ES2931180T3 - Sistema de tipo Tet-on lentivírico de promotor dual muy inducible - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a sistemas de expresión útiles para la expresión regulada de un gen de interés basado en la expresión constitutiva del represor TetR original y la expresión del polinucleótido impulsado por un promotor constitutivo ligado operativamente a una secuencia operadora para una secuencia operadora de tetraciclina. El sistema se puede proporcionar como dos polinucleótidos diferentes o como un vector todo en uno. La invención también se refiere a vectores, células huésped y partículas virales según la invención, así como a los usos de los mismos para la producción in vitro e in vivo de productos de interés o para terapia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Sistema de tipo TET-ON lentivírico de promotor dual muy inducible

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de expresión génica y, más en particular, a reactivos y métodos que permiten la expresión regulada de un gen de interés en una célula sin los requisitos de clonación celular y/o selección con antibiótico.

Antecedentes de la invención

Los sistemas de expresión génica inducibles basados en antibióticos u hormonas son herramientas de investigación potentes y se desarrollan constantemente para su uso en investigación básica y/o aplicación clínica. Entre los sistemas reguladores de genes transcripcionales inducibles existentes, el sistema regulable de rtTA es la herramienta más ampliamente explotada para controlar la expresión génica. Este sistema, descrito por primera vez en el documento WO9429442, se basa en un factor de transcripción quimérico que consiste en la fusión del represor tet bacteriano (TetR) con el dominio activador de la proteína vírica 16 (VP-16), que produce un transactivador sensible a tetraciclina (tTA). La mutagénesis aleatoria de tTA produjo la proteína rtTA (transactivador controlado por tetraciclina inverso) que, al contrario que tTA, requiere que la tetraciclina se una al tetO. El sistema basado en rtTA requiere la adición de tetraciclina para activar la transcripción (sistema TET-ON) al permitir la unión de rtTA al promotor TetO-CMV. Se han hecho varias mejoras del rtTA que mejoran la inducibilidad y reducen el fondo. Sin embargo, todos estos sistemas inducibles por tetraciclina requieren un transactivador dependiente de tetraciclina para activar el promotor regulado. El requisito de un transactivador para la actividad transcripcional tiene varias consecuencias indeseadas, en particular, el patrón de expresión endógena del promotor puede estar alterado debido a la activación de los promotores de los promotores regulados, la posible activación de genes celulares debido a la unión del transactivador a sitios pseudo-TetO y la toxicidad causada por la presencia de un dominio transactivador hacen estas proteínas muy tóxicas. De hecho, varios estudios han demostrado que los sistemas basados en rtTA pueden generar mala interpretación de los datos debido a la toxicidad del transactivador.

Un sistema regulado pordoxiciclina basado en el represor TetR original se desarrolló en 1998, por Yao y colaboradores (Hum Gene Ther 1998; 9: 1939-50). El tetR original no contiene ningún dominio de transactivación y se basa en bloquear la actividad de promotores endógenos. Estas características deben permitir el diseño de un casete de expresión inducible por Tet menos tóxico que mantenga las características endógenas de los promotores regulados y no transactive otros genes celulares. Se han obtenido buenos resultados usando diferentes sistemas de vectores para administración génica (Nghiem P. et al., Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 9092-7; Trapani JG y Korn SJ., BMC Neurosci 2003; 4: 15; Reeves PJ. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99: 13419-24; van de Wetering M. et al., EMBO Rep 2003; 4: 609-15 y Wiederschain D. et al. Cell Cycle 2009; 8: 498-504). Sin embargo, la mayoría de estos sistemas se basan en sistemas de dos vectores y son reproducibles solo si las células sensibles a doxiciclina se seleccionan o bien por clonación o por selección con antibiótico. Una de las razones para este requisito es las altas concentraciones de TetR requeridas para bloquear la actividad del promotor.

A pesar de las ventajas potenciales del sistema TetR sobre los equivalentes transactivadores, el desarrollo de sistemas de vectores regulables integrales basados en el represor TetR no se ha explorado en detalle. Yao et al. (The Journal of the American Society of Gen, 2006, 13 (6): 1133-1141) han descrito vectores integrales basados en herpesvirus simplex (HSV). El uso de vectores basados en HSV se ha enfocado en células neurales debido a su tropismo, su toxicidad y las dificultades para obtener vectores de alto título.

Ogueta y col. han descrito un vector lentivírico autorregulable sin los requisitos de selección con antibiótico (Mol Med 2001; 7: 569-79). Este vector autorregulable expresa el represor TetR mediante un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) localizados después del promotor CMVTetO2. Sin embargo, este sistema tiene varias desventajas potenciales que podrían limitar el uso del vector: 1- El represor TetR y el transgén regulado se expresan mediante el promotor CMVTetO. Por tanto, la concentración de TetR en estado estacionario requerida para bloquear la expresión de CMV siempre permitirá la expresión del transgén. 2- La eficacia del IRES (del EMCV) es especifica de tipo celular y esto puede llevar a la pérdida de la regulación de doxiciclina en células diana importantes.

Según esto, hay una necesidad en la técnica para vectores de transferencia de genes regulables que superen las desventajas de los vectores conocidos en el estado de la técnica.

Compendio de la invención

En un primer aspecto, la invención se refiere a un vector lentivírico que comprende un polinucleótido, en donde el polinucleótido comprende

(i) una secuencia reguladora transcripcional que comprende un primer promotor y al menos un sitio de unión para un represor transcripcional en donde dicho primer promotor y dicho sitio de unión para un represor transcripcional están organizados de modo que la unión del represor transcripcional a dicho sitio de unión inhibe la actividad transcripcional del promotor y

(ii) un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un represor transcripcional regulable bajo el control operativo de un segundo promotor en donde dicho represor transcripcional regulable es capaz de unirse específicamente al sitio de unión en la secuencia reguladora transcripcional en ausencia, pero no en presencia de un ligando del mismo,

en donde el primer promotor es el promotor inmediato temprano de citomegalovirus (CMV), en donde el sitio de unión para el represor transcripcional comprende una secuencia operadora TetO, en donde el represor transcripcional regulable es el represor de tetraciclina y en donde el segundo promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor de la repetición a largo plazo (LTR) del virus formador de focos esplénicos (SFFV) y el promotor del factor de elongación lalfa (EF1a).

En aspectos adicionales, la invención se refiere a una partícula lentivírica o célula huésped que comprende un vector lentivírico de la invención.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición o kit de partes que comprende el vector lentivírico de la invención y un ligando del represor transcripcional que, cuando se une al represor, produce el represor inactivo que ya no es capaz de unirse a su sitio de unión en la secuencia reguladora transcripcional.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para regular la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés que comprende las etapas de

(i) proporcionar una célula huésped que comprende un vector lentivírico de la invención,

(a) en donde el ácido nucleico de interés está operativamente ligado al primer promotor en dicho polinucleótido y

(ii) poner en contacto dicha célula huésped con un ligando para el represor transcripcional en donde dicho ligando es capaz de unirse al represor transcripcional produciendo un represor inactivo que se libera de su sitio de unión en la secuencia reguladora transcripcional permitiendo mediante ello la transcripción del ácido nucleico dirigida por el primer promotor.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un vector lentivírico, una célula huésped o una partícula lentivírica según la invención para uso en medicina. En un aspecto adicional, la invención se refiere a un vector lentivírico, una célula huésped o una partícula lentivírica según la invención para uso en el tratamiento de una enfermedad que requiere la expresión del polinucleótido bajo control operativo de la secuencia reguladora transcripcional.

Descripción de las figuras

Fig. 1. Sistema de dos vectores para la regulación eficaz por doxiciclina de transgenes usando el represor TetR. A) Mapas de los dos vectores lentivíricos requeridos para la regulación de transgenes dependiente de doxiciclina. El represor TetR se expresa mediante el promotor constitutivo SFFV, muy activo en la mayoría de los tipos celulares, incluyendo células hematopoyéticas. El segundo vector lentivírico contiene el promotor CMV-TetO sensible a doxiciclina (Yao et al 1998, Hum Gene Ther. 9: 1939-50) que dirige la expresión de eGFP. B) Generación de células 293T muy inducibles después de transducción de STetR y CTetOE. La adición de 100 ng/ml de doxiciclina fue suficiente para alcanzar expresión óptima de eGFP.

Fig. 2. Nivel de inducción de GFP usando vectores lentivíricos binarios. A) Se transdujeron células 293T de forma estable con cantidad creciente de vector lentivírico STetR. Se generaron diferentes líneas de células 293T que expresan TetR cada una porta una media de 0,2, 0,8, 2, 4 y 9 copias por células (c.c.) (indicado en la parte superior de la figura A). Cada una de estas líneas celulares 293T que expresan TetR se transdujeron posteriormente con cantidad creciente de vectores CTetOE (media de 0,5, 3, 6 y 10 c.c.) (indicado a la izquierda de la figura A). Los gráficos muestran la expresión de eGFP de las diferentes líneas celulares en ausencia (-Dox) o presencia (+Dox) de 1 |jg de doxiciclina. B. Gráfico que muestra el incremento en veces de inducción de células 293T transducidas después de la adición de 100 ng/ml de doxiciclina. Los mayores niveles de inducción se logran cuando las células contienen múltiples copias de vectores tanto StetR (7-9 copias) como como CTetOE (6-10 copias).

Fig. 3. Fácil generación de líneas celulares muy sensibles con el vector lentivírico controlable por doxiciclina integral CEST. A) Representación esquemática de CEST. El transgén eGFP se expresa de un promotor CMV-TetO sensible a tetraciclina y el represor TetR se expresa del promotor SFFV. B) Sensibilidad a doxiciclina de 293T que contienen diferentes cantidades de vector CEST copia por célula (0 (control), 0,4, 4 y 20 c.c como se indica en el lado izquierdo). Las diferentes líneas celulares se incubaron en ausencia de doxiciclina (-Dox), y con 0,001 jg/ml, 0,01 jg/m l y 0,1 jg/m l como se indica en la parte superior. La pérdida en ausencia de doxiciclina disminuye según aumenta el número de copia del vector (gráficos izquierdos de arriba a abajo). C) Inducción en veces (paneles izquierdos) y pérdida (paneles derechos) en 293T (paneles superiores) y células madre mesenquimatosas humanas (hMSC) (paneles inferiores) transducidas con MOI crecientes del vector CEST. Las copias medias del vector CEST por genoma de las diferentes líneas celulares analizadas se indican en la parte inferior de los gráficos. La mejor regulación en términos de mayor inducibilidad y menor pérdida se alcanza en las células que contienen el mayor número de vector CEST integrado.

Figura 4. Las células madre mesenquimatosas humanas (hMSC) sensibles a doxiciclina mantienen las principales propiedades de las hMSC parentales. A) Se generaron diferentes hMSC sensibles a doxiciclina con MOI crecientes del vector CEST para obtener una media de 0,1, 0,5 y 2 c.c. (indicado en la parte superior de la figura A). La expresión de diferentes marcadores de superficie se analizó por citometría de flujo y se comparó con la expresión por una hMSC parental (transducida control). B) Las hMSC que contienen 2 c.c. del vector CEST se analizaron adicionalmente para probar la influencia de la expresión del vector en el estado del ciclo celular. No se observaron diferencias significativas entre las hMSC parentales y las transducidas con CEST.

Figura 5. Desarrollo del CEETn. El CEETn (abajo) se construyó usando el vector CEST (arriba) como esqueleto. Se hicieron dos modificaciones: 1- Inclusión de una señal de localización nuclear al TetR (NLS2) y 2- Cambiar el promotor SFFV por el promotor Ef1alfa.

Figura 6. El CEETn modula eficazmente la expresión de transgenes a bajo número de copia. Nótese la baja pérdida (sin expresión de transgén en ausencia de doxiciclina) y buena inducibilidad después de la adición de doxiciclina en células madre mesenquimatosas (MSC) de ratón (paneles izquierdos) y humanas (gráficos medios), así como en células 293T.

Figura 7. El vector lentivírico CEETn modula la expresión de transgenes en poblaciones grandes de células madre embrionarias humanas (hESC). A) Gráficos de puntos que muestran la expresión de eGFP de hESC sin transducir (Control) y transducidas con CEETn (CEETn) con (+) y sin (-) doxiciclina 8, 22 y 50 días después de la transducción.

Descripción detallada de la invención

Vector lentivírico de la invención

Los autores de la presente invención han desarrollado un sistema lentivírico integral basado en TetR que genera de forma eficaz líneas celulares sensibles a doxiciclina sin los requisitos de clonación y/o selección con antibiótico. Este vector (vector CEST) genera de forma eficaz líneas celulares sensibles a doxiciclina humanas inmortalizadas y primarias. El vector CEST produce más de 10.000.000 tu/ml y una única transducción en células 293T fueron capaces de generar células muy sensibles. Esta sensibilidad era estable (mantenida durante un periodo de 8-10 pases), pero requería un mínimo de 2 copias del vector para alcanzar buena regulación. Por tanto, en un primer aspecto, la invención se refiere a un vector lentivírico que comprende un polinucleótido, en donde el polinucleótido comprende

(i) una secuencia reguladora transcripcional que comprende un primer promotor (CMV) y al menos un sitio de unión para un represor transcripcional, en donde dicho primer promotor y dicho sitio de unión para un represor transcripcional están organizados de modo que la unión del represor transcripcional a dicho sitio de unión inhibe la actividad transcripcional del promotor y

(ii) un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un represor transcripcional regulable bajo el control operativo de un segundo promotor, en donde dicha proteína represora transcripcional regulable es capaz de unirse específicamente al sitio de unión en la secuencia reguladora transcripcional en ausencia, pero no en presencia de un ligando del mismo,

en donde el primer promotor es el promotor inmediato temprano de citomegalovirus (CMV), en donde el sitio de unión para el represor transcripcional comprende una secuencia operadora TetO, en donde el represor transcripcional regulable es el represor de tetraciclina y en donde el segundo promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor de la repetición a largo plazo (LTR) del virus formador de focos esplénicos (SFFV) y el promotor del factor de elongación 1alga (EF1a).

Como se usa en el presente documento, los términos “polinucleótido” o “molécula de ácido nucleico” se pretende que incluyan moléculas de ADN {por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN {por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario. El ácido nucleico se puede sintetizar usando análogos o derivados de oligonucleótidos {por ejemplo, inosina o nucleótidos de fosforotioato). Tales oligonucleótidos se pueden usar, por ejemplo, para preparar ácidos nucleicos que tienen capacidades de emparejamiento de bases alteradas o resistencia aumentada a nucleasas.

Secuencia reguladora transcripcional

El primer componente del vector integral según la invención es una secuencia reguladora transcripcional. El término “secuencia reguladora transcripcional”, como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que es capaz de regir la expresión de otra secuencia de ácido nucleico operativamente ligada a la misma, tal como un gen de interés. La secuencia de control de transcripción, preferiblemente, es una secuencia de ADN. La secuencia de control transcripcional comprende un primer promotor y al menos un sitio de unión para un represor transcripcional, en donde dicho primer promotor y dicho sitio de unión para un represor transcripcional están organizados de modo que la unión del represor transcripcional a dicho sitio de unión inhibe la actividad transcripcional del promotor.

