaccgcc atgttgacat 551 tgattattga ctagttatta atagtaatca attactgagt cattagggac 601 tttccaatgg gttttgccca gtacataagg tcaatagggg tgaatcaaca 1 651 ggaaagtccc attggagcca agtacactga gtcaataggg actttccatt 701 gggttttgcc cagtacaaaa ggtcaatagg gggtgagtca atgggttttt 751 cccattattg gcacgtacat aaggtcaata ggggtgagtc attgggtttt 801 tccagccaat ttaattaaaa cgccatgtac tttcccacca ttgacgtcaa 851 tgggctattg aaactaatgc aacgtgacct ttaaacggta ctttcccata 901 gctgattaat gggaaagtac cgttctcgag ccaatacacg tcaatgggaa 951 gtgaaagggc agccaaaacg taacaccgcc ccggttttcc cctggaaatt 1001 ccatattggc acgcattcta ttggctgagc tgcgttctac gtgggtataa 1051 gaggcgcgac cagcgtcggt accg

[069]A sequência reguladora do promotor quimérico de acordo com a SEQ ID NO: 8 (aqui também referida como "construto 2") tem um comprimento completo de 1128 pb e é composta de uma sequência de 1026 pb incluindo a sequência a montante de IE1 de hCMV e sequência de potencializador IE1 de hCMV (mostrada em itálico) e uma sequência de promotor de "núcleo" IE1 de mCMV de 102 pb (também mostrada como SEQ ID NO: 4) 1 ctgcagtgaa taataaaatg tgtgtttgtc cgaaatacgc gttttgagat 51 ttctgtcgcc gactaaattc atgtcgcgcg atagtggtgt ttatcgccga 101 tagagatggc gatattggaa aaatcgatat ttgaaaatat ggcatattga 151 aaatgtcgcc gatgtgagtt tctgtgtaac tgatatcgcc atttttccaa 201 aagtgatttt tgggcatacg cgatatctgg cgatagcgct tatatcgttt 251 acgggggatg gcgatagacg actttggtga cttgggcgat tctgtgtgtc 301 gcaaatatcg cagtttcgat ataggtgaca gacgatatga ggctatatcg 351 ccgatagagg cgacatcaag ctggcacatg gccaatgcat atcgatctat 401 acattgaatc aatattggcc attagccata ttattcattg gttatatagc 451 ataaatcaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat ccatatcata 501 atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa cattaccgcc atgttgacat 551 tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca 601 tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc 651 ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 701 gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 751 gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 801 caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat 851 tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta 901 cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca 951 atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc 1001 attgacgtca atgggagttt gttttgacac cgccccggtt ttcccctgga 1051 aattccatat tggcacgcat tctattggct gagctgcgtt ctacgtgggt 1101 ataagaggcg cgaccagcgt cggtaccg

[070]A sequência reguladora do promotor quimérico de acordo com a SEQ ID NO: 9 (aqui também referida como "construto 3") tem um comprimento completo de 509 pb e é composta de uma sequência de potencializador IE1 de hCMV de 407 bp (mostrada em itálico) e uma sequência de promotor de "núcleo" IE1 de mCMV de 102 pb (também mostrada como SEQ ID NO: 4). 1 cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 51 cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 101 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc 151 cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga 201 cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct 251 tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 301 accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt 351 tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt 401 tgttttgaca ccgccccggt tttcccctgg aaattccata ttggcacgca 451 ttctattggc tgagctgcgt tctacgtggg tataagaggc gcgaccagcg 501 tcggtaccg

[071]A sequência reguladora do promotor quimérico de acordo com a SEQ ID NO: 10 (aqui também referida como "construto 4") tem um comprimento completo de 961 pb e é composta por uma sequência a montante de IE1 de sCMV de 452 pb (mostrada em negrito; SEQ ID NO: 6), uma sequência de potencializador IE1 de hCMV de 407 pb (mostrada em itálico) e uma sequência de promotor de “núcleo” IE1 de mCMV de 102 pb (também mostrada como SEQ ID NO: 4). 1 gaccatagcc aattcaatat ggcgtatatg gactcatgcc aattcaatat 51 ggtggatctg gacctgtgcc aattcaatat ggcgtatatg gactcgtgcc 101 aattcaatat ggtggatctg gaccccagcc aattcaatat ggcggacttg 151 gcaccatgcc aattcaatat ggcggacctg gcactgtgcc aactggggag 201 gggtctactt ggcacggtgc caagtttgag gaggggtctt ggccctgtgc 251 caagtccgcc atattgaatt ggcatggtgc caataatggc ggccatattg 301 gctatatgcc aggatcaata tataggcaat atccaatatg gccctatgcc 351 aatatggcta ttggccaggt tcaatactat gtattggccc tatgccatat 401 agtattccat atatgggttt tcctattgac gtagatagcc cctcccaatg 451 ggcgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac 501 gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc 551 aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg 601 cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 651 gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 701 cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 751 ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg 801 tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag 851 tttgttttga. caccgccccg gttttcccct ggaaattcca tattggcacg 901 cattctattg gctgagctgc gttctacgtg ggtataagag gcgcgaccag 951 cgtcggtacc g

[072]A sequência reguladora do promotor quimérico de acordo com a SEQ ID NO: 11 (aqui também referida como "construto 5") tem um comprimento completo de 909 bp e é composta de uma sequência de 807 pb incluindo elementos da região a montante de IE1 de sCMV e a sequência de potencializador IE1 de sCMV (mostrada em negrito; SEQ ID NO: 6 sendo sublinhada) e uma sequência de promotor de “nú-cleo” IE1 de mCMV de 102 pb (mostrada como SEQ ID NO: 4). 1 gaccatagcc aattcaatat ggcgtatatg gactcatgcc aattcaatat 51 ggtggatctg gacctgtgcc aattcaatat ggcgtatatg gactcgtgcc 101 aattcaatat ggtggatctg gaccccagcc aattcaatat ggcggacttg 151 gcaccatgcc aattcaatat ggcggacctg gcactgtgcc aactggggag 201 gggtctactt ggcacggtgc caagtttgag gaggggtctt ggccctgtgc 251 caagtccgcc atattgaatt ggcatggtgc caataatggc ggccatattg 301 gctatatgcc aggatcaata tataggcaat atccaatatg gccctatgcc 351 aatatggcta ttggccaggt tcaatactat gtattggccc tatgccatat 401 agtattccat atatgggttt tcctattgac gtagatagcc cctcccaatg 451 ggcggtccca tataccatat atggggcttc ctaataccgc ccatagccac 501 tcccccattg acgtcaatgg tctctatata tggtctttcc tattgacgtc 551 atatgggcgg tcctattgac gtatatggcg cctcccccat tgacgtcaat 601 tacggtaaat ggcccgcctg gctcaatgcc cattgacgtc aataggacca 651 cccaccattg acgtcaatgg gatggctcat tgcccattca tatccgttct 701 cacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccact tggcagtaca 751 tcaatatcta ttaatagtaa cttggcaagt acattactat tggaagtacg 801 ccagggtaca ccgccccggt tttcccctgg aaattccata ttggcacgca 851 ttctattggc tgagctgcgt tctacgtggg tataagaggc gcgaccagcg 901 tcggtaccg

