ITMI20120489A1 - Sistema di espressione gspe-express - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description
Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo:
SISTEMA DI ESPRESSIONE GSPE-EXPRESS
DESCRIZIONE
CAMPO DELL’INVENZIONE
Il campo tecnico dell’invenzione à ̈ relativo a molecole e metodi per lo studio dei sistemi cellulari di mammifero per l'espressione di proteine e/o RNA di interesse biomedico e/o biotecnologico.
STATO DELLA TECNICA
La produzione commerciale di proteine ricombinanti, attualmente, avviene mediante l’impiego di cellule procariotiche ed eucariotiche. La scelta di un sistema rispetto ad un altro à ̈ principalmente basata sulla complessità strutturale della proteina da esprimere, sui costi di produzione, sulla quantità di produzione richiesta.
Nel caso la proteina nativa non sia modificata post-traduzionalmente o le modificazione post-traduzionali non ne compromettano la sua funzione, la proteina ricombinante può essere prodotta in procarioti. Proteine ricombinanti derivate da cellule animali sono sempre più ampiamente utilizzate nella ricerca di base, ma anche in agricoltura e in medicina. I progressi nel settore della genetica molecolare e nelle procedure di coltivazione delle cellule animali hanno consentito un progressivo incremento del numero di proteine ricombinanti e della quantità prodotta aprendo lo sviluppo a nuovi protocolli terapeutici. L'impiego di cellule di lievito, insetto, mammifero o di animali transgenici ha permesso di superare le limitazioni imposte dai sistemi procariotici dovuti all’incapacità di produrre modificazioni post-traduzionali e alla bassa percentuale di proteina biologicamente attiva.
La necessità di esprimere elevate quantità di proteine ricombinanti impone lo sviluppo di metodiche di produzione che salvaguardino conformazione strutturale e modificazioni post-traduzionali, caratteristiche che influenzano pesantemente alcune proprietà della proteina stessa quale per esempio la secrezione, l’attività biologica, l'antigenicità , l’attività enzimatica, la stabilità ecc.
Attualmente, più del 60-70% delle proteine terapeutiche presenti sul mercato sono prodotte in cellule di mammifero, la maggior parte delle quali nella linea cellulare immortalizzata isolata dall’ovaio di criceto cinese (Chinese Hamster Ovary, CHO) e adattata a crescere in sospensione. Queste cellule furono storicamente impiegate nel 1986 per la produzione della prima proteina terapeutica, l’attivatore tissutale del plasminogeno (tPA, Activase; Genentech, S. San Francisco, CA, USA), approvata per uso in medicina dagli enti preposti (Wurm, 2004). Nel corso degli anni, altre linee cellulari sono state impiegate per la produzione di proteine terapeutiche, quali ad esempio quelle isolate da mielomi umani (NSO e SP2/0), le renali di criceto Baby Hamster Kidney (BHK-21), le umane isolate da rene embrionale e stabilizzate in vitro Human Embryonal Kidney (HEK293).
Nella maggior parte dei casi, le linee cellulari ricombinanti sono generate dopo l'introduzione nelle cellule ospiti, del gene di interesse insieme con il marcatore di selezione mediante trasfezione di un singolo vettore plasmidico o in plasmidi separati. L’impiego di un numero sempre più crescente di linee cellulari consente di allargare la schiera di cellule che per caratteristiche biologiche varie sono ottimali per la produzione su larga scala di proteine di interesse. Questo ha determinato la necessità di selezionare i cloni ricombinanti mediante l’impiego di marcatori genetici dominanti, che conferiscono per esempio la resistenza ad antibiotici in sostituzione dei geni che complementano un difetto di funzione derivato da una mutazione somatica della cellula.
Per far fronte alla crescente domanda di proteine terapeutiche, le industrie farmaceutiche sono fortemente stimolate a migliorare vari aspetti tecnologici dei protocolli di espressione operando a vari livelli, quali ad esempio: 1- sviluppo di linee cellulari adattate alla crescita in sospensione che permettono condizioni di coltura più semplici rispetto alla coltura in adesione su un supporto; 2- terreni di coltura che sono in grado di sostenere elevate densità cellulari; 3- fermentatori che permettono una più facile ed economica coltura della linea cellulare; 4- procedure che allungano il tempo di espressione elevata del transgene durante la coltura e quindi la produzione globale per ogni lotto di coltura cellulare; 5- sviluppo di metodi che permettono una facile purificazione della proteina ricombinante direttamente dal terreno di coltura.
Dall’approvazione della produzione del tPA (1986) ad oggi si à ̈ passati da una produzione di proteina ricombinante di 10pg/cell/day per un lotto di coltura per un massimo di 7 giorni con una produzione totale di circa 50mg/lt ad una produzione superiore a 90pg/cell/day di proteina pari a circa 5gr/lt per periodi di coltura fino a 3 settimane (Wurm, 2004).
Nonostante i notevoli progressi, à ̈ a tutt’oggi ancora sentita l'esigenza di migliorare l’efficienza di produzione allungando il tempo di espressione nella linea cellulare, stabilizzando quindi l’espressione del trangene per ottenere una più elevata produzione della proteina di interesse.
Scopo della presente invenzione à ̈ pertanto quello di fornire un sistema di espressione genica che permette un’elevata, efficiente e duratura espressione di transgeni, adatto ad ottenere risultati rapidi e precisi che permetta di superare gli ostacoli e le difficoltà dei metodi noti per la medesima applicazione.
SOMMARIO DELL’INVENZIONE
L’invenzione pertanto concerne un vettore di espressione di derivazione plasmidica comprendente la sequenza di SEQ ID NO. 3 inserita al 5’ di un promotore.
Sotto ancora un ulteriore aspetto, l’invenzione concerne un vettore di espressione di derivazione plasmidica per l'uso nei saggi di Recombinase Mediated Cassette Exchange (RMCE).
Sotto ancora un ulteriore aspetto, l'invenzione concerne un vettore di espressione di derivazione plasmidica per l’uso nella espressione e nella preparazione di un gene ricombinante.
Sotto ancora un ulteriore aspetto, l’invenzione concerne un procedimento per la preparazione di un gene ricombinante comprendente la trasformazione in vitro di una cellula staminale o una cellula di mammifero, con un vettore secondo la presente invenzione.
DESCRIZIONE DELLE FIGURE
L'invenzione verrà ora descritta in dettaglio e facendo riferimento alle Figure allegate.
Figura 1: Rappresentazione schematica dei vettori usati nei saggi di RMCE (Esempio 1). (A) Il vettore RMCE Cassetta 1, pLNeoTk L2, à ̈ mostrato linearizzato e integrato nel genoma ospite. Le unità trascrizionali del gene Neo (resistenza all’antibiotico G418) e del gene per la timidino cinasi dell’Herpes Simplex Virusl (sensibilità al chemioterapico Ganciclovir) sono comprese tra le sequenze lox, che sono i siti bersaglio della ricombinasi fagica Cre. L’ingrandimento sopra ciascun sito lox mostra la sequenza di 34bp dell’elemento selvatico LoxP (a sinistra) e della variante mutata Lox2272 (a destra). Ciascun sito lox e' costituito da due sequenze di 13bp ripetute invertite (frecce nere) separate da uno spacer centrale di 8bp. I siti lox sono clonati nel vettore in orientamento diretto (freccia rossa sotto lo spacer) per permettere lo scambio delle cassette e le due sequenze LoxP e Lox2272 si distinguono per i due nucleotidi sottolineati nella regione dello “spacer†(in grassetto). La combinazione del sito loxP con la variante Lox2272 permette di evitare o minimizzare eventi di ricombinazione intramolecolari che causano la excisione del vettore dal genoma. Nello schema non sono mostrati gli elementi del plasmide richiesti per la crescita nei batteri. (B) Nel diagramma à ̈ rappresentato un vettore RMCE cassetta 2 prototipo linearizzato con agli estremi dai siti LoxP e Lox2272 che mediano l’evento di ricombinazione sito-specifica dipendente dalla ricombinasi Cre. Non e’ mostrata la porzione di sequenza plasmidica necessaria per la crescita in batterio. Il vettore contiene l’unità trascrizionale pac (resistenza all'antibiotico puromicina) fiancheggiata agli estremi dai siti FRT, sequenze bersaglio della ricombinasi di lievito Flippasi, che permettono se richiesto di excidere l’unita' pac. Al 3’ à ̈ clonata l’unità trascrizionale diretta dal forte promotore virale del citomegalovirus (CMVp) che esprime il gene di interesse (GOI), ad esempio un gene reporter come la Green Fluorescence Protein GFP o la luciferasi o un gene qualsiasi di interesse biomedico/biotecnologico. In questo schema e’ inoltre rappresentata la sequenza di 1.2kb deH’origine di replicazione della Lamina B2 (LamB2-ori) clonata al 5’ del promotore CMV. In altri vettori la sequenza LamB2-ori e’ assente (per es vettore R4) o costituita da mutanti di delezione/sostituzione della LamB2-ori o da sequenze chimeriche core-LamB2-ori con Cdh1 (pR21 ) (vedi testo). Il GOI e’ introdotto nel vettore mediante ricombinazione tra siti attL/R in vitro con il sistema Gateway (Invitrogen) oppure per semplice clonaggio con enzimi di restrizione. Sopra la RMCE cassetta 2 à ̈ rappresentato un vettore Gateway donatore pENTR con un qualsiasi GOI;
