CN114134251A - 一种快速检测慢病毒载体滴度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速检测慢病毒载体滴度的方法,具体地,本发明提供了一种测定慢病毒载体滴度的方法,包括:(a)提供一待测样品,所述待测样品含有慢病毒载体和游离的质粒DNA;(b)对所述待测样品分别进行RT‑PCR和PCR反应,从而获得待测样品中含有WPRE元件的拷贝数,所述含有WPRE元件的拷贝数包括含有WPRE元件的慢病毒载体中RNA的拷贝数以及含有WPRE元件的游离质粒DNA的拷贝数;(c)基于所述待测样品中含有WPRE元件的慢病毒载体中RNA的拷贝数,从而测定慢病毒载体滴度。本发明的方法可在2小时之内获得特异性定量结果,可用于快速定量评估慢病毒载体生产过程中各步骤中间产品的滴度,并且可以对终产品滴度实施控制。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域,具体地,本发明涉及一种快速检测慢病毒载体滴 度的方法。
背景技术
基因治疗(gene therapy)是指将外源治疗性基因导入靶细胞,以纠正或 补偿因基因缺陷或异常引起的疾病,或通过外源基因表达的产物作用于疾病 靶点,以达到治疗目的。
外源基因可通过病毒载体或非病毒载体进行转导或递送,常用的非病毒 载体有脂质体、树枝状大分子、非天然阳离子聚合物、天然多糖等。非病毒 基因递送载体比较安全、稳定,但其转染效率通常较低。病毒载体是将外源 基因包装到天然病毒的外壳中,利用病毒对宿主细胞的感染性将外源基因导 入细胞中。常见的病毒载体包括逆转录病毒(recombinant retrovirus,rRV), 重组慢病毒(recombinant lentivirus,rLV)、腺病毒(recombinant adenovirus, rAd)、腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)等。病毒载 体的转导效率比非病毒载体的转导效率要高很多,特别适合用于侵染难感染 的靶细胞,如淋巴细胞。
重组慢病载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基 因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具 有感染能力。重组慢病载体因其体内、外生物滴度高和免疫原性低等优势, 成为CART细胞和基因治疗的首选转基因载体。
目前重组慢病毒载体检测多使用p24Elisa方法和生物滴度定量法,前者 需要1天时间出结果,后者至少需要7天时间出结果,且有较高的非特异性。
因此,本领域迫切需要开发一种快速检测慢病毒载体滴度的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测慢病毒载体滴度的方法。
本发明的第一方面,提供了一种测定慢病毒载体滴度的方法,包括:
(a)提供一待测样品,所述待测样品含有慢病毒载体和游离的质粒DNA;
(b)对所述待测样品分别进行RT-PCR和PCR反应,从而获得待测样品中含 有WPRE元件的拷贝数,所述含有WPRE元件的拷贝数包括含有WPRE元件的 慢病毒载体中RNA的拷贝数以及含有WPRE元件的游离质粒DNA的拷贝数;
(c)基于所述待测样品中含有WPRE元件的慢病毒载体中RNA的拷贝数, 从而测定慢病毒载体滴度。
在另一优选例中,所述待测样品中含有WPRE元件的慢病毒载体中的RNA 的拷贝数用如下公式计算:含有WPRE元件的慢病毒载体中RNA的拷贝数和含 有WPRE元件的游离质粒DNA的总拷贝数-含有WPRE元件的游离质粒DNA的 拷贝数。
在另一优选例中,“基于所述待测样品中含有WPRE元件的慢病毒载体中 RNA的拷贝数”包括用公式Q1进行计算,从而获得慢病毒载体滴度:
Q1=(待侧样品中重组慢病毒载体RNA的拷贝数*阳性品生物滴度)/阳性品 中重组慢病毒载体RNA的拷贝数;
其中,阳性品指已知生物滴度的慢病毒载体悬液;阳性品生物滴度和阳性品 中RNA的拷贝数的计算公式与待测样品的计算公式相同;待侧样品中重组慢病毒 载体RNA的拷贝数用如下公式计算:含有WPRE元件的慢病毒载体中RNA的 拷贝数和含有WPRE元件的游离质粒DNA的总拷贝数-含有WPRE元件的游 离质粒DNA的拷贝数。