[073]A sequência reguladora do promotor quimérico de acordo com a SEQ ID NO: 12 (aqui também referida como "construto 6") tem um comprimento completo de 976 bp e é composta por uma região a montante de IE1 de sCMV de 452 pb (mostrada em negrito), uma sequência de potencializador IE1 de hCMV de 407 pb (mostrada em itálico), e uma sequência de promotor de "núcleo" de hCMV de 117 pb (mostrada como SEQ ID NO: 5). 1 gaccatagcc aattcaatat ggcgtatatg gactcatgcc aattcaatat 51 ggtggatctg gacctgtgcc aattcaatat ggcgtatatg gactcgtgcc 101 aattcaatat ggtggatctg gaccccagcc aattcaatat ggcggacttg 151 gcaccatgcc aattcaatat ggcggacctg gcactgtgcc aactggggag 201 gggtctactt ggcacggtgc caagtttgag gaggggtctt ggccctgtgc 251 caagtccgcc atattgaatt ggcatggtgc caataatggc ggccatattg 301 gctatatgcc aggatcaata tataggcaat atccaatatg gccctatgcc 351 aatatggcta ttggccaggt tcaatactat gtattggccc tatgccatat 401 agtattccat atatgggttt tcctattgac gtagatagcc cctcccaatg 451 ggcgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac 501 gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc 551 aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg 601 cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 651 gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 701 cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 751 ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg 801 tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag 851 tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact 901 ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat 951 ataagcagag ctcgtttagt gaaccg

[074]A sequência reguladora do promotor quimérico de acordo com a SEQ ID NO: 13 (aqui também referida como "construto 7") tem um comprimento completo de 924 bp e é composta por uma sequência de potencializador e região a montante de IE1 de sCMV de 807 pb (mostrada em negrito; a porção também incluída no "cons- truto 4" sendo sublinhada) e um promotor de “núcleo” de hCMV de 117 pb (mostrada como SEQ ID NO: 5). 1 gaccatagcc aattcaatat ggcgtatatg gactcatgcc aattcaatat 51 ggtggatctg gacctgtgcc aattcaatat ggcgtatatg gactcgtgcc 101 aattcaatat ggtggatctg gaccccagcc aattcaatat ggcggacttg 151 gcaccatgcc aattcaatat ggcggacctg gcactgtgcc aactggggag 201 gggtctactt ggcacggtgc caagtttgag gaggggtctt ggccctgtgc 251 caagtccgcc atattgaatt ggcatggtgc caataatggc ggccatattg 301 gctatatgcc aggatcaata tataggcaat atccaatatg gccctatgcc 351 aatatggcta ttggccaggt tcaatactat gtattggccc tatgccatat 401 agtattccat atatgggttt tcctattgac gtagatagcc cctcccaatg 451 ggcggtccca tataccatat atggggcttc ctaataccgc ccatagccac 501 tcccccattg acgtcaatgg tctctatata tggtctttcc tattgacgtc 551 atatgggcgg tcctattgac gtatatggcg cctcccccat tgacgtcaat 601 tacggtaaat ggcccgcctg gctcaatgcc cattgacgtc aataggacca 651 cccaccattg acgtcaatgg gatggctcat tgcccattca tatccgttct 701 cacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccact tggcagtaca 751 tcaatatcta ttaatagtaa cttggcaagt acattactat tggaagtacg 801 ccagggtgca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc 851 gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat 901 aagcagagct cgtttagtga accg

[075]Em modalidades específicas, a sequência reguladora de promotor quimérico é composta por uma sequência de potencializador e/ou região a montante de IE2 de hCMV e/ou sCMV e uma sequência de promotor IE2 de mCMV. Em outras modali-dades específicas, a sequência reguladora de promotor quimérico é composta por uma sequência de potencializador e/ou região a montante de IE2 de hCMV e/ou sCMV e uma sequência de promotor IE2 de hCMV. Em ainda outras modalidades específicas, a sequência reguladora de promotor quimérico é composta por uma se-quência de potencializador e/ou região a montante de IE1 de hCMV e/ou sCMV e uma sequência de promotor IE2 de mCMV. Em ainda outras modalidades específi-cas, a sequência reguladora de promotor quimérico é composta por uma sequência de potencializador e/ou região a montante de IE1 de hCMV e/ou sCMV e uma se-quência de promotor IE2 de hCMV. Em ainda outras modalidades específicas, a se- quência reguladora de promotor quimérico é composta por uma sequência de poten- cializador e/ou região a montante de IE2 de hCMV e/ou sCMV e uma sequência de promotor IE1 de mCMV. Em ainda outras modalidades específicas, a sequência re-guladora de promotor quimérico é composta por uma sequência de potencializador e/ou região a montante de IE2 de hCMV e/ou sCMV e uma sequência de promotor IE1 de hCMV.

[076]As sequências reguladoras 3’ de um "cassete de expressão", tal como defi-nido no presente documento tipicamente englobam elementos de regulação envolvi-dos na terminação da transcrição, poliadenilação, ou semelhantes. Se, no entanto, essas sequências de terminação não são funcionalmente satisfatórias em uma célu-la hospedeira particular, então elas podem ser substituídas com sinais funcionais na célula.

[077]Elementos de regulação adicionais compreendidos em um tal "cassete de expressão" incluem, inter alia, sítios de entrada de ribossoma (IRES; permitindo a expressão de sequências de ácidos nucleicos "policistrônicas"), bem como sequên-cias de sinal raduzidas para o direcionamento do polipeptídeo nativo para um com-partimento específico de uma célula hospedeira. Exemplos de sequências sinaliza-doras adequadas para células de CHO são divulgados, por exemplo, no documento WO 2008/148519 A2. O versado na técnica também está bem ciente de todos estes elementos reguladores e como selecionar tais elementos adequados para a expres-são de uma sequência de ácidos nucleicos em um ambiente celular particular.

