CN110468193B - 一种用于免疫缺陷病检测的试剂盒 - Google Patents

一种用于免疫缺陷病检测的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于免疫缺陷病检测的试剂盒，所示试剂盒包括通过定量PCR同时检测T细胞受体重排删除环和κ删除元件重组删除环的试剂。本发明中的TREC及KREC引物的扩增片段选择在各自删除环的连接点两侧的保守序列中，使得扩增时只对环状的删除序列进行扩增，而在基因组上不会产生可扩增的产物，保证的检测的特异性。

Description

一种用于免疫缺陷病检测的试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，特别涉及一种用于免疫缺陷病检测的试剂盒。
背景技术
T细胞受体重排删除环(T Cell Receptor Excision Circle，TREC)是在正常儿童T细胞成熟期间产生的。每个T细胞都有各自不同的T细胞受体(TCR)，为了生成大量的独特TCR，T细胞DNA会发生基因重排和线性重组，并最终使得多样的初始T细胞从胸腺释放到外周血中。TCR重组时被切除的DNA片段也会末端连接，形成各种各样的环状DNA副产品，即TREC。TREC很稳定，但在有丝分裂期间不会复制，因此他们会一直存在。因此，TREC数量可以作为胸腺产生的初始T细胞的指标，而低TREC信号则对应于自体T细胞数量不足，提示有重症联合免疫缺陷(SCID)之类的免疫缺陷病的可能。目前国内在这方面还没有相应的检测标准和试剂盒出现。
κ删除元件重组删除环(κ-Deleting Recombination Excision Circle，KREC)则是在B细胞成熟分化时产生的。同T细胞一样，B细胞在成熟时也会发生基因重组，并释放删除环。KREC信号同初始B细胞含量相关，低KREC信号对应于自体B细胞数量不足，提示有患常见变异型免疫缺陷病(CVID)之类的免疫缺陷病的可能。
发明内容
为了克服目前没有同时TREC和KREC检测方法的不足，本发明提供一种TREC和KREC基因检测方法，该方法能够方便快速的对TREC及KREC基因进行定量，从而判断受检者是否患有SCID等免疫缺陷病或综合征。
本发明所采用的技术方案是：使用特异的TREC、KREC和β-ACTIN引物和探针，对人血液基因组DNA进行三重荧光定量PCR反应。反应在荧光定量PCR仪上运行，扩增结果以荧光曲线的形式给出。通过扩增曲线，可以判断TREC和KREC的含量。
在一种实施方式中，本发明提供一种用于免疫缺陷病检测的试剂盒，所示试剂盒包括通过定量PCR同时检测T细胞受体重排删除环和κ删除元件重组删除环的试剂。
在一种实施方式中，检测T细胞受体重排删除环的PCR上游引物所扩增的区域是：NC_000014.9:22475205-22475224；检测T细胞受体重排删除环的PCR下游引物所扩增的区域是：NC_000014.9:22386844-22386859。
在一种实施方式中，检测T细胞受体重排删除环的PCR扩增上游引物为SEQ IDNO.1：AAAATGGGGCTCCTGTGGGG；检测T细胞受体重排删除环的PCR扩增下游引物为SEQ IDNO.2：GGCACGGGGTGCAGGTGC；
在一种实施方式中，所述试剂盒包括检测T细胞受体重排删除环的PCR扩增的探针为SEQ ID NO.7：CCTCTGTCAACAAAGGTGATGCCA。
在一种实施方式中，检测κ删除元件重组删除环的PCR上游引物所扩增的区域是：NC_000002.12:88859577-88859602；检测T细胞受体重排删除环的κ删除元件重组删除环所扩增的区域是：NC_000002.12:88832811-88832833。
在一种实施方式中，检测κ删除元件重组删除环的PCR上游引物为SEQID NO.3：TCCCTTAGTGGCATTATTTGTATCAC；检测κ删除元件重组删除环的PCR下游引物为SEQ ID NO.4：AGGAGCCAGCTCTTACCCTAGAG。
在一种实施方式中，所述试剂盒包括检测κ删除元件重组删除环的PCR扩增的探针为SEQ ID NO.8：CCTCTGTCAACAAAGGTGATGCCA。
在一种实施方式中，所述试剂盒包括检测内参基因β-ACTIN的引物和探针，扩增所述内参基因β-ACTIN的上游引物是SEQ ID NO.5：TCCTTTGGAACTCTGCAGGT；扩增所述内参基因β-ACTIN的下游引物是SEQ ID NO.6：CTTGGGATGGGGAGTCTGTT；和检测内参基因β-ACTIN的PCR扩增的探针为SEQ ID NO.9：TTCCCAGATGAGCTCTTTTTCTGGTG。
本发明中的TREC及KREC引物的扩增片段选择在各自删除环的连接点两侧的保守序列中，使得扩增时只对环状的删除序列进行扩增，而在基因组上不会产生可扩增的产物，保证的检测的特异性。引物探针经过优化设计，确保相互之间对扩增效率影响最小。TREC和KREC引物在三重扩增时的扩增效率比单独扩增时没有显著下降。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明的TREC及KREC引物设计位点示意图；和
图2是本发明的试剂盒PCR扩增曲线图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。以下实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种化学试剂，均为市售产品。
实施例DNA样本中的TREC和KREC的PCR定量检测
一、引物和探针的设计
本发明所采用的技术方案是：使用特异的TREC、KREC和β-ACTIN引物和探针，对人血液基因组DNA进行双重荧光定量PCR反应。反应在荧光定量PCR仪上运行，扩增结果以荧光曲线的形式给出。通过扩增曲线，可以判断TREC的含量。