在另一优选例中,所述滴度为生物滴度。
在另一优选例中,所述待测样品来源于慢病毒载体的研发、生产过程中的 慢病毒载体包装上清、纯化中间产品、终产品。
在另一优选例中,所述PCR包括q-PCR。
在另一优选例中,在步骤(b)中,利用特异性扩增含有WPRE元件的重组慢 病毒载体的上游引物和下游引物和利用特异性扩增含有WPRE元件的游离质粒 DNA的上游引物和下游引物对待测样品进行RT-PCR反应,对重组慢病毒载体内 的RNA和游离质粒DNA进行扩增,从而获得特异性扩增WPRE元件的重组慢病 毒载体中的RNA和游离质粒DNA的Ct值。
在另一优选例中,所述上游引物和下游引物用于扩增WPRE元件。
在另一优选例中,所述上游引物和下游引物分别如下所示:
引物对1:
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下游引物:acaacaccacggaattgtca(SEQ ID NO.:2);或
引物对2:
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引物对3:
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在另一优选例中,在步骤(b)中,利用特异性扩增含有WPRE元件的游离质 粒DNA的上游引物和下游引物对待测样品进行PCR反应,对游离质粒DNA进行 扩增,从而获得特异性扩增WPRE元件的游离质粒DNA的Ct值。
在另一优选例中,所述上游引物和下游引物分别如下所示:
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在另一优选例中,在步骤(b)中,基于特异性扩增WPRE元件的游离质粒 DNA的Ct值,从而获得特异性扩增WPRE元件的游离质粒DNA的含量。
在另一优选例中,在步骤(b)中,基于特异性扩增WPRE元件的重组慢病 毒载体中的RNA和游离质粒DNA的Ct值,用公式Q2进行计算,从而获得重 组慢病毒载体中的RNA和游离质粒DNA的总拷贝数:
Q2=RNA和/或DNA拷本数=(每个反应孔中样品的核酸拷贝数×1000× 稀释倍数)/每个反应孔中加入样品的量;
其中,每个反应孔中样品的核酸拷贝数=10^(aX+b),
其中,X:待测样品检测得到的CT值平均值;
a:标准曲线拟合得到的系数
b:标准曲线拟合得到的截距。
在另一优选例中,步骤(b)中,基于重组慢病毒载体中的RNA和游离质粒 DNA的总拷贝数,以及游离质粒DNA的拷贝数,用公式Q3进行计算,从而获 得待测样品中的重组慢病毒载体中RNA的拷贝数:
Q3=重组慢病毒载体中的RNA和游离质粒DNA的总拷贝数-游离质粒 DNA的拷贝数。
在另一优选例中,在步骤(b)中,特异性扩增含有WPRE元件的重组慢病 毒载体中的RNA和游离质粒DNA的上游引物和下游引物均来自于Lenti-XTM qRT-PCR Titration Kit(Takara)检测试剂盒。
在另一优选例中,所述游离质粒DNA来源于包装质粒。
在另一优选例中,所述方法中还包含阳性对照。
在另一优选例中,所述的方法是非诊断和非治疗性方法。
在另一优选例中,所述的方法是体外方法。
在另一优选例中,所述待测样品中慢病毒载体的浓度为5x105-5x109Tu/ml, 较佳地,1x106-8x108Tu/ml,更佳地,5x106-5x108Tu/ml。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中 具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限 于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1为慢病毒control系列稀释梯度的制备过程,其中试剂盒本身提供的慢病 毒control浓度为5×107copies/ul。首先吸取2ul 5×107copies/ul慢病毒control到一个 干净的EP管中,再加入18ul EASY dilution Buffer,充分混匀后,取3ul混合液(此 时慢病毒control的浓度为5×106copies/ul)再加入18ul EASY dilution Buffer,充分混 匀,按照此操作,做成5个如图所示的慢病毒control稀释梯度。其中的NTC是只 有EASY dilutionBuffer。右边的图是待测样品的稀释过程(如有需要需按图所示 进行稀释)。