[078]O vetor de expressão da presente invenção pode ser, por exemplo, um plasmídeo, cosmídeo, fagemídeo, cromossoma artificial, ou outro veículo comumen- te usado em engenharia genética.

[079]Tais vetores de expressão incluem, tipicamente, além de um ou mais "cas-setes de expressão" que englobam as sequências reguladoras descritas acima, um ou mais sítios de clonagem múltipla, a fim de facilitar a inserção e/ou remoção de sequências de ácidos nucleicos. Os sítios de clonagem múltipla podem ser localiza-dos a montante e a jusante dos cassetes de expressão descritos acima, permitindo, assim, a substituição de todo o cassete. Os sítios de clonagem múltipla também po-dem ser localizados dentro de tal cassete de expressão a jusante das sequências reguladoras de promotor e a montante das sequências reguladoras 3', permitindo, assim, a inserção ou a substituição de uma sequência de ácidos nucleicos a ser ex-pressa. Para as transfecções estáveis (cf. abaixo), os vetores de expressão podem ainda compreender sequências de reconhecimento para integrases ou recombina-ses sitio específicas, a fim de facilitar a recombinação e integração estável no geno- ma da célula hospedeira.

[080]Além disso, os vetores de expressão como definido no presente documento tipicamente compreendem pelo menos uma origem de replicação, bem como se-quências de controle derivadas de uma espécie compatível com a célula hospedeira usada, a fim de assegurar a replicação autônoma/ manutenção epissomal do vetor de expressão (em particular, para uso em transfecções transientes; cf. abaixo). Exemplos de origens de replicação em mamíferos incluem a origem de replicação de EBV e/ou SV40. Os vetores de expressão projetados especificamente (isto é, vetores “shuttle”), compreendendo mais de uma origem de replicação permitem o vaivém entre os diferentes hospedeiros, tais como entre bactérias e células de animais. Ori-gens de replicação adequadas para as células procarióticas incluem, por exemplo, as origens de replicação de ColE1 e M13.

[081]Além disso, um vetor de expressão como definido no presente documento, pode compreender um ou mais marcadores de seleção que conferem um fenótipo selecionável em células transfectadas. Os marcadores de seleção adequados inclu-em, inter alia, o gene de higromicina B fosfatase, o gene da timidina cinase, o gene da ornitina descarboxilase, o gene da di-hidrofolato redutase, e o gene de glutamina sintetase. De preferência, o gene da glutamina sintetase (GS) é usado (Cockett, D.K. et al. (1990) Bio/Technology 8, 662-667; Bebbington, C.R. et al. (1992) Bio/Technology 10:169-175;).

[082]Numerosos métodos que podem ser usados para criar e/ou modificar vetores de expressão recombinantes estão bem estabelecidos na técnica (ver, por exemplo, Sambrook, J. e Russel, D.W. (2001), Molecular cloning:. A laboratory manual (3- Ed) Cold Spring Harbor, Nova Iorque, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, Hoboken, NJ, EUA). Um grande número de vetores de expressão de mamíferos adequados também estão disponíveis comercialmente e bem conhecidos para o versado na técnica que também é capaz de determinar quais os vetores são adequados para a expressão de uma molécula de ácido nucleico de interesse em uma dada configuração. Exemplos de tais vetores incluem, inter alia, pcDNA3, pFRT, pTAR- GET, pSV2- dhfr, bem como derivados dos vetores pRY42 (SEQ ID NO: 1) e pRY57 (SEQ ID NO: 2) aqui descritos abaixo.

[083]As sequências de ácidos nucleicos a serem expressas através do uso dos vetores de expressão da invenção podem ser monocistrônicas (ou seja, codificam um único polipeptídeo ou proteína, incluindo proteínas de fusão) ou policistrônicas (ou seja, codificam dois ou mais polipeptídeos ou proteínas individuais).

[084]Em modalidades específicas, o vetor de expressão compreende uma única (isto é, em primeira) sequência reguladora de promotor quimérico sendo operativa-mente ligada a uma (primeira) sequência de ácidos nucleicos a ser expressa.

[085]Em outras modalidades particulares, o vetor de expressão compreende ainda uma segunda sequência reguladora de promotor quimérico sendo operativamente ligada a uma segunda sequência de ácidos nucleicos a ser expressa, em que a segunda sequência reguladora de promotor quimérico é idêntica à primeira sequên-cia reguladora de promotor quimérico. Por exemplo, as primeira e segunda sequên-cias reguladoras de promotor quimérico são compostas de uma sequência de poten- cializador e/ou região a montante de IE1 de hCMV/sCMV em combinação com uma sequência de promotor IE1 de mCMV ou IE1 de hCMV.

[086]Em modalidades particulares alternativas, o vetor de expressão compreende ainda uma segunda sequência reguladora de promotor quimérico sendo operativa-mente ligada a uma segunda sequência de ácidos nucleicos a ser expressa, em que a segunda sequência reguladora de promotor quimérico é diferente da primeira se-quência reguladora de promotor quimérico. Por exemplo, a primeira sequência regu-ladora de promotor quimérico é composta por uma sequência de potencializador/ou região a montante de IE2 de hCMV e/ou sCMV e uma sequência de promotor IE2 de hCMV e IE2 de mCMV, ao passo que a segunda sequência reguladora de promotor quimérico é composta por uma sequência de potencializador e/ou região a montante de IE1 de hCMV e/ou sCMV e uma sequência de promotor IE1 de hCMV ou IE1 de mCMV.

[087]Em modalidades específicas, o vetor de expressão compreende uma terceira sequência reguladora de promotor quimérico sendo operativamente ligada a uma terceira sequência de ácidos nucleicos a ser expressa, em que a terceira sequência reguladora de promotor quimérico pode ser idêntica à primeira e/ou segunda se-quência reguladora de promotor ou pode ser diferente de ambas as primeira e se-gunda sequências reguladoras de promotor quimérico. Em outras modalidades es-pecíficas, o vetor de expressão compreende mais de três sequências reguladoras de promotor quimérico.