Figura 2: Efficienza di formazione di colonie (CFE) del saggio di RMCE e verifica molecolare mediante PCR dello scambio dei vettori (Esempio 2). (A) Il grafico mostra la RMCE cassetta 2 (nell’esempio à ̈ il vettore pR5), integrata nel genoma ospite mediante ricombinazione sito-specifica per scambio di cassette; (B) Nel fotogramma à ̈ mostrato un esempio di RMCE. Cellule HeLa clone 26.147 contenenti la RMCE cassetta 1 stabilmente integrata in copia singola nel genoma, furono co-trasfettate con il vettore pR5 in presenza del vettore pCre che esprime la ricombinasi Cre (RMCE) o in presenza di un vettore irrilevante pBsKs, per misurare il background di cloni che integrano casualmente la RMCE cassetta 2 (Control). Nei fotogrammi sono mostrati i cloni stabili resistenti alla puromicina, fissati e colorati con Coomassie Brilliant Blu R250 dopo tre settimane di coltura; (C) Alcuni cloni resistenti alla puromicina furono prelevati dalla piastra in cui à ̈ avvenuto l’RMCE, un’aliquota di cellule di ciascun clone fu lisata e il lisato fu sottoposto alla verifica molecolare dell’avvenuto scambio di cassette mediante saggi di PCR. Nel grafico (A) à ̈ mostrato il primer set (NeoTk1_fw/FPuro3_fw) che identifica una sequenza complementare alla cassetta 1 esterna ai siti lox (Neo_tk1) e una complementare alla cassetta 2 (FPuro3_fw), pertanto solo se à ̈ avvenuta la ricombinazione dei due vettori si può ottenere un prodotto di amplificazione sulla regione del loxP di 405bp (PCR1). A destra à ̈ illustrato l’altro primer set (attB2_fw/NeoTK2_rev) utilizzato per verificare l’integrità della regione del sito lox2272. Nota: in alcuni costrutti il primer interno complementare alla cassetta 2 può variare a seconda del costrutto in analisi e di conseguenza può variare anche la dimensione del prodotto di amplificazione (PCR2). Al centro e’ rappresentato il primer set (B48ll_dx e B48_sx) utilizzato per verificare la presenza in singola copia della cassetta 2 integrata nel genoma ospite. Questo primer set amplifica la cassetta 2 e la sequenza selvatica endogena (LamB2-ori) che à ̈ di 25bp piu’ lunga (PCR3). Pertanto nello screening di PCR con i primers indicati, i cloni positivi generano due prodotti di amplificazione che sono risolti in elettroforesi su gel di agarosio al 2.5-3%, la cui abbondanza della banda lenta (endogena) à ̈ circa 1.5-2.0 volte la quantità di banda corrispondente alla sequenza ectopica. Solo i cloni che hanno superato i tre saggi molecolari di PCR di validazione (indicati da pallini rossi) sono quindi scelti per gli studi successivi.
Figura 3: L’attività di innesco della replicazione della LamB2-ori à ̈ confinata nella sequenza di 353bp, denominata core (Esempio 3).
(A) Il diagramma mostra la sequenza selvatica della LamB2-ori. La regione core ricca in nucleotidi AT à ̈ indicata. Essa contiene la sequenza Origin Protected Region (OPR) nel quale à ̈ stato mappato il punto di innesco bi-direzionale della replicazione precisamente nell’elemento 5' ripetuto diretto di 11 basi (rettangoli pieni). Adiacente à ̈ mostrata la porzione 5' della CpG island del gene Timm13 e il primo nucleotide di trascrizione (+1 ). Dopo l’interruzione a circa 4500bp dall’OPR à ̈ mostrata la sequenza di controllo a replicazione passiva B13 (B13 control). Sotto lo schema sono inoltre indicati i primer (B48ll_dx /B48endo_sx e B13_dx/B13_sx) e i relativi prodotti di amplificazione T1 e T2 rispettivamente sulla regione dell’OPR e del controllo B13. In ordine dall’alto al basso à ̈ mostrata una porzione del vettore pR5: eLB2-ori che contiene la sequenza ectopica selvatica di 1.2kb della LamB2-ori (eLamB2-ori) clonata nella RMCE cassetta 2. Per distinguere la sequenza deH’origine ectopica da quella endogena nel saggio di PCR competitiva, una delezione di 25bp à ̈ stata introdotta nella sequenza clonata nel vettore. Il prodotto di PCR, T3, à ̈ generato dai primer B48ll_dx/B48ecto_sx. Il mutante (pR8: eLB2-core) che conserva le basi 1-353 della sequenza selvatica della 1.2kb eLamB2-orià ̈ stato ottenuto dalla delezione della sequenza CpG di circa 800bp del vettore R5. Il mutante (R7) à ̈ stato ottenuto sostituendo la regione core con una sequenza di pari lunghezza isolata dalla regione di controllo B13 a replicazione passiva. Le cellule dei cloni stabilmente integrati con le indicate RMCE cassette 2 sono state lisate e il DNA nascente à ̈ stato isolato su gradiente di saccarosio. L’abbondanza di DNA nascente dell’origini di replicazione selvatica, ectopica e dei relativi mutanti e’ stata misurata in PCR competitiva. (B) Elettroforesi su gel di agarosio dei prodotti di amplificazione ottenuti mediante PCR competitiva di DNA nascente. In alto sono indicati i primer set usati per quantificare l’abbondanza dello stampo corrispondenti all’origine endogena (T1), ectopica (T3) e di controllo (T2) e del competitore (C) indicate a lato del fotogramma. In alto à ̈ riportata la diluizione del DNA artificiale detto competitore (C) che viene addizionato alla reazione di PCR. La freccia nera piena indica la concentrazione di competitore la cui intensità della banda à ̈ in equilibrio con la banda dell’origine endogena, la testa di freccia indica la concentrazione di equilibrio tra la banda del competitore e quella del controllo B13, mentre la freccia vuota si riferisce alla concentrazione di equilibrio tra il competitore e la banda della sequenza dell’origine ectopica. (C) L’istogramma schematizza il risultato della cPCR mostrata in B. L’abbondanza di DNA nascente generata daN’origine ectopica (R5) e dei mutanti (vettori R7 e R8) à ̈ espressa come percentuale relativa all’attività della sequenza selvatica della LamB2-ori.
Figura 4: Il replicatore di 353bp, eLB2-core (R8) non à ̈ in grado di prevenire il silenziamento genico.
L’espressione di EGFP à ̈ stata analizzata in immunoblot (mostrati 4-5 cloni indipendenti per ogni costrutto) con estratti totali isolati dai cloni coltivati in terreno selettivo per 30 giorni dopo l’evento di integrazione sito-specifica dei vettori pR4, pR5, pR7 e pR8 nelle cellule riceventi 26.147 (A) e 26.217 (B). L’espressione della tubulina à ̈ mostrata come controllo di quantità di estratto totale saggiato. (C) Il diagramma mostra le caratteristiche molecolari dei costrutti saggiati e la tabella riassume la loro capacita’ di promuovere sia l'innesco della replicazione (descritta in figura 3) sia quella di prevenire il silenziamento genico;
Figura 5: L’elemento del replicatore 1.2kb eLamB2-ori necessario alla prevenzione del silenziamento genico à ̈ distinto dall’elemento necessario per l’innesco della replicazione.
(A) Le cellule riceventi 26.147 (pannello di sinistra) e 26.217 (pannello di destra) sono state trasfettate con i vettori schematizzati in (B). Dopo 1 mese in terreno selettivo, 5 cloni RMCE sono stati isolati da ciascuna trasfezione, lisati in un unico estratto totale ed analizzato mediante immunoblot per l’espressione di EGFP e del controllo tubulina. (B) Nel diagramma sono mostrate le caratteristiche dei vettori (indicati da R seguita dal numero) contenenti la sequenza selvatica ectopica 1.2kb eLamB2-ori o i relativi mutanti di delezione/sostituzione analizzati. Nel diagramma della sequenza ectopica selvatica 1.2kb eLamB2-ori, l’ovale indica la porzione ricca in AT detta core, sequenza di 353bp necessaria per l’innesco della replicazione, mentre il rettangolo indica la regione ricca nel dinucleotide CG della porzione 5’ della CpG island di Timm13. Il punto di inizio della trascrizione del gene (+1 ), la regione codificante il primo esone (Ex1), il primo codone (ATG), il primo introne (Intr 1 ) e il secondo esone del gene TIMM13 sono indicati. I numeri si riferiscono alla sequenza nucleotidica della eLamB2-ori. (C) Il confronto dei livelli di espressione del gene reporter EGFP mostra una regione di 257bp (LB2-IE) mappata nella CpG island del frammento 1.2kb eLamB2-ori che à ̈ essenziale per la prevenzione del silenziamento. Questa sequenza à ̈ pertanto distinta dalla sequenza core (bp1-353) che à ̈ necessaria per l’innesco della replicazione.