图2是q-PCR检测时候的程序运行方法编辑,检测时只需要按图所示进行温 度与时间设定即可。
图3是以试剂盒中慢病毒control的系列梯度稀释样品检测得到的CT平均值 为横坐标,以对应的的慢病毒control含量(copies)的对数值(以10为底)为纵 坐标,拟合得到的标准曲线,得到计算公式:y=-0.5883x+10.97,R2=0.9999。从该 公式可知在该检测方法下,慢病毒含量的对数值与对应的CT值具有良好的线性相 关性,该批次样品检测的操作过程稳定可靠,该标准曲线可用于待测样品慢病毒拷 贝数的计算。
图4为上下游引物特异性扩增WPRE元件和游离的质粒DNA得到的产物的溶 解曲线,该溶解曲线只有一个尖锐的峰,说明引物的特异性好。
图5是实时定量PCR反应的扩增曲线,该扩增曲线具有相同的倾斜程度且平 行,说明引物的效率一致,反应孔中不存在抑制PCR的污染(紫色曲线除外,紫 色曲线为含有NTC的孔)。
图6是设置反应管和对照管,同时进行RT-PCR和PCR反应,用绝对定 量的方式计算得到核酸拷贝数,反应管获得的拷贝数记为n2(其为总核酸拷贝 数),对照管获得的拷贝数记为n1(其为游离DNA拷贝数),n2-n1=慢病毒载体 RNA拷贝数。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,首次意外地发现,对待测样品分别使用 RT-PCR(含逆转录酶,对慢病毒载体中的RNA和质粒DNA均扩增)和PCR (不含逆转录酶,只对质粒DNA进行扩增)的方式进行扩增,将RT-PCR获 得的含有WPRE元件的慢病毒载体中RNA的拷贝数和游离质粒DNA的拷贝 数减去PCR获得的含有WPRE元件的游离质粒DNA的拷贝数可获得待测样品 中含有WPRE元件的慢病毒载体中RNA的拷贝数,并基于所述待测样品中含 有WPRE元件的慢病毒载体中RNA的拷贝数,可测定慢病毒载体滴度,并且, 本发明的方法可去除质粒或其他核酸的非特异性干扰,快速实现定量,并且可 在2小时之内获得特异性定量结果,可用于快速定量评估慢病毒载体生产过程 中各步骤中间产品的物理滴度,并且可以对终产品物理滴度(生物滴度)实施 控制。在此基础上,本发明人完成了本发明。
术语说明
除非另外定义,否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用,在提到具体列举的数值中使用时,术语“约”意指该值可以从列举 的值变动不多于1%。例如,如本文所用,表述“约100”包括99和101和之间的全 部值(例如,99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用,术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之,所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
RT-PCR
RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的 作用,从RNA合成cDNA,再以cDNA为模板,在DNA聚合酶作用下扩增合成 目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平、细 胞中或培养上清中RNA病毒的含量。RT-PCR反应体系中包含引物、逆转录酶、 PCR酶,缓冲液,dNTP等成分。
在本发明中,用RT-PCR技术同时检测同一样品中的DNA和RNA含量,分别设 置反应管和对照管。反应管中含有待测样品和RT-PCR所有反应体系,对照管中含 有与反应管中同样的待测样品,及去除了逆转录酶的RT-PCR反应体系。在反应管 中,将对RNA和DNA同时进行扩增,获得特异性扩增WPRE元件的Ct值,由此计 算的拷贝数为慢病毒载体RNA拷贝数加上游离质粒DNA拷贝数。在对照管中,未 添加逆转录酶,慢病毒载体上的RNA得不到扩增,仅对游离质粒DNA进行扩增, 获得特异性扩增WPRE元件的Ct值,由此计算的拷贝数为游离质粒DNA拷贝数。