[088]As sequências de ácidos nucleicos a serem expressas através do uso de ve-tores de expressão da presente invenção podem codificar quaisquer polipeptídeos ou proteínas de interesse, em particular, os polipeptídeos ou proteínas tendo aplica-bilidade de diagnóstico ou terapêutica, tais como, inter alia, fatores de crescimento, citocinas (interferons, interleucinas), hormônios, receptores de tirosinas cinases, (GPCRs), integrinas, fatores de transcrição, fatores de coagulação do sangue, anti- corpos de cadeia simples, fragmentos de anticorpos ou moléculas semelhantes a anticorpos (anticalinas), e semelhantes.

[089]No caso de vetores de expressão como definido no presente documento que compreendem duas sequências reguladoras de promotor quimérico (como parte de cassetes de expressão), as primeira e segunda sequências de ácidos nucleicos a serem expressas codificam polipeptídeos diferentes (ou proteínas). Em modalidades específicas, os diferentes polipeptídeos representam subunidades de uma proteína dimérica ou multimérica, tais como, inter alia, moléculas receptoras homoméricas ou heteroméricas, hormônios peptídicos, DNA/RNA-polimerases, hemoglobinas, vaci-nas, e similares.

[090]Em modalidades particularmente preferenciais, a proteína dimérica ou mul- timérica é uma molécula de anticorpo "clássica" que compreende a cadeia leve como a primeira subunidade e a cadeia pesada como a segunda subunidade. A molécula de anticorpo pode ser uma que ocorre naturalmente ou um anticorpo geneticamente modificado, ou um anticorpo de comprimento completo ou uma variante truncada dos mesmos (tais como fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2). Os anticorpos de imunoglobulina IgG são particularmente preferenciais. Dependendo da aplicação específica, as moléculas de anticorpo podem ser quiméricas (por exemplo, de muri- no/humano), humanizadas ou completamente humanas.

[091] Em outras modalidades que utilizam vetores de expressão compreendendo duas sequências reguladoras de promotores quiméricos, a primeira e segunda se-quência de ácidos nucleicos a serem expressas codificam uma "proteína alvo" a ser analisada e uma proteína repórter correspondente (tal como a proteína fluorescente verde, luciferase, fosfatase alcalina, -galactosidase e peroxidase de rábano) para monitoramento, por exemplo, localização celular ou atividade funcional da proteína alvo.

[092]Ao usar duas (ou mais) sequências reguladoras de promotor quimérico apresentando diferentes taxas de expressão do gene, pode ser possível produzir certas razões molares das proteínas de interesse correspondentes.

[093]Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula hospedei-ra de mamífero transfectada com um vetor de expressão como definido no presente documento acima.

[094]As células hospedeiras adequadas incluem qualquer tipo de células de ma-míferos, as células sendo de origem humana ou não humana. As células de mamífero de origem não humana incluem, inter alia, as células derivadas de camundongo, rato, hamster, coelho, gato, cão, porco, vaca, cavalo ou macaco.

[095]As células hospedeiras de mamífero adequadas incluem linhagens de célu-las imortalizadas, tais como células Hela humanas, fibroblastos MRC5, melanoma 983M, HEK293, H9, MCF7, e células Jurkat; células de rim canino MDCK; fibroblas- tos de pulmão de rato cultivados em RF isolados a partir de ratos Sprague-Dawley; NIH3T3 de murino, C127, mastocitoma P815, adenocarcinoma mamário MT1A2, e células L; células COS1 e COS 7 de símio, células QC1-3 de codorna; e células ou linhagens de células de ovário de hamster chinês (CHO).

[096]Em modalidades preferenciais, as células hospedeiras usadas são células de CHO ou linhagens de células de CHO.

[097]As linhagens de células de CHO adequadas incluem, nomeadamente, CHO Kl (Tjio, J.T. e Puck, T.T. (1958) J. Exp. Med.108, 945-955), CHO pro3-, CHO DG44, CHO P12, DUK-B11 dhfr-negativo (Urlaub, G. e Chasin L.A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 77, 4216-4220), e particularmente de CHOK1SV (Lonza Ltd. Basel, Suíça). CHOK1SV é um derivado de CHOK1 adaptado livre de proteínas, em suspensão, usando o sistema de expressão de gene glutamina sintetase (GS): transfectantes positivos foram obtidos em dupla seleção de meio livre de glutamina e metionina sul- foximina.

[098]Todas estas células hospedeiras ou linhagens de células podem ser obtidas a partir de depositários tais como a American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA) ou o Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Brauns-chweig, Alemanha), bem como a partir de vários fornecedores comerciais. Também incluídas na presente invenção estão as células de mamífero primárias, isto é, células obtidas diretamente a partir de um organismo (em qualquer estágio de desenvolvimento incluindo inter alia blastócisto, embriões, estágios de larvas, e adultos). Exemplos de células primárias adequadas compreendem cardiomiócitos, hepatócitos primários, fibroblastos, células neuronais, bem como células tronco. Também incluídas na presente invenção estão as linhagens de células imortalizadas estáveis derivadas de células primárias.

[099]Em algumas modalidades, a célula hospedeira da presente invenção consti-tui uma parte de um organismo multicelular. Em outras palavras, a invenção também se refere a organismos mamíferos transgênicos compreendendo pelo menos uma célula hospedeira, tal como definido no presente documento.

[0100]No escopo da presente invenção, o vetor de expressão introduzido pode ser propagado e mantido na célula hospedeira como uma unidade genética independente (ou seja, epissomalmente) (aqui também referido como "transfecção transitória") ou fragmentos de vetor podem tornar-se integrados de forma estável no genoma da célula hospedeira (aqui também referido como "transfecção estável"). Tal recombi- nação pode ocorrer quer em posições aleatórias do genoma por recombinação não homóloga ou em posições específicas do genoma por recombinação homóloga ou por meio de integrases sítio específicas. De preferência, os fragmentos de vetor (incluindo as sequências de ácidos nucleicos heterólogas para serem expressas) tornam-se integradod no genoma da célula hospedeira como uma única cópia.

[0101]Para introduzir os vetores de expressão como definido no presente docu-mento em uma célula hospedeira de mamífero, qualquer técnica de transfecção que seja apropriada para o tipo de célula particular usada pode ser usada. Numerosos métodos de transfecção são bem conhecidos na técnica, incluindo, inter alia, a ele- troporação, co-precipitação com fosfato de cálcio, transfecção química (por exemplo, ciclodextrina, DEAE-dextrano, polietilenoimina), lipofecção, magnetofecção, e "pisto-la de genes" (ver, por exemplo, Sambrook, J. e Russel, D.W. (2001), supra;. Ausu- bel, F.M. et al (2001), supra).