El término “promotor”, como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ADN que determina el sitio de inicio de la transcripción para una ARN polimerasa. Las secuencias promotoras comprenden motivos que son reconocidos y unidos por polipéptidos, es decir, factores de transcripción. Los dichos factores de transcripción tras la unión reclutarán ARN polimerasas II, preferiblemente, ARN polimerasa I, II o III, más preferiblemente ARN polimerasa II o III, y lo más preferiblemente, ARN polimerasa II. Mediante ello se iniciará la expresión de un ácido nucleico operativamente ligado a la secuencia de control de la transcripción. Se debe entender que dependiendo del tipo de ácido nucleico que se va a expresar, la expresión como se quiere decir en el presente documento puede comprender la transcripción de secuencias de ADN a polinucleótidos de ARN (adecuado para, por ejemplo, enfoques antisentido, enfoques de iARN o enfoques de ribozimas) o puede comprender la transcripción de secuencias de ADN a polinucleótidos de ARN seguido por la traducción de dichos polinucleótidos de ARN a polipéptidos (adecuado para, por ejemplo, enfoques de expresión génica y producción de polipéptidos recombinantes). Con el fin de regir la expresión de una secuencia de ácido nucleico, la secuencia de control de la transcripción puede estar localizada inmediatamente adyacente al ácido nucleico que se va a expresar, es decir, físicamente ligada al dicho ácido nucleico en su extremo 5'. Alternativamente, puede estar localizada en proximidad física. En el último caso, sin embargo, la secuencia debe estar localizada de modo que permita la interacción funcional con ácido nucleico que se va a expresar.

El primer promotor es el promotor inmediato temprano del citomegalovirus (CMV). El primer promotor es un promotor funcional en células de mamífero. El primer promotor es un promotor constitutivo de alto nivel. Los ejemplos de tales promotores, no parte de la invención, incluyen, sin limitación, el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous retrovírico (RSN) (opcionalmente con el potenciador RSV), el promotor del citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador CMV) [véase, por ejemplo, Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)], el promotor SN40, el promotor de dihrofolato reductasa, el promotor de beta-actina, el promotor beta-activo ligado al potenciador derivado del promotor inmediato temprano (IE) del citomegalovirus (CMN), el promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK), y el promotor de EF1a [Invitrogen]. Los promotores inducibles están regulados por compuestos suministrados exógenamente, incluyendo, el promotor de metalotioneína (MT) de oveja inducible por cinc, el promotor del virus del tumor mamario de ratón (MMTV) inducible por dexametasona (Dex), el sistema promotor de la polimerasa de T7 [documento WO 98/10088]; el promotor de insecto de ecdisona [No et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)], el sistema reprimible por tetraciclina [Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)], el sistema inducible por tetraciclina [Gossen et al, Science, 268:1766-1769 (1995); véase también Harvey et al, Curr. Opin. Chem. Biol, 2:512-518 (1998)], el sistema inducible por RU486 [Wang et al, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) y Wang et al, Gene Ther., 4:432-441 (1997)] y el sistema inducible por rapamicina [Magari et al, J Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)]. Otros tipos de promotores inducibles son los que están regulados por un estado fisiológico específico, por ejemplo, temperatura, fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula, o en células en replicación solo.

En otro aspecto, no parte de la invención, se usará el promotor nativo para el transgén. El promotor nativo puede ser preferido cuando se desea que la expresión del gen debe mimetizar la expresión nativa. El promotor nativo se puede usar cuando la expresión del gen se debe regular temporalmente o según el desarrollo, o de una manera específica de tejido, o en respuesta a estímulos transcripcionales específicos. En un aspecto adicional, otros elementos de control nativos, tal como elementos potenciadores, sitios de poliadenilación o secuencias consenso de Kozak también se pueden usar para mimetizar la expresión nativa. En otro aspecto, el producto del transgén u otro producto deseable que se va a expresar está operativamente ligado a un promotor específico de tejido. Por ejemplo, si se desea expresión en músculo esquelético, se debe usar un promotor activo en músculo. Estos incluyen los promotores de genes que codifican a-actina esquelética, cadena ligera de miosina 2A, distrofina, creatina quinasa de músculo, así como promotores de músculo sintéticos con actividades mayores que los promotores naturales [véase, Li et al., Nat. Biotech, 17:241-245 (1999)]. Se conocen ejemplos de promotores que son específicos de tejido para hígado [albúmina, Miyatake et al. J Virol, 71:5124-32 (1997); promotor nuclear del virus de la hepatitis B, Sandig et al, Gene Ther., 3:1002-9 (1996); y alfa-fetoproteína (AFP), Arbuthnot et al, Hum. Gene Ther, 7:1503-14 (1996)], hueso [osteocalcina, Stein et al, Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997); y sialoproteína de hueso, Chen et al, J Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)], linfocitos [CD2, Hansal et al., J Immunol, 161:1063-8 (1998); cadena pesada de la inmunoglobulina; cadena a del receptor de células T], neuronal [promotor de enolasa específica de neurona (NSE), Andersen et al. Cell. Mol. Neurobiol, 13:503-15 (1993); gen de la cadena ligera de neurofilamentos, Piccioli et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991); y el gen vgf específico de neuronas, Piccioli et al, Neuron 15:373-84 (1995)]; entre otros.

Preferiblemente, un promotor referido en el presente documento puede derivar del promotor mínimo del citomegalovirus (CMV) y, más preferiblemente, del CMV humano (hCMV) tal como el promotor mínimo derivado del promotor inmediato temprano de hCMV descrito en, por ejemplo, Gossen y Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89: 5547-5551). También se pueden usar promotores modificados, incluyendo mutación por inserción y deleción de promotores nativos y combinaciones o permutaciones de los mismos. Un ejemplo de un promotor modificado es el “promotor de CMV mínimo” descrito por Gossen y Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89: 5547-5551). En cualquier caso, cualquier promotor se puede ensayar fácilmente para su eficacia en el sistema de expresión sensible a tetraciclina descrito en el presente documento por sustitución por el promotor de CMV mínimo descrito en el presente documento. En una forma de realización preferida, el promotor mínimo de CMV comprende la secuencia (SEQ ID NO: 1):

1 GCCCCGTTGA CGCAAATGGG CGGTAGGCGT GTACGGTGGG AGGTCTATAT

51 AAGCAGAGCT C

En otra forma de realización, el promotor CMV comprende la secuencia (SEQ ID NO: 2):

1 GCCCCGTTGA CGCAAATGGG CGGTAGGCGT GTACGGTGGG AGGTCTATAT

51 AAGCAGAGCT CGTTTAGTGA ACCGTCAGAT C

Además, la región reguladora transcripcional presente en el polinucleótido de la invención puede comprender además secuencias adicionales que ayudan a regular la actividad del promotor, tal como secuencias potenciadoras. Potenciador en general se refiere a una secuencia de ADN que funciona a distancia no fijada desde el sitio de inicio de la transcripción y puede estar o bien 5' o 3' respecto a la unidad de transcripción. Además, los potenciadores pueden estar dentro de un intrón, así como dentro de la secuencia codificante misma. Habitualmente tienen entre 10 y 300 pares de bases de longitud, y funcionan en cis. Los potenciadores habitualmente funcionan para aumentar la transcripción de promotores cercanos. Los potenciadores también pueden contener elementos de respuesta que median la regulación de la transcripción. Mientras se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, fetoproteína, e insulina), típicamente se usará un potenciador de un virus de células eucariotas para expresión general. Los ejemplos preferidos son el potenciador de CMV, el potenciador de SV40, el potenciador del polioma y potenciadores de adenovirus. En una forma de realización preferida, los polinucleótidos de la invención comprenden el potenciador de CMV que tiene la secuencia (SEQ ID NO: 3).

1 G T T G A C A T T G A T T A T T G A C T A G T T A T T A A T A G T A A T C A A T T A C G G G G T C A T T A G T T C A T A

61 G C C C A T A T A T G G A G T T C C G C G T T A C A T A A C T T A C G G T A A A T G G C C C G C C T G G C T G A C C G C

1 21 C C A A C G A C C C C C G C C C A T T G A C G T C A A T A A T G A C G T A T G T T C C C A T A G T A A C G C C A A TA G

1 81 G G A C T T T C C A T T G A C G T C A A T G G G T G G A G T A T T T A C G G T A A A C T G C C C A C T T G G C A G T A C

2 4 1 A T C A A G T G T A T C A T A T G C C A A G T A C G C C C C C T A T T G A C G T C A A TG A C G G T A A A T G G C C C G

3 01 C C T G G C A T T A T G C C C A G T A C A T G A C C T T A T G G G A C T T T C C T A C T T G G C A G T A C A T C T A C G

3 6 1 T A T T A G T C A T C G C T A T T A C C A T G G T G A T G C G G T T T T G G C A G T A C A T C A A T G G G C G T G G A T

4 2 1 A G C G G T T T G A C T C A C G G G G A T T T C C A A G T C T C C A C C C C A T T G A C G T C A A T G G G A G T T T G T

4 8 1 T T T G G A A C C A A A A T C A A C G G G A C T T T C C A A A A T G T C G T A A C A A C T

Según esto, un promotor mínimo preferido que se va a usar para una secuencia de control de la transcripción según la presente invención tiene una secuencia de ácido nucleico como se muestra en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. Por supuesto, se entenderá que variantes del dicho promotor mínimo mostrado en SEQ ID NO: 1 que tienen una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 70 por ciento, al menos el 80 por ciento, al menos el 90 por ciento, al menos el 95 por ciento, al menos el 97 por ciento, al menos el 98 por ciento o al menos el 99 por ciento idéntica a la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1 o 2 o variantes que hibridan a las mismas, preferiblemente, en condiciones de hibridación rigurosas, también se contemplan por la presente invención siempre que las variantes retengan las propiedades de un promotor mínimo como se expone anteriormente.

El término “sitio de unión para un represor transcripcional” se refiere a una secuencia que es capaz de unirse específicamente a un represor transcripcional. El sitio de unión para un represor transcripcional es un motivo de la secuencia operadora tet. El término “motivo de secuencia operadora tet”, “operador tet”, o “tetO” como se usa en el presente documento se pretende que abarque todas las clases de secuencias operadoras tet. Preferiblemente se refiere a tetO(A), tetO (B), tetO (C), tetO (D), tetO (E), tetO (G), tetO (H), tetO(J) y tetO (Z). Las secuencias de nucleótidos de los represores Tet de miembros de las clases A, B, C, D, E, G, H, J y Z, y sus correspondientes secuencias operadoras tet se conocen bien en la técnica, véase, por ejemplo, Waters 1983, Nucl. Acids Res 11:6089-6105, Hillen 1983, Nucl. Acids Res. 11:525-539, Postle 1984, Nucl. Acids Res. 12:4849-4863, Unger 1984, Gene 31: 103-108, Unger 1984, Nucl Acids Res. 12:7693-7703 y Tovar 1988, MoI. Gen. Genet. 215:76-80. Las secuencias operadoras tet también se divulgan en el documento US 5.464.758.

Por tanto, la secuencia reguladora transcripcional para uso en el vector de la invención contiene suficientes secuencias operadoras tet para unirse a las secuencias tetR descritas posteriormente. En una forma de realización, las secuencias tetO incluyen al menos una copia de las secuencias O-1 y O-2 del tetO. En una forma de realización preferida, la secuencia operadora tet comprende al menos una copia de la secuencia de repetición invertida de 19 pb del operador O2 (hebra superior: 5-CCCTATCAGTGATAGAG-3') (SEQ ID NO:4). En otra forma de realización, el vector contiene múltiples copias de estas secuencias en organización en tándem, por ejemplo, una copia de la secuencia O-1 u O-2, seguida por otra copia de la secuencia O-1 u O-2. En una forma de realización preferida, la secuencia operadora tet comprende al menos dos copias de la secuencia de repetición invertida de 19 pb del operador O2 (hebra superior: 5'-CCCTATCAGTGATAGA GATCTCCCTATC AGTGATAGAG -3') (SEQ ID NO:5). En otra forma de realización, el vector contiene al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos 10 o más copias en tándem copies de las secuencias O-1 y/u O-2 en tándem. Sin embargo, un experto en la materia puede generar fácilmente un vector que contenga más de tres copias de estas secuencias tetO. Para una discusión de las secuencias operadoras tet, véase, por ejemplo, I. Kaffenberger, J Biol. Chem., 257:6805-6813 (1982); W. Hillen et al, J Mol. Biol, 172:185-201 (1984); G. Klock et al, J Bacteriology, 161:326-332 (1985); C. Kleinschmidt et al, Biochem., 27: 1094-1104 (1988), y más recientemente, P. Orth et al, Nature Struct. Biol., 7:215-219 (2000).

El primer promotor y el sitio de unión para un represor transcripcional están organizados de modo que la unión del represor transcripcional a dicho sitio de unión inhibe la actividad transcripcional del promotor. Típicamente, esto se puede alcanzar al colocar el sitio de unión para un represor transcripcional a una distancia adecuada de la caja TATA en el promotor de modo que el represor se une en el mismo lado de la hélice de ADN que la proteína de unión a TATA. Esto típicamente se logra cuando el sitio de unión para el represor transcripcional empieza en una posición entre 6 y 100 nucleótidos (y preferiblemente entre 6 y 24 nucleótidos) después del elemento TATA en la región del promotor. Por tanto, en una forma de realización preferida, el sitio de unión para un represor transcripcional está localizado después del primer promotor. La orientación relativa entre la región promotora y el sitio de unión para represor transcripcional, así como la distancia óptima entre ambas regiones con el fin de prevenir transcripción dirigida por el promotor cuando el represor transcripcional está unido al sitio de unión se puede determinar por experimentación de rutina usando un método descrito en el documento WO9900510. Según estos métodos, un plásmido que comprende un gen indicador bajo control operativo de un promotor y el sitio de unión para un represor transcripcional se introduce en una célula huésped y la actividad transcripcional del gen indicador se determina en una célula que expresa el represor transcripcional. Si la presencia en los polinucleótidos de un sitio de unión para un represor transcripcional inhibe la actividad transcripcional del promotor, se debe observar ninguna o mínima expresión del gen indicador. En el contexto de la presente invención, la expresión “que la unión del represor transcripcional a dicho sitio de unión inhibe la actividad transcripcional del promotor” se debe entender que la colocación de la unión del represor transcripcional en la vecindad del promotor produce al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 100% de inhibición en la transcripción de un gen operativamente ligado al promotor cuando se compara a la transcripción dirigida por el promotor en ausencia de un sitio de unión vecino para un represor transcripcional.

En una forma de realización preferida, la secuencia reguladora transcripcional según la invención comprende el promotor inmediato temprano del citomegalovirus humano (hCMV) y al menos una secuencia operadora tet localizada 3' con respecto a la caja TATA en el promotor CMV. En aún otra forma de realización, la secuencia reguladora transcripcional según la invención comprende el promotor inmediato temprano del citomegalovirus humano (hCMV) y dos secuencias operadoras tet en tándem localizadas 3' con respecto a la caja TATA en el promotor CMV. En una forma de realización aún más preferida, cada una de las secuencias operadoras tet tiene la secuencia CCCTATCAGTGATAGAG (SEQ ID NO:6). Una región reguladora de transcripción típica adecuada para uso en la presente invención que comprende el promotor inmediato temprano mínimo de hCMV y dos secuencias operadoras tet después del promotor se ha descrito en el documento WO9900510.