在一优选实施方式中,按照上述方式设置反应管和对照管,同时进行 RT-PCR和PCR反应,用绝对定量的方式计算得到核酸拷贝数,将反应管获得 的拷贝数减去对照管获得的拷贝数为慢病毒载体RNA拷贝数,n2-n1=慢病毒载体 RNA拷贝数RNA拷贝数(如图6所示)。
WPRE元件
WPRE元件来自于美洲旱獭肝炎病毒,1999年Zufferey等将美洲旱獭肝 炎病毒的翻译后调节元件(woodchuck postregulatory element,WPRE)插至慢 病毒转移载体的3′末端。WPRE可以促进转录物出核,还可以通过上调初级转 录物的多聚腺苷化,来增加胞内mRNA的总量,最终提升慢病毒载体RNA的 表达效率,提高慢病毒载体的产量。
阳性对照
在本发明中,阳性对照为已知生物滴度的慢病毒载体悬液(比如, LV-CAR001,获自上海赛比曼生物科技有限公司)。
在本发明中,阳性对照也含有DNA和RNA,并且阳性对照的拷贝数和 滴度的计算方式与检测样本的计算公式相同。
测定慢病毒载体滴度的方法
在本发明中,提供了一种测定慢病毒载体滴度的方法,包括:
(a)提供一待测样品,所述待测样品含有慢病毒载体和游离的质粒DNA;
(b)对所述待测样品分别进行RT-PCR和PCR反应,从而获得待测样品中含 有WPRE元件的拷贝数,所述含有WPRE元件的拷贝数包括含有WPRE元件的 慢病毒载体中RNA的拷贝数以及含有WPRE元件的游离质粒DNA的拷贝数;
(c)基于所述待测样品中含有WPRE元件的慢病毒载体中RNA的拷贝数, 从而测定慢病毒载体滴度。
本发明的主要优点包括:
(1)本发明首次发现,本发明的快速检测慢病毒载体物理滴度的方法,可在两 小时之内获得特异性定量结果,可用于快速定量评估慢病毒载体生产过程中各步骤 中间产品的物理滴度,并且可以对病毒载体终产品装量实施控制。
(2)本发明首次发现,通过RT-PCR绝对定量的方法扩增WPRE元件,检测待 测样品中的游离质粒DNA拷贝数和慢病毒载体的RNA拷贝数,基于游离质粒 DNA拷贝数和慢病毒载体的RNA拷贝数的总拷贝数扣除游离质粒DNA拷贝数, 可快速且特异地测定慢病毒载体滴度,并且本发明的实验设计简单,操作简单,能 在两小时内快速有效且特异地对重组慢病毒载体进行含量测定。
(3)本发明以阳性品的生物滴度作为对照,计算实验组生物滴度数值,从而快 速实现重组载体的含量调整。
(4)本发明操作步骤少,检测耗时短,检测结果反馈快,检测结果可信度高, 非常适用于关于慢病毒载体的研发或者生产过程中需要动态掌握不同阶段慢病毒 载体含量的测定。
下面结合具体实施,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按 照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非 另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
如无特别说明,本发明实施例中所用的试剂和材料均为市售产品。
设备:
QuantstudioTM DX(ABI)
实施例和应用参数
1.试剂准备
于冰上操作,准备充足体积的Master Reaction Mix(MRM)
2.样品稀释
待检测样品用EASY dilution buffer稀释至合适的浓度(105-109pfu/ml)。
3.样品裂解
加上2μl稀释后的病毒,18μl病毒裂解缓冲液,混合均匀后,孵化在室温 下1-5min。
4.建立标准曲线Lenti-X RNA Control稀释模板
标准品稀释在干净的0.2ml PCR管中进行,将RNA control做系列稀释, 每管须充分混匀后进行下一管稀释。5×107copies/μl作为标准曲线的最高点, EASY dilutionbuffer作为阴性对照(NTC,0copies/μl)。
5.把96-well PCR plate放于冰上,用移液器吸取18.4μl MRM(三个平行) 分配到合适的孔中。
6.用移液器转移1.6μl control稀释,NTCs,和samples(三个平行) 到96-wellPCR plate。
7.并且于4℃以2000rpm离心2min以去除气泡。
8.按下表建立PCR程序,放入96孔板并开始程序
9.数据处理
1)标准曲线:Lenti-X RNA Control梯度稀释的CT平均值与RNA拷贝数 (logscale)成线性相关。
2)根据稀释后样品的CT平均值,求每个反应孔中样品的RNA拷贝数。 以试剂盒中慢病毒标准品的系列梯度稀释样品检测得到的CT平均值 为横坐标,以对应的的慢病毒control含量(copies)的对数值(以10 为底)为纵坐标,拟合做标准曲线,得到计算公式:Y=aX+b
Y:待测慢病毒含量的对数值(以10为底)
X:待测样品检测得到的CT值平均值。
a:标准曲线拟合得到的系数
b:标准曲线拟合得到的截距
A(每个反应孔中的核酸拷贝数)=10^(aX+b)
3)原始样品的RNA拷贝数(copies/ml)=5×107copies/ul
结果:
1.标准曲线
用已知浓度的标准品制作标准曲线来计算未知样品的量。按照图1所示 进行Lenti-X RNA control标准品的稀释,以及病毒样品稀释。按照图2所示 程序进行PCR扩增。根据Ct值和对应的病毒拷贝数绘制标准曲线(图3)。 从本专利方法实例数据可以得出结论:通过测定标准品,对得到的检测值进 行拟合,拟合数据显示出良好的线性相关性(R2≥0.9999),说明该检测方法 具有良好的稳定性与准确性。
2.溶解曲线
溶解曲线(图4)可以验证扩增产物特异性,产物的情况,通常通过溶解曲线 可以看到有几个峰,以及峰出现的位置。因为不同的峰代表不同的产物,如果有两 个峰甚至多个峰,说明引物特异性不高,即得到的Ct值不可信。本实时定量PCR 反应得到的溶解曲线只有一个尖锐的峰,说明通过本反应体系中引物特异性高,本 专利方法扩增得到的产物是稳定并且正确的,检测数据是可信的。
3.扩增曲线(图5)
实时定量PCR的扩增曲线可以粗略判断反应扩增效率,保证高扩增效率与一 致性的扩增效率是检测成功的关键,如果扩增效率不一致,那么扩增效率曲线倾斜 程度不会具有相同的倾斜程度且平行,说明引物的效率不一样,或者个别样品或者 反应孔中存在抑制PCR的污染。从图可知采用本专利方法得到的扩增曲线基本是 平行位移并且倾斜程度基本是一致的,说明本专利方法对于检测具有高效的扩增效 率。
4.结果计算:
通过CT SD值可以看出待测样品的平行较好,其中特异性扩增之后的产物溶 解温度都在75℃附近,说明引物的扩增效率比较好,没有出现非特异性扩增,通 过对已知生物滴度的阳性对照品的比较,还可以快速较准确估算出待测样品的生物 滴度,对相关研发与生产人员及时掌握样品的慢病毒含量具有非常重要的意义。说 明该方法针对慢病毒滴度的快速检测具有良好的适用性。
根据实施例和应用参数中的第8条,q-PCR方法程序,该方法程序从程序 运行到结束总时间为1小时20分钟,加上前期样品制备操作以及q-PCR程序 运行结束后数据处理的时间,所有时间加起来可以控制在2小时内。
结论
使用本发明的检测方法,能高效快速且特异地对慢病毒载体物理滴度进行定 量,可快速用于检测生产过程中各步骤中间样品的物理滴度,确定中间产品上样量, 并进行终产品浓度控制。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域 技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利 要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海赛比曼生物科技有限公司
无锡赛比曼生物科技有限公司
<120> 一种快速检测慢病毒载体滴度的方法
<130> P2020-0547
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
actgtgtttg ctgacgcaac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
acaacaccac ggaattgtca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
actgtgtttg ctgacgcaac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
gatgatttcc ccgacaacac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
gtgttgtcgg ggaaatcatc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
gagatccgac tcgtctgagg 20
Claims (10)
1.一种测定慢病毒载体滴度的方法,其特征在于,包括:
(a)提供一待测样品,所述待测样品含有慢病毒载体和游离的质粒DNA;
(b)对所述待测样品分别进行RT-PCR和PCR反应,从而获得待测样品中含有WPRE元件的拷贝数,所述含有WPRE元件的拷贝数包括含有WPRE元件的慢病毒载体中RNA的拷贝数以及含有WPRE元件的游离质粒DNA的拷贝数;
(c)基于所述待测样品中含有WPRE元件的慢病毒载体中RNA的拷贝数,从而测定慢病毒载体滴度。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述待测样品中含有WPRE元件的慢病毒载体中的RNA的拷贝数用如下公式计算:含有WPRE元件的慢病毒载体中RNA的拷贝数和含有WPRE元件的游离质粒DNA的总拷贝数-含有WPRE元件的游离质粒DNA的拷贝数。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,“基于所述待测样品中含有WPRE元件的慢病毒载体中RNA的拷贝数”包括用公式Q1进行计算,从而获得慢病毒载体滴度:
Q1=(待侧样品中重组慢病毒载体RNA的拷贝数*阳性品生物滴度)/阳性品中重组慢病毒载体RNA的拷贝数;
其中,阳性品指已知生物滴度的慢病毒载体悬液;阳性品生物滴度和阳性品中RNA的拷贝数的计算公式与待测样品的计算公式相同;待侧样品中重组慢病毒载体RNA的拷贝数用如下公式计算:含有WPRE元件的慢病毒载体中RNA的拷贝数和含有WPRE元件的游离质粒DNA的总拷贝数-含有WPRE元件的游离质粒DNA的拷贝数。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(b)中,利用特异性扩增含有WPRE元件的重组慢病毒载体的上游引物和下游引物和利用特异性扩增含有WPRE元件的游离质粒DNA的上游引物和下游引物对待测样品进行RT-PCR反应,对重组慢病毒载体内的RNA和游离质粒DNA进行扩增,从而获得特异性扩增WPRE元件的重组慢病毒载体中的RNA和游离质粒DNA的Ct值。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(b)中,利用特异性扩增含有WPRE元件的游离质粒DNA的上游引物和下游引物对待测样品进行PCR反应,对游离质粒DNA进行扩增,从而获得特异性扩增WPRE元件的游离质粒DNA的Ct值。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,在步骤(b)中,基于特异性扩增WPRE元件的游离质粒DNA的Ct值,从而获得特异性扩增WPRE元件的游离质粒DNA的含量(拷贝数)。
7.如权利要求4所述的方法,其特征在于,在步骤(b)中,基于特异性扩增WPRE元件的重组慢病毒载体中的RNA和游离质粒DNA的Ct值,用公式Q2进行计算,从而获得重组慢病毒载体中的RNA和游离质粒DNA的总拷贝数:
Q2=RNA和/或DNA拷本数=(每个反应孔中样品的核酸拷贝数×1000×稀释倍数)/每个反应孔中加入样品的量;
其中,每个反应孔中样品的核酸拷贝数=10^(aX+b),
其中,X:待测样品检测得到的CT值平均值;
a:标准曲线拟合得到的系数
b:标准曲线拟合得到的截距。
8.如权利要求6或7所述的方法,其特征在于,步骤(b)中,基于重组慢病毒载体中的RNA和游离质粒DNA的总拷贝数,以及游离质粒DNA的拷贝数,用公式Q3进行计算,从而获得待测样品中的重组慢病毒载体中RNA的拷贝数:
Q3=重组慢病毒载体中的RNA和游离质粒DNA的总拷贝数-游离质粒DNA的拷贝数。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法中还包含阳性对照。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述待测样品中慢病毒载体的浓度为5x105-5x109Tu/ml,较佳地,1x106-8x108Tu/ml,更佳地,5x106-5x108Tu/ml。
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