[0102]Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a expressão heteróloga de uma sequência de ácidos nucleicos de interesse em uma célula hospedeira de mamífero, compreendendo:

[0103](i) transfecção da célula hospedeira de mamífero com um vetor de expressão como definido no presente documento acima; e

[0104](ii) cultivo da célula hospedeira de mamífero transfectada em condições que permitam a expressão da sequência de ácidos nucleicos de interesse.

[0105]Em outras palavras, a presente invenção é também dirigida a um processo para a produção de polipeptídeos ou proteínas recombinantes (ou seja heterólogos) de interesse em células hospedeiras de mamífero a serem transfectadas com um vetor de expressão como definido no presente documento que compreendem as se-quências de ácidos nucleicos correspondentes que codificam os referidos polipeptí- deos ou proteínas. A transfecção pode ser realizada com um único vetor de expres-são ou como uma co-transfecção, com dois ou mais vetores de expressão diferentes.

[0106]Como já foi descrito acima, numerosos métodos estão disponíveis para a transfecção transiente ou estável de célula hospedeira de mamífero. Em modalida-des preferenciais, a transfecção é a transfecção estável, a fim de estabelecer as cé-lulas ou linhagens de células que expressam continuamente as sequências de áci-dos nucleicos heterólogos que codificam os polipeptídeos ou proteínas de interesse.

[0107]Em algumas modalidades, o método compreende ainda a etapa de coleta (e opcionalmente purificação) dos polipeptídeos ou proteínas recombinantes produzi- dos. Dependendo da natureza dos referidos polipeptídeos ou proteínas eles podem tornar-se secretados no sobrenadante da cultura de células, integrados na membra-na da célula hospedeira, ou permanecer no compartimento intracelular.

[0108]Tipicamente, se for usada uma célula hospedeira de mamífero unicelular o versado na técnica pode atentar para uma variedade de condições de cultura de cé-lulas que permite a expressão da sequência de ácidos nucleicos de interesse. Con-venientemente, os polipeptídeos ou proteínas produzidos são coletados (e, opcio-nalmente, purificados) a partir de meio de cultura, lisados ou extratos de células em cultura ou de membranas isoladas (biológicas) através de técnicas estabelecidas, tais como, inter alia, precipitação fracionada com sais ou solventes orgânicos, cro- matografia de troca de íons, cromatografia em gel, cromatografia de exclusão por tamanhos, HPLC, cromatografia de afinidade (ver, por exemplo, Sambrook, J. e Russel, D.W. (2001), supra). No caso, a célula hospedeira é parte de um organismo multicelular, uma fração destas células pode servir como fonte para o isolamento do peptídeo da invenção.

[0109]Meios de cultura e condições apropriados para as células hospedeiras acima descritas são bem conhecidos na técnica (cf., por exemplo, Fresney, R.I. (2000) Cul-ture of Animal Cells. A Manual (4° Ed.) Wiley- Liss, Nova Iorque). Dependendo das exigências específicas de crescimento da célula hospedeira usado, a cultura de células de mamífero pode ser realizada, por exemplo, em meio de RPMI 1640, meio de F12 de Ham, ou DMEM (Meio Eagle Modificado por Dulbecco). Em alternativa, um meio de crescimento com uma concentração de soro reduzida, tal como OptiMEM, pode ser usado. Os meios podem, opcionalmente, ser suplementados com 10% (v/v) de FCS (soro fetal de vitelo), vários fatores de crescimento, aminoácidos, antibióticos e outros meios de cultura de células aditivos especialmente adaptados para as célu-las de CHO são descritos, por exemplo, em EP 0 481 791 B1 e EP 1 525 320 B1. As células hospedeiras de mamífero transfectadas podem ser incubadas a 37°C em 5% de CO2, atmosfera saturada de água. Os respectivos meios de cultura, kits e reagen-tes estão disponíveis comercialmente a partir de vários fornecedores.

[0110]Em um outro aspecto, a presente invenção relaciona-se com o uso de um vetor de expressão, como definido no presente documento anteriormente, para a expressão heteróloga de uma sequência de ácidos nucleicos de interesse em uma célula hospedeira de mamífero. De preferência, a sequência de ácidos nucleicos de interesse pode codificar uma proteína ou polipeptídeo destinado a aplicações de di-agnóstico ou terapêuticas.

[0111]Em modalidades preferenciais, o vetor de expressão é usado para a expres-são simultânea de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos de interesse que são inseridas no vetor de expressão sob o controle de sequências reguladoras de promotor quimérico separadas. Por exemplo, um vetor de expressão pode ser usado para a expressão de um gene de interesse, juntamente com um gene repórter para monitoramento celular direcionado e/ou a funcionalidade do gene de interesse.

[0112]De particular preferência, o vetor de expressão é usado para a expressão simultânea de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos de interesse que codificam subunidades de uma proteína dimérica ou multimérica, por exemplo, cadeias leve e pesada de uma molécula de anticorpo ou subunidades de uma vacina. Ao empregar diferentes sequências reguladoras de promotor quimérico resultando em diferentes taxas de expressão de genes, um vetor de expressão, como definido no presente documento, pode ser usado para a expressão de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos de interesse em uma razão (molar) particular.

[0113]Em uma modalidade específica, os vetores de expressão, tal como definidos no presente documentos, são usados como medicamentos (ou como partes de um medicamento ou partes de um kit) para terapia genética.

[0114]A invenção é ainda descrita pelas figuras e os exemplos seguintes, que são apenas para o propósito de ilustrar modalidades específicas da presente invenção, e não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção de qualquer forma.

EXEMPLOS Lógica:

[0115]Sete sequências reguladoras de promotor quimérico diferentes, tal como es-pecificado nas reivindicações, foram geradas com base nas sequências de genomas de citomegalovírus de murino, de humano e de símio (mCMV, hCMV e sCMV) (ver Tabela 1, Figura 3). Estes construtos foram analisados quanto à sua eficácia no con-trole da expressão de genes heterólogos de cadeias leves e pesadas (HC e LC) de um anticorpo monoclonal em células de ovário de hamster chinês (CHO).

Exemplo 1: Vetor de Construção

[0116]Síntese de genes foi usada para gerar os sete construtos reguladores de promotor quimérico diferentes aqui usados (isto é, construtos "1 - 7"). Os construtos foram fornecidos prontamente para clonagem no vetor alvo "vazio" pRY42 (cf. Figura 1, SEQ ID NO: 1), a fim de substituir os promotores de citomegalovírus original de murino (mCMV) (SEQ ID NO: 3) nele contidos. O vetor pRY42 de origem compreende dois cassetes de expressão, cada um sob o controle de uma sequência reguladora de promotor (originalmente derivada de mCMV).