En aún otra forma de realización, la secuencia reguladora de transcripción según la invención comprende la secuencia (SEQ ID NO: 7)

1 GCCCCATTGA CGCAAATGGG CGGTAGGCGT GTACGGTGGG AGGTCTATAT

51 AAGCAGAGCT CTCCCTATCAGTGATAGA GATCTCCCTATC AGTGATAGAGA

en donde la región subrayada corresponde al promotor CMV y las regiones doblemente subrayadas corresponden a las secuencias operadoras Tet.

Casete de expresión

El segundo componente del vector integral según la invención es un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un represor transcripcional regulable bajo el control operativo de un segundo promotor en donde dicho represor transcripcional regulable es capaz de unirse específicamente al sitio de unión en la secuencia reguladora transcripcional en ausencia, pero no en presencia de un ligando de dicho represor, en donde el represor transcripcional regulable es el represor de tetraciclina, y en donde el segundo promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor de la repetición a largo plazo (LTR) del virus formador de focos esplénicos (SFFV) y el promotor del factor de elongación 1alfa (EF1a).

El término “casete de expresión” se refiere a una construcción de ácido nucleico, generada de forma recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados, que permite la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula diana.

El término “represor transcripcional regulable” se refiere a una molécula capaz de inhibir la expresión de un gen particular de un promotor de una manera regulable, es decir, que se puede “activar” o “desactivar” regulado por la presencia o ausencia de factores bióticos o abióticos. En efecto, la molécula “reprime” la expresión del gen de su promotor en presencia o ausencia de una molécula inductora determinada, que típicamente es un ligando de dicho represor. Por ejemplo, el represor tet es una proteína que reprime la transcripción génica del operón tet tras unión a sus secuencias operadoras tet afines en el promotor del operón en ausencia de un ligando afín (tetraciclina), pero no en presencia del ligando. Los ejemplos de represores inducibles incluyen; represores químicamente regulados, incluyendo represores cuya actividad transcripcional está regulada por la presencia o ausencia de alcohol, tetraciclina, esteroides, metal y otros compuestos; y represores físicamente regulados, incluyendo represores cuya actividad transcripcional está regulada por la presencia o ausencia de luz y bajas o altas temperaturas. Los ejemplos de represores químicamente inducibles pueden tener elementos sensibles a hormonas (HRE), elementos sensibles a metales (^m R^e ), elementos sensibles al choque térmico (HSRE), secuencia operadora de tetraciclina (TetO) y elementos sensibles a interferón (IRE).

El represor transcripcional regulable es un represor Tet. El término “represor Tet”, como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína natural o formas modificadas de la misma que combina alta afinidad por su secuencia de ADN afín (tetO) con inducción sensible por tetraciclina (tc) y específicamente los análogos más potentes doxiciclina (dox) y anhidrotetraciclina (ate). El represor Tet regula la transcripción de las secuencias operadoras tet en células procariotas en ausencia o presencia de tetraciclina. El regulador transcripcional dependiente de tetraciclina se une al operador tet en ausencia de tetraciclina o análogo de la misma (llamados “activadores transcripcionales dependientes de tetraciclina auténticos” o “tTA”) mientras en presencia de tetraciclina el represor no se une ya a las secuencias operadoras afines.

Los reguladores transcripcionales dependientes de tetraciclina preferidos que tienen dichas propiedades se divulgan en los documentos US5.464.758, US6.914.124, US5.789.156, US6.271.348, WO96/01313, o WO00/75347. Como se usa en el presente documento, “represión” de la transcripción se pretende que signifique una disminución en el nivel o cantidad de transcripción de una secuencia de ácido nucleico diana comparado con el nivel o cantidad de transcripción antes de la regulación por la proteína silenciadora transcripcional. La inhibición transcripcional puede ser parcial o completa.

El término “represor Tet” incluye represor de tipo salvaje y represores Tet mutados.

El término “represor Tet de tipo salvaje” se pretende que describa una proteína natural que reprime la transcripción de las secuencias operadoras Tet en células procariotas en ausencia de tetraciclina. El término se pretende que incluya represores de diferentes tipos de clase, tal como, pero no limitado a, TetR(A), TetR(B), TetR(C), TetR(D), TetR(E), TetR(G), TetR(H), TetR(J), y TerR(Z). A la luz del alto grado de conservación de secuencia (al menos el 80 por ciento) entre miembros de cada clase de represor Tet, un único miembro de cada clase de represor Tet se usa en el presente documento como representativo de la clase entera. Según esto, la enseñanza de la presente invención con respecto a un miembro específico de una clase de represor Tet es directamente aplicable a todos los miembros de esa clase.

Como se usa en el presente documento, la clase TetR(A) está representada por el represor Tet portado en el transposón Tn1721 (Allmeir et al. (1992) Gene 111: 11-20; Nc BI (Biblioteca Nacional de Medicina, Centro Nacional para Información Biotecnológica) número de registro X61367 y número de referencia cruzado de base de datos (Gl:) para la secuencia de proteína codificada GL48198).

La clase TetR(B) está representada por un represor Tet codificado por un determinante de resistencia a tetraciclina Tn1O (Postle et al. (1984) Nucleic Acids Research 12(12): 4849-63, No. de registro X00694, G 43052).

La clase TetR(C) está representada por el represor de tetraciclina del plásmido pSCIO1 (Brow et al. (1985) Mol. Biol. Evol 2(1): 1-12, No. de registro M36272, GL150496).

La clase TetR(D) está representada por el represor Tet identificado en Salmonella ordonez (Allard et al. (1993) Mol. Gen. Genet. 237: 301-5, No. de registro X65876, GL49075).

La clase TetR(E) está representada por un represor Tet aislado de un miembro de Enterobacteriaceae (Tovar et al. (1988) Mol Gen. Genet. 215(1): 76-80, No. de registro M34933, GI: 155020).

La clase TetR(G) está representada por un represor Tet identificado en Nibrio anguillarum (Zhao et al. (1992) Microbiol Immunol 36: 1051-60, No. de registro S52438, GT.262929).

La clase TetR(H) está representada por un Tet codificado por el plásmido pMN1 11 aislado de Pasteurella multocida (Hansen et al. (1993) Antimicrob. Agents. Chemother. 37(12): 2699-705, No. de registro U00792, G 392872).

La clase TetR(J) está representada por un represor Tet clonado de Proteus mirabilis (Magalhaes et al. (1998) Biochim. Biophys. Acta. 1443(1-2): 262-66, No. de registro AF038993, GL4104706).

La clase TetR(Z) está representada por un represor Tet codificado por el plásmido pAG1 aislado del organismo gram positivo Corynebacterium glutamicum (Tauch et al. (2000) Plasmid 44(3): 285-91, No. de registro AAD25064, G 4583400).

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de los represores Tet de las clases A, C, D y E se divulgan en Waters, S. H. et al. (1983) Nucl. Acids Res 11:6089-6105, Unger, B. et al. (1984) Gene 3: 103-108, Unger, B. et al. (1984) Nucl Acids Res. 12:7693-7703 y Tovar, K. et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 215:76-80, respectivamente. Estas secuencias de tipo salvaje se pueden mutar según las enseñanzas de la invención para uso en el sistema regulador inducible descrito en el presente documento.

El término “represor Tet mutado” se pretende que incluya polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es similar a un represor Tet de tipo salvaje, pero que deriva del represor de tipo salvaje por sustitución de uno o más aminoácidos, deleción de uno o más aminoácidos o adición de uno o más aminoácidos y que sustancialmente conserva su capacidad para interaccionar con las secuencias operadoras Tet en ausencia del análogo de tetraciclina. La capacidad de un represor Tet mutado para unirse a las secuencias operadoras Tet la puede determinar el experto en la materia por experimentación rutinaria proporcionando una célula que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia operadora Tet operativamente ligada a un gen indicador (por ejemplo, el represor Lac que controla la expresión de un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a fármaco). La unión del represor Tet mutado o variante a las secuencias operadoras tet en la célula huésped inhibirá la expresión del represor Lac en ausencia de tetraciclina, induciendo mediante ello la expresión del gen del marcador seleccionable. Las células que expresan el gen del marcador se seleccionan basado en el fenotipo seleccionable (por ejemplo, resistencia a fármaco).

El término “represor Tet mutado” incluye represores que confieren la capacidad del TetR específico inductor para unirse preferentemente a un cierto análogo de tetraciclina o tipo de análogo de tetraciclina. Un TetR modificado específico inductor tiene distinción de afinidad inductora entre análogos de tetraciclina, en donde el TetR modificado se une a ciertos análogos de tetraciclina, pero no a otros. Por ejemplo, el represor Tet mutado análogos de tetraciclina que carecen del agrupamiento 4-dma y no se une a tc o análogos de tc con un agrupamiento 4-dma.

Alternativo a las mutaciones descritas anteriormente, se pueden crear represores Tet mutados adecuados adicionales (por ejemplo, que tienen las propiedades funcionales deseadas descritas anteriormente) por mutagénesis de un represor Tet de tipo salvaje y selección como se describe en el documento US 5.789.156 (ejemplo 1). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de represores Tet de clase B de tipo salvaje se describen en Hillen, W. y Schollmeier, K. (1983) Nucl. Acids Res. 11:525-539 y Postle, K. et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:4849-4863. Las referencias para las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de represores tipo de las clases A, C, D y E de tipo salvaje se citan anteriormente. Un represor Tet mutado se puede crear y seleccionar, por ejemplo, como sigue: un ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que codifica un represor Tet de tipo salvaje se somete a mutagénesis aleatoria y los ácidos nucleicos mutados resultantes se incorporan a un vector de expresión y se introducen en una célula huésped para cribado. Se puede usar un ensayo de cribado, por ejemplo, que permite la selección de un represor Tet que se une a una secuencia operadora Tet solo en ausencia de un compuesto de tetraciclina sustituida. Por ejemplo, una genoteca de ácidos nucleicos mutados en un vector de expresión se puede introducir en una cepa de E. coli en la que las secuencias operadoras Tet controlan la expresión de un gen que codifica un represor Lac y el represor Lac controla la expresión de un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a fármaco). La unión del represor Tet a las secuencias operadoras Tet en las bacterias inhibirá la expresión del represor Lac, induciendo mediante ello la expresión del gen del marcador seleccionable. Las células que expresan el gen marcador se seleccionan basado en el fenotipo seleccionable (por ejemplo, resistencia a fármaco). Para represores Tet de tipo salvaje, la expresión del gen marcador seleccionable se producirá en ausencia de tetraciclina. Un ácido nucleico que codifica un represor Tet mutado se puede seleccionar usando este sistema basado en la capacidad del ácido nucleico de inducir expresión del gen marcador seleccionable en las bacterias solo en presencia de un compuesto de tetraciclina sustituida.

También están comprendidos en el ámbito de la presente invención “represor de tetraciclina quimérico” o “revTetR quimérico”. Como se usa en el presente documento, “represor de tetraciclina quimérico” se pretende que incluya polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos derivados de más de un tipo de represor de tetraciclina. El término se pretende que incluya represores de tetraciclina quiméricos construidos de diferentes tipos de clase, tal como, pero no limitado a, TetR(A), TetR(B), TetR(C), TetR(D), TetR(E), TetR(G), TetR(H), TetR(J), y TerR(Z). En ciertas formas de realización, los represores de tetraciclina quiméricos comprenden un dominio de unión a ADN amino-terminal y un dominio de unión a tetraciclina carboxi-terminal, incluyendo, pero no limitado a los correspondientes dominios de TetR(A), TetR(B), TetR(C), TetR(D), TetR(E), TetR(G), TetR(H), TetR(J), y TerR(Z). Tales represores de tetraciclina quiméricos comprenden además al menos una sustitución de aminoácido que confiere el fenotipo inverso. Un rev TetR quimérico retiene la especificidad de unión a ADN del dominio de unión a ADN de un represor Tet de tipo salvaje. Preferiblemente, este fenotipo inverso del rev TetR quimérico se muestra un eucariota.

El represor transcripcional usado en la presente invención puede además comprender una o más copias de una señal de localización nuclear. Como se usa en el presente documento, el término “señal de localización nuclear” significa una secuencia de aminoácidos que se sabe que, in vivo, dirige una proteína encontrada en el citoplasma de una célula a través de la membrana nuclear y al núcleo de la célula. Esto es particularmente útil en el caso de represores transcripcionales de origen bacteriano cuando se usan en células eucariotas ya que carecen de NLS naturales. Se conocen una variedad de señales de localización nuclear y la selección de una secuencia apropiada se puede hacer basado en las propiedades conocidas de estas varias secuencias. Las NLS representativas incluyen secuencias monopartitas tal como la del antígeno T grande de SV40 y el protooncogén c-myc. Las señales bipartitas se caracterizan como un grupo pequeño de residuos básicos colocados 10-12 residuos N-terminal respecto a una secuencia de tipo monopartito. Un ejemplo de una señal de localización nuclear bipartita es la de nucleoplasmina. En algunas formas de realización, una n Ls seleccionada de la siguiente lista se puede conjugar al oligonucleótido: antígeno T grande de SV40: PKKKRKV (SEQ ID NO: 8); Nucleoplasmina: KRPAAIKKAGQ AKKKK (SEQ ID NO: 9); CBP80: RRRHSDENDGGQPHKRRK (SEQ ID NO: 10); VIH-I Rev: RQARRNRRRWE (SEQ ID NO: 11); HTLV-I Rex: MPKTRRRPRRSQRKRPPT (SEQ ID NO: 12); hnRNP A: NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGP YGGGGQ YFAKPRNQGGY (SEQ ID NO: 13); c-myc PAAKRVKLD (SEQ ID NO: 14) y rpL23a: VHSHKKKKIRTSPTFTTPKTLRLRRQPKYPRKSAPRRNKLDHY (SEQ ID NO: 15). En una forma de realización de la invención, la señal de localización nuclear comprenden el motivo K(K/R)X(K/R) (SEQ ID NO: 16). En una forma de realización específica, la señal de localización nuclear es KRXR (SEQ ID NO: 17), en donde X es cualquier aminoácido.

La NLS puede estar presente en cualquier posición en el represor transcripcional, aunque está preferiblemente presente en el extremo C.

El represor transcripcional regulable está bajo el control operativo de un segundo promotor.

Los términos “bajo el control operativo” y “operativamente ligado” se usan en el presente documento de forma intercambiable para referirse a dos ácidos nucleicos están físicamente ligados o están funcionalmente ligados de modo que al menos uno de los ácidos nucleicos puede actuar sobre el otro ácido nucleico. La secuencia de control de transcripción de la presente invención y una secuencia de ácido nucleico que se va a expresar, por ejemplo, un gen de interés, están operativamente ligadas si la expresión de la secuencia de ácido nucleico puede estar regida por la dicha secuencia de control de transcripción. Según esto, la secuencia de control de transcripción y la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar pueden estar físicamente ligadas entre sí, por ejemplo, insertando la secuencia de control de transcripción en el extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. Alternativamente, la secuencia de control de transcripción y el ácido nucleico que se va a expresar pueden estar solamente en proximidad física de modo que la secuencia de control de transcripción esté funcionalmente ligada a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. La secuencia de control de transcripción y el ácido nucleico que se va a expresar están, preferiblemente, separadas por no más de 1.500 pb, 500 pb, 300 pb, 100 pb, 80 pb, 60 pb, 40 pb, 20 pb, 10 pb o 5 pb.

El término “promotor” se ha definido en detalle con respecto a la secuencia reguladora transcripcional del vector de la invención y habitualmente tiene el mismo significado en el contexto del casete de expresión. El segundo promotor es un promotor funcional en células de mamífero. En una forma de realización más preferida, el segundo promotor es el promotor de la repetición a largo plazo (SFFV LTR) del virus formador de focos esplénicos (SFFV) (de aquí en adelante promotor SFFV) como se describe por Joyner et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, 79: 1573-7). En otra forma de realización, el segundo promotor es el promotor de EF1a.

Secuencias adecuadas para expresar un gen de interés

Los polinucleótidos comprendidos en los vectores lentivíricos según la presente invención pueden además comprender regiones adecuadas para insertar un polinucleótido de interés de modo que dicho polinucleótido esté bajo el control operativo de la región reguladora transcripcional. En una forma de realización preferida, el polinucleótido comprendido en el vector lentivírico de la invención comprende un polienlazador después de la región reguladora transcripcional. Los términos “polienlazador” y “sitio múltiple de clonación” se usan en el presente documento de forma intercambiable para referirse a una región de ADN que contiene uno o más sitios de restricción comúnmente usados que permiten la inserción de un fragmento de ADN (por ejemplo, gen de interés) en la construcción de expresión.

Alternativamente, el polinucleótido comprendido en el vector lentivírico según la presente invención puede además comprender un polinucleótido de interés bajo control operativo de la región reguladora transcripcional. El experto en la materia apreciará que los polinucleótidos de interés para uso en los vectores lentivíricos según la presente invención dependerán del uso pretendido del vector. Los polinucleótidos particularmente preferidos incluyen genes indicadores, cuando los polinucleótidos se usan como herramientas de investigación o para fines de imagenología, polinucleótidos que codifican polipéptidos cuando los polinucleótidos se usan para terapia génica en enfermedades caracterizadas por una falta de función de dicho polipéptido y polinucleótidos que son capaces de silenciar la expresión de genes diana, adecuados en esos casos en donde los vectores lentivíricos según la invención se usan para el tratamiento de enfermedades asociadas con una expresión excesiva de un gen determinado, sea endógeno al organismo que se trata o heterólogo. Los ejemplos de polinucleótidos de interés que se pueden insertar después de la región reguladora transcripcional se proporcionan posteriormente en el contexto de los usos terapéuticos y no terapéuticos de los vectores lentivíricos de la invención.

El término “vector”, como se usa en el presente documento se pretende que incluya una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha ligado. El término “vector”, preferiblemente, abarca vectores fagos, plásmidos, víricos o retrovíricos, así como cromosomas artificiales, tal como cromosomas artificiales bacterianos o de levadura. Además, el término también se refiere a construcciones de direccionamiento que permiten la integración aleatoria o dirigida de la construcción de direccionamiento en ADN genómico. Tales construcciones de direccionamiento, preferiblemente, comprenden ADN de suficiente longitud para recombinación homóloga o integración heteróloga como se describe en detalle posteriormente. El vector lentivírico que abarca la secuencia de control de transcripción de la presente invención, preferiblemente, además comprende marcadores seleccionables para la propagación y/o selección en un huésped.

Un vector se puede caracterizar por uno o un pequeño número de sitios de endonucleasas de restricción en los que tales secuencias de ADN se pueden cortar de modo determinable sin la pérdida de una función biológica esencial del vector, y en la que un fragmento de ADN se puede cortar y empalmar con el fin de producir su replicación y clonación. Un vector puede además contener un marcador adecuado para uso en la identificación de células transformadas con el vector. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamíferos episómicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episómicos) se integran en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped y mediante ello se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están operativamente ligados. Tales vectores se denominan en el presente documento “vectores de expresión”. En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están con frecuencia en forma de plásmidos. En la presente especificación, “plásmido” y “vector” se pueden usar de forma intercambiable ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada. Sin embargo, otras formas de vectores de expresión, tal como vectores víricos (por ejemplo, retrovirus deficientes en replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que sirven funciones equivalentes, también se divulgan.

El vector lentivírico de la presente invención es un vector de expresión. Más preferiblemente, en el vector lentivírico de la invención, la secuencia de control de la transcripción está operativamente ligada a una secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. Tal ligamiento operativo, preferiblemente, permite la expresión de la dicha secuencia de ácido nucleico en células eucariotas o fracciones aisladas de las mismas. En principio, los elementos reguladores que aseguran la expresión en células eucariotas, preferiblemente células de mamífero, son bien conocidos en la técnica. Preferiblemente, comprenden secuencias reguladoras que aseguran el inicio de la transcripción comprendidas por la secuencia de control de la transcripción, así como señales poli-A que aseguran la terminación de la transcripción y estabilización del transcrito. Se pueden incluir elementos reguladores adicionales en el vector tal como potenciadores transcripcionales, así como de traducción. Se pueden usar métodos que conocen bien los expertos en la materia para construir vectores víricos recombinantes; véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y. y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994).

Los vectores lentivíricos son uno de los vectores más prometedores para transferencia de genes en células humanas primarias, son muy eficaces y no expresan ningún gen vírico que pudiera alterar la fisiología celular normal.

Como se usa en el presente documento, el término “ lentivirus” se refiere a un grupo (o género científico) de retrovirus que en la naturaleza dan lugar a enfermedad que se desarrolla lentamente debido a su capacidad para incorporarse en un genoma huésped. Los genomas lentivíricos modificados son útiles como vectores víricos para la administración de una secuencia de ácido nucleico a una célula. Una ventaja de los lentivirus para la infección de células es la capacidad para expresión de transgenes sostenida. Estos virus incluyen en particular, el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1), virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 2 (VIH-2), virus de inmunodeficiencia del simio (SIV), virus de inmunodeficiencia felina (FIV), virus de anemia infecciosa equina (EIAV), virus de inmunodeficiencia bovina (BIV), virus visna de oveja (VISNA) y virus de artritis-encefalitis caprina (CAEV). Los vectores lentivíricos se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Naldini et al., Science, 272(5259):263- 267, 1996; Zufferey et al., Nat Biotechnol, 15(9):871-875, 1997; Blomer et al., J Virol, 71(9):6641-6649, 1997; patentes en EE UU Nos. 6.013.516 y 5.994.136). Los vectores lentivíricos recombinantes son capaces de infectar células que no se dividen y se pueden usar para transferencia de genes y expresión tanto in vivo como ex vivo de secuencias de ácidos nucleicos. Por ejemplo, se describe un lentivirus recombinante capaz de infectar una célula que no se divide en donde una célula huésped adecuada se transfecta con dos o más vectores que portan las funciones de empaquetamiento, es decir, gag, pol y env, así como rev y tat en la patente en EE UU No. 5.994.136. Se puede dirigir el virus recombinante por ligación de la proteína de la envuelta con un anticuerpo o un ligando particular para dirigirse a un receptor de un tipo celular particular. Al insertar una secuencia (incluyendo una región reguladora) de interés en el vector vírico, junto con otro gen que codifica el ligando para un receptor en una célula diana específica, por ejemplo, el vector es ahora específico de diana. Los lentivirus recombinantes según la invención se pueden modificar genéticamente de tal modo que ciertos genes que constituyen el virus infeccioso nativo se eliminan y sustituyen con una secuencia de ácido nucleico de interés que se va a introducir en las células diana.

El vector lentivírico se puede integrar en el genoma de la célula huésped. El material genético así transferido se transcribe después y posiblemente se traduce a proteínas dentro de la célula huésped. Cuando el vector lentivírico es un vector lentivírico no integrativo, el vector está presente en formas episómicas. El vector lentivírico según la presente invención, además de la secuencia reguladora transcripcional y el casete de expresión como se describe anteriormente, puede además comprender elementos adicionales que ayudan a mejorar la expresión de los genes codificados en el vector.

- Regiones requeridas para la integración del vector en el genoma de la célula diana tal como las repeticiones terminales largas (LTR) que flanquean el vector integral definido en el presente documento. Por tanto, un vector lentivírico según la invención preferiblemente comprende una 5' LTR y una 3' LTR. “5' LTR” se refiere a una repetición terminal larga retrovírica o lentivírica 5', que puede o puede no estar modificada de su correspondiente 5' LTR nativa delecionando y/o mutando secuencias endógenas y/o añadiendo secuencias heterólogas. La 5' LTR puede ser natural o sintética. “3' LTR” se refiere a una repetición terminal larga retrovírica o lentivírica 3', que puede o puede no estar modificada de su correspondiente 3' LTR nativa (es decir, la que existe en el retrovirus de tipo salvaje) delecionando y/o mutando secuencias endógenas y/o añadiendo secuencias heterólogas. La 3' LTR puede ser natural o sintética.

- Una secuencia de encapsidación tal como la secuencia lentivírica psi (^y ),

- Secuencias que aumentan la exportación nuclear de ARN, ventajosa durante la producción, tal como la secuencia que comprende la secuencia del elemento de respuesta a REV (RRE) de VIH-1. Otra secuencia, utilizable en el contexto de la presente invención, que aumenta la exportación nuclear de ARN, es la secuencia CTE (Oh et al, 2007, Retrovirology. 5 de junio 2007;4:38.). Estas secuencias también son útiles para determinar el número de copias de los vectores lentivíricos integrados.

- Secuencias que aumentan la importación nuclear del ADN vírico transcrito, tal como la secuencia cPPT CTS (flap) lentivírica de VIH-1. Otras secuencias, utilizables en el contexto de la presente invención, que aumentan la importación nuclear del ADN vírico transcrito son secuencias cPPT CTS lentivíricas de VIH-2, SIV, FIV, EIAV, BIV, VISNA y CAEV.

- Se pueden seleccionar elementos de regulación postranscripcional del elemento sensible del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE), región APP UTR5' y TAU UTR3'.

- Una o más secuencias aisladoras seleccionadas del grupo que consiste en, por ejemplo, secuencias MAR, SAR, S/MAR, scs y scs'.

- Elementos reguladores transcripcionales adicionales: estas son regiones que ayudan a mejorar la expresión de los genes codificados en el vector. En particular, el vector puede incorporar el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE) en la región 3' no traducida (Paterna et al., 2000, Gene Ther. 7: 1304-1311).

En otra forma de realización, el vector lentivírico es otra forma vector autoinactivador (SIN) como resultado de una deleción en la región de la repetición terminal larga (LTR) 3'. Preferiblemente, el vector contiene una deleción en el promotor vírico. La LTR de lentivirus tal como la LTR de VIH contiene un promotor vírico. Aunque este promotor es relativamente ineficaz, cuando se transactiva mediante, por ejemplo, tat, el promotor es eficaz porque la transactivación mediada por tat aumenta la velocidad de transcripción aproximadamente 100 veces. Sin embargo, la presencia del promotor vírico puede interferir con promotores heterólogos operativamente ligados a un transgén. Para minimizar tal interferencia y regular mejor la expresión de transgenes, el promotor lentivírico se puede delecionar.

En una forma de realización particular, el vector lentivírico comprende, en la orientación 5' a 3':

- La 5' LTR (de tipo salvaje o modificada)

- Un elemento de respuesta de Rev (RRE)

- Un tramo de c polipurina (cPPT)

- La región reguladora transcripcional

- Un polinucleótido de interés

- El casete de expresión

- El elemento de regulación transcripcional WPRE y

- La 3' LTR

Células huéspedes y partículas víricas

En otra forma de realización, la invención se refiere a una célula huésped que comprende un vector lentivírico según la presente invención. Como se usa en el presente documento, una “célula huésped” incluye cualquier célula cultivable que se puede modificar por la introducción de ADN heterólogo. Preferiblemente, una célula huésped es una en la que el represor transcripcional codificado por el polinucleótido de la invención se puede expresar establemente, modificar postraduccionalmente, localizar al compartimento subcelular apropiado, y hacer emplear la maquinaria de transcripción apropiada. La elección de una célula huésped apropiada también estará influida por la elección de señal de detección. Por ejemplo, construcciones indicadoras, como se describe posteriormente, pueden proporcionar un rasgo seleccionable o cribable tras activación o inhibición de la transcripción génica en respuesta a una proteína reguladora transcripcional; con el fin de lograr selección óptima o cribado, se considerará el fenotipo de la célula huésped. Una célula huésped de la presente invención incluye células procariotas y células eucariotas. Procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli, o bacilos. Se debe entender que las células procariotas se usarán, preferiblemente, para la propagación de los polinucleótidos que comprenden la secuencia de control de transcripción o el vector de la presente invención. Las células huéspedes procariotas adecuadas para transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y varias otras especies en los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus. Las células eucariotas incluyen, pero no están limitadas a, células de levadura, células vegetales, células fúngicas, células de insecto (por ejemplo, baculovirus), células de mamífero y las células de organismos parasíticos, por ejemplo, tripanosomas. Como se usa en el presente documento, levadura incluye no solo levadura en un sentido taxonómico estricto, es decir, organismos unicelulares, sino también hongos multicelulares de tipo levadura de hongos filamentosos. Las especies ejemplares incluyen Kluyverei lactis, Schizosaccharomyces pombe, y Ustilaqo maydis, siendo preferida Saccharomyces cerevisiae. Otras levaduras que se pueden usar en practicar la presente invención son Neurospora crassa, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Pichia pastoris, Candida tropicalis, y Hansenula polymorpha. Los sistemas de cultivo de células huéspedes de mamífero incluyen líneas celulares establecidas tal como células COS, células L, células 3T3, células de ovario de hámster chino (CHO), células madre embrionarias, siendo preferidas células BHK, HeK o HeLa. Las células eucariotas preferiblemente se usan para expresión génica recombinante aplicando la secuencia de control de transcripción o el vector de expresión de la presente invención.

La célula huésped de la invención se puede obtener poniendo en contacto una célula con un vector de la invención en condiciones adecuadas para la incorporación del vector en una célula huésped. El vector se puede incorporar en una célula huésped por varios métodos bien conocidos en la técnica. Los métodos adecuados para la administración de ácidos nucleicos para transformación de una célula, un tejido o un organismo para uso con la invención actual se cree que incluyen virtualmente cualquier método por el que un ácido nucleico (por ejemplo, ADN) se puede introducir en una célula, un tejido o un organismo, como se describe en el presente documento o como sabría un experto en la materia. Tales métodos incluyen, pero no están limitados a, administración directa de ADN tal como por transfección ex vivo (Wilson et al., Science, 244:1344-1346, 1989, Nabel y Baltimore, Nature 326:711-713, 1987), opcionalmente con Fugen (Roche) o Lipofectamine (Invitrogen), por inyección (patentes en EE UU Nos. 5.994.624, 5.981.274, 5.945.100, 5.780.448, 5.736.524, 5.702.932, 5.656.610, 5.589.466 y 5.580.859, incluyendo microinyección (Harland y Weintraub, J. Cell Biol, 101: 1094-1099, 1985; patente en EE UU No. 5.789.215; por electroporación (patente en ^e E UU No. 5.384.253, Tur-Kaspa et al., MoI. Cell Biol, 6:716-718, 1986; Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, 1984); por precipitación con fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973; Chen y Okayama, Mol Cell Biol, 7(8):2745- 2752, 1987; Rippe et al., Mol. Cell Biol, 10:689-695, 1990); usando DEAE-dextrano seguido por polietilenglicol (Gopal, Mol. Cell Biol, 5: 1188-1190, 1985); por carga sónica directa (Fechheimer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:8463-8467, 1987); por transfección mediada por liposomas (Nicolau y Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982; Fraley et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979; Nicolau et al., Methods Enzymol, 149: 157176, 1987; Wong et al., Gene, 10:87-94, 1980; Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989; Kato et al., J Biol Chem., 266:3361-3364, 1991) y transfección mediada por receptor (Wu y Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; Wu y Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432, 1987)); y cualquier combinación de tales métodos.

En el caso particular donde el vector según la invención sea un vector lentivírico integrativo, después la célula huésped es capaz de integrar una o más copias de dicho vector en el genoma. El nivel de expresión del represor transcripcional dependerá de la potencia del promotor al que está operativamente ligado y del número de copias del vector en la célula huésped. Como se muestra en la presente invención, una buena inducibilidad y baja pérdida en la expresión del polinucleótido de interés, las células preferiblemente contienen al menos 2 copias del vector integrado. Además, la sensibilidad máxima se puede alcanzar cuando las células tienen una media de 4 copias de vector del vector. Sin embargo, en esos casos en donde el segundo promotor es un promotor débil, entonces se puede requerir un mayor número de copias del vector por genoma con el fin de alcanzar buena inducibilidad, baja pérdida y máxima sensibilidad. En formas de realización preferidas, la célula huésped según la invención contiene al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 y al menos 10 copias del polinucleótido de la invención integrado en el genoma. En una forma de realización aún más preferida, la célula huésped según la invención contiene entre 2 y 4 copias del vector de la invención integradas en el genoma. El vector contiene, preferiblemente, el promotor SFFV como segundo promotor.

En otra forma de realización, la invención se refiere a una partícula lentivírica que comprende el polinucleótido de la invención. El término “partícula lentivírica”, se refiere a un lentivirus recombinante que porta al menos un gen o secuencia de nucleótidos de interés, que en general está flanqueada por LTR lentivíricas. El lentivirus también puede contener un marcador seleccionable. El lentivirus recombinante es capaz de transcribir inversamente su material genético a ADN e incorporar su material genético al ADN de una célula huésped tras la infección. Los componentes de la partícula se pueden modificar con respecto al lentivirus de tipo salvaje. Por ejemplo, las proteínas Env en la cubierta proteinacea de la partícula se pueden modificar genéticamente con el fin de alterar su especificidad de direccionamiento o alcanzar alguna otra función deseada.

Las partículas lentivíricas según la invención se pueden obtener poniendo en contacto una célula empaquetadora adecuada con un vector lentivírico según la invención y con uno o más virus auxiliares transcomplementarios que comprenden los genes lentivíricos necesarios para el empaquetamiento del vector lentivírico en cápsides de vector. En una forma de realización preferida, las partículas lentivíricas se obtienen usando dos plásmidos auxiliares. Un primer plásmido para transcomplementación proporciona un ácido nucleico que codifica los productos proteicos de los genes lentivíricos gag y pol y que carece de secuencia de encapsidación, de secuencia que codifica una envuelta y, ventajosamente, también carece de LTR lentivíricas (el plásmido de empaquetamiento). Como resultado, las secuencias que codifican las proteínas gag y pol están ventajosamente colocadas bajo el control de un promotor heterólogo, por ejemplo, un promotor vírico, celular, etc., que puede ser constitutivo o regulado, débil o fuerte. Este plásmido permite la expresión de todas las proteínas necesarias para la formación de viriones vacíos, excepto las glucoproteínas de la envuelta. Se entiende que los genes gag y pol pueden ser portados por diferentes plásmidos. Un tercer plásmido proporciona un ácido nucleico que permite la producción de la glucoproteína de la envuelta (env) elegida (el plásmido de la envuelta). Este vector preferentemente carece de todas las secuencias lentivíricas.

Ventajosamente, los tres vectores usados no contienen ninguna secuencia homóloga suficiente para permitir una recombinación. Los ácidos nucleicos que codifican gag, pol y env pueden ser ventajosamente ADNc preparados según técnicas convencionales, de secuencias de los genes víricos disponibles en el estado de la técnica y en bases de datos.

Para la producción de los lentivirus no replicativos, los vectores descritos anteriormente se introducen en células competentes y los virus producidos se recogen. Las células usadas pueden ser cualquier célula competente, preferiblemente célula de mamífero, por ejemplo, célula animal o humana, que no sea patogénica. Se puede hacer mención, por ejemplo, de células 293, células embrionarias, fibroblastos, células musculares, etc.

Un método preferido para preparar un lentivirus recombinante no replicativo, según la invención, comprende transfectar una población de células competentes con una combinación de vectores (dos vectores, tres vectores o más de tres vectores) como se describe anteriormente, y recuperar los virus así producidos.

Los lentivirus de la invención también se pueden preparar, como se ha explicado previamente, a partir de una línea celular de encapsidación que produce una o más proteínas gag, pol y env.

Composiciones o kits de partes

Aunque el vector lentivírico de la invención se usa como un integral de vector puesto que permite la generación en una etapa de las líneas celulares primarias sensibles y estrategias de terapia génica, sistemas de vectores en donde los diferentes elementos del vector integral (la secuencia reguladora transcripcional y el casete de expresión) se proporcionan en diferentes polinucleótidos también se divulgan. Por tanto, en otro aspecto, la divulgación se refiere a una composición o kits de partes que comprende

(i) un primer polinucleótido que comprende una secuencia reguladora transcripcional que comprende un primer promotor y al menos un sitio de unión para un represor transcripcional en donde dicho primer promotor y dicho sitio de unión están organizados de modo que la unión del represor transcripcional a dicho sitio de unión inhibe la actividad transcripcional del promotor y

(ii) un segundo polinucleótido que comprende un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un represor transcripcional regulable bajo el control operativo de un segundo promotor en donde dicho represor transcripcional regulable es capaz de unirse específicamente al sitio de unión en la secuencia reguladora transcripcional en ausencia, pero no en presencia de un ligando del mismo

El kit se puede usar para regular la expresión de un gen de interés (es decir, una secuencia de nucleótidos de interés que se va a transcribir) que se puede clonar bajo el control operativo de la unidad reguladora de transcripción. Alternativamente, células eucariotas que tienen ácido nucleico que codifica un transactivador y/o proteína de fusión inhibidora establemente incorporado en las mismas, de modo que el transactivador y/o proteína de fusión inhibidora se expresan en la célula eucariota, se pueden proporcionar en el kit.

El término “kit” como se usa en el presente documento se refiere a una colección de los compuestos anteriormente mencionados, medios o reactivos de la presente invención que pueden o no estar embalados juntos. Los componentes del kit pueden estar comprendidos en viales separados (es decir, como un kit de partes separadas) o proporcionados en un único vial. Además, se debe entender que el kit de la presente invención se va a usar para practicar los métodos a que se hace referencia en el presente documento anteriormente. Preferiblemente, se prevé que todos los componentes se proporcionen de una manera lista para usar para practicar los métodos a que se hace referencia anteriormente. Además, el kit preferiblemente contiene instrucciones para llevar a cabo los dichos métodos. Las instrucciones se pueden proporcionar mediante un manual de usuarios en papel o forma electrónica. Por ejemplo, el manual puede comprender instrucciones para interpretar los resultados obtenidos cuando se llevan a cabo los métodos anteriormente mencionados usando el kit de la presente divulgación.

En un aspecto, el kit incluye un medio soporte que tienen en confinamiento cerrado en el mismo al menos dos medios de contención: un primer medio de contención que contiene el polinucleótido que comprende la secuencia transcripcional regulable y un segundo medio de contención que contiene el casete de expresión. El primer polinucleótido típicamente comprende un sitio de clonación para la introducción de una secuencia de nucleótidos que se va a transcribir (que opcionalmente incluye una secuencia promotora mínima operativamente ligada) y al menos una secuencia operadora tet operativamente ligada. El término “sitio de clonación” se pretende que abarque al menos un sitio de endonucleasa de restricción. Típicamente, múltiples sitios de endonucleasas de restricción diferentes (por ejemplo, un polienlazador) están contenidos en el ácido nucleico.

Los términos “polinucleótido”, “secuencia reguladora transcripcional”, “promotor”, “sitio de unión para un represor transcripcional”, “casete de expresión”, y “represor transcripcional regulable” y “control operativo” se han descrito en detalle en el contexto del polinucleótido de la invención y se usan con el mismo significado en el contexto de la composición o kit de partes de la divulgación.

En un aspecto preferido, el primer y el segundo promotor son promotores diferentes. El primer promotor es el promotor inmediato temprano de CMV. En otro aspecto, el sitio de unión para un represor transcripcional es un sitio de unión para el represor de tetraciclina y en donde el represor transcripcional regulable es el represor de tetraciclina. El sitio de unión para el represor de tetraciclina es una secuencia operadora TetO. En otro aspecto, el sitio de unión para el represor transcripcional está después del primer promotor. En otro aspecto, el segundo promotor es el promotor SFFV. En aún otro aspecto, la composición o kit de partes de la divulgación además comprende un polinucleótido de interés bajo control operativo de la secuencia reguladora transcripcional. Los polinucleótidos de interés adecuados se definen posteriormente en el contexto de los usos de las composiciones y kits de partes de la divulgación. En otro aspecto, el primer y/o el segundo promotor se proporcionan formando parte de un vector. El vector es un vector lentivírico. En aún otro aspecto, el vector lentivírico es un vector lentivírico integrativo. Los términos “vector”, “vector lentivírico” y “vector lentivírico integrativo” se han descrito en detalle anteriormente con respecto al vector lentivírico de la invención.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición o kit de partes que comprende el vector lentivírico de la invención y un ligando del represor transcripcional que, cuando se une al represor, produce el represor inactivo que ya no es capaz de unirse a su sitio de unión en la secuencia reguladora transcripcional. El represor transcripcional es un represor de tetraciclina y el ligando es tetraciclina o un análogo de tetraciclina. Como se usa en el presente documento, “análogo de tetraciclina” se pretende que incluya compuestos que están estructuralmente relacionados con tetraciclina y que se unen al represor Tet al que se hace referencia en el presente documento posteriormente con un IQ de al menos 10-6 M. Preferiblemente, el análogo de tetraciclina se une con una afinidad de aproximadamente 10-9 M o mayor. Los análogos de tetraciclina preferidos son anhidrotetraciclina (ate), doxiciclina (dox), clorotetraciclina, oxitetraciclina, o desoxitetraciclina. Se divulgan análogos adicionales por Hlavka y Boothe, "The Tetracyclines," en Handbook of Experimental Pharmacology 78, R. K. Blackwood et al. (eds.), Springer-Verlag, Berlin, N.Y., 1985; Mitscher, "The Chemistry of the Tetracycline Antibiotics", Medicinal Research 9, Dekker, N. Y., 1978; Noyee Development Corporation, "Tetracycline Manufacturing Processes" Chemical Process Reviews, Park Ridge, N. J., 2 volúmenes, 1969; Evans, "The Technology of the Tetracyclines," Biochemical Reference Series 1, Quadrangle Press, Nueva York, 1968; y Dowling, "Tetracycline," Antibiotic Monographs, no. 3, Medical Encyclopedia, Nueva York, 1955. Además, los análogos de tetraciclina abarcan los que se divulgan en los documentos WO2007/133797 y WO2007/133798.

Los polinucleótidos que forman las composiciones o kits de partes según la invención se proporcionan como vectores de expresión lentivíricos. Los polinucleótidos pueden además comprender uno o más elementos seleccionados del grupo que consiste en:

- repeticiones terminales largas (LTR) en los extremos 5' o 3'

- una secuencia de encapsidación tal como la secuencia psi (y ) lentivírica,

- una secuencia que aumenta la exportación nuclear de ARN (por ejemplo, la secuencia RRE)

- una secuencia que aumenta la importación nuclear del ADN vírico transcrito (por ejemplo, la secuencia cPPT) - uno o más elementos de regulación postranscripcionales tal como el elemento sensible del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE)

- una secuencia aisladora seleccionada del grupo que consiste en, por ejemplo, secuencias MAR, SAR, , S/MAR, scs y scs'.

Método para regular la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés

En una célula huésped que porta una secuencia reguladora transcripcional según la invención, una secuencia polinucleotídica operativamente ligada a la secuencia reguladora transcripcional y un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un represor transcripcional regulable bajo el control operativo de un segundo promotor permite alto nivel de transcripción de la secuencia de nucleótidos operativamente ligada a la secuencia reguladora transcripcional en presencia de un ligando del represor transcripcional regulable, mientras la transcripción no se produce en ausencia del ligando del represor transcripcional regulable. El nivel de transcripción basal de la secuencia de nucleótidos puede variar dependiendo de la célula huésped y el sito de integración de la secuencia, pero en general es bastante bajo o incluso indetectable en ausencia de un ligando del represor transcripcional. Con el fin de inducir transcripción en una célula huésped, la célula huésped se pone en contacto con un ligando para el represor transcripcional en donde dicho represor transcripcional regulable es capaz de unirse específicamente al sitio de unión en la secuencia reguladora transcripcional en ausencia, pero no en presencia de un ligando del mismo. Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para regular la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés que comprende las etapas de

(i) proporcionar una célula huésped que comprende un vector lentivírico según la invención en donde el ácido nucleico de interés está operativamente ligado al primer promotor en dicho polinucleótido

y

(ii) poner en contacto dicha célula huésped con un ligando para el represor transcripcional en donde dicho ligando es capaz de unirse al represor transcripcional produciendo un represor inactivo que se libera de su sitio de unión en la secuencia reguladora transcripcional permitiendo de esta manera la transcripción del ácido nucleico dirigida por el primer promotor.

Con el fin de poder expresar un polinucleótido de interés, los polinucleótidos, composiciones y kits de partes según la invención se modifican de modo que incorporen dicho polinucleótido de interés bajo control operativo de la secuencia reguladora transcripcional.

El sitio de unión para un represor transcripcional es un sitio de unión para el represor de tetraciclina, en donde el represor transcripcional regulable es el represor de tetraciclina y en donde el ligando es tetraciclina o un análogo de la misma. El término “análogo de tetraciclina” se ha definido en detalle anteriormente.

Para inducir la expresión génica en una célula in vitro, la célula se pone en contacto con la tetraciclina o un análogo de la misma cultivando la célula en un medio que contiene el ligando. Cuando se cultivan células in vitro en presencia de la tetraciclina o un análogo de la misma, un intervalo de concentración preferido para el agente de inducción es entre aproximadamente 10 y aproximadamente 1000 ng/ml. La tetraciclina o el compuesto análogo de la misma se puede añadir directamente al medio en el que las células ya se cultivan, o más preferiblemente para altos niveles de inducción génica, las células se recogen del medio sin compuesto de tetraciclina sustituida y se cultivan en medio nuevo que contiene el compuesto de tetraciclina sustituida deseado. Por ejemplo, células de mamífero, levadura o fúngicas se pueden modificar para contener estos componentes de moléculas de ácido nucleico descritos en el presente documento. Las células de mamífero, levadura o fúngicas modificadas se pueden después cultivar por técnicas de fermentación estándar en presencia de Tc o un análogo de la misma para inducir expresión del gen y producir la proteína de interés. Según esto, la divulgación proporciona un proceso de producción para aislar una proteína de interés cuando la proteína es tóxica para las células. En el proceso, una célula huésped (por ejemplo, una levadura u hongo), en la que se ha introducido un vector lentivírico según la invención se hace crecer a escala de producción en un medio de cultivo en ausencia de tetraciclina. Una vez el cultivo alcanza un pico, la adición de tetraciclina o un análogo de tetraciclina estimula la transcripción de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de interés (es decir, la secuencia de nucleótidos operativamente ligada a la(s) secuencia(s) operador(as) tet) y la proteína de interés se aísla de células huésped recogidas o del medio de cultivo. Se pueden usar técnicas de purificación de proteínas estándar para aislar la proteína de interés del medio o de las células recogidas.

Para inducir la expresión génica in vivo, no parte de la invención, células en un sujeto se ponen en contacto con la tetraciclina o el análogo de la misma administrando el compuesto al sujeto. La divulgación también proporciona la producción a gran escala de una proteína de interés en animales, tal como en animales de granja transgénicos. Los avances en tecnología transgénica han hecho posible producir ganado transgénico, tal como vacas, cabras, cerdos y ovejas (revisado en Wall, R.J. et al. (1992) J. Cell. Biochem. 49:113-120; y Clark, A.J. et al. (1987) Trends in Biotechnology 5:20-24). Según esto, se puede construir ganado transgénico que porta en su genoma los componentes del sistema regulador inducible de la invención, en donde un gen que codifica una proteína de interés está operativamente ligado a al menos una secuencia operadora tet. La expresión génica, y por tanto la producción de proteína, se induce al administrar cierta Tc (o análogo de la misma) al animal transgénico. La producción de proteína se puede dirigir a un tejido particular incorporando a la secuencia reguladora transcripcional en el vector lentivírico de la invención elementos reguladores específicos de tejido apropiados que limitan la expresión del gen de interés a ciertas células. Por ejemplo, un elemento regulador específico de glándula mamaria, tal como el promotor del suero de leche (patente en EE UU No. 4.873.316 y publicación de solicitud europea No. 264.166), puede estar ligado al transgén transactivador para limitar la expresión del transactivador al tejido mamario. Por tanto, en presencia de Tc (o análogo), la proteína de interés se producirá en el tejido mamario del animal transgénico. La proteína se puede diseñar para que se secrete a la leche del animal transgénico, y si se desea, la proteína se puede aislar de la leche. Cuando el agente inductor se administra a un sujeto humano o animal, la dosis se ajusta para alcanzar preferiblemente una concentración en suero entre aproximadamente 0,0005 y 1,0 pg/ml. La tetraciclina o análogo de la misma se puede administrar a un sujeto por cualquier medio eficaz para alcanzar una concentración in vivo suficiente para inducción génica. Los ejemplos de modos adecuados de administración incluyen administración oral (por ejemplo, disolver el agente inductor en el agua de beber), pellas de liberación lenta e implantación de una bomba de difusión. Para administrar los compuestos de tetraciclina sustituida a una planta transgénica, el agente inductor se puede disolver en agua administrada a la planta.

La expresión de un polinucleótido de interés se puede llevar a cabo en cualquier célula en donde el primer y segundo promotores sean funcionales. En una forma de realización preferida, la célula es una célula madre mesenquimatosa. Como se usa en el presente documento, el término “célula madre mesenquimatosa” (también denominada en el presente documento “MSC”) se tomará que significa una célula que es capaz de dar lugar a múltiples tipos diferentes de célula, originalmente derivada del mesénquima. En una forma de realización preferida, la célula madre mesenquimatosa es una célula madre mesenquimatosa humana.

El término “modular la concentración de una tetraciclina o análogo de la misma” como se usa en el presente documento significa “alterar la concentración de la tetraciclina o análogo de la misma”. Específicamente, si un regulador transcripcional dependiente de tetraciclina que se une al operador tet en presencia de tetraciclina o análogo de la misma se va a usar en el método in vitro de la presente invención, la expresión del ácido nucleico que se va a expresar se puede alcanzar añadiendo de novo una cantidad de tetraciclina o aumentando la cantidad de tetraciclina presente en la célula huésped, planta o animal transgénico no humano. Al contrario, si un regulador transcripcional dependiente de tetraciclina que se une al operador tet en ausencia de tetraciclina o análogo de la misma se va a usar, la cantidad de tetraciclina presente en la célula huésped, planta o animal transgénico no humano se disminuirá o la tetraciclina se puede retirar por completo. Se puede administrar tetraciclina o un análogo de la misma a la célula huésped, preferiblemente, a través del medio de cultivo que comprende las células huéspedes. En el caso de plantas, se puede administrar tetraciclina o un análogo de la misma a las células individuales de la planta o animal transgénico no humano por suministro de agua o nutrientes o a través de infusiones. Estas técnicas las conoce bien el experto en la materia y se pueden adoptar para condiciones individuales sin más.

Usos de los vectores y partículas lentivíricas de la invención

El sistema de expresión génica regulable de la invención tiene numerosas ventajas propiedades que lo hacen particularmente adecuado para aplicación a terapia génica. Por ejemplo, el sistema proporciona un interruptor de “encendido”/”apagado” para expresión génica que permite dosificación regulada de un producto génico en un sujeto. Hay varias situaciones en las que puede ser deseable poder proporcionar un producto génico a niveles específicos y/o momentos de una manera regulada, más que simplemente expresar el producto génico constitutivamente a un nivel ajustado. Por ejemplo, un gen de interés se puede “activar” a intervalos fijados (por ejemplo, a diario, días alternos, semanalmente, etc.) para proporcionar el nivel más eficaz de un producto génico de interés en el momento más eficaz. El nivel del producto génico producido en un sujeto se puede seguir por métodos estándar (por ejemplo, seguimiento directo usando un ensayo inmunológico tal como ELISA o RIA o indirectamente por seguimiento de un parámetro de laboratorio dependiente de la función del producto génico de interés, por ejemplo, niveles de glucosa en sangre y similares). Esta capacidad de “activar” la expresión de un gen a intervalos de tiempo discretos en un sujeto mientras también se permite que el gen se mantenga “desactivado” en otros momentos evita la necesidad de administración continuada de un producto génico de interés a intervalos intermitentes. Este enfoque evita la necesidad de inyecciones repetidas de un producto génico, que puede ser dolorosa y/o producir efectos secundarios y probablemente requeriría visitas continuas al médico. Al contrario, el sistema de la invención evita estos inconvenientes. Además, la capacidad de “activar” la expresión de un gen a intervalos de tiempo discretos en un sujeto permite el tratamiento enfocado de enfermedades que implican “estallidos” de actividad (por ejemplo, muchas enfermedades autoinmunitarias) solo en momentos cuando el tratamiento es necesario durante la fase aguda cuando el dolor y los síntomas son evidentes. En momentos cuando tales enfermedades están en remisión, el sistema de expresión se puede mantener en el estado “desactivado”. Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un vector lentivírico según la invención o una partícula lentivírica según la invención para uso en medicina.

Terapia génica

El vector lentivírico de la invención se puede usar en enfoques de terapia génica, en tratamientos para enfermedades genéticas o adquiridas. El enfoque general de la terapia génica implica la introducción de ácido nucleico en células de modo que uno o más productos génicos codificados por el material genético introducido se producen en las células para restablecer o aumentar una actividad funcional. Para revisiones en enfoques de terapia génica véase Anderson, W. F. (1992) Science 256:808-813; Miller, A. D. (1992) Nature 357:455-460; Friedmann, T. (1989) Science 244:1275-1281; y Cournoyer, D., et al. (1990) Curr. Opin. Biotech. 1:196-208). Genes de interés particular que se van a expresar en las células de un sujeto para el tratamiento de enfermedades genéticas o adquiridas incluyen los que codifican adenosina desaminasa, factor VIII, factor X, distrofina, beta-globina, receptor de LDL, CFTR, insulina, eritropoyetina, factores anti-angiogénesis, hormona de crecimiento, glucocerebrosidasa, beta-glucouronidasa, a1-antitripsina, fenilalanina hidroxilasa, tirosina hidroxilasa, ornitina transcarbamilasa, arginosuccinato sintetasa, UDP-glucuronisil transferasa, apoA1, TNF, receptor de TNF soluble, interleuquinas (por ejemplo, IL-2), interferones (por ejemplo, a- o Y-IFN) y otras citoquinas y factores de crecimiento. Los tipos celulares que se pueden modificar para fines de terapia génica incluyen células madre hematopoyéticas, mioblastos, hepatocitos, linfocitos, epitelio de la piel y epitelio de las vías respiratorias. Para descripciones adicionales de tipos celulares, genes y métodos para terapia génica, véase, por ejemplo, Wilson, J.M et al. (1988) Proc. Natl Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano, D. et al. (1990) Proc. Natl Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Wolff, J.A. et al. (1990) Science 247:1465-1468; Chowdhury, J.R. et al. (1991) Science 254:1802-1805; Ferry, N. et al (1991) Proc. Natl Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Wilson, J.M. et al. (1992) J. Biol Chem.

267:963-967; Quantin, B. et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581- 2584; Dai, Y. et al. (1992) Proc. Natl Acad. Sci. USA 89:10892-10895; van Beusechem, V.W. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644; Rosenfeld, M.A. et al. (1992) Cell 68:143-155; Kay, M.A. et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Cristiano, R.J. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2122-2126; Hwu, P. et al. (1993) J. Immunol. 150:4104-4115; y Herz, J. y Gerard, R.D. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816.

Las aplicaciones de terapia génica de interés particular en el tratamiento de cáncer incluyen sobreexpresión de un gen de citoquina (por ejemplo, TNF-a) en linfocitos infiltrantes en tumor o expresión ectópica de citoquinas en células tumorales para inducir una respuesta inmunitaria antitumoral en el sitio del tumor, expresión de una enzima en células tumorales que puede convertir un agente no tóxico a un agente tóxico, expresión de genes supresores de tumores (por ejemplo, p53 o Rb) en células tumorales, expresión de un gen de multirresistencia a fármacos (por ejemplo, MDR1 y/o MRP) en células de médula ósea para protegerlas de la toxicidad de la quimioterapia.

Las aplicaciones de terapia génica que pueden beneficiarse particularmente de esta capacidad para modular la expresión génica durante intervalos de tiempo discretos incluyen los siguientes ejemplos no limitantes:

- Artritis reumatoide - los genes que codifican productos génicos que inhiben la producción de citoquinas inflamatorias (por ejemplo, TNF, IL-1 e IL-12) se pueden expresar en sujetos. Los ejemplos de tales inhibidores incluyen formas solubles de un receptor para la citoquina. Adicional o alternativamente, se pueden expresar las citoquinas IL-10 y/o IL-4 (que estimulan una respuesta protectora de tipo Th2). Además, se puede expresar un receptor de glucocorticomimético (GCMR).

- Hipopituitarismo - se puede expresar el gen de la hormona del crecimiento humana en tales sujetos solo en la primera infancia, cuando la expresión génica es necesaria, hasta que se alcanza estatura normal, momento en el que la expresión génica se puede disminuir.

- Cicatrización de heridas/regeneración tisular -S e pueden expresar factores (por ejemplo, factores de crecimiento, factores angiogénicos, etc.) necesarios para el proceso de cicatrización solo cuando se necesiten y después disminuir.

- Tratamientos anticáncer - La expresión de productos génicos útiles en tratamiento anticáncer se puede limitar a una fase terapéutica hasta que se alcanza retraso del crecimiento tumoral, momento en el que la expresión del producto génico se puede disminuir. Los tratamientos anticáncer sistémicos posibles incluyen el uso de linfocitos infiltrantes en tumor que expresan moléculas inmunoestimuladoras (por ejemplo, IL-2, IL-12 y similares), inhibidores de angiogénesis (PF4, Il-12, etc.), Her-regulina, leucorregulina (véase publicación PCT No. WO 85/04662), y factores de crecimiento para terapia de apoyo de médula ósea, tal como G-CSF, GM-CSF y M-CSF. Respecto a lo último, el uso del sistema regulador de la invención para expresar factores para terapia de apoyo de médula ósea permite el cambio terapéutico simplificado a intervalos regulares de quimioterapia a terapia de apoyo de médula ósea (similarmente, tal enfoque también se puede aplicar al tratamiento del SIDA, por ejemplo, cambio simplificado de tratamientos antivirales a tratamiento de apoyo de médula ósea). Además, también es posible el direccionamiento local controlado de tratamientos anticáncer. Por ejemplo, la expresión de un gen suicida por un regulador de la invención, en donde el regulador mismo está controlado por, por ejemplo, un promotor específico de tumor o un promotor inducido por radiación.

- Enfermedades víricas - La expresión de proteínas de transactivación víricas negativas transdominantes tal como mutantes de tat y rev negativos transdominantes para HEV o mutantes de ICp4 transdominantes para HSV (véase, por ejemplo, Balboni, P.G. et al. (1993) J. Med. Virol. 41:289-295; Liem, S.E. et al (1993) Hum. Gene Ther. 4:625-634; Malim, M.H. et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1197-1201; Daly, TJ. et al (1993) Biochemistry 32:8945-8954; y Smith, CA. et al. (1992) Virology 191:581-588), expresión de proteínas de envuelta negativas transdominantes, tal como mutantes de env para HEV (véase, por ejemplo, Steffy, K.R. et al. (1993) J. Virol 67:18541859), expresión intracelular de anticuerpos, o fragmentos de los mismos, dirigidos a productos víricos ("inmunización interna", véase, por ejemplo, Marasco, W.A. et al (1993) Proc. Natl Acad. Sci. USA 90:7889-7893) y expresión de receptores víricos solubles, tal como CD4 soluble. Además, el sistema de la invención puede usarse para expresar condicionalmente un gen suicida en células, permitiendo de esta manera la eliminación de las células después de que hayan servido una función deseada. Por ejemplo, las células usadas para vacunación se pueden eliminar en un sujeto después de que el sujeto haya generado una respuesta inmunitaria induciendo la expresión de un gen suicida en las células administrando Tc o un análogo de Tc al sujeto.

- Hipertrofia prostática benigna - Similar a lo anterior, se puede regular un gen suicida por un regulador de la invención, en donde el regulador mismo está controlado por, por ejemplo, un promotor específico de próstata. - Hemofilia: factor XIII y EX (por ejemplo, la expresión se puede elevar durante tiempos de riesgo de lesión tal como durante deportes);

- Diabetes: insulina o amilina (según sea necesario, dependiendo del estado de la enfermedad en el sujeto, dieta, etc.);

- Eritrocitopenia: eritropoyetina (según sea necesario, por ejemplo, en insuficiencia renal terminal);

- Arteriesclerosis o terapia génica en hígado: receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLr) o receptor de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDLr) (por ejemplo, usando implantes ex vivo).

- Enfermedad de Alzheimer: se puede lograr ajuste fino de la expresión de colina acetil transferasa (ChAT) para restaurar los niveles de acetilcolina, factores neurotróficos (por ejemplo, NGF, BDNGF y similares) y/o inhibidores del complemento (por ejemplo, sCR1, sMCP, sDAF, sCD59, etc.).

- Enfermedad de Parkinson: ajuste fino de la expresión de tirosina hidroxilasa (TH) para aumentar los niveles de levodopa y dopamina.

En otra forma de realización, las proteínas reguladoras divulgadas se usan para expresar inhibidores de angiogénesis desde dentro de un tumor a través de un transgén regulado por el sistema de la invención. La expresión de inhibidores de angiogénesis de esta manera puede ser más eficaz que la administración sistémica del inhibidor y evitaría cualquier efecto secundario dañino que pudiera acompañar la administración sistémica. En particular, restringir la expresión del inhibidor de angiogénesis a dentro de tumores podría ser particularmente útil en tratar cáncer en niños que todavía experimentan angiogénesis asociada con crecimiento celular normal.

En otra forma de realización, la expresión regulada a alto nivel de citoquinas puede representar un método para enfocar la respuesta inmunitaria propia de un paciente en células tumorales. Las células tumorales se pueden transducir para expresar quimioatrayentes y citoquinas que fomentan el crecimiento, importantes en aumentar la respuesta inmunitaria natural de un individuo. Debido a que las mayores concentraciones de citoquinas estarán en la proximidad del tumor, la probabilidad de provocar una respuesta inmunológica a antígenos tumorales aumenta. Un potencial problema con este tipo de terapia es que esas células tumorales que producen citoquinas también serán objetivos de la respuesta inmunitaria y por tanto la fuente de las citoquinas se eliminará antes de que la erradicación de todas las células tumorales pueda ser cierta. Para combatir esto, la expresión de proteínas víricas que se sabe que enmascaran células infectadas del sistema inmunitario se puede colocar bajo regulación, junto con el/los gen(es) de citoquinas, en las mismas células. Una de tales proteínas es la proteína E19 de adenovirus (véase, por ejemplo, Cox, Science 247:715). Esta proteína previene el transporte de antígenos de HLA de clase I a la superficie de la célula y por tanto previene el reconocimiento y lisis de la célula por las células T citotóxicas del huésped. Según esto, la expresión regulada de E1 9 en células tumorales podría proteger las células productoras de citoquinas de células T citotóxicas durante el inicio de una respuesta inmunitaria provocada por la expresión de la citoquina. Después de que haya pasado un periodo suficiente de tiempo para erradicar todas las células tumorales, excepto las que expresan E1 9, la expresión de E1 9 se puede desactivar, produciendo que estas células caigan víctimas entonces a la respuesta inmunitaria antitumoral provocada.

La capacidad para expresar un gen suicida (por ejemplo, un gen de apoptosis, gen TK, etc.) de una manera controlada usando el sistema regulador de la invención suma a la seguridad general y utilidad del sistema. Por ejemplo, al final de una terapia deseada, la expresión de un gen suicida se puede desencadenar para eliminar células que portan el vector de terapia génica, tal como células en un implante bioinerte, células que se han diseminado más allá de la localización original pretendida, etc. Además, si un trasplante se vuelve tumorigénico o tiene efectos secundarios, las células se pueden eliminar rápidamente por inducción del gen suicida.

En ciertas situaciones de terapia génica, puede ser necesario o deseable adoptar etapas para evitar o inhibir reacciones inmunitarias indeseadas en un sujeto que recibe tratamiento. Para evitar una reacción contra las células que expresan el producto génico terapéutico, las propias células de un sujeto se usan generalmente, cuando es posible, para expresar el producto génico terapéutico, mediante modificación in vivo de las células del sujeto u obteniendo células del sujeto, modificándolas ex vivo y devolviéndolas al sujeto. En situaciones en las que se usan células alogénicas o xenogénicas para expresar un producto génico de interés, el sistema regulador de la invención, además de regular un gen terapéutico, también puede usarse para regular uno o más genes implicados en el reconocimiento inmunitario de las células para inhibir una reacción inmunitaria contra las células exógenas. Por ejemplo, moléculas de la superficie celular implicadas en el reconocimiento de una célula exógena por linfocitos T pueden disminuirse en la superficie de una célula exógena usada para la administración de un producto génico terapéutico, tal como mediante la expresión regulada en la célula exógena de una ribozima que corta el ARNm que codifica la molécula de superficie celular. Moléculas de superficie celular particularmente preferidas que pueden disminuirse de esta manera para inhibir una respuesta inmunitaria indeseada incluyen moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I y/o clase II, moléculas coestimuladoras (por ejemplo, B7-1 y/o B7-2), CD40 y varias moléculas de "adhesión", tales como ICAM-1 o ICAM-2. Usando enfoques descritos en el presente documento para la regulación independiente pero coordinada de múltiples genes en la misma célula, la disminución de la expresión de una molécula(s) de superficie celular en una célula huésped puede coordinarse con el aumento de la expresión de un gen terapéutico. Según esto, después de completar la terapia y la expresión del gen terapéutico se interrumpa, la expresión de molécula(s) endógena(s) de superficie celular se puede restaurar a la normal.

Expresión de ARN inhibidores

En otra forma de realización, la invención se refiere a vectores lentivíricos para expresión inducible y/o específica de tejido de moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, moléculas de ARN bicatenario, que interfieren con la expresión de un gen diana usando métodos conocidos en la técnica. En esta forma de realización, una región codificante que codifica un ARN antisentido específico de gen diana se asocia operativamente con la región reguladora transcripcional de modo que la unión de la tetraciclina o análogo de la misma a la secuencia operadora produce la expresión del ARN antisentido. En varios aspectos de esta forma de realización, el nivel de expresión de una molécula de ARN antisentido, y traducción de un ARNm de gen diana inhibido por la molécula de ARN antisentido, se puede modular por la concentración de tetraciclina o su análogo, el nivel de expresión de la proteína TetR específica de inductor, y/o la temperatura. En un aspecto particular de esta forma de realización, el gen diana corresponde a una copia de un gen duplicado en un organismo procariota, permitiendo de esta manera la construcción de una célula huésped que puede ser funcionalmente haploide para ese producto génico. Tales organismos son particularmente útiles para la detección de agentes antimicrobianos activos contra el producto génico diana codificado.

Como se usa en el presente documento, el termino “interferencia de ARN” o “iARN” se refiere a degradación intracelular selectiva de ARN usado para silenciar la expresión de un gen diana seleccionado. iARN es un proceso de silenciamiento génico específico de secuencia, postranscripcional en organismos iniciado por ARN bicatenario (ARNbc) que es homólogo en secuencia al gen que se va a silenciar. La técnica de iARN implica ARN interferentes pequeños (ARNip) que son complementarios a los ARN diana (que codifican un gen de interés) y específicamente destruyes el ARNm conocido, disminuyendo o suprimiendo de esta manera la expresión génica. iARN está mediada por ARN interferentes pequeños (ARNip). El término “ARN interferente pequeño” o “ARNip” se refiere a una molécula de ácido nucleico que es un agente de ARN bicatenario que es complementario a, es decir, capaz de realizar emparejamiento de bases, una porción de un ARN diana (generalmente ARNm). El ARNip actúa para guiar específicamente enzimas en la célula huésped para cortar el ARN diana. En virtud de la especificidad de la secuencia del ARNip y su homología al ARN diana, el ARNip es capaz de producir el corte de la hebra de ARN diana, inactivando de esta manera la molécula de ARN diana. Las regiones complementarias del ARNip permiten suficiente hibridación del ARNip al ARN diana y por tanto median iARN. En células de mamífero, los ARNip tienen aproximadamente 21-25 nucleótidos de longitud. La secuencia del ARNip necesita ser de suficiente longitud para reunir el ARNip y el ARN diana mediante interacciones de emparejamiento de bases complementarias. El ARNip usado con el sistema de expresión Tet de la invención pude ser de longitudes variables. La longitud del ARNip es preferiblemente mayor que o igual a diez nucleótidos y de suficiente longitud para interaccionar establemente con el ARN diana; específicamente 15-30 nucleótidos; más específicamente cualquier número entero entre 15 y 30 nucleótidos, tal como 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. Mediante “suficiente longitud” se quiere decir un oligonucleótido mayor que o igual a 15 nucleótidos que es de una longitud suficientemente grande para proporcionar la función pretendida en las condiciones esperadas. Mediante “interaccionar establemente” se quiere decir interacción del ARN interferente pequeño con el ácido nucleico diana (por ejemplo, formando enlaces de hidrógeno con nucleótidos complementarios en la diana en condiciones fisiológicas).

Además de iARN, se pueden expresar ribozimas de una manera controlada en un sujeto para fines terapéuticos. Por ejemplo, se puede diseñar una ribozima que discrimine entre una forma mutada de un gen y un gen de tipo salvaje. Según esto, un gen “correcto” (por ejemplo, un gen p53 de tipo salvaje) se puede introducir en una célula en paralelo con la introducción de una ribozima regulada específica para la forma mutada del gen (por ejemplo, un gen p53 endógeno mutado) para eliminar el ARNm deficiente expresado del gen endógeno. Este enfoque es particularmente ventajoso en situaciones en las que un producto génico del gen defectuoso interferiría con la acción del gen de tipo salvaje exógeno.

Modelos animales de enfermedad humana

Los vectores lentivíricos y partículas lentivíricas de la invención pueden usarse para estimular la expresión de genes específicos en animales para imitar la fisiopatología de la enfermedad humana para crear de ese modo modelos animales de enfermedad humana. Por ejemplo, en un animal huésped, un gen de interés que se cree que está implicado en una enfermedad puede ponerse bajo el control transcripcional de una o más secuencias reguladoras transcripcionales (por ejemplo, mediante recombinación homóloga, como se describe en el presente documento). Tal animal puede aparearse con un segundo animal que porta el represor transcripcional bajo el control del segundo promotor, para crear progenie que porta ambos polinucleótidos. La expresión del gen de interés en esta progenie puede modularse usando tetraciclina o un análogo de la misma. Alternativamente, la expresión del gen de interés puede disminuirse usando moléculas silenciadoras para el gen diana bajo el control de la secuencia reguladora transcripcional. Tal enfoque puede ser ventajoso sobre la “inactivación de genes” mediante recombinación homóloga para crear modelos animales de enfermedad, puesto que el sistema regulado descrito en el presente documento permite el control tanto sobre los niveles de expresión del gen de interés como la cronología de cuándo se disminuye o aumenta la expresión génica.

Imagenología de la expresión génica regulada in vivo

Los métodos de la invención se pueden emplear en combinación con técnicas de imagenología invasivas o más preferiblemente no invasivas, para seguir la expresión génica regulada en células, líneas celulares y/o sujetos vivos. Por ejemplo, se pueden colocar tanto un gen reportero(por ejemplo, luciferasa, GFP, CAT, etc.) como una secuencia de nucleótidos de interés bajo el control de una secuencia reguladora transcripcional, haciendo mediante ello la expresión del gen reportero y la secuencia de nucleótidos de interés sensible a un ligando del represor transcripcional. Mediante el uso de tales construcciones genéticas, se pueden derivar animales transgénicos y líneas celulares en las que la expresión y/o actividad de un gen indicador tal como luciferasa sirve como un marcador indirecto, no invasivo de la expresión de la secuencia de nucleótidos ligada al operador tet. El uso de tales métodos para la implementación de imagenología no invasiva en sujetos vivos se describe en Hasan, MT et al. Genesis 29(3):11622. El término "gen indicador" o "gen reportero" se refiere genéricamente a una secuencia de ADN expresable (por ejemplo, capaz de transcribirse y (opcionalmente) traducirse) que se expresa en respuesta a la actividad de una proteína reguladora transcripcional. Los genes indicadores incluyen genes endógenos sin modificar de la célula huésped, genes endógenos modificados, o un gen marcador de una construcción heteróloga, por ejemplo, como parte de una construcción de gen marcador. En una forma de realización preferida, el nivel de expresión de un gen indicador produce una señal detectable. Los ejemplos de genes marcadores incluyen, pero no están limitados a, CAT (cloranfenicol acetil transferasa) (Alton y Napnek, 1979, Nature 282: 864-869) luciferasa, y otros sistemas de detección de enzimas, tal como beta-galactosidasa; luciferasa de luciérnaga (deWet et al. (1987), Mol. Cell Biol. 7:725-737); luciferasa bacteriana (Engebrecht y Silverman (1984), PNAS 1: 4154-4158; Baldwin et al. (1984), Biochemistry 23: 3663-3667); fosfatasa alcalina (Toh et al. (1989) Eur. J. Biochem. 182: 231-238, Hall et al. (1983) J. Mol. Appl Gen. 2: 101), fosfatasa alcalina secretada placentaria hximan (Cullen y Malim (1992) Methods in Enzymol. 216:362-368), y peroxidasa de rábano. En una forma de realización preferida, el gen indicador es proteína fluorescente verde (patente en EE UU 5.491.084; documento WO96/23898).

Los vectores lentivíricos de la invención se pueden incorporar a composiciones farmacéuticas adecuadas para administración. Tales composiciones típicamente comprenden la molécula de ácido nucleico y un soporte farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento la frase “soporte farmacéuticamente aceptable” se pretende que incluya cualquiera de solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Excepto en tanto que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones. Una composición farmacéutica de la invención se formula para ser compatible con su vía pretendida de administración. Los ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa y rectal.

La invención se describe a continuación mediante los siguientes ejemplos que se deben interpretar como simplemente ilustrativos y no limitantes del ámbito de la invención.

Ejemplos

Materiales y métodos

Células y reactivos

Las células 293T (ATCC: CRL-11268) se mantuvieron en Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogen) suplementado con suero bovino fetal (SBF, Invitrogen) al 10%, aminoácidos esenciales al 1% y antibióticos. Las células madre mesenquimatosas humanas (hMSC) se obtuvieron de Inbiobank (www.inbiobank.org; San Sebastián, España), y se cultivaron en Advanced-DMEM (Gibco) más SBF al 10%. Cuando los cultivos celulares alcanzaron más del 85% de densidad, las células adherentes se tripsinizaron, lavaron en PBS y volvieron a sembrar a una concentración de 5x103 células/cm2.

Construcción de plásmidos

Sistema dual: StetR y CTetOE. El plásmido vector StetR se obtuvo sustituyendo el ADNc de EGFP del plásmido pHRSIN-CSEW (Demaison et al., Hum Gene Ther 2002; 13: 803-13) (usando escisión con BamHI y NotI) con un ADNc de TetR obtenido por PCR usando pcDNA6TR (Invitrogene) como molde y BamH1-tetR Fw GGATCCATGTCTAGATTAGATAAAAG, SEQ ID NO: 18) y Not-TetR inverso (5' GCGGCCGCTTAATAAGATCTGAATTCCCGGG, SEQ ID NO:19). Cebadores para incluir los sitios BamHI NotI en ambos extremos. Para construir el plásmido vector CTetOE, se usó el vector pHRSIN-CSEW como esqueleto, cortando el promotor SFFV usando enzimas de restricción EcoRI/BamHI. Se obtuvo un fragmento de ^p C^r que contenía el casete CMVTetO por PCR usando los cebadores EcoR1 directo (CCGGAATTCGTTGACATTGATTATTGACTA, SEQ ID NO:20) y BamH1 inverso (CGCGGATCCCGGAAGATGGATCGGTCC. SEQ ID NO:21) y el plásmido pcDNA4/TO (Invitrogene) como molde.

Vector lentivírico CEST integral: El plásmido vector CEST que tiene el casete regulable CMV-tetO dirigiendo la expresión de GFP, así como el promotor del virus formador de focos esplénicos dirigiendo la expresión del gen represor TetR se construyó clonando el fragmento SFFV-TetR PstI del vector STetR en el sitio de restricción Pst1 único del vector CTetOE.

Producción y titulación de vectores

El plásmido de empaquetamiento de VIH (pCMVDR 8.9) y el plásmido VSG-G (pMD.G) se describen en otro sitio (Naldini et al., 1996, Science 1996: 272:263-7 y Zufferey et al., 1998, J. Virol. 1998. 72: 9873-80). La producción de vector se realizó como se ha descrito previamente (Toscano et al., 2004, Gene Ther 2004; 11: 956-61). Brevemente, se sembraron células 293T, y el vector, plásmidos de empaquetamiento y envuelta (proporción de plásmidos 3:2:1) se resuspendieron en 1,5 ml de Opti-MEM (GIBCO) mezclado con 60 pl de Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y diluyó en 1,5 ml de Opti-MEM (GIBCO). La mezcla se añadió a las células 293T, que se incubaron durante 6-8 h, lavaron y cultivaron durante 48 h adicionales. Los sobrenadantes víricos se recogieron y filtraron a través de un filtro de 0,45 pm (tamaño de poro) (Nalgene, Rochester, NY) se hicieron alícuotas y congelaron inmediatamente a -80°C. Para la titulación de vectores, las células transducidas se lisaron y el ADN se extrajo después de 7-10 días, y el número de copia de vector por genoma (v.c.g) se determinó usando PCR cuantitativa como se describe posteriormente.

Extracción de ADN y PCR en tiempo real cuantitativa

Se aisló ADN genómico añadiendo 1 ml por 106 células de tampón de extracción SNET (Tris-HCl 20 mM [pH 8], EDTA 5 mM [pH 8], NaCl 400 mM, SDS al 1%) que contenía proteinasa K (100 mg=ml; Sigma-Aldrich). Las muestras de ADN se incubaron a 55°C durante 2-18 h, se inactivó la proteinasa K incubando a 958C durante 10 min, y por último se añadió RNasa (1 mg=ml) durante 30 min a 37°C. Las proteínas se extrajeron dos veces con fenol-cloroformo, y el ADN se precipitó después y su concentración se determinó espectrofotométricamente. Se realizó PCR en tiempo real cuantitativa con un sistema Mx3005P (Agilent). Las PCR en tiempo real se realizaron usando el kit de PCR QuantiTect™ SYBR Green (de Qiagen). Para cuantificar la integración lentivírica se usaron cebadores para la secuencia WPRE; WPRE-F: 5'-CACCACCTGTCAGCTCCTTT (SEQ ID NO: 22) y WPRE-R: 5'-ACAACACCACGGAATTGTCA (SEQ ID NO: 23). Los parámetros para la PCR fueron 1x (95°C, 2 min); 40x (95°C, 15 s/63°C, 30 s/72°C, 30 s); 1 x (72°C 2 min). Se calculó el número de copias del vector por genoma interpolando en la curva patrón hecha con cantidades 10 veces crecientes de ADN de plásmido (CTetOW)) de 103 a 107 copias y empezando con 0,6 ug de ADN genómico (aproximadamente 100.000 genomas).

Extracción celular e inmunotransferencia

Se obtuvieron las fracciones citosólica y nuclear de células transducidas usando el kit de proteína nuclear Qproteome (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Las proteínas se separaron por electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE; geles de poliacrilamida al 10%, condiciones reductoras), y se electrotransfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) Hybond-P (GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, RU). Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% y se ensayaron durante 1 h a temperatura ambiente con anti-GRB2 en conejo (BD pharmingen; no 559266), anti-actina en conejo (Sigma; A5060) y anti-represor Tet en ratón (Mobitec; TET02). La combinación de IRDye 680LT anti- IgG de conejo en cabra (Licors: 26-68021) e IRDye 800CW anti-IgG de ratón en cabra (Licors: 926-32210) se usaron a diluciones 1:10.000 para analizar la proteína TetR en combinación con actina o GRB2. Después de lavar las membranas, la detección y cuantificación de proteína se realizaron usando Odyssey Image Scanner System (Licor Biosciences, Cambridge, RU) usando anticuerpos secundarios conjugados a iRdye (Licor) y el software de cuantificación Odyssey.

Inmunotinción

Para el análisis de inmunofluorescencia de células cultivadas, las células se fijaron en paraformaldehído al 4%-PBS durante 20 min, permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1-1%-PBS durante 15 min, y bloquearon con PBS al 5% durante 45 min a temperatura ambiente (RT). Las células fijadas se incubaron con 2 ug/ml anti-represor Tet (Mobitec; TET02) y después con un secundario anti-IgG de ratón conjugado a FITC (Becton Dickinson (B^d )). Las células teñidas se montaron después en medio de montaje Vectashield con DAPI (H-1500, vector laboratories) y se examinaron usando un microscopio de fluorescencia Olympus AX60.

Fenotipo de las hMSC

Las MSC, se recogieron, lavaron y preincubaron en una solución de bloqueo en PBS que contenía el 3% de suero bovino fetal (SBF) y azida sódica al 0,2% durante 15 minutos a 4°C. Se usaron los siguientes anticuerpos para caracterizar completamente el patrón de expresión de MSC transducidas y sin transducir: anti CD90 humano-FITC, CD73-PE, CD105-FITC, CD166-PE, CD106-PE, CD45-PERCP, CD34-APC, HLA-DR-PERCP, CD19-APC todos de Becton Dickinson (BD). Los anticuerpos se diluyeron en PBS 0,3% de SBF y 0,02% de azida sódica. Las células se incubaron con 100 pl de los diferentes anticuerpos (1/100), durante 1 h a 4°C y agitación y se lavaron en PBS 0,3% de SBF y 0,02% de azida sódica seguido por un lavado final en PBS solo. Las células se analizaron en un citómetro de flujo FACScan.

Índice de veces de inducción y determinación de la pérdida

Se analizaron células transducidas incubadas en presencia o ausencia de diferentes concentraciones de doxiciclina por citometría de flujo para determinar el porcentaje de células positivas para eGFP y la intensidad de fluorescencia media (IFM) de la población eGFP+ o la población entera.

El índice de veces de inducción se estimó como unidades arbitrarias obtenido por la siguiente fórmula:

[% de eGFP+ (+Dox)/% de eGFP+ (-Dox)] x [IFM de células eGFP+ (+Dox)/IFM de células eGFP+ (-Dox)]

La pérdida del sistema se determinó usando la siguiente fórmula:

[% de eGFP+ (-Dox)/% de eGFP+ (+Dox)] x IFM de células eGFP+ (-Dox)

Análisis del ciclo celular

Se realizaron ensayos del ciclo celular como se ha descrito previamente [21]. Brevemente, las células tripsinizadas se fijaron en etanol al 70%, se lavaron con PBS, y después se incubaron con yoduro de propidio (20 mg/ml) en PBS que contenía RNasa A durante 30 min a 37°C. Después de lavar, las células se analizaron por citometría de flujo (FACScan, Becton Dickenson).

Ejemplo 1

El sistema de vector lentivírico binario basado en el represor TetR original alcanza alta inducción y bajo fondo en poblaciones grandes.

Basado en los dos vectores de expresión clave del sistema de expresión T-Rex (pcDNA4/TO-E y pcDNA/TR), se construyó un sistema de dos vectores lentivíricos alternativo basado en el vector lentivírico pHRSIN-WPRE (Figura 1A). El primer vector expresa el represor TetR (STetR) mediante el promotor SFFV y el segundo expresa eGFP mediante el promotor regulable CMV-TetO (CTetOE) (véase M&M). El título obtenido con el vector StetR estaba por encima de 10.000.000 tu/ml antes de concentración. El alto título junto con el amplio tropismo del promotor SFFV permitió la fácil generación de líneas celulares grandes estables que expresan alto nivel del represor TetR. Usando este sistema se desarrollaron líneas de células 293T muy sensibles a baja concentración de doxiciclina (Figura 1B).

Ejemplo 2

La alta inducción y baja pérdida de sistema basado en TetR es dependiente de alta concentración de TetR, pero independiente de los sitios diana de CMVTetO.

El represor que contiene transactivador (tTA y rtTA) son bastante tóxicos para la mayoría de las células y se deben mantener a baja concentración. Con el fin de alcanzar buena regulación, la concentración de sitios de unión de TetO se debe mantener baja para igualar las bajas concentraciones del represor. Por tanto, se estudió si esto era también el caso para los sistemas basados en TetR sin modificar usando los vectores lentivíricos STetR y CTetOE. Se usaron cantidades crecientes de STetR para obtener líneas de células 293T con cantidades crecientes del represor TetR (Figura 2A: de izquierda a derecha). Todas estas líneas celulares 293T-TetR se transdujeron con cantidades crecientes de CTetOE para obtener concentraciones crecientes de dianas CMVTetO (Figura 2A: de arriba a abajo). Se mostró que solo esas células que expresan altos niveles de represor TetR tienen buena inducción y baja pérdida (Figura 2A paneles derechos). Se requiere un mínimo de 2 copias del vector STetR con el fin de alcanzar buena regulación y más de 3-4 copias da fondo mínimo y máxima inducción (Figura 2A; segundo gráfico derecho). De forma interesante, hubo una correlación directa entre las copias de vector CTetOE por célula (c.c.) y el índice de veces de inducción (Figura 2A y 2B). Se alcanzaron más de 1000 veces de inducción en poblaciones grandes que contienen aproximadamente 7 c.c del vector StetR y 6 c.c del vector CtetOE (Figura 2B). Esto indica que el represor TetR, al contrario que el transactivador rtTA, se puede expresar en exceso para poder unirse y modular un alto número de operones TetO.

Ejemplo 3

Desarrollo de LV integral que regula eficazmente la expresión de transgenes de una manera dependiente de la dosis.

Aunque un sistema de dos vectores tiene varias aplicaciones en investigación básica, la generación de un único vector capaz de administrar el represor TetR y un casete de expresión CMVTetO se requiere para fácil generación de líneas celulares primarias sensibles a doxiciclina y para estrategias de terapia génica. Por tanto, se construyó un vector lentivírico bicistrónico que contiene tanto el casete sensible a doxiciclina (CMVTetO) como el casete que expresa TetR (SFFV-TetR) (Figura 3a). El vector integral se ensayó en células inmortalizadas (293T) y primarias (MSC). De forma interesante, como para el sistema de dos vectores, el vector único requiere también varias copias para alcanzar buena regulación (Figura 3b y 3c). De hecho, no solo la inducción en veces fue mayor a mayor MOI en ambas líneas celulares (Figura 3b y 3c; gráficos izquierdos), sino que también tenía menos pérdida (Figura 3b y 3c; gráficos derechos). Estos datos corroboran la hipótesis del requisito de altas concentraciones de TetR como el factor principal para alcanzar buena regulación. En efecto, en este sistema, las células que contienen múltiples copias de StetR contendrán el mismo número de dianas TetO y aún, la pérdida cae al aumentar la MOI.

Las MSC son una diana importante para aplicaciones de terapia génica celular. Su papel en regeneración, inmunomodulación, así como sus capacidades migratorias a localizaciones inflamatorias las hacen una diana atractiva para manipulación génica. El desarrollo de un sistema de transferencia génica sensible a doxiciclina eficaz para alcanzar altos niveles de expresión de transgenes en MSC (sin afectar el fenotipo) es de especial interés para el campo. Por tanto, se estudiaron los cambios potenciales en hMSC sensibles a doxiciclina comparadas con hMSC parentales. No se pudieron detectar cambios en la expresión de los marcadores de superficie principales (Figura 4A) ni en el estado del ciclo celular (Figura 4B).

Ejemplo 4

Desarrollo de un LV mejorado que regula eficazmente la expresión de transgenes en células madre embrionarias El vector CEST es muy eficaz modulando la expresión de transgenes en líneas celulares inmortalizadas y en células primarias muy permisivas tal como células madre mesenquimatosas. Sin embargo, en células que son difíciles de transducir, tal como las células madre embrionarias humanas (hESC), el vector no es capaz de bloquear la expresión y tiene una fuerte pérdida. La razón para esto es el requisito de integrar 2-4 copias de CEST por célula con el fin de alcanzar las concentraciones de TetR necesarias para detener la expresión génica. El vector CEST se mejoró al:

a- aumentar la translocación nuclear del represor TetR. Esto se logró incluyendo una señal de localización nuclear en el extremo N: TetRn.

b- Expresar el TetRn mediante promotores más fuertes. Esto se logró usando el promotor de Eflalfa.

Se muestra un dibujo esquemático de este nuevo vector en comparación con el vector CEST en la figura 5.

Este vector (de aquí en adelante denominado CEETn integral) es muy eficaz modulando la expresión de transgenes en la mayoría de las líneas celulares analizadas incluso a bajo número de copia por célula (véase la figura 6).

De forma importante, el vector CEETn modula la expresión de transgenes en células madre embrionarias humanas sin el requisito de separación y/o selección con antibiótico (véase la figura 7). Este es, hasta donde sabemos, el primer vector integral capaz de modular expresión de transgenes en células madre embrionarias.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un vector lentivírico que comprende un polinucleótido, en donde el polinucleótido comprende

(i) una secuencia reguladora transcripcional que comprende un primer promotor y al menos un sitio de unión para un represor transcripcional en donde dicho primer promotor y dicho sitio de unión para un represor transcripcional están organizados de modo que la unión del represor transcripcional a dicho sitio de unión inhibe la actividad transcripcional del promotor y

(ii) un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un represor transcripcional regulable bajo el control operativo de un segundo promotor en donde dicho represor transcripcional regulable es capaz de unirse específicamente al sitio de unión en la secuencia reguladora transcripcional en ausencia, pero no en presencia de un ligando del mismo,

en donde el primer promotor es el promotor inmediato temprano del citomegalovirus (CMV), en donde el sitio de unión para el represor transcripcional comprende una secuencia operadora TetO, en donde el represor transcripcional regulable es el represor de tetraciclina y en donde el segundo promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor de la repetición a largo plazo (LTR) del virus formador de focos esplénicos (SFFV) y el promotor del factor de elongación lalfa (EF1a).

2. Un vector lentivírico según la reivindicación 1, en donde el sitio de unión para el represor transcripcional está después del primer promotor.

3. Un vector lentivírico según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el represor transcripcional regulable además comprende una señal de localización nuclear.

4. Un vector lentivírico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que además comprende un polinucleótido de interés bajo control operativo de la secuencia reguladora transcripcional.

5. Una partícula lentivírica o una célula huésped que comprende un vector lentivírico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Una composición o kit de partes que comprende el vector lentivírico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y un ligando del represor transcripcional que, cuando está unido al represor, produce el represor inactivo que ya no es capaz de unirse a su sitio de unión en la secuencia reguladora transcripcional.

7. Un método in vitro para regular la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés que comprende las etapas de

(i) proporcionar una célula huésped que comprende un vector lentivírico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el ácido nucleico de interés está operativamente ligado al primer promotor en dicho polinucleótido y

(ii) poner en contacto dicha célula huésped con un ligando para el represor transcripcional en donde dicho ligando es capaz de unirse al represor transcripcional produciendo un represor inactivo que se libera de su sitio de unión en la secuencia reguladora transcripcional permitiendo de esta manera la transcripción de ácido nucleico dirigida por el primer promotor.

8. Un método según la reivindicación 7, en donde la célula es una célula madre mesenquimatosa, preferiblemente una célula madre mesenquimatosa humana.

9. Un vector lentivírico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una partícula lentivírica o células huésped según la reivindicación 5 para uso en medicina.

10. Un vector lentivírico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una partícula lentivírica o célula huésped según la reivindicación 5 para uso en el tratamiento de una enfermedad que requiere la expresión del polinucleótido bajo control operativo de la secuencia reguladora transcripcional.