Figura 6: La sequenza isolata dal gene umano CDH1 in combinazione con l’elemento eLB2-core esercita una potente azione di prevenzione del silenziamento genico (Esempio 4).
(A) Il diagramma mostra la sequenza isolata dalla regione regolativa (bp 3965-6020, GeneBank accession no. NG_008021) del gene umano CDH1. Nel diagramma sono schematizzate varie RMCE cassette 2 che sono state integrate mediante RMCE nel ricevente 26.147. Il vettore R8 contiene la sequenza LB2-core (ovale). Il vettore R21 à ̈ composto dalla sequenza bp 3965-6020 di CDH1 clonata al 3' dell’elemento eLB2-core, mentre il vettore R34 à ̈ privo dell’elemento eLB2-core. I vettori R35, R36, R37 contengono varie porzioni della sequenza isolate dal gene CDH1 (le bp sono indicate). La porzione di CpG island di CDH1 à ̈ indicate. Il punto di inizio della trascrizione del gene (+1 ), la regione codificante il primo esone (Ex1 ), il primo codone (ATG) e il primo introne (Intr 1 ) sono indicati. R5 à ̈ la sequenza originale di 1.2kb della LamB2-ori; R31 contiene solo l’elemento LB2-IE. (B) L’immunoblot mostra il livello di espressione della proteina reporter EGFP nei cloni stabili dopo un mese di coltura. L’immunoblot con anti-tubulin à ̈ il controllo di caricamento degli estratti. Ciascun estratto à ̈ stato ottenuto da un pool di cinque cloni isolati mediante RMCE. Figura 7: La sequenza eLB2-core-Cdh1-GSPE permette un’espressione elevata, duratura nel tempo, costante e priva di variegature in assenza di pressione selettiva.
(A) Nel diagramma à ̈ schematizzato il vettore pR21: (eLB2-core-Cdh1-GSPE) e il vettore pR5 contenente la sequenza selvatica ectopica della 1.2kb LamB2-ori. I fotogrammi mostrano la fluorescenza emessa dalla EGFP di due cloni rappresentativi R21.36 e R5.16 coltivati in presenza di selezione con puromicina (C: controllo) o senza pressione selettiva per 1 (1) e 3 (3) mesi. Gli stessi campi sono stati controcolorati con il colorante nucleare DAPI. Notare la costante e regolare espressione di EGFP in tutte le cellule del clone contenente la sequenza CDH1 (R21.36), mentre il clone R5.16 mostra variegatura con una progressive perdita del segnale fluorescente di EGFPnelle cellule coltivate in assenza di puromicina. (B) Tre cloni rappresentativi di ciascun vettore descritto al punto A sono stati coltivati in presenza (C: controllo) o in assenza di puromicina per 1 (1) o 3 (3) mesi. Le cellule sono state quindi lisate e gli estratti totali analizzati in immunoblot per l’espressione della proteina reporter EGFP o del controllo di caricamento tubulin. Notare la notevole azione di prevenzione del silenziamento genico in assenza di pressione selettiva esercitato dalla sequenza eLB2-core-Cdh1-GSPE, mentre la sequenza 1.2kb eLB2-ori non riesce a prevenire il progressivo silenziamento in assenza di puromicina.
Figura 8: eLB2-core e Cdh1-GSPE insieme esercitano un’azione di prevenzione del silenziamento genico più efficace della singola sequenza Cdh1-GSPE.
(A) Nel diagramma à ̈ schematizzato il vettore R21: LB2-core Cdh1-GSPE e il costrutto R34 che contiene la sequenza Cdh1-GSPE senza l’elemento eLB2-core. Sei cloni di ciascun vettore, ottenuti mediante RMCE, sono stati isolati, espansi e coltivati in presenza (C: controllo) e in assenza di pressione selettiva per almeno 2 mesi (2). Estratti totali sono stati quindi analizzati in immunoblot per l’espressione della proteina reporter EGFP e del controllo di caricamento Tubulina. Notare che l’azione combinata di eLB2-core e sequenza CDH1-GSPE à ̈ più potente della sola azione esercitata dalla sequenza CDH1-GSPE (B) Lo stesso esperimento descritto in A à ̈ stato eseguito con 6 cloni isolati con il vettore R5 o il vettore R7 integrato per RMCE contenenti rispettivamente la sequenza 1.2kb LamB2-ori o la CpG-island senza la regione LamB2-core che à ̈ stata sostituita dalla sequenza B13 a replicazione passiva .
(C) Due cloni rappresentativi di R5 e R7 che vanno incontro a riduzione dell’espressione di EGFP dopo due mesi di coltura in terreno standard sono stati incubati alle concentrazioni indicate con l'inibitore delle deacetilasi TSA. L’immunoblot mostra l’espressione di EGFP e del controllo di caricamento Tubulina in estratti di controllo di cellule coltivate in terreno selettivo (+), in terreno standard per 2 mesi (0) e addizionato di TSA (100 e 200nM) nelle ultime 12 ore di coltura. Da notare che il trattamento con TSA ripristina l’espressione della EGFP dimostrando che la perdita dì segnale di EGFP nei cloni coltivati in assenza di pressione selettiva à ̈ causata da silenziamento e non da instabilità genomica del costrutto integrato.
Figura 9: Il vettore pR21: (eLB2-core-Cdh1-GSPE) integrato casualmente nel genoma di cellule di criceto CHO Ã ̈ in grado di esercitare efficacemente la prevenzione del silenziamento genico in cloni cellulari coltivati a lungo termine.
Cellule CHO sono state trasfettate con il vettore pR21: eLB2-core-Cdh-GSPE. Dopo selezione in puromicina sono stati isolati cloni stabili ad integrazione casuale e un pool di cloni à ̈ stato espanso in presenza (+) o in assenza (-) di puromicina per 1 mese. Le cellule sono state Usate e analizzate in immunoblot per l’espressione della EGFP e del controllo di caricamento Tubulina. Come controlli sono stati anche saggiati cloni trasfettati nelle medesime condizioni sperimentali con il vettore pR4 contenente il solo promotore CMVp o con pR5 contenente la sequenza 1.2kb LamB2-ori clonata al 5’ del CMVp.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
Lo scopo indicato più sopra à ̈ stato raggiunto attraverso un vettore di espressione di derivazione plasmidica e attraverso una cellula comprendente detto vettore.
L’invenzione pertanto concerne un vettore di espressione di derivazione plasmidica comprendente la sequenza di SEQ ID NO. 3 inserita al 5’ di un promotore.
L’invenzione pertanto concerne un vettore di espressione di derivazione plasmidica comprendente la sequenza di SEQ ID NO. 3 inserita al 5’ di un promotore in cui detto promotore à ̈ preferibilmente il promotore del citomegalovirus umano (CMVp), più preferibilmente avente SEQ ID NO.4..
In una forma preferita, l’invenzione riguarda un vettore di espressione di derivazione plasmidica comprendente la sequenza di SEQ ID NO. 3 inserita al 5’ di un promotore, ulteriormente comprendente la sequenza di SEQ ID NO. 1, preferibilmente inserita al 5’ della SEQ ID NO. 3.
La combinazione di eLB2-core con Cdh1-GSPE consente un’espressione elevate e durevole del GOI (gene d’interesse). Inoltre consente una espressione del GOI senza evidente variegatura tra le varie cellule del clone in coltura a lungo termine (saggiati per almeno 3 mesi) in assenza di pressione selettiva. Questa proprietà permette di ridurre al minimo il numero di cloni da vagliare per individuare i cloni meglio esprimenti il GOI e di coltivare questi cloni cellulari a lungo termine in assenza di antibiotici.
In una forma ancora più preferita, l’invenzione riguarda un vettore di espressione di derivazione plasmidica comprendente la sequenza di SEQ ID NO. 3 inserita al 5’ di un promotore, in cui detto promotore à ̈ il promotore del citomegalovirus umano (CMVp), preferibilmente avente SEQ ID NO.4.
In una forma ancora più preferita, l’invenzione riguarda un vettore di espressione di derivazione plasmidica comprendente la sequenza di SEQ ID NO. 3 inserita al 5’ di un promotore, ulteriormente comprendente la sequenza di SEQ ID NO. 1, preferibilmente inserita al 5’ della SEQ ID NO. 3, in cui detto promotore à ̈ il promotore del citomegalovirus umano (CMVp), preferibilmente avente SEQ ID NO.4.
Vantaggiosamente in una forma di realizzazione preferita l’invenzione concerne un vettore di espressione di derivazione plasmidica secondo l’invenzione, ulteriormente comprendente un gene read-out, preferibilmente il gene EGFP, più preferibilmente il gene di SEQ ID NO. 5.
Sotto ancora un ulteriore aspetto, l’invenzione concerne un vettore di espressione di derivazione plasmidica secondo l’invenzione, avente la sequenza di SEQ ID NO. 6 (o pR21) oppure il vettore di espressione di derivazione plasmidica precursore di pR21 e avente la SEQ ID NO 36.