[0117]Os construtos quiméricos (cf. Tabela 1, Figura 3, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 13) foram sintetizados de modo a incluir sequências de DNA adicionais nas ex-tremidades 5’ e 3' que flanqueiam as sequências reguladoras do promotor, permitin-do, assim, a incorporação de sítios de restrição de endonuclease (isto é, também presentes em pRY42), a fim de facilitar a troca de fragmentos de ácidos nucleicos.

[0118]A Tabela 1 ilustra os diversos elementos de sequência compreendidos nos construtos reguladores do promotor quimérico 1 - 7 aqui usados. São mostrados os respectivos comprimentos e locais genéticos das sequências reguladoras individu-ais, tal como indicado na base de dados de Genomas Virais de NCBI (http: //www.ncbi.nlm.nih.qov/qenomes/GenomesHome:. Bao, Y. et ai (2004 ) J. Virol. 78, 7291 -7298). Notavelmente, todas as sequências de promotor de hCMV ou mCMV aqui usadas incluem, na sua extremidade 3’ um nucleotídeo de guanosina (“G”) adi- cional, que representa o sítio de partida de transcrição.

[0119]Os novos vetores compreendendo construtos quiméricos 1 - 7 foram, cada um, construídos por uma reação de ligação de quatro vias de acordo com o esquema ilustrado na Tabela 2. A sequência reguladora de promotor quimérico para a expressão da sequência de ácidos nucleicos de cadeia leve do anticorpo foi inserida em 3’ (isto é, "a jusante") do sítio FRT mutado (Alvo de reconhecimento de flipase) (F5- mFRT) de pRY42, seguido por um fragmento inter-cadeias e a sequência reguladora de promotor quimérico para a expressão da sequência de ácidos nucleicos de anticorpo de cadeia pesada.

[0120]As reações de ligação foram realizadas com o uso do kit de ligação de DNA rápida (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Os vetores de plasmídeos resultantes foram transformados em células competentes de E. coli DH5, (Invitrogen/Life Technologies GmbH; Darmstadt, Alemanha). As amostras foram plaqueadas em meio agar de Luria-Bertani (LB) suplementado com 50 μg/ml de ampicilina e incubadas de um dia para o outro a 37°C. As colônias únicas foram usadas para inocular frasco de agitação de 500 ml contendo 200 ml de meio LB líquido, mais 50 μg/ml de ampicilina. Os frascos foram incubados de um dia para o outro em uma incubadora com agitação a 37°C, 200 rpm. As culturas resultantes foram usadas para preparação de DNA de plasmídeo com o uso de um kit Nucleobond Maxi (Macherey-Nagel GmbH, Duren, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Os plasmídeos produzidos foram verificados por digestão de restrição de diagnóstico.

[0121]A Tabela 2 mostra o esquema de clonagem para gerar construtos 1- 5 da sequência reguladora de promotor quimérico.

[0122]Em uma etapa subsequente, a LC e HC de anticorpo monoclonal de IgG4 cB72.3 (Whittle, N. et al. (1987) Protein Eng. 1, 499-505) foram clonadas em cada um dos sete vetores compreendendo construtos quiméricos 1 - 7. As sequências de ácidos nucleicos que codificam as cadeias de anticorpos foram obtidas a partir do vetor pRY57 (Figura 2, SEQ ID NO: 2) como os fragmentos de restrição Eco- RI/HindIII (LC) e BamHI/NruI (HC) e clonadas sequencialmente nos vetores para cada construto do promotor, usando as mesmas endonucleases de restrição. Os métodos usados foram como descrito acima. Os vetores de plasmídeos resultantes foram verificados por digestão de restrição de diagnóstico e sequenciação de DNA das regiões promotoras, respectivamente. Exemplo 2: Transfecção e construção de linhagem de células

[0123]Uma linhagem de células derivada da linhagem de células de ovário de hamster chinês adaptada em suspensão CHOK1SV foi usada para todas as experi-ências (Lonza Ltd., Basileia, Suíça). Nesta linhagem de células, os construtos de expressão de ácidos nucleicos, são inseridos em um locus genômico específico da célula hospedeira e em número de cópias definido por meio de um sistema de inte-gração sítio específica (SSI).

[0124]A seleção positiva para a integração é realizada por restauração funcional de um cassete de resistência à higromicina B presente no sítio SSI. A integração do construto de expressão no genoma do hospedeiro também remove uma cópia do gene da timidina quinase, que converte o pró-fármaco ganciclovir em um análogo nucleotídeo fosforilado, tóxico. Assim, a adição de higromicina B e ganciclovir durante a construção da linhagem de células fornece pressões de seleção positivas e negativas, respectivamente, para a integração no locus genômico alvo.

[0125]A linhagem de células hospedeira foi reavivada de frascos criopreservados e sub-cultivados. Toda a cultura de células foi realizada em meio CD-CHO (Invitro- gen/Life Technologies GmbH; Darmstadt, Alemanha). 48 h antes da transfecção, as células foram semeadas em 30 ml de meio CD-CHO, a uma concentração final de 0,3 x 106 células/mL.

[0126]No dia da transfecção, 0,2 x 1107 células foram peletizadas e ressuspensas em 1 ml de CD-CHO antes da co-transfecção com 45 μg de plasmídeo pOG44 (Invi- trogen/Life Technologies GmbH; Darmstadt, Alemanha) e 5 μg de cada vetor alvo (compreendendo construtos quiméricos 1 - 7, respectivamente) foi realizado usando eletroporação em uma cubeta GenePulser da Bio-Rad Xcell de 0,4 cm (pulso único de 300 V/900 F, constante de tempo de 12-16 ms). O plasmídeo pOG44 engloba um cassete de expressão para a recombinase FLP de levedura (flipase) necessária para facilitar a recombinação nos sítios de FRT presentes no locus alvo. Todas as experiências de transfecção foram realizadas pelo menos em duplicata.

[0127]Cada amostra de eletroporação foi transferida para 20 ml de meio CD-CHO em um frasco T75 (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha) e incubada em modo estático a 36,5°C, em uma incubadora umidificada (5% (v/v) CO2 em ar). 48 h após a transfecção, as células foram peletizadas (150 x g, 5 min) e ressuspensas em 20 ml de meio CD-CHO contendo 200 μg/ml de higromicina B (seleção positiva). A cultura foi mantida em modo estático e, após 72 h, o meio foi trocado com CD-CHO recém- preparado contendo 200 μg/ml de higromicina B.