引物探针序列，5’-3’方向
TREC上游引物：AAAATGGGGCTCCTGTGGGG(SEQ ID NO.1)；
TREC下游引物：GGCACGGGGTGCAGGTGC(SEQ ID NO.2)；
KREC上游引物：TCCCTTAGTGGCATTATTTGTATCAC(SEQ ID NO.3)；
KREC下游引物：AGGAGCCAGCTCTTACCCTAGAG(SEQ ID NO.4)；
ACTB上游引物：TCCTTTGGAACTCTGCAGGT(SEQ ID NO.5)；
ACTB下游引物：CTTGGGATGGGGAGTCTGTT(SEQ ID NO.6)；
TREC探针：FAM-CCTCTGTCAACAAAGGTGATGCCA-BHQ(SEQ IDNO.7)；
KREC探针：NED-CTGCACGGGCAGCAGGTTGG-BHQ(SEQ ID NO.8)；和
ACTB探针：HEX-TTCCCAGATGAGCTCTTTTTCTGGTG-BHQ(SEQ ID NO.9)。
上述引物和探针是经过优化以达到最佳的特异性和灵敏度。因为TREC及KREC环本身也是从基因组上被切除的一部分，所以其序列同样也存在于正常细胞的基因组上，常规引物设计将在在基因组上产生非特异扩增。本发明中的TREC及KREC引物的扩增片段选择在各自删除环的连接点两侧的保守序列中，使得扩增时只对环状的删除序列进行扩增，而在基因组上不会产生可扩增的产物，保证检测的特异性。同时TREC扩增片段长度为105bp，KREC的扩增片段长度为90bp，保证引物的扩增效率。ACTB引物扩增片段选取的是ACTB基因中在基因组上没有同源序列而相对保守的区域，片段长度209bp，保证引物的特异性和效率的同时，减少对TREC和KREC引物扩增效率的影响。本发明的TREC及KREC引物设计位点示意图如图1所示。
引物设计所选用的序列如下：
TREC上游引物：NC_000014.9:22475205-22475224；
TREC下游引物：NC_000014.9:22386844-22386859；
KREC上游引物：NC_000002.12:88859577-88859602；和
KREC下游引物：NC_000002.12:88832811-88832833。
二、本发明的引物和探针进行单重和三重PCR扩增的结果
优化后的引物探针可以检测到低至10copies/μl的TREC含量。标准曲线的线性拟合度达0.99以上，线性范围覆盖10-1000copies/μl的区间。
引物探针经过优化设计，确保相互之间对扩增效率影响最小。TREC和KREC引物在三重扩增时的扩增效率比单独扩增时没有显著下降；三重扩增曲线如图2所示。
表1：单独扩增和三重扩增时的三组引物探针的扩增效率
Figure BDA0002154729530000041
三、本发明的引物和探针用于检测新生儿血斑样品
从直径3mm的新生儿血斑中提取得到DNA作为待测样本，并按照下表配制PCR反应液，然后将待测样本、浓度梯度标准品(10copies/μl，100copies/μl，1000copies/μl，10000copies/μl)、阴性对照各2μl分别加入PCR反应管中，盖好PCR反应管盖，振荡混匀后瞬时离心，进行PCR扩增反应。
表2：PCR扩增体系配制方法
去离子水 3.5μl
2×PCR MIX 10μl
TREC上游引物10μM 0.5μl
TREC下游引物10μM 0.5μl
KREC上游引物10μM 0.5μl
KREC下游引物10μM 0.5μl
ACTB上游引物10μM 0.5μl
ACTB下游引物10μM 0.5μl
TREC探针10μM 0.5μl
KREC探针10μM 0.5μl
ACTB探针10μM 0.5μl
模板 2μl
表3：PCR扩增程序
Figure BDA0002154729530000051
表4：PCR扩增结果
Figure BDA0002154729530000052
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 北京致谱医学检验实验室有限公司
<120> 一种用于免疫缺陷病检测的试剂盒
<130> PF1935
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaatggggc tcctgtgggg 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcacggggt gcaggtgc 18
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcccttagtg gcattatttg tatcac 26
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggagccagc tcttacccta gag 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcctttggaa ctctgcaggt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cttgggatgg ggagtctgtt 20
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cctctgtcaa caaaggtgat gcca 24
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctgcacgggc agcaggttgg 20
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttcccagatg agctcttttt ctggtg 26