Sotto ancora un ulteriore aspetto, l’invenzione concerne un vettore di espressione di derivazione plasmidica secondo l’invenzione, avente la sequenza di SEQ ID NO. 7. Sotto ancora un ulteriore aspetto, l’invenzione concerne un vettore di espressione di derivazione plasmidica secondo l’invenzione, avente la sequenza di SEQ ID NO. 6. Sotto ancora un ulteriore aspetto, l’invenzione concerne un vettore di espressione di derivazione plasmidica per l’uso nei saggi di Recombinase Mediated Cassette Exchange (RMCE) avente la sequenza di SEQ ID NO. 6.
Sotto ancora un ulteriore aspetto, l’invenzione concerne un vettore di espressione di derivazione plasmidica per l’uso nei saggi di Recombinase Mediated Cassette Exchange (RMCE) avente la sequenza di SEQ ID NO. 7.
Sotto ancora un ulteriore aspetto, l’invenzione concerne un vettore di espressione di derivazione plasmidica per l’uso nei saggi di Recombinase Mediated Cassette Exchange (RMCE) avente la sequenza di SEQ ID NO. 36.
Sotto ancora un ulteriore aspetto, l’invenzione concerne un vettore di espressione di derivazione plasmidica per l’uso nella espressione e nella preparazione di un gene ricombinante.
Sotto ancora un ulteriore aspetto, l’invenzione concerne un procedimento per la preparazione di un gene ricombinante comprendente la trasformazione in vitro di una cellula, con un vettore secondo la presente invenzione.
Vantaggiosamente in una forma di realizzazione preferita l’invenzione concerne un procedimento per la preparazione di un gene ricombinante, in cui detta cellula à ̈ una cellula di mammifero.
In una forma più preferita l’invenzione concerne un procedimento per la preparazione di un gene ricombinante, in cui detta cellula à ̈ una cellula staminale o una cellula umana, preferibilmente una cellula HeLa o HEK293, una cellula di roditore, preferibilmente Chinese Hamster Ovary: CHO o una cellula di maiale, preferibilmente PK15, o un animale transgenico di mammifero (uomo escluso) o per un impiego in terapia genica.
Si riportano di seguito Esempi di realizzazione della presente invenzione forniti a titolo illustrativo.
ESEMPI
Esempio 1: RMCE Cassetta 1: pL1NeoTkL2.
La RMCE Cassetta 1 denominata pL1NeoTkL2: SEQ ID NO:7, e’ costituito dalle sequenze necessarie per la replicazione del plasmide e dal gene per la resistenza airampicillina per espandere la molecola in colture batteriche. In questa porzione del vettore à ̈ presente il sito unico di restrizione BamHI che serve per la linearizzazione del vettore prima della trasfezione in cellule animali. Il vettore contiene inoltre l’unità trascrizionali del gene neo, il marcatore di selezione positivo, che conferisce alle cellule animali riceventi la resistenza aH’antibiotico G418, e l'unità trascrizionale del gene tk codificante per l’enzima timidino-chinasi (TK) del virus dell’Herpes Simplex I (HSV) per la controselezione delle cellule sensibili al Ganciclovir (GCV) durante i saggi di ricombinazione sito-specifica (vedi di seguito). Le due unità trascrizionali eucariotiche sono delimitate dalla sequenza loxP di 34bp che costituisce il segnale di riconoscimento per la ricombinasi Cre e dalla sequenza lox2272 (Figura 1 ). Lox2272 à ̈ una variante di loxP per sostituzione di due nucleotidi nella porzione centrale o core, e permette di ridurre o persino annullare in saggi in vitro e in vivo eventi ricombinativi intramolecolari tra siti lox identici che condurebbero all’escissione senza scambio della cassetta integrata (Lee and Saito, 1998).
Costruzione- Il vettore pL1 NeoTkL2 fu derivato dal vettore plasmidico di espressione eucariotico pEGFP-N1 (BD Biosciences Clontech, GenBank acc, N, U55762) come segue: Il vettore pEGFP-N1 fu digerito con gli enzimi di restrizione Bglll e EcoRI e tra i due siti fu clonato il frammento isolato dal plasmide pTK2A (Colbere-Garapin et al., 1979) codificante l'unita’ trascrizionale del gene HSVtk (promotore, gene e segnale di poli-adenilazione). Questo vettore intermedio, denominato pEGFP-N1-Hsv-tk1 , fu successivamente modificato mediante digestione enzimatica con gli enzimi di restrizione Sali e Noti e clonaggio del prodotto di PCR denominato LoxP-BamHI-Lox2272 nei corrispondenti siti per ottenere il vettore finale pL1 NeoTkL2.
Il prodotto di PCR LoxP-BamHI-Lox2272 fu ottenuto mediante tre reazioni di PCR. Le prime due furono eseguite utilizzando il vettore pEGFP-N1 come stampo e la coppia di primer Sali L2_fw e EGFP-Bam_rev per ottenere il megaprimer A e la coppia di primer EGFP-Bam_fw e Notl-L1_rev per il megaprimer B. Successivamente i due megaprimer A e B furono impiegati nella terza reazione di PCR insieme con la coppia di primer Sali L2_fw e Notl-L1_rev per produrre il frammento finale LoxP-BamHILox2272. Questo prodotto di PCR fu clonato nei siti Sali-Noti di pEGFP-N1-Hsv-tk1. Il vettore fu linearizzato nel sito singolo BamH1 prima di essere trasfettato nelle cellule. PRIMERS:
L2-EGFPJW (SEQ ID NO: 8) 5’acgcgtcgacataacttcgtataaagtatcctatacgaagttatctcgaggccaccatggtgagcaagg-3’ L1 EGFP_rev (SEQ ID NO: 9) 5'ataagaatgcggccgcataacttcgtatagcatttatacgaagttataagattctacagctcgtccatg-3' EGFP-BAM_rev (SEQ ID NO: 10)
5'-gtggccgatccttgaagttcaccttgc-3’
Sall-L2_fw (SEQ ID NO: 11)
5’-acgcgtcgacataacttcgtataaag-3’
Sall-L2_fw (SEQ ID NO: 12)
5'-acgcgtcgacataacttcgtataaag-3'
EGFP-BAMJw (SEQ ID NO: 13)
5†̃-gaacttcaaggatccgccacaacatcgaggacg-3’
Notl-L1_rev (SEQ ID NO: 14)
5'-ataagaatgcggccgcataacttcg-3’
pCre, vettore di espressione per la ricombinasi Cre.
L’unita’ trascrizionale costituita dal promotore minimo del gene per la timidino cinasi dell’Herpes simplex virus 1 (HSV-tk1p), dal gene codificante la ricombinasi fagica Cre e il sito di poliadenilazione dei Simian Virus SV40 isolati dal vettore pCreFlp (Lauth et al., 2002) furono clonate nei siti Hindlll-Sall del vettore pBluescript pBsKS ll(+) (Stratagene) e denominato pCre.
Esempio 2: Costruzione di vetori intermedi per la RMCE Casseta 2:
Descrizione della sequenza ectopica di 1.2kb della origine di replicazione del DNA della Lamina B2, denominata eLamB2-ori.
La sequenza selvatica della LamB2-ori à ̈ contenuta nel frammento Bglll-Nrul di circa 1 .2kb, dal nucleotide 3728 al 4929 della sequenza GenBank accession no. M94363. Questo frammento fu amplificato mediante PCR per inserire i siti EcoRI-BamHI di clonaggio nel vettore pBluescript II KS(+) (pBKS) (Stratagene) (Paixao et al., 2004) .
La sequenza ectopica della LamB2-ori (eLamB2-ori) fu generata mediante mutagenesi con PCR per generare una delezione di 35bp tra i nucleotidi 4035 e 4070 e introdurre i siti di restrizione Sali, Sfil e Noti rispettivamente alle posizioni nucleotidiche 4015, 4030, 4115 (Paixà o et al., 2004). Pertanto il nucleotide no.1 della sequenza ricombinante ectopica corrisponde al nucleotide 3728 della sequenza GenBank: M94363. Tutti i mutanti dell’origine della LamB2-ori descritti di seguito sono derivati dalla sequenza della eLamB2-ori.
pL1eOriL2
Costrutto intermedio: Il DNA stampo pBKS-eLamB2-ori (Paixà o et al., 2004) contenente la sequenza Bglll-Nrul di circa 1.2kb corrispondente alla origine di replicazione ectopica della Lamina B2 fu amplificato con la coppia di primer EcoLOri_fw e BaL2ori_rev che contengono rispettivamente i siti di riconoscimento della ricombinasi batterica CRE, LoxP e Lox2272. Il prodotto di PCR generato à ̈ caratterizzato dal 5' al 3’ dal sito di clonaggio EcoRI seguito dalla sequenza LoxP, dal sito Bglll, dalla sequenza della eLamB2-ori che termina con il sito Nrul, dalla sequenza Lox2272 e infine dal sito di clonaggio BamHI. Questo prodotto di amplificazione fu subclonato in pCRII-TOPO-TA cloning (Invitrogen), sequenziato e quindi il frammento EcoRI-BamHI fu clonato nei siti EcoRI e BamHI del plasmide pBKS-eLamB2-ori e denominato pL1eOriL2.
PRIMERS:
EcoLOriJw (SEQ ID NO: 15) 5’cggaattcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatagatctgagggactcgtcagtcctag-3’ BaL20ri_rev (SEQ ID NO: 16) 5’cgggatccataacttcgtataggatactttatacgaagttattcgcgacccttgccccgaacctcc-3'
pL1 FFeOriL2
Costrutto intermedio: Nel sito unico Bglll di pL1eOriL2 fu clonato il frammento di DNA, digerito con BamHI, ottenuto dall’appaiamento dei primer Bam-FRT_fw e Bam-FRT_rev. Questo inserto oltre ai due siti di clonaggio BamHI posti agli estremi, contiene due sequenze FRT, che sono i siti di riconoscimento della ricombinasi FLP, separati (procedendo dal 5’ al 3’) dai siti di restrizione Ndel, EcoRI e Bglll. Questo intermedio fu denominato pL1 FFeOriL2.
PRIMERS:
Bam-FRT_fw (SEQ ID NO: 17) 5’cgggatccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttccatatggaattccagatctgaagttcc-3’
Bam-FRT_rev (SEQ ID NO: 18) 5’cgggatccgaagttcctatactttctagagaataggaacttcagatctggaattcc-3’ DL1 FPuroFeOriL2
Costrutto intermedio:
Descrizione- Questa RMCE Cassetta 2 contiene tra i siti loxP e lox2272, la sequenza ectopica di 1.2kb dell'origine di replicazione della lamina B2 umana (eLamB2-ori) (Paixao et al., 2004) e l'unita' trascrizionale del gene Pac per la resistenza all’antibiotico Puromicina. L’unita' Pac e’ inoltre fiancheggiata alle estremità 5’ e 3’ dalle sequenze FRT. Questi siti permettono l’escissione dell’unita' Pac mediante ricombinazione sito-specifica (Flp-out).
Costruzione: Nei siti Ndel e Bglll di pL1 FFeOriL2 fu clonato il frammento Ndel-BamHI contenente l’unita’ trascrizionale Pac isolato dal vettore pPUR (BD Biosciences Clontech) (Figura 1 ).
pLI FpuroF.
Costrutto intermedio: Questo vettore fu derivato dal parentale pL1 FPuroFeOriL2 mediante digestione con Ndel e BamHI per espellere il frammento codificante la sequenza Ndel-BamH1 di 1.2kb eLamB2-ori e successivo clonaggio del frammento Ndel-BamHI ottenuto per appaiamento dei primer FRT_Lox2227_f e FRT_Lox2227_r. Questo inserto contiene dal 5’ al 3’ rispettivamente il sito di clonaggio Ndel, la sequenza FRT, i siti di restrizione Nrul e Bglll, la sequenza lox2272 e il sito di clonaggio BamHI.
PRIMERS:
FRT_Lox2227_f (SEQ ID NO: 19) 5’CATATGgaagttcctatactttctagagaataggaacttcTCGCGAAGATCTataacttcgtataaagtatc ctatacgaagttatGGATCC-3'
FRT_Lox2227_r (SEQ ID NO: 20)
5’GGATCCataacttcgtataggatactttatacgaagttatAGATCTTCGCGAgaagttcctattctctagaaa gtataggaacttcCATATG-3’
PCRI1-CDH1
Costrutto intermedio:
La sequenza della regione regolativa del gene umano Cdh1 , da noi denominata Cdh1-GSPE (vedi esempio 8, Cdh1-Gene Silencing Preventing Element), corrispondente ai nucleotidi 12929730-12931783 della sequenza NCBI Reference Sequence: NW_001 838290.1 fu amplificato da DNA genomico isolato da fibroblasti primari umani di derma mediante PCR con i primer CDH1_fw and CDH1_rev. Il prodotto di amplificazione fu clonato nel vettore commerciale pCRII-TOPO (Invitrogen) e sequenziato.
PRIMERS:
CDH1_fw (SEQ ID NO: 21 )
5'-tagtgagatcccctctctaga-3’
CDH1 _rev (SEQ ID NO: 22)
5’-tctggggtgggggaaaggtag-3’
pRMCE-eOri-CDH1
Costrutto intermedio:
Il vettore pBKS-eLamB2-ori (Paixao et al., 2004), fu dapprima digerito in Noti per espellere la regione della CpG island della eLamB2-ori e conservare la regione eLB2-core (sequenza 1-353). Il vettore pCRII-CDH1 fu usato come stampo con i primer Notl-CDH1_fw e Notl-CDH1 e il prodotto di PCR fu digerito con Noti e quindi clonato nel sito Noti di pBKS-eLamB2-ori, orientato e denominato peOri-Cdh1. Il vettore ricombinante peOri-Cdh1 fu quindi digerito BgllI e Sacl, appiattito con klenow (blunted) e l’inserto fu clonato nel sito Nrul del vettore pLI FpuroF e orientato.
Notl-CDH1_fw (SEQ ID NO: 23)
5’-ataagaatgcggccgctagtqagatcccctctctaq-3’
Notl-CDH1_rev (SEQ ID NO: 24)
5’-ataagaatgcggccgctcggcatctggggtgggggaaaggtag-3'
Esempio 3: Costruzione di vettori di espressione RMCE Casseta 2
NOTA:
I vettori denominati “entry vector" con il gene di interesse (per esempio EGFP) sono stati utilizzati secondo la procedura Gateway (Invitrogen) in combinazione con i vettori denominati “Destination vector†per generare i vettori finali.
pENTR-EGFP
vettore tipo entry vector:
II frammento BamHI-Notl del cDNA della EGFP fu isolato dal vettore commerciale pEGFP-N1 (GenBank Accession #U55762,Clontech) e clonato nei siti BamHI e Noti del vettore commerciale della serie “Gateway entry vector" pENTR- 11 .
pRMCE-RfA
destination vector:
Descrizione- Questa RMCE cassetta 2 di espressione à ̈ un “destination vector†secondo la procedura di clonaggio Gateway (Invitrogen). Esso contiene il promotore virale hCMVp seguito dalla cassetta di clonaggio Gateway RfA (Invitrogen).
Costruzione: Nel sito EcoRV del vettore pcDNA3 (Invitrogen) fu clonata la cassetta Gateway RfA per generare il vettore di destinazione Gateway pcDNA-RfA. Questo vettore fu usato come stampo con la coppia di primer hCMV-Bglll_fw e BGHpA-Bglll_rev per amplificare l’unità trascrizionale CMVp-RfA-BGHpolyA fiancheggiata dai siti Bglll. Il prodotto di amplificazione digerito in Bglll fu quindi clonato nel sito Bglll del vettore pL1 FPuroF e orientato generando il vettore finale pRMCE-RfA.
PRIMERS:
hCMV_Bglll_f (SEQ ID NO: 25)
5’-ggaAGATCTcgatgtacgggccagatatacgcg-3’
BGHpA_Bglll_r (SEQ ID NO: 26)
5TCTAGATCTtccccagcatgcctgctattgtct-3’
pRMCE-eOri-CDH1-RfA (SEQ ID NO: 36)
Destination vector:
Descrizione- Questa RMCE Cassetta 2 di espressione à ̈ un “destination vector compatibile con la tecnologia Gateway per il clonaggio di un qualsiasi gene di interesse clonato in un entry vector. Essa contiene il sito loxP seguito in orientamento opposto daH’unita’ trascrizionale del gene Pac che conferisce la resistenza all’antibiotico Puromicina. L’unita’ Pac e’ inoltre fiancheggiata alle estremità 5' e 3’ dalle sequenze FRT che sono i siti di riconoscimento per la ricombinasi FLP. Questi siti permettono l’escissione dell’unita’ Pac mediante ricombinazione sito-specifica (Flp-out). Al 3’ del sito FRT si trova l’elemento eLB2-core (bp 1-353) della sequenza ectopica di 1.2kb dell'origine di replicazione della lamina B2 umana (eLamB2-ori) (Paixao et al., 2004) seguito dalla sequenza CDH1 (Cdh1-GSPE). Al 3’ di questa sequenza à ̈ clonata l’unità trascrizionale di espressione del gene di interesse, che à ̈ costituita dal promotore hCMV, seguita dalla cassetta RfA di Gateway e dal sito di poliadenilazione BGHpA. Al 3' di essa à ̈ quindi inserito il sito lox2272, all'esterno dei siti lox sono presenti gli elementi genetici per la crescita del vettore in batterio.
Costruzione: Il frammento Bglll del vettore pRMCE-RfA contiene il promotore CMVp, il sito di poliadenilazione BGHpA e la sequenza RfA di Gateway clonata in mezzo. Questo inserto fu clonato nel sito Bglll del vettore pRMCE-eOri-CDH1 e orientato in modo che la sequenza eLB2-core-Cdh1-GSPE e il promotore del hCMV siano nello stesso orientamento 5’-3’
pRMCE-CDH1-RfA
Destination vector:
Descrizione- Questa RMCE Cassetta 2 di espressione à ̈ un “destination vector compatibile con la tecnologia Gateway per il clonaggio di un qualsiasi gene di interesse clonato in un entry vector.
Costruzione: Il frammento Noti isolato dal vettore pRMCEeOri-CDH1 contiene la sequenza Cdh1-GSPE priva della sequenza eLB2-core della 1.2kb eLamB2-ori. Le estremità Noti furono appiattite con klenow, il frammento fu clonato nel sito Nrul del vettore pRMCE-RfA e orientato. In conclusione, questo vettore ha la sequenza Cdh1-GSPE clonata al 5’ e nello stesso orientamento dell’unità trascrizionale del promotore CMVp.
pR4: pRMCE-GFP
Vettore finale:
Questa RMCE Cassetta 2 di espressione finale per il gene reporter EGFP fu costruito mediante la reazione di ricombinazione in vitro LR tra l'entry vector pENTR-EGFP e il destination vector pRMCE-RfA secondo la procedura Gateway (Invitrogen).
pR21: pRMCE- eLB2-core-Cdh1-GSPE-GFP
Vettore finale:
Questa RMCE Cassetta 2 di espressione finale per il gene reporter EGFP fu costruito mediante la reazione di ricombinazione in vitro LR tra l’entry vector pENTR-EGFP e il destination vector pRMCE-eOri-CDH1-RfA secondo la procedura Gateway (Invitrogen).
pR34: pRMCE- CDH1-GSPE-GFP
Vettore finale:
Questa RMCE Cassetta 2 di espressione finale per il gene reporter EGFP fu costruito mediante la reazione di ricombinazione in vitro LR tra l’entry vector pENTR-EGFP e il destination vector pRMCE-CDH1-RfA secondo la procedura Gateway (Invitrogen).
Esempio 4; Isolamento dei cloni parentali. 26.147 e 26.217, con la RMCE cassetta 1 stabilmente integrata nel genoma e ad elevata efficienza di RMCE.
Per identificare sequenze in grado di prevenire il silenziamento di transgeni di interesse biomedico, fu sviluppato un saggio di ricombinazione sito-specifica mediato dalla ricombinasi Cre basato su scambio per sostituzione di un vettore integrato nel genoma ospite (RMCE cassetta 1) con vettori plasmidici (RMCE cassetta 2) contenenti la sequenza di DNA di interesse (GOI). Questo saggio denominato Recombinase Mediated Cassette Exchange (RMCE) permette pertanto di confrontare l'efficienza di espressione di vari vettori plasmidici (RMCE cassetta 2) integrati in un sito cromatinico costante minimizzando l'effetto posizionale delle sequenze genomiche fiancheggianti. Allo scopo di derivare cloni parentali contenenti la cassetta RMCE1 che funge da piattaforma per lo scambio di vettori RMCE, cellule della linea umana HeLa, notoriamente conosciuta nel settore, furono trasfettate con il vettore RMCE Cassetta 1 , pL1 NeoTkL2, linearizzato in BamHI mediante una procedura nota nel settore basata sull’esposizione delle cellule a una miscela di DNA trasformante e liposomi (Lipofectamine2000 - Invitrogen). Queste cellule furono coltivate in terreno (da qui in seguito denominato terreno standard) D-MEM (DuIbecco’sModifiedEagle medium, Sigma-Aldrich) contenente 10% siero fetale bovino (Sigma-Aldrich), 4mM L-Glutamina e 80pg/ml gentamicina (Gentalyn, Schering-Plough) in atmosfera umidificata, al 5% di anidride carbonica e a 37°C e i cloni trasformati stabilmente furono selezionati in terreno standard contenente l’antibiotico G418 (400pg/ml Geneticin). I cloni positivi furono quindi saggiati mediante PCR per la presenza delle sequenze LoxP e Lox2272 con le coppie di primers rispettivamente:
NeoTk1_fw:CATGGTCCTGCTGGAGTTCG (SEQ ID NO:27);
LoxP_rev: GGTTTTT CG CCCTTT GACGTT G (SEQ ID NO: 28)
e
(NeoTk4_fw: GATCCCCAGGTAGGTACGTG (SEQ ID NO: 29);
Lox2_rev: CCATGGTGGCCTCGAGATAAC (SEQ ID NO: 30)).
Dai cloni positivi al test di PCR fu purificato il DNA ad alto peso molecolare, digerito con gli enzimi di restrizione EcoRI e Bglll, che tagliano una sola volta nel vettore e il DNA genomico fu quindi analizzato mediante la tecnica di Southern blot, ben nota nel settore. I cloni denominati 26.133, 26.147, 26.175, 26.179, 26.217 e 26.224, che mostrarono singole integrazioni del vettore RMCE 1 pL1 NeoTkL2, furono quindi saggiati in un test di efficienza di RMCE con il vettore RMCE cassetta 2, pR5, che contiene i siti LoxP e Lox2272 e che conferisce resistenza alla puromicina (Figura 2). Il vettore pR5 fu cotrasfettato in rapporto molare di 3:4 con il vettore pCre, che esprime transientemente la ricombinasi batterica Cre. Dopo 48 ore dalla trasfezione, le cellule furono seminate in terreno standard contenente 2.5pg/ml Puromicina e dopo 96 ore venne aggiunto al terreno selettivo il chemioterapico Ganciclovir (GCV) alla concentrazione di 25microM per controselezionare i cloni che non scambiarono le cassette. Dopo circa 2-3 settimane di selezione, i cloni ricombinanti furono fissati e colorati con Coomassie Brilliant Blu R250. I cloni parentali, 26.147, 26.217, mostrarono le migliori efficienze di RMCE con valori percentuali pari a circa il 90% e 60%, rispettivamente e il minore livello di background misurato come rapporto tra la efficienza di formazione di colonie (CFE) di cellule trasfettate in presenza rispetto a quelle in assenza di attività Cre. Per verificare a livello molecolare l’awenuto scambio di cassette, fu sviluppato un saggio di PCR che permette di amplificare esclusivamente il DNA ricombinato. Pertanto alcuni cloni trasfettati con pR5 vennero prelevati, espansi e da un’aliquota di cellule fu quindi estratto il DNA genomico ed utilizzato come DNA stampo in saggi di PCR con tre coppie di primer per verificare l'integrità ’ del vettore coinvolto nello scambio:
1- L’integrità della sequenza loxP nei ricombinanti venne saggiata con il primer set costituito da NeoTk1-fw (CATGGTCCTGCTGGAGTTCG: SEQ ID NO: 27) complementare ad una regione della RMCE cassetta 1 esterna ai siti lox e quindi non coinvolta nello scambio e dal primer Fpuro3-fw (AGGCCCACCGACTCTAGAGG SEQ ID NO: 31 ) complementare ad una sequenza del gene Pac (gene per la resistenza alla puromicina) che à ̈ comune a tutte le RMCE cassetta 2 saggiate. Pertanto in caso di evento positivo di RMCE questi primer consentono di amplificare un frammento di 405 bp.
2- Il secondo set di primer permette di verificare l'integrità ’ della sequenza nella regione del sito lox2272. Esso à ̈ costituito dal primer NeoTk2_rev ( 5 -CGGACACGCTGAACTTGTGG: SEQ ID NO: 32) che à ̈ complementare ad una sequenza della RMCE cassetta 1 esterna ai siti lox e dal primer attB2_fw (5 -CAGC I I I CTTGTACAAAGTGGT SEQ ID NO: 33) che à ̈ complementare ad una sequenza della RMCE cassetta 2. In alcuni casi, quest’ultimo primer venne sostituito da altri specifci per la RMCE cassetta 2 in analisi a seconda della sequenza clonata nel vettore.
3- La coppia di primer B48ll_dx\ (5’-G ACTGG AAACTTTTTT GT AC SEQ ID NO: 34) e B48_sx\ (5’-TAGCTACACTAGCCAGTGACCTTTTTCC SEQ ID NO: 35) amplifica una regione di 135 bp sulla regione “core†(bp 1-353) della eLamB2-ori (origine ectopica) e permette di verificare la presenza della cassetta 2 in singola copia per confronto di intensità ’ con il segnale della banda di 170 bp amplificata dalla sequenza della LamB2-ori (origine selvatica). In conclusione, i cloni parentali 26.147, 26.217, vennero quindi impiegati per gli esperimenti di RMCE descritti negli esempi successivi e la verifica molecolare di un evento di RMCE fu iterata per le varie RMCE cassette 2 coinvolte nello scambio.
Esempio 5: La sequenza core di 353bp della eLamB2-ori à ̈ sufficiente per innescare la replicazione.
Essendo il frammento di 1.2kb della el_amB2-ori attivo nel promuovere l'innesco della replicazione in quasi tutti i siti di integrazione, decidemmo di definire nel dettaglio la minima sequenza della LamB2-ori necessaria per l’innesco della replicazione generando un set di mutanti della 1.2kb eLamB2-ori. Per limitare l’effetto posizionale esercitato dalle sequenze fiancheggianti che nel caso di integrazione casuale cambiano da clone a clone, i mutanti furono integrati in siti costanti del genoma ospite mediante RMCE. A tale scopo, oltre al vettore pR5 contenente la sequenza ectopica 1.2kb eLamB2-ori, furono costruiti e saggiati due mutanti: 1- il vettore pR7 che à ̈ caratterizzato dalla sostituzione della sequenza eLB2-core di 353bp della 1.2kb eLamB2-ori con un frammento di eguale lunghezza isolato dalla regione di controllo B13 a replicazione passiva; e 2- il vettore pR8 caratterizzato dalla presenza del solo frammento eLB2-core (Figura 3).
Con metodi ben noti nel settore fu misurata l’abbondanza di DNA nascente (capacità d’innesco della replicazione) prodotto dalla regione dell’origine ectopica, la sequenza eLB2-core (vettore pR8) si dimostrò sufficiente ed essenziale per innescare la replicazione nel sito ectopico del clone ricevente 26.147 e 26.217. La sostituzione dieLB2-core con una sequenza di controllo B13 (vettore pR7) determinò lo spegnimento dell’attività di innesco della replicazione.
Pertanto la sequenza 1-353 della 1.2kb eLamB2-ori denominata eLB2-core (SEQ ID NO.1) costituisce il replicatore più piccolo ad oggi conosciuto nei mammiferi.
Esempio 6: L’origine di replicazione di 1.2kb della LaminB2 previene il silenziamento di un transgene ma à ̈ una funzione indipendente dalla sua capacità di innescare la replicazione.
E’ stato riportato in letteratura che negli eucarioti superiori le origini di replicazione attive in fase S precoce si trovano spesso associate a geni attivamente trascritti (Schwaiger and , 2006). Essendo la LamB2-ori, una origine attiva nei primi istanti della fase S e mantenendo la sua capacità di innesco della replicazione nella stragrande maggioranza dei siti ectopici del genoma ospite, noi ipotizzammo che la sequenza potesse esercitare un effetto dominante sulle sequenze fiancheggianti favorendo una struttura cromatinica aperta e permissiva alla trascrizione di geni adiacenti, pertanto questa sequenza fu clonata al 5’ di unità trascrizionali di geni di interesse.
Per verificare questa ipotesi, alcuni cloni derivati dai parentali 26.147 e 26.217, contenenti la RMCE cassetta 2, pR5, pR7 o pR8 descritti nell'esempio 5, furono analizzati per la capacità di esprimere il gene reporter Enhanced Green Fluorescence Protein (EGFP) che à ̈ posto sotto il controllo del potente promotore del citomegalovirus umano (CMVp). In questi vettori, il promotore à ̈ preceduto all’estremità 5’ dalla sequenza di 1 .2 kb della el_amB2-ori (pR5), dalla sola sequenza eLB2-core (pR8) o dalla sequenza 1 .2 kb della eLamB2-ori in cui l’elemento eLB2-core fu sostituito da una sequenza di controllo (B13) a replicazione passiva (pR7). Come controllo fu anche saggiato il vettore pR4 che contiene il solo promotore a guidare l’espressione della EGFP (Figura 4).
Dopo un mese di coltura dall’evento di trasfezione, cloni ricombinanti rappresentativi di ciascun vettore e derivati da ciascuna linea parentale 26.147 e 26.217 furono analizzati per l’espressione della EGFP mediante immunoblot, tecnica ben nota nel settore. Come controllo di caricamento di estratto, fu analizzato il livello di tubulina alpha. L’immunoblot con l’anticorpo anti-EGFP rivelò un segnale per la EGFP molto debole e/o al di sotto della soglia di sensibilità del saggio nella stragrande maggioranza dei cloni di controllo R4 sia nelle cellule riceventi 26.147 sia in quelle 26.217 indicando che il silenziamento del transgene EGFP posto sotto il controllo del promotore hCMVp à ̈ avvenuto in un tempo inferiore alle 4 settimane dalla trasfezione. Al contrario una forte espressione fu osservata, nei cloni R5 contenenti la sequenza selvatica della eLamB2-ori posta a monte del promotore in accordo a precedenti osservazioni (Fu et al., 2006). Nei cloni in cui la sequenza eLB2-core fu sostituita dalla sequenza a replicazione passiva, B13 (vettore pR7) l’espressione della EGFP fu osservata in tutti i cloni analizzati sebbene l’abbondanza della proteina fu mediamente minore rispetto a quanto osservato in R5 soprattutto nel ricevente 26.147. Nei cloni contenenti solo la sequenza eLB2-core a monte del CMVp (vettore R8), l’espressione della EGFP fu paragonabile ai cloni con il vettore di controllo R4, cioà ̈ molto debole o assente, indicando che il transgene fu silenziato. In conclusione questo risultato indicò: 1- che il replicatore eLB2-core non à ̈ in grado di prevenire il silenziamento genico; 2- che la porzione di CpG island del gene Timm13 presente nel frammento di 1.2kb e’ necessaria per prevenire il silenziamento genico; 3- che tuttavia esiste una cooperazione tra l’elemento essenziale per la replicazione, l’elemento eLB2-core, e la CpG island che verosimilmente contiene almeno un elemento essenziale per la prevenzione del silenziamento genico. Utilizzando vettori privi del promotore CMVp ma contenenti varie porzioni della eLamB2-ori sia in esperimenti di transattivazione transiente, sia mediante la formazione di cloni stabili fu possibile dimostrare che la sequenza deH’origine non contiene enhancer o promotori criptici in grado di supplire al ruolo del promotore hCMVp nel caso questi fosse silenziato (non mostrato).
Esempio 7: La sequenza di 1.2kb della eLamB2-ori ha un elemento insulator necessario per la prevenzione del silenziamento genico del transgene che à ̈ distinto dall’elemento richiesto per l'innesco della replicazione del DNA.
Un pannello di mutanti di delezione del frammento di 1.2 kb della lamB2-ori fu saggiato allo scopo di identificare l’elemento regolatore della cromatina nella sequenza della CpG island del gene Timm13 responsabile nella prevenzione del silenziamento genico. Dopo che ciascun vettore fu integrato mediante RMCE nei due siti di integrazione 26.147 e 26.217, almeno 5-6 cloni per vettore furono isolati, espansi per 30 giorni e i lisati vennero riuniti in un unico lisato rappresentativo di ciascun mutante. I lisati furono quindi frazionati su gel di poliacrilammide e l’espressione della proteina reporter EGFP fu analizzata mediante saggi di immunoblot (Figura 5). Il segnale per la EGFP fu ben visibile nel pool R5 e in misura più moderata anche nel pool R7 mentre fu molto debole o in al di sotto dei limiti di sensibilità del saggio nel pool R8, come atteso dal quadro di espressione effettuato sui singoli cloni di ciascun vettore. Similmente a R8, i mutanti R22 (bp 1-599) e R25 (bp 1-813) che estendono la sequenza eLB2-core nella regione 5’ della CpG island non mostrarono un significativo aumento dei livelli di EGFP. Diversamente, il pool dei cloni R26 (bp 1-1047), la cui sequenza si estende ulteriormente al 3’ nella CpG island di Timm13, mostrò un significativo aumento del segnale che raggiunse nel clone R38 (bp 1-1071) livelli paragonabili alla sequenza selvatica (R5). A conferma che l’elemento essenziale à ̈ localizzato nella sequenza 814-1071 furono effettuate le analisi sui mutanti di delezione della porzione 5’ della LamB2-ori. Il pool di cloni derivati dal vettore pR31 (bp 814-1166) mostrò un segnale paragonabile al pool dei cloni selvatici R5, mentre nel pool R32 (bp 1072-1166) il segnale fu paragonabile a R25. In conclusione questa analisi mutazionale evidenziò la sequenza 814-1071 come elemento regolatore della cromatina essenziale per la prevenzione del silenziamento del transgene.
L’insieme di questi dati dimostrò che l’elemento necessario all’innesco della replicazione (eLB2-core) à ̈ localizzato nella porzione 5’ della 1.2kb eLamB2-ori (bp 1-353) ed à ̈ separato da quello essenziale alla prevenzione del silenziamento che à ̈ localizzato nella CpG island (bp 814-1071). Inoltre, il confronto dei livelli di espressione di EGFP tra i cloni del pool R5 rispetto al pool R7, suggerì che la presenza dell'elemento replicatore eLB2-core sembra favorire una espressione più regolare e intensa del transgene probabilmente interagendo con la CpG island di eLamB2-ori.
L’analisi bioinformatica con lo strumento Matlnspector:
(http://www.genomatix.de/online_help/help_matinspector/matinspector_help.html) rivelò nella sequenza 814-1071 la presenza di putativi siti di legame per due proteine associate a sequenze insulator, CTCF e USF1. Inoltre la distribuzione di questi siti di legame sul DNA fu simile a quella osservata nell’insulator HS4 isolato nella regione della beta-globina di pollo (Wang et al., 2009). Mediante saggi di ChIP (Chromatinimmunoprecipitation) sulla cromatina isolata dai cloni contenenti i mutanti della eLamB2-ori descritti sopra, fu dimostrato il legame di CTCF e USF1 sulla sequenza 814-1071 (non mostrato). Queste evidenze dimostrarono che la sequenza 814-1071 della eLamB2-ori à ̈ un insulator element (LB2-IE), il quale à ̈ in grado di condizionare la struttura della cromatina locale e prevenire il silenziamento di un gene clonato nelle vicinanze.
Esempio 8. Una sequenza isolata dalla regione regolativa del gene umano CDH1 previene il silenziamento genico ed à ̈ potenziato dall'elemento eLB2-core.
Dagli esempi precedenti sono emerse due funzioni distinte della LamB2-ori associate a due regioni della sequenza: l’elemento eLB2-core necessario per l’innesco della replicazione; e l’elemento LB2-IE mappato nella regione della CpG island del gene Timm13, la cui funzione à ̈ necessaria per la prevenzione del silenziamento genico del transgene (esempio 7). L’effetto di prevenzione del silenziamento da parte di questo elemento sembrò essere potenziato dalla vicinanza della sequenza eLB2-core. Pertanto decidemmo di sostituire la CpG island di Timm13 con una sequenza regolativa isolata dal gene Cdh1 umano che codifica la e-caderina per verificare se la proprietà di prevenzione del silenziamento fosse attribuibile ad altre sequenze strutturalmente simili. La sequenza del gene Cdh1 corrispondente ai nucleotidi 12929730-12931783 della sequenza NCBI Reference Sequence: NW_001 838290.1 fu clonata e utilizzata per costruire un pannello di sequenze chimeriche con o senza l’elemento eLB2-core. La sequenza di 2054bp isolata dal gene Cdh1 contiene una porzione 5’ ricca in AT (1-876) seguita da una sequenza ricca in CG che à ̈ parte della CpG island (876-1842) di Cdh1 (Figura 6). La sequenza Cdh1 2054bp fu clonata tra eLB2-core e il 5’ del promotore CMVp per dare origine al vettore pR21. Furono inoltre generate altre cassette RMCE 2: la pR34 equivalente alla precedente pR21 ma priva della eLB2-core; la pR35 (bp 877-1842) con la regione ricca in CpG (bp877-1842) della sequenza di 2054bp Cdh1 ; la pR36 (bp1 342-1 842) e la pR37 (bp 877-1362) rispettivamente contenenti la porzione al 3’ e al 5’ della CpG island di Cdh1. Dopo 30 giorni di selezione, furono isolati 5 cloni per ogni costrutto mediante rìcombinazione sito-specifica nel ricevente 26.147 e gli estratti proteici furono risolti su gel di poliacrilammide (Figura 4.1 B). L’analisi di immunoblot rivelò una notevole espressione della proteina reporter EGFP nel pool R21 , la cui intensità fu maggiore di quella osservata in R5 e in R34. Questo dato indicò che: (1) la CpG island di eLamB2-ori (Timm13) à ̈ interscambiabile con la sequenza del gene Cdh1 ; (2) la presenza di eLB2-core potenzia significativamente l’espressione della proteina reporter rispetto all’espressione osservata con la Cdh1 (R34) da sola. L’analisi di delezione effettuata sulla CpG island di Cdh1 rivelò una sequenza essenziale per la prevenzione del silenziamento nella porzione 5’ (bp 877-1842) della CpG island. Questa osservazione fu confermata dall’analisi del pool R37 contenente il solo elemento di prevenzione del silenziamento di Cdh1 (bp 877-1842) che fu in grado di mantenere un’espressione della EGFP persino superiore all’elemento LB2-1E (R31). La sequenza di 2054bp (SEQ ID NO 3) isolata dal gene Cdh1 fu da qui in seguito denominata Cdh1-GSPE (Cdh1- Gene Silencing Preventing Element),
L’analisi bioinformatica (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks) che integra dati di ChIP sequencing, di caratterizzazione dello stato conformazionale della cromatina, di proteine leganti il DNA e di miRNA, evidenziò che l’elemento Cdh1-GSPE non rivela evidenti caratteristiche che possano ricondurre a sequenze con funzioni di insulator, LAD, MAR e UCOE descritte (non mostrato).
Esempio 9. La sequenza eLB2-core-Cdh1-GSPE esercita un potente effetto di prevenzione del silenziamento genico in colture a lungo termine senza pressione selettiva.
Il frammento di 1.2kb della LamB2-ori fu in grado di prevenire il silenziamento genico del promotore CMVp in cloni stabili coltivati in presenza di pressione selettiva per un periodo di almeno 6 mesi. Fu quindi investigata la capacità delle sequenze della LamB2-ori (pR5) e della eLB2-core-Cdh1-GSPE (pR21) di prevenire il silenziamento del gene reporter EGFP in condizioni di coltura a lungo termine per almeno tre mesi in terreno standard senza l'aggiunta dell’agente di selezione puromicina (Figura 7). L’analisi di almeno tre cloni per ciascun vettore integrato mediante RMCE nel genoma ospite, mostrò nei cloni R21 una fluorescenza costante e omogenea in tutte le cellule, inoltre nessuna perdita di segnale fu osservato persino dopo 3 mesi di coltura senza pressione selettiva. Al contrario le cellule R5 mostrarono un segnale disomogeneo nelle cellule coltivate in terreno con puromicina e la variegatura divenne notevole con una progressiva perdita di segnale per EGFP nel corso dei 3 mesi di coltura. Questo quadro di espressione per EGFP costante in R21 e, al contrario, di progressivo spegnimento in R5 dopo coltura a lungo termine senza antibiotico venne confermato anche con il saggio di immunoblot (Figura 7). La verifica dell'espressione di EGFP in cellule coltivate in assenza di pressione selettiva venne ripetuta sui cloni R21 e R5 e sulle rispettive varianti deprivate dell’elemento replicatore eLB2-core precisamente il vettore pR7 contenente la CpG island di Timm13 e il vettore pR34 con la sequenza Cdh1-GSPE (Figura 8).
NeH’immunoblot per l’espressione di EGFP, come atteso 5 dei 6 cloni R5 mostrarono una notevole riduzione della quantità di EGFP dopo 2 mesi di coltura senza pressione selettiva. La caduta di segnale fu persino più evidente nei cloni R7 (6 su 6). Come in precedenza nei cloni R21 la combinazione del replicatore LB2-core con Cdh1-GSPE favorì in tutti e 6 cloni analizzati una espressione costante, elevata e stabile nel tempo con una espressione equivalente al clone cresciuto in condizioni di pressione selettiva, mentre nei cloni R34, in cui la Cdh1 à ̈ priva di eLB2-core, l'espressione stabile ed equivalente al controllo della EGFP fu osservata in 3 cloni su 6 dopo 2 mesi di coltura in terreno standard. Il trattamento con l’inibitore delle deacetilasi TSA di un clone R5 e uno R7 coltivati per 2 mesi senza puromicina ripristinò i livelli di EGFP ai valori paragonabili al controllo dimostrando che la caduta di espressione fu causata da silenziamento trascrizionale e non dalla excisione del vettore dal genoma (Figura 8C).
In conclusione, la combinazione del replicatore di soli 353bp eLB2-core con la sequenza isolata dalla regione regolativa del gene Cdh1-GSPE (pR21) si rivelò molto potente e più elevata del replicatore eLamB2-ori (pR5) nel prevenire il silenziamento del transgene sia in condizioni di pressione selettiva sia in quelle deprivate di pressione selettiva.
La proprietà di prevenire il silenziamento genico del vettore pR21 e favorire un quadro di espressione omogeneo senza variegature fu osservata anche il altre cellule di mammifero tra cui CHO (Chinese Hamster Ovary) (Figura 9) e di maiale PK15 (non mostrato).
Dalla descrizione dettagliata e dagli Esempi sopra riportati, risultano evidenti i vantaggi conseguiti mediante il sistema della presente invenzione. In particolare, tale sistema si à ̈ mostrato sorprendentemente e vantaggiosamente adatto all’espressione di geni di interesse biomedico e biotecnologico.
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Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Vettore di espressione di derivazione plasmidica comprendente la sequenza di SEQ ID NO. 3 inserita al 5’ di un promotore.
- 2. Vettore secondo la rivendicazione 1, ulteriormente comprendente la sequenza dì SEQ ID NO. 1, preferibilmente inserita al 5’ della SEQ ID NO. 3.
- 3. Vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 2, ulteriormente comprendente un gene read-out, preferibilmente il gene EGFP, più preferibilmente il gene di SEQ ID NO. 5.
- 4. Vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, avente la sequenza di SEQ ID NO. 36, preferibilmente la SEQ ID NO.6.
- 5. Vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, per l’uso nei saggi di Recombinase Mediated Cassette Exchange (RMCE).
- 6. Uso secondo la rivendicazione 5, in cui viene ulteriormente impiegato il vettore avente la SEQ ID NO.7.
- 7. Vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, per l'uso nell’espressione e nella preparazione di un gene ricombinante.
- 8. Procedimento per la preparazione di un gene ricombinante comprendente la trasformazione in vitro di una cellula, con un vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4.
- 9. Procedimento secondo la rivendicazione 8, in cui detta cellula à ̈ una cellula staminale, o una cellula umana, preferibilmente una cellula HeLa o una cellula HEK293.
- 10. Procedimento secondo la rivendicazione 8, in cui detta cellula à ̈ una cellula di mammifero, preferibilmente scelta dal gruppo consistente in una cellula CHO e una cellula PK15 o una cellula di un animale transgenico.
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