[0128]Subsequentemente, a cada 72 h a concentração de células viáveis foi de-terminada e o meio trocado com 20 ml de CD-CHO recém preparado contendo 200 μg/ml de higromicina B e 3 de ganciclovir (seleção negativa). Uma vez que a cultura no frasco T75 atingiu uma concentração celular total de 9 x 106 células/ml, a cultura foi ajustada para um volume final de 30 ml de CD-CHO contendo 200 μg/ml de higromicina B e 3 de ganciclovir. Cada cultura diluída foi então transferida para um frasco de agitação E125. Exemplo 3: Cultura de suspensão de supercrescimento em batelata alimentada (FOG) para a determinação da concentração do anticorpo monoclonal produzido usando os "construtos de promotor 1 - 5"

[0129]A análise dos fracos com agitação de supercrescimento de batelada alimentada (FOG) foi realizada como descrito na publicação da patente internacional WO 2008/148519 A2. Todas as experiências de FOG para uma dada cultura em suspen são de células transfectadas foram realizadas pelo menos em duplicata.

[0130]Em resumo, as células transfectadas foram semeadas a uma concentração de 2 x 105 células/ml em frascos de agitação de 250 ml, cada um contendo 50 ml de meio de crescimento CM42/SPE (Lonza Ltd., Basileia, Suíça) e incubadas a 37°C em uma incubadora com agitação orbital umidificada (5% (v/v) CO2 em ar) a 140 rpm. As células foram alimentadas, começando no dia 3 de cultura, com uma alimentação consistindo em uma mistura de aminoácidos e elementos traços. As viabilidades diárias e as concentrações de células viáveis foram determinadas com o uso de um Analisador de Viabilidade Celular Automatizado Cedex (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). A concentração de anticorpos no meio foi determinada por HPLC de proteína A no dia 15 da cultura (coleta das culturas "supercresci- das"). Exemplo 4: Determinação da concentração de anticorpo monoclonal produzido por meio de HPLC de Proteína A (usando "construtos de promotor 1 - 5")

[0131]As concentrações do anticorpo monoclonal (mAb) de IgG4 cB72.3 produzidos pelas respectivas linhagens de células que abrigam os cassetes de expressão do gene de LC/HC sob o controle dos diferentes construtos quiméricos 1 -5 e secre- tados para o meio de cultura de células foram determinadas por cromatografia líquida de alto desempenho de Proteína A (HPLC). Os sobrenadantes isentos de células (passados através de uma unidade de filtro de 0,22 de m) foram carregados em uma Coluna de Imunodetecção de Proteína A POROS (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, EUA), conectada a um HPLC Agilent 1200. A coluna foi lavada e o mAb ligado foi eluído abaixando o pH do solvente.

[0132]A concentração do mAb foi determinada por comparação com uma curva padrão gerada com diluições em série de IgG4 de cB72.3 purificado por MabSelect SuRe (GE Healthcare GmbH, Freiburg, Alemanha) (faixa de curva padrão: 1025 ng/ a 200 ng/ ).

[0133]Os resultados das experiências acima estão resumidos na Tabela 3 e Figura 4, respectivamente: para cada um dos construtos quiméricos aqui usados, n = 4, re-presentando análises de FOG em duplicata para transfecções em duplicata, com a exceção de construto 4, em que n = 6 (análises de FOG em duplicata para transfec- ções em triplicata) e pRY57 (mCMV original), onde n = 8, com pontos de dados das experiências 1 e 2 sendo combinados. Os cálculos dos parâmetros de cultura celular foram realizados como descrito anteriormente (Porter et al. (2010) 26, Biotechnol. Prog., 1446- 1454).

[0134]A partir da Figura 4, é evidente que, no dia da coleta da cultura (ou seja, dia 15), o uso de qualquer um dos construtos quiméricos n°. 2 - 5 resultou na produção de concentrações de anticorpos mais elevadas do que com o uso da sequência de promotor de mCMV original (isto é, vetor pRY57). O uso do construto quimérico n°. 1 também resultou em uma concentração de anticorpos mais elevada do que com o promotor de mCMV (um fator de 1,31), embora o resultado não tenha atingido signi- ficância estatística.

[0135]Os melhores resultados foram obtidos com o construto quimérico n°. 4 resul-tando em uma expressão de genes de cerca de 2,88 vezes mais elevada em compa-ração com o promotor de mCMV, seguido pelo (em ordem decrescente) construto quimérico n°. 5 (fator de cerca de 2,54), construto quimérico n°. 2 (fator de cerca de 1,80), e construto quimérico n°. 3 (fator de cerca de 1,45).

[0136]A Tabela 3 ilustra as taxas de crescimento e as quantidades de mAbs pro-duzidos por diferentes linhagens de células hospedeiras transfectadas usadas aqui (compreendendo sequências reguladoras de promotor quimérico/construtos 1 -5).

Legenda: Max. - concentração máxima de células viáveis (106 células/ml); - taxa de crescimento específico (1/h); IVC - tempo integral da concentração de célu-las viáveis (106 células-h/ml); P- taxa de produção específica do mAb (g/célula.h); e [mAb] - concentração do mAb produzido no momento da coleta (mg/l)

[0137]Os dados acima mostram que o uso de sequências reguladoras de promotor quimérico compreendendo elementos potencializadores e/ou região a montante de sCMV e/ou hCMV, em combinação com os elementos do promotor de mCMV repre-sentam ferramentas genéticas superiores para a obtenção de sistemas de expressão de genes heterólogos altamente eficientes para células de mamífero. Exemplo 5: Cultura em suspensão de supercrescimento de batelada (BOG) para a determinação da concentração do anticorpo monoclonal produzido usando os "construtos de promotor 6 - 7"

[0138]As culturas de batelada foram realizadas em frascos E125ventilados conten- do 30 mL de CD-CHO no modo de suspensão (incubadora de 4 camada Kühner, 36,5°C, 5% de CO2 em ar (v/v) e 85% de umidade (v/v)). Em resumo, as células transfectadas foram semeadas a uma concentração de 2 x 105 células/ml e as con-centrações de células viáveis foram monitoradas ao longo da cultura. As amostras do meio foram tomadas no dia sete da cultura (cultura de alta viabilidade) para de-terminação da concentração de cB72.3 no meio com o uso de HPLC de Proteína A. Todas as experiências de BOG para uma dada cultura em suspensão de células transfectadas foram realizadas pelo menos em duplicata. Exemplo 6: Determinação da concentração do anticorpo monoclonal produ-zido por meio de HPLC de Proteína A (usando "construtos de promotor 6 - 7")

[0139]As concentrações do anticorpo monoclonal (mAb) de IgG4 cB72.3 produzido pelas respectivas linhagens de células que abrigam os cassetes de expressão do gene de LC/HC sob o controle dos diferentes construtos quiméricos 6 - 7 e secreta- dos para o meio de cultura de células foram determinadas por cromatografia líquida de alto desempenho da Proteína A (HPLC). Os sobrenadantes isentos de células (passados através de uma unidade de filtro de 0,22 m) foram carregados em uma coluna de imunodetecção de Proteína A POROS (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, EUA), conectada a um sistema de HPLC Agilent 1100. A coluna foi lavada e o mAb ligado foi eluído abaixando o pH do solvente.

[0140]A concentração do mAb foi determinada por comparação com uma curva padrão gerada com diluições em série de IgG4 de cB72.3 purificado por MabSelect SuRe (GE Healthcare GmbH, Freiburg, Alemanha) (faixa de curva padrão: 1025 ng/ a 64 ng/).

[0141]Os resultados das experiências acima estão resumidos na Figura 5: Para mCMV e construto 7, n = 6 (análise de batelada em duplicata para transfecções em triplicata), e para o construto 6, n = 4 (análise de batelada em duplicata para trans- fecções em duplicata).

[0142]A partir da Figura 5, é evidente que no dia 7 de cultura, o uso de qualquer um dos construtos quiméricos 6 e 7 resultou na produção de concentrações de anti-corpos mais elevadas do que com o uso da sequência de promotor de mCMV origi-nal (isto é, vetor pRY57).

[0143]Os melhores resultados foram obtidos com o construto 6 do promotor quimé-rico resultando em produtividade de mAb de cerca de 2,27 vezes mais elevada em comparação com o promotor de mCMV.

[0144]Os dados acima mostram que o uso de sequências reguladoras de promotor quimérico compreendendo elementos potencializadores e/ou região a montante de sCMV e/ou hCMV, em combinação com os elementos do promotor de núcleo de hCMV representam ferramentas genéticas superiores para a obtenção de sistemas de expressão de genes heterólogos altamente eficientes para células de mamífero.

[0145]A presente invenção descrita no presente documento forma ilustrativa pode ser adequadamente praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, não especificamente aqui divulgados. Assim, por exemplo, os termos "compreendendo", "incluindo", "contendo", etc. devem ser lidos expansivamente e sem limitação. Além disso, os termos e expressões aqui usados têm sido usados como termos de descrição e não de limitação, e não há qualquer intenção no uso desses termos e expressões, de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou porções das mesmas, mas é reconhecido que são possíveis várias modificações dentro do escopo da invenção reivindicada. Dessa forma, deve ser entendido que, embora a presente invenção tenha sido especificamente divulgada por modalidades e características opcionais, modificações e variações das invenções nelas incorporadas podem ser observadas pelos versados na técnica, e que tais modificações e variações são consideradas dentro do escopo da presente invenção.

[0146]A invenção foi descrita de forma ampla e genérica no presente documento. Cada uma das espécies mais estreitas e os agrupamentos sub-genéricos que fazem parte da descrição genérica também fazem parte da invenção. Isto inclui a descrição genérica da invenção com a condição ou limitação negativa removendo qualquer matéria em questão do gênero, independentemente de se o material retirado é ou não especificamente descrito no presente documento.

[0147]Outras modalidades estão incluídas nas reivindicações seguintes. Além dis-so, quando as características ou aspectos da invenção são descritas em termos de grupos de Markush, aqueles versados na técnica irão reconhecer que a invenção também é assim descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo de Markush.

Claims (10)

1. Vetor de expressão para a expressão heteróloga de uma sequência de ácidos nucleicos de interesse em células de mamíferos, o vetor CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma primeira sequência reguladora quimérica sendo operativamente ligada a uma primeira sequência de ácidos nucleicos a ser expressa, em que a sequência reguladora quimérica compreende: (i) uma sequência de promotor sendo selecionada dentre o promotor IE1 de citomegalovírus de murino consistindo na SEQ ID NO: 4 ou o promotor IE1 de citomegalovírus de humano consistindo na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5, a sequência promotora sendo operativamente ligada ao sítio de partida de transcrição da sequência de ácidos nu- cleicos a ser expressa; e (ii) uma sequência de potencializador sendo selecionada da região IE1 de citomegalovírus símio ou representando uma quimera da região IE1 do citamegalovírus humano e do símio, a sequência de potencializador sendo localizada a 5’, e ligada operativamente à sequência de promotor de humano ou de murino, em que a sequência de potencializador compreende a SEQ ID NO: 6.

2. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência reguladora quimérica compreende uma sequência de nucleotídeos selecio- nado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, e SEQ ID NO: 13.

3. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma segunda sequência reguladora quimérica sendo operativamente ligada a uma segunda sequência de ácido nucleico a ser ex-pressa, em que a segunda sequência reguladora quimérica é idêntica à primeira sequência reguladora quimérica.

4. Vetor de expressão, de acordo com qualquer a rei-vindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma segunda sequência reguladora quimérica sendo operativamente ligada a uma segunda sequência de ácido nu- cleico a ser expressa, em que a segunda sequência reguladora quimérica é diferente da primeira sequência reguladora de promotor quimérico.

5. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, CARACTERIZADO pelo fato de que as primeiras e segundas sequências de ácido nucleico a serem expressas codificam diferentes polipeptídeos.

6. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que os diferentes polipeptí- deos representam subunidades de uma proteína dimérica ou multimérica.

7. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína dimérica ou multimérica é uma molécula de anticorpo.

8. Método in vitro para a expressão heteróloga de uma sequência de ácidos nucleicos de interesse em uma célula hospedeira de mamífero CARACTERIZADO pelo fato de que com-preende: (i) transfecção da célula hospedeira de mamífero com um vetor de expressão, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7; e (ii) cultivo da célula hospedeira de mamífero trans- fectada em condições que permitam a expressão da sequência de ácidos nucleicos de interesse.

9. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a transfecção é a transfec- ção estável.

10. Uso de um vetor de expressão, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a expressão heteróloga de uma sequência de ácidos nucleicos de interesse em uma célula hospedeira de mamífero.

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