Claims (1)

1.一种用于免疫缺陷病检测的试剂盒，其特征在于，所示试剂盒包括通过定量PCR同时检测T细胞受体重排删除环和κ删除元件重组删除环的试剂；
检测T细胞受体重排删除环的PCR上游引物所扩增的区域是：NC_000014.9:22475205-22475224；检测T细胞受体重排删除环的PCR下游引物所扩增的区域是：NC_000014.9:22386844-22386859，检测T细胞受体重排删除环的PCR扩增上游引物为SEQ ID NO.1：AAAATGGGGCTCCTGTGGGG；检测T细胞受体重排删除环的PCR扩增下游引物为SEQ ID NO.2：GGCACGGGGTGCAGGTGC；检测T细胞受体重排删除环的PCR扩增的探针为SEQ ID NO.7：CCTCTGTCAACAAAGGTGATGCCA；和
检测κ删除元件重组删除环的PCR上游引物所扩增的区域是：NC_000002.12:88859577-88859602；检测T细胞受体重排删除环的κ删除元件重组删除环所扩增的区域是：NC_000002.12:88832811-88832833；检测κ删除元件重组删除环的PCR上游引物为SEQ IDNO.3：TCCCTTAGTGGCATTATTTGTATCAC；检测κ删除元件重组删除环的PCR下游引物为SEQ IDNO.4：AGGAGCCAGCTCTTACCCTAGAG；检测κ删除元件重组删除环的PCR扩增的探针为SEQ IDNO.8：CTGCACGGGCAGCAGGTTGG；
所述试剂盒包括检测内参基因β-ACTIN的引物和探针，扩增所述内参基因β-ACTIN的上游引物是SEQ ID NO.5：TCCTTTGGAACTCTGCAGGT；扩增所述内参基因β-ACTIN的下游引物是SEQ ID NO.6：CTTGGGATGGGGAGTCTGTT；和检测内参基因β-ACTIN的PCR扩增的探针为SEQ IDNO.9：TTCCCAGATGAGCTCTTTTTCTGGTG。
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Application publication date: 20191119

Assignee: Beijing Pude Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: Beijing Zhipu medical laboratory Co.,Ltd.

Contract record no.: X2021990000640

Denomination of invention: A kit for detecting immune deficiency diseases

Granted publication date: 20200925

License type: Exclusive License

Record date: